DE19624620C2 - Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern aus Körperflüssigkeiten - Google Patents

Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern aus Körperflüssigkeiten

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern aus Körperflüssigkeiten.
Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin, speziell die Diagnostik der primär biliären Zirrhose, und die pharmazeutische Industrie.
Die primär biliäre Zirrhose (PBC) stellt eine chronisch­ entzündliche cholestatische Lebererkrankung dar, die, ausgehend von entzündlichen Veränderungen der kleinen und mittleren Gallengänge, über langsam fortschreitende pathologische Veränderungen des Gewebes zu vollständiger Leberzirrhose führt. Betroffen hiervon sind vorzugsweise Frauen, meist im Alter zwischen 40 und 60 Jahren (Kaplan, M. M. (1987) Adv. Intern. Med. 32: 359-378).
Die PBC ist einerseits als eine organspezifische Erkrankung anzusehen, andererseits durch eine Reihe von Autoantikörpern gegen unbiquitäre zytoplasmische und nukleäre Antigene, die typischerweise bei nicht organspezifischen Autoimmuner­ krankungen auftreten, charakterisiert.
Diagnostisch wichtige Markerantikörper der PBC sind die anti-mitochondrialen Antikörper (AMA), die in bis zu 95% der Seren von PBC-Patienten auftreten, wobei die M2-An­ tikörper als Marker für die PBC gelten.
Diese Antikörper werden auch zur Diagnose von PBC eingesetzt (Berg, P. A., Klein, B. Lindenborn-Fotinos, J. (1986), J. Hepatol. 2: 123-131).
Der Nachteil dieser Methode besteht darin, daß nicht alle PBC-Patienten AMA positiv sind und daß AMAs auch bei anderen Erkrankungen gefunden werden (Berg et al 1986 ibidem, Fregeau, D. R. et al (1988) Arthritis Rheum. 31: 386-392.)
Weitere Möglichkeiten der serologischen Diagnose sind zur Zeit nicht bekannt.
Die Erfindung hat das Ziel, die Diagnostik der PBC zu verbessern, insbesondere in Richtung auf eine Erfassung auch schon im Frühstadium und von AMA-negativen PBCs sowie auf eine höhere differentialdiagnostische Aussagekraft.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen realisiert, sie geht von folgenden Befunden aus.
Bei intensiven Untersuchungen von Patienten mit einer PBC sowie chronischer Polyarthritis treten charakteristische Muster in der Immunfluoreszenz auf ("Spots"). Diese Autoantikörper markieren, unter Aussparung der Nukleoli, punktförmige Strukturen im Zellkern und sind in mitotischen Zellen nicht mit dem Chromosom assoziiert. Das Immun­ fluoreszenzmuster unterscheidet sich deutlich sowohl von dem gesprenkelten Muster der Anti-RNP-Antikörper als auch dem typischen Punktmuster der Anti-Zentromerantikörper und wird auch als "nuclear dot"-Muster bezeichnet.
Das zugrunde liegende Antigen kann aus HeLa-Zellen isoliert und als Protein mit einer elektrophoretischen Mobilität von 95-100 kD charakterisiert werden.
Aufgrund des charakteristischen Immunfluoreszenzbildes ("Spot") sowie des Laufverhaltens während der Elektrophorese wurde das Autoantigen als "Sp-100" bezeichnet.
Szosßecki et al beschreiben die Isolierung von nativem Sp 100-Antigen (Clin. Exp. Immunol., 1987, Bd. 68, S. 108-116) und die Verwendung von rekombinantem Sp 100-Antigen oder seinen immundominanten Sequenzen. Diese können, jeweils an feste Phasen gebunden, zur spezifischen Bindung und zum Nachweis der Anti-Sp 100-Antikörper in einem Immunoassay eingesetzt werden (J. Immunol., 1992, Bd. 36, Nr. 4, S. 555-564: J. Immunol., 1990, Bd. 145, Nr. 12, S. 4338-4347).
Anti-Sp 100-Antikörper sind in 31% der Fälle von Patienten mit einer PBC nachweisbar. Bei anderen autoimmunen Lebererkrankungen sind die Autoantikörper nicht nachweisbar.
Besonders häufig (48%) findet man diese Autoantikörper in der Gruppe der AMA-negativen Patienten mit einer gesicherten PBC.
Zur Realisierung der Erfindung wird natives oder rekombinantes Sp 100-Antigen bevorzugt der Sequenz gemäß Abb. 1 eingesetzt. Das bevorzugte immundominante Bruchstück dieses Antigens ist das 26 kD-Bruchstück ( Aminosäuren 240-474 bzw. Nukleotide 747-1454), eingezeichnet in Abb. 1.
Die Herstellung des 26 kD-Antigens erfolgt durch Expression in E. coli, wobei das entsprechende cDNA Stück durch PCR mit synthetischen Oligonukleotiden von der Gesamtlängen-Sp 100 cDNA amplifiziert und in den pQE9 inseriert wird. Die Reinigung des rekombinanten Proteins erfolgt über Ni-Chelat-Af­ finitätschromatographie.
Die Herstellung des nativen Sp 100-Antigens erfolgt über die Transdektion von eukaryontischen Zellen mit Hilfe eines CMV-Ex­ pressionsvektors.
Eine besonders bevorzugte Variante der Erfindung ist der Einsatz eines Gemischs von Sp 100-Antigen und dem 26 kD-Bruch­ stück im Verhältnis 1 : 9 bis 9 : 1. Der Einsatz des Gemischs hat den überraschenden Effekt, daß eine erheblich vergrößerte Stabilität des 26 kD-Bruchstücks erreicht wird. Dieses immundominante Bruchstück ist im Gesamtantigen aus sterischen Gründen nicht ausreichend zugänglich, für sich allein jedoch nur eine bestimmte Zeit stabil. Im Gemisch ist die Stabilität wesentlich erhöht, was zu einer größeren Empfindlichkeit des Testkits führt. Im Regelfalle wird ein Gemisch von Sp 100-Antigen und dem 26 kD-Bruchstück im Verhältnis 1 : 1 eingesetzt.
Nachfolgend werden einige Einzelheiten der Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern aufgeführt.
Die Bindung des Sp 100-Antigens erfolgt adsorptiv oder kovalent nach vorheriger chemischer Aktivierung der festen Phase. Die feste Phase besteht vorzugsweise aus Polystyren und hat eine unterschiedliche geometrische Form. Die als feste Phase dienenden Träger können in Form einer Mikrotitrationsplatte oder eines Röhrchens vorliegen oder eine kugelförmige oder flächenförmige Gestalt haben.
Die Anti-Sp 100-Antikörper werden spezifisch an das immobilisierte Sp 100-Antigen gebunden und im Immunoassay bestimmt. Üblicherweise erfolgt die Bindung der Anti-Sp 100-An­ tikörper in geeigneten Puffern, die nichtionische oder ionische Detergenzen oder Proteine enthalten. Die gebundenen Anti-Sp 100-Antikörper werden durch spezifische Konjugate, die gegen einzelne Immunglobulinklassen oder gegen mehrere gerichtet sind, nachgewiesen.
Der Anti-Sp 100-Antikörper-Nachweis stellt einen wesent­ lichen Beitrag zur Verbesserung der Diagnostik der PBC dar, da auch ein großer Teil von AMA-negativen PBC-Seren erfaßt wird.
Die hohe Spezifität der Anti-Sp 100-Antikörper als Marker­ antikörper der PBC erlaubt den Aufbau von Enzymimmunoassays, womit erstmals ein Test zum Nachweis dieser bedeutsamen und hochspezifischen Autoantikörper zur Verfügung gestellt wird. Dadurch wird die Diagnostik und Differentialdiagnostik autoimmuner Lebererkrankungen erheblich verbessert.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiel Beispiel 1
Die Herstellung von Sp 100-Antigen erfolgt durch Expression in E. coli unter Nutzung des Vektors pQE9 (Qiagen GmbH, Hilden FRG) in das der Sp 100-cDNA-Insert über die Bam HT-Schnittstelle eingesetzt wird. Die Reinigung des rekombinanten Proteins erfolgt über Ni-Chelat-Af­ finitätschromatographie (Protokoll von Qiagen).
Beispiel 2
Die Herstellung von 26 kD-Antigen erfolgt durch Expression in E. coli. Das entsprechende cDNA-Stück wird durch PCR mit synthetischen Oligonukleotiden von der Gesamtlängen-Sp 100- cDNA amplifiziert und in den pQE9 inseriert. Die Reinigung erfolgt über Ni-Chelat-Affinitätschromatographie.
Beispiel 3
Das entsprechend Beispiel 1 hergestellte Antigen wird in einer Konzentration von 1 µg/ml in einem 0,1 m Carbonat-Bi­ carbonat-Puffer, pH 9,6, an Polystyren-Mikrotiterplatten (Nunc, Dänemark) über Nacht bei Raumtemperatur gebunden. Nach dreimaligem Waschen mit einem PBS-Puffer, pH 7,4, der 0,05% Tween 20 (Serva, BRD) enthält (Waschpuffer), werden die Platten mit einem PBS-Puffer, pH 7,4, der 1% Rinderserumalbumin (RSA) (Blockierungspuffer) (Sigma, BRD) enthält, für 2 h bei Raumtemperatur blockiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen mit o.g. Waschpuffer werden die Platten getrocknet und unter Vakuum eingeschweißt.
Beispiel 4
Das entsprechend Beispiel 2 hergestellte 26 kD-Bruchstück wird analog Beispiel 3 gebundene
Beispiel 5
Das entsprechend Beispiel 1 hergestellte Sp 100-Antigen und das gemäß Beispiel 3 hergestellte 26 kD-Bruchstück werden im Verhältnis 1 : 1 gemischt und in einer Endkonzentration von 1 µg/ml in einem 0,1 m Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, über Nacht bei Raumtemperatur an Mikrotiterplatten aus Polystyren (Labsystems, Finnland) gebunden. Anschließend werden die Platten dreimal mit o.g. Waschpuffer gewaschen und entsprechend Beispiel 3 mit Rinderserumalbumin geblockt, gewaschen, getrocknet und eingeschweißt.
Beispiel 6
Die entsprechend Beispiel 4 und 5 hergestellten Mikrotiterplatten aus Polystyren werden nunmehr mit den zu bestimmenden Seren 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Seren wurden zuvor in einem PBS-Puffer, pH 7,4, der 0,05% Tween 20 und 0,5% RSA enthält, 1 : 100 verdünnt. Nach dreimaligem Waschen mit o.g. Waschpuffer werden die gebundenen Antikörper mit einem Ziege-anti-human-IgG- Peroxidase-Konjugat in PBS-Puffer, pH 7,4, der 0,05% Tween 20 und 0,5% RSA enthält, für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen mit o.g. Waschpuffer wird die Enzymaktivität mit Tetramethylbenzidin und abschließender photometrischer Messung bei 450 nm bestimmt.
Als Standardkurve wurde ein Patientenserum eingesetzt, das in Vorversuchen besonders gut reagierte. Hierbei wurde die höchste Konzentration mit 1000 Einheiten/ml (U/ml) definiert. Diese Standardkurve wird auf jede Mikrotiterplatte aufgetragen. Der cut off-Punkt als Kriterium der Differenzierung zwischen "gesund" und "krank" wurde unter Einsatz von 250 Blutspenderseren ermittelt, wobei er als Mittelwert der Extinktion dieser Blutspender plus drei Standardabweichungen definiert wurde.
Beispiel 7
Die entsprechend Beispiel 3, 4 und 5 mit dem Sp 100-Voll­ antigen bzw. dem 26 kD-Bruchstück beschichteten Mikrotiterplatten bzw. dem Gemisch aus beiden Antigenen werden entsprechend Beispiel 5 im Enzymimmunoassay eingesetzt. Hierzu werden neben der Standardkurve 50 Seren von PBC-Patienten (AMA M2 positiv und AMA M2 negativ) sowie 50 Seren von Blutspendern eingesetzt. Hierbei zeigte sich überraschenderweise, daß das Gemisch aus dem Vollantigen und dem Bruchstück eine höhere Spezifität und Sensitivität als das Vollantigen besitzt und daß das 26 kD-Bruchstück allein für den Nachweis von Anti-Sp 100-Antikörpern nicht geeignet ist.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
Tabelle 1

Claims (11)

1. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern aus Körperflüssigkeiten, gekennzeichnet dadurch, daß ein Gemisch von nativem oder rekombinantem Sp 100-Antigen und seinen immundominanten Sequenzen an feste Phasen adsorptiv oder kovalent gebunden und nachfolgend zur spezifischen Bindung und zum Nachweis der Anti-Sp 100-Antikörper in Immunoassays eingesetzt wird.
2. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als Antigen das 26 kD-Bruchstück des Gesamtantigens (Aminosäuren 240-474 bzw. Nukleotide 747-1454) eingesetzt wird.
3. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß ein Gemisch von Sp 100-Antigen und dem 26 kD-Bruchstück im Verhältnis 1 : 9 bis 9 : 1 eingesetzt wird.
4. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach Anspruch 2 oder 3, gekennzeichnet dadurch, daß ein Gemisch von Sp 100-Antigen und dem 26 kD-Bruchstück im Verhältnis 1 : 1 eingesetzt wird.
5. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach einem der Ansprüche 1-4, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung des Sp 100-Antigens adsorptiv oder kovalent nach vorheriger­ chemischer Aktivierung der festen Phase erfolgt.
6. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach einem der Ansprüche 1-5, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase aus Polystyren besteht.
7. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach einem der Ansprüche 1-6, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase eine unterschiedliche geometrische Form hat.
8. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach einem der Ansprüche 1-7, gekennzeichnet dadurch, daß die als feste Phase dienenden Träger in Form einer Mikrotitrationsplatte oder eines Röhrchens vorliegen oder eine kugelförmige oder flächenförmige Gestalt haben.
9. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach einem der Ansprüche 1-8, gekennzeichnet dadurch, daß die Anti-Sp 100-An­ tikörper spezifisch an das immobilisierte Sp 100-Antigen gebunden und im Immunoassay bestimmt werden.
10. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach einem der Ansprüche 1-9, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung der Anti-Sp 100-Antikörper in geeigneten Puffern, die nichtionische oder ionische Detergenzen oder Proteine enthalten, erfolgt.
11. Verfahren zur Bestimmung von Anti-Sp 100-Antikörpern nach einem der Ansprüche 1-10, gekennzeichnet dadurch, daß die gebundenen Anti-Sp 100-Antikörper durch spezifische Konjugate, die gegen einzelne Immunglobulinklassen oder gegen mehrere gerichtet sind, nachgewiesen werden.
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