TW496897B - Non-splicing variants of gp350 - Google Patents

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經濟部中央標準局員工消費合作社印製 496897 第84109561號專利申請案 中文說明書修正頁(90年6月） 玉，發胡禅明（1 ) 1修正Γ ----頓病毒（EBV)，疱疹病毒群之一員，在人體人生成 傳染性單核血球病。此疾病影響多於90%之人口。健康分 析家估計在美國此疾病之花費為每年1億元。此病毒主要 由放出病毒之個體之唾液交換散播。由EBV感染之兒童大 部份為無症狀的或具極溫和之症狀，而受感染之青少年和 成人發展出典型傳染性單核血球病，特徵為發燒、咽頭炎 和腺病。已感染之人在其人生中維持抗一 EBV抗體，及因 此對進一步之感染免疫。目前並無商品來源之EBV疫苗。 除其傳染性本質外，EBV已經顯示將淋巴細胞轉形成快 速分裂細胞及因此已牵連在許多不同淋巴瘤中，包括巴氏 淋巴瘤和口内毛狀白斑病。EBV亦已在鼻咽頭腫瘤之組織 樣品檢出。世界性估算發生80,000個鼻咽頭癌之例子及其 更盛行在中國人種。 開發對EBV之活的、減弱疫苗已是和仍是問題。因為與 EBV有關之潛在致癌本質，研究者已不願使用活疫苗途 徑。本發明由創造次單元疫苗之方法和組合物克服與活疫 苗開發有關之問題，其並不需要使用潛在致癌之活病毒。 次單元疫苗使用1或多種自病毒之抗原蛋白，其將引起免 疫反應給予免疫性。 更重要抗原EBV蛋白質之二種為醣蛋白gp350/300和 gp220/200，其形成病膜鞘之部分及允許病毒粒子與人目標 細胞結合及進入，藉與細胞膜蛋白CD21反應。見 Nemerow，J. Virology 61:1416(1987)。其早已被單離為次 單元疫苗選體，但在獲得自天然來源純化之抗原活性蛋白 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 496897 A7 B7 五、發明説明（2 ) 質上具有困難性，且在自重組製造來源之低產量，已阻礙 研究者和疫苗開發者之努力。在文獻中此些蛋白質係指使 多種分子量範圍（350或300千道耳呑為蛋白質之一及220或 200 kD為另一種蛋白質）。gp 350或300在此係指gp 350蛋白 質，gp220或200蛋白質在此係指gp220。集合地，兩種蛋 白質在此係指gp350/220蛋白質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經由替代地剪接，單基因編碼gp350/220蛋白質及產生 gp350和gp220 mRNA轉錄子之生成；已知在gp350/220基因 剪接部位中無天然發生之變異。該基因產生兩種表現產 物，gp350和gp220蛋白質。gp350/220 DNA序列之開放讀 框為2721個鹽基對（bp)。整個讀框編碼gp350之907個胺基 酸。見頒予Kieff(1987)之美國專利第4,707,358號。經剪接 之讀框涵蓋2130個鹽基及轉譯成gp220蛋白質，其含710個 胺基酸序列。gp350蛋白質和gp220蛋白質之分子量理論值 分別為95 kD和70 kD。經表現後之gp350蛋白質和gp220蛋 白質之測定分子量有差異，但分別約為350千道耳呑和220 千道耳呑（kD)。蛋白質之延伸糖化作用說明預測和真實分 子量之差異。在任何一個細胞中，gp350/和gp220蛋白質兩 者以自約6:1至1:1範圍之莫耳比值產生。例如，在B 9 5 - 8細 胞中，其以EBV持續感染，該比值出現變異，但有時可達 到 6:1 範圍。見 Miller，Proc. Natl. Acad. Sci. 69:383(1972)。 同樣地，此些醣蛋白之重組產生迄今常造成所產生之 gp3 50和gp220蛋白質之混合物。目前gp350/220蛋白質已在 大鼠腦下垂體、倉鼠卵巢VERO(非洲綠猴腎）細胞以及在 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 第84109561號專利申請案 中文說明書修正頁(90年6月） 五、發明説明（3)卜ν·7^3 : 補充I . ' , 一; 醇母細胞中表現。見 Whang，J. Virol· 61:1796H982V Motz， Gene 4-4.:353(1986)和 Emini，Virology 166:387(1988、。牛乳 頭狀瘤病毒病表現系統亦經使用以在小鼠纖維胚細胞中製 成 gp350/220蛋白質。見 Madei，Vaccine 10:777(1992、〇 牛痘 病毒之實驗室和疫苗株亦經用以表現gP350/220蛋白質。 經修飾重組之EBV gp350/220 DNA和蛋白質在此技藝中係 已知的。特別地，gp350/220基因缺乏膜跨越序列之重組斜 截構體已經製得。' 此構體仍產生gp350和gp220兩種之混合 物，但膜跨越區域之刪除允許蛋白質之分泌。見Finerty，L Gen. Virology ：44QM 和 Madej， Vaccine 10: 777(1992)。而且，包括不同gP350/220序列之不同重組產 生之限制片斷和融合蛋白質亦被製得，並可在大腸桿菌中 表現。見1991年日7月24日出版之歐洲專利第〇 173 254 號。 於是，與gp350/220有關之EBV研究迄今已著重在獲得天 然gp350/220序列之有效表現或在缺乏穿透膜功能部位之修 飾序列，具可造成天然或穿透膜缺之蛋白質之兩種任一剪 接之混合物，或著重在^ -半乳糖謀酶融合蛋白質中抗原 決定部位片斷序列之產生。 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 gp350/220之部份純化製備物係為已知的。見Finerty，L Gen· Virology 73:449Π992Η重組產生、部份純化的）。有關 天然gp350/220蛋白質，在大部分之例子中，純化程序造成 蛋白質抗原性之失活，使其不適宜用於次單元疫苗。然 而，自天然（即非重組）來源具抗原活性gP350蛋白質之高 -6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 496897 第84109561號專利申請案 中文說明書修正頁(90年6月） 五、發明説明（4 年Η 條不I _!. -,V- * 领尤： 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 度純化製備物已在科學文獻中報導。見David，J. Immunol. Methods ,108:23 1(1988)。表現 gp350/220蛋白質之附加重組 疫苗病毒係用以免疫接種棉頂南美小猴對抗EBV-謗生之淋 巴癌。見Morgan，J. Med. Virology 25:189 (1988)，Mackett， EMBO J,,. 4:3229(1985)和 Mackett，VACCINES.丨86· 293 頁 (Lerner RA，Chanock RM，Brown F編者，1986，冷泉港實 驗室）。然而，病毒gP350/220 DNA序列迄今尚未經工程處 理，以使其能單獨表現任一經剪接之基因而確實製得純 gp350或gp220蛋白質。亦未有可表現gp350或gp220蛋白質 二者之一之經重組或突變之病毒被製得。 一般而言，剪接部位促進預-mRNA分子加工成mRNA。 在多瘤病毒中，剪接部位對於後期mRNA之有效蓄積為必 要的。在多瘤病毒轉錄本中3'和5’剪接部位之改變且降低 或完全封阻mRNA之蓄積。見Treisman，Nature 2_22:5 95(1981)。在SV40病毒中，可切除之介入序列促使 mRNA運出核外和在核中之mRNA穩定性，因為此些插入 序列/表現序列聯結序促使小之核狀RNP粒子之結合，其被 認為預剪接性mRNA可能無法與加工途徑正確地聯合。頃 知在表現序列/插入序列剪接部位上之點突變降低表現序 列/插入序列裂解及可中斷預-mRNA處理，核運送和穩定 性·見 Ryu，J. Virology 63:4386(1989)和 Gross，Nature 286:634(1980) 〇 因此，直到本發明，在由EBV gp350/220序列編碼之蛋白 質在官能表現和抗原活性上剪接部位修飾之影響方才清楚 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) . 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 496897 A7 B7 五、發明説明（5 ) 及可預測。 ’ 附加之背景文獻包括以下者。E B V生物學和疾病通常 回顧於 Straus，Annal of Int. Med. 118:45(1993)。EBV BLLFI 開 放密碼之描述係見於Baer, Nature 3 10:207(1984)。愛氏頓 病毒gp350/220 DNA和胺基酸序列之描述係見於文章，由 Beisel，J. Virology 54:665(1985)和 Biggin，EMB〇 J. 3:1083(1984) 及在給Kieff等人之美國專利第4,707,358(1987)。在愛氏頓 病毒A和B型中編碼gp35 0/220之DNA序列之比較係揭示於 Lees, Virology 195:578(1993)。對抗 EBV 之 gp350/220 醣蛋白 表現中和活性之單株抗體係揭示於_Thorley-Lawson，Proc. Natl. Acad. Sci. 77:5307(1980)。最後，供體和受體剪接部 位之剪接部位交感序列係揭示於Mount, Nucleic Acids Res. 10:459(1982)。 在一個特徵中，本發明提供EBV gp350/220 DNA序列之 非剪接性變異型。本發明之DNA序列可包括分離之DNA序 列，其編碼同質gp350蛋白質之表現。編碼gp350蛋白質之 DNA序列特徵在包括在圖1中相同或實質地相同之核甞酸 序列，其中在供體和受體剪接部位上天然核苷酸係以非天 然核苷酸和其片斷置換。此DNA序列可包括侧接編碼序列 之5’和3’非偏碼序列及進一步包括胺基末端訊息序列。圖1 說明非編碼序列及以星號指出推定之訊息序列之末端。然 而，當然地，本發明之DNA序列可包括此些侧接或訊息序 列之一些或全部。本發明之非剪接性變異DNA序列係在編 碼gp350/220基因之供體和受體剪接部中由將變異導入圖1 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 496897 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（6 ) DNA序列產生。此消除gp22〇蛋白質之產生，因使僅產生 gp350蛋白質。 於疋，在另一個特徵中，本發明包括同質蛋白質 和在合適表現控制序列之控制下，在適當之原核或真核宿 王細胞中由EBV gp350/220 DNA序列之非剪接性變異型之 表現製成該等蛋白質之方法。如在此所用與gP350有關之 名詞，同質意指無或實質地無gp22〇蛋白質。吾等注記著 在哺乳類或昆蟲細胞中重組產生之同質gp35〇並不為吾等 所知，亦不在目前之科學文獻中報導。 +在再一個特徵中，提供在分泌產物中附加地具刪除之同 貝gp3 50蛋白質。如此之刪除包括穿透膜區域之除去或穿 透膜區域和gp350剩餘c_末端之除去。如此附加修飾之 DNA序列和所編碼之蛋白質因而為本發明之再一個特徵。 亦提供的是包括載體DNA和編碼同質gp35〇蛋白質之 DNA序列之重組DNA分子。DNA分子提供與合適調節二= $作聯合之gp350序列，其在選定之宿主細胞中能引導同 貝gp350之複製和表現。以如此DNA分子轉形之宿主細胞 用於表現重組同質gp35〇亦由本發明所提供。 本發明之DNA分子和轉形宿主細胞係應用在本發明之 f 一個特徵中，產生重組同質gp 3 5〇蛋白質或其片斷之新 穎方法中。在此方法中，以編碼同質gp35〇蛋白質或其片 斷=DN A序列（或如上述之重組DN a分子）與能控制此蛋 白質表現之合適調節或表現控制序列操作聯合地轉形之細 胞系係在允許重組DN A表現之適當條件下培養。表現2 -9- 本紙張尺度適用中ϋϋ標準（CNS) M規格（：淑撕公楚）一— ----- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) il·衣. 訂 496897 A7 B7 五、發明説明（7 ) =白質然後自宿主細胞或培養液由合適之—般方法採收。 此二法可採用多數之已知細胞為宿主細胞；目前較佳的為 哺乳類細胞和昆蟲細胞。 —本，明之腿序列和蛋白質係有料產生具ebv抗原決 疋^療和免疫生成化合物。如此化合物發現在刪有關 =之預防治療和防止之次單元疫曲上之用途，如單核血 表病、巴氏淋巴瘤和鼻，因頭癌。於是，在再—個特徵中， 本發明包括如此之醫療和/或免疫生成醫葯组合物，供在 人體中防止和治療EBV有關之病症和疾《，如傳染性單 核血球病、巴氏淋巴瘤和鼻咽頭癌。如此之醫療和/或免 疫生成醫葯組合物包括在免疫生成上謗生有效量之本發明 〈：或多種gP350蛋白質與如在技藝中已知之在醫葯上可 接党之載體混合’如氫氧化鋁、鹽水和磷酸 藉，，在免疫生成上謗生，，吾等意指足以在哺乳類中：：對 EBV抗體產生之量。可替代地，該活性成分可以含微脂粒 〈集合ff形式施用。為預防之職，如此之醫葯組合物可 如次單元疫苗地調配供在病人施用。病人可以足以刺激在 病人中杬體形成 < 劑量免疫注射；及在6週或丨年後再 疫注射。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本發明之進一步特徵因此為治療EBV有關之疾病和病症 之方法，由將在免疫生成上謗生之醫療有效量之同質 gP350蛋白質於合適之醫葯載體施至病患，特別地至病 人。本發明 < 再一個特徵為刺激免疫反應對抗£BV之方法 由和在免疫生成上诱生之有效量之同質即35〇蛋白質於合 -10- 496897 五 第084109561號專利申請案 ^ 中文說明書修正頁（91年5月） 以 、發明説明（8 ) ^正丨 適之醫葯載體施至病人。 圖l(lA至lG)說明gp3 50/220之DNA和胺基酸序列（Belsel， J.Virology 54:665(1985))。供體和受體剪接部位列於其 上。穿透膜區域以水平箭頭描述及星號（*)註記在推定訊 息序列之末端。核甞酸編號顯示在左邊；胺基酸編號在 右邊。 圖2說明gp3 50刪除和部位引導突變體之構築。標示為 pMDTM和pMSTOP之質體圖例証本發明之非剪接性 gp350/220變異型蛋白質。在（A)中，gp350蛋白質之線性模 式由以下編碼選體BLLFI之尺寸顯示。N-末端訊息序列（SS) 和穿透膜功能部位（TM)標記於蛋白質上，重要之限制部 位標記於基因圖形上。gp350基因選殖於兩種片段，Hind III/Bfa I BLSH1 片段及Banl/Hind III BLSH2片段。SCYT使用 聚合酶鏈反應自所指示之BLLFI區域創造。在（B)中，說明 pDTM、pSTOP、pMDTM和pMSTOP之選殖圖式（質體不按 尺寸）。選殖之細節則描述於實施例1和2。質體圖以適切 之限制部位、所用之選殖載體和gP350基因片斷註記。在 pMDTM和pMSTOP中剪接部位突變係用星號標記。 圖3說明自pMDTM選體之同質gp3 50蛋白質之免疫沈澱 結果，如由SDS-PAGE分析。正控制組（GH3 △ 19)細胞分泌 钭截形式之gp350/220蛋白質，負控制組（pEE 14)細胞和一 些pMDTM選體以35S-甲硫胺酸代謝5.5小時；同質gp350蛋 白質自生成之組織培養上清液免疫沈澱。為各細胞型 態，標示之組織培養上清液（S)和gp350/220沈澱物（Ip)之樣 品在5%SDS-PAGE(聚丙烯基醯胺凝膠電泳法）中電泳。分子量 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X ‘297公釐） 裝 訂 k 496897 A7 B7 五、發明説明（9 ) 標記之位置指示於左侧。 ^ 圖4說明自在CHO細胞表現之pMDTM選體之蛋白質之北 吸潰分析結果，如在實施例3 . 4中所述。 揭示的為包括編碼非剪接性之gp350蛋白質變異型之選 殖EBV DNA序列之組合物和方法。如所註記地，如此非剪 接性之變異型在此係指同質gP350蛋白質。通常當 gp350/220基因在哺乳類細胞中表現時，產生兩種基因產 物，gp3 50和gp220，因為基因之RNA剪接。本發明僅允許 產生一種基因產物，gp 350。本發明涉及除去在gp 350基因 中RNA剪接部位訊息之一些或全部及在合適之宿主細胞中 表現基因。當gp350/220基在哺乳類細胞中表現時，導入 在gp350/220基因之突變以防止220kD版蛋白質之產生。因 此，產生僅編碼gp350之mRNA轉錄本。gp350表現由使用 gp350/220基因非剪接性之變異型之消除將造成相對於 gp220和gp350之增加產生。gp220之產生並不為有效抗-EBV疫苗之產生所必需，因為gp350含在gp220中所發現之 所有潛在抗原部位。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製

因此，本發明之一個特徵提供編碼實質地與gp350相同 之多肽序列之DNA序列，除了編碼胺基酸50 1之供體剪接 部位密碼子和編碼胺基酸698之受體剪接部位密碼子已由 以非天然核替酸置換天然核嘗酸修钟。較佳地，天然核嘗 酸以非天然核菩酸置換，以使胺基酸多列維持相同。特別 地，在實施例中，在供體剪接部位（核苷酸1500至1504)之 天然核苷酸AAGT及侧接GG受體剪接部位之天然核甞酸A -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） A7 B7 五、發明説明（i〇) '~- 和耶芬酸2091和2〇94)分別以核芬酸GTCA及丁和A置換。 其後’由於此在供體邵位中之取代之結果，在胺基酸位置 5 00上之麩胺醯胺和在位f L 置501上之絲胺酸維持相同。同樣 地，由於在受體部位上修飾夕 ,^ I哪 < 結果，在胺基酸位置697之 踩胺酸和在位置698上之甘胺酸維持相同。 類似地’非該等可由熟諸此技藝者輕易進行之特別例証 者之取代係更全然地描述於下。 因此’在一個特徵中，本發明包括同質gP350蛋白質。 同貝gp^50蛋白質進一步特徵在具與在圖！所示者實質地相 同（胺基酸序歹J，自胺基酸r9〇7,自胺期酸山^或自 胺基酸1至907和除了胺基酸863至881，各具或不具n_末端 18個胺基酸訊息序列。此外，提供同質卯35〇蛋白質之類 似物及包括其在胺基酸序列中具變異之突變，其保持抗原 活性及較佳地具至少80%，更佳地9〇%和最佳地95%與同 質gP350蛋白質相對應區域之同質性·實例包括具自圖i之 胺基酸序列 < 最少胺基酸變異之蛋白質和多肽；特別地保 守性胺基酸置換。保守性置換係該等在與其支鏈有關之胺 基1群中進行者。遺傳編碼之胺基酸通常區分為4群：（” 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 I性-天冬胺故、越胺酸；（2 )械性=離胺酸、精胺酸、組 織胺酸；（3 )非極性=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺 、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及（4 )未帶 電荷之極性=甘胺酸、天冬胺醯胺、麩胺醯胺、半胱胺 酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。苯丙胺酸、色胺酸和酪胺 酸有時結合地分類為芳族胺基酸。例如，可預期地，白胺 -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（11 §又之刀離置換或胺基酸以在結構上有關之胺基酸相似地保 +置換將對抗原活性或官能性不具主要之作用。 本發明提供gP35〇之更簡單純化之優點。因為gP350和 gP220具相似之生化性質，gp220通常在gp350之製備中共 純化。僅表現非剪接性gp35〇/22〇基因之變異型之細胞簡 化蛋白質純化。此將降低產生gp35〇之成本。本發明亦使 gp350純化之起始物之特徵化更容易。因為僅存在一種物 質’蛋白質含量分析和胺基酸序列分析可在不考慮第二種 物質之存在下進行。 本發明附加地提供增加gp35〇生產之優點。gp35〇基因剪 接之防止將轉移細胞自gp35〇和gp220雙產生至gp35〇之單 獨產生。在一些細胞中，gp22〇之濃度已估測為卵35〇濃度 之30%-1〇〇%。在消除基因剪接下，即35〇產生由缺乏卯22〇 產生而增加。 gpJ50/220 基因之 DNA 序列係由 Beisel，J. Virology 54: 665(1985)和 Biggin，EMBO J· 3:1083门 984、始述及說明於圖 1。該基因為2721個鹽基之開放密碼，編碼907個胺基酸及 特定著約95kD之初級轉譯產物。預測和真實值間之差異 代表蛋白質之延伸糖化作用。591個鹽基（編碼197個胺基 酸）經剪接以產生gP220。gP350/220基因產物之示分子量亦 可根據所用測定係統之型態，在不同細胞型態中糖化部位 利用、轉譯後處理差異或選擇性基因突變而變化。測定值 因不同gpj50/220基因非男接性部位變異型之產物而變 化，但π同質gp350蛋白質或蛋白質類，，一詞涵蓋非剪接性 -14- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X29*7公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ^衣·

、1T 496897 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12) 變兴型之基因產物，視情況在此揭示的具附加地刪除或突 變如c-末端刪除/或穿透膜修飾。”gp22〇蛋白質，，一詞意指 具約220kD分子量之任一剪接型gp35〇/22〇基因產物。在 gp350/220基因中剪接部位係由gp35〇/22〇基因與交感供體 和受體剪接序列，基於其他基因，優勢地自原核生物，之 比較鏗足。由 Mount，Nucleic Acids Res. 10:459Π9^7Λ 自研 究在其他基因之剪接部位發展之交感序列為：

供體：4jG/G*r*-jGr C G 受 以上星號之鹽基代表在i 〇 〇 %之所有剪接部位（高度保守 的）出現之鹽基。具2個鹽基或1個鹽基之位置代表保守之 位置（非顯自位置）。斜線指示剪接之真實部位。 在gp350/220基因中，供體剪接部位發生在核甞酸15〇1後 和受體剪接發生在核甞酸2092後，如由gp350/220基因之 DNA讀序所示（Biggin，EMBO J,3:1083(1 9R4))。（在此所用 和在圖1中之編號順從在Biggin中之編號）。剪接部位發生 在B型之EBV株中之相對應基因區域（供體剪接部位在a 後和受體剪接部位在G2〇29後）。本發明涵蓋使用八或3株或 其EBV他株之剪接部位以自gp3 50/220基因產生單一物質製 成之組合物。自株B95-8病毒之A型DN A序列係用於實施例 中，雖然B型株之DNA序列可相同地使用，因為轉譯基因 產物至520和570至576。A型株經使用，因為其含所有可处 之gp350抗原部位。可替代地，具株特異序列之 gp350/220可與在此之教導一致地使用，以產生對特別株 -15- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼ 496897 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（13 具免疫生成性質之EBV株牿佘π #， ^ m 特疋同質gP35〇蛋白質，及因此 可用於免疫生成和/或醫療組人从似、^ U此 EBV相關之疾病。表1顯示，免株特疋 供把和文體男接邵位之 核苷酸和胺基酸序列。 土土 為防止gp35〇/22〇基因之RNA剪接，突變經導入 gP35〇/22G基因核酸序列，以取代⑽剪接部位之適切 對。、為使剪接部位不官能性，較佳地構成供體部位或=體 部位之兩個南度保守鹽基之至少 xfm g§ JL ^ . ^ 個鹽基應以非保守蹢其 置換’更佳地至少兩個高度鹽基應經突變成非保守鹽^。 ^他保守鹽基，遠離剪接部位多於兩個鹽基亦可以非料 剪接部位鹽基置換，以進-步降低剪接部位之識別。供胁 和受體部位兩者可改變以損害剪接機制。較佳地，供體= ^:體兩者含在4個高保守剪接部位鹽基位置之一之各至少 一個改變及更佳地在4個高度保守剪接部位鹽基位置之1 之至少兩個改變。若i個剪接部位不可突變，因為需要維 持野生型胺基酸序列時，較佳地將至少兩個突變導入至另 一個剪接部位。 在gP3 5 0/220剪接部位上之突變可將改變導入至其後表現 gP350蛋白質之胺基酸序列。較佳地，如此改變將為保守 胺基酸取代作用。在胺基酸中之保守取代作用，如相對於 在胺基酸中之非保守改變，將有助保留抗原部位。保守之 胺基酸改變儘長鹽基改變（鹽基改變群）地製成以導致在非 ’交兴型供/受體鹽基中之合適改變。例如，Gly可在供骨# 男接部位上取代Ser50 1 ’使用非GGU之任何Gly-特異之穷 -16- 木紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 訂 496897 A7 B7 五、發明説明（14) 碼子（GGU之使用將保留G核苷酸及將不造成在剪接訊息中 所要之GT置換）。同樣地，在受體剪接部位中，Gly698成 Ala將為保守之改變，但所Ala有密碼子以高度保守G核苷 酸開始，此將不造成所要之置換。雖然脯胺酸亦可為保守 胺基酸改變，脯胺酸將不用以置換野生型胺基酸，因為其 將造成蛋白質之三汲結構之修飾及因而掩蓋1或多個gp350 抗原部位。表1顯示在野生型序例中可接受之保守胺基酸 置換。在表1之底部為具保守胺基酸改變之實例。 表1 供體 - 受體 GAA 接合 A-l GT 野生型序列 ACA 接合 G| GT Glu Ser5CU Thr GIy69S i i 保+之胺基 1 1 As η Ala 酸改變 Ala Ser Asp Gly Gly Thr , Gin Thr 、 Ser 實例：GAC ACA TCG TC 丁 Asp Thr50l Ser Ser09s 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 雖然本發明之一個特徵包括非剪接性gp350/220變異型， 但是gp350/220編碼序列之附加突變亦為所要的。為了產 生可溶性同質gp350蛋白質（"可溶性蛋白質”係在溶液中游 離的或與膜有關的，但非膜整合的），例如為避由表現如 -17- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（15) 完整膜蛋白質之全長gp350所招致細胞毒性問題，gp350之 膜跨越區域（亦稱為膜穿透區域）由刪除其編碼DN A序列之 全部或部分修飾。gp350/220之膜跨越區域包括胺基酸 861(甲硫胺酸）至 881(丙胺酸）。見 Beisel，J. Virolorv 54: 665(1985)。較佳地，穿透膜區域之至少8個胺基酸經刪 除，更佳地至少12個胺基酸經刪除及最佳地18至21個間之 胺基酸經删除。於是，在另一個特徵中，本發明提供非剪 接性變異型之gp350/220 DNA和/或gp350同質蛋白質，附加 地包括在gp350/220 DNA和/或gp350同質蛋白質之穿透膜區 域中至少1個刪除，其造成可溶性同質gp350蛋白質之表 現。 除刪除全部或部分非剪接性gp350/220變異型之穿透膜功 能部位外，在穿透膜功能部位後和包括胺期酸88 1至907之 C-末端序列亦可全部或部分刪除，如在此所述地，與本發 明一致。因此，在本發明之另一個特徵包括非剪接性變異 型之gp350/220 DNA和/或同質蛋白質，進一步由刪除全部 或部分包括gp350/220穿透膜區域之DNA編碼和/或胺基酸 序列修飾及甚進一步由刪除gp350/220之剩餘C-末端DNA 和/或胺基酸序列。 於是，在另一個特徵中，本發明包括編碼本發明之同質 gp350蛋白質之非剪接性變異型DNA序列。如此之DNA序 列包括編碼胺基酸/至907之圖1之DNA序列及進一步包括 在此所教以除去供體和受體剪接部位之核苷酸取代作用。 如此之DNA序列視情況包括斜截之DNA序列，其中删除包 -18- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

496897 A7 B7 五、發明説明（16 ) 括胺基酸86 1至907之編碼全部或部分穿透膜功能部位和C-末端之核苷酸及刪除變異型，其中刪除包括胺基酸86 1至 88 1之編碼全部或部份穿透膜功能部位之核甞酸。本發明 之編碼同質gp350蛋白質之DNA序列亦可包括能在合適之 嚴厲條件下雜交之DNA，或其能在如此之條件下雜交，但 僅退化遺傳密碼至圖1之分離DNA序列。於是，本發明之 DNA序列可含在非編碼序列、訊息序例或編碼序列中之修 飾，基於對偶質變異、物種變異或有意之修飾。 如在此揭示地，此些非剪接性變異型gp350/220 DNA序 列可使用在技藝中熟知之方法構築。_本發明之修飾DNA序 列可同樣地使用已知之方法重組地表現，以產生本發明之 同質gp350蛋白質。如此之重組蛋白質可經純化及併入預 防治療和防止EBV有關疾病之醫葯組合物。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 本發明之非剪接性變異性gp350/220 DNA可在不同型之 細胞中使用如在技藝中已知之合適表現控制系統重組地表 現。在技藝中已知和可獲得之合適細胞包括，但不限於酵 母細胞如酒酵母菌，細菌細胞如大腸桿菌和枯草桿菌及哺 乳類細胞如GH3、CHO、NS〇、MDCK和C-127細胞。與細 胞型共用之載體經基於其與所用之細胞型和表現控制系統 之相容性選定。允許表現gp350/220基因之分泌產物之細 胞和載體係較佳的。典型地，例如大腸桿菌使用pBR322 之衍生物轉形，其已經使用一般之技藝修飾，以含表現所 要蛋白質之DNA序列，在此例中EBV gp350之非剪接性變 異型序列，具或不具編碼C-末端/和膜跨越區域之序列。 -19- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（17 ) pBRj22含氨下青黴素和四環素抗性之基因，其可作為標 兄。見Bolivar，^^:95(1977)。常用之表現控制序列， 即轉錄引發之啟動基因和視性況操縱基因或促進基因，包 括Θ -内醯胺酶和lac啟動基因系統（見Chang，Nature 121:1056(1977))，色胺酸啟動基因系統（見G〇eddel ， Nuclei Acids,Re.s: 8:4057(1980))^ λ -衍生之 PL啟動基因和 N-基因核糖體結合部位（見阳⑽執Nauture 2^1:128(1981)。然而，與原核宿主細胞相容之任例可得啟 動系統或表現控制系統可以使用。其他例証之宿主細胞、 、體和表現載體係揭示於美國專利第4,356,270號，發予

Itakura (1982)，第 4,431，739 號，發予 Riggs (1984)和第 4,440,859號，發予 Rutter (1984)。 昆蟲細胞亦可用為宿主細胞，作為昆蟲細胞表現。在昆 蟲細胞中表現之例中，通常表現系統之成分包括轉移載 體，通常為細菌質體，其含捍病毒基因體之片斷和插入所 要表現之異質基因或基因群之方便限制部位兩者；在轉移 載體中具與桿病毒特異片斷同質之序列之野生型桿病毒 (此允許同質重組異質基因至桿病毒基因體）；及合適之昆 蟲宿主細胞和生長之培養基。 目前，將外來基因導入AcNPV之最常用之轉移載體為 pAc373。其他許多載體，為熟諳此技藝者所熟知的，亦柄 設計。其包括’例如pVL985(其改變多體系起始密碼子自 ATG至ATT，及其將BamHI選殖部位導入自Αττ之32個瞒其 對下游；見 Luckow和 Summers，Virology (1989) 17.3 ι。 -20- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 496897 A7 B7 五、發明説明（18 ) 質體通常亦含多體素多腺苷化作用訊息（Miller*等人（1988) Ann. Rev. Microbiol.，42:177)和原核氣苄青黴素抗性（amp) 基因及在大腸样菌中選定和繁殖之複製本源。 桿病毒轉移載體經常含桿病毒啟動基因。样病毒啟動基 因為能結合样病毒RN A聚合酶和起始編碼序列（例如結構 基因）之下游轉錄成mRNA之任何DNA序列。啟動基因將具 轉錄起始區域，其經常置於近於編碼序列之5’端。此轉錄 起始區域典型地包括RN A聚合酶結合部位和轉錄起始部 位。桿病毒轉移載體亦可具稱為促進基因之第二個功能部 位，其在存在時，經常遠於結構基因_。表現可經調節或本 質的。為昆蟲細胞表現技藝，見歐洲專利出版第155 476 號。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 酵母，例如酒酵母菌，亦可用為宿主細胞。不同之菌株 可以獲得及可以使用。同樣地，適於酵母表現之質體載體 係已知的，如為啟動基因和表現控制基因。見例如 Myanohara, Proc. Natl· Acad. Sci. 80:1Π983ΚΡΗ05 啟動基 因），歐洲專利出版第012 873(引導序列），Kurtz，Mol. Cell· Biol. 6:142(1986), Ito，J. Bacteriol· 153 :163Π983)和 Hinnen. Proc. Natl· Acad. Sci. 75:1929(1979)(韓形程序和合適之載 體）。 自多細胞生物之真核細胞當然地亦可用為宿主細胞，以 表現編碼所要之蛋白質和多肽之基因。有用之宿主細胞線 包括VERO和HeLa細胞及倉鼠卵巢細胞（CHO)。與如此細 胞相容之表現載體亦可獲得和典型包括啟動基因和表現控 -21 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 496897 A7 _ B7— __ 五、發明説明（19 ) 制序列，例如自SV40之早期和後期啟動基因（見Fiers， Nature 273:113(1978))和自多瘤病毒、腺病毒2、牛乳頭瘤 病毒或鳥肉瘤病毒之啟動基因。例註之宿主細胞、啟動基 因、可選定之標記和技藝亦揭示於美國專利第5,122,469 號，發予 Mather(1992)，第 4,399,216號，發予 Axel(1983)， 第4,634,665號，發予人\叫1987)’第4,713,339號，發予 Levinson(1987)，第 4,656，134 號，發予 Ringold(1987)，第 4,822,736 號，發予 Kellems(1989)和第 4,874,702 號’發予 Kellems(1989)和第 4,874,702號，發予 Fiers(1989)。 合適宿主細胞之轉形係使用適合於如此細胞之標準技術 完成，如原核生物之CaCl2處理，如在Cohen，Proc. Natl. Acad. Sci. 69:21100972)中所述及哺乳類細胞之CaP04a 澱，如在Graham，Virology 52:546Π978)中所述。酵母轉形 可如在 Hsiao，Proc. Natl. Acad. Sci. 76:3829(1 Q7Q)中所述地 或如在Klebe，Gene 25:333(1 983)中所述地進行。 含非剪接性變異型gP350序列（具或不具在此所揭示造成 C -末端和/或膜跨越區域刪除之附加修飾）之合適載體之構 築係使用現在技藝中所熟知之一般連接和限制技術完成。 部位特異之DNA裂解係由以合適之限制酵素在標準條件下 處理進行’其特別者係由限制酵素廠商所典型地特異。聚 丙烯醯胺凝膠或瓊脂糖凝膠電泳法可經進行以使用標準技 藝定開裂解片斷之尺寸及片斷鈍端由以大腸桿菌之聚合酶 I之克里諾（Klenow)片斷在4個去氧核苷酸三磷酸酯之存在 下處理消端。以S1核酸酶處理水解任何單股部份。合成之 -22- 本紙張尺度適β關家縣 -— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 訂 496897 A7 B7 五、發明説明（20) 核苷酸可使用例如在技藝中已知之二乙基磷醯胺鹽方法製 成。見美國專利第4,4 15,732號（1983)。連結作用可使用T4 DNA連結酶在標準條件和溫度下進行，及正確之連結由將 大腸桿菌或COS細胞以連結混合物轉形確認。成功之轉形 物係由氨芊青黴素、四環素或其他抗生素抗性或使用如在 技藝中已知之其他標記選定。 如此之重組DNA技術係全然地說明於文獻中。見例如 Sambrook，分子選殖：實驗室操作手冊，第2版（1989); DNA選殖，第I和II卷（DN Glover編者1985);少核苷酸合成 (MJ Gait編者1984);核酸雜交作用（BD Hames編者1984); 轉錄和轉譯作用（BD Hames編者1984);動物細胞培養物（RI Freshney編者1986) ; B. Perbal，分子選殖之實際指引 (1984);哺乳類細胞之基因轉移載體（JH Miller編者1987冷 泉港實驗室）；Scopes，蛋白質純化作用：理論和練習，第2 版（1987 Springer-Verlag NY)和實驗性免疫學手冊，第I-IV 卷（DM Weired 1986)。所有在此所提之所有出版物皆以文 獻併入供參考其所揭示之物質。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 於是，在另一個特徵中，本發明包括含非剪接性變異型 gp350/220 DNA序列之載體和宿主細胞及進一步包括製備 非剪接性變異型gp350/220蛋白質之方法，由將含載體之 該等宿主細胞培養，其載體載有與表現控制序列在培養條 件下操作連接之非剪接性變異型gp350/220 DNA序列，以 能表現同質gp350蛋白質。 表現之同質gp350係自細胞和培養基組成份中使用一般 -23- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 五 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 、發明説明（21 醣蛋白純化技術純化，如但不限於超過濾法、自由流動電 永去、.f豆過;慮屬析法、親和力屬析法、SDS_pAGE、差 矢性ΝΗρ〇4沈澱法、外源凝集素管柱、離子交換管柱和 2水性管枉，如在技藝中已知。gp35〇之少量分析製備物 最常使用SDS-PAGE或外源凝集素親和力管柱純化及如此 少量用於免疫注射或免疫反應實驗之製備物最常使用液相 層析法純化。為大量產生用於免疫接種組合物之商用顯著 里之gp350 ’超過濾、膠體過濾、離子交換和疏水性反應 屬析法之組合係較佳的。 本發明之純化、同質gp35〇蛋白質可應用於醫療和/或免 疫生成之組合物，供防止和治療Ebv有關病症和疾病，如 傳染性單核血球病、巴氏淋巴瘤和鼻咽頭瘤。如此之醫葯 組合物包括在免疫生成上有效量之1或多種本發明之同質 gp350與在醫葯上可接受之載體混合，例如佐葯/抗原呈現 系統如明礬。其他佐葯/抗原呈現系統，例如MF59(chir〇n 公司）、QS-21(康橋生化公司）、3_Dmpl(3-去醯基單磷醯基 月旨質A)(RibiImmunoChem研究公司）、臨床汲不完整弗羅恩 得氏佐葯（IFA)、融合生成微脂粒、水溶性聚合物或 Iscoms(免疫刺激複合物）亦可使用。其他例註在醫葯上可 接受之載體或溶液為氫氧化銘、鹽水和鱗酸鹽缓衝之鹽 水。該組合物可系統地施葯，較佳地皮下或肌肉内，以可 接受之皮下或肌肉内溶液之形式。而且，接種可有效以表 面犧生或以體穴之接種。如此溶液之製備，具有關之 p Η、等張性、穩定性及類似物則在包括在技藝之技術 -24- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） ~~' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

496897 A7 B7 五、發明説明（22 請 先 閱 讀 背 δ 冬 ί 事 項 再 填 寫 本 頁 中。施用劍量療法將由出席之醫師¥慮不同已知之因素以 修飾葯物之作用而決定，例如物理狀態、體重、性別、飲 食、病症之嚴重性、施葯時間和其他臨床之因素。例証之 施用劑量範圍包括約1微克至約1000微克蛋白質間。 在實施本發明之治療方法中，在免疫生成上有效量之同 質gp3 50蛋白質經施至需要醫療和預防治療之病人中。在 免疫生成上有效量之本發明組合物係預期為每劑量施用約 1微克至約1毫克之範圍。劑量施用數可依以上所述因素 而改變。本發明進一步描述於以下之實施例，其意在說明 本發明而非限制其範轉。 _ 實施例1 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 gp3 50/220穿透膜區域和穿透膜區域 至C-末端之刪除以創造pDTM和pSTOP 自 EBV B95-8株之 gp350/220基因（Miller等人，1972)係獲 自BamHI庫，而為開放密碼稱為BLLFl(Baer，Nature 3 10:207, I984)。為創造所要之構體（在圖2中圖示）， gp350/220基因經選殖入兩個部分：1)BLSH1，2.3kb Hind III/BfaI3’片斷和 2)BLSH2，337 b.p. Banl/Hindlll 5’片斷（圖 2A)。此些片斷經選殖入階段載體，以使C-末端細胞質和/ 或編碼穿透膜功能部位之刪除可以進行。因為Bfal部位發 生在編碼gp350穿透膜（TM)功能部位之區域之5’端上/其用 以構築TM功能部位刪除和具鄰近Ο末端刪除之TM功能部 位刪除。使用Bfal，可能地創造僅維持T Μ區域之2個胺基 酸之刪除（表2 )。 -25- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 496897 A7 B7 五、發明説明（23)

1 .自 pSTGl和 PSTG3構築 pDTM 質體pDTM包含gp 3 5 0 /2 2 0核酸序列，其缺乏完整之 T Μ編碼區域。此構體使用兩種階性載體，p S T G 1和 pSTG3製成。450 bp PCR產物，SYCT，其在ΤΜ區域 之3 ·端上導入B fa I，係使用B L L F 1選體自標序列製成（圖 2 )。所用之P C R引子係如下：

Bfal

引子1: GG ATC CTA GAC TGC GCC ΊΊΤ AGG CGT A BLLF1: •會· GAC TGC GCC ΊΊΤ AGG CGT A. V Asp Cys Ala Phe Arg Arg . ·· 个 TM區域之 —端 引子2: GGA TCC TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG BLLF1: TCT GTT CCT TCT GCT CCA GTG 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 引子I之Bfal經用以選殖SCYT之Bfal/Xmal入pSTGl。引 子I之剩餘部分與由BLLF1所編碼之胺基酸序列相對應。引 子2與在基因3’端上gp3 5 0/220開放密碼外面之區域相對 應。SCYT PCR片斷以Bfal和Xmal切開，以產生136個鹽 基片斷，其與第二個片斷，BLSH1 Hindlll/Bfal片斷一同 選殖入pMTll載體（Spaete和Mocarski，1985)，以創造 pSTGl。讀序過Bfail指出所TM有胺基酸編碼區域經刪除， 除了胺基酸Met和Leu(見表2)。第三個BLLF1片斷， BLSH2，經選殖入pMTll，以創造pSTG3。gp350/220基因 編碼序列外面之16個鹽基對Banl/Xbal少核苷酸連結基經用 -26- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X 297公釐） 經濟部中央榡準局員工消f合作、社印製 496897 A7 B7 五、發明説明（24 ) 以選殖 BLSH2 Banl/Hindlll 片斷至 pSTG3。2.4 Hindlll/Xmal pSTGl片斷與0.3 Xbal/Hindlll pSTG3片斷一同選殖入 pEE14載體（Celltech，英國），以完成pDTM構體。 2 . pSTOP使用載體PSTG2弄口 PSTG3之構築 質體pSTOP包括gp350/220基因，其缺乏TM區域及 鄰近T Μ區域之C ·末端細胞質區域。為創造此構體，1 6個 鹽基對B a fl / E c 〇 R I少核苷酸連結基以停止密碼子（劃底 線）在B fa I粘端後之三個結構中創造如下述：

TAT AGA CTA GTC TAG G A TCT GNT CAG ATC CTT AA 上序列之5 ’懸垂物（TA)為Bfal限制部位之粘端和下序列 之5’懸垂物（TTAA)為EcoRI粘端。此16個鹽基對連接基經 用以選殖BLSH1 Hindlll/Bfal片斷至pMll，以期創造 pSTG2。2.3 kb pSTG2 Hindlll/EcoRI 片斷和 pSTG3 0.3 kb Xbal/Hindlll片斷經選殖入pEE 14，以創造pSTOP。 3 · HM區域上野生型、PDTM和pSTOP序列之比較 gp350 DNA之野生型、pST〇P和pDTM3,端之少核甞酸序 列和轉譯之胺基酸序列及胺基酸序列群係示於以下之表 2。箭頭指示野生型穿透膜功能部位（TM)之開始和結束。 自穿透膜功能部位僅兩個胺基酸維持在pDTM和pSTOP 上，Met861和Leu862(亦見圖1)。註記地，在pSTOP中終止密 碼子緊接在Leu862後。在pDTM中，刪除穿透膜區域之前位 置係註以△ TM，，。（在表中，指出天然胺基酸）。 -27- 〜 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

、1T 496897 A7 B7 五、發明説明（25 ) 表2 gp350野生型序列之3<端

...AAC CTC TCC ATG CTA GTA CTG.....GTC ATG GCG GAC TGC GCC ...Asn Leu Ser Met Leu862 Val Leu. .... Val Met Ala Aspgg2 Cys Ala 个 个 TM開始 TM結束 pSTOP 之 3* 端 …AAC CTC TCC ATG CTA TAG ACT AGT TCT AGG …

...Asn Leu Ser Met Leu^ STOP pDTM之 3·端 、 ...AAC CTC TCC ATG CTA GAC TGC GCC... ...Asn Leu Ser Met Leu^ A5pSS2Cys Ala... Λ ' ΔΤΜ ' ‘ 實施例2 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) gp350/220基因供體和受體 剪接部位之除去，以創造pMDTM和pMSTOP 為獲得gp350蛋白質之同質產生，gp350/220基因剪接部 位之高度保守和保守之鹽基經改變。在供體剪接部位上4 個鹽基經改變，包括高度保守之GT對，其發生在1〇〇%之 所有男接部位。兩個保守之供體邵位鹽基AA，GT置換。 兩個高度保守（不變異）之供體剪接部位鹽基GT自變成 C A。在受體剪接部位上，僅丨個高高度保守之受體剪接部 -28- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) A4規格（210X 297公釐） 496897 A7 B7 五、發明説明（26) 位鹽基經改變，以保留胺基酸序列：第二個保守受體剪接 部位鹽基經改變如在表3中所示。表3簡化在gp350/220基 因之供體和受體剪接部位上改變之鹽基。 表3: EBV gP350/220基因接合部位變化 供體接合部位： 野生型： 受體接合部位: 野生型：

供體 GAA AtGT Glu Ser50I 供體 突變型： GAG* Glu Ser30l (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 受體 AC A G1GT Xhr Gly69g

受ft - 突變型Γ ACT* GGA* Thr Gly69S 訂 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 由少核苷酸基質之突變生成所改變之鹽基係以星號在突 變之序列中標示。剪接之真實部位由箭頭指示及編碼之胺 基酸經顯示。註記地，胺基酸序列由於核苷酸取代、作用之 結果並不改變。 此些核甞酸取代至野生型gp350/220供體剪接部位和受體 剪接部位DNA序列由使用少核甞酸中介之突變生成完成。 修飾之噬菌體載體，M13TAC，經應用以產生突變，如在 Zoller，M.E.和 Smith，M(1983) Methods of Enzymol· 100:468 中所述。gp350/220核苷酸之BamHI/XhoI片斷經選殖入質 體M 13TAC之多連結基，使用在多連結基上之Asp 718和 BamHI限制部位，與含Asp 718和Xhol粘端之19 bp少核苷 -29- 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 A7 B7 五、發明説明（27 ) 酸連結基組合。實施例1之質體M13DTM和Μ 13STOP經用 於突變生成。 兩個4 2體少核嘗酸，PrDonorl和PrAcceptorl，經製成用 於突變生成。各經設計與在供體或受體剪接部位中心之 gp350/220基因序列共補。與gp350/220基因不互補之少核 菩酸之惟一區域為代表所要哭變之基地。突變生成少核答 酸包括以下：

PrDonorl

引子： GGT CAT GTC GGG GGC CTT TG |A CTC TGT GCC GTT GTC CCA TGG 拿傘 I« _ 拿

EBV： GGT CAT GTC GGG GGC CTT AC JT TTC TGT GCC GTT GTC CCA TGG

PrAcceptorl

子： CTG TGT TAT ATT TTC ACC TC jC AGT TGG GTG AGC GGA GGT TAG • I " '

EBV： CTG TGT TAT ATT TTC ACC AC |C TGT TGG GTG AGC GGA GGT TAG 突變生成少核甞酸之序列標示為”引子"，而跨越 gp350/220基因剪接部位之DNA序列標示為”EBV”。由於突 變生成結果而改變之基地以星號標示。點線指示剪接之位 置。 經濟部中央榡準局員工消費合作，社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 少核芬酸PrDonorl和PrAcceptorl與單股之M13-DTM和 M13-ST0P選體雜交。T4 DNA聚合酶全酶係用以產生雙股 M13DNA及大腸桿菌以雙股DNA轉形。使用載體 M13TAC ’含所要突變之任何選體可由在x-gai和異硫丙基 半乳糖二酸鹽之存在下，自白至黃之顏色變化鑑定。藍斑 點經挑出及生長，及過剪接接點之DNA讀序經用為突變選 -30- "一 ______ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） 經濟部中央榡準局員工消費合作衽印製 496897 A7 B7 五、發明説明（28 ) 體之最後鑑定，標示M13-MDTM和M13-MST0P。 在鑑定含所要突變之選體後，BamHI/XhoI片斷M13-MDTM和M13-MSTOP切出及連結回至pDTM和pSTOP骨架 上，以分別創造構體pMDTM和pMSTOP。此些構體經轉移 感染入CHO細胞，以表現非剪接性變異型gp350/220 DNA 序列，如在實施例3中所述。 實施例3 在CHO細胞中gp350之表現 1 . 2D350/220基因構體之韓移感染作用 自哺乳類細胞產生高量之本發明同質gp350蛋白質之方 法涉及具多倍異質gp350 DNA序列之細胞之構築。異質 DNA序列係與擴大標記操作地連結，在此實施例中，其細 胞之麩胺醯胺合成酶基因可使用甲硫胺酸亞颯亞胺擴大。 在實施例2中製成之pMDTM和pMSTOP載體經轉移感染 入CHO細胞，如以下所討論，根據Crockett，Bio/Technology §_:662(1992)之程序和如在Celltech指導手冊中所述為麴胺 醯胺合成酶基因擴大系統（1992)。 CHQ-K1細月包（ATCC CCR61)維持在無麩胺醯胺之 EMEM(伊哥氏最小必需培養基），以10%牛胎兒血清、100 單位/毫升盤尼西林、100毫克/毫升鏈黴素、MEM(修飾之 伊哥氏培養基）非必需胺基酸及1毫莫耳濃度丙酮酸鈉（全 部獲JRH Biosciences)補充。該培養基亦以60毫克/毫升越 胺酸、60毫克/毫升天冬胺醯胺、7毫克/毫升腺苷、7毫克/ 毫升鳥甞、7毫克/毫升胞苷、7毫克/毫升尿苷和2.4毫克/ 毫升胸苷（全部自Sigma)補充。此培養基製備物在整個轉 -31 - --—------ __ 本紙張尺度適用中國國家榡準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

496897 A7 B7 五、發明説明（29 ) 移感染間使用，自此處方之變異如所註記。 在轉移感染前一天，10厘米培養皿以3xl06個CH0-K1細 胞撒種。在轉移感染之日，細胞以每皿10毫升無血清之培 養基清洗。質體DNA(自pMDTM、pMSTOP質體）由CaP〇4 沈澱法使用一般之技術應用。10微克之各質體DNA沈澱物 與CH0-K1細胞加上2毫升無血清之培養基在37 °C下培養 4.5小時。製成各三重覆之4種質體DNA轉移感染物。細胞 然後以15%甘油在HEPES-缓衝久鹽水中衝擊1.5分。在以 無血清之培養基潤洗後，細胞再餵以含血清之培養基及培 養24小時。 第二天培養基經改變以包括1 0 %透析之牛胎兒血清（JRH Biosciences)和由添加25微莫耳濃度甲硫胺酸亞颯亞胺之培 養基（Sigma)擴大。細胞每3-5天再銀以含甲硫胺酸亞颯亞 胺之培養基，直至擴大之選體大到足夠挑取，約13-14天 後。選體由以無菌200微升吸管尖將菌落刮下皿而挑取及 轉入在無甲硫胺酸亞颯亞胺之培養基之96#盤中之一#。1-2天後培養基以培養基+25微莫耳濃度甲硫胺酸亞颯亞胺置 換。在4天後，培養物上清液經採取及在ELISA分析中分 析蛋白質產物，如下所討論。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) CH0細胞亦以pEE14控制組載體單獨轉移感染（其不含 EBV序列）及CH〇-pEE14之24個選體亦挑取和轉至盤上作 為控制組。（此控制組選體在甲硫胺酸亞颯亞胺中基於殘 存鑑定）。 2 . ELISA分析

轉移感染後，CH〇-pMDTM之241個選體和CH〇-pMST〇P -32- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（30) 之15 8個選體經挑取及生長。自此些選體之上清液經測試 gp350蛋白質生產。96#盤以親和力'純化之免抗gp350/220抗 體（抗體MDP 1 ; Andrew Morgan之禮物）塗布，其在50毫莫 耳濃度硼酸鈉緩衝液，pH9中以1:2000稀釋。該等培養盤 在37 °C下培養3-4小時及以PBS + 0.05%吐溫20使用Nunc ImmunoWasher清洗3次。在吸潰乾後，培養盤由與2% BSA 在PBS + 0.0 1% Thimerosal中在37°C培養0.5小時封阻及再 清洗。自轉移感染之細胞和控制組細胞之上清液加入#中 及在37°C培養2小時。培養盤然後與初級偵測抗體，小鼠 單株抗體對抗gp3 50/220(抗體#65221M ; Biodesign國際公司） 以1毫克/毫升在PBS清洗缓衝液稀釋下，在37°C下培養1小 時。在清洗後，培養盤與二級抗體，山葵過氧化酶共山羊 F(ab)2片斷指引對小鼠免疫球蛋白（人Ig吸附的；Bioscience 國際公司），0.7微克/毫升在PBS + 0.05% BSA和0.01% Thimerosal，在37°C下培養1小時。培養盤經清洗及使用 ABTS(Pierce化學）溶於穩定過氧化物受質缓衝液（Pierce化 學）在室溫下發展0.5小時。反應以1% SDS終止及培養盤在 4〇5和605毫微米下使用分子裝置Vmax ELIS A盤閱讀機讀 取。24個pMDTM和18個pMSTOP選體對分泌gp350測試為正 反應。展現最高ELISA訊息之選體則轉入24#盤以量產及進 一步以西方吸潰法和放射免疫沈殿法分析測試。 3 .西方吸潰法和放射免疫沈澱法分析 在最初之篩選中，自pMDTM轉移感染物之組織培養上 清液在西方吸潰法中分析活性。CHO細胞上清液在5% SDS-PAGE凝膠中純化，轉入硝基纖維素過夜及以抗gp35〇 -33- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

496897 A7 B7 五、發明説明（31 ) 抗體探測。7個pMDTM選體經發現在西方吸潰法分析中對 gp350為正反應。 在西方吸潰法中為正反應之pMDTM選體進一步由放‘射 免疫沈澱法測試gp220之存在。選定之轉形pMDTM細胞， pEE 14控制組和GH3 Δ19控制組細胞（以下所述）在6#盤中生 長過夜，以使其在實驗當天約3/4融合。各#含約5 X 106個 細胞。為標示，培養基自各#除去及以0.7毫升無甲硫胺酸 MEM(10%小牛胎兒血清）+100微居里35S-甲硫胺酸置換。細 胞在37°C下培養5.5小時及然後在4000 rpm下微離心5分。 在上清液中同質gp350蛋白質由添加10微升Sepharose-蛋白 質A(Sigma)在50%漿和20微升單株抗gp350/220(抗體 #C65221M，100毫克/毫升；Biodesign國際）免疫沈澱，在4 °C下搖動過夜。混合液然後在2000 rpm下，在室溫下片化 2分及以少量鱗酸鹽缓衝鹽水清洗4次。在最後清洗後，所 有液體自片狀物除去及以50微升蛋白質凝膠樣品缓衝液置 換。含沈澱之免疫複合物之樣品經煮沸5分及在5% SDS-P AGE中分離。免疫沈澱物與以蛋白質樣品缓衝液1:1混合 之組織培養上清液之凝膠樣品比較。凝膠經乾燥及以 Hyperfilm 冷-Max(Amersham)放射自動顯影。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 圖3顯示放射免疫沈澱法之SDS-PAGE分析之放射自動顯 影結果。作為正控制組之細胞線為GH3 /XlMElliot Keiff之 禮物；Whang等人，1987)。GH3 Δ19細胞分泌斜截形式之 gp350/220蛋白質，缺乏穿透膜和C-末端細胞質功能部 位。為作為負控制组，CH0細胞以pEE 14載體單獨轉移感 染及由甲硫胺酸亞颯亞胺與pMDTM轉移感染平行地選 -34- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 A7 B7 五、發明説明（32) 擇。在圖3中，上清液（"S")顯示於每數行，免疫沈澱物另 一地顥示於偶數行。在控制組第2行，自GH3 Δ19控制組細 胞之沈澱造成在約220和350 kD上兩個蛋白質紋線，表示 斜截剪接性變異型gp350和gp220蛋白質以約1:1比值產生。 如預期地，此些免疫沈殿紋線與在第1行之放射標示組織 培養上清液（非免疫沈殿之樣品）相關下經濃縮。而且，如 預期地，無紋線顯示於負控制組（第4行），因為pEE 14載體 並不含任何gp350/220構體。 在第6，8和10行中自pMDTM上清液免疫沈澱之SDS-PAGE 分析造成在約350 kD上單一強紋線，一如在在GH3 Δ19控 制組第2行之更高分子量物質。然而，與GH3 Δ19控制組行 相對地，在約220 kD上附加之強紋線並不存在於第6，8和 10行，雖然在第8行上顯露在略低分子量上遷移一個極淡 紋線。此可代表崩解產物，共沈澱細胞產物或少量gp220 蛋白質，自誤轉譯和突變事件生成，其回復刪除之供體和 受供剪接部位至天然核苷酸或胺期酸序列。在約350 kD上 強單一紋線經發現於5個其他經測試之MTDM重覆值（數據 未顯示）。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 在第6和10行上在220 kD上紋線之完全不存在不像是由 於自MDTM上清液之無效沈澱，因為在35S-標示GH3A 19控 制組行（2)中，在220 kD之紋線係容易目視的。而且，使用 含野生型剪接部位之實施例1之pDTM構體之附加分析造成 在350和220 kD上兩個強紋線。因此，此些結果展現剪接 部位之刪除造成在gp350蛋白質產生上無gp220蛋白質之產 生。 -35- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 A7 B7 五、發明説明（33) 在CHO細胞線中，或在其他哺乳類或非哺孔類細胞線中 之同質gp350蛋白質可進一步量產及同質gP350蛋白質可自 細胞線自調整之培養基中，使用在技藝中熟知之方法分離 和純化，包括技術如外源凝集素親和力屬析法、逆相 HPLC、FPLC、膠體過濾法及其類似方法。見DaVld，L Immunol. Methods 108:23 1(1988)和 Madej，Yaccni^_±〇:777 (1992)。 4 · pMDTM蛋白質之北方吸清法分析_ 在此實驗中，吾等由北方吸潰法顯示MDTM-1細胞製k gp350 RNA而非gp220 RNA，提供剪接部位突變防止gp220 產生之另一程度之確認。 與gp350互補之DNA探針係自pDTM製成，見實施例i。 gp350/220 探針模板 XP464 係以 464 bp XhoI/PstIpDTlvI片斷八 離。XP464識別gp35〇和gp22〇兩者。為製成gp35〇特異、 針AN537，pDTM係以Ncol和Ndel切開，分離兩個 重疊之 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本育) ^------、一 經濟部中夬橾準局員工消費合作、杜印¾ 58〇 bp片斷，及此混合物以XmnI切開，以除秦1询、武 斷及以Alul切開，以生成537 bp Alul/Ndel片辦 亏喪片 gp35〇/22〇剪接部位。AN537係特異於gp22〇剪越 ^ ^ ^ 及因此對gp350信息特異。DNA探針由32P-deTt/卜史离抑 (Amersham)使用DNA片斷XP464和AN537標示。 咴轉、 全細胞RNA基本地根據Chomczyunski和$ Biochem·，162:156-59(1987)之方法製備。自各，An 瓶之CHO-pEE14(負控制組細胞線，見實施別 1 MDTM-1和CHO-DTM-7細胞，90%融合之培養 矣 1)、 氣 取及細經分解和在變性缓衝液（10毫升4莫耳渗&杯 -36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐

— III 7 9 8 6 9 4 A7 B7 五、發明説明（34 ) 請 閱 讀 背 \έ 之 注 意 I % 本 頁 醋、25毫莫耳濃度擰檬酸鈉，pH7: 0.5% sarkosyl，100毫 莫耳濃度2-氫硫基乙醇）中刮取。各10毫升之分解液以1毫 升2莫耳濃度乙酸鋼，pH4，10毫升飽和酸，pH4.5和2毫升 氯仿/異戊醇補充；分解液在冰中培養15分，在4°C下在 10000 X g下離心20分，及上水屬經除去。RNA係自水屬由 添加1體積之異丙醇在20 °C下1少時沈澱，在4°C下成片 狀，再懸浮於變性緩衝液及再沈澱。RNA片在70%乙醇中 清洗IX，在Speed-Vac中乾燥及再懸浮於DEPC-處理水中。 訂 DTM-7和MDTM-1全細胞RNA在65°C下在15%甲醯胺和6% 甲醛中變性15分，在1%瓊脂糖/6.6%甲醛凝膠中分離及由 毛細管作用轉入硝基纖維素及以標示之XP464和AN537探 測。DNA探針由沸騰5分變性，在5X SSPE中在65%C下雜 交過夜及硝基纖維素在高緊張下清洗。放射自動顯影使用 Bio-Rad磷影像機進行。

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 自CHO-MDTM細胞之總細胞RNA之北方吸潰法顯示剪接 突變在防止gp220-特異RNA產生上之有效性。gp350-特異 之探針AN53 7僅與在MDTM-1和DTM-7細胞之一種RNA結合 (圖4，第1和2行），如預期地之gp350·特異之探針。XP464 探針，其為gp350和gp220 RNA兩者特異的，識別在DTM-7 中之二種及在MDTM-1中之單一更高分子量紋線（圖4，第4 和3行），如預期地剪接部位防止在MDTM-1中gp220信息產 生。即使MDTM-1紋線為gp350特異RNA超載，仍未見明顯 之gp220 RNA。在gp350信息之示運動性在MDTM-1對DTM-7線間差異之理由尚不清楚。MDTM-1與DTM-7比較下超 載，其可影響在凝膠中之遷移。而且，gp3 50信息接近在 -37- 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） 496897 A7 B7 五、發明説明（35 ) 凝膠中大核糖體RNA紋線地展開，其可歪曲示分子量。任 一方面，與gp350 RNA序列互補之單一物質之存在建議此 訊息代表gp350 mRNA。因此，在供體和受體剪接部位中 之突變係有效於防止gp220信息產生，如由北方吸潰法所 判斷。此結果進一步由放射免疫沈澱法使用對gp350/220 特異之單株抗體以及由MDTM-1和DTM-7上清液之西方吸 潰法確認。 實施例4 測試同質gp350蛋白質之免疫生成活性 純化同質gp350蛋白質併入合適供施葯之載體及施至小 鼠如下。 2x佐葯載體濃縮物由將Pluronic L121和鯊燒在0.4%(v/v) 吐溫80在磷酸鹽缓衝之鹽水與（Thr’）MDP混合，根據David， J. Immunol. Methods 108:23 1(1988)和 Allison，J. Immunol. Methods 95:157(198 6)之程序製備。 施葯用組合物係由添加等量之蛋白質和佐葯載體在施用 之曰製備。蛋白質含量應在每劑量5微克至5 0微克之範 圍。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) BALB/c小鼠以3次0.1毫升肌肉注射在0，21和42天時免疫 化。預免疫化流血和在各注射後1 0天所取之連續流血係 自後眼窩獲得。 血清抗體量係由ELISA根據在實施例3中所述之程序測 定。在血清中EBV中和抗體係由其抑制由EBV在試管中轉 -38- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 496897 A7 B7 五、發明説明（36 ) 形小牛腱血淋巴細胞之能力，根據Moss, J. Gen. Virol· 12:233 (1972)和 De Schryver，Int. J.Cancer 13:353Π974)> -ττ 法定量。 可替代地’紐西蘭白兔由肌肉内施用在前面佐葯乳化之 五劑量蛋白質在〇, 21，42, 63和84天時接種。劑量應在每次 接種約5彳政克至5 0微克之範圍。血清在最後劑量後兩週獲 取及測試對抗原之抗體滴定量，為對Β95-8自細胞之病毒 gp350/220之交互反應抗體和為在試管中EBV-中和活性， 依循 Emini，Virology 166:3S7MQSR^ 方法。 因為EBV gp3 5 0/220蛋白質在動物模式之EBV感染中誘生 保護免疫性之能力已經建立，見Epstein，Clin, Exp. ImmunoL 63:485(1986)，自同質gp 350蛋白質組合物施用之 相似正結果係預期的。 在此所鏗定之所有出版物之揭示係表現地在此併入供參 考。前面詳述之描述係僅為暸解清楚給定及暸解或其推論 無不必要之限制，而在本發明範疇中之修飾將對熟諳此技 藝很明顯的。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -39- 本·.氏張尺度相中關家縣（⑽）A规格（2似297公餐） 496897

{ …卜 、Λ曰雙正！ 91·5· 24 補充I 第08410956丨號專利申請案 中文補充說明書（91年5月） 野生型及MSTOP gp350的抗體辨認係相似的 抗體 MSTOP Wi 即350 GH3 -E^coli 72A1 + + F29-167 + + + 2F5.6 - - —-—.. —~~-—-_ F16-3E3 + - BMA17.3 + + + + F29-89 + + + F16-1C10 + + + F34-5H7 + + + + F30-5C8 - - __ + 2L10 - + + ——.— --------1 所有抗gp350單株抗體以表現野生型gp350之抗活化b淋巴球之營光免 疫分析進行最初篩選（Hoffinan el al.，1980; Quaitiere et al.，1987)，而抗 MSTOP gp350之抗體反應性以EIA分析測定；自GH3細胞產生的抗gp350 之免疫原性以對gp3 50免疫沈殿之能力進行測定；由e. coli產生之 gp350，由點潰測出正反應。N/A :未測量。 I J:vrYPR\W(-K'.WKC； B\3lM77S(JP D〇(： 兔子之gp350免疫原性 抗-gp350效價^_ 中和效價2

Sample 預免疫 血樣1 血樣2 預免疫 血樣1 血樣2 Alum 13744 0 100,000 64,000 <10 800 1600 14025 0 13,000 128,000 <10 200 3200 14047 0 13,000 128,000 <10 400 3200 FA 14065 0 200,000 1，000,000 <10 800 6400 14066 0 50,000 250,000 <10 800 800 14115 0 200,000 500,000 <10 6400 3200 將6隻兔子在第0、21及42天時以MSTOP gp350與弗氏佐劑或明蓉進 行免疫。在最初免疫前（預免疫）及每次注射後十天（血樣i及血樣2)進行 血清取樣。 1·抗gpdo效彳貝足義為相較於背景值產生2倍之最高血清稀釋值，其以比 色EIA測定，其數值=1/血清稀釋度） 2.中和效價定義為在B .淋巴球分析中產生至少、之正聊對照之抑制 性，其數值=1/血清稀釋度，FA=弗氏佐劑。 TYPE\WCK\WK：C.B\39477SUP DQC -2-

Claims (1)

1. 496897 A8 B8 C8 D8 第084109561號專利申請案 中文申請專利範圍修正本（91年5月）

   專利範圍 Ό1Γ5· 24 補充丨 年月曰 1. 一種衍生自愛氏頓病毒（EBV)之同質gp350蛋白質， 其係選自包括下列之群： ㈤胺基酸19至胺基酸862 ; (b)胺基酸1至胺基酸8 6 2 ; (C)胺基酸19至胺基酸862和胺基酸882至胺基酸 9 0 7 ； (d)胺基酸1至胺基酸862和胺基酸882至胺基酸90 7 ; 及 •裝 ⑹胺基酸1至胺基酸907，其中刪除在穿透膜區域上 編碼至少8個胺基酸之核菩酸， 其中胺基酸之位置係相對於下列之序列： Eco RI GAATTCCATA AATGAAACAC GCTGGTCAGG TGTTAAAACT TCCTCCCAGA TTTTCGTGAG 60 GCTCCTGTGT ATAGCCATAT AGTCAAAGAA AATACTGTAG CGGGGA1TAC AGCTCTGTAC 120 AATGTTACCC ACGGAGCTCT GAACATACAA CCACTGGCGA TCCCCGGGGG TACATCGCGG ISO CAGCTTAAAG GTGCCGGCGG AAAAGGTCAC GTGACACCTA CGGCCACCTG TGCACCCAAG 240 TGTCGCCTGG AGATGTACGA ATGTGGGAGT CGTCTGGTGA TCGGTGTAGC TGTACATCCA 300 GCTGCTGTAT GCCTGGTAAC CCATAGGCCA TCCGGCGGCC AGGGTTTGCA GTCTCCAnT 360 GGCCTGATCT CTACGAGAAG CrGGATITCT CCGACGATCT CTAATGGCCT GTCGAATGGC 420 CATGGCATAC ATTATGTACA TCTCGGTATT TGAAATCTGG ATCCGAAAAA CTGGTCTATG 430 GCTCGTGTGT CGATGCGCTG AAACCAACGG CAACAAATTA CTTACCTTGT TGTTGTGTGA 540 TGGGTAAAAA CACACATCAC ACACTTAGGC CATAGGGATG CTCACCGTAG CCGCGGCTCC 600 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐） 496897 Λ 8 Β8 C8 D8 々、申請專利範圍 AATCGCTTGA AGAAGTGTTC TTAGATCTAG TGGAAACCTG CGGAGAATGG CTTCTCGCCC 660 AGGGAGATCC GGCTGGGGTG GGAGCATGGG TCGTGCTGGA GCTGACCCAC CGGCATCATG 720 ATCGACCCGC TTTCTCTTCG TACCCTTCrG GGCCGGCTCC AGGTGGGCAT CTTCrGCTTC 7 80 CTTTrCTGAG CTGCTATCTG ATAACTCTAT GAGGACATTT TCCCAATCTC CCGCCGATAC 340 CTGTTCCTGC ACAACCGAGG TAGATGGGAC TTCTTCTTCC ATGTTGTCAT CCAGGGCCGG 900 GGGACCCGGC CrGTCCTTGT CCATnTGTC TGCAACAAAA GTGTGACTCA CCAACACCGC 950· ACCCCCCTTG TACCTAITAA AGAGGATGCT GCCTAGAAAT CGGTGCCGAG ACA ATG 1016 Met I GAG GCA GCC TTG CTT GTG TGT CAG TAC ACC ATC CAG AGC CTG ATC CAT 1064 Glu Ala Ala Leu Leu Val Cys Gin Tyr Thr lie Gin Ser Leu He His S 10 15 CTC ACG GGT GAA GAT CCT GGT ΤΤΓ TTC AAT GTT GAG ATT CCG GAA TTC 1X12 Leu Thr Gly Glu Asp Pro Gly Phe Phe Asn Va.1 Glu lie Pro Glu Phe ， 20 25 30 CCA ΤΤΓ TAC CCC ACA TGC AAT GTT TGC ACG GCA GAT GTC AAT GTA ACT 11^0 Pro Phe Tyr Fro Thr Cys Asn Val Cys Thr Ala Asp Val Asn Val Thr 35 40 45 ATC AAT TTC GAT GTC GGG GGC AAA AAG CAT CAA CTT GAT CTT GAC ΤΊΤ 1203 工le Asn Phe Asp Val Gly Gly Lys Lys His Glra Leu Asp Leu Asp Phe 50 55 60 6S GGC CAG CTG ACA CCC CAT ACG AAG GCT GTC TAC CAA CCT CGA GGT GCA I2S$ Gly Gin Leu Thr Pro His Thr Lys Ala Val Tyr Gin Pro Arg Gly Ala 70 75 80 TTT GGT GGC TCA GAA AAT GCC ACC AAT CTC TTT CTA CTG GAG CTC CTT 1304 Phe Gly Gly Ser Glu Asn Ala Thr Asn Leu Phe Leu Leu Glu Leu Leu SS 90 9S -2 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 496897 A 8 B8 C8 D8 V、申請專利範圍 GGT GCA GGA GAA TTG GCT CTA ACT ATG CGG TCT AAG AAG CTT CCA ATT 1352 Gly Ala Gly Glu L^u Ala Leu Thr Met Arg Ser Lys I*ys Leu PrO lie 100 105 110 AAC GTC ACC ACC GGA GAG GAG CAA CAA GTA AGC CTG GAA TCT GTA GAT 140Q Asn val Thr Thr Gly Glu Glu Gin Gin Val Ser Leu Glu Ser Val Asp 115 120 12S GTC TAC ΤΊΤ CAA GAT οτα TIT GGA ACC ATG TGG TGC CAC CAT GCA GAA 1449 Val Tyx Phe Gin Asp Val Phe Gly Thr Met Trp Cys His His Ala Glu 130 135 140 14S

   ATG CAA AAC CCC GTG TAC CTG ATA CCA GAA ACA GTG CCA TAC AtA AAG 1495 Met: Gin Asn Pro Val Tyr Leu lie Pro Glu Thr VaJL Pro Tyr lie Lys 150 155 160 裝 TGG GAT AAC TGT AAT TCT ACC AAT ATA ACG GCA GTA GTG AGG GCA CAG 1544 Trp Asp Asn Cys Asn Ser Thr Asn lie Thr Ala Val Val Arg Ala Gin 155 170 175 GGG CTG GAT GTC ACG CTA CCC TTA AGT TTG CCA ACG TCA GCT CAA GAC Gly Leu Asp Val Thr Leu Pro Leu Ser Leu Pro Thr Ser Ala Gin Asp 130 165 190 TCG AAT TTC AGC GTA AAA ACA GAA ATG CTC GGT AAT GAG ATA GAT ATT Ser Asn Phe Ser Val Lys Thr Giu Leu Gly Asn Glu lie Asp lie 195 200 20S GAG TGT ΑΊΤ ATO GAG GAT GGC GAA ATT TCA CAA QTT CTG CCC GGA GAC Glu Cys lie Mec Glu Asp Gly Glu Ue Ser Gin Val Leu Pro Gly Asp 210 215 220 22S AAC AAA ΤΤΓ AAC ATC ACC TGC AGT GGA TAC GAG AGC CAT GTT CCC AGC Asn Lys Phe Asn 工le Thr Cya Ser Gly Tyr Glu Ser His VaJL Pro Ser 230 235 240 1592 1640 訂 參 1688 ： 173$ GGC GGA ATT CTC ACA TCA ACG AGT CCC GTG GCC ACC CCA ATA CCT GGT 1784 Gly Gly lie I^eu Thr Ser Thr Ser Pro Val Ala Thr Pro lie Pro Gly -245 250 2S5 -3- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210.x 297公釐） 496897 Λ 8 Β8 C8 D8 v、申請專利範圍 1332 ACA GGG TAT "GCA TAC AGC CTG CGT CTG ACA CCA CGT CCA GTG TCA CGA Thr Gly Tyr Ala Tyr Ser Leu Arg Leu Thr Pro Arg Pro Val Ser Arg 260 265 270 1880 ITT CTT GGC AAT AAC AGT ATC CTG TAC GTG ΤΓΤ TAC TCT GGG AAT GGA Phe Leu Gly Asn Asn Ser lie Leu Tyr Val Phe Tyr Ser Gly Asn Gly 275 230 285 [►•in CCG AAG GCG AGC GGG GGA GAT TAC TGC ATT 57 CAG TCC AAC ATT GTG TTC 1928 Pro Lys Ala Ser Gly Gly Asp Tyr Cys lie Gin Ser Asn 工le Val Phe 290 29S 300 30S 1976 TCT GAT GAG ATT CCA GCT TCA CAG GAC ATG CCG ACA AAC ACC ACA GAC Ser Asp Glu lie Pro Ala Ser Gin Asp Met Pro Thr Asn Thr Thr Asp 310 315 320 2024 ATC ACA TAT GTG GGT GAC AAT GCT ACC TAT TCA GTG CCA ATG GTC ACT He Thr Tyr Val Gly Asp Asn Ala Thr Tyr Ser Val pro Met Val Thr 325 330 335 AAT Asn 2072 TCT GAG GAC GCA AAC TCG CCA Ser Glu Asp Ala Asn Ser Pro GTT ACA GTG ACT GCC TTT TGG GCC Val Thr Val Thr Ala Phe Trp Ala 340 345 350 TGG CCA AAC AAC ACT GAA ACT GAC ΤΓΓ AAG TGC AAA TGG ACT CTC ACC Trp Pro Asn Asn Thr Glu Thr Asp Phe Lys Cys Lys Trp Thr Leu Thr 35S 360 365 2120 TCG GGG ACA CCT TCG GGT TGT GAA AAT ATT TCT GGT GCA ΤΤΓ GCG AGC Ser Gly Thr Pro Ser Gly Cys Glu Asn lie Ser Gly Ala· Phe Ala Ser 370 375 380 3SS AAT CGG ACA ΤΓΓ GAC ATT ACT GTC TCG GGT CTT GGC ACG GCC CCC AAG Asn Arg Thr Phe Asp lie Thr Vai Ser Gly Leu Gly Thr Ala Pro Lys 330 395 400 ACA CTC ATT ATC ACA CGA ACG GCT ACC AAT GCC ACC ACA ACA ACC CAC Thr Leu lie lie Thr Arg Thr Ala Thr Asn Ala Thr Thr Thr Thr His 405 410 41S 2163 2216 2254 -4- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 x 297公釐） 496897 Λ8 B8 C8 D8 々、申請專利範圍 AAG αττ ΑΤΑ ttc tcc aag GCA ccc gag AGC ACC ACC ACC TCC CCT ACC 2312 Lys Val lie Phe Ser Lys Ala Pro Glu Ser Thr Thr Thr Ser Pro Thr 420 425 430 TTG AAT ACA ACT GGA TTT GCT GAT CCC AAT ACA ACG ACA GGT CTA CCC 2350 Leu Asn Thr Thr Gly Phe Ala Asp Pro Asn Thr Thr Thr Gly J^eu Pro 435 440 445 AGC TCT ACT CAC GTG CCT ACC AAC CTC ACC GCA CCT GCA AGC ACA GGC 2408 Ser Ser Thr His Val Pro Thr Asn Leu Thr Ala Pro Ala Ser Thr Gly 4S0 455 460 465 CCC ACT GTA TCC ACC GCG GAT GTC ACC AGC CCA ACA CCA GCC GGC ACA . 2456 Pro Thr Val Ser Thr Ala Asp Val Thr Ser Pro Thr Pro Ala Gly Thr 470 47S 430 ACG TCA GGC GCA TCA CCG GTG ACA CCA AGT CCA TCT CCA TGG GAC AAC 2504 Thr Ser Gly Ala Ser Pro Val Thr Pro Ser Pro Ser Pro Trp Asp Asn 485 490 495 r-DONOR GGC ACA GAA AGT AAG GCC CCC GAC ATG ACC AGC TCC ACC TCA CCA GTG 25S2 Gly Thr Glu Ser Lys Ala Pro Asp Met Thr Ser Ser Thr Ser Pro Val 500 505 510 ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC PiGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC 2600 Thr Thr Pro Thr Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr 51S 520 525 CCA ACC CCA AAT Asn GCC ACC AGC CCC ACC CCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC 2643 Pro Thr Pro Ala Thr Ser Pro Thr Pro Ala Val Thr Thr Pro Thr 530 535 540 54S CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA ARA ACA AGT CCT ACC TCA GCA 2695 Pro Asn Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala 550 555 S60 GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC ACC TTG GGA AAA ACA 2744 Val Thr Thr Pro Thr Pro Asa Ala Thr Ser Pro Thr Leu Gly Lys Thr 555 570 575 -5- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210X297公釐）

   裝

   496897 Λ 8 Β8 CS D8 申請專利範圍 2792 AGC CCCL ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA AAT GCC ACC AGC CCC Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro Aan Ala Thr Ser Pro 580 585 590 2340 ACC TTG GGA AAA ACA AGC CCC ACC TCA GCA GTG ACT ACC CCA ACC CCA Thr Leu Gly Lys Thr Ser Pro Thr Ser Ala Val Thr Thr Pro Thr Pro 5SS 600 60S AAT GCC ACC GGC CCT ACT GTG GC3A GAA Asn Ala Thr Gly Pro Thr Val Gly Glu ACA Thr 610 6lS AGT CCA CAG GCA AAT GCC Ser Pro Gin Ala Asn Ala 620 62S 2388 ACC AAC CAC ACC ΊΤΑ GGA GGA ACA AGT CCC ACC CCA GTA GTT ACC AGC Thr Asn His Thr Leu Gly Gly Thr Ser Pro Thr Pro Val Val Thr Ser 630 635 640 233S CAA CCA AAA AAT GCA ACC AGT GCT CfTT ACC ACA GGC CAA CAT AAC ATA Gin Pro Lys Asn Ala Thr Ser Ala Val Thr Thr Gly Gin His Asn Ila 645 650 655 2984 裝 ACT TCA AGT TCA ACC TCT TCC ATG TCA CTG AGA CCC AGT TCA AAC CCA Thr Ser Ser Ser Thr Ser Ser Met Ser Leu Arg Pro Ser Ser Asn Pro 660 $6S S70 3032 訂 GAG ACA CTC AGC CCC TCC ACC AGT GAC AAT TCA ACG TCA CAT ATG CCT Glu Thr Leu Ser Pro Ser Thr Ser Asp Asn Ser Thr Ser His Met Pro 67S 685ACCEPTOR 3〇a〇 ΊΤΑ CTA ACC TCC GCT CAC CCA ACA GGT GGT GAA AAT ATA ACA CAG GTG Leu Leu Thr Ser Ala His Pro Thr Gly Gly Glu Asn He Thr Gin Val 690 63S 700 705 3128 ACA CCA GCC TCT ATC AGC ACA CAT CAT GTG TCC ACC AGT TCG CCA GAA Thr Pro Ala Ser 工le Ser Thr His His Val Ser Thr Ser Ser Pro Glu 710 715 720 3176 CCC CGC CCA GGC ACC ACC AGC CAA GCG TCA GGC CCT GGA AAC AGT TCC Pro Arg Pro Gly Thr Thr Ser Gin Ala Ser Gly Pro Gly Asn Ser Ser 725 730 73S 3224 -6 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格(210 X 297公釐) 496897 A8 B8 C8 D8 ^、申請專利範圍 ACA TCC ACA AAA CCG GGG GAG GTT AA.T GTC ACC AAA GGC ACG CCC CCC Thr Ser Thr -Lys Pro Gly Glu Val Asn Val Thr Lys Gly Thr Pro Pro 740 745 750 CAA AAT GCA ACG TCG CCC CAG GCC CCC AGT GGC CAA AAG ACG GCG GTT Gin Asn Ala Thr Ser Pro Gin Ala Pro Ser Gly Gin Lys Thr Ala Val 75S 760 755 3272 3320 CCC ACG GTC ACC TCA ACA GGT GGA AAG GCC AAT TCT ACC ACC GGT GGA Pro Thr Val Thr Ser Thr Gly Gly Lys Ala Asn Ser Thr Thr Gly Gly 770 775 780 785 3363 AAG CAC ACC ACA GGA CAT GGA GCC CGG ACA AGT ACA GAG CCC ACC ACA Lys His Thr Thr Gly Kis Gly Ala Arg Thr Ser Thr Glu Pro Thr Thr 790 795 300瓜 574-1 GAT TAC GGC GGT QAT TCA ACT ACG CCA AGA CCG AGA TAC AAT GCG ACC 3416 3464 Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Thr Thr Pro Arg Pro Arg 80s aio Asn Ala Thr 815 ACC TAT CTA CCT CCC AGC ACT TCT AGC AAA CTG CGG CCC CGC TGG ACT Thr Tyr. Leu Pro Pro Ser Thr Ser Ser Lys Leu Arg Pro Arg Trp Thr 820 825 S30 3512 ΊΤΤ ACG AGC CCA CCG GTT ACC ACA GCC CAA GCC ACC GTG CCA GTC CCG Phe Thr Ser Pro Pro Val Thr Thr Ala Gin Ala Thr Val Pro Val Pro S35 B40 845 3563 CCA ACG TCC CAG CCC AGA TTC TCA AAC CTC TCC Pro Thr Ser Gin Pro Arg Phe Ser Asn Leu Ser 350 3S5 360 —«► TM ATG CTA GTA CTG CAG Met Leu Val Leu Qla 865 3603 TM TGG GCC TCT CTG GCT GTG CTG ACC CTT CTG CTG CTG CTG GTC Trp Ala Ser Leu Ala Val Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Val 870 375 380 ATG GCG met Ala I 3656 GAG TGC GCC ΠΤ AGG CGT AAC TTG TCT ACA TCC CAT ACC TAC ACC ACC Asp Cys Ala Phe Arg Arg Asn Leu Ser Thr Ser His Thr Tyr Thr Thr aes S90 89S 3704 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210 X 297公釐） 496897 Λ 8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 CCA CCA TAT GAT GAC GCC GAG ACC TAT GTA TAAAGTCAAT ΑΑΑΑΑΤΤΓΑΤ 3754 Pro Pro Tyr Aap Asp Ala Glu Thr Tyr Val POLY A 900 905 TAATCAGAAA TrTGCACnT CTTTGCTrCA CGTCCCCGGG AGCGGGAGCG GGCACGTCGG 3814 GTGGCGTTGG GGTCGTTTG 3833 2. —種分離之D N A序列，其編碼根據申請專利範圍第1 項之同質g p 3 5 0蛋白質之表現。 3. —種用於治療EBV -相關疾病或病症之醫藥組合物， 其包括根據申請專利範圍第1項之同質g p 3 5 0蛋白質與 在醫葯上可接受之載體混合。 4 .根據申請專利範圍第1項之同質g p 3 5 0蛋白質，係用作 製備適於預防治療EBV-有關疾病或病症之醫藥組合 物。 5 .根據申請專利範圍第1項之同質g p 3 5 0蛋白質，其中該 蛋白質進一步特徵在於相對於根據申請專利範圍第1項 所述之序列至少在位置5 0 1之絲胺酸及位置6 9 8之甘胺 酸置換。 -8- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) A4規格（210X297公釐）