ES2277449T3 - Tratamiento de enfermedades inflamatorias. - Google Patents
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Abstract
La proteína BiP(GRP78) que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº 1 o SEQ ID nº 2 del Listado de secuencias.
Description
Tratamiento de enfermedades inflamatorias.
Este invento se refiere a la enfermedad
inflamatoria y, más particularmente, a la artritis reumatoide.
La artritis reumatoide (RA, del inglés
rheumatoid arthritis) es una enfermedad inflamatoria crónica
de las articulaciones sinoviales que conduce a la destrucción de las
articulaciones, discapacidad y muerte precoz. Aunque actualmente se
desconoce la causa de la RA, se ha sugerido que el colágeno tipo II,
que se encuentra exclusivamente en el cartílago articular, es un
autoantígeno posible para la RA. Recientemente, se ha propuesto que
gp39, una glicoproteína de 39 kDa, y los péptidos derivados de ella
son tales autoantígenos. Sin embargo, los datos que apoyan esta
hipótesis son limitados y, por tanto, el papel de la gp39 permanece
aún sin esclarecer.
El presente invento proviene de una aproximación
diferente basada en un estudio de condrocitos, las células
especializadas del cartílago articular. Los autores han aislado una
proteína de los condrocitos humanos y de las líneas celulares de
condrosarcoma humano que reacciona con anticuerpos presentes en los
sueros de pacientes con RA y cumple los criterios aceptados para un
autoantígeno putativo. Esta proteína purificada se ha sometido a
ensayo para la proliferación de células T y se ha mostrado que las
células T sinoviales de pacientes con RA proliferan selectivamente.
Esta proteína es la proteína de unión a la cadena pesada de la
inmunoglobulina BiP(GRP78), que los autores denominan
posteriormente p78.
La solicitud de patente internacional WO
99/18131 propone la detección de anticuerpos frente a un BiP
derivado de células Hela como una indicación diagnóstica de RA. Sin
embargo, esta declaración previa no describe la extracción de BiP a
partir de células Hela de una manera reproducible y, por tanto, es
insuficiente para la aplicación práctica.
Los autores de la presente memoria han obtenido
e identificado ahora el autoantígeno correcto de RA y este
descubrimiento conduce al desarrollo de pruebas pronósticas y
diagnósticas para esta enfermedad y de terapia específica. Los
autores han aislado y secuenciado el ADN de esta proteína. También
han clonado y expresado este ADN. Las secuencias de aminoácidos y
ADN son nuevas y se muestran en el Listado de secuencias
adjunto a esta memoria descriptiva. Las secuencias de aminoácidos de
la proteína BiP se proporcionan como listados de secuencias en dos
versiones, SEQ ID nº 1 y SEQ ID nº 2, cualquiera de las cuales puede
emplearse como un reactivo de ensayo. La secuencia de ADNc para la
SEQ ID nº 1 se da como SEQ ID nº 3 en el Listado de
secuencia. Esta secuencia se ha depositado en el GENBANK bajo el
nº de acceso AF 188611. Posteriormente se proporciona una
comparación de esta secuencia con la del nº de acceso X87949 del
GENBANK.
La primera parte de la descripción siguiente
concierne a la caracterización de tal autoantígeno; la segunda, a la
clonación, secuenciación y expresión de la proteína; y la tercera
parte, a la demostración de la especificidad de las células T de la
enfermedad (artritis reumatoide) y de los tejidos (compartimento
sinovial) al autoantígeno.
Parte
1
Los condrocitos se aislaron a partir del
cartílago obtenido durante la sustitución osteoarticular. El
cartílago se desmenuzó finamente y se digirió con 1 mg/ml de
colagenasa (Worthington). Tras la digestión las células se
centrifugaron a 300 g y se resuspendieron en medio esencial mínimo
de Dulbecco (DNMM) (Life Technologies, Paisley, RU) enriquecido con
10% de suero bovino fetal (FCS) (Harlan Sera-Lab,
Loughborough, RU). Se retiraron los restos celulares de las células
adherentes después de 24 horas y se dejó que las células se
expandieran hasta la confluencia. Las células se pasaron con
tripsina (0,25%) y se dividieron 1:3.
Las células de condrosarcoma (HTB94) (SW1353) se
suministraron por la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, del
inglés American Type Culture Collection) (Rockville,
Maryland, EE.UU.) y por el Dr. J. Block, de la Universidad Rush de
Chicago, EE.UU. (regalo personal). Estas células se cultivaron en
DMEM con 10% de FCS y se dividieron 1:3 después de tripsinización
suave (0,25% de tripsina, Life Technologies, Paisley, RU) cuando
estaban confluyentes.
Las células se rasparon de la superficie del
frasco, se homogeneizaron y se sonicaron en presencia de los
inhibidores de proteasas PMSF (2 mM), leupeptina (200 \mug/ml) y
aprotinina (50 \mug/ml) (Sigma, Poole, RU).
Se añadió dodecil sulfato sódico (SDS) (Sigma,
Poole, RU) hasta una concentración final del 1% y las proteínas se
solubilizaron a temperatura ambiente durante 1 hora. La
concentración de proteína se estimó mediante el ensayo del ácido
bicinconínico, empleando albúmina sérica bovina (BSA) como proteína
estándar (Sigma) y el lisado celular se empleó a 10
\mug/equivalente de pocillo.
Se empleó el sistema Mini Protean (BioRad
Laboratories, Hemel Hempstead, RU) para migrar los geles. Se
prepararon geles desnaturalizantes de SDS poliacrilamida de 1,5 mm
de grosor al 5%, 7,5% o 10% (véase el Apéndice 1). Los geles
se cargaron con 10 \mug de proteína/pocillo o el equivalente se
cargó en geles preparativos. La electroforesis se llevó a cabo a 100
V constantes y un amplio intervalo de marcadores caleidoscópicos
(BioRad) se migraron en paralelo con los lisados celulares.
Tras la electroforesis las proteínas se
transfirieron a nitrocelulosa a 100 V constantes durante 1 hora
(véase el Apéndice 1). La nitrocelulosa se bloqueó entonces
con 3% de BSA (Sigma, Poole, RU) y se dejó toda la noche a 4ºC. Las
membranas de geles preparativos se cortaron en 16 tiras finas cuando
se necesitó, cada una teniendo un perfil de proteína idéntico. Las
membranas se hibridaron con sondas de sueros de pacientes (dilución
1/100) o con anticuerpos monoclonales específicos (a las
concentraciones requeridas) durante 1 hora a temperatura ambiente y
entonces se lavaron x3 durante 1 hora en TTBS (véase el
Apéndice 1). El anticuerpo secundario, anti-IgG
(Fab^{2}) humano de cabra conjugado con peroxidasa de rábano (HRP,
del inglés horse-radish peroxidase) (Sigma)
se añadió a dilución 1/1000 y se incubó durante 1 hora a temperatura
ambiente. Las membranas se lavaron entonces x3 durante 1 hora en
TTBS. Se empleó quimioluminicencia aumentada (Amersham) para revelar
el sistema, y los complejos de
antigeno-anticuerpo.HRP aparecieron como bandas
discretas sobre película fotográfica cuando se
revelaron.
revelaron.
La banda de interés se observó en
aproximadamente un 30% de los sueros de artritis reumatoide
empleados para escrutar los lisados celulares según se describió
previamente.
Para aislar la proteína, el lisado celular se
concentró x23, empleando un filtro de punto de corte de 30.000 MW
(Vivascience). Esta proteína se cargó entonces en geles del 5% y del
7,5% en paralelo. Una calle en cada uno se cargó a concentración
normal, mientras que las otras dos calles se sobrecargaron con la
proteína. Los marcadores caleidoscópicos se cargaron en cualquiera
de los lados de las calles de ensayo. Los geles se migraron entonces
como se describió previamente hasta que los marcadores
caleidoscópicos mostraron que la proteína de 70.000 MW estaría en
el tercio inferior del gel, tan cerca como era posible del punto de
salida. Los geles entonces se transfirieron sobre membrana de PVDF
(Immobilon P, Millipore), la cual fue inmediatamente colocada en
agua destilada después de que se completó la transferencia de las
proteínas. La tira con la carga normal se empleó para la
inmunodetección de la banda de proteína. La película revelada de
esta inmunodetección y la tinción con rojo Ponceau de las tiras
sobrecargadas se emplearon para identificar la banda sobre la
membrana que entonces se secó al aire. Entonces estas tiras se
tomaron para aislar y secuenciar la proteína empleando
espectroscopía de deserción/ionización mediante láser asistida por
matriz (MALDI, del inglés matrix-assisted laser
desorption/ionisation).
Las proteínas electrotransferidas se tiñeron con
Ponceau S (0,05% p/v de metanol acuoso/0,1% de ácido acético)
empleando un protocolo de tinción rápida (1). Las proteínas teñidas
secas se digirieron entonces in situ con tripsina
(Boehringer, modificado) y los péptidos se extrajeron con 1:1 v/v de
ácido fórmico:etanol (2). Una alícuota de 0,2 \mul
(aproximadamente un 5% del total digerido) se tomó de muestra y se
analizó directamente mediante espectrometría de masas con analizador
de tiempo de vuelo de deserción/ionización mediante láser asistida
por matriz (MALDI) empleando un espectrómetro de masas LaserMat 2000
(Thermo Bioanalysis, RU) (3). Una segunda alícuota de 0,2 \mul se
esterificó cuantitativamente empleando un 1% v/v de cloruro de
tionilo en metanol y también se analizó por MALDI para proporcionar
la composición de residuos acídicos (4). Las masas de péptidos
nativos y esterificados se escrutaron entonces frente a la base de
datos de huellas de masas de péptidos MOWSE (5). El resto de los
péptidos digeridos (90% del digerido total) se pusieron a reaccionar
con acetato de
N-succinimidil-2(3-piridil)
(SPA) para incrementar la abundancia de b-ión y
facilitar el análisis de secuencia por espectrometría de masas en
tándem (6). Las fracciones peptídicas secas se trataron con 7 \mul
de 1% de p/v de acetato de
N-succinimidil-2(3-piridil)
en 0,5 M de HEPES (pH de 7,8 con NaOH) que contenía 15% v/v de
acetonitrilo durante 20 min en hielo. La reacción se terminó con 1
\mul de ácido heptafluorobutírico (HFBA) y la solución se inyectó
inmediatamente en una columna capilar de fase reversa (300 \mum x
15 cm) empaquetada con material POROS R2/H (Perseptive Biosystems,
MA) equilibrada con 2% v/v de acetonitrilo/0,05% v/v de TFA
corriendo a 3 \mul/min. Los péptidos absorbidos se lavaron
isocráticamente con 10% v/v de acetonitrilo/0,05% v/v de TFA durante
30 minutos a 3 \mul/min para eluir el exceso de reactivo y el
tampón HEPES. Los péptidos derivatizados se eluyeron entonces con
un gradiente de etapa única en 75% v/v de acetonitrilo/0,1% v/v de
ácido fórmico y se recogieron en una única fracción de 4 \mul. Los
péptidos derivatizados se secuenciaron entonces mediante disociación
activada por colisión de baja energía (CAD, del inglés
collison-activated dissociation) empleando un
Finnigan MAT TSQ7000 equipado con una fuente de
nanoelectropulverización (7,8). Se llevó a cabo CAD empleando 2,5
mTorr de argón con voltajes de desplazamiento colisional entre -18 V
y -28 V. Los espectros de los productos iónicos se recogieron con
Q3 escaneados a 500 amu/s.
Secuencia de datos obtenidos del gel del 7,5%
(banda única)
- a partir de GR78_humana
Péptidos específicos identificados:
- NQLTSNPENTVFDAK 82-96
- SDIDEIVLVGGSTR 353-366
- TWNDPSVQQDIK 107-113
Proteína humana GR 78 identificada:
- kDa del precursor de la proteína regulada por glucosa (GRP78)
- Proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina (BIP)
Parte
2
Los condrocitos humanos se aislaron y se
cultivaron durante tres semanas, según se describe. El ARNm
poli(A) (1-2 \mug) se extrajo con un kit
Micro-Fastrack (Invitrogen) de un total de
1-2 x 10^{6} células. Un microgramo del ARNm
resultante se transcribió de forma reversa en ADNc en un volumen de
20 \mul a 45ºC durante 1 hora empleando 1 \mug de transcriptasa
reversa del virus de la leucemia murina de Moloney (200 u/\mul); 5
x tampón de la primera cadena (250 mM de Tris-HCl pH
8,3; 375 mM de KCl; 15 mM de MgCl); 0,1 M de DTT; 20 ng/\mul de
oligo dT(_{12-18}) (Life Technologies); y
100 mM de mezcla de dNTP (Amershan Pharmacia Biotec, Uppsala,
Suecia).
La PCR se llevó a cabo en un volumen de reacción
de 50 \mul bajo condiciones estándar (véase a continuación)
empleando un ciclador térmico PE2400 de Perkin Elmer Applied
Biosystems. Las secuencias de los cebadores se derivaron de la
secuencia de la base de datos GenBank correspondiente al gen humano
de la proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina,
Bip (grp78), número de acceso X87949. Los cebadores específicos se
sintetizaron para amplificar el gen del autoantígeno putativo a
partir del ADNc de condrocitos. El producto resultante de la PCR
consistió en la mayoría de la región codificante grp78, excepto las
regiones no traducidas, las secuencias señal y el codón de parada
(posiciones de nucleótidos 279-2.169 de la secuencia
grp78 de la base de datos).
Los grupos de cebadores para PCR se diseñaron
con sitios de restricción integrados para permitir el subclonaje
rápido del ADNc dentro del vector de expresión bacteriano. Los
cebadores directos codificaban un sitio NdeI y los cebadores
reversos contenían un sitio de restricción XhoI: el listado
de secuencias para el cebador directo se proporciona de aquí en
adelante como SEQ ID nº 4 y el del cebador reverso se proporciona
como SEQ ID nº 5.
| Cebador directo Bip | 5' TATACATATGGAGGAGGACAAGAAGGAGGACG 3' | (32 nucleótidos) |
| Cebador reverso Bip | 5' CCACCTCGAGTTCTGCTGTATCCTCTTCACCA 3' | (32 nucleótidos) |
Después de la desnaturalización inicial a 96ºC
durante 2 min la PCR se llevó a cabo durante 28 ciclos, empleando un
perfil de ciclación de 94ºC durante 30 s, 60ºC durante 30 s y 72ºC
durante 2 min, con una extensión final a 72ºC durante 7 min. La
reacción de PCR generó un único fragmento Bip específico de 1.890
pb.
Los sitios de restricción fabricados por
ingeniería genética en los cebadores directos y reversos empleados
para las reacciones de PCR precisaron de ADN flanqueante para ser
reconocidos por sus endonucleasas específcas (NdeI y
XhoI). Para proporcionar este ADN flanqueante, el fragmento
generado por PCR se clonó dentro de un vector de clonación de PCR,
pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Los plásmidos ligados se
transformaron dentro de E. coli XL1-Blue
(Stratagene) competentes y el ADN plasmídico se extrajo empleando
columnas de purificación Miniprep (Qiagen). El ADN plasmídico
purificado para el clon se designó Bip-Topo. Estas
muestras de ADN se almacenaron a -20ºC. El ADN plasmídico purificado
para Bip-Topo se digirió con NdeI y
XhoI. Los fragmentos de restricción se separaron mediante
electroforesis en gel de agarosa y se purificaron empleando el kit
de extracción de ADN de gel de Qiagen.
El fragmento purificado para el clon se ligó
dentro del vector de expresión bacteriano pET30a (Novagen)
predigerido con NdeI/XhoI. La ligación se llevó a cabo
a 12ºC durante toda la noche en presencia de ligasa T4 (20 unidades)
y de 1/10 de volumen de tampón de ligasa 10X (proporcionado con la
enzima ligasa T4 de Promega). Los plásmidos ligados se transformaron
dentro de E. coli XL1-Blue (Stratagene)
competentes y se escrutó para colonia-PCR empleando
cebadores específicos de Bip. Los transformantes positivos que
transportaban los plásmidos recombinantes requeridos se purificaron
y se transformaron en la cepa de expresión de E. coli
BL21-(DE3) competente (Invitrogen).
Se entenderá por supuesto que la clonación puede
llevarse a cabo en hospedantes procariotas o eucariotas, incluyendo
bacterias, células de insectos y células de mamíferos. Los
hospedantes preferidos son aquellos que aseguran la glicosilación
del producto expresado.
La secuenciación de los extremos terminales 5' y
3' del clon pET30a::Bip confirmó que la molécula de ADN recombinante
estaba en fase con el codón de iniciación ATG en el vector pET30 y
que la lectura a través de este sitio continuaba a través del gen
Bip y terminaba con los 6X residuos de His y el codón de parada
localizado en el brazo 3' del vector de expresión.
La secuenciación extensiva del ADN se llevó a
cabo empleando cebadores de oligonucleótidos sintéticos que se
extendían sobre la longitud completa del subclón de Bip. El análisis
de la secuencia del fragmento del gen Bip recién subclonado se llevó
a cabo por alineamiento comparativo frente a la secuencia existente
de grp78 de la base de datos (número de acceso X87949). Se
detectaron muchas diferencias entre las dos secuencias, tanto a
nivel de ADN como de proteína (véase el Apéndice 4). Estas
áreas de discordancia pueden bien ser resultado de errores en la
secuenciación original del ADN (de grp78) o pueden indicar la
presencia de un gen Bip adicional relacionado, pero ligeramente
diferente, en el genoma.
Toda la secuenciación del ADN se llevó a cabo en
un secuenciador de ADN automático ABI 377 de Applied Biosystems
empleando el kit de terminación del colorante dRodamina (Perkin
Elmer - Applied Biosystems).
La cepa BL21-(DE3) de expresión de E.
coli conteniendo el plásmido recombinante
pET30a-Bip se cultivó a 37ºC en medio LB que
contenía kanamicina (50 \mug/ml). Cuando las células habían
alcanzado una OD_{600} de 0,6 unidades, se añadió isopropilo
\beta-D-tiogalactopiranosido
(IPTG) (1 mM) al medio para inducir la expresión de la proteína
recombinante, conducida por el promotor inducible de IPTG del vector
de expresión. Para permitir la expresión máxima de la proteína
recombinante se incubó el cultivo durante otras 4 horas a 37ºC. Las
células se sedimentaron por centrifugación y se almacenaron a
-70ºC.
Para purificar las proteínas bacterianas
recombinantes los sedimentos bacterianos se lisaron en tampón de
unión (20 mM de NaPO_{4}, 500 mM de NaCl, 5 mM de imidazol, 1 mM
de PMSF, 1 mg/ml de lisozima, 5 unidades/ml de ADNasa, 0,1% de
Tritón X-100, pH 7,4). El lisado se aclaró por
centrifugación para eliminar impurezas insolubles y restos
celulares. El lisado aclarado se pasó a través de una columna
quelante de afinidad Hi-trap equilibrada con tampón
de unión, con un volumen muerto de 5 ml (Pharmacia). La proteína
unida inespecíficamente se eliminó de la columna bajo condiciones
astringentes empleando una serie de tres tampones de lavado. El
primer lavado se realizó empleando 100 ml de tampón de unión. Éste
se siguió por un lavado a pH bajo de alta astringencia (20 mM de
NaPO_{4}, 500 mM de NaCl, 0,1% de Tritón X-100, pH
5,5) y un lavado adicional de alta astringencia empleando 100 ml de
20 mM de NaPO_{4}, 500 mM de NaCl, 0,1% de Tritón
X-100, 50 mM de imidazol, pH 7,4. Las proteínas
recombinantes etiquetadas con histidina se eluyeron de la columna
mediante extracción con 50 mM de EDTA. Las proteínas eluidas se
dializaron durante toda la noche contra 1x PBS para eliminar el EDTA
y los contaminantes de Ni. La proteína purificada se concentró y se
lavó en PBS estéril empleando una columna concentradora con punto
de corte de 50.000 MW (Millipore). La cantidad total de proteína se
determinó mediante espectrofotometría empleando BSA como estándar
con el ensayo del ácido bicinconínico.
La artritis por colágeno (CIA, del inglés
collagen-induced arthritis) y la artritis por
pristano (PIA, del inglés pristane-induced
arthritis) se indujeron en ratones DBA/1 de acuerdo con el
protocolo descrito previamente por los autores. Se sangraron los
ratones antes de inducir la artritis (15 animales), al comienzo de
la CIA (16 animales) y al comienzo de la PIA (14 animales). El
anticuerpo frente a p78 en los sueros de ratón se determinó
empleando un ensayo inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) con p78
recombinante. Las placas de ELISA de 96 pocillos de Nunc (Fisher
Biotech, Orangeburg, NY) se recubrieron durante toda la noche a 4ºC
con p78 a 500 ng (en 100 ml de 5% de leche desnatada en PBS) por
pocillo. Después de lavar 3 veces con fosfato tamponado salino (PBS)
que contenía 0,05% de Tween-20, la placa se bloqueó
con 5% de leche desnatada/PBS durante toda la noche a 4ºC. Los
sueros de ratón se añadieron a los pocillos a una dilución 1:200 en
leche/PBS y se incubaron durante toda la noche a 4ºC. La placa se
lavó, se añadieron 100 ml de anti-Ig de ratón en
cabra conjugado con fosfatasa alcalina
(anti-Ig-AK, dilución 1:500 en
leche/PBS/Tween-20, Fisher Biotech) durante 60 min a
37ºC. Después de tres lavados con PBS/Tween-20, se
añadieron 100 ml de solución de paranitrofenilfosfato (comprimidos
de PNPP; Sigma Chemicals, St. Louis, MO) en tampón de
dietilanolamina a cada pocillo. Se dejó proceder la reacción en la
oscuridad durante 30 min y la placa se leyó en un espectrofotómetro
a 405 nm (Molecular Devices, Menlo Park, CA). Los datos se
analizaron empleando el paquete analítico de software
SOFTmax. Las uniones específicas fueron las lecturas de OD de los
pocillos recubiertos de p78 a los que se sustrajo la OD de los no
recubiertos, así como los blancos sin suero. Los niveles de
anticuerpo se expresaron como unidades de OD_{405}.
Cuando los sueros de RA y control se
transfirieron contra los extractos de condrocitos, un 30% de los
sueros de RA reaccionaron con una proteína de 78 kDa comparado con
un 10% de los sueros control (Figura 1). La secuenciación de tres
péptidos trípticos mediante CAD de baja energía identificó un
componente de la banda de 78 kDa como la proteína de 78 kDa regulada
por glucosa, también conocida como proteína de unión a la cadena
pesada de la inmunoglobulina (BiP). Los análisis de secuencia de ADN
de p78 de los ADNc de condrocitos articulares mostraron muchas
desviaciones de la secuencia publicada (número de acceso X87949). Un
total de seis sustituciones únicas de nucleótidos y una inserción de
un codón dieron como resultado tres sustituciones de aminoácidos y
una inserción de arginina en la posición 834-836 de
p78 (número de acceso AF188611).
Las respuestas proliferativas de las células T
se determinaron para las preparaciones de células mononucleares a
partir de muestras emparejadas de sangre periférica (PB, del inglés
peripheral blood) y fluido sinovial (SF, del inglés
synovial fluid) obtenidas de 23 pacientes con artritis
reumatoide y de 12 controles de la enfermedad. Doce de 23 (52 por
ciento) pacientes con RA y sólo 2 de 12 (17 por ciento) de los
controles de la enfermedad mostraron proliferación sinovial
aumentada (Figura 2). La respuesta proliferativa a p78 de las
células T sinoviales fue significativamente mayor que la de la
sangre periférica correspondiente (índice de estimulación, media
\pm DE: SF 3,5 \pm 0,7; PB 1,6 \pm 0,2; p < 0,01, prueba
pareada de Wilcoxon). Una diferencia significativa se observó
también en las respuestas del fluido sinovial a p78 entre los
pacientes de RA y los controles de enfermedad (SI: RA 3,5 \pm 0,7;
OIJD 1,4 \pm 0,2; p = 0,03, prueba U de Mann Whitney). No hubo
asociación con HLA-DR dado que un 50% de
respondedores y no respondedores fueron HLA-DR4
positivos (datos no mostrados).
El anticuerpo monoclonal
anti-HLA-DR L243 (ATCC, Rockville,
MD) inhibió en un 66-84% la proliferación de las
células T del fluido sinovial reumatoide frente a p78 (datos no
mostrados).
No se pudo medir IFNg en los sobrenadantes de
las células mononucleares emparejadas del fluido sinovial y de la
sangre periférica (datos no mostrados) a pesar de emplear un ELISA
sensible hasta 0,01 ng/ml. No se pudo detectar IFNg mediante
fluorescencia intracelular en las células T de sangre periférica de
los pacientes con RA (n = 7) o de los controles sanos (n = 2)
después de la estimulación por p78 (datos no mostrados). Estos
hallazgos implican que las células T respondedoras es improbable que
pertenezcan al clásico subgrupo TH1 productor de IFNg {1461}.
La inmunización de ratones DBA/1, C57BL y ratas
de Lewis con p78 en adyuvante completo de Freund (CFA) no condujo al
desarrollo de artritis (datos no mostrados). Hubo una falta similar
de artritogenicidad de p78 cuando se inyectó con CFA en ratones
HLA-DR1^{+/+} (0/10) o en ratones
HLA-DR4^{+/-} (0/5).
A pesar del fallo para inducir artritis al
inmunizar los animales con p78, los autores investigaron si los
ratones DBA/1 durante el curso de la artritis inducida por colágeno
(CIA) o pristano (PIA) desarrollaron anticuerpos contra p78 (Figura
3). Los ratones desarrollaron anticuerpos anti-p78
en suero al comienzo de la artritis por colágeno (OD_{405} = 0,189
\pm 0,042, m \pm de) y de la artritis inducida por prostano
(0,504 \pm 0,074) cuando se compararon con los sueros
presangrados (0,070 \pm 0,019; p < versus CIA y p <
versus PIA, respectivamente). Además, la concentración de
estos anticuerpos fue significativamente superior en los ratones PIA
que en los ratones CIA. Había 14 ratones en cada grupo.
La presencia de anticuerpos contra p78 en los
sueros de ratones con CIA o PIA sugirió que la manipulación de la
respuesta inmune frente a p78 podría impedir el desarrollo
subsiguiente de CIA por un fenómeno presencial. Se inyectaron
intravenosamente ratones transgénicos
HLA-DR1^{+/+} con 1 mg de p78 antes de la
inmunización con colágeno tipo II en CFA una semana más tarde (Tabla
2). Mientras que el 83% de los animales tenían el 46% de sus
extremidades comprometidas con artritis a las 8 semanas cuando se
trataron previamente con salino, sólo el 10% de los animales tenía
el 3% de las extremidades comprometidas con artritis en el grupo al
que se había administrado previamente p78 intravenoso. Estas
diferencias son altamente significativas (p \leq 0,008 y p \leq
0,0001). La Tabla 2 muestra también que hubo una reducción
significativa en los anticuerpos anticolágeno en los animales
tratados previamente con p78 hasta un tercio el nivel de los
controles. La reducción fue igual en los isotipos IgG1 e IgG2 (Tabla
3). La histología de las articulaciones de estos animales confirmó
los hallazgos clínicos en cuanto a que no hubo sinovitis en las
articulaciones de los ratones previamente tratados con p78.
Los autores de la presente memoria han mostrado
en este estudio que el 30% de los pacientes con RA tienen
anticuerpos, detectados por transferencia Western, dirigidos contra
la chaperona humana BiP/GRP78, denominada por los autores p78.
Además, las células T del fluido sinovial reumatoide proliferaron
preferentemente con p78. Hubo una respuesta mínima por parte de las
células T a partir de la sangre periférica de los mismos pacientes.
Las células T de los pacientes con otras artritides inflamatorias,
bien del fluido sinovial o de la sangre periférica, no proliferaron
significativamente ante p78. Finalmente, la respuesta proliferativa
se inhibió por el anticuerpo monoclonal
anti-HLA-DR, lo que sugiere que las
células T positivas CD4+ responden a los péptidos antigénicos
presentados en el contexto de HLA-DR. Esta respuesta
policlonal de las células T no se restringió a
HLA-DR4. Entonces, la estimulación por p78 de la
proliferación de las células T posee dos características que se
esperan de un autoantígeno reumatoide, a saber, es específica de
articulación y de enfermedad.
En base a estas observaciones, los autores
emprendieron inmunización intravenosa de ratones con p78 para
someter a ensayo la hipótesis de que desviando la respuesta inmune
hacia p78 se impediría el desarrollo de CIA por un mecanismo
presencial. Se provó que éste era el caso con una profilaxis casi
total frente a la inducción de CIA en ratones transgénicos
HLA-DR1^{+/+}. En el pasado, varias tipos de
artritis experimentales se habían evitado o tratado mediante la
administración de proteínas de choque térmico bacterianas, y
especialmente micobacterianas, tales como HSP60 o células T que
respondían a HSP60 completo o a péptidos específicos {2103, 2280,
2282, 2283, 2284, 2281}. Sin embargo, es de importancia destacar que
los péptidos auto-HSP60 no muestran tales efectos
protectores {2281}. Por tanto, la capacidad de p78 de impedir CIA es
de importancia fundamental. Las observaciones descritas en este
trabajo son las primeras, al conocimiento de los autores, que
implican una chaperona endógena en la patogénesis de RA y en la
inmunoterapia de la artritis experimental. El potencial para la
inmunoterapia de RA es claramente aparente.
Pueden emplearse varias técnicas tales como
aglutinación, transferencia Western y ELISA.
Las placas de ELISA se recubren la mitad con p78
en tampón bicarbonato y la otra mitad con tampón bicarbonato solo
durante 4 horas a temperatura ambiente. Después de 2 lavados en PBS
la placa se bloquea durante 2 horas a temperatura ambiente con 10%
de suero de cabra en PBS con 0,05% de Tween 20 para parar la unión
inespecífica de proteínas. Después de 2 lavados adicionales se
añaden sueros diluidos (en PBS/1% de suero de cabra/0,05% de Tween)
en duplicado a ambas partes de la placa, la recubierta con p78 y la
no recubierta. Después de 4 lavados se añade
anti-inmunoglobulina humana conjuda con biotina
(1/10.000 diluida en PBS/1% de suero de cabra/0,05% de Tween) a la
placa. La placa se lava 6 veces. El anticuerpo biotinilado unido se
detecta con peroxidasa de rábano conjugada con estreptavidina (1/800
en PBS/1% de suero de cabra/0,05% de Tween) y sustrato adecuado. Los
sueros que contienen anticuerpos contra p78 se determinan
espectrofotométricamente. Esta prueba forma la base de una prueba
diagnóstica y/o pronóstica para la artritis reumatoide.
Muchas vías de administración de la proteína
recombinante o del vector son posibles, incluyendo intravenosa,
intramuscular, nasal, oral, cutánea y administración tópica de
composiciones farmacéuticas apropiadas. Hay varios planteamientos
para usar p78 o derivados con propósitos terapéuticos, incluidos los
siguientes:
La administración del autoantígeno p78 o de
péptidos derivados del mismo por rutas mucosas, p. ej., a través de
la mucosa intestinal o nasal, altera la respuesta inmune al
disminuir la actividad de la enfermedad, dejando el sistema inmune
del paciente de lo contrario intacto. Alternativamente, p78 o
péptidos de p78 pueden administrarse como plásmidos de ADN
codificados con un vector de expresión de mamíferos adecuado.
Los péptidos de la región CDR3 de las cadenas
Valfa y Vbeta del receptor de células T pueden sintetizarse y usarse
como vacunas para administración por inyección intradérmica o
intramuscular. Los plásmidos que codifican estos péptidos pueden
usarse de la misma manera.
Los péptidos p78 pueden administrarse parenteral
u oralmente en los casos apropiados bien sin modificarse o
modificados mediante sustitución de aminoácidos y/o unión de
agrupaciones químicas a fin de bloquear MHC, y especialmente
HLA-DR4, conduciendo por tanto a la supresión de la
activación de las células T y de la enfermedad. Los péptidos p78,
bien nativos o alterados, pueden combinarse con moléculas
HLA-DR4 solubles y aplicarse parenteral u
oralmente.
Los plásmidos que consisten en ADN codificante
para toda la proteína p78 o sus péptidos unidos a un vector de
expresión de mamífero pueden administrarse mediante inyección. El
ADN que codifica para IL-10, IL-4,
IL-11 o TGF-beta humana, incorporado
solo o en cualquier combinación, puede emplearse para desviar la
respuesta inmune frente a p78 hacía un modo TH2 a fin de suprimir la
enfermedad.
En los regímenes terapéuticos indicados
anteriormente la proteína o los péptidos derivados pueden
administrarse en composiciones apropiadas administrando cantidades
que varían entre aproximadamente 0,1 microgramos hasta
aproximadamente 1 gramo o el equivalente en el caso de plásmidos o
preparaciones de vacunas.
Apéndice
1
Gel de acrilamida: 10%
- 6,075 ml de acrilamida (40%) (BDH, Poole, RU)
- 3,35 ml de metilenbisacrilamida (2%) (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia)
- 6,25 ml de tampón de gel de acrilamida (véase abajo)
- 9 ml de agua destilada (producida en el laboratorio)
- 250 \mul de amonio persulfato (AMPERS) (0,025 mg en 250 \mul de agua destilada) (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
- 25 \mul de NNN'N'-tetrametiletilenediamina (TEMED) (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de gel de acrilamida: pH 8,8
- 1,5 M de Tris (tris(hidoximetil)aminometano) (Sigma-Aldrich, Poole, RU); titración del pH con ácido clorhídico concentrado
- 0,4% de dodecil sulfato sódico (SDS) (BDH-Merck, Poole, RU)
\vskip1.000000\baselineskip
Gel de empaquetamiento:
- 1,2 ml de acrilamida (40%) (BDH-Merck, Poole, RU)
- 0,65 ml de bisacrilamida (2%) (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia)
- 3,15 ml de tampón de gel empaquetador (véase abajo)
- 7,5 ml de agua destilada (producida en el laboratorio)
- 125 \mul de amonio persulfato (AMPERS) (0,025 mg/250 \mul) (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
- 12,5 \mul de NNN'N'-tetrametiletilenediamina (TEMED) (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de gel empaquetador, pH 6,8:
- 0,5 M de Tris (tris(hidoximetil)aminometano) (Sigma-Aldrich, Poole, RU); titración del pH con ácido clorhídico concentrado
- 0,4% de dodecil sulfato sódico (SDS) (BDH-Merck, Poole, RU)
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de carga:
- 2 ml de glicerol
- 2 ml de dodecil sulfato sódico al 10% (SDS) (BDH-Merck, Poole, RU)
- 0,25 mg de azul de bromofenol
- 2,5 ml de tampón de gel empaquetador concentrado 4 veces (0,5 M de Tris; 0,4% de SDS; pH 6,8)
- 0,5 ml de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de electroforesis/migración:
- 3 g/l de Tris (tris(hidoximetil)aminometano) (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
- 14,4 g/l de glicina (BDH-Merck, Poole, RU)
- 1 g/l de dodecil sulfato sódico (SDS) (BDH-Merck, Poole, RU)
\vskip1.000000\baselineskip
Tampón de transferencia:
- 3 g/l de Tris (tris(hidoximetil)aminometano) (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
- 14,4 g/l de glicina (BDH-Merck, Poole, RU)
- 1 g/l de dodecil sulfato sódico (SDS) (BDH-Merck, Poole, RU)
- 10% de metanol (BDH-Merck, Poole, RU)
\vskip1.000000\baselineskip
Tris Tween tamponado salino (TTBS, del inglés
Tris Tween buffered saline):
- 2,4 g/l de Tris (tris(hidoximetil)aminometano) (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
- 29 g/l de cloruro sódico (BDH-Merck, Poole, RU)
- 500 \mul de tween 20 (polioxietileno sorbitán monolaurato) (Sigma-Aldrich, Poole, RU)
\vskip1.000000\baselineskip
3% de solución de albúmina sérica bovina (BSA,
del inglés bovine serum albumin):
- 3 g de fracción 5 de albúmina bovina (BDH-Merck, Poole, UK)
- 100 ml de TTBS (véase arriba)
Apéndice
2
Secuencia de aminoácidos de la proteína
recombinante humana BiP expresada. 1.917 nucleótidos en total.
Inicio en Metionina (codón de iniciación), terminación en la cola 6x
His.
Peso molecular de 70.937,50 daltons
639 aminoácidos
86 aminoácidos fuertemente básicos (+) (K,
R)
108 aminoácidos fuertemente ácidos (-) (D,
E)
204 aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, F, W,
V)
142 aminoácidos polares (N, C, Q, S, T, Y)
Punto isoeléctrico de 5.173
Carga a pH 7,0 de -20,041
Apéndice
3
Fragmento grp78 (BiP) clonado por
RT-PCR y secuenciado empleado para expresar la
proteína recombinante humana. 1.917 nucleótidos en total. Inicio en
el codón de iniciación ATG; terminación en la cola 6x His.
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(Apéndice pasa a página
siguiente)
\newpage
Apéndice
4
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Transferencia Western que muestra 6
sueros reumatoides (calles 1-6), 5 sueros normales
(calles 7-11) y 4 controles de enfemermedad (calles
12-15) reaccionando con el lisado de condrosarcoma.
Se muestran los marcadores de peso molecular.
Figura 2. Proliferación de linfocitos en células
mononucleares cultivadas durante 6 días expresada como un índice de
estimulación: proliferación en presencia de p78/proliferación en
presencia del medio de cultivo solo. Una estimulación \geq 2,5 fue
considerada significativa. RABP (del inglés, rheumatoid arthritis
peripheral blood), sangre periférica de artritis reumatoide;
RASF (del inglés, rheumatoid arthritis synovial fluid),
fluido sinovial de artritis reumatoide; OIJDPB (del inglés, other
inflammatory joint disease peripheral blood), sangre periférica
de otras enfermedades inflamatorias de la articulación; OIJDSF (del
inglés, other inflammatory joint diseases synovial fluid),
fluido sinovial de otras enfermedades inflamatorias de la
articulación.
Figura 3. Anticuerpos frente a p78 recombinante
humana en los sueros de ratones medidos por ELISA y expresados como
OD_{405}. Se muestran los valores para los animales sangrados
antes de la inducción de la artritis experimental
(pre-sangrado) y al comienzo de la artritis inducida
por colágeno (CIA) y de la artritis inducida por pristano (PIA).
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inflamatoria
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<140>
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<151>
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<160> 5
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<170> PatentIn, versión 2.1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
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<211> 639
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<212> Proteína
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
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<211> 633
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<212> Proteína
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 1.917
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
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<211> 32
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
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\hskip-.1em\dddseqskiptatacatatg gaggaggaca agaaggagga cg
\hfill32
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<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccacctcgag ttctgctgta tcctcttcac ca
\hfill32
Claims (11)
1. La proteína BiP(GRP78) que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº 1 o SEQ ID nº 2 del
Listado de secuencias.
2. BiP(GRP78) recombinante que tiene la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID nº 1 o SEQ ID nº 2.
3. Uso de la proteína recombinante de unión a
la cadena pesada de la inmunoglobulina BiP(GRP78) en la
fabricación de un medicamento para la enfermedad inflamatoria.
4. Uso de la proteína recombinante de unión a
la cadena pesada de la inmunoglobulina BiP(GRP78) en la
fabricación de un medicamento para la artritis reumatoide.
5. Una secuencia de ADNc que codifica para la
proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina
BiP(GRP78) para uso en la terapia de la enfermedad
inflamatoria.
6. Una secuencia de ADNc que codifica para la
proteína de unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina
BiP(GRP78) para uso en la terapia de la artritis
reumatoide.
7. Una secuencia de ADNc que tiene o contiene la
secuencia de nucleótidos de la SEQ ID nº 3 del Listado de
secuencias.
8. Un vector recombinante que contiene una
secuencia de ADN de acuerdo con la reivindicación 7.
9. Un organismo no humano recombinante capaz de
expresar la proteína BiP(GRP78) que tiene la secuencia de
aminoácidos de la SEQ ID nº 1 o SEQ ID nº 2.
10. Uso de un ADN que codifica para
BiP(GRP78) recombinante en la preparación de un medicamento
para la artritis reumatoide.
11. Una composición farmacéutica para el
tratamiento de la artritis reumatoide en mamíferos, humanos
incluidos; la composición comprende la proteína recombinante de
unión a la cadena pesada de la inmunoglobulina designada
BiP(GRP78) que tiene una secuencia de aminoácidos como se
muestra en la SEQ ID nº 1 o SEQ ID nº 2 en combinación con un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
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