DE19707343C2 - Verfahren zur Bestimmung von Anti-Proteasom-Antikörpern in Körperflüssigkeiten sowie ein Testkit zur Durchführung dieses Verfahrens - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Autoantikörpern gegen Proteasom in Körperflüssigkeiten. Die Erfindung betrifft insbesondere den Nachweis dieser Autoantikörper für die serologische Diagnostik einer autoimmunen Myositis bzw. eines systemischen Lupus erythematodes (SLE) in vitro und die Bereitstellung von Testkits.

Es ist bekannt, daß bei autoimmun bedingten Systemerkrankungen, wie dem SLE und der autoimmunen Myositis, multifaktorielle Störungen in der Immunregulation vorliegen. Ein besonderes Phänomen ist dabei die Entstehung von Autoantikörpern. Die Auswertung der individuellen Autoantikörperprofile und Verlaufstiter geben in der Regel wichtige Informationen zu Therapie und Prognose der zugrundeliegenden Erkrankung (Mühlen CA, Tan EM (1995). Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Seminars in Arthritis and Rheumatism 5: 323- 358). Dabei repräsentieren die Autoantikörper zum Teil wichtige diagnostische Marker und erlauben einen differenzierteren Umgang innerhalb der klinisch definierten Entitäten. Jedoch konnten Autoantikörper bei autoimmuner Myositis bisher nur in einer niedrigen Prävalenz nachgewiesen werden (10-20% der Fälle) (Targoff, I. N. 1994. Immune manifestations of inflammatory muscle disease. Rheum. Dis. Clin. N. Am. 20: 857). Die Anti-Aminoacyl-tRNA Synthetase-Antikörper, die die Bindung zwischen tRNA und ihrer jeweiligen Aminosäure im Zytoplasma katalysieren, waren die bisher am häufigsten nachgewiesenen Autoantikörper bei autoimmuner Myositis. Diese Autoantikörper charakterisieren eine klinische Untergruppe der Myositis, das sogenannte Anti-Synthetase-Syndrom (Bernstein, R. M., S. H. Morgan, J. Chapman, C. C. Bunn, M. B. Mathews, M. Turner Warwick, and G. R. Hughes. 1984. Anti-Jo-1 antibody: a marker for myositis with interstitial lung disease. Br. Med. J. Clin. Res. Ed. 289: 151). Die Mehrzahl der Patienten mit autoimmuner Myositis können jedoch bisher serologisch nicht erfaßt werden, so daß die Diagnosesicherung meist nur durch typische Klinik und entzündliche Parameter erfolgt.

Das Proteasom ist ubiquitär und hochkonserviert in jeder eukaryonten Zelle vorhanden (Rivett, A. J. 1993. Proteasomes: multicatalytic proteinase complexes. Biochem. J. 291: 1). Es besteht aus mindestens 14 verschiedenen Untereinheiten, die in einer zylinderförmigen Struktur aus vier übereinandergelagerten Ringen arrangiert sind (Puhler, G., S. Weinkauf, L. Bachmann, S. Muller, A. Engel, R. Hegerl, and W. Baumeister. 1992. Subunit stoichiometry and three-dimensional arrangement in proteasomes from Thermoplasma acidophilum. EMBO J. 11: 1607). Die beiden äußeren Ringe werden von den α-Typ Untereinheiten und die beiden inneren Ringe von β-Typ Untereinheiten gebildet. Die gegenwärtigen Vorstellungen zur Funktion des Proteasoms gehen von einer Interaktion der äußeren Untereinheiten mit verschiedenen regulatorischen Poteinen wie PA-28 aus, während die inneren Untereinheiten für die proteolytische Aktivität verantwortlich sind (Puhler, G., S. Weinkauf, L. Bachmann, S. Muller, A. Engel, R. Hegerl, and W. Baumeister. 1992. Subunit stoichiometry and three-dimensional arrangement in proteasomes from Thermoplasma acidophilum. EMBO J. 11: 1607). Interessanterweise ist nur das komplett zusammengesetzte Proteasom proteolytisch aktiv. In kürzlichen Untersuchungen konnte sowohl eine strukturelle als auch funktionelle Beeinflussung der Proteinasefunktion durch Interferon-γ gezeigt werden, welches als inflammatorisches T-Zell-Zytokin auch bei aktiven Autoimmunprozessen im Gewebe erhöht ist (Ahn, J. Y., N. Tanahashi, K. Akiyama, H. Hisamatsu, C. Noda, K. Tanaka, C. H. Chung, N. Shibmara, P. J. Willy, J. D. Mott, and et al. 1995. Primary structures of two homologous subunits of PA28, a gamma­ interferon-inducible protein activator of the 20S proteasome. FEBS Lett. 366: 37).

Proteasom ist für den Abbau von sowohl körpereigenen als auch körperfremden Proteinen (z. B. Virusproteine) im Zytoplasma verantwortlich. Dabei entstehen kurze Peptide, die an der Zelloberfläche über MHC-Klasse I Moleküle präsentiert werden können (Fehling, H. J., W. Swat, C. Laplace, R. Kuhn, K. Rajewsky, U. Muller, and H. von Boehmer. 1994. MHC class I expression in mice lacking the proteasome subunit LMP-7. Science 265: 1234). Die Zellen der körpereigenen Immunabwehr (zytotoxische T-Lymphozyten) unterscheiden über die präsentierten Peptide des jeweiligen MHC-Moleküls zwischen körpereigen und körperfremd. Im Falle eines viralen Antigens, also eines körperfremden Proteins, kommt es im Regelfall zur Elimination dieser infizierten Zelle.

Zur Nachweis der Antikörper gegen Proteasom werden in der Immunologie etablierte Verfahren wie ELISA, Sandwich-ELISA und Immunoblot eingesetzt. Die Analyse der Antikörperreaktivitäten im ELISA hat im Vergleich zu der Methode des Immunoblots vor allem den Vorteil des geringeren Zeitaufwandes und der niedrigen Kosten. Deshalb wird der ELISA als Screening-Methode eingesetzt. Wird eine Feinanalyse der Antikörperreaktivität angestrebt, so kommt der Immunoblot zum Einsatz. Mit dieser Methode kann die jeweilige antigene Untereinheit des Proteasoms zwar näher bestimmt werden, eine Erfassung aller Untereinheiten ist jedoch nicht möglich.

Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, ein sicheres Verfahren zur Bestimmung von Anti-Proteasom-Antikörpern bereitzustellen sowie einen entsprechenden Testkit zu entwickeln.

Überraschend wurde die Untereinheit C9 des Proteasoms als das prädominante Zielantigen bei diesen Patienten identifiziert, was erfindungsgemäß ermöglichte, ein Nachweisverfahren sowohl über Proteasom wie auch über die als serologischen Marker identifizierte α-Untereinheit C9 aufzubauen. Durch die hohe Prävalenz der Anti-Proteasom-Antikörper bei autoimmuner Myositis liegt damit ein neuer wichtiger diagnostischer Marker vor. Überraschend wird interessanterweise gerade der Enzymkomplex, der die Antigene für die Unterscheidung zwischen körpereigen und körperfremd zurechtschneidet, selbst zum Autoantigen bei Patienten mit Myositis und SLE. Da das Proteasom innerhalb der Zelle eine essentielle Funktion hat, kann ein Zusammenhang zwischen Antikörperbildung und Pathogenese hergestellt werden. Die beschriebenen Antikörper gegen Proteasom, stellen einen wichtigen Befund zur Differentialdiagnose gegenüber anderen Erkrankungen wie virale Myositis, neurogene Muskelschädigung oder Stoffwechselerkrankungen der Muskulatur dar, bei denen üblicherweise keine Autoantikörper auftreten.

Erfindungsgemäß wird sowohl Proteasom oder seine Untereinheiten, vorzugsweise das 20S-Proteasom bzw. seine α- Typ-Untereinheit C9, an feste Phasen adsorptiv oder kovalent gebunden und zum Nachweis der Anti-Proteasom-Antikörper in verschiedenen Immunoassays eingesetzt. Besonders bevorzugt ist als Antigen die Untereinheit C9 vom α-Typ des Proteasoms.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Anti- Proteasom-Antikörpern in biologischen Flüssigkeiten wird durchgeführt, indem Proteasom an ein Trägermaterial gebunden wird gegebenenfalls nach vorheriger chemischer Aktivierung und mit den biologischen Flüssigkeiten unter Bedingungen, die eine Antigen-Artikörper-Reaktion zulassen, in Kontakt gebracht wird. Der Nachweis der Antikörper-Antigen-Reaktion erfolgt durch physikalische oder chemische Methoden. Die eingesetzten Trägermaterialien sind feste Phasen unterschiedlicher Form, so z. B. in Form von Mikrotiterplatten oder Röhrchen, kugelförmig oder flächenförmig. Bevorzugt werden feste Phasen aus Polystyren verwendet.

Die Bindung der Anti-Proteasom-Antikörper erfolgt in an sich üblichen Puffern, die nichtionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthalten.

Vorzugsweise auf der Basis des Nachweises eines serologischen Markers (α-Untereinheit C9) bei Patienten mit autoimmuner Myositis und SLE, konnten erfindungsgemäß Autoantikörper gegen Proteasom bei Patienten mit autoimmuner Myositis in 62% der Fälle und bei SLE in 58% der Fälle im ELISA und Immunoblot nachgewiesen werden. Dazu wurden Patientenseren hinsichtlich eine Antikörperreaktivität gegen gereinigtes Proteasom getestet. Weiterhin wurden Autoantikörperprofile der Patienten ausgewertet, um eventuelle serologische Subgruppen zu identifizieren.

Gemäß der Erfindung wird außerdem ein Testkit für die Bestimmung von Anti-Proteasom Antikörpern zur Verfügung gestellt.

Dieser Test ist gekennzeichnet durch:

• - Proteasom oder seine Untereinheiten, die adsorptiv oder kovalent an eine feste Phase gebunden sind, vorzugsweise 20S- Proteasom bzw. seine α-Typ-Untereinheit C9,
• - einen Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
• - ein spezifisches Konjugat, bestehend aus einem Antikörper, der gegen humanes Immunglobulin IgG, IgM, IgA oder gegen mehrere dieser Immunglobuline gerichtet ist und einem Enzym,
• - einen Puffer zum Verdünnen des Konjugats, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
• - einen Puffer zum Waschen (Entfernen) der nichtgebundenen Immunreaktanten, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
• - eine Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion und
• - eine Stopp-Lösung zum Unterbrechen der Enzymreaktion.

Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher erläutert, die die Erfindung aber nicht auf diese beschränken sollen.

Ausführungsbeispiele

In die Untersuchung gingen 8 Patienten mit einer Dematomyositis (DM), 26 Patienten mit einer Polymyositis (PM), 52 Patienten mit einem SLE, 10 Patienten mit einer Mischkollagenose (MCTD), 20 Patienten mit einer rheumatoiden Arthritis (RA) und 112 gesunde Blutspender (Kontrollen) ein. Die Reinigung des Proteasoms erfolgte aus humanen Erythrozyten, wobei die Reinigunsschritte standardisiert sind.

Die statistische Auswertung erfolgte mittels des nicht­ parametrischen U-Testes nach Mann und Whitney und des Chi- Quadrat Testes mit Yates Korrektur um die qualitativen und quantitativen Reaktivitäten der unterschiedlichen Serengruppen zu vergleichen.

Beisipiel 1 Herstellung des ELISA zum Nachweis von Anti-Proteasom- Autoantikörpern Beschichtung des Proteasoms an die feste Phase des ELISAs

Für die Beschichtung wurden Polystyren-Platten (Nunc, Dänemark) mit je 96 Wells verwendet. Die Beschichtung erfolgte mit 1 µg/ml Proteasom, wobei 50 µl je Well verwendet wurden. Als Benetzungsmedium diente 0,05 M Carbonatpuffer, pH 9,5. Die Benetzung erfolgte über Nacht im Kühlschrank. Anschließend wurden die Platten entweder weiter verwendet oder bei -20°C eingefrohren.

Probenauftragung von Patientenseren und von Kontrollseren gesunder Spender

Vor dem Auftragen der Proben erfolgte eine Vorblockierung der Platten mit je 100 µl/Well Probenpuffer (PBS-Tween 20, pH 7,2, mit 5% Kälberserum) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Nach dreimaligem Waschen mit dem Waschpuffer (PBS-Tween 20 0,1%, pH 7,2) erfolgte die Probenauftragung (Serumverdünnung 1 : 100 in Probenpuffer) mit je 50 µl/Well über 2 Stunde bei Raumtemperatur. Als Eichkurve wurde ein stark positives Patientenserum (Standardserum) in 6 linearen Verdünnungsschritten, beginnend bei 1 : 100, mitgeführt.

Anschließend erfolgte dreimal der Waschvorgang mit dem Waschpuffer.

Konjugatzugabe

Die Inkubation mit POD-markiertem Anti-Human-IgG erfolgte in einer Verdünnung von 1 : 1000 in Probenpuffer mit jeweils 50 µl/­ Well über 2 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wurde dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen.

Substratreaktion

Die Färbung der Antigen-Antikörperreaktion erfolgt mit 2 mg/ml O-Phenylendiamin (OPD) in 0,1 M Citratpuffer pH 5,0 und H₂O₂ 0,003% mit 50 µl/Well über 15 Minuten. Die Reaktion wurde mit 1 M Schwefelsäure, 50 mM Natriumsulfit, 150 µl/Well gestoppt. Die optische Dichte (Extinktion) wurde bei 492 nm gemessen. Dabei ist der resultierende Farbumschlag der Reaktion üblicherweise proportional der Anzahl der gebundenen konjugierten Antikörper.

Die gemessene Antikörperreaktivität des Standardserums in der Verdünnungsstufe 1 : 100 wurde mit 10000 Relativen Einheiten (RE) definiert. Die Verdünnungsstufen 1 : 200, 1 : 400, 1 : 800, 1 : 1600 und 1 : 3200 entsprachen demnach 5000 RE, 2500 RE, 1250 RE, 625 RE und 312,5 RE. Die Messung der Eichkurve und der Serenproben erfolgte als Doppelbestimmung. War die Antikörperreaktivität in einem Serum höher als im Standardserum, so wurde es in höheren Verdünnungsstufen (1 : 200, 1 : 400 etc.) erneut gemessen. Die resulierenden RE wurden dann mit dem gegenüber 1 : 100 höheren Verdünnungsfaktor multipliziert.

Im ELISA konnten Anti-Proteasom-Antikörper bei 62% (21/34) der Patienten mit Dermato- und Polymyositis und bei 58% (30/52) der Patienten mit systemischem Lupus erythematodes nachgewiesen werden (Abb. 1). Während bei Patienten mit Mischkollagenose (2/8, p < 0.025) und rheumatoider Arthritis (1/20, p < 0.001) eine signifikant niedrigere Prävalenz vorlag. In einem Kontrollkollektiv von 112 gesunden Blutspendern konnte in zwei Fällen eine Reaktion gegen Proteasom nachgewiesen werden (p < 0.001). Weiterhin lagen die Antikörperreaktivitäten der Patienten mit PM/DM und SLE gegenüber den Patienten mit MCTD (p < 0.025) und RA (p < 0.0005) signifikant höher. Die Anti- Proteasom-Antikörper konnten dabei vor allem in hohen Antikörpertitern bei aktiven und schweren Krankheitsverläufen nachgewiesen werden.

Beispiel 2 Nachweis der Anti-Proteasomen-Antikörper in anderen Immunoassays und Bestätigung ihrer Spezifität

Die positiven Patientenseren wurden anschließend in einem Spezifitäts-ELISA hinsichtlich einer Anti-Proteasom-Reaktivität untersucht. Dieser ELISA unterscheidet sich vorn ersten Beispiel durch eine höhere Spezifität des Nachweises von Anti-Proteasom- Antikörpern. Hier wurde erst ein monoklonaler Anti-Proteasom- Antikörper (Klon B65-BA5) an die feste Phase der ELISA-Platte gebunden und anschließend die ELISA-Platte vorblockiert (je 100 µl/Well Probenpuffer PBS-Tween 20, pH 7,2, mit 5% Kälberserum für 1 Stunde bei Raumtemperatur). Gereinigtes Proteasom wurde in einer Konzentration von 10 µg/ml aufgetragen.

Die monoklonalen Anti-Proteasom-Antikörper reagieren hochspezifisch mit Proteasom. Das am monoklonalen Antikörper gebundene Proteasom diente dann zum Nachweis der Patientenantikörper. Die Verdünnung der Patientenseren und die Inkubationszeiten sind identisch mit dem ersten Beispiel. Als Konjugat wurde ein POD-markierter Anti-Human-IgG (Fc- spezifisch, SIGMA) in der Verdünnung von 1 : 10000 verwendet. Dieses Konjugat wurde Affinitätsgereinigt und zeigt keine Kreuzreaktionen mit Maus- oder Ratten-IgG. Die Färbung der Antigen-Antikörperreaktion erfolgt mit 2-Acino-bis- Ethylbenzthiazolin-6-Sulfat Diammonium. Die optische Dichte (Extinktion) wurde bei 405 nm gemessen. Dabei ist der resultierende Farbumschlag der Reaktion üblicherweise proportional der Anzahl der gebundenen konjugierten Antikörper. Die Ergebnisse sind in Abb. 2 zusammengefaßt.

Im Immunoblot reagierten die Anti-Proteasom-Antikörper positiven Seren insbesondere gegen eine Untereinheit des Proteasoms mit einem Molekulargewicht von 28 kD. Um herauszufinden, welche Untereinheiten des Proteasoms für die Antikörperreaktivität verantwortlich sind, wurde die Proteasomfraktion in der 2-dimensionalen Gelelektrophorese aufgetrennt. Hier konnte als prädominantes Zielantigen die α- Untereinheit C9 nachgewiesen werden.

Beispiel 3 Nachweis von Autoantikörpern gegen andere Antigene in den untersuchten Seren

Bei den Patienten wurden die Autoantikörperprofile bestimmt, die in Assoziation mit der Grundkrankheit auftreten (z. B. Anti- ds DNA-Antikörper bei SLE, Anti-Jol-Antikörper beim Anti- Synthetase-Syndrom). Diese Antikörperbefunde zeigten keine Korrelation zum Nachweis von Anti-Proteasom-Antikörpern. Nur in einem von fünf Fällen war eine Koinzidenz von Anti-Synthetase- Antikörpern und Anti-Proteasom-Antikörpern nachweisbar (Tabelle 1).

Tabelle 1. ANA wurden in der indirekten Immunfluoreszenz auf Hep-2 Zellen nachgewiesen. Der Nachweis von. Antids DNA- Antikörpern erfolgte in der Crithidien-Immunfluoreszenz. Der Nachweis von Anti-Proteasom-Antikörpern (APA), Anti-Jo1- Antikörpern, Anti-Sc170-Antikörpern, Anti-Sm-Antikörpern und Anti-U1-RNP-Antikörpern erfolgte in ELISA und Immunoblot. Rheumafaktoren (Rf) wurden im ELISA gemessen.

Legende zu den Abbildungen

Abb. 1: Autoantikörperreaktivitäten gegen Proteasom im ELISA. Die Mittelwerte der Antikörperreaktivitäten sind angezeigt. Der Normwert (---) des ELISA wurde als dreifache Standardabweichung der Kontrollseren vom Mittelwert bestimmt. Die Reaktivitäten der im ELISA positiven und im Immunoblot negativen Kontrollseren sind eingekreist.

Abb. 2: Im Spezifitäts-ELISA bestätigten sich die Reaktivitäten der positiven Seren der Patienten mit DM/PM, SLE, während die beiden im ersten ELISA positiven Kontrollseren nicht in diesem Assay reagierten.

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Proteasom-Antikörpern in Körperflüssigkeiten, gekennzeichnet dadurch, daß das 20S- Proteasom oder seine α-Typ-Untereinheit C9 an feste Phasen adsorptiv oder kovalent gebunden und nachfolgend zur spezifischen Bindung und zum Nachweis der Anti-Proteasom-Antikörper im Immunoassay eingesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Antigen die Untereinheit C9 vom α-Typ des Proteasoms eingesetzt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung des Proteasom-Antigens adsorptiv oder kovalent nach vorheriger chemischer Aktivierung der festen Phase erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung des Proteasoms über spezifische monoklonale Anti- Proteasom-Antikörper erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase aus Polystyren besteht.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase eine unterschiedliche geometrische Form hat.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die als feste Phase dienenden Träger in Form einer Mikrotitrationsplatte oder eines Röhrchens vorliegen oder eine kugelförmige oder flächenförmige Gestalt haben.

8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß die Anti-Proteasom-Antikörper spezifisch an das immobilisierte Proteasom-Antigen gebunden und im Immunoassay bestimmt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung der Anti-Proteasom-Antikörper in geeigneten Puffern, die nicht-ionische oder ionische Detergenzen oder Proteine enthalten, erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß die gebundenen Anti-Proteasom-Antikörper durch spezifische Konjugate, die gegen einzelne Immunoglobulinklassen oder gegen mehrere gerichtet sind, nachgewiesen werden.

11. Testkit für die Bestimmung von Anti-Proteasom-Antikörpern, gekennzeichnet durch

• - das 20S-Proteasom oder seine α-Typ Untereinheit C9 oder eine Verbindung dieses Proteasoms, das adsorptiv oder kovalent an eine feste Phase gebunden ist,
• - einen Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, der nicht-ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
• - ein spezifisches Konjugat, bestehend aus einem Antikörper, der gegen humanes Immunglobulin IgG, IgM, IgA oder gegen mehrere dieser Immunglobuline gerichtet ist, und einem Enzym,
• - einen Puffer zum Verdünnen des Konjugats, der nicht- ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
• - einen Puffer zum Waschen (Entfernen) der nichtgebundenen Immunreaktanten, der nicht-ionische oder ionische Detergentien oder Proteine enthält,
• - eine Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion und
• - eine Stopp-Lösung zum Unterbrechen der Enzymreaktion.