CN1665529A - 增强核酸接种免疫应答的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于将核酸和辅助蛋白共递送至细胞的组合物，其中含有囊泡、核酸和辅助蛋白，其中所述核酸可操作地编码一种抗原性蛋白或其部分，该抗原性蛋白或其部分与所述辅助蛋白之间共有至少1个表位，含所述核酸和所述辅助蛋白的组合物与同一囊泡彼此结合在一起。一种优选的实施方案是一种组合物，其中含有由脂质体形成材料以及与脂质体结合在一起的核酸和辅助蛋白组成的脂质体，该核酸可操作地编码一种抗原性蛋白，其中所述辅助蛋白与所述抗原性蛋白之间具有至少一个相同表位。所述组合物可用作疫苗，提供改良的免疫应答，这种改良是相对于非囊泡组合物或者脂质体混合物而言的，组成所述脂质体混合物的一部分与核酸结合，一部分与辅助蛋白结合。
Description
本发明涉及用于共递送核酸和蛋白质的组合物。共递送意指核酸和蛋白质二者源白同一囊泡，并且一起被递送到同一细胞。所述组合物可用于激发免疫应答。具体而言，其中的核酸能够可操作地编码一种抗原性蛋白或其部分，其序列与作为组合物组分的“辅助蛋白”同源，优选为等同。
长期以来一直使用源自病原体的蛋白质抗原制备疫苗，激发接受者体内产生特异性针对抗原的中和抗体或细胞-介导免疫应答。但是，蛋白质往往不能很好地激发一些类型的细胞-介导免疫应答，特别是生成效应T细胞(包括细胞毒性T-细胞)的免疫应答，效应T细胞(特别是那些针对细胞内病原体或癌抗原的效应T细胞)是多种疫苗的应答反应中期望出现的成分。后来，疫苗发展到以裸露DNA为基础，这些DNA通常从大肠杆菌制备得到但是不含有适于哺乳动物细胞内表达的启动子序列。现已得知后来的这些疫苗能够很好地产生细胞介导免疫(包括效应T-细胞，例如分泌干扰素-γ的抗原特异性T-细胞和抗原-特异性细胞毒性T-细胞)，但是产生针对编码及表达抗原的抗体的效果很差。抗体是多种病原体保护性免疫应答的重要成分，特别是细菌和一些病毒例如流感病毒。现已提出和开发了各种方案来弥补DNA-为基础的疫苗的缺陷，如下文所述。
多年来，使用脂质体制剂增强蛋白形式的疫苗抗原的免疫原性。近年来，脂质体制剂也被用于疫苗用的DNA制剂。有试验描述了用脂质体共配制质粒DNA与蛋白质。但是，将DNA与蛋白质共配制的试验通常使用编码除抗原本身之外的免疫刺激细胞因子或其他生物活性蛋白的质粒。
在含有经过设计在体内表达蛋白的核酸的疫苗组合物中，包括蛋白形式的抗原本身是多余的。我们得知只有1篇文献其中在制剂中除了含有DNA之外还使用蛋白抗原作为添加剂(Alvarez-Lajonchere，L.et al.MemInst Oswaldo Cruz，Rio de Janiero，97(1)：95-99，January 2002)。与本发明不同，与单独使用蛋白质免疫相比，这些作者在抗原编码DNA及其同源蛋白的共制剂中并没有观察到任何的抗体增强。Alvarez-Lajonchere等人使用的制剂中含有活性核酸(编码丙肝病毒核心蛋白的质粒)外加无关载体DNA和聚乙二醇的混合体以及蛋白质。注射后，所述蛋白质和活性DNA(在混合物中它们物理学上互不相连)各自扩散分别到达抗原提呈细胞。Alvarez-Lajonchere的否定性发现使得本领域技术人员认为将蛋白质与其同源DNA配制不是一种能实现免疫应答增强的可行途径，至少没有增强抗体应答。
WO-A-9930733中指出与同源蛋白同时施用能够增强核酸疫苗的免疫应答。这两种成分无需放在同一组合物中施用。只不过是二者都必须在免疫应答的诱导期施用，优选在所述核酸核酸刺激免疫系统之前所述蛋白质是被覆盖或被隐藏着的。一些实施例中，疫苗中含有物理混合的裸露DNA和裸露蛋白抗原。其他实施例中，为了延迟释放，将蛋白抗原配制在混合了裸露DNA的生物可降解聚合物-矾制剂中。
WO-A-9728818中的疫苗其目的是为了将核酸和蛋白抗原递送入抗原提呈细胞。所述核酸可以表达与所述蛋白抗原相同的蛋白质。所述核酸和蛋白质复合在一起的，例如通过共价结合。所述复合体可以配制为合成病毒样颗粒。另外还教导可以使用脂质体系统，但是没有提供关于应该如何将蛋白质和核酸掺入所述系统的任何实施例，而且说明书中也没有提供体内试验的任何定量性结果，而是预测了在实践中可能不会发生的结果，特别是II类应答。
现已知：当将非-编码质粒DNA与肽共埋入脂质体囊泡中时，非-编码质粒DNA具有免疫佐剂的作用(Gursel，M.et al.Vaccine(1999)17：1376-1383)，对于裸露的DNA和肽疫苗而言带有CpG基序的DNA具有免疫佐剂作用(Klinman，D.M.et al.Vaccine(1999)17：19-25)。
但是在本发明中，我们设想如果我们用物理学方法将核酸例如DNA与其同源蛋白结合在一起并将其包埋，这两种物质将一起到达抗原提呈细胞，从而使得所述抗原的获得性蛋白形式的处理和提呈与所述抗原性蛋白的DNA编码形式的表达在同一细胞中进行。由于表达蛋白的抗原处理通过不同途径发生的，动力学也与获得的蛋白质略有不同，所以我们设想将DNA与其同源蛋白共递送将会为这两种抗原提呈模式产生加成或协同作用以及增强免疫应答提供良机。现在我们已经用DNA及其同源蛋白囊泡制剂对这一新论断进行了测试，这种制剂形式将DNA及其同源蛋白结合在一起。与Alvarez-Lajonchere等人不同，我们发现：DNA结合(通过脂质体)其同源蛋白(称其为“辅助蛋白”)能够作为特殊的疫苗组合物，其中在免疫后可以观察到加强了的抗体应答(与单独用蛋白或单独用DNA免疫相比)。我们发现如果将DNA与蛋白质配制在不同颗粒中并混合颗粒，则没有观察到抗体产量的增加。这些发现与我们的将DNA与辅助蛋白共递送到同一抗原提呈细胞的理论相一致，尽管我们承认迄今还有其他的理论解释不能被排除。
本发明提供了一种用于共递送核酸和辅助蛋到细胞中的组合物，其中含有两性成分形成的囊泡，其中所述核酸可操作地编码一种抗原性蛋白或其部分，该抗原性蛋白或其部分与所述辅助蛋白之间共有至少1个表位，含所述核酸和所述辅助蛋白的组合物与同一囊泡彼此结合在一起。
术语辅助蛋白是指完整的蛋白质或蛋白质片段，单一类型的蛋白或不同类型的蛋白质。
核酸编码的抗原性蛋白质通常为目的蛋白：即期望在受试者体内激发有益免疫应答的目的抗原。所述辅助蛋白通常与抗原性蛋白编码核酸的表达形式等同，即为所述核酸的同源蛋白。抗原性蛋白和/或所述辅助蛋白可以各自(分别)含有相关来源的天然生成蛋白的全长序列。优选地，所述核酸编码完整的天然生成的蛋白抗原。替代地，所述核酸可以只编码天然蛋白的一部分，其中含有辅助蛋白的至少一个表位。在本发明的一个优选实施方案中，所述表位是一种B细胞表位，暴露于其天然生成形式感染因子的表面。所述核酸可以只编码天然蛋白的一部分，其中含有天然生成因子的至少一个表位。所述因子为，例如，微生物，例如细菌或酵母或病毒。类似地，所述辅助蛋白应该含有不同来源的表位，当所述来源是存在于天然环境时，这些表位(在一个实施方案中)是暴露于表面上的。替代地并且是有用的，抗原性蛋白和辅助蛋白二者与病原体的分泌型毒性产物例如破伤风毒素具有相同的表位，这样就能够准确地中和所述毒素。类似地，抗原性蛋白和辅助蛋白二者可以相互间共有一个或多个表位，这个/这些表位是与除毒素之外的病原体分泌型产物所共有的，例如由EB病毒编码并由该EB病毒感染细胞分泌的白介素-10类似物。
我们已经提出了两种彼此互不抵触的相关理论来解释这种新的组合物的改良特性。我们将这些理论称之为一般和专门理论(如下文所述)。
1.一般理论
一般理论认为适当共配制物质的改良特性(其中DNA及其同源蛋白通过一个囊泡结合在一起，从而使得囊泡中同时具有DNA和蛋白质)是由于核酸及其同源蛋白(辅助蛋白)二者被同一抗原提呈细胞(其是经典的抗原提呈细胞例如巨噬细胞或树突状细胞，或抗原特异性或非-抗原特异性B细胞)获取。DNA及其同源蛋白共递送到同一细胞使得二者在激发免疫应答方面产生协同相互作用，而这在DNA被一抗原提呈细胞获得而蛋白质被另一抗原提呈细胞获得的情况下是无法实现的。(此前描述的组合物不能提供或识别将DNA与其同源蛋白共递送至同一抗原提呈细胞的重要性)。
2.专门理论
专门理论认为适当共配制物质(其中DNA及其同源蛋白通过一个囊泡结合在一起，从而使得囊泡中同时具有DNA和蛋白质)的改良特性包括将该囊泡靶向(通过暴露于颗粒表面的蛋白形式的抗原)抗原-特异性B细胞，从而将DNA及其同源蛋白二者都以定向方式选择性地递送至同一抗原特异性B细胞。由于抗原特异性B细胞通常在免疫应答过程中增殖，与未增殖细胞相比，这些增殖细胞对于仍存在于颗粒中核酸的传导来说能够形成更好的靶标。与上述一般理论情况一样，DNA及其同源蛋白共递送到同一细胞使得二者在激发免疫应答方面产生协同相互作用，而这在DNA被一抗原提呈细胞(这种情况下为抗原特异性B细胞)获得而蛋白质被另一抗原提呈细胞获得情况下是无法实现的。在理论的专门形式中，所述颗粒是被B细胞的抗原特异性受体(即表面抗体)俘获的，而核酸及其同源蛋白(辅助蛋白)都是被抗原特异性B细胞个体摄取的。
核酸为基础的免疫的效果受抗原编码核酸裸露制剂(即裸露DNA)在体内的低转导效率限制，因此极少细胞能摄取和表达目的核酸。在本发明的举例中，使用囊泡(主要是脂质体)组合物实现了保护DNA免受体内核酸酶消化，并且将DNA及其同源蛋白(辅助蛋白)共配制入同一颗粒，但是读者应当清楚其他囊泡组合物可以用于实现将DNA及其同源蛋白结合获得本申请所述共递送必备特性。
在本发明一种具体的优选组合物中，所述囊泡含有由脂质体形成材料即脂双层形成的脂质体。可替代地所述囊泡可以为单层。脂质体可以含有合成的两性成分，例如表面活性剂型的分子。该类型的非离子囊泡通常被称为非离子表面活性剂囊泡(niosome)。所述囊泡可以不含磷脂，但是优选基本上以磷脂为基础。
在我们使用脂质体组合物的研究过程中，我们尽力获得了蛋白和DNA在同一脂质体颗粒中的有效共包埋和/或结合。我们发现：我们开发用于包裹和保护DNA抗核酸酶以及DNA免疫的脂质体组合物(如次前申请WO-A-9810748中所述)还能够非常有效地同时共包裹蛋白质和DNA。值得注意的是，在本申请所述配制脂质体的条件下，DNA和蛋白质不相互竞争被脂质体颗粒结合或包含。而且，它们还能够在脂质体颗粒表面展示显著数量的抗原活性形式的辅助蛋白。我们相信我们的新组合物的表面定位蛋白抗原(辅助蛋白)能够将脂质体或这些结构体内崩解产生的脂质体片段靶向抗原特异性B细胞。
尽管脂质体配制的DNA能够被靶向抗原提呈细胞表面上的受体，例如通过在脂质体表面上放置抗原提呈细胞细胞受体的配体(例如，甘露糖基元或补体蛋白如C3d)，但此前还未有将抗原本身用作核酸为基础疫苗的靶向工具。
新组合物使得抗原提呈细胞能够同时提呈获得蛋白形式的抗原(辅助蛋白)和来自其同源核酸的蛋白表达形式。所述组合物能够产生一种新的基础-加强免疫效果，因而表达的抗原性蛋白和辅助蛋白提呈的不同动力学(在不同时间具有最大值)为相关免疫细胞与抗原之间提供了更为持久并且“连击(double hit)”的接触效果。与核酸疫苗领域内的其他基础-加强免疫现象不同，所述新组合物用单一剂量提供了基础和加强功能。
所述新组合物的另一有益特征涉及两种形式抗原提呈的不同模式(蛋白质的外加形式和体内表达形式)。由于获得和表达蛋白是通过抗原提呈细胞中两种不同途径提呈的(前者通过II类MHC实现肽提呈，而后者则是通过I类MHC)，所以所述新组合物提供了更广泛的基础免疫应答，包括刺激T辅助细胞(II类限制性)，II类限制性效应T细胞以及细胞毒性T细胞(I类限制性)。所述新组合物创造的细胞微环境(其中II类和I类提呈都发生在同一抗原提呈细胞表面)使得充当抗原提呈细胞的不同T细胞类型之间能够相互作用。由于两种类型的T细胞(I类和II类限制性的)在与同一抗原提呈细胞相互作用时都能被刺激，通过同时提呈于抗原提呈细胞表面时相互间的作用，所以所述新的制剂与以往描述的用于核酸免疫的方法和组合物具有几种理论上的优势。此处我们申明这些理论优势已经通过针对抗原的抗体应答水平得到了实践证实。但是，我们认为还会发现新制剂策略在刺激细胞介导免疫(包括T辅助细胞应答和效应T-细胞应答包括细胞毒性T细胞)中的其他优点。由于针对蛋白抗原的抗体应答是高度T细胞依赖性的，所以本申请给出的抗体产生的数据清楚表明新组合物在刺激(至少)T辅助细胞(MHC II类限制性的)应答方面是有效的。新制剂策略使II类限制性辅助细胞和I类限制性细胞毒性细胞同时刺激同一抗原提呈细胞的事实也表明：该策略也能有效地刺激细胞毒性T细胞应答。因此，辅助蛋白对细胞毒性T-细胞应答提供了额外的帮助：即增加抗原中被抗原提呈细胞表面T辅助细胞识别的MHC II类分子限制性肽表位表达的浓度和/或持续时间，从而增加了细胞毒性T细胞应答的T细胞辅助机会，所述细胞毒性T细胞应答是针对通过I类MHC途径提呈的蛋白抗原的表达形式的。
免疫应答需要免疫系统不同细胞间的合作，即抗原提呈细胞(例如例如巨噬细胞或树突状细胞，它们被称为“经典的”抗原提呈细胞)、T细胞(T-淋巴细胞)和B细胞(B-淋巴细胞)之间的合作。B细胞能够将抗原提呈给T细胞，以在几个方面都类似于常规抗原提呈细胞提呈的方式。就是在B细胞和T细胞相互作用的过程中B细胞获得了产生特异性抗体所需的“辅助”。
但是与经典的抗原提呈细胞不同，B细胞不能很好地获得颗粒抗原。但是，一些B细胞(即特异性针对给定抗原的那些B细胞)特别擅长抗原提呈，因为它们能通过其抗原-特异性表面-免疫球蛋白受体获得和浓缩抗原颗粒(包括抗原分子)。与非-抗原特异性B细胞相比，抗原特异性B细胞在提呈抗原方面的效率比II类分子限制性T细胞高至少1000倍(Lanzavecchia，A.Antigen-specific interaction between T and B cells.Nature1985 Apr 11-17；314(6011)：537-9)。因此，抗原特异性B细胞是本发明组合物的重要靶标，由于它们能够获取抗原性蛋白颗粒及其结合的DNA。
T细胞和B细胞通过不同途径识别抗原。这些不同的识别模式体现在本发明不同形式的实施方案中。为了理解本发明的优选实施方案，首先需要理解这些不同识别模式的特征。T细胞识别包埋于细胞表面II类或I类抗原内的蛋白质肽片段，而B细胞(其最终产生抗体)通过其细胞表面的抗体-样抗原受体识别非片段抗原的表面特征(其特征通常为蛋白质)。T细胞和B细胞识别的差异反映在其表位的性质不同。因此，B细胞必须识别抗原或病原体的表面特征(B-细胞表位)，而T细胞表位(其中含有一段长度约8-12个氨基酸的肽)则不仅限于提呈于表面上的抗原，当在抗原三维结构范畴内考虑时可能是“内在的”也是“外在的”。根据本发明的专门理论(如上所述)，B细胞表位的最佳位置是在抗原或病原体的“表面”，这样有助于抗原特异性B细胞对适当配制脂质体[核酸+蛋白]的摄取和刺激。但是，根据本发明的一般理论(这种情况下脂质体是通过非抗原特异性方式被抗原提呈细胞获取的)，表位(特别是T细胞表位)可以位于抗原结构的内部，不必要是抗原或因子表面可获取的或暴露的。
在本发明的一个优选实施方案中，抗原性蛋白和辅助蛋白都源自病毒蛋白的表面抗原。这些蛋白的序列可以彼此相同，或者可以变异，可以部分缺失或可以与其他多肽融合，只要它们共有至少1个表位(B细胞或T细胞)，优选多个表位。
抗原性蛋白和辅助蛋白共有的蛋白部分可以其序列同系物的方式表达。这些蛋白应该是这样的：辅助蛋白具有至少一段至少10个残基的连续序列，该序列与抗原性蛋白等长连续序列之间具有至少50％，优选至少75％，更优选至少90％的相似性。通常各个连续序列长度为至少50个残基，具有至少90％序列相似性，优选至少75％序列相似性。更优选地，所述连续序列具有至少50％，优选至少75％，更优选至少90％的序列相似性。
但是，序列相似性仅仅是结构相似度的一个参数，在“专门理论”(上述)中只需要辅助蛋白与编码及表达蛋白共有一个B细胞表位(定义为仅被识别因子的单一抗体所识别)，而无需任何序列同源性。
本发明的组合物可用于激发免疫应答，例如激发足以抵抗感染的针对感染因子的免疫应答。
因此，抗原性蛋白和辅助蛋白优选源自感染因子，例如微生物例如细菌或病毒。合适地所述病毒是这样的病毒，即已知(或认为)抗该病毒的免疫应答能够中和或杀灭该病毒，例如肝炎病毒(例如乙肝或丙肝病毒)或流感病毒(例如A型或B型流感病毒)。合适地，所述感染因子可以是细菌，例如链球菌(例如肺炎链球菌，或者A群或B群链球菌的成员)或者能够引发脑膜炎的致病因子如脑膜炎球菌A、B及C群或流感嗜血杆菌，或者能导致儿童耳道感染的微生物例如Moraxella cattharalis。合适地所述因子可以是分枝杆菌例如结核分枝杆菌。合适地所述因子可以是选择性表达于癌细胞或癌组织上或内的宿主蛋白，例如癌胚抗原或CD55(一种补体调节蛋白)，或者整合蛋白(integrin)或其他肿瘤血管标记。这种新疫苗组合物的目的抗原可以是一种需要中和或消除的宿主蛋白或肽例如有害的自身抗体，或者肽例如各种形式的阿尔茨海默病β-淀粉样肽(A-β40和A-β42)。
疫苗的目的抗原也可以是碳水化合物，例如细菌多糖，其中蛋白和/或辅助蛋白的表达形式模拟所述碳水化合物抗原的抗原结构。B群脑膜炎球菌多糖(Laing，Granoff Granoff DM and Moe GR.Molecular mimetics ofmeningococcal B epitopes.U.S.patent 6,030,619)和B群链球菌多糖的合适肽模拟物已有描述。这类肽以浓缩形式表达，将碳水化合物表位的不同的肽序列实施方案在DNA水平上连接在一起形成一种含有不同序列表位的重复结构。
根据本发明，期望的有益免疫应答针对的目的表位应该是那些DNA编码蛋白与辅助蛋白之间共有的表位。目的表位在目的抗原上的原位位置可以是抗体可到达的(例如A群流感病毒血凝素的中和表位)，但是另外也可以位于因子的内部(例如结核分枝杆菌的热休克蛋白)。
辅助蛋白，尽管通常与组合物中核酸编码蛋白高度近似或等同，但是也可以是全病毒(毒粒)或裂解后的病毒制剂(例如众所周知的去污剂裂解的流感病毒制剂)，只要其中含有的蛋白与核酸编码蛋白之间具有至少1个(优选为数个)共有表位即可。通常辅助蛋白中不含有能在宿主动物中复制的活病毒。
本发明中的核酸可以是RNA，但是优选为DNA且优选为双链。可操作编码抗原的核酸应该优选含有启动子以及优选含有调控序列。合适地，所述DNA是质粒DNA，可以为源白大肠杆菌C1质粒，也可以是线性DNA。
本发明期望的是包括编码不止一种蛋白的核酸和/或一种或多种不同辅助蛋白。就这样的实施方案而言，优选的是单一囊泡应该将单个囊泡与编码抗原性蛋白的核酸结合在一起，而所述抗原性蛋白与同该颗粒结合在一起的抗原性或辅助蛋白之间共有上述表位。例如本发明的组合物可以含有两种或多种不同类型脂质体的混合物，例如其中一种脂质体含有编码第一抗原性蛋白的核酸和第一辅助蛋白，抗原性蛋白和辅助蛋白间关系如上所述，第二种类型脂质体含有编码第二抗原性蛋白的核酸和第二辅助蛋白，第二辅助蛋白与上述第二抗原性蛋白相关。替代地，单个脂质体可以含有两种或多种不同核酸，其中一种编码第一抗原性蛋白，另一种编码第二抗原性蛋白(等)，以及第一和第二(等)辅助蛋白，其中第一和第二辅助蛋白与上述第一和第二抗原性蛋白分别相关。所述两种或多种抗原性蛋白可以是由单个核酸编码的相同表达蛋白分子(即融合蛋白)的部分。替代地，可以将两种或多种独立的核酸成分(与蛋白一起)包含在单个脂质体中，这些核酸分别编码一种抗原性蛋白的不同部分。一种优选的组合物还可以含有多组共配制的DNA及其同源蛋白(辅助蛋白)，只要各种DNA与其同源或辅助蛋白都在同一脂质体内即可。
用由非磷脂成分形成的本发明组合物可以实现核酸和蛋白的同一安排(same arrangement)。
涉及不止一种抗原性蛋白的实施方案，如前面章节所示，可以是具体数值，其中所述组合物通常用于接种受试者，激发针对存在于几种感染株中感染因子的免疫应答。本发明这种实施方案是一种具体数值，其中所述感染因子是一种病毒，特别是流感病毒。因此，所述的核酸编码的抗原性蛋白及其相应辅助蛋白，可以源自A群和B群流感病毒。一种优选的实施方案是其中含有两株A群流感病毒当前流行(或预期流行)株，以及一株B群流感病毒当前流行(或预期流行)株。优选地，所述组合物含有总共6个与单个囊泡(例如脂质体颗粒)结合的分子个体从而使得该颗粒与所有三种核酸及所有三种蛋白质结合在一起。含有流感病毒的另一优选实施方案含有三种分别制备的囊泡制剂，其中分别含有：{Ai蛋白+AiDNA}；{Aii蛋白+AiiDNA}和{B蛋白+BDNA}(其中大括号代表单个囊泡的有效载荷)，这三种囊泡制剂全部混合在一起或者以三份单独剂量施用给接受的人或动物。
在本发明的一个有用的实施方案中，所述核酸是至少部分，优选基本完全，包埋于囊泡的囊泡内空间，通常为脂质体。当核酸被包埋于囊泡内空间时，其最好被保护避免与其所在环境接触，但是一旦施用给受试者便可递送入合适细胞内。替代地，但是并不优选的是，可以将所述核酸与囊泡混合，即核酸主要结合于囊泡的外表面。这样的排列在核酸的施用和递送过程中提供了较低程度的保护，但也可能是有效的。
在本发明的一个实施方案中，辅助蛋白优选至少部分可在囊泡的外表面上获得。这就使得囊泡可被抗原特异性B细胞获得，并且在针对疫苗组合物免疫应答早期产生抗体后，有助于抗体-复合囊泡被抗原提呈细胞通过高亲和Fc-γ受体摄取，该受体能够识别囊泡表面上的表面结合抗原特异性IgG。类似地，脂质体或其他囊泡上的表面定位抗原使得补体结合，导致囊泡及其片段被抗原提呈细胞和B细胞上的补体受体摄取.为了实现这些结果，可以只将蛋白质与囊泡的外表面复合在一起(例如通过静电或疏水相互作用，以外在膜蛋白的方式)，或者优选将蛋白质嵌入囊泡壁内(例如通过多肽链的跨-双层疏水序列)且仍有部分暴露至囊泡的外环境。该技术方案的无论那种情况，目的表位都应该可从囊泡的外部接近。这种可接近性可以通过使用抗各个表位的抗体的结合试验来测定。这些证明表面暴露的结合数据在正文所附的关于共配制A群流感病毒DNA和蛋白质方面的工作的图中描述。
当囊泡是脂质体时，用于形成脂质体的脂质体形成成分可以包括中性、两性、阴离子和/或阳离子脂质基元。这些成分可以相对量使用从而使得脂质体带电，或者并不优选，所述脂质体总体上不带电。我们发现使用能使脂质体具有总正电荷的脂质体成分能够提供很好的结果(参考本申请的数据部分)。除了那些真正是脂质的成分(包括甘油酯和胆固醇)之外，所述脂质体形成成分还可以包括非-脂质成分(即非天然生成的脂类)例如非-离子或阳离子表面活性剂。
根据本发明特别优选的实施方案，所述新组合物包括由脂质体形成成分形成的脂质体，其中包括至少一种带有阳离子电荷的成分，其量足以使该脂质体具有总正电荷。
在本发明这种实施方案中，被掺入脂质体的阳离子成分可以是已经被用于脂质体制剂通过与多核苷酸复合从而提高感染率的任一阳离子成分。所述成分可以是脂类或非脂类化合物，可以是合成的或天然的。优选的阴离子脂类为1，2-双(油酰氧)-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)，1，2-双(十六烷基氧)-3-三甲氨丙烷(BisHOP)，N-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三乙铵(DOTMA)以及具有US-A-4,897,355(该文献在此引入)中所述结构I的其他脂类，或者酯类似物。
所述结构如下：
或其光学异构体，其中Y1和Y2相同或不同，为-O-或O-C(O)-，其中羰基碳原子视情况与R1或R2相连；R1和R2各自独立地为6-24个碳原子的烷基、烯基或炔基，R3、R4和R5各自独立地为氢、1-8个碳原子的烷基、6-11个碳原子的芳基芳烷基或；替代地R3、R4和R5中的两个或三个与带正电的氮原子结合形成一种5-8个碳原子的环状结构，此时，除带正电氮原子外，该结构中的原子是碳原子，并且可以包括一个氧、氮或硫原子；n为1-8；X为阴离子。
优选的实施方案是组合物，其中R1和R2各自具有0-6个不饱和位点，并且具有下列结构
CH3-(CH2)a-(CH＝CH-CH2)b-(CH2)c-
其中a和c的和为1-23；b为0-6。最优选地，R1和R2都为油基(oleyl)。特别优选的实施方案是组合物中的长链烷基为脂肪酸，即，其中所述的Y1和Y2同为-O-C(O)-。
替代地，可以使用US-A-5,459,127中结构通式I和结构通式II所示的阳离子脂类，所述专利文献在此引入。
其他合适的阳离子成分为非脂类成分硬脂酰胺和3β[N-N′N′-二甲氨乙烷)-氨甲酰]胆固醇(DC-Chol)(一种脂类成分)或其类似物。
除了含有阳离子成分外，所述脂质体通常还含有非-离子和/或两性离子成分，包括脂类，可以是磷脂或不含磷酰基的其他脂类。优选地，所述脂类包括磷脂，例如天然或合成磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸，其中任一种中的长链烷基(通过酯或醚键连接)可以是饱和或不饱和的。优选所述甘油脂中的酰基是不饱和的。所述成分可以包括非脂类成分，例如非离子表面活性剂如脂肪酸单山梨糖酯，和/或乙氧基化脂肪酸或其他类似物，例如乙氧基化羊毛脂。
当脂质体包括融合脂类时获得的结果最佳，融合脂类通常为其中酰基不饱和的磷脂酰乙醇胺。胆固醇可以被包括，尽管对于将多核苷酸递送入靶细胞而言胆固醇会使脂质体太稳定。
阳离子的量优选为占脂质体形成成分总摩尔数的5-50％，优选为10-250摩尔。
通常，囊泡组合物为含水悬浮液，例如生理缓冲液悬浮液。替代地，其可以是一种待再水化的干制组合物。
所述组合物优选为疫苗，例如经过调整适于皮下、静脉内、肌肉内、皮内、鼻内、口内、其他粘膜或肺途径施用。
所述囊泡可以使用任一种常用囊泡形成技术制备而成。所述囊泡可以是多层或单层囊泡，可以相对大些(囊泡直径为300nm-5000nm；优选小于2000nm，优选普遍直径为500-1000nm)或者小些(囊泡直径为100nm-400nm，优选普遍直径为200-300nm)。优选地，所述囊泡的平均直径不超过500nm，优选基本上所有直径都小于2000nm。
尽管本发明的脂质体组合物可以用常规的脂质体形成方法制备，例如通过将脂质体形成材料从膜分散入含核酸和蛋白质的悬浮介质，接着是一个或多个大小调整步骤，或者替代地将脂质体形成材料与核酸和/或辅助蛋白共溶入同一溶剂然后进行脂质体形成步骤包括添加含水液体，或者使用浓度梯度电穿孔或电泳技术通过所操作脂质体壁加入核酸和/或辅助蛋白，优选的方法是使用脱水-再水化技术。
几种合适脂质体配制方法的描述见Christopher J.Kirby and GregoryGregoriadis：ISBN 0-471-14828-8 Encyclopedia of Controlled Drug DeliveryEditor：Edith Mathiowitz，Published July 1999 by Wiley Chapter′L′forliposomes。这些包括(但非穷举)用“手摇(hand shaken)”方法制备的多层薄膜脂质体；脱水/再水化囊泡(本发明实施例中使用的方法，该方法是高效的)；以及溶剂溶解脂类的简单水化。这些方法中DNA和蛋白质的同时出现导致各种不同程度的共包埋以及两种成分与脂质体的其他结合方式。也可以使用磷酸钙将DNA和蛋白一起沉淀实现WO-A-0141739中所述的本发明版的“蛋白质与DNA共配制”
用于将DNA与其同源蛋白结合配制的优选方法是Judith Senior andGregory Gregoriadis(Biochimica et Biophysica Acta 1989；1003，58-62)中公开的方法。该方法是脱水-再水化方法的变通形式，其中可以将本发明所述“辅助蛋白通过共价偶联到小单层囊泡(SUV)的表面。然后将这些SUV冻干，然后按照Senior and Gregoriadis(上述)的方法用抗原编码DNA的溶液再水化。得到的多层薄膜囊泡将大部分的蛋白质被覆在脂质体颗粒的表面上，这是本发明的优选实施方案。
本发明用于形成脂质体组合物的方法包括下列步骤：
a)提供一种由脂质体形成材料形成的小单层囊泡(SUVs)含水悬液；
b)让SUV含水悬液与核酸接触形成一种SUV-核酸悬液，该核酸可操作地编码一种抗原性蛋白；
c)将SUV-核酸悬液脱水提供一种脱水混合物；以及
d)将上述脱水混合物用含水重悬介质再水化形成一种含核酸脂质体的悬液，
其中包括下述步骤：导入辅助蛋白，从而使含核酸脂质体与所述辅助蛋白结合在一起。
这种脱水-再水化方法使得核酸包埋在脂质体产物的囊泡内空间。此外，也可有少量留在脂质体外表面上。辅助蛋白可以在各种不同阶段加入。可以让辅助蛋白在步骤b前、中或后以及步骤c之前与SUV含水悬液接触。辅助蛋白与核酸共包埋入脂质体的囊泡内空间。
在另一种方法中，辅助蛋白出现在再水化步骤过程的重悬介质中。在该实施方案中，至少一部分蛋白质可能被暴露在脂质体的外表面上。另一种方法中，可以让蛋白与含核酸脂质体的含水悬液接触。该技术方案使得蛋白质基本上全部结合在脂质体的外表面。
为了增大蛋白质的掺入程度，同时还要让其表位暴露在脂质体外表面，在一些实施方案中是将辅助蛋白与亲脂基元偶联，该基元适于嵌入脂质体壁内，例如脂酰基元。所述偶联可以包括辅助蛋白制备方法的一部分。替代地，可以在步骤d后将辅助蛋白与脂质体成分偶联。
在脂质体形成材料含有阳离子基元因而使得脂质体上带有总正电荷的情况下，带正电荷的脂质体与辅助蛋白之间可能有足够的静电吸引，辅助蛋白在环境条件下带有总负电荷，因此需要疏水蛋白，蛋白质的复合提供了足够强的结合。
优选所述脂质体形成材料中含有至少5％摩尔比的阳离子化合物。
在本发明中，核酸与辅助蛋白的重量比优选为1000∶1-1∶1，最优选该比例为5∶1-30∶1。
核酸与脂质体形成材料的重量比优选为1∶100-1∶1000，更优选为1∶100-1∶300。
在本发明的方法中，步骤a)中使用的脂质体颗粒的大小优选为30nm-5000nm，最优选基本上所有脂质体的直径都小于1000nm。该方法得到的脂质体产物的颗粒大小为200nm-5000nm，优选为300nm-2000nm。必要情况下，所述方法可包括大小-控制特征。这可以包括将成分掺入控制脂质体大小的重悬介质(例如蔗糖，如WO-A-0156548中所述)。替代地，所述大小的控制可以包括在步骤d后追加一个步骤，将所述悬液进行微观流态化(microfluidisation)、过滤或均化处理。对于该目的超声处理并不优选却也是可行的选择，但是超声处理不可避免地会产生一些DNA片段。
上述处理后，优选将含有核酸和蛋白质的脂质体产物进行纯化，将未包埋的核酸或辅助蛋白或其他成分从脂质体产物中除去。所述纯化方法可以包括离心、过滤、通过特定孔径的多孔膜、凝胶排阻层析，例如大小排阻层析，此时囊泡出现在空隙体积中。
我们已发现：当施用给受试者时本发明能够高效地激发免疫应答，尤其是增强了的抗体应答。我们认为本发明带来的改进主要是由于：核酸和辅助蛋白共靶向至同一抗原提呈细胞，(可能包括抗原特异性B细胞)，从而使得在与适当配制的囊泡相遇后，单个抗原提呈细胞会同时摄取核酸及其同源蛋白。就流感病毒血凝素而言，将核酸(编码血凝素的DNA)和其同源蛋白(血凝素蛋白，此处为不含核酸的完整的灭活病毒蛋白)分别配制入单独的脂质体腔室或单独成群，然后混合，共施用到体内，我们发现这样无法实现在下述情况下出现的协同效果：将DNA及其同源蛋白共配制入同一脂质体颗粒从而使每一脂质体都同时含有DNA及其同源蛋白。这些数据支持了我们的论断：DNA及其同源蛋白协同激发免疫应答(此时为抗流感病毒血凝素的免疫应答)需要进行适当配制从而使得DNA及其同源蛋白二者能够共靶向至同一抗原提呈细胞。
本发明用下列实施例做进一步说明：
实施例1-阳离子脂质体中的血凝素
材料和方法：
脂类
鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2-二油酰-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)购自Sigma Chemical Co.，UK。所有脂类都溶于氯仿中(-20℃)保存，用氮净化。
DNA
质粒pCI-OVA(参考DNA OVA)(由Dr.T.Nagata，HamamatsuUniversity School of Medicine，Japan惠赠)中含有克隆入位于CMV增强子/启动子区域下游的pCI质粒(Promega，Madison，WI)EcoR1位点的鸡蛋白蛋白(卵白蛋白，OVA)cDNA(Yoshida A，Nagata T，Uchijima M，HigashiT.Koide Y.Advantage of gene gun-mediated over intramuscular inoculationof plasmid DNA vaccine in reproducible induction of specific immuneresponse.Vaccine.2000，18，1725-1729)。质粒pl.17/SichHA(参考DNAHA)由Dr J.Robertson(NIBSC，UK)(Johnson，P et al.J.Gen.Virol.2000，1737-1745)提供，其中含有源自A群流感病毒/Sichuan/2/87病毒株的全长HA。剂量免疫(dosing)用的两种质粒都是Aldevron(Fargo，USA)的商业化产品，含有＜100内毒素单位(EU)/mg DNA，并且没有检测到任何残留蛋白质。
蛋白质
A群流感病毒/Sichuan/2/87病毒株的完整灭活病毒蛋白(蔗糖梯度纯化，主要蛋白HA，参考抗原HA)获自NIBSC，UK。卵白蛋白(VI级，ref抗原OVA)购自Sigma Chemical Co.，UK。
制备脂质体组合物
简而言之，将由鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)和1，2-二油酰氧-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)(4∶2∶1摩尔比)通过超声处理制成的小单层囊泡(SUV)与单独存在的DNA或蛋白质或者与一起存在的DNA和蛋白质混合(表1)。制剂按三份平行方式制备，其中两管用于剂量免疫(基础和加强免疫)，另一管用于根据加入包埋物质中的放射标记示踪剂计算包埋百分比(HA和OVA，DNA和蛋白质)，然后冻干过夜，描述见Gregoriadis，G.，Saffie，R.and Hart，S.L.High yield incorporation ofplasmid DNA within liposome：effect on DNA integrity and transfectionefficiency，J Drug Targeting.1996，3(6)，467-475和Kirby，C.，Gregoriadis，G.Dehydration-Rehydration Vesicles(DRV)：A new method for high yielddrug entrapment in liposomes.Biotechnology.1994，2，979-984。在控制条件下再水化后，将得到的脱水-再水化囊泡(DRV脂质体)离心洗涤将未掺入物质除去。将洗涤后的沉淀用PBS重悬得到所需的剂量体积。脂质体中DNA和/或蛋白质的掺入量根据悬浮沉淀物回收的35S(对于DNA)和125I(对于蛋白质)放射活性来计算。25℃下用Malvern Zetasizer 3000对脂质体进行微量电泳和光子相关光谱分析法(PCS)处理，分别测定其表面电位(ZP)和z-平均直径。
表1
| 组 | 制剂 | 包埋百分率 | |||
| DNAμg | 抗原μg | 脂质体(PC：DOTAPμmol) | DNA | 蛋白质 | |
| 1.1 | 70(HA) | 4.2(HA) | 11.2∶5.6∶2.8 | 100 | 99.5 |
| 1.2 | 70(OVA) | 4.2(HA) | 11.2∶5.6∶2.8 | 91.9 | 84.1 |
| 1.3 | 70(HA) | 5.25(OVA) | 11.2∶5.6∶2.8 | 97.5 | 99.0 |
| 1.4 | 70(HA) | 11.2∶5.6∶2.8 | 100 | - | |
| 1.5 | 4.2(HA) | 11.2∶5.6∶2.8 | - | 89.8 | |
动物学试验
将6-12周龄的雌性Balb/c小鼠(Harlan，UK)通过皮下注射施用0.2ml剂量体积(表2)进行免疫。最终剂量根据包埋物质(DNA、蛋白质或二者)的百分比(从放射活性计量管中得出)计算。阴性对照小鼠分别接受同等剂量的PBS。小鼠在第0和第28天接受了两份免疫剂量的抗原，在第一次注射后的第16、28和42天从小鼠尾静脉采集血样。
制剂的捕获ELISA试验
用捕获酶联免疫吸附测定(ELISA)测定免疫用制剂(表2)的HA(A/Sichuan)抗原性。将验证结合的化学96孔板用碳酸盐缓冲液(pH9.6)1∶2000倍稀释的绵羊抗A/Sichuan HA标准血清(NIBSC)按50μl/孔的量4℃下包被过夜。除去绵羊抗体溶液后，用200μl 10％(w/v)FCS(胎牛血清)PBS溶液包被各孔。37℃下孵育2小时后，去除封闭液，向孔中加入系列稀释(2倍稀释)的制剂(参见表2)(50μl样本/孔)。用PBS和Triton X100(Tx-100)溶液稀释制剂，该溶液能够溶解脂质体暴露被包埋的物质(5)Gregoriadis，G，Brenda McCormack，Mia Obrenovic，Roghieh Saffie，BrahimZadi，和Yvonne Perrie.Vaccine entrapment in liposomes.Methods.1999，19，156-162.).37℃下孵育1小时后，平板用PBS/Tween 20洗涤4次，然后用1/5000稀释度的鼠特异性抗血清(A群流感病毒/Sichuan株)稀释液被覆(50μl样本/孔)。37℃下孵育1小时后，平板用PBS/Tween 20洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆兔抗鼠Ig-HRP偶联血清(Dako)。37℃下孵育1小时后，平板用PBS/Tween 20洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆底物溶液邻苯二胺(Sigma，Fast OPD)。加入50μl/孔终止液(3M硫酸)终止反应，490nm下测定各孔的吸光度(OD)。
血清ELISA
将血样获得的血清用PBS稀释20倍，-20℃保存直至酶联免疫吸附测定(ELISA)试验。将验证结合的化学96孔板用碳酸盐缓冲液(pH9.6)1∶1000倍稀释的绵羊抗A/Sichuan HA标准血清(NIBSC，UK)按50μl/孔的量4℃下包被过夜。除去绵羊抗体溶液后，用200μl 2％(w/v)BSA PBS溶液包被各孔。37℃下孵育2小时后，去除封闭液，向孔中(50μl样本/孔)加入2.5μg/ml的(溶于PBS)A群流感病毒Sichuan/2/87完整的灭活病毒蛋白(蔗糖梯度纯化，主要蛋白HA)。37℃下孵育1小时后，平板用PBS/Tween 20(商标)洗涤4次，然后用不同试验血清(单个动物血样或者成组动物血样混合物)的稀释液被覆，以1/100的稀释度起始(50μl样本/孔)。37℃下孵育1小时后，平板用PBS/Tween 20洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆兔抗鼠Ig-HRP偶联血清(Dako)。37℃下孵育1小时后，平板用PBS/Tween 20洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆底物溶液邻苯二胺(Sigma，Fast OPD)。加入50μl/孔终止液(3M硫酸)终止反应，490nm下测定各孔的吸光度(OD)。所述抗体应答表示为OD读数达到0.200时所需血清稀释度(终点稀释度)的倒数。
用阴性对照动物(参见表3，组1.12的应答)，x2阴性对照(OD为约0.2单位)建立血清阳转标准。
表2
剂量制剂
| 组 | 剂量/动物(0.2ml皮下) | ||
| 脂质体 | DNA(μg) | 抗原(μg) | |
| 1.1 | 是(共配制) | HA(10) | HA(0.6) |
| 1.2 | 是(共配制) | OVA(11) | HA(0.6) |
| 1.3 | 是(共配制) | HA(10) | OVA(0.76) |
| 1.4 | 是 | HA(10) | 0 |
| 1.5 | 是 | 0 | HA(0.6) |
| 1.6 | 是(混合1.4和1.5) | HA(10) | HA(0.6) |
| 1.7 | 否 | HA(10) | OVA(0.76) |
| 1.8 | 否 | OVA(11) | HA(0.6) |
| 1.9 | 否 | HA(10) | HA(0.6) |
| 1.10 | 否 | HA(10) | 0 |
| 1.11 | 否 | 0 | HA(0.6) |
| 1.12 | 否 | 0 | 0 |
结果
这些数据表明所述组合物实现了DNA和蛋白质的高效共包埋，蛋白质的出现只给DNA的包埋效率带来极微小的副作用，反之亦然。
对制剂的HA(A群流感病毒/Sichuan株)抗原性进行评估，图示于图1，OD 490nm信号与HA抗原成比例。12个组的血清抗体结果(表2)见表3。该结果还图示于图2(第16天)，图3(第28天)和图4(第42天，第二剂量后第15天)。
表3
| 组 | 制剂 | 抗A/sichuan流感病毒抗原的总Ig | ||||||||||||
| 5 | DNA | 抗原 | 1份剂量免疫后第16天 | 1份剂量免疫后第28天 | 2份剂量免疫后第15天 | |||||||||
| 小鼠/grp | 10ug/剂量 | 0.6ug/剂量 | OD(+/-sem) | sero/5 | Titre | OD(+/-sem) | sero/5 | Titre | OD(+/-sem) | sero/5 | Titre | |||
| 1.1 | 脂质体( | HA | HA) | 0.400 (0.017) | 5 | 675 | 0.457 | (0.053) | 5 | 1298 | 1.181 | (0.071) | 5 | 6015 |
| 1.2 | 脂质体( | OVA* | HA) | 0.142 (0.039) | 1 | ＜100 | 0.240 | (0.017) | 4 | 150 | 0.656 | (0.034) | 5 | 1847 |
| 1.3 | 脂质体( | HA | OVA)** | 0.090 (0.012) | 0 | ＜100 | 0.073 | (0.003) | 0 | ＜100 | 0.158 | (0.014) | 0 | ＜100 |
| 1.4 | 脂质体( | HA | nif) | 0.088 (0.013) | 0 | ＜100 | 0.070 | (0.007) | 0 | ＜100 | 0.12B | (0.026) | 0 | ＜100 |
| 1.5 | 脂质体( | nif | HA) | 0.075 (0.013) | 0 | ＜100 | 0.132 | (0.043) | 1 | ＜100 | 0.425 | (0.055) | 5 | 974 |
| 1.6 | 脂质体(HA) | +脂质体(HA) | 0.085 (0.009) | 0 | ＜100 | 0.158 | (0.034) | 2 | ＜100 | 0.468 | (0.042) | 5 | 477 | |
| 1.7 | 非脂质体 | HA | +OVA | 0.067 (0.004) | 0 | ＜100 | 0.060 | (0.004) | 0 | ＜100 | 0.178 | (0.009) | 1 | ＜100 |
| 1.8 | 非脂质体 | OVA | +HA | 0.130 (0.046) | 1 | ＜100 | 0.279 | (0.122) | 2 | 191 | 0.517 | (0.253) | 4 | 423 |
| 1.9 | 非脂质体 | HA | +HA | 0.079 (0.007) | 0 | ＜100 | 0.099 | (0.011) | 0 | ＜100 | 0.381 | (0.104) | 4 | 334 |
| 1.10 | 非脂质体 | HA | 非脂质体 | 0.046 (0.012) | 0 | ＜100 | 0.007 | (0.002) | 0 | ＜100 | 0.180 | (0.009) | 1 | ＜100 |
| 1.11 | 非脂质体 | 非脂质体 | +HA | 0.078 (0.014) | 0 | ＜100 | 0.083 | (0.006) | 0 | ＜100 | 0.336 | (0.006) | 4 | 298 |
| 1.12 | 非脂质体 | 非脂质体 | 非脂质体 | 0.115 (0.013) | 0 | ＜100 | 0.050 | (0.002) | 0 | ＜100 | 0.063 | (0.008) | 0 | ＜100 |
OD：用1/100稀释度血清测得，sero(＝血清阳转)＞在1/100血清稀释度时0.2OD单位，滴度＝OD值为0.2OD单位的血清稀释度(用个体血清混合物/组测得)
*剂量11μg
*剂量0.76μg
讨论
将通过捕获ELISA测定制剂(表2)HA抗原性的试验(图1)应用于含有和不含脂质体裂解剂Triton X100(TX100)的制剂(注：-组1.3、1.4、1.7、1.10和1.12用做试验的阴性对照，其中不含HA蛋白)。不含TX100时测试的制剂表明：在含有HA但该蛋白没有与脂质体配制的制剂(组1.8，1.9，1.10)中很容易检测到HA抗原，对于制剂1.1和1.2可检测到很小的HA抗原阳性信号，这可能是该试验中所用抗体可检测的HA抗原表面暴露程度导致的。在含有TX100的情况下，脂质体组1.1和1.2得到了明显更强的阳性信号，这表明此前(即不含TX100情况)含在脂质体制剂内的抗原被检测到了。制剂1.5和1.6在制剂中无DNA的情况下(相对于1.1和1.2而言)都含有被脂质体包埋的HA抗原，但是几乎检测不到HA抗原性。
通过测量抗-流感(主要蛋白HA)抗体应答，对制剂(表2)免疫后产生的免疫应答进行了测定。结果总结于表3并图示于图2、3和4。制剂1.1是由用同一脂质体制剂共递送的DNA和蛋白质组成的，对于每一测试血样(第16天、第28天和第42天(第二剂量免疫后第15天))都能够产生比其他所有制剂更强的免疫应答。在每一采血时间点，这种共配制制剂激发的免疫应答在程度(1/100血清稀释度490nm OD值和滴度)及血清阳性动物数目上都是最强的。
制剂1.2和1.3也是由用同一脂质体制剂共递送的DNA和蛋白质组成的，但是不能激发如同制剂1.1那样的显著免疫应答。制剂1.2和1.3是由彼此非同源的蛋白质和DNA组成的。
制剂1.6进一步证实了本发明，因为就施用给动物的蛋白和DNA制品而言，制剂1.1与1.6是等同的。但是，制剂1.1中这些制品是被共递送入同一脂质体囊泡，而制剂1.6中所述DNA和蛋白质是由独立的脂质体囊泡分别递送的。又如此前所述一样，制剂1.1的免疫应答明显强于制剂1.6。
除1.1之外的其他含HA DNA的制剂(制剂1.3，1.4，1.7和1.10)基本上都不能激发免疫应答，但是这种免疫应答可能是剂量相关性的，如Johnson，P et al.J.Gen.Virol.2000，1737-1745报导该质粒(未包埋)免疫后有阳性应答。
脂质体对于递送入脂质体制剂的蛋白质的佐剂作用(制剂1.5与制剂1.11相比)此前已有报道(Gregoriadis G，Tan L，Ben-Ahmeida ET，Jennings R.Vaccine 1992；10(11)：747-53)，这种佐剂作用在第2及再次剂量免疫后第15天的血样中几乎观察不到，这可能是免疫方案的不同导致结果差异。此前报道的脂质体内质粒DNA的免疫佐剂效果(Gursel M et al.Vaccine 1999：17：1376-1383)在制剂1.2和1.5的应答差异上又一次得到了体现。
但是，蛋白质和其合适(同源)质粒共配制的协同作用远远超过已知的DNA免疫佐剂效果的作用，例如Klinman(Klinman，D et al.Vaccine1999 19：25 19-26)观察到的CpG基元对免疫佐剂效果的影响。
尽管给出的结果是在皮下施用所述脂质体制剂后获得的，但是提出的作用机制，一般和专门的(以及抗原动力学特性)，对于其他施用途径都是有效的：静脉内、肌肉内、皮内、经鼻/肺和口的途径等。实际上，现已成功地使用脂质体通过这些途径递送蛋白质和DNA，从而激发免疫应答。
总之，我们已经发现本发明在施用给受试者时能够高效激发免疫应答。所述应答包括抗体应答。本发明带来的改进包括脂质体形成材料和与脂质体结合的可操作编码抗原性蛋白的核酸及共递送蛋白质组成的组合物，其中共递送的蛋白质与抗原性蛋白具有相同的表位。
实施例2-甘露糖导向的乙肝疫苗
材料和方法：
脂类
鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2-二油酰-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)购自Sigma Chemical Co.，UK。
N-[2-(2-{2-[2-(2，3-二-octadec-9-enyloxy-丙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)-乙基]-3-(3，4，5-三羟基-6-羟甲基-四氢-吡喃-2-ylsulfanyl)-丙酰胺(下文给出通式(DOGP4aMan，Prof.Francis Schuber(Universit Louis PasteurStrasbourg I，Facult de Pharmacie 74，Route du Rhin，BP 24 67401 IllkirchGraffenstaden)惠赠)。所有脂类都溶于氯仿中(-20℃)保存，用氮净化.
DNA
质粒pRc/CMV-HBs(S)(或简称pCMV-S)能够在CMV即刻早期启动子调控下表达乙肝表面抗原(小，或S，蛋白)(Davis HL，Michel ML，Whalen RG.DNA-based immunisation for Hepatitis B induces continuoussecretion of antigen and high levels of circulating antibody.HumanMolecular Genetics.1993.2：1847-1851)。剂量免疫用的质粒都是Aldevron(Fargo，USA)的商业化产品，含有＜100内毒素单位(EU)/mg DNA，并且没有检测到任何残留蛋白质。
蛋白质
乙肝病毒表面抗原(HBsAg)重组蛋白，纯度＞95％用SDS-PAGE电泳纯化自酵母(Hansenula polymorpha，购自Aldevron，Fargo，USA.Lot05/00 HBsAg)。
制备脂质体组合物
简而言之，将由鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)、1，2-二油酰氧-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)和N-[2-(2-{2-[2-(2，3-二-octadec-9-enyloxy-丙氧基)-乙氧基]-乙氧基}-乙氧基)乙基]-3-(3，4，5-三羟基-6-羟甲基-四氢-吡喃-2-ylsulfanyl)-丙酰胺)(DOGP4aMan)(4∶2∶1∶1摩尔比)通过超声处理制成的小单层囊泡(SUV)与单独存在的DNA或蛋白质或者与一起存在的DNA和蛋白质混合(表4)。制剂制备两管用于剂量免疫(基础和加强免疫)，每一管中都含有加入待包埋物质的放射标记示踪剂(DNA和蛋白质物质)用于包埋百分比的计算，然后冻干过夜，描述见Gregoriadis，G.，Saffie，R.and Hart，S.L.High yield incorporation ofplasmid DNA within liposome：effect on DNA integrity and transfectionefficiency，J Drug Targeting.1996，3(6)，467-475和Kirby，C.，Gregoriadis，G.dehydrate-rehydrate vesicles(DRV)：A new method for high yield drugentrapment in liposomes.Biotechnology.1994，2，979-984。在冷冻之前(在冻干处理之前)向每一管都加入蔗糖，脂类与蔗糖之比(w/w)为1∶3，然后20℃下溶解(Brahim，Z.and Gregoriadis，G.A novel method forhigh-yield entrapment of solutes into small liposomes，J Liposome Research.2000，100(1)，73-80)。在控制条件下再水化后，将得到的脱水-再水化囊泡(DRV脂质体)用PBS稀释得到所需的剂量体积。再水化后每管容积(～25％)离心洗涤除去未掺入的物质。脂质体制剂中DNA和/或蛋白质的掺入百分率根据悬浮沉淀物回收的35S(对于DNA)和125I(对于蛋白质)放射活性计算。25℃下用Malvern Zetasizer 3000对脂质体进行微量电泳和光子相关光谱分析法(PCS)处理，分别测定其表面电位(ZP)和z-平均直径。
表4
| 组 | 制剂 | ||
| DNAμg | 蛋白质(HBsAg)μg | 脂质体PC∶DOPE∶DOTAP∶DOGP4αManμM | |
| 2.1 | 464 | 13.28 | 42.6∶21.3∶5.3∶5.3 |
| 2.2 | 0 | 13.28 | 42.6∶21.3∶5.3∶5.3 |
| 2.3 | 464 | 0 | 42.6∶21.3∶5.3∶5.3 |
动物学试验
将6-12周龄的雌性Balb/c小鼠(Harlan，UK)通过皮下注射施用0.2ml剂量体积(表2)。最终剂量(Final dose quantities)总结于表5。小鼠在第0和第28天接受了两份免疫剂量的抗原，在第一次注射后第28天(1份免疫剂量后)和第56天(2份免疫剂量后)从小鼠尾静脉采集血样。
表5
| 组 | 每只动物接种总剂量 | ||
| DNAμg | 蛋白质(HBsAg)μg | 脂mg | |
| 2.1 | 35 | 1 | 4.35 |
| 2.2 | 0 | 1 | 4.35 |
| 2.3 | 35 | 0 | 4.35 |
血清ELISA
将由血样获得的血清用PBS稀释，-20℃保存直至酶联免疫吸附测定(ELISA)试验。将验证结合的化学96孔板用以2.5μg/ml浓度溶于0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)重组蛋白(Aldevron，Fargo，USA.Lot 05/00 HBsAg)按50μl/孔的量4℃下包被过夜。过夜孵育后，将各孔用PBS/Tween 20TM(PBST)洗涤4次，然后用200μl 2％(w/v)BSA PBS溶液包被各孔。37℃下孵育2小时后，去除封闭液，用PBST洗孔4次，然后被覆以不同试验血清(单个动物血样)的稀释液，以1/100的稀释度起始(50μl样本/孔)。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆兔抗鼠Ig-HRP偶联血清(Dako)。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆底物溶液3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB，Pierce)。加入50μl/孔终止液(2M硫酸)终止反应，450nm下测定各孔的吸光度(OD)。
结果
物理特性(产品(DNA和/或蛋白质)包埋百分率，颗粒大小以及表面电位(Zeta))总结于表6。
表6
| 第一剂量 | 第二剂量 | 第一剂量 | 第二剂量 | |||||
| 组 | 包埋百分率 | 包埋百分率 | 大小nm | 电位mV | 大小nm | 电位mV | ||
| DNA | 蛋白质 | DNA | 蛋白质 | |||||
| 2.1 | 79.8 | 71.3 | 90.5 | 88.9 | 379 | 18.1 | 448 | ND |
| 2.2 | 0 | 30.3 | 0 | 58.3 | 166 | 18.5 | 134 | ND |
| 2.3 | 85.6 | 0 | 94.5 | 0 | 367 | 19.1 | 355 | ND |
ND＝未测定。
抗体应答(血清ELISA)表示为Log10血清稀释度测得的OD信号平均值(n＝5动物/组)±SEM。结果表示于图5和图6，图5给出了第一免疫剂量HbsAG后28天的总Ig结果，图6给出了第二免疫剂量后28天的总Ig结果。
讨论
用经甘露糖配体标记的脂质体作为递送DNA和蛋白的工具诱导免疫应答，此前已有描述(Kawakami S，Sato A，Nishikawa M，Yamashita F，Hashida M，Gene Ther.2000，7(4)：292-9(DNA).和Latif N，Bachhawat BK.Immunol Lett 1984；8(2)：75-8(蛋白质))。另外，甘露糖受体介导抗原提呈细胞摄取抗原的广泛应用已被视作诱导免疫应答的有力武器
(Lanzavecchia A.Curr Opin Immunol 1996；8：348-354.)。用甘露糖配体靶向的脂质体共递送同一递送介质内的DNA和蛋白质(而且还可能共递送至同一靶细胞)还未见报道。
通过测量抗乙肝病毒表面抗原(HBsAg)抗体应答，对制剂(表4和5)免疫后产生的免疫应答进行了测定。结果图示于图5和6。制剂2.1是由用同一脂质体制剂共递送的DNA和蛋白质组成的，对于每一测试血样(第28天和第56天(第二剂量免疫后第28天))制剂2.1都能够激发比其他所有制剂更强的免疫应答。这种共配制制剂激发的免疫应答在OD450nm血清稀释度和滴度(终点OD阅读值为0.3单位)的数值都最大。
除2.1之外的其他含DNA的制剂(制剂2.3)激发产生的免疫应答与此前使用位于不含甘露糖脂类(DOGP4aMan)的相同(PC∶DOPE∶DOTAP)脂质体囊泡中的同一DNA产物(DNA剂量为10μg)公开的结果(GregoriadisG.Pharm Res.1998，15(5)：661-70)一致。使用与本发明所述相同的DNA(非编码，ISS容积控制)和蛋白质产物，脂质体中质粒DNA的免疫佐剂作用此前已有报道(Gursel M et al.Vaccine 1999：17：1376-1383)。该文献报道用于抗原-pDNA共包埋制剂中的DNA成分的佐剂作用是适度的，大约3倍滴度，在两份剂量免疫后。类似结果例示于图6，当使用编码(HBsAg)的DNA成分时(制剂2.1)应答提高了30倍(相对于制剂2.2)。因此，HBsAg蛋白和其合适(同源)质粒共配制的协同作用超过DNA的免疫佐剂效果，根据例如Gursel或Klinman(Klinman，D et al.Vaccine 1999 19：25 19-26)观察的单独CpG基元的作用大约为3倍。
总之，我们已经发现本发明在施用给受试者时能够高效地激发免疫应答。所述应答包括抗体应答。本发明带来的改进包括脂质体形成材料和与脂质体结合的可操作编码抗原性蛋白的核酸及共递送蛋白质组成的组合物，所述脂质体形成材料包括甘露糖基化脂类成分，其中共递送的蛋白质与抗原性蛋白具有相同的表位。
实施例3
对流感病毒攻击的保护
材料和方法
脂类
鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2-二油酰-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)购自Sigma Chemical Co.，UK。所有脂类都溶于氯仿中(-20℃)保存，用氮净化.
DNA
pl.18/PR8-HA(称为DNA HA)由Dr J.Robertson(NIBSC，UK)提供，其中含有来自A群流感病毒/Puerto Rico/8/34株的全长HA。剂量免疫用的质粒是Aldevron(Fargo，USA)的商业化产品，含有＜100内毒素单位(EU)/mg DNA，并且没有检测到任何残留蛋白质。
蛋白质
A群流感病毒/Puerto Rico/8/34株完整灭活蛋白(蔗糖梯度纯化，主要蛋白HA，参考抗原HA)获自NIBSC，UK。
制备脂质体组合物
简而言之，将由鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)和1，2-二油酰氧-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)(4∶2∶1摩尔比)通过超声处理制成的小单层囊泡(SUV)与DNA(参考DNA HA)和蛋白质(参考抗原HA)混和，见表7。制剂按四份平行方式制备，其中两管用于剂量免疫(基础和加强免疫)，另两管用于根据加入包埋物质中的放射标记示踪剂计算包埋百分比(HA；DNA和蛋白质)，然后冻干过夜，描述见Gregoriadis，G.，Saffie，R.and Hart，S.L.High yield incorporation of plasmid DNA withinliposome：effect on DNA integrity and transfection efficiency，J DrugTargeting.1996，3(6)，467-475和Kirby，C.，Gregoriadis，G.Dehydration-Rehydration Vesicles(DRV)：A new method for high yield drugentrapment in liposomes.Biotechnology.1994，2，979-984。在控制条件下再水化后，将得到的脱水-再水化囊泡(DRV脂质体)离心洗涤将未掺入物质除去。将洗涤后的沉淀用PBS重悬得到所需的剂量体积。脂质体中DNA和/或蛋白质的掺入量根据悬浮沉淀物回收的35S(对于DNA)和125I(对于蛋白质)放射活性来计算。25℃下用Malvern Zetasizer 3000对脂质体进行微量电泳和光子相关光谱分析法(PCS)处理，分别测定其表面电位(ZP)和z-平均直径。
动物学试验
将6-12周龄的雌性Balb/c小鼠(Harlan，UK)通过皮下注射施用0.2ml剂量体积。最终剂量一并列于表7。小鼠在第0和第28天接受了两份免疫剂量的抗原，在第一次注射后的第21天(第一次剂量免疫之后)和第42天(第二次剂量免疫之后)从尾静脉采集血样。
表7
| 组 | 每只动物接种总剂量 | ||
| DNAμg | 蛋白质(HA)μg | 脂mg | |
| 3.1 | 10 | 1.5 | 2.1 |
| 3.2 | 10 | 0.5 | 2.1 |
| 3.3 | 10 | 1.5 | 非脂质体递送的混和的(DNA+蛋白质) |
| 3.4 | 0 | 0 | 0(PBS) |
活流感病毒攻击
在英国生物学标准与控制研究院，UK(NIBSC)内，在第一次免疫后第57天用约10 MID50(50％小鼠感染剂量)的小鼠适应活流感病毒(A/Puerto Rico/8/34)对小鼠进行攻击，该病毒溶于含2％(w/v)BSA的PBS中。将病毒以50μl体积通过两侧鼻孔滴鼻的方式施用给未经麻醉的小鼠。攻毒后隔日，每只小鼠用0.5ml含2％(w/v)BSA的PBS冲洗鼻腔。取样后，立即测定鼻腔洗液样本中脱落流感病毒的存在。将溶于无血清Eagle氏最低要求培养基的鼻腔洗液样本加入96-孔组织培养平板内经TPCK-胰蛋白酶处理后的MDCK细胞融合单层。35℃下孵育3天后，通过取上清液50μl与等体积的0.7％(v/v)火鸡红细胞孵育，测定细胞内病毒的存在。病毒阳性样本出现明显的血凝反应(血凝斑清晰可见)。
血清ELISA
将血样获得的血清用PBS稀释，-20℃保存直至酶联免疫吸附测定(ELISA)试验。将验证结合的化学96孔板用流感病毒HA-PR8抗原(20μg/ml)PBS溶液按50μl/孔的量过夜包被。4℃下过夜孵育后，将各孔用PBS/Tween 20TM(PBST)洗涤4次，然后用200μl 2％(w/v)BSA PBS溶液包被各孔。37℃下孵育2小时后，去除封闭液，用PBST洗孔4次，然后被覆以不同试验血清(单个动物血样)的稀释液，以1/100的稀释度起始(50μl样本/孔)。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆兔抗鼠Ig-HRP偶联血清(Dako)。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆底物溶液3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB，Pierce)。加入50μl/孔终止液(2M硫酸)终止反应，450nm下测定各孔的吸光度(OD)。
结果
脂质体的物理特性(产品(DNA和/或蛋白质)包埋百分率，颗粒大小以及表面电位(Z))概述于表8。
表8
| 第一剂量 | 第二剂量 | 第一剂量 | 第二剂量 | |||||
| 组 | 包埋百分率 | 包埋百分率 | 大小nm | 电位mV | 大小nm | 电位mV | ||
| DNA | 蛋白质 | DNA | 蛋白质 | |||||
| 3.1 | 80.0 | 78.9 | 89.3 | 91.1 | 913 | ND | 820 | 43 |
| 3.2 | 85.6 | 81.5 | 92.2 | 91.0 | 821 | ND | 906 | 43 |
ND＝未测定。
抗体应答(血清ELISA)表示为Log10血清稀释度测得的OD信号平均值(n＝5动物/组)±标准偏差(SEM)。结果图示于图7和图8，图7给出的是一份免疫剂量的应答，图8给出的是两份免疫剂量后的结果。
活病毒攻毒试验的结果显示于表9，表示为得到的鼻腔洗液样本中能检测到病毒的动物占每组动物(攻毒动物数n＝15)的百分比。
表9
| 组 | 第1天 | 第2天 | 第3天 | 第4天 | 第5天 |
| 3.1 | 0 | 0 | 3.3 | 30 | 3.6 |
| 3.2 | 6.7 | 6.7 | 53.3 | 50 | 3.3 |
| 3.3 | 0 | 35.7 | 39.3 | 60.7 | 50 |
| 3.4 | 0 | 66.7 | 93.3 | 100 | 82.1 |
讨论
通过测量抗流感病毒(A/PR8株特异性)应答，对制剂(表7)免疫后产生的免疫应答进行了测定。结果图示于图7和8。组(制剂)3.1是由用同一脂质体制剂共递送的HA DNA和蛋白质组成的，对于每一测试血样(第21天和第42天(第二剂量免疫后第14天))制剂3.1都能够激发比其他所有制剂更强的免疫应答。这种共配制制剂组(3.1)激发的免疫应答在OD450nm血清稀释度和滴度(终点OD阅读值为0.3单位)的数值都最大。
与之相一致的是，混合的HA DNA和蛋白质这样的有效荷载成分激发的免疫应答弱于共递送的相同有效荷载成分(组3.1)。实际上，使用相同的脂质体介质其中DNA有效荷载量相同(DNA剂量为10μg)但蛋白质有效荷载量减少(蛋白质剂量为0.5μg)(组3.2)，这种情况下激发的血清Ig免疫应答与蛋白成分有效荷载量高3倍的HA DNA与蛋白质混合物(组3.3)强度相等。组3.4没有能够激发产生任何特异性的抗流感Ig免疫应答，但是由于这一组没有接受任何免疫原性成分(只有PBS)，因而这一结果在意料之中。
活病毒攻毒试验的结果是用来查明：制剂免疫后小鼠体内诱导的免疫应答是否足以保护动物免受病毒感染。组3.4可以用作阴性对照，因为它们是完全“新生的”动物，因而能够反映攻毒后病毒感染的一般规律。该组(3.4)中，到第4天时所有动物全部感染了病毒，平均感染率为(5天以上)有68％(sem 18％)的动物被感染。在诱导抗流感免疫应答时，组3.3是由混合的但并非脂质体共递送的HA DNA和蛋白质的有效荷载成分组成的(图7)，这种情况下没有表现出动物感染百分比的明显降低(相对于组3.4)，动物感染的平均百分比(5天以上)为37％(sem 10％)。组(制剂)3.1是由同一脂质体制剂中共递送的HA DNA和蛋白质组成的，产生了比所有其他组(制剂)都更强的应答，抗体应答见图7和8，而且动物感染百分比明显(相对于组3.4)(p＜0.05)降低，动物感染的平均百分比(5天以上)仅为7％(sem 6％)。
总之，我们已经发现本发明能够高效激发免疫应答，当有感染力生物体施用给受试者时该免疫应答能够保护个体免受感染。所述应答包括抗体应答。本发明带来的改进包括由递送着有效载荷的脂质体形成材料组成的组合物，所述有效载荷为可操作编码抗原性蛋白的核酸以及与其共递送的蛋白质，其中共递送的蛋白质与所述抗原性蛋白具有相同的表位。
实施例4-多价流感病毒疫苗
材料和方法
脂类
鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和1，2-二油酰-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)购自Sigma Chemical Co.，UK。所有脂类都溶于氯仿中(-20℃)保存，用氮净化。
DNA
质粒pI17/HA-Sichuan和pI.18/PR8-HA由Dr J.Robertson(NIBSC，UK)(Johnson，P et al.J.Gen.Virol.2000，1737-1745)提供，其中分别含有源自A群流感病毒/Sichuan/2/87株和A群流感病毒/Puerto Rico/8/34株的全长HA。剂量免疫(dosing)用的质粒都是Aldevron(Fargo，USA)的商业化产品，含有＜100内毒素单位(EU)/mg DNA，并且没有检测到任何残留蛋白质。
蛋白质
A群流感病毒/Sichuan/2/87株和A群流感病毒/Puerto Rico/8/34株的完整灭活病毒蛋白(蔗糖梯度纯化，主要蛋白HA，参考抗原HA)获自NIBSC，UK。
制备脂质体组合物
简而言之，将由鸡蛋磷脂酰胆碱(PC)和二油酰磷脂酰胆碱(DOPE)和1，2-二油酰氧-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)(4∶2∶1摩尔比)通过超声处理制成的小单层囊泡(SUV)与pI17/HA-Sichuan DNA及A群流感病毒/Sichuan/2/87株病毒蛋白或者pI.18/PR8-HA DNA及A群流感病毒/Puerto Rico/8/34株病毒蛋白混合(参见表10)。制剂按两份平行方式制备，其中一管用于剂量免疫，另一管用于根据加入包埋物质中的放射标记示踪剂计算包埋百分比(HA；DNA和蛋白质)，然后冻干过夜，描述见Gregoriadis，G.，Saffie，R.and Hart，S.L.High yield incorporation ofplasmid DNA within liposome：effect on DNA integrity and transfectionefficiency，J Drug Targeting.1996，3(6)，467-475和Kirby，C.，Gregoriadis，G.Dehydration-Rehydration Vesicles(DRV)：A new method for high yielddrug entrapment in liposomes.Biotechnology.1994，2，979-984。在控制条件下再水化后，将得到的脱水-再水化囊泡(DRV脂质体)离心洗涤将未掺入物质除去。将洗涤后的沉淀用PBS重悬得到所需的剂量体积。脂质体中DNA和/或蛋白质的掺入量根据悬浮沉淀物回收的35S(对于DNA)和125I(对于蛋白质)放射活性来计算。25℃下用Malvern Zetasizer 3000对脂质体进行微量电泳和光子相关光谱分析法(PCS)处理，分别测定其表面电位(ZP)和z-平均直径。
动物学试验
将6-12周龄的雌性Balb/c小鼠(Harlan，UK)通过皮下注射施用0.2ml剂量体积。最终剂量列于表10。小鼠在第0天接受了一份免疫剂量，第14天和第28天从小鼠尾静脉采集血样。组4.3的脂质体组合物是用组4.1和4.2的组合物在临施用前现时混合而成的。
表10
| 组(制剂) | 总剂量/动物 | ||||
| pI17/HA-Sichuan DNA | A/Sichuan/2/87病毒蛋白 | pI.18/PR8-HA DNA | A/PuertoRico/8/34病毒蛋白 | 脂类mg | |
| 4.1 | 10μg | 1.5μg | -- | -- | 2.1 |
| 4.2 | -- | -- | 10μg | 1.5μg | 2.1 |
| 4.3 | 10μg | 1.5μg | 10μg | 1.5μg | 4.2 |
| 4.4 | -- | -- | -- | -- | 0(PBS) |
血清ELISA
将血样获得的血清用PBS稀释，-20℃保存直至酶联免疫吸附测定(ELISA)试验。根据要检测蛋白质底物的不同使用了两种不同方法。
对于HA-PR8，将验证结合的化学96孔板用流感病毒HA-PR8抗原的(20μg/ml)PBS溶液按50μl/孔的量包被。4℃孵育过夜后，将各孔用PBS/Tween 20TM(PBST)洗涤4次，然后用200μl 2％(w/v)BSA PBS溶液包被各孔。37℃下孵育1小时后，去除封闭液，用PBST洗孔4次，然后按50μl样本/孔的量被覆以不同试验血清(单个动物血样)的稀释液，以1/100的稀释度起始。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆兔抗鼠Ig-HRP偶联血清(Dako)。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆底物溶液3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB，Pierce)。加入50μl/孔终止液(2M硫酸)终止反应，450nm下测定各孔的吸光度。
对于HA-Sichuan而言，将验证结合的化学96孔板用0.1M碳酸盐缓冲液(pH9.6)1/2000倍稀释的绵羊抗HA/Sichuan血清(NIBSC标准试剂)按50μl/孔的量包被。4℃孵育过夜后，将各孔用PBS/Tween 20TM(PBST)洗涤4次，然后用200μl 2％(w/v)BSA PBS溶液包被各孔。37℃下孵育1小时后，去除封闭液，用PBST洗孔4次，然后按50μl样本/孔的量被覆以HA-Sichuan抗原的(5μg/ml)PBS溶液。37℃下孵育1小时后，除去抗原溶液，用PBST洗涤板孔4次，然后按50μl样本/孔的量被覆以不同试验血清(单个动物血样)的稀释液，以1/100的稀释度起始。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆兔抗鼠Ig-HRP偶联血清(Dako)。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆底物溶液3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB，Pierce)。加入50μl/孔终止液(2M硫酸)终止反应，450nm下测定各孔的吸光度(OD)。
结果
物理特性(产品(DNA和/或蛋白质)包埋百分率，颗粒大小以及表面电位(Z))总结于表11。
表11
| 组 | 包埋百分率(％) | 大小nm | 电位mV | |
| DNA | 蛋白质 | |||
| 4.2 | 96.7 | 92.2 | 676 | 48.4 |
| 4.1 | 93.9 | 87.4 | 816 | 42.7 |
抗体应答(血清ELISA)表示为Log10血清稀释度测得的OD信号平均值(n＝5动物/组)OD±SEM。结果表示于图9a-d。
讨论
通过测量抗流感病毒HA-PR8株和HA-Sichuan株特异性抗体应答，，对制剂(表10)免疫后产生的免疫应答进行了测定。结果图示于图9a-d。
在第14天，除制剂4.4(PBS)外，所有试验组都检测到了抗流感抗原的显著抗体应答。制剂4.3是由流感病毒Sichuan和流感病毒Puerto Rico8这两株病毒的HA DNA和蛋白质组成的，用制剂4.3免疫诱导产生的抗每一株病毒的抗体滴度与用制剂4.1或制剂4.2免疫后诱导产生的抗体滴度在标准偏差(SEM)范围之内都是相等的。
在第28天，抗流感病毒抗原的抗体应答与第14天时相比显著增强。此外，用由流感病毒Sichuan和流感病毒Puerto Rico 8这两株病毒的HADNA和蛋白质组成的制剂4.3免疫，诱导产生的抗流感病毒Sichuan株的抗体滴度与用制剂4.1(流感病毒Sichuan株DNA和蛋白质)免疫后诱导产生的抗体滴度在标准偏差范围内是相等的。但是，用由流感病毒Sichuan和流感病毒Puerto Rico 8这两株病毒的HA DNA和蛋白质组成的制剂4.3免疫诱导产生的抗流感病毒Puerto Rico 8株的抗体滴度，在所测试的两种稀释度下都低于用制剂4.2(流感病毒Puerto Rico 8株)诱导产生的抗体滴度。
总之，我们发现：当多价(例如多毒株)递送时，本发明能够高效诱导抗该制剂中不同毒株的抗体应答。这种抗体应答发展快速(仅在单次免疫后的14天就产生了＞1000的抗原特异性抗体滴度)，其水平与本发明仅递送一株病毒的DNA和蛋白质(例如单价制剂)时诱导产生的抗体水平相等。即使用多价制剂免疫时偶尔会出现其中一株的抗体应答低于用相同单价制剂时的抗体水平，但是该应答的水平仍然是很高的(＞1000滴度)，并且随时间而升高。因此，本发明的改进，如该试验显示的那样，在于能够诱导产生抗数株不同抗原性毒株的显著免疫应答，在用含有源自所有这些毒株的DNA和蛋白质的制剂单次免疫后。
实施例5-DNA和蛋白质的包埋水平以及脂质体大小
用实施例1所述配制脂质体的一般方法，按蛋白不同水平包埋乙肝病毒表面抗原和编码抗原的质粒DNA，如表12所示。包埋百分比数值列于表12，表13给出的是脂质体的平均大小和表面电位。
表12
将HbsAg蛋白质和/或HbsAg编码DNA包埋入脂质体
| DNA | 蛋白质 | 脂类PC∶DOPE∶DOTAP | 包埋百分率(％) | ||
| DNA | 蛋白质 | ||||
| 5.1 | 62.0μg | 17.68μg | 9.07∶4.53∶2.27μM6.96+3.37+1.59mg(总脂类11.92mg) | 98.9 | 64.4 |
| 5.2 | 62.0μg | 3.536μg | 9.07∶4.53∶2.27μM6.96+3.37+1.59mg(总脂类11.92mg) | 100 | 76.4 |
| 5.3 | 62.0μg | 0.697μg | 9.07∶4.53∶2.27μM6.96+3.37+1.59mg(总脂类11.92mg) | 100 | 66.2 |
| 5.4 | - | 17.68μg | 9.07∶4.53∶2.27μM6.96+3.37+1.59mg(总脂类11.92mg) | - | 74.9 |
| 5.5 | - | 3.536μg | 9.07∶4.53∶2.27μM6.96+3.37+1.59mg(总脂类11.92mg) | - | 80.4 |
| 5.6 | - | 1.23μg | 9.07∶4.53∶2.27μM6.96+3.37+1.59mg(总脂类11.92mg) | - | 93.8 |
表12表明：DNA的包埋是高效的，而HbsAg蛋白的包埋效率略差一些。质粒DNA的存在对蛋白质的包埋效率有一定不利影响。但是，当蛋白质和DNA被一起包埋时，对DNA的包埋没有任何不利影响。这些数据表明DNA和蛋白质在这些脂质体制剂中的有效共包埋并非是A群流感病毒血凝素或者任一种质粒所特有的现象。有可能DNA和蛋白质的有效共包埋是这些脂质体组合物本身的常规属性，实际上可以适用于质粒DNA和蛋白质抗原的任一组合。
表13用于HbsAg制剂的脂质体的Z平均尺寸(nm)和表面电位(mV)
| 制剂 | 尺寸nm | 表面电位mV |
| 5.15.25.35.45.55.6 | 547710704666694639 | +45+37+39+41+33-10 |
从脂质体制剂的这些数据和实施例2、3和4的结果可以明显看出：所述尺寸范围是适合被经典的抗原提呈细胞摄取的，例如巨嗜细胞和树突状细胞。来自这些脂质体的材料要被B细胞摄取可能还需要在体内一定程度的破碎和降解，或者是让脂质体制剂的不均一群体发展成为小尺寸脂质体。
实施例6-非磷脂制剂
囊泡材料
材料 1-单棕榈酰-rac-甘油(C16:0)(Monopal)、胆固醇(CHOL)和3β-[N-N′N′-二甲氨乙烷)-氨甲酰]胆固醇(DC-Chol)购自Sigma ChemicalCo.，UK。所有脂类都溶于氯仿中(-20℃)保存，用氮净化。
DNA
质粒pCI-OVA(参考DNA OVA)(由Dr.T.Nagata，HamamatsuUniversity School of Medicine，Japan惠赠)中含有克隆入位于CMV增强子/启动子区域下游的pCI质粒(Promega，Madison，WI)EcoRl位点的鸡蛋白蛋白(卵白蛋白，OVA)cDNA(Yoshida A，Nagata T，Uchijima M，HigashiT.Koide Y.Advantage of gene gun-mediated over intramuscular inoculationof plasmid DNA vaccine in reproducible induction of specific immuneresponse.Vaccine.2000，18，1725-1729)。质粒pl.18/PR8-HA(参考DNAHA)由Dr J.Robertson(NIBSC，UK)提供，其中含有源自A群流感病毒/Puerto Rico/8/34株的全长HA。剂量免疫(dosing)用的质粒是Aldevron(Fargo，USA)的商业化产品，含有＜100内毒素单位(EU)/mg DNA，并且没有检测到任何残留蛋白质。
蛋白质
A群流感病毒/Puerto Rico/8/34株完整灭活病毒蛋白(蔗糖梯度纯化，主要蛋白HA，参考抗原HA)获自NIBSC，UK。
制备组合物
在真空条件下，将Monopal和Chol和DC-Chol(4∶2∶1摩尔比)通过膜干燥(film drying)技术制备成递送系统介质。将得到的膜用水水化，60℃下振摇1小时，凉至室温(RT)后，将其与DNA(参考DNA HA orDNA OVA)和/或蛋白质(参考抗原HA)混合，参见表14。制剂按四份平行方式制备，其中两管用于剂量免疫(基础和加强免疫)，另两管用于根据加入包埋物质中的放射标记示踪剂计算包埋百分比(DNA和蛋白质)，然后冻干过夜，描述见Gregoriadis，G.，Saffie，R.and Hart，S.L.High yieldincorporation of plasmid DNA within liposome：effect on DNA integrity andtransfection efficiency，J Drug Targeting.1996，3(6)，467-475和Kirby，C.，Gregoriadis，G.Dehydration-Rehydration Vesicles(DRV)：A new method forhigh yield drug entrapment in liposomes.Biotechnology.1994，2，979-984。在控制条件下再水化后，将得到的脱水-再水化囊泡(DRV)离心洗涤将未掺入DNA除去。将洗涤后的沉淀用PBS重悬得到所需的剂量体积。脂质体中DNA和/或蛋白质的掺入量根据悬浮沉淀物回收的35S(对于DNA)和125I(对于蛋白质)放射活性来计算。25℃下用Malvern Zetasizer 3000和Malvern Mastersizer对脂质体进行微量电泳和使用激光衍射，分别测定其表面电位(ZP)和z-平均直径。
动物学试验
将6-12周龄的雌性Balb/c小鼠(Harlan，UK)通过皮下注射施用0.2ml剂量体积。最终剂量一并列于表14。小鼠在第0和第28天接受了两份免疫剂量的抗原，在第一次注射后的第21天(第一次剂量免疫之后)和第42天(第二次剂量免疫之后)从尾静脉采集血样。
表14
| 组(制剂) | 总剂量/动物 | ||
| DNA μg | 蛋白质(HA)μg | 赋形剂mg | |
| 6.1 | 10 (HA) | 1.5 | 5.7 |
| 6.2 | 10 (OVA) | 1.5 | 5.7 |
| 6.3 | 10 (HA) | 1.5 | 11.4 |
| 6.4 | 0 | 1.5 | 5.7 |
| 6.5 | 10 (HA) | 0 | 5.7 |
| 6.6 | 0 | 1.5 | 0(PBS) |
在组6.1和6.2的组合物中，DNA和蛋白质是共包埋的。在组6.3的组合物中，DNA和蛋白质是分别包埋然后再混合的，即其就是组6.4和6.5的混合。在组6.6中，蛋白质未被包埋。
血清ELISA
将血样获得的血清用PBS稀释，-20℃保存直至酶联免疫吸附测定(ELISA)试验。将验证结合的化学96孔板用流感病毒HA-PR8抗原(20μg/ml)PBS溶液按50μl/孔的量过夜包被。4℃下过夜孵育后，将各孔用PBS/Tween 20TM(PBST)洗涤4次，然后用200μl 2％(w/v)BSA PBS溶液包被各孔。37℃下孵育2小时后，去除封闭液，用PBST洗孔4次，然后被覆以不同试验血清(单个动物血样)的稀释液，以1/100的稀释度起始(50μl样本/孔)。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆兔抗鼠Ig-HRP偶联血清(Dako)。37℃下孵育1小时后，平板用PBST洗涤4次，然后按50μl/孔的量被覆底物溶液3，3’，5，5’四甲基联苯胺(TMB，Pierce)。加入50μl/孔终止液(2M硫酸)终止反应，450nm下测定各孔的吸光度(OD)。
结果
脂质体的物理特性(产品(DNA和/或蛋白质)包埋百分率，颗粒大小以及表面电位(Z))概述于表15。
表15
| 第1份剂量 | 第2份剂量 | 第1份剂量 | 第2份剂量 | |||||
| 组 | 包埋百分率(％)DNA 蛋白质 | 包埋百分率(％)DNA 蛋白质 | 大小nm | 电位mV | 大小nm | 电位mV | ||
| 6.1 | 96.7 | 89.7 | 98.3 | 88.0 | 4140 | 23 | 3770 | ND |
| 6.2 | 94.6 | 90.2 | 79.4 | 82.8 | 4620 | 23.9 | 2950 | ND |
| 6.4 | ND | 86.9 | ND | 92.8 | 4550 | 23.6 | 4060 | ND |
| 6.5 | 97.2 | ND | 97.2 | ND | 4150 | 24.9 | 3580 | ND |
ND＝未测定。
动物个体(n＝5/组)的抗体应答(血清ELISA)表示为OD读数达到0.270所需血清稀释度的倒数(终点稀释度，1/100稀释度测得的~x2正常小鼠血清)。结果表示于图10。
讨论
通过测量抗流感病毒(A/PR8株特异性)应答，对制剂(表14)免疫后产生的免疫应答进行了测定。结果图示于图10。组(制剂)6.1是由用同一脂质体制剂共递送的HA DNA和蛋白质组成的，它产生比除制剂6.2外其他所有制剂更强的免疫应答。
结果表明：与蛋白质单用相比，HA蛋白采取递送方式并没有带来任何优势(组6.4相对于组6.6而言)，HA DNA单独递送没有任何产生显著抗体应答(组6.5)，实际上5只动物中有4只没有激发产生强于试验检测下限的应答(1/100稀释的血清)，将分别处于独立介质中的HA DNA和蛋白质混合递送(组6.3)，相对于蛋白单用或介质递送蛋白(分别对应组6.6和6.4)并没有获得任何优势，而将HA蛋白与DNA(HA或OVA，组6.1和6.2)成分共递送能够产生比混合递送物质或单独递送物质(分别对应组6.3，6.4，6.5和6.6)都明显强的抗HA应答。
在本发明中，最终的观察结果适合于“同源的”和“不相关的”DNA成分。测试的免疫系统应答仅限于抗体应答，细胞介导的免疫应答(辅助T细胞，CTL等)还未测定。因此，在针对“同源”和“不相关的”DNA组(组6.1 and 6.2)的免疫应答还不能做出同样的结论。实际上，已经发现用HA DNA单独免疫(Plasmid DNA encoding influenza virushaemagglutinin induces Thl cells and protection against respiratory infectiondespite its limited ability to generate antibody responses.Johnson PA.Conway MA，Daly J，Nicolson C，Robertson J，Mills KH.：J Gen Virol.2000Jul；81(Pt7)：1737-45.)能够提供抗流感病毒攻毒的保护，此时没有抗体应答产生因而仅仅依靠的是细胞介导的免疫应答。由于″同源″共递送的组6.1含有HA DNA作为制剂的活性成分，而“不相关”共递送的组6.2不含有HA DNA作为制剂的活性成分，所以看起来认定组6.1诱导产生了另外一种还未经测量的细胞介导免疫应答是没有道理的。
总之，我们已经发现本发明能够高效激发免疫应答。所述应答包括抗体应答。本发明带来的改进包括由递送着有效载荷的不含磷脂成分的递送介质组成的组合物，所述有效载荷为可操作编码抗原性蛋白的核酸以及与其共递送的蛋白质。
Claims (24)
1.一种用于将核酸和辅助蛋白共递送至细胞的组合物，其中含有两性成分形成的囊泡，其中所述核酸可操作地编码一种抗原性蛋白或其部分，该抗原性蛋白或其部分与所述辅助蛋白之间共有至少1个表位，含所述核酸和所述辅助蛋白的组合物与同一囊泡彼此结合在一起。
2.上述任一项权利要求所述组合物，其中所述囊泡是由脂质体形成材料形成的脂质体，所述核酸和所述辅助蛋白与该脂质体结合在一起。
3.权利要求2所述组合物，其中所述核酸被包埋在脂质体囊泡内空间。
4.权利要求2或3所述组合物，其中所述辅助蛋白在脂质体外表面上可以接近。
5.上述任一项权利要求所述组合物，其中所述两性成分包括至少一种带有阳离子电荷的成分，其含量足以使囊泡带有总正电荷。
6.权利要求5所述组合物，其中阳离子成分选自1，2-双(油酰氧)-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)、1，2-双(十六烷基氧)-3-三甲氨丙烷(BisHOP)，β-[1-(2，3-二油酰氧)丙基]-N，N，N-氯化三乙铵(DOTMA)和3β[N-N′N′-二甲氨乙烷)-氨甲酰]胆固醇(DC-Chol)。
7.上述任一项权利要求所述组合物，其中所述核酸包括不止一种的核酸分子，其中的每一种都编码一种不同的抗原性蛋白，其中所述辅助蛋白包括与每一种所述抗原性蛋白具有相同表位的相应蛋白。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述核酸分子与同一囊泡结合在一起。
9.上述任一项权利要求所述组合物，其中所述的抗原性蛋白和辅助蛋白源自病毒，优选为流感病毒。
10.上述任一项权利要求所述组合物，其中所述的核酸分子为DNA，优选为质粒DNA。
11.上述任一项权利要求所述组合物，其为疫苗。
12.权利要求11所述的组合物，该组合物经过调整适于皮下、肌肉内、静脉内、皮内、鼻内、口内、其他粘膜或肺途径施用。
13.一种在动物中产生免疫应答的方法，是向该动物施用权利要求1-12中任一项所述组合物。
14.权利要求13所述的方法，其中所述的免疫应答包括特异性针对所述抗原性蛋白和/或辅助蛋白的免疫应答。
15.权利要求13或14所述的方法，其中所述的免疫应答包括刺激细胞毒性T-淋巴细胞。
16.权利要求13-15中任一项所述方法，该方法能够赋予抗感染性因子感染的免疫力，优选为病毒。
17.一种制备脂质体组合物的方法，该方法包括下列步骤：
(a)提供一种由脂质体形成材料形成的小单层囊泡(SUVs)的含水悬液；
(b)让上述SUV含水悬液与核酸接触形成一种SUV-核酸悬液，该核酸可操作地编码一种抗原性蛋白；
(c)将SUV-核酸悬液脱水提供一种脱水混合物；以及
(d)将上述脱水混合物用含水重悬介质再水化形成一种含核酸脂质体的悬液。
其中包括下述步骤：导入辅助蛋白，从而使含核酸脂质体与所述辅助蛋白结合在一起。
18.权利要求17所述的方法，其中让所述辅助蛋白在步骤b前、中或后以及步骤c之前与SUV含水悬液接触。
19.权利要求17所述的方法，其中所述辅助蛋白存在于重悬介质中。
20.权利要求17-19中任一项所述方法，其中所述脂质体形成材料含有至少一种磷脂以及至少一种胆固醇。
21.权利要求20中所述的方法，其中所述材料包括至少一种阳离子化合物，所述脂质体具有总正电荷。
22.权利要求17-21中任一项所述方法，其中核酸与脂质体形成材料之间的重量百分比为1∶100-1∶1000，优选为1∶100-1∶300。
23.权利要求17-22中任一项所述方法，其中核酸与辅助蛋白之间的重量百分比为1000∶1-1∶1，优选为30∶1-5∶1.
24.权利要求17-23中任一项所述方法，其中所述的脱水是通过冷冻-干燥实现的。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102068698A (zh) * | 2009-11-24 | 2011-05-25 | 深圳先进技术研究院 | 纳米疫苗及其制备方法 |
| CN108593936A (zh) * | 2011-06-29 | 2018-09-28 | 塞尔雷斯蒂斯有限公司 | 具有增强灵敏度的细胞介导免疫应答测定 |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6740323B1 (en) * | 1999-11-24 | 2004-05-25 | Chiron Corporation | HBV/HCV virus-like particle |
| WO2004004758A1 (en) * | 2002-07-05 | 2004-01-15 | Lipoxen Technologies Limited | Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination |
| AU2005321904B2 (en) * | 2004-12-29 | 2012-07-12 | Mannkind Corporation | Methods to elicit, enhance and sustain immune responses against MHC class I-restricted epitopes, for prophylactic or therapeutic purposes |
| TW200800235A (en) * | 2005-10-18 | 2008-01-01 | Otsuka Pharma Co Ltd | Carrier composition for nucleic acid transport |
| US8877206B2 (en) | 2007-03-22 | 2014-11-04 | Pds Biotechnology Corporation | Stimulation of an immune response by cationic lipids |
| JP5971945B2 (ja) | 2008-04-17 | 2016-08-17 | ピーディーエス バイオテクノロジー コーポレイションＰｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ | カチオン性脂質の鏡像異性体による免疫応答の刺激 |
| GB0815872D0 (en) * | 2008-09-01 | 2008-10-08 | Pasteur Institut | Novel method and compositions |
| EP2184054A1 (en) | 2008-11-08 | 2010-05-12 | Lipoxen Technologies Limited | Small Interfering RNA Delivery |
| WO2011005772A1 (en) | 2009-07-06 | 2011-01-13 | Variation Biotechnologies, Inc. | Methods for preparing vesicles and formulations produced therefrom |
| BR112012000826B1 (pt) | 2009-07-06 | 2022-07-26 | Variation Biotechnologies Inc | Método para a preparação de vesículas |
| RU2448685C2 (ru) * | 2009-11-30 | 2012-04-27 | Российская Федерация в лице Министерства промышленности и торговли Российской Федерации | Липосомы, содержащие олигопептиды - фрагменты основного белка миелина, фармацевтическая композиция и способ лечения рассеянного склероза |
| AU2011276223C1 (en) | 2010-07-06 | 2016-05-12 | Variation Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for treating influenza |
| WO2012006378A1 (en) | 2010-07-06 | 2012-01-12 | Novartis Ag | Liposomes with lipids having an advantageous pka- value for rna delivery |
| LT3243526T (lt) | 2010-07-06 | 2020-02-10 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Rnr pristatymas, skirtas keleto imuninio atsako paleidimui |
| DK2591114T3 (en) | 2010-07-06 | 2016-08-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunization of large mammals with low doses of RNA |
| WO2012006368A2 (en) * | 2010-07-06 | 2012-01-12 | Variation Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for treating influenza |
| DK2611461T3 (da) | 2010-08-31 | 2022-05-16 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Pegylerede liposomer til afgivelse af RNA, der koder immunogen |
| WO2012051211A2 (en) | 2010-10-11 | 2012-04-19 | Novartis Ag | Antigen delivery platforms |
| BR112013017939B1 (pt) | 2011-01-13 | 2022-11-16 | Variation Biotechnologies Inc | Composição imunogênica liofilizada termoestável, uso e método para preparação da mesma |
| ES2656050T3 (es) | 2011-07-06 | 2018-02-22 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas |
| EP3508219A1 (en) | 2011-07-06 | 2019-07-10 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Self-replicating rna prime - protein boost vaccines |
| EP2802353A4 (en) | 2012-01-12 | 2015-12-02 | Variation Biotechnologies Inc | COMPOSITIONS AND METHOD FOR THE TREATMENT OF VIRUS INFECTIONS |
| US20150079077A1 (en) | 2012-01-27 | 2015-03-19 | Variation Biotechnologies, Inc. | Methods and compositions for therapeutic agents |
| EP2836229B1 (en) * | 2012-04-11 | 2018-12-05 | Lipoxen Technologies Limited | Liposomes containing oligopeptide fragments of myelin basic protein, a pharmaceutical composition and a method for treatment of multiple sclerosis |
| RU2649365C2 (ru) | 2012-06-15 | 2018-04-02 | ПиДиЭс БАЙОТЕКНОЛОДЖИ КОРПОРЭЙШН | Вакцинные композиции с катионными липидами и способы применения |
| EP2897639A4 (en) | 2012-09-21 | 2016-05-04 | Frank Bedu-Addo | IMPROVED VACCINE COMPOSITIONS AND METHODS OF USE |
| CN104922666A (zh) * | 2014-03-21 | 2015-09-23 | 中国科学院苏州纳米技术与纳米仿生研究所 | 超小氧化石墨烯-金纳米粒子免疫复合物及其制备方法 |
| WO2016045732A1 (en) * | 2014-09-25 | 2016-03-31 | Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh | Stable formulations of lipids and liposomes |
| CA3005251A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | Pds Biotechnology Corporation | Lipids as synthetic vectors to enhance antigen processing and presentation ex-vivo in dendritic cell therapy |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| ES2184990T3 (es) * | 1996-02-12 | 2003-04-16 | Ml Lab Plc | Nuevos metodos de vacunacion y vacunas para los mismos que comprenden un acido nucleico que codifica un primer epitope y un peptido que contiene un segundo epitope. |
| CA2271388C (en) | 1996-09-13 | 2007-11-06 | The School Of Pharmacy, University Of London | Liposomes encapsulating polynucleotides operatively coding for immunogenic polypeptides |
| ATE421527T1 (de) | 1997-08-27 | 2009-02-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Molekular-mimetika von meningokokkus b epitopen |
| GB9726555D0 (en) * | 1997-12-16 | 1998-02-11 | Smithkline Beecham Plc | Vaccine |
| US6166177A (en) * | 1998-12-08 | 2000-12-26 | Corixa Corporation | Compounds and methods for the treatment and diagnosis of chlamydial infection |
| ES2256043T3 (es) * | 1999-10-01 | 2006-07-16 | Lipoxen Technologies Limited | Vacunas de uso oral que contienen liposomas y adn atrapado. |
| CN1301572A (zh) * | 1999-10-28 | 2001-07-04 | 上海生物制品研究所 | 用于疫苗的佐剂组合物 |
| EP1237541B1 (en) * | 1999-12-13 | 2004-09-01 | Lipoxen Technologies Limited | Liposomes comprising a complex of a polyanionic compound and calcium phosphate |
| ES2272496T3 (es) | 2000-02-04 | 2007-05-01 | Lipoxen Technologies Limited | Procedimiento de deshidratacion/rehidritacion para la preparacion de lipososmas. |
| US7285289B2 (en) * | 2002-04-12 | 2007-10-23 | Nagy Jon O | Nanoparticle vaccines |
| WO2004004758A1 (en) * | 2002-07-05 | 2004-01-15 | Lipoxen Technologies Limited | Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination |
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Cited By (3)
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