DE69934324T2

DE69934324T2 - Behandlung von entzündungskrankheiten

Info

Publication number: DE69934324T2
Application number: DE69934324T
Authority: DE
Inventors: Stavros Gabriel PANAYI; Mary Valerie CORRIGALL; Duncan Mark BODMAN-SMITH; Stewart Mark FIFE; Shaun Jeremy LANCHBURY
Original assignee: Kings College London
Current assignee: Kings College London
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2019-10-09
Also published as: DE69934324D1; ATE347561T1; US6995240B1; GB9822115D0; WO2000021995A1; CA2344590C; DK1117685T3; CA2344590A1; AU754888B2; JP4435422B2; ES2277449T3; EP1117685B1; AU6215499A; CN1253470C; EP1117685A1; JP2003523167A; CN1322213A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft entzündliche Erkrankungen und im Besonderen rheumatische Arthritis.
Die rheumatische Arthritis (RA) ist eine chronische Entzündungskrankheit der Synovial-gelenke, welche zur Zerstörung der Gelenke, Behinderung und frühem Tod führt. Obwohl der Auslöser für RA gegenwärtig nicht bekannt ist, wurde angeregt, dass es sich beim Typ II Kollagen, welches überall im Gelenkknorpel vorkommt, um ein mögliches Autoantigen für die RA handelt. Es wurde kürzlich vorgeschlagen, dass gp39, ein 39 Kd Glykoprotein, sowie davon abgeleitete Peptide, solche Autoantigene sind. Jedoch sind die Daten, welche diese Hypothese unterstützen, recht begrenzt und die Rolle die gp39 spielt bleibt deshalb ungewiss.
Die vorliegende Erfindung resultiert aus einem anderen Ansatz, basierend auf einer Studie an Chondrozyten, einem spezialisierten Zelltyp im Gelenkknorpel. Es wurde ein Protein aus humanen Chondrozyten und humanen Chrodrosarkom-Zelllinien isoliert, welches mit Antikörpern im Serum von RA-Patienten reagiert und das den akzeptierten Kriterien für ein mutmaßliches Autoantigen entspricht. Das aufgereinigte Protein wurde auf die Proliferation von T-Zellen hin untersucht und es wurde gezeigt, dass selektiv synoviale T-Zellen von Patienten mit RA proliferieren. Bei diesem Protein handelt es sich um das an die schwere Kette des Immunglobulins bindende Protein (Immunglobulin-heavy chain-Bindeprotein) BiP (GRP78), das nachfolgend als p78 bezeichnet wird.
Die internationale Patentanmeldung WO 99/18131 schlägt den Nachweis von Antikörpern gegen ein BiP, das aus HeLa-Zellen gewonnen wurde, als diagnostische Indikation für die RA vor. Jedoch beschreibt diese frühere Veröffentlichung nicht die Extraktion von BiP aus HeLa-Zellen in reproduzierbarer Art und Weise und ist deshalb für die praktische Anwendung nicht ausreichend. Es wurde nun das richtige Autoantigen gegen die RA gewonnen und identifiziert. Diese Entdeckung führt zur Entwicklung von prognostischen und diagnostischen Tests für diese Krankheit und die spezifische Therapie. Die DNA für dieses Protein wurde isoliert und sequenziert. Diese DNA wurde auch kloniert und exprimiert. Die Aminosäure- und DNA-Sequenzen sind neu und werden in der Sequenzliste, die dieser Beschreibung folgt, aufgeführt. Die Aminosäuresequenzen des BiP-Proteins werden in der Sequenzliste in zwei Versionen, SEQ ID Nr. 1 und SEQ ID Nr. 2, aufgeführt und können gleichermaßen als Testreagenz verwendet werden. Die cDNA für die SEQ ID Nr. 1 ist in der Sequenzliste als SEQ ID Nr. 3 aufgeführt. Diese Sequenz ist bei der GENBANK unter der Zugriffsnummer AF 188611 hinterlegt. Ein Vergleich der Sequenz mit der Zugriffsnummer X 87949 aus der GENBANK wird nachfolgend geliefert.
Der erste Teil der folgenden Beschreibung beschäftigt sich mit der Charakterisierung eines solchen Autoantigens; der zweite Teil mit der Klonierung, Sequenzierung und Expressions des Proteins; und der dritte Teil mit der Darstellung der Spezifität des Autoantigens bezogen auf die Krankheit (rheumatische Arthritis) und das Gewebe (Synovialbereich).
Teil 1: Charakterisierung des Autoantigens
Chondrozyten/Chondrosarkomzellen
Die Chondrozyten wurden aus Knorpelmaterial isoliert, das während Gelenkerneuerungen gewonnen wurde. Der Knorpel wurde fein zerkleinert und mit 1 mg/ml Kollagenase (Worthington) verdaut. Nach diesem Verdau wurden die Zellen bei 300 g zentrifugiert und in Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM) (Life Technologies, Paisley, UK), das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) (Harlan Sera-Lab, Loughborough, UK) angereichert ist, resuspendiert. Die Zelltrümmer wurden nach 24 Stunden von den adherenten Zellen abgewaschen und die Zellen konnten sich bis zur Konfluenz vermehren. Die Zellen unter Verwendung von Trypsin (0,25%) passagiert und 1:3 aufgeteilt.
Die Chondrosarkom Zelllinien (HTB94) (SW1353) wurden von der American Type Culture Collection ATCC (Rockville, Maryland, USA) und von Dr. J. Block, Rush University, Chicago, USA (persönliches Geschenk) bereitgestellt. Diese Zellen wurden in DMEM mit 10% FCS kultiviert und 1:3 aufgeteilt, nachdem sie bei Konfluenz vorsichtig trypsiniert (0,25% Trypsin, Life Technologies, Paisley, UK) wurden.
Vorbereitung der Zelllysate
Die Zellen wurden von der Flaschenoberfläche gekratzt und im Beisein von Proteinaseinhibitoren, PMSF (2 mM), Leupeptin (200 μg/ml) und Aprotinin (50 μg/ml) (Sigma, Poole, UK), homogenisiert und beschallt.
Natrium-dodecylsulfat (SDS) (Sigma, Poole, UK) wurde bis zu einer Endkonzentration von 1% zugegeben und die Proteine bei Raumtemperatur über eine Stunde aufgeschlossen. Die Proteinkonzentration wurde durch ein Bicinchoninsäure-Assay unter Verwendung von Bovinem Serumalbumin (BSA) als Standardprotein (Sigma) und den Zelllysaten als 10 μg/well Äquivalente, abgeschätzt.
Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Western Blot
Das Mini Protean System (BioRad Laboratories, Hemel Hempstead, UK) wurde verwendet, um die Gele laufen zu lassen. Es wurden 5-, 7,5- oder 10-%ige denaturierende SDS-Polyacrylamidgele mit einer Stärke von 1,5 mm hergestellt (siehe Anhang 1). Die Gele wurden mit 10 μg Protein/well beladen, oder es wurde gleichviel auf ein präparatives Gel geladen. Die Elektrophorese wurde beim konstanten 100 V durchgeführt und Broad Range Kaleidoscope Molekulargewichtsmarker (BioRad) liefen parallel zu den Zelllysaten.
Nach der Elektrophorese wurden die Proteine bei konstenten 100 V für eine Stunde auf Nitrozellulose geblottet (siehe Anhang 1). Die Nitrozellulose wurde anschließend mit 3% BSA blockiert und über Nacht bei 4°C belassen. Die präparativen Membranen wurden falls erforderlich in 16 schmale Streifen, jeder mit einem identischen Proteinprofil, geschnitten. Die Membranen wurden mit Patientenserum (1/100 Verdünnung) oder spezifischen monoklonalen Antikörpern (mit der nötigen Konzentration) für 1 Stunde bei Raumtemperatur geprobt und dann 3× über eine Stunde in TTBS (siehe Anhang 1) gewachen. Der Sekundärantikörper, Ziege anti-Mensch IgG (Fab²) mit Horse-Radish-Peroxidase (Sigma) konjugiert, wurde in einer 1/1000 Verdünnung zugegeben und für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden dann 3×. über eine Stunde in TTBS gewaschen. Verstärkte Chemilumineszenz (Amersham) wurde verwendet um das System zu entwickeln und die Antigen-Antikörper-HRP komplexe erschienen nach der Entwicklung als einzelne Banden auf dem Photofilm.
Isolierung des möglichen Autoantigens p78
Die Bande von Interesse war in etwa 30% der Seren der rheumatischen Arthritis, die wie vorhin beschrieben für das Screening der Zelllysate verwendet wurden, zu sehen.
Um das Protein zu isolieren, wurden das Zelllysat mit einem 30,000 MW Cut-off Filter 23fach konzentriert. Das Protein wurde dann im Parallelansatz auf 5% und 7,5% Gele geladen. Eine Spur auf jedem Gel wurde mit normaler Proteinkonzentration geladen, während die beiden anderen Spuren überladen wurden. Kaleidoskop Molekulargewichtsmarker wurden beiderseits der Testspur geladen. Die Gele wurden wie vorher beschrieben so lange laufen gelassen, bis der Kaleidoskop Molekulargewichtsmarker zeigte, dass sich das 70,000 MW Protein im unteren Drittel des Gels, nahe dem Auslaufpunkt befindet. Die Gele wurden dann auf PVDF Membran geblottet (Immobilon P, Millipore), die unmittelbar nach dem vollständigen Transfer der Proteine in destilliertes Wasser gelegt wurde. Der Streifen mit der normalen Beladung wurde für die Immundetektion der Proteinbande verwendet. Der entwickelte Film dieser Immundetektion und die Ponceau-Rot-Färbung der überladenen Streifen wurden nach der Lufttrocknung zur Identifikation der Bande auf der Membran verwendet. Diese Streifen wurden dann gebraucht, um das Protein zu isolieren und unter Verwendung einer Matrixunterstützten Laserdesorption/Ionisation (MALDI) Spektrometrie sequenziert.
Die elektrogeblotteten Proteine wurden mit Ponceau S (0,05% wässriges Methanol/0,1% Essigssäure) mit Hilfe eines Schnellfärbe-Protokolls (1) gefärbt. Die getrockneten und gefärbten Proteine wurden anschließend in situ mit Trypsin (Boehriger, modifiziert) verdaut und die Peptide mit 1:1 v/v Ameisensäure:Ethanol (2) extrahiert. Ein 0,2 μl Aliquot (etwa 5% des gesamten Verdaus) wurde als Probe genommen und direkt durch eine Matrixunterstützte Laserdesorption/Ionisation (MALDI) Time-of-Flight Massenspektrometrie mit einem LaserMat 2000 Massenspektrometer (Thermo Bioanalysis, UK) (3) analysiert. Ein zweites 0,2 μl Aliquot wurde mit 1% v/v Thionylchlorid in Methanol esterifiziert und ebenfalls mit MALDI analysiert, um die Zusammensetzung der Säurereste (4) zu erhalten. Die nativen und esterifizierten Peptide wurden dann gegen die MOWSE Peptid-Fingerprint Datenbank (5) überprüft. Die verbleibenden verdauten Peptide (90% des Gesamtverdaus) wurden dann mit N-Succinimidyl-2(3-pyridyl) acetat (SPA) reagiert, um die Häufigkeit von b-Ionen zu verstärken und die Sequenzanalyse durch Tandem-Massenspektrografie zu erleichtern. Die getrockneten Peptidfraktionen wurden mit 7 μl 1% w/v N-Succinimidyl-2(3-pyridyl) acetat in 0,5 M HEPES (pH 7.8 mit NaOH eingestellt), das 15% v/v Acetonitril enthält, für 20 min auf Eis behandelt. Die Reaktion wurde durch 1 μl Heptafluorbutylsäure (HFBA) abgestoppt und die Lösung wurde unmittelbar in eine kapillare Umkehrphasensäule (300 μm × 15 cm) injiziert, die mit POROS R2/H Material (Perseptive Biosystems, MA) gepackt, mit 2% v/v Acetonitril/0,05% v/v TFA equilibriert war und mit einer Laufgeschwindigkeit von 3 μl/min. Die adsorbierten Peptide wurden mit 10% v/v Acetonitril/0,05% v/v TFA für 30 Minuten isokratisch gewaschen, um das überschüssige Reagenz und den HEPES Puffer zu eluieren. Die derivatisierten Peptide wurden anschließend in einem Single-Step Gradienten gegen 75% v/v v Acetonitril/0,05% v/v Ameisensäure eluiert und in einer einzelnen 4 μl Fraktion gesammelt. Die derivatisierten Peptide wurden dann durch niedrigenergetische stoßinduzierte Fragmentierung (CAD) mit einem Finnigan MAT TSQ7000, der mit einer Nanoelektrospray-Quelle (7,8) ausgerüstet war, sequenziert. Die CAD wurde unter einem Argondruck von 2,5 mTorr und stossinduzierenden Offset-Spannungen zwischen –18 V und –28 V durchgeführt. Die Produkt-Ion Spektren wurden mit Q3 und einer Scangeschwindigkeit von 500 amu/sec gesammelt.
Ergebnisse

Sequenzdaten erhalten von einem 7,5% Gel (Einzelbande)
Von GR78_human
Spezifisch identifizierende Peptide: NQLTSNPENTVFDAK 82–96 SIDIDEIVLVGGSTR 353–366 TWNDPSVQQDIK 107–113
Identifiziertes menschliches Protein GR 78: KD Glucose Regulierter Protein precursor (GRP78) Immunglobulin-heavy chain-Bindeprotein (an die schwere Kette des Immunglobulins bindendes Protein) (BiP)

Teil 2: Klonierung, Sequenzierung und Expression von p78
1) Isolierung der mRNA und PCR-Amplifikation der identifizierten Gene
Humane Chondrozyten wurden wie beschrieben isoliert und über drei Wochen kultiviert. Die Poly(A) mRNA (1–2 μg) wurde mit Hilfe eines Micro-Fastrack Kits (Invitrogen) aus einer Gesamtmenge von 1–2 × 10⁶ Zellen isoliert. Ein Mikrogramm der erhaltenen mRNA wurde unter Verwendung von 1 μl Moloney Murine Leukemia Virus Reverser Transkriptase (200 μ/μl); 5 × First Strand Buffer (Tris-HCl pH 8.3, 250 mM; KCl 375 mM; MgCl 15 mM; 0,1M DTT; oligo-dT_(12-18) 20 ng/μl (Life Technologies); und dNTP Mix 100 mM (Amersham Pharmacia Biotec, Upsala, Schweden) in einem Volumen von 20 μl bei einer Temperatur von 45° C für 1 Stunde in cDNA revers transkribiert.
Die PCR wurde in einem Reaktionsvolumen von 50 μl bei Standardbedingungen (siehe unten) in einem Perkin Elmer Applied Biosystems Thermo Cycler PE2400 durchgeführt. Die Primersequenzen wurden aus der GenBank Datenbanksequenz, mit der Zugriffsnummer X87949, dem humanen Gen für das Immunglobulin-heavy chain-Bindeprotein, BiP (grp78) entsprechend, erhalten. Spezifische Primer wurden synthetisiert, um das Gen des mögliche Autoantigens aus der Chrodrozyten cDNA zu amplifizieren. Das erhaltene PCR Produkt bestand aus dem Großteil der grp78 Kodierungssequenz, ohne die nicht-translatierten Regionen, die Signalsequenzen und das Stop-Codon (Nukleotidpositionen 279–2169 der grp78 Datenbanksequenz).
Die Primer Sets für die PCR waren mit integrierten Restriktionsschnittstellen versehen, um eine schnelle Subklonierung der cDNA in den bakteriellen Expressionsvektor zu ermöglichen. Der Forward-Primer kodierte eine NdeI Schnittstelle und der Revers-Primer enthielt eine XhoI Restriktionsschnittstelle: Die Sequenz für den Forward-Primer ist nachfolgend als SEQ ID No. 4 und die des Revers-Primers als SEQ ID No. 5 aufgeführt.
BiP Forward Primer 5' TATACATATGGAGGAGGACAAGAAGGAGGACG 3' (32mer)
BiP Revers Primer 5' CCACCTCGAGTTCTGCTGTATCCTCTCACCA 3' (32mer)
Nach der anfänglichen Denaturierung für 2 min bei 96°C wurde die PCR über 28 Zyklen durchgeführt, mit einen Zyklusprofil von 94°C für 30 s, 60°C für 30 s und 72° C für 2 min und einer abschließenden Verlängerung bei 72°C für 7 min. Die PCR Reaktion erzeugte ein einzelnes spezifisches BiP-Fragment mit einer Länge von 1890 Bp.
2) Klonierung der PCR-generierten Fragmente
Die in die für die PCR verwendeten Forward und Reverse Primer eingebauten Restriktionsschnittstellen erfordern flankierende DNA, um durch die spezifischen Endonukleasen (NdeI und XhoI) erkannt zu werden. Um diese flankierende DNA zu liefern, wurde das in der PCR generierte Fragment in dem PCR-Klonierungsvektor pCR2.1-TOPO (Invitrogen) kloniert. Die ligierten Plasmide wurden in kompetente E. coli XL1-Blue (Stratagene) transformiert und die Plasmid-DNA wurde mit Miniprep-Säulen (Quiagen) extrahiert. Die aufgereinigte Plasmid-DNA für den Klon wirde BiP-TOPO genannt. Diese DNA Proben wurde bei –20°C aufbewahrt. Die aufgereinige Plasmid-DNA für BiP-TOPO wurde mit NdeI und XhoI verdaut. Die Restriktionsfragmente wurden auf einem Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit dem DNA Gelextraktionskit von Quiagen aufgereinigt.
3) Subklonierung der geschnittenen Genfragmente in einen bakteriellen Expressionsvektor
Das aufgereinigte Fragment für den Klon wurde in den mit NdeI/XhoI vorverdauten bakteriellen Expressionsvektor pET30a (Novagen) ligiert. Die Ligation wurde über Nacht bei 12°C und dem Beisein von T4 Ligase (20 Units und 1/10 Volumen eines 10 × Ligasepuffers (von Promega zusammen mit der T4 Ligase bereitgestellt) durchgeführt. Die ligierten Fragmente wurde in kompetente E. coli XL1-Blue (Stratagene) transformiert und mit BiP-spezifischen Primern in einer Colony-PCR überprüft. Die positiven Transformanten, die das notwendige rekombinante Plasmid tragen, wurden aufgereinigt und in den kompetenten E. coli Expressionsstamm BL21-(DE3) (Invitrogen) transformiert. Es ist selbstverständlich so zu verstehen, dass die Klonierung in prokarotischen oder eukaryotische Wirte, einschließlich von Bakterien, Insektenzellen und Säugerzellen, erfolgen kann. Bevorzugt solche Wirte, die eine Glykosylierung des exprimierten Produktes gewährleisten.
4) Sequenzierung des 1890Bp pET30::BiP Subklons
Die Sequenzierung der 5' und 3' terminalen Enden des pET30::BiP Klones bestätigte, dass sich das rekombinante DNA-Molekül in-frame mit dem ATG-Startcodon auf dem pET30 Vektor befand und dass sich ein Durchlesen von dieser Seite durch das BiP-Gen fortsetzte und mit den sich am 3' Arm des Expressionsvektors befindlichen 6x His-Resten und dem Stop-Codon endet.
Eine gründliche DNA-Sequenzierung wurde mit synthetischen Oligonukleotidprimern durchgeführt, welche die gesamte Länge des BiP-Subklons überspannten. Die Sequenzanalyse des neu subklonierten BiP-Fragments wurde mit vergleichendem Alignment gegen die bestehende grp78 Sequenz aus der Datenbank (Zugriffsnummer X87949) durchgeführt. Eine Reihe von Unterschieden zwischen den beiden Sequenzen wurde sowohl auf DNA-Ebene als auch auf Proteinebene entdeckt (siehe Anhang 4). Diese Bereiche der Nichtübereinstimmung können entweder das Ergebnis von Fehlern in der ursprünglichen DNA-Sequenzierung (von grp78) sein, oder sie weisen auf die Präsenz eines weiteren verwandten, aber geringfügig unterschiedlichen BiP-Genes im Genom hin.
Sämtliche DNA-Sequenzierungen wurden auf dem automatischen DNA Sequenzierer ABI377 von Applied Biosystems mit dem dRhodamin Dye Terminator Kit (Perkin Elmer – Applied Biosysystems) durchgeführt.
Expression der rekombinanten Proteine in Bakterien und Aufreinigung
Der E. coli Expressionsstamm BL21-(DE3), der das rekombinante pET30a-BiP Plasmid enthält, wurde bei 37°C in LB-Medium mit Kanamycin (50 μg/ml) kultiviert.
Nachdem die Zellen eine OD₆₀₀ von 0,6 Einheiten erreicht hatten, wurde dem Medium Isopropyl-βD-thiogalactopyranosid (IPTG) zugegeben, um die durch den IPTG-induzierbaren Promotor des Expressionsvektors gesteuerte Expression des rekombinanten Proteins zu induzieren. Um die maximale Expression des rekombinanten Proteins zu ermöglichen, wurde die Kultur für weitere 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletiert und bei –70°C gelagert.
Für die Aufreinigung der rekombinanten Bakterienproteine wurden die Pellets in Binding Buffer (20 mM NaPO₄, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazol, 1 mM PMSF, 1 mg/ml Lysozym, 5 Units/ml DNAse, 0,1% Triton X-100, pH 7.4) lysiert. Das Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt, um unlösliche Stoffe und Zellbestandteile zu entfernen. Das geklärte Lysat wurde über eine mit Binding Buffer equlibrierte HiTrap Chelating Affinitätssäule mit einem Füllvolumen von 5 ml, geschickt. Das unspezifisch gebundene Protein wurde unter stringenten Bedingungen mit einer Serie von drei Waschpuffern von der Säule abgewaschen. Der erste Waschschritt wurde mit 100 ml Binding Buffer durchgeführt. Darauf folgte ein hoch stringenter Waschschritt bei niedrigem pH (20 mM NaPO₄, 500 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 5.5) und ein weiterer hoch stringenter Waschschritt mit 100 ml von 20 mM NaPO₄, 500 mM NaCl, 50 mM Imidazol, pH 7.4.
Die rekombinanten Proteine mit den Histidin-Tags wurden durch ein Strippen mit 50 mM EDTA aus der Säule eluiert. Die eluierten Proteine wurden über Nacht gegen 1 × PBS dialysiert, um Kontaminationen mit EDTA und Ni zu entfernen. Das aufgereinigte Protein wurde in einer 50000 MW Cut-Off Konzentrationssäule (Millipore) aufkonzentriert und in sterilem PBS gewaschen. Die Gesamtmenge an Protein wurde mit dem Bicinchoninsäure-Assay durch Spektrophotometrie und mit BSA als Standard, bestimmt.
Immunologische Untersuchungen in experimenteller Arthritis
Antikörperantwort auf p78 in experimenteller Arthritis
Kollagen-induzierte (CIA) und Pristan-induzierte Arthritis (PIA) wurde in DBA/1 Mäusen gemäß unseres bereits früher beschriebenen Protokolls induziert. Die Mäuse wurden vor der Induktion der Arthritis (15 Tiere) geblutet (Prebleed), bei Beginn der CIA (16 Tiere) und bei Beginn der PIA (14 Tiere). Der gegen p78 gerichtete Antikörper im Mausserum, wurde durch einen enzymgekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA) mit rekombinantem p78 bestimmt. Nunc 96-Well ELISA Platten (Fisher Biotech, Orangebwg, NY) wurden über Nacht bei 4°C mit p78, mit 500 ng (in 100 ml fettarmer Milch/PBS) pro Well, beschichtet. Nach dreimaligem Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 0,05% Tween-20 enthält, wurden die Platten über Nacht bei 4°C mit 5% fettarmer Milch/PBS gesättigt. Die Mausseren wurden in einer Verdünnung von 1:200 zu den Wells zugegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wurde gewaschen. 100 ml Ziege anti-Maus Ig konjungiert mit Alkalischer Phosphatase (Anti-Ig-Ak: 1:500 Verdünnung in Milch/PBS/Tween-20, Fisher Biotec) wurde für 60 Minuten bei 37°C zugegeben. Nach drei Waschschritten mit PBS/Tween-20, wurde 100 ml p-Nitrophenylphosphat Lösung (PNPP Tabletten, Sigma Chemicals; St. Louise, MO) in Dietholaminpuffer zu jedem Well zugegeben. Die Reaktion konnte für 30 Minuten im Dunkeln ablaufen und die Platte wurde in einem Spektrophotometer (Molecular Devices, Menlo Park, CA) bei 405 nm ausgelesen. Die Daten wurden mit der Analyse-Software SOFTmax analysiert. Die spezifische Bindung ergab sich aus der OD-Messung der p78-beschichteten Wells, abzüglich der OD-Werte nicht-beschichteter Wells, sowie auch ,blank' Werten ohne Serum. Die Antikörper-Titer wurden als OD₄₀₅ Einheiten ausgedrückt.
ERGEBNISSE
Identifikation eines Autoantigens
Als RA und Kontrollseren gegen Chondrozyten-Extrakte geblottet wurden, haben 30% der RA Seren, verglichen zu 10% der Kontrollseren (1), mit einem 78 kD Protein reagiert. Die Sequenzierung von drei tryptischen Peptiden durch niedrigenergetische CAD, wies einen Bestandteil der 78 kD Bande als das 78 kD glucose regulated (Glucose reguliertes) Protein, auch bekannt als Immunglobulin-heavy chain-Bindeprotein (BiP), nach. Eine Sequenzierung der p78 DNA aus artikulärer Chondrozyten-cDNA zeigte eine Reihe von Abweichungen von der publizierten Sequenz (Zugriffsnummer X87949). Die insgesamt sechs singulären Mutationen, sowie eine Condon-Insertion führen zu drei Aminosäureaustäuschen und der Insertion eines Arginin an der Position 834–836 von p78 (Zugriffsnummer AF 188611).
Immunologische Tests bei rheumatischer Arthritis
Es wurden die T-Zell-Proliferationsantworten für mononukleäre Zellpräparationen von gepaarten Proben von peripherem Blut und Synovialflüssigkeit aus 23 Patienten mit rheumatischer Arthritis und von 12 Krankheitsproben, bestimmt. Zwölf der 23 (52 Prozent) Patienten mit RA und nur 2 der 12 (17 Prozent) der Krankheitsproben zeigten eine gesteigerte synoviale Proliferation (2). Die Proliferationsantwort von synovialen T-Zellen aus RA auf p78 lag signifikant höher, als die der gepaarten Proben mit peripherem Blut (Stimulationsindex, durchschnittlich ± SEM: SF 3,5 ± 0,7; PB 1,6 ± 0,2; p < 0,01 Wilcoxon-Paired-Test). Ein signifikanter Unterschied ergab sich auch bei den Antworten der Synovialflüssigkeiten auf p78 zwischen RA Patienten und Krankheitskontrollen (SI: RA 3,5 ± 0,7; OIJD 1,4 ± 0,2; p = 0,03 Mann Whitney U Test). Es gab keine Assoziation mit HLA-DR, da 50% der Responder und Non-Responder HLA-DR4 positiv waren (Daten nicht gezeigt).
Die T-Zell-Proliferation von rheumatischer Synovialflüssigkeit gegen p78 wurde zu 66–84% durch den monoklonalen anti-HLA-DR Antikörper L243 (ATCC, Rockville, MD) (Daten nicht gezeigt), gehemmt.
Kein IFN-γ konnte in den Überständen der gepaarten mononuklearen Zellen aus der Synovialflüssigkeit und dem peripheren Blut gemessen werden (Daten nicht gezeigt), trotz einer ELISA-Sensitivität von 0,01 ng/ml. Es konnte kein IFN-γ durch intrazelluläre Fluoreszenz in den T-Zellen aus dem peripheren Blut von RA Patienten (n = 7) oder gesunden Kontrollpersonen (n = 2) nach einer Stimuation mit p78 nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse implizieren, dass die antwortenden T-Zellen wahrscheinlich nicht zum klassischen, IFN-γ produzierenden TH1-Subset, gehören [146].
Immunologische Studien in experimenteller Arthritis
Induktion von experimenteller Arthritis durch p78
Die Immunisierung von DAB/1, C57BL Mäusen und Lewis Ratten mit p78 in Freund's complete adjuvans (CFA) führte nicht zur Entstehung von Arthritis (Daten nicht gezeigt). Es gab einen ähnlichen Mangel an arthritischem Potential von p78 bei der Injektion zusammen mit CFA in HLA-DR1^+/+ (0/10 Mäuse) oder in HLA-DR4^+/– (0/5) Mäuse.
Immunantwort auf p78 in experimenteller Arthritis
Trotz des Misserfolgs, durch die Immunisierung von Tieren mit p78 Arthritis auszulösen, untersuchten wir, ob DBA/1 Mäuse während des Verlaufs einer Kollagen-induzierten (CIA) oder einer Pristan-induzierten (PIA) Arthritis Antikörper gegen p78 entwickeln (3). Die Mäuse entwickeln anti-p78 Antikörper im Serum bei Ausbruch der Kollagen-induzierten Arthritis (O.D. 0,189 ± 0,042, m ± sem) und der Pristan-indizierten Arthritis (0,504 ± 0,074) verglichen mit den „prebleed" Seren (0,070 ± 0,019; p< versus CIA und p< versus PIA, entsprechend). Außerdem war die Konzentration dieser Antikörper in den PIA Mäusen signifikant höher als in den CIA Mäusen. In jeder Gruppe waren 14 Mäuse.
Vermeidung von Kollagen-induzierter Arthritis durch intravenöse Gabe von p78
Die Anwesenheit von Antikörpern gegen p78 in den Seren von Mäusen mit CIA oder PIA legt nahe, dass die Manipulation der Immunantwort gegen p78 die nachfolgende Entstehung einer CIA durch einen Bystander-Effekt verhindern kann. HLA-DR1^+/+ Mäusen wurde intravenös 1 mg p78 injiziert, vor der Immunisierung mit Typ II-Kollagen in CFA eine Woche später (Tabelle 2). Während 83% der Tiere die mit Kochsalzlösung vorbehandelt wurden, nach 8 Wochen 46% ihrer Gliedmaßen von Arthritis betroffen hatten, waren nur 3% der Gliedmaßen von 10% der Tiere von Arthritis betroffen, der Gruppe welcher zuvor intravenöses p78 verabreicht wurde. Diese Unterschiede sind hoch signifikant (p ± 0,008 und p ≤ 0,0001). Die Tabelle 2 zeigt auch, dass es einen signifikanten Rückgang der anti-Kollagen Antikörper in den mit p78 vorbehandelten Tieren, auf ein Drittel des Titers in den Kontrollen, gab. Der Rückgang war in den IgG1 und IgG2 Isotypen gleich (Tabelle 3). Die Histologie der Gelenke dieser Tiere bestätigte die klinischen Befunde, dass es in den Gelenken der mit p78 vorbehandelten Mäuse keine Synovitis gab.
Wir haben in dieser Studie gezeigt, dass 30% der RA Patienten Antikörper haben, nachgewiesen durch Western Blot, die gegen das humane Chaperonin BiP/GRP78 und von uns p78 genannt, gerichtet sind. Außerdem proliferieren T-Zellen aus der rheumatischen Synovialflüssigkeit vorzugsweise auf p78. Es gab eine minimale Antwort der T-Zellen aus dem peripheren Blut derselben Patienten. Die T-Zellen von Patienten mit anderen entzündlichen arthritischen Formen, ob aus der Synovialflüssigkeit oder dem peripheren Blut, zeigten keine signifikante Proliferation auf p78. Abschließend wurde die Proliferationsantwort durch monoklonale anti-HLA-DR Antikörper gehemmt, was darauf hinweist, dass die CD4+ positiven T-Zellen auf antigene Peptide im Zusammenhang mit HLA-DR reagieren. Diese polyklonale T-Zell Antwort war nicht auf HLA-DR4 beschränkt. Demnach besitzt die durch p78 stimulierte T-Zell-Proliferation zwei Charakteristika, die von einem rheumatischen Autoantigen erwartet werden, es ist nämlich gelenk- und krankheitsspezifisch.
Basierend auf diesen Beobachtungen wurden intravenöse Immunisierungen von Mäusen mit p78 durchgeführt, um die Hypothese zu testen, dass die Umlenkung einer Immunantwort auf p78, die Entstehung einer CIA durch einen Bystander-Effekt verhindern würde. Dies stellte sich tatsächlich heraus, mit einer nahezu vollständigen Prophylaxe gegen die Induktion einer CIA in HLA-DR1^+/+ transgenen Mäusen. In der Vergangenheit wurden verschiedene Formen von experimenteller Arthritis durch die Gabe von bakteriellen, insbesondere mycobakteriellen, Heat Shock Proteinen, wie etwa HSP60 oder T-Zellen, die auf Gesamt-HSP60 oder spezifische Peptide reagieren, verhindert oder behandelt [2103, 2280, 2282, 2283, 2284, 2281]. Es ist jedoch wichtig anzumerken, dass Self-HSP60 Peptide keine solche schützende Wirkung zeigen [2281]. Deshalb ist die Fähigkeit von p78 eine CIA zu verhindern von grundlegender Bedeutung. Die in dieser Arbeit beschriebenen Beobachtungen sind unserem Wissen nach die ersten, die ein endogenes Chaperon mit der Pathogenese von RA und der Immuntherapie von experimenteller Arthritis in Verbindung bringen. Das Potential für eine Immuntherapie von RA ist klar ersichtlich.
2. Verwendung von Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen p78 in biologischen Flüssigkeiten oder Kulturüberständen
Verschiedene Techniken können verwendet werden, wie etwa Agglutination, Western Blot und ELISA
ELISA Protokoll für den Nachweis von Antikörpern gegen p78 im Serum
ELISA Platten werden zur Hälfte mit p78 in Bicarbonatpuffer und zur anderen Hälfte mit Bicarbonatpuffer alleine für 4 Stunden bei Raumtemperatur beschichtet. Nach zwei Waschschritten in PBS wird die Platte für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 10% Ziegenserum in PBS mit 0,05% Tween-20 blockiert, um die unspezifische Bindung von Protein zu verhindern. Nach weiteren zwei Waschschritten wird verdünntes Serum (in PBS/1% Ziegenserum/0,05% Tween-20) in Duplikaten sowohl auf der p78-beschichteten als auch auf der nicht beschichteten Seite der Platte zugegeben. Nach 4 Waschschritten wird anti-human Immunglobulin konjugiert mit Biotin (1/10000 verdünnt in PBS/1% Ziegenserum/0,05% Tween-20) auf die Platte gegeben. Die Platte wird 6-mal gewaschen. Gebundener biotinylierter Antikörper wird mit Streptavidinkonjugierter Horse-Radish Peroxidase (1/800 in PBS/1% Ziegenserum/0,05% Tween-20) und geeignetem Substrat nachgewiesen. Seren die Antikörper gegen p78 enthalten werden mit dem Spektrophotometer bestimmt. Dieser Test bildet die Grundlage eines diagnostischen und/oder prognostischen Tests für rheumatische Arthritis.
3. Therapeutische Anwendung
Viele Wege zur Gabe des rekombinanten Proteins oder des Vektors sind möglich, einschließlich der intravenösen, intramuskulären, nasalen, oralen, kutanen und topischen Gabe einer geeigneten pharmazeutischen Zusammensetzung. Es gibt einige Ansätze, p78 oder Derivate davon für therapeutische Zwecke zu verwenden, einschließlich der folgenden:
(a) Induktion einer mukosalen Toleranz
Die Zuführung des p78 Autoantigens oder der davon abgeleiteten Peptide über mukosale Wege, beispielsweise über die Magen- oder Nasenschleimhaut, verändert die Immunantwort durch Verminderung der Krankheitsaktivität und lässt ansonsten das Immunsystem des Patienten intakt. Alternativ können p78 oder p78 Peptide als DNA- Plasmide zugeführt werden, die von einem geeigneten Säuger-Expressionsvektor kodiert werden.
(b) Impfung mit TCR Peptiden
Peptide der CDR3 Region der T-Zell-Rezeptor Valpha und Vbeta Ketten können synthetisiert werden und als Impfstoff zur intradermalen oder intramuskulären Injektion verwendet werden. Plasmide, die diese Peptide kodieren, können auf die gleiche Weise verwendet werden.
(c) MHC Blockade mit nativen oder veränderten Peptiden
Die p78 Peptide können in geeigneten Fällen parenteral oder oral gegeben werden, entweder nicht modifiziert oder modifiziert durch Aminosäureaustausch und/oder das Anhängen von chemischen Gruppen, um so MHC und insbesondere HLA-DR4 zu blockieren und dadurch zu einer Unterdrückung der T-Zell Aktivierung und der Krankheit zu führen. Die p78 Peptide, ob nativ oder verändert, können mit löslichen HLA-DR4 Molekülen kombiniert und parenteral oder oral gegeben werden.
(d) Toleranzinduktion durch Immunisierung mit Plasmid-DNA
Plasmide, die aus einer DNA bestehen, die das gesamte p78 Protein kodiert oder Peptide davon, gekoppelt an einen Säuger-Expressionsvektor, können durch Injektion verabreicht werden. DNA, die humanes IL-10, IL-4, IL-11 oder TGF-beta kodiert, kann singulär eingebaut oder in beliebiger Kombination, dazu verwendet werden, die Immunantwort auf p78 in Richtung TH2 Modus abzuändern, um die Krankheit zu unterdrücken.
In den oben angegebenen Therapieverfahren können das Protein oder davon abgeleitete Peptide in geeigneten Zusammensetzungen, die Mengen in der Größenordnung von etwa 0,1 Mikrogramm bis etwa 1 Gramm oder dem Äquivalent im Falle eines Plasmids oder eine Impfstoffzubereitung zuführt, verabreicht werden.
Anhang 1
Methodik für die Gelektrophorese
Acrylamid-Gel: 10%

6,075 ml Acrylamid (40%) (BDH, Poole, UK)
3,35 ml Methylenbisacrylamid (2%) (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)
6,25 ml Acrylamid Gelpuffer (siehe unten)
9 ml Aqua dest (hergestellt im Labor)
250 μl Ammoniumpersulfat (AMPERS) (0,025 mg in 250 μl Aqua dest) (Sigma- Aldrich, Poole, UK)
25 μl NNN'N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)

Acrylamidgelpuffer: pH 8.8

1,5 M Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)
pH Titration mit konzentrierter Hydrochloriger Säure
0,4% Natrium-dodecylsulfat (SDS) (BDH-Merck, Poole, UK)

Stacking Gel:

1,2 ml Acrylamid (40%) (BDH-Merck, Poole, UK)
0,65 ml Bisacrylamid (2%) (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)
3,15 ml Stacking Gel Puffer (siehe unten)
7,5 ml Aqua dest (hergestellt im Labor)
125 μl Ammoniumpersulfat (AMPERS) (0,025 mg/250 μl) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)
12,5 μl NNN'N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)

Stacking Gel Puffer: pH 6.8

0,5 M Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)
pH Titration mit konzentrierter Hydrochloriger Säure
0,4% Natrium-dodecylsulfat (SDS) (BDH-Merck, Poole, UK)

Ladepuffer:

2 ml Glycerol
2 ml 10% Natrium-dodecylsulfat (SDS) (BDH-Merck, Poole, UK)
0,25 mg Bromphenolblau
2,5 ml Stacking Gel Puffer 4-fach konzentriert (0,5 M Tris; 0,4% SDS; pH 6.8)
0,5 ml 2-Mercaptoethanol (Sigma-Aldrich, Poole, UK)

Elektrophorese/Laufpuffer:

3 g/l Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)
14,4 g/l Glycin (BDH-Merck, Poole, UK)
1 g/l Natrium-dodecylsulfat (SDS) (BDH-Merck, Poole, UK)

Transferpuffer:

3 g/l Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)
14,4 g/l Glycin (BDH-Merck, Poole, UK)
1 g/l Natrium-dodecylsulfat (SDS) (BDH-Merck, Poole, UK)
14,4 g/l Glycin (BDH-Merck, Poole, UK)
10% Methanol (BDH-Merck, Poole, UK)

Tris-Tween-Buffered-Saline (TTBS):

2,4 g/l Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)
29 g/l Natriumchlorid (BDH-Merck, Poole, UK)
500 μl Tween-20 (Polyethylen-sorbitan-monolaurat) (Sigma-Aldrich, Poole, UK)

3% Rinderserumalbuminlösung (BSA):

3 g Rinderalbumin Fraction V (BDH-Merck, Poole, UK)
100 ml TTBS (siehe oben)

Anhang 2 Aminosäuresequenz des exprimierten, rekombinanten, humanen BiP Proteins. Gesamtlänge 1917 Nukleotide. Start bei Methionin (Startkodon) und Ende im 6 × His-Tag.
Anhang 3 RT-PCR kloniertes und sequenziertes grp78 (BiP) Fragment, das für die Expression des rekombinanten humanen Proteins verwendet wurde. Start am ATG Startkodon und Ende im 6 × His-Tag.
Anhang 4 RT-PCR kloniertes und sequenziertes grp78 (BiP) Fragment, das für die Expression des rekombinanten humanen Proteins verwendet wurde. Start am ATG Startkodon und Ende im 6 × His-Tag.
Originale Gesamtlängen cDNA des BiP (grp78) aus der Datenbank. Zugriffsnummer X87949. Gesamtlänge 2554 Nucleotide (bereits publiziert).
Anhang 4 (Fortsetzung)
Tabelle 1 Die Verhinderung von CIA durch die intravenöse Injektion von rekombinantem p78

^a HLA-DR 1^+/+ transgene Mäuse wurden entweder mit PBS (Negativkontrolle) oder rekombinantem p78 intravenös injiziert. Es wurde entweder 1 mg Protein, gelöst in 0,1 ml PBS oder 0,1 ml PBS intravenös verabreicht und die Mäuse wurden sieben Tage nach der intravenösen Dosis mit Typ II Kollagen in CFA immunisiert.
^b Die Häufigkeit von Arthritis nach 8 Wochen wird angegeben.
^c Die Antikörper stellen die mittleren Einheiten pro Gruppe dar, unter Verwendung von Seren, die 8 Wochen nach der Immunisierung gesammelt wurden. Es wurden ELISA's durchgeführt und die Ergebnisse sind als Aktivitätseinheiten angegeben, die sich durch den Vergleich der Testseren mit dem Standardserum, für das willkürlich bestimmt wurde, dass es 50 Einheiten an Aktivität hat, ergaben. Die Seren wurden einzeln untersucht und die Ergebnisse sind als mittlere Standardabweichung (± SD) für jede Gruppe von Tieren dargestellt.
^* p ≤ 0,008 (Fisher-Exact-Test) ** ≤ 0,0001 (Fisher-Exact-Test) *** < 0,05 (Student Test)

Tabelle 2 IgG1 und IgG2 Antikörper-Isotypen gegen Typ II Kollagen in Mäusen, die entweder mit rekombinantem p78 oder PBS intravenös behandelt wurden.

^a HLA-DR1 transgenen Mäusen wurden entweder PBS (Negativkontrolle) oder rekombinantes p78 intravenös injiziert, gefolgt von einer Immunisierung mit Typ II Kollagen in CFA eine Woche später.
^b ELISA's wurden durchgeführt wie in der Beschriftung für Tabelle 2 beschrieben.
^* p < 0,05 (Student Test)

Tabelle 3 Anti-p78 Antikörper in CIA oder PIA Mausseren (Verdünnung 1:200)
Figurenbeschreibung
1 Western Blot Analyse von 6 rheumatischen Seren (Spuren 1–6), 5 normalen Seren (Spuren 7–11) und 4 Krankheitskontrollen (Spuren 12–15), die mit Chondrosarkomlysat reagieren.
2 Lymphozytenproliferation in über sechs Tage kultivierten mononukleären Zellen, dargestellt als Stimulationsindex: Proliferation in Anwesenheit von p78/Proliferation in Anwesenheit von Kulturmedium alleine. Eine Stimulation von > 2,5 wurde als signifikant erachtet. RAPB, periphäres Blut rheumatischer Arthritis; RASF, Synovialflüssigkeit rheumatischer Arthritis; OIJDPB, peripheres Blut anderer entzündlicher Gelenkserkrankungen; OIJDSF, Synovialflüssigkeit anderer entzündlicher Gelenkserkrankungen.
3 Antikörper gegen rekobinantes humanes p78 in Seren von Mäusen, gemessen durch ELISA und als OD₄₀₅ dargestellt. Angegeben sind die Werte für die Tierblutungen vor der Induktion der experimentellen Arthritis (Prebleed) und bei Beginn der Kollagen-induzierten Arthritis (CIA) und der Pristan-induzierten Arthritis (PIA).
Literaturverzeichnis
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SEQUENCE LISTING

Claims

Das BiP (GRP78) Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß der SEQ.ID.NR.1 oder SEQ.ID.NR.2 der Sequenzliste.
Rekombinantes BiP (GRP78) mit der Aminosäuresequenz der SEQ.ID.NR.1 oder SEQ.ID.NR.2.
Verwendung des rekombinaten, an die schwere Kette des Immunglobulins bindenden BiP (GRP78) Proteins zur Herstellung eines Medikaments gegen entzündliche Krankheiten.
Verwendung des rekombinanten, an die schwere Kette des Immunglobulins bindenden BiP (GRP78) Proteins zur Herstellung eines Medikaments gegen rheumatische Arthritis.
Eine cDNA Sequenz, die für das an die schwere Kette des Immunglobulins bindende BiP (GRP78) Proteins kodiert, zur Verwendung in der Therapie von entzündlichen Erkrankungen.
Eine cDNA Sequenz, die für das an die schwere Kette des Immunglobulins bindenden BiP (GRP78) Proteins kodiert, zur Verwendung in der Therapie von rheumatischer Arthritis.
Eine cDNA Sequenz umfassend oder enthaltend die Nukleotidsequenz gemäß der SEQ.ID.NR.3 aus der Sequenzliste.
Ein rekombinanter Vektor enthaltend eine DNA Sequenz gemäß Anspruch 7.
Ein rekombinanter, nicht menschlicher Organismus, der in der Lage ist das BiP (GRP78) Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ.ID.NR.1 oder SEQ.ID.NR.2 zu exprimieren.
Verwendung einer DNA, die für ein rekombinantes BiP (GRP78) kodiert, zur Herstellung eines Medikaments gegen rheumatische Arthritis.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von rheumatischer Arthritis in Säugetieren, eingeschlossen den Menschen, wobei die Zusammensetzung rekombinantes, an die schwere Kette des Immunglobulins bindenden BiP (GRP78) Protein mit eine Aminosäuresequenz, wie sie in SEQ.ID.NR.1 oder SEQ.ID.NR.2 gezeigt ist, zusammen mit einem geeignetem pharmazeutischen Träger umfasst.