DE19744132A1

DE19744132A1 - Anti-Heavy Chain Binding Protein-Antikörper (Anti-BiP-Antikörper) bei rheumatoider Arthritis sowie Verfahren und Testkits zu ihrer Bestimmung in Körperflüssigkeiten

Info

Publication number: DE19744132A1
Application number: DE1997144132
Authority: DE
Inventors: Stefan Dr Blaes; Gerd-R Prof Dr Burmester
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1997-10-01
Filing date: 1997-10-01
Publication date: 1999-04-22
Also published as: JP2001519357A; WO1999018131A2; EP1019441A2; WO1999018131A3

Description

Die Erfindung betrifft Anti-Heavy Chain Binding Protein-Antikörper (Anti-BiP-Antikörper) sowie Verfahren und Testkits zur Bestimmung von Anti-Heavy Chain Binding Protein (Anti- Grp78)-Antikörpern in Körperflüssigkeiten. Sie bezieht sich insbesondere auf den Nachweis dieser Antikörper als Autoantikörper für die serologische Diagnostik einer rheumatoiden Arthritis in Differentialdiagnose zu anderen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises in vitro.

Die rheumatoide Arthritis (RA) ist die häufigste entzündliche Gelenkerkrankung, von der ca. 1-2% der Bevölkerung betroffen sind. Im Verlauf der Erkrankung kommt es zur Bildung von Autoantikörpern, vor allem Rheumafaktoren. Rheumafaktoren sind bislang die einzigen serologische Marker, die zur Diagnostik der RA eingesetzt werden. Sie sind jedoch auch in anderen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, wie dem systemischen Lupus erythematodes, der systemischen Sklerodermie und den Mischkollagenosen und sogar in der gesunden Bevölkerung nachweisbar. Die Spezifität des Rheumafaktors für die RA beträgt nur 74%, seine Häufigkeit unter RA-Patienten 68% (Bläß St, Specker Ch, Lakomek HJ, Schneider EM, Schwochau M. Novel 68k autoantigen detected by rheumatoid arthritis (RA) specific autoantibodies. Ann Rheum Dis 1995; 54 : 355-60). Die RA ist eine sehr heterogene und daher schwer zu diagnostizierende Erkrankung. Zur Diagnosestellung der RA existieren sieben Kriterien des American College for Rheumatism, von denen mindestens vier erfüllt sein müssen (Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, Healey LA, Kaplan SR, Liang MH, Luthra HS, Medsger TA jr, Mitchell DM, Neustadt DH, Pinals RS, Schaller JG, Sharp JT, Wilder RL, Hunder GG. The American Rheumatism Assocciation 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arhtritis Rheum 1988; 31 : 315-24). Darunter befindet sich nur ein einziger serologischer Marker, der Rheumafaktor. Daher ist eine Verbesserung der Diagnosestellung durch weitere und ggf. spezifischere serologische Parameter insbesondere auch für eine adäquate und zeitgemäße Behandlung von größter Bedeutung.

Heavy Chain Binding Protein (BiP), ursprünglich beschrieben als Glucose Regulated Protein 78, ist ein sogenanntes molekulares Chaperon, das im endoplasmatischen Retikulum vorkommt und für die Faltung und Komplexierung von Proteinen verantwortlich ist, die den sekretorischen Weg beschreiten. Es gehört zur Hsp70-Familie der Streßproteine und ist ein ubiquitär exprimiertes, hochkonserviertes und in Hefe essentielles Protein. BiP wurde bislang nicht in Zusammenhang mit der rheumatoiden Arthritis gebracht. Dies mag seine Ursache darin haben, daß die Anti-BiP-Antikörper gegen ein glykosidisches Epitop gerichtet sind, das in den bislang eingesetzten Expressionssystemen nicht exprimiert wird.

Der Erfindung liegen die Aufgaben zugrunde, Anti-Heavy Chain Binding Protein-Antikörper von Patienten mit rheumatoider Arthritis zur Verfügung zu stellen, ein sicheres Verfahren zur Bestimmung von Anti-BiP-Autoantikörpern bereitzustellen sowie entsprechende Testverfahren zu entwickeln.

Die Aufgaben wurden dadurch gelöst, daß Anti-BiP-Antikörper gewonnen wurden, indem natürliches (biochemisch gereinigtes) oder rekombinantes BiP an eine feste Phase gebunden und zur Anreicherung der Antikörper aus Körperflüssigkeiten verwendet wurde. Die Ablösung der Antikörper aus dem Antigen-Antikörper-Komplex erfolgt mit Hilfe chaotroper Substanzen.

Erfindungsgemäß wird BiP natürlich (biochemisch gereinigt) oder rekombinant an feste Phasen adsorptiv oder kovalent oder durch Elektrotransfer gebunden und zum Nachweis der Anti-BiP-Antikörper in verschiedenen Immunoassays eingesetzt. Besonders bevorzugt ist das Antigen in seiner glykosylierten Form.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Anti-BiP-Antikörpern in Körperflüssigkeiten besteht darin, das Protein BiP an feste Phasen zu binden und im Immunoassay einzusetzen. Dabei wird BiP adsorptiv oder kovalent an feste Phasen gebunden, gegebenenfalls nach vorheriger chemischer Aktivierung der festen Phase. Als Antigen wird natürliches (biochemisch gereinigtes) oder rekombinantes BiP eingesetzt.

Die feste Phase besteht aus Polystyren, Polyvinylidenfluorid oder Nitrocellulose in unterschiedlichen geometrischen Formen, wie Mikrotitrationsplatten, Röhrchen oder in kugelförmiger bzw. flächenförmiger Gestalt.

Die Anti-BiP-Antikörper werden gebunden im Immunoassay bestimmt. Dabei erfolgt die Bindung der Anti-BiP-Antikörper in geeigneten Puffern, die nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthalten. Die gebundenen Anti-BiP-Antikörper werden durch spezifische Konjugate, die gegen einzelne Immunglobulinklassen oder gegen mehrere gerichtet sind, nachgewiesen.

Der erfindungsgemäße Testkit zur Bestimmung von Anti-BiP-Antikörpern ist gekennzeichnet durch:

- BiP in gereinigter oder rekombinanter Form, das adsorptiv oder kovalent an eine feste Phase gebunden ist,
- einen Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, der nicht ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- ein spezifisches Konjugat, bestehend aus einem Antikörper, der gegen humanes Immunglobulin IgG, IgM, IgA oder mehrere dieser Immunglobuline gerichtet ist und ein Enzym bzw. einen Fluoreszenzfarbstoff oder eine radioaktiv markierte Komponente,
- einen Puffer zum Verdünnen des Konjugates, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- einen Puffer zum Waschen (Entfernen) der nichtgebundenen Immunreaktanten, der nicht ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- eine Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion und
- eine Stoplösung zum Unterbrechen der Enzymreaktion.

Durch die hohe Prävalenz der erfindungsgemäßen Anti-BiP-Antikörper liegt überraschenderweise ein neuer wichtiger diagnostischer Marker vor. Da BiP innerhalb der Zelle eine essentielle Funktion hat, kann ein Zusammenhang zwischen Antikörperbildung und Pathogenese hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper stellen einen wichtigen Befund zur Differentialdiagnose gegenüber anderen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises dar, bei denen diese Antikörper nicht auftreten.

Zum Nachweis der Antikörper gegen BiP werden in der Immunologie etablierte Verfahren wie Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Sandwich-ELISA und Immunoblot eingesetzt. Die Analyse der Antikörperreaktivitäten im ELISA hat im Vergleich zu der Methode des Immunoblots vor allem den Vorteil des geringeren Zeitaufwandes und der niedrigen Kosten. Deshalb wird der ELISA als Screening-Methode eingesetzt. Wird eine Feinanalyse der Antikörperreaktivität angestrebt, so kommt der Immunoblot zum Einsatz.

Auf der Basis des Nachweises eines serologischen Markers (Anti-Bip-Antikörper) bei Patienten mit rheumatoider Arthritis konnten erfindungsgemäß Autoantikörper gegen BiP bei Patienten mit rheumatoider Arthritis in 66% der Fälle im ELISA und im Immunoblot nachgewiesen werden. Dabei wurden Patientenseren hinsichtlich einer Autoreaktivität gegen gereinigtes (natürliches) BiP getestet.

Erfindungsgemäß wurde angezeigt daß die Anti-BiP-Antikörper bei RA-Patienten mit großer Häufigkeit auftreten. Diese Antikörper richten sich vorwiegend gegen ein glykosidisches Epitop, dessen Hauptdeterminante N-Acetylglucosamin ist. BiP wurde aufgrund seiner molekularen und biochemischen Eigenschaften (relative molekulare Masse, isoelektrischer Punkt, Aminosäuresequenz) charakterisiert.

Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher erläutert, die die Erfindung aber nicht auf diese beschränken sollen.

Ausführungsbeispiele

In die Untersuchungen gingen 214 Patienten mit RA, 47 Patienten mit systemischem Lupus erythematodes, 23 Patienten mit Psoriasis-Arthritis, 24 Patienten mit systemischer Sklerose, 6 Patienten mit Mischkollagenose, 13 Patienten mit Osteoarthrose, 13 mit ankylosierender Spondylitis, 4 mit reaktiver Arthritis, 10 mit Morphea, sowie 100 gesunde Spender ein. Die Reinigung des BiP erfolgte aus HeLa-Zellen, wobei die Reinigungsschritte standardisiert sind.

Beispiel 1 Gewinnung von Anti-BiP-Antikörpern aus Körperflüssigkeiten von Patienten mit RA

Kopplung von BiP an feste Phase
Blockierung überzähliger Bindungsstellen
Inkubation mit Körperflüssigkeiten von Patienten mit RA
Waschen (Entfernen) nicht-gebundener Immunreaktanten
Ablösen spezifisch gebundener Anti-BiP-Antikörper durch Behandlung mit chaotropen Salzen, z. B. 3 M Guanidiniumisothiocyanat-Lösung
Waschen und Konzentrierung der Antikörper

Beispiel 2 Herstellung, des ELISA zum Nachweis von Anti-BiP-Antikörpern Beschichtung des BiP an die feste Phase des ELISA

Für die Beschichtung wurden 96-Well Polystyren-Platten verwendet. Die Beschichtung erfolgte mit 10-15 ng BiP pro Well. Als Benetzungsmedium diente 50 mM Carbonatpuffe, pH 9.5. Die Benetzung erfolgte über Nacht bei 4°C. Anschließend wurden die Platten entweder weiter verwendet oder bei -20°C eingefroren.

Vor dem Auftrag der Proben erfolgte eine Vorblockierung der Platten mit je 100 µl Probenpuffer [Phosphate Buffered Saline mit Nonidet P40, (PBS-NP40), 0.1%, pH 7.0], anschließend der Probenauftrag (Serumverdünnung 1 : 20 in Probenpuffer) mit je 50 µl/well über 3 Stunden bei Raumtemperatur (Probenauftragung von Patientenseren und von Kontrollseren gesunder Spender und Patienten des rheumatischen Formenkreises). Als Eichkurve wurde ein stark positives Patientenserum (Standardserum) in 6 linearen Verdünnungsschritten, beginnend bei 1 : 10 mitgeführt. Anschließend erfolgte dreimal der Waschvorgang mit Waschpuffer.

Konjugatzugabe

Die Inkubation mit Alkalische Phosphatase(AP)-markiertem Anti-Human-IgG erfolgte in einer Verdünnung von 1 : 3000 in Probenpuffer mit jeweils 50 µl/well über 3 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wurde dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen.

Substratreaktion

Die Färbung der Antigen-Antikörperreaktion erfolgte mit BCIP/NBT (5-Bromo-3-chloro indolylphosphat/Nitro-Blue Tetrazolium) in alkalischem Puffer.

Die gemessene Antikörperreaktivität des Standardserums in der Verdünnungsstufe 1 : 20 wurde mit 10000 Relativen Einheiten (RE) definiert. Die Verdünnungsstufen 1 : 10, 1 : 30, 1 : 50, 1 : 100, 1 : 500 entsprechen demnach 20000RE, 6667RE, 4000RE, 1000RE, 200RE. Die Messung der Eichkurve und der Serenproben erfolgte als Dreifachbestimmung. War die Antikörperreaktivität in einem Serum höher als im Standardserum, so wurde es in höheren Verdünnungsstufen erneut gemessen. Die resultierenden RE wurden dann mit dem gegenüber 1 : 100 höheren Verdünnungsfaktor multipliziert.

Im ELISA konnten Anti-BiP-Antikörper bei 66% der RA-Patienten und bei 0.5% der Patienten mit anderen Diagnosen des rheumatischen Formenkreises, nicht aber bei gesunden Spendern nachgewiesen werden.

Beispiel 3

HeLa-Zellen wurden in einem Puffer lysiert, der Gardol, Harnstoff und 2-Mercaptoethanol enthielt und bei 70°C für 15 min inkubiert. Die lysierten Zellen wurden mit einer gesättigten Cäsiumchloridlösung bei Raumtemperatur auf eine Dichte von r = 1.6 g/cm gebracht und für 2 Stunden bei 10,000 g ultrazentrifugiert. Das resultierende Proteinfloat wurde in einem Lyspuffer aufgenommen, der anstelle des Cardol das nicht-ionische Detergenz NP40 enthielt und gegen 25 mM Tris-Puffer dialysiert. Das Material wurde mit Ethanol gefällt und auf einer Sodium Dodecylsulfat Polyacrylamide Gelelectrophoresis (SDS-PAGE) mit einem 10-20%igen Acrylamidgradienten nach molekularer Masse aufgetrennt. Gele wurden auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) elektrotransferiert.

Elektrotransfers wurden mit PBS NP40 und BSA blockiert und in Streifen geschnitten. Jeder Streifen wurde mit einem in PBS NP40 1 : 20 verdünnten Serum über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Streifen in einem Waschpuffer (PBS-NP40) gewaschen und mit AP-konjugiertem Zweitantikörper inkubiert. Dessen Verdünnung betrug 1 : 5,000 in PBS- NP40 seine Inkubationszeit 1 Stunde. Nach erneutem Waschen in PBS-NP40 wurde in AP- Puffer (pH 8.7) inkubiert und Substrat für die Farbreaktion (BCIP/NBT) zugegeben. Bei ausreichender Farbung der Immunreaktionen wurde mit neutralem oder saurem Puffer gestoppt.

Claims

1. Anti-Heavy Chain Binding Protein-Antikörper (Anti-BiP-Antikörper), erhalten durch Immunadsorption an natürliches (biochemisch gereinigtes) oder rekombinantes BiP und Ablösen der Antikörper durch Behandlung mit chaotropen Salzen.

2. Verfahren zur Bestimmung von Anti-BiP-Antikörpern nach Anspruch 1 in Körperflüssigkeiten, gekennzeichnet dadurch, daß BiP an feste Phasen gebunden und im Immunoassay eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des BiP-Antigens adsorptiv oder kovalent an feste Phasen erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung des BiP- Antigens adsorptiv oder kovalent nach vorheriger chemischer Aktivierung an feste Phasen erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß als Antigen natürliches, biochemisch gereinigtes oder rekombinantes BiP eingesetzt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung des BiP über spezifische monoklonale Anti-BiP-Antikörper erfolgt.

7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase aus Polystyren, Polyvinylidenfluorid oder Nitrocellulose besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 2 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase eine unterschiedliche geometrische Form hat.

9. Verfahren nach Anspruch 2 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß die als feste Phase dienenden Träger in Form einer Mikrotitrationsplatte oder eines Röhrchens vorliegen oder eine kugelförmige oder flächenförmige Gestalt haben.

10. Verfahren nach Anspruch 2 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Anti-BiP-Antikörper gebunden im Immunoassay bestimmt werden.

11. Verfahren nach Anspruch 2 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung der Anti- BiP-Antikörper in Puffern, die nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthalten, erfolgt.

12. Verfahren nach Anspruch 2 bis 11, gekennzeichnet dadurch, daß die gebundenen Anti- BiP-Antikörper durch spezifische Konjugate, die gegen einzelne Immunglobulinklassen oder gegen mehrere gerichtet sind, nachgewiesen werden.

13. Verfahren nach Anspruch 2 bis 12, gekennzeichnet dadurch, daß die spezifischen Konjugate aus Antikörpern, die gegen humanes Immunglobulin G, M oder A oder mehrere dieser Immunglobuline gerichtet sind und einem Enzym oder einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer radioaktiv markierten Komponente bestehen.

14. Testkit zur Bestimmung von Anti-BiP-Antikörpern nach Anspruch 1, bestehend aus

- BiP, das an eine feste Phase gebunden ist,
- einem Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit
- einem spezifischen Konjugat
- einem Puffer zum Verdünnen des Konjugates
- einem Puffer zum Waschen der nichtgebundenen Immunreaktanten
- einer Substratlösung und
- einer Stoplösung.

15. Testkit nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch

- BiP, das adsorptiv oder kovalent an eine feste Phase gebunden ist,
- einen Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, der nicht ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- ein spezifisches Konjugat, bestehend aus einem Antikörper, der gegen humanes Immunglobulin IgG, IgM, IgA oder mehrere dieser Immunglobuline gerichtet ist, und einem Enzym oder einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer radioaktiv markierten Komponente,
- einen Puffer zum Verdünnen des Konjugates, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- einen Puffer zum Waschen (Entfernen) der nichtgebundenen Immunreaktanten, der nicht ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- eine Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion und
- eine Stoplösung zum Unterbrechen der Enzymreaktion.