DE60030701T2

DE60030701T2 - VERFAHREN ZUM BEWERTEN VON AUTOIMMUNKRANKHEITEN, VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON GEGEN Reg GERICHTETEN AUTOANTIKÖRPERN

Info

Publication number: DE60030701T2
Application number: DE60030701T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Sendai-shi Okamoto
Original assignee: Okamoto Hiroshi Sendai
Current assignee: Okamoto Hiroshi Sendai
Priority date: 1999-04-07
Filing date: 2000-04-06
Publication date: 2007-09-13
Anticipated expiration: 2020-04-07
Also published as: AU3672200A; ES2270817T3; CA2369883A1; DE60030701D1; EP1167974A4; US6919210B1; WO2000062066A1; EP1167974B1; AU769194B2; EP1167974A1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bewertung von Autoimmunkrankheiten und Diabetes mellitus (einschließlich insulinabhängigem Diabetes mellitus, nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus, etc.).
Stand der Technik
Autoimmunkrankheiten sind durch ein abnormales Immunsystem verursachte Krankheiten, wobei das Immunsystem, als Antwort auf Eigenzellen oder Eigengewebe, nicht normal arbeitet und eine humorale oder zelluläre Antwort erzeugt, sondern einen Antikörper als Antwort auf Eigenzellen und Eigengewebe erzeugt.
Es ist bekannt, dass ein Autoantikörper Eigenzellen oder Eigengewebe angreift, um ihre Funktion zu stören, was Autoimmunkrankheiten verursacht. Weiterhin wurde unlängst berichtet, dass der Autoantikörper im Serum des Patienten vor dem Auftreten einer Autoimmunkrankheit nachweisbar ist.
Das heißt, dass der Nachweis eines Antikörpers eine frühe Entdeckung oder Vorhersage des Auftretens einer Autoimmunkrankheit oder Vorhersage einer Verschlimmerung des Zustandes der Krankheit erlaubt, was eine frühe Behandlung oder präventive Therapie der Autoimmunkrankheit ermöglicht.
Auf Grundlage dieser Erkenntnisse sind eine Vielzahl von Autoantikörpern gegen Autoantigene entdeckt worden und die Autoantikörper gegen Autoantigene wurden in klinischen Untersuchungen gemessen.
Zum Beispiel wurden im Falle eines autoimmunen Diabetes mellitus als relevante Antikörper ein Inselzellen-Antikörper (im Folgenden als ICA abgekürzt), ein Inselzellen-Oberfächenantikörper (im Folgenden als ICSA abgekürzt), Antiinsulin-Antikörper, Antiglutaminsäuredecarboxilase-Antikörper, Antigangliosid-Antikörper, Antibovinlactoalbumin-Antikörper, Antipankreascytokeratin-Antikörper und ähnliche genannt. Beim oben genannten autoimmunen Diabetes mellitus können ICA und ICSA im Serum von Patienten häufig zum Zeitpunkt der Entwicklung von insulinabhängigem Diabetes mellitus (im Folgenden als IDDM abgekürzt) nachgewiesen werden. Insbesondere ICA kann im Serum der Patienten vor der Entwicklung von IDDM nachgewiesen werden, so dass er entsprechend als ein Marker für eine sich anbahnende Entwicklung von IDDM bekannt ist.
Wie oben erwähnt, sind viele IDDM-Patienten von autoimmunem Diabetes mellitus betroffen, der im Autoimmunsystem entwickelt wurde, obwohl berichtet wird, dass bei manchen Patienten kein Antikörper nachgewiesen werden kann.
Im Gegensatz zu nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus (im Folgenden als NIDDM bezeichnet) liegt z.B. der Prozentsatz der Existenz von ICA bei IDMM-Patienten bei 40% oder darüber, während derjenige bei NIDD-Patienten deutlich unter 3% liegt (Kobayashi T. et al., Diabetes, Vol. 35, 335–340 (1986)). So ist die positive Rate des Vorliegens eines Antikörpers bei IDDM zwar hoch, bei NIDDM aber niedrig und es wurde noch nicht über einen Autoantikörper berichtet, der als Marker zur Diagnose für NIDDM wirksam ist.
Andererseits ist ein Reg (Regenerierungsprotein) ein Protein, das aus dem Gen entdeckt wurde, dessen Expression während der Regenerierung der Langerhansschen Inselzellen durch Verabreichen von Nicotinamid auf ungefähr 90% entnommener Bauchspeicheldrüsen bei Ratten auftritt (Terazono et al., Journal of Biological Chemistry, 263, 2111–2114 (1988)).
Reg-Proteine werden bei Menschen, Ratten, Rindern und Hamstern gefunden und in drei Untergruppen untergliedert, nämlich Reg I, Reg II und Reg III, und zwar aufgrund der Homologie ihrer Primärstruktur und dem Vorliegen der Insertionssequenz von 7 oder 5 Aminosäureresten.
Reg-Proteine können nicht nur in den oben genannten Langerhansschen Inselzellen gefunden werden, sondern auch in Leber, Darm, Krebszellen in der Bauchspeicheldrüse und der Dünndarmschleimhaut, und es wird berichtet, dass sie während der Regenerierung von Nerven oder der Magenschleimhaut zum Zeitpunkt der Entwicklung von Pankreatitis auftreten. Entsprechend werden Reg-Proteine als intensiv an der Regenerierung und Proliferation von inneren Organen beteiligt, betrachtet.
Jedoch wurde bisher nichts über die Existenz von Autoantikörpern gegen Reg-Proteine und dadurch verursachte Autoimmunkrankheiten berichtet.
Beschreibung der Erfindung
Einer der Gegenstände der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bewertung einer Autoimmunkrankheit zur Verfügung zu stellen. Insbesondere soll ein Verfahren zur Verfügung gestellt werden, Diabetes mellitus einzuschätzen, genauer ein Verfahren zur Bewertung von insulinabhängigem Diabetes mellitus und nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus.
Ein anderer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers zur Verfügung zu stellen, das zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten verwendet werden kann.
Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist es, ein Reagens zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten zur Verfügung zu stellen. Insbesondere soll ein Reagens zur Diagnose von Diabetes mellitus, genauer ein Reagens zur Diagnose von insulinabhängigem Diabetes mellitus und nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus zur Verfügung gestellt werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die folgenden Punkte (1)–(24).

(1) Verfahren zur Bewertung einer Autoimmunkrankheit, das den Schritt des Nachweisens der Existenz eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers in einer Probe umfasst.
(2) Verfahren zur Bewertung von Diabetes mellitus, das den Schritt des Nachweisens der Existenz eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers in einer Probe umfasst.
(3) Verfahren zur Bewertung von insulinabhängigem Diabetes mellitus, das den Schritt des Nachweisens der Existenz eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers in einer Probe umfasst.
(4) Verfahren zur Bewertung von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus, das den Schritt des Nachweisens der Existenz eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers in einer Probe umfasst.
(5) Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers, das den Schritt des In-Kontaktbringens einer Probe mit einer Antigenkomponente umfasst, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, und das Nachweisen der Bildung eines Immunkomplexes, der durch die Reaktion des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers mit der Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, entsteht.
(6) Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers gemäß (5), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein Reg-Protein ist.
(7) Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers gemäß (5), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein Teil eines Reg-Proteins ist.
(8) Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers gemäß (6) oder (7), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein künstlich hergestelltes Reg-Protein ist.
(9) Reagens zur Diagnose einer Autoimmunkrankheit, das eine Antigenkomponente umfasst, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden.
(10) Reagens zur Diagnose einer Autoimmunkrankheit gemäß (9), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein Reg-Protein ist.
(11) Reagens zur Diagnose einer Autoimmunkrankheit gemäß (9), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, Teil eines Reg-Proteins ist.
(12) Reagens zur Diagnose einer Autoimmunkrankheit gemäß (10) oder (11), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein künstlich synthetisiertes Reg-Protein ist.
(13) Reagens zur Diagnose von Diabetes mellitus, das eine Antigenkomponente umfasst, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden.
(14) Reagens zur Diagnose von Diabetes mellitus gemäß (13), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein Reg-Protein ist.
(15) Reagens zur Diagnose von Diabetes mellitus gemäß (13), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, Teil eines Reg-Proteins ist.
(16) Reagens zur Diagnose von Diabetes mellitus gemäß (14) oder (15), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein künstlich synthetisiertes Reg-Protein ist.
(17) Reagens zur Diagnose von insulinabhängigem Diabetes mellitus, das eine Antigenkomponente umfasst, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden.
(18) Reagens zur Diagnose von insulinabhängigem Diabetes mellitus gemäß (17), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein Reg-Protein ist.
(19) Reagens zur Diagnose von insulinabhängigem Diabetes mellitus gemäß (17), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, Teil eines Reg-Proteins ist.
(20) Reagens zur Diagnose von insulinabhängigem Diabetes mellitus gemäß (18) oder (19), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein künstlich synthetisiertes Reg-Protein ist.
(21) Reagens zur Diagnose von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus, das eine Antigenkomponente umfasst, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden.
(22) Reagens zur Diagnose von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus gemäß (21), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein Reg-Protein ist.
(23) Reagens zur Diagnose von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus gemäß (21), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, Teil eines Reg-Proteins ist.
(24) Reagens zur Diagnose von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus gemäß (22) oder (23), bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein künstlich synthetisiertes Reg-Protein ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bewertung von Autoimmunkrankheiten zielt darauf ab, Autoimmunkrankheiten zu diagnostizieren oder vorherzusagen, die durch einen Anti-Reg-Protein-Antikörper verursacht werden, indem die Existenz des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers in einer Probe nachgewiesen wird.
Die Autoimmunkrankheiten, die mittels des Nachweises des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers nachgewiesen werden können, sind nicht besonders beschränkt, solange sie durch das Existieren des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers verursacht werden, und schließen z.B. Diabetes mellitus, insulinabhängigen Diabetes mellitus, nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus, Leberkrebs, Dickdarmkrebs, Dünndarmkrebs, Pancreatitis, Magengeschwür und Alzheimerkrankheit ein. Unter diesen ist Diabetes mellitus im Hinblick auf eine stark positive Rate bevorzugt und weiter bevorzugt sind insulinabhängiger Diabestes mellitus und nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus.
In der vorliegenden Erfindung sind die nachzuweisenden Anti-Reg-Protein-Autoantikörper nicht besonders eingeschränkt, solange sie mit Reg-Proteinen reagieren, und schließen z.B. die Klassen der IgE-Antikörper, IgM-Antikörper, IgA-Antikörper, IgD-Antikörper und IgE-Antikörper, die mit Reg-Proteinen reagieren, ein. Unter den oben genannten Klassen von Antikörpern, die mit Reg-Proteinen reagieren, ist es bevorzugt, einen IgG-Antikörper oder einen IgM-Antikörper nachzuweisen, weil sie bei Patienten, die an Autoimmunkrankheiten leiden, in ausreichender Menge vorliegen.
In der vorliegenden Erfindung kann als zum Nachweis verwendeter Anti-Reg-Protein-Antikörper jede der oben genannten Klassen von Antikörpern alleine nachgewiesen werden oder in einer Kombination von zwei und mehr.
Die in der vorliegenden Erfindung zu verwendenden Proben sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie möglicherweise den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper enthalten, und schließen z.B. Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum, Plasma, Urin und Rückenmarksflüssigkeit ein, und Gewebe wie Langerhanssche Inselzellen, Bauchspeicheldrüsen, exokrine Bauchspeicheldrüsen, Nervenzellen und verschiedene Krebszellen ein. Unter ihnen sind Blut, Serum, Plasma und Urin bevorzugt, weil die Proben leicht zu erhalten sind.
Die beim erfindungsgemäßem Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers verwendeten Antigenkomponenten sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper binden können, und schließen bevorzugt im Hinblick auf ihre Spezifität Reg-Proteine ein. Spezieller bevorzugt ist ein Teil eines Reg-Proteins.
Darüber hinaus sind Reg-Proteine, die mittels genetischer Rekombination oder chemischer Synthese künstlich hergestellt werden, bevorzugt, weil sie in einer stabilen Form in guter Qualität erhalten werden können.
Für die Reg-Proteine gibt es keine Einschränkung, solange ein genetisches Produkt eines Reg-Proteins von einem Gen, das ein Gen der Reg-Familie ist, verwendet wird (Umino et al., Nippon Rinsho, Vol. 55, S. 817–821; Yonekura H., et al., in: Flatt P. R. et al. (Herausgeber) Frontiers of Insulin Secretion and Pancreatic B-Cell Research, Smith-Golden, London, S. 581–588; Miyashita H. et al., FEBS Letter, Band 377, S. 429–433 (1995)). Zum Beispiel sind das humane Reg-Protein Iα, Reg Iβ, HIP (ein Gen, das in hepatzellulärem Karzinom, Dünndarm, Bauschspeicheldrüse exprimiert wird), PAP (das Gen für das mit Pankreatitis verbundene Protein), RS (Reg-verwandte Sequenz), Reg I von Ratten, PAP I, II, II, Ratten-Reg I, II, IIIα, IIIβ, IIIγ, IIIδ, Hamster INGAP (mit der Neogenese der Inselzellen assoziiertes Protein), Rinder-PTP Bauchspeichel-Fadenprotein und ähnliche eingeschlossen.
Was menschliche Reg-Proteine betrifft, beschreiben Terazona et al. (Journal of Biological Chemistry, Band 263, 2111–2114 (1988)), Moriizumi S. et al. Biochimica et Biophysica Acta, Band 1217, 199–202 (1994), Lasserre C. et al. (Cancer Research, Band 52, 5089–5095 (1992) und Lasserre C. et al. (European Journal of Biochemistry, Band 224, 29–38 (1994) ihre Sequenzen und ähnliches im Detail.
Die oben genannten Reg-Proteine können entsprechend der Art der nachzuweisenden Autoimmunkrankheiten geeignet ausgewählt werden. Im Hinblick auf die Spezifität des Nachweises des Anti-Regproteinantikörpers, sind im verletzen Organ vorkommende Reg-Proteine bevorzugt. Zum Beispiel ist dann, wenn die nachzuweisende Krankheit Diabetes mellitus, insulinabhängiger Diabetes mellitus oder nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus ist, menschliches Reg Iα-Protein bevorzugt.
Was die im erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers betrifft, ist es möglich, im Hinblick auf ihre Empfindlichkeit und Spezifität beim Nachweis des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers ebenso wie auf die Stabilität der Antigenaktivität während der Langzeitlagerung als Diagnosereagens Reg-Proteine zu verwenden, die mittels wohlbekannter enzymatischer Verfahren oder genetischer Rekobinationstechniken fragmentiert wurden, oder Reg-Proteine, die mittels wohlbekannter enzymatischer Verfahren oder genetischer Rekobinationstechniken teilweise modifiziert wurden.
Bei der vorliegenden Erfindung kann als zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers als Anti-Reg-Protein verwendetes jedes der oben genannten Reg-Proteine alleine oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet werden.
Als Verfahren zur Herstellung der oben genannten erfindungsgemäßen Reg-Proteine kann ein künstliches Verfahren wie genetische Rekombination oder künstliche Synthese, oder das Aufreinigen aus Organen, Körperflüssigkeiten oder Sekreten angepasst werden, obwohl es nicht besonders eingeschränkt ist.
Beim Verfahren zur Herstellung von Reg-Proteinen mittels genetischer Rekombination z.B. wird eine das oben genannte Reg-Protein kodierende DNS in einen Vektor eingefügt, um einen rekombinanten Vektor herzustellen. Dieser wird dann in einen Wirt eingeschleust, um einen Transformanten zu erzeugen, der dann inkubiert wird, um den Transformanten selbst oder den Überstand der Kultur zu verwenden.
Eine ein Reg-Protein kodierende DNS, die in einen Vektor eingefügt wird, um einen rekombinanten Vektor herzustellen, kann eine DNS sein, die die gesamte Länge des oben genannten Reg-Proteins oder einen Teil davon kodiert.
Der rekombinante Vektor kann hergestellt werden, indem auf konventionelle Weise eine das oben genannte Reg-Protein kodierende DNS in einen Plasmidvektor oder einen Phagenvektor eingeführt wird, der in einer Wirtszelle repliziert werden kann. Bei dieser Operation kann, falls nötig, ein Linker verwendet werden. Als Plasmidvektoren können solche, die ein Dogen resistentes Gen wie das Kanamycin resistente Gen, das Ampicillin resistente Gen, etc. enthalten, bevorzugt verwendet werden, weil diese Vektoren einfaches Screening eines Transformanten erlauben, der den herzustellenden rekombinanten Vektor enthält und den rekombinanten Vektor in einer Wirtszelle stabil halten.
Spezifische Beispiele für Plasmidvektoren schließen die Plasmide pPIC3.5K, pPIC9K, pAO815, pYX011, pYX111, pUC118, pUB110 und ähnliche ein. pPIC3.5K, pPIC9K und pAO815 können von Funakoshi Co, Ltd. erworben werden, pYX011 und pYX111 von Cosmo Bio Co., Ltd., pUC118 und pUB110 von Takara Shuzo Co., Ltd., respektive.
Spezifische Beispiele für Phagenvektoren schließen λgt11-Phagen, λgt10-Phagen und ähnliche ein. Die λgt11-Phagen und die λ-gt10-Phagen können von Funakoshi Co. Ltd. erworben werden. In jedem Fall kann ein rekombinanter Vektor entsprechend des zu verwendenden Eltern-Vektors verwendet werden.
Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung rekombinanter Plasmide ist von J. Samblock et al. In Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) beschrieben worden (im Folgenden wird diese Literaturstelle als „Molecular Cloning" bezeichnet).
Der Transformant kann hergestellt werden, indem das oben genannte Plasmid in einen Wirt eingeführt wird.
Der Wirt, der nicht besonders eingeschränkt ist, solange die Reg-Protein-DNS im rekombinanten Plasmid exprimiert wird, schließt z.B. Hefe wie Saccharomyces cervisiae, Pichia pastoris, etc., Echerichia-Bakterien wie Echerichia coli, etc., Bacillusbakterien wie Bacillus subtilis etc. ein.
Durch das Einführen eines rekombinanten Plasmids in einen Wirt, wird z.B. eine Wirtszelle in einen Spheroplasten oder Protoplasten konvertiert, in den ein rekombinantes Plasmid mittels Elektroporation, Transformation mit Calciumchlorid oder mit dem Tris-PEG-Verfahren eingeführt wird. Diese Operationen können je nach Art des Wirts entsprechend ausgewählt werden.
Ein allgemeines Verfahren zur Herstellung eines Transformanten unter Verwendung eines rekombinanten Plasmids ist im Detail in der Literatur, „Molecular Cloning" usw. beschrieben. Zur Herstellung eines Transformanten unter Verwendung eines rekombinanten Plasmids sind unterschiedliche Sets kommerziell erhältlich. Z.B. ist ein Set, das Hefe, nämlich Pichia pastoris verwendet, kommerziell von Funakoshi Co., Ltd. (Katalognummer IV-1750-01; Hersteller Invitrogen Corp.) erhältlich, und ein Transformant kann entsprechend der dem Set beiliegenden Anleitung hergestellt werden.
Ein spezifisches Beispiel, das zur Herstellung von Reg-Proteinen unter Verwendung von Transformanten verwendet wird, schließt eine rekombinante Hefe, einen Pichia pastoris GS115-Stamm (humanes REGIα-13) ein, die einen Vektor enthält, in den humane REGIα-13-DNS eingefügt worden ist. Der GS115-Stamm wurde in der Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human Technology (Postleitzahl 305-8566; Higashi 1-chome, Tukuba city, Ibaragi, Japan) hinterlegt und hat die Zugriffsnummer FERM P-17358, 5. April 1999, und unter dem Budapest-Abkommen als FERM BP-7111 am 30. März 2000 überführt.
Das Inkubieren eines Transformanten wird durchgeführt, indem ein Transformant in ein Kultivierungsmedium gegeben wird, auf dem der Transformant wachsen kann, und dann bei einer geeigneten Temperatur geschüttelt oder stehengelassen wird.
Als Kultivierungsmedium können diejenigen, die Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthalten, verwendet werden. Die Kohlenstoffquelle schließt z.B. Zucker, Alkohol, organische Säuren und ähnliches ein; Zucker sind beispielsweise Glucose, Stärke, Dextrose, Molasse, etc., Alkohole beispielsweise Methanol, Ethanol, Glycerin etc. und organische Säuren wie Citronensäure, Malonsäure, etc.. Die Stickstoffquelle schließt z.B. organische Stickstoffquellen und anorganische Stickstoffquellen etc. ein. Organische Stickstoffquellen sind beispielsweise Peptone, Casein, Polypepton, Bakto-Trypton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Casamin-Säure, Glycin etc., anorgansiche Stickstoffquellen sind Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, etc..
Wenn der Transformant auxotrop ist, werden für das Wachstum nötige Nährstoffe zum Medium gegeben. Dolche Nährstoffe schließen z.B. Aminosäuren, Vitamine, Nukleinsäuren, Salze und ähnliches ein.
Als Medium kann z.B. ein synthetisches Medium, das im Wesentlichen aus Alkoholen und organischen Stickstoffquellen zusammengesetzt ist, verwendet werden.
Wenn als Medium ein festes Medium verwendet wird, wird zusätzlich Agar zugegeben.
Um das rekombinante Plasmid stabil zu halten und das Wachstum von Stämmen ohne rekombinantes Plasmid zu inhibieren, können ein oder mehrere Antibiotika zum Medium zugegeben werden. Solche Antibiotika schließen z.B. Penicillin, Erythromycin, Kanamycin, Neomycin, Chloramphenicol, Bacitracin, D-Cycloserin, Ampillicin und ähnliche ein.
Weiterhin kann, falls nötig, als Entschäumer Sojaöl, Schmalz, verschiedene oberflächenaktive Stoffe etc. zugegeben werden.
Der pH-Wert des Mediums wird gewöhnlich in einem Bereich von 4 bis 9 gehalten, bei dem der Transformant wachsen kann. Wenn als Wirt die Hefe Pichia pastoris verwendet wird, wird das Medium vorzugsweise auf einem pH-Wert von 5,0–7,0 gehalten.
Die Inkubationstemperatur wird gewöhnlich beispielsweise auf 15–42°C gehalten, vorzugsweise auf 24–37°C.
Die Inkubationszeit ist unterschiedlich, in Abhängigkeit von der Art des Wirtes, dem physikalischen Zustand des Mediums (fest oder flüssig), der Inkubationsvorrichtung, Inkubationstemperatur etc. Z.B. ist die Inkubationszeit, wenn die Hefe Pichia pastoris bei einer Inkubationstemperatur von 15–42°C als Wirt verwendet wird, gewöhnlich 12–96 Stunden, vorzugsweise 60–84 Stunden.
Wie oben beschrieben, wird ein Transformant, in den ein ein Reg-Protein kodierendes Gen eingeführt worden ist, inkubiert, um das Reg-Protein in einer Kultur anzureichern, die nach der Inkubation die Kultivierungsbrühe und den Transformanten umfasst; die Kultur wird gewonnen und aus ihr kann das Ziel-Reg-Protein aufgereinigt werden.
Wenn das in einem Wirt erzeugte Reg-Protein z.B. ein Fusionsprotein ist, das aus einer Signalsequenz und einer Aminosäuresequenz des Reg-Proteins zusammengesetzt ist, wird die Signalsequenz mittels Signalpeptidase vom Fusionsprotein entfernt und das Reg-Protein wird vom Transformanten ausgeschieden. So wird der Überstand als Kultur nach der Inkubierung des Transformanten gewonnen, aus dem das Reg-Protein vorzugsweise auf konventionelle Weise aufgereinigt wird.
Alternativ wird der inkubiert Transformant als Kultur gewonnen, die zerquetscht oder gelöst wird, so dass man eine Flüssigkeit oder Lösung erhält, aus der das Reg-Protein aufgereinigt wird.
Zusätzlich kann die Aufreinigung aus der Kulturbrühe und aus dem Inkubieren Transformanten als Kultur kombiniert werden, um die Ausbeute am Ziel-Reg-Protein zu verbessern.
Zerquetschen des Transformanten kann z.B. mittels eines Verfahrens zum physikalischen Zerquetschen des Transformanten durchgeführt werden. Ein Transformant wird z.B. in einem Puffer suspendiert, der mit Ultraschallwellen beschallt wird, oder der mit Quarzsand vermischte Transformant wird in einem Puffer suspendiert. Andererseits kann Lösen des Transformanten z.B. mittels eines Verfahrens zur Auflösung der Zellwand des Transformanten mit einem Enzym und einem oberflächenaktiven Stoff erreicht werden. Wenn der Wirt des Transformanten Escherichia coli ist, können als Enzym Lysozym und als oberflächenaktiver Stoff Natriumdodecylsulfat (im Folgenden als SDS abgekürzt) verwendet werden.
Zum Aufreinigen des Ziel-Reg-Proteins aus der resultierenden Flüssigkeit nach dem Zerquetschen oder aus der Lösung werden die Flüssigkeit nach dem Zerquetschen oder die Lösung z.B. zentrifugiert, um Zellrückstände zu entfernen und einen Überstand zu erhalten, der resultierende Überstand wird behandelt, indem Ammoniumsulfit in einer Konzentration zugegeben wird, bei der kein Ausfällen von Reg-Protein erfolgt. Das Gemisch wird gerührt, zentrifugiert, um den Niederschlag zu entfernen und einen Überstand zu erhalten, zu dem weiter Ammoniumsulfat in einer Konzentration gegeben wird, bei der das Ausfällen des Reg-Proteins erfolgt. Der nach dem Rühren erhaltene Niederschlag kann mittels Zentrifugieren gewonnen werden. Es ist vorteilhaft, das Vorliegen von Reg-Proteinen im Überstand und der ausgefällten Fraktion mittels Probennahme beim abschließenden Zentrifugieren zu bestätigen, weil manchmal der Überstand das Ziel-Reg-Protein enthält. Zur Reinigung des Ziel-Reg-Proteins aus dem Überstand der Kultur nach der Inkubierung des Transformanten wird z.B. die Kulturbrühe zentrifugiert, um die Zellen als Niederschlag zu entfernen, und der Überstand wird durch Zugabe von Essigsäure auf pH 3,5 eingestellt und auf eine Ionenaustauschsäule aufgegeben, um das Reg-Protein zu absorbieren. Nach dem Waschen der Säule mit einem Natriumacetatpuffer wird das adsorbierte Reg-Protein mit einem 1 M NaCl enthaltenden Natriumacetatpuffer eluiert, um das Reg-Protein zu erhalten.
Alternative, vom oben genannten verschiedene Verfahren zur Aufreinigung des Ziel-Reg-Proteins aus der Flüssigkeit nach dem Zerquetschen, aus Lösung oder Überstand nach dem Inkubieren des Transformanten schließen fraktioniertes Aussalzen, Ausfällen mit Ethanol, Gelfiltration, Affinitätschromatographie, Hydrophobchromatographie und ähnliches ein. Diese Aufreinigungsverfahren können alleine oder in Kombination von zwei und mehr verwendet werden. Diese oben genannten Verfahren zur Aufreinigung von Proteinen sind im Detail in den Literaturstellen „Molecular Cloning" und „Basic Experimental Method for Protein and Enzymes" (2. überarbeitete Ausgabe, Hrsg. Buichi Kajio, Nankodo Co., Ltd. (1994)) beschrieben.
In spezifischen Beispielen zur Herstellung von Reg-Proteinen unter Verwendung genetischer Rekombination können die Reg-Proteine auch entsprechend der Verfahren hergestellt werden, die in der japanischen Patentanmeldung mit der Offenlegungsnummer Hei 1-137994/1989 und der japanischen Patentanmeldung mit der Offenlegungsnummer Hei 6-29963/1994 beschrieben sind.
Bei der Herstellung von Reg-Proteinen mittels chemischer Synthese kann eine Abfolge von 10 bis 30 Aminosäuren einer Sequenz als Teil der Aminosäuresequenz des Reg-Proteins entsprechend eines bekannten Verfahrens zur Peptidsynthese synthetisiert werden. Die Peptidsynthese kann unter Verwendung eines Festphasenverfahrens, bei dem sich eine Peptidkette vom C-Ende auf einem Polymerträger erstreckt, erzielt werden, oder mittels eines Flüssigphasenverfahrens ohne Verwendung eines Trägers.
Beim oben genannten Festphasenverfahren kann die Peptidsynthese durch Verwendung einer kommerziell erhältlichen Peptidsynthetisierers erreicht werden. Darüber hinaus können zwei oder mehrere Peptidketten, die wie oben beschrieben synthetisiert wurden, miteinander verknüpft werden, so dass sie ein Protein bilden.
Bei der Herstellung des aufgereinigten Reg-Proteins aus Organen, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen, schließen die als Ausgangsstoffe verwendeten Organe, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen, die nicht besonders eingeschränkt sind, solange sie Reg-Proteine enthalten, Bauchspeicheldrüse, Langerhanssche Inselzellen, exocrine Bauchspeicheldrüsen, Nervenzellen und verschiedene Krebszellen einschließlich Heptoma, Darmkrebs, Dünndarmkrebs etc. ein.
Als Verfahren, um eine Lösung nach dem Zerquetschen oder Auflösen von Organen zu erhalten, kann das oben genannte zum Zerquetschen oder Auflösen des Transformanten beschriebene Verfahren verwendet werden.
Als Verfahren zum Aufreinigen der Reg-Proteine aus Organen, Körperflüssigkeiten oder Ausscheidungen, kann das selbe Verfahren, wie das oben für die Aufreinigung des Reg-Proteins aus Transformanten verwendet werden.
Spezifischere Beispiele für das Verfahren zum Aufreinigen von Reg-Proteinen schließen Verfahren ein, die in Guy-Crotte et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, Band 125, 516–523 (1984); De Caro A. M. et al. European Journal of Biochemistry, Band 168, 201–207 (1987) und De Caro A. M. et al., Biochimica et Biophysica Acta, Band 994, 281–284 (1989) beschrieben sind.
In der vorliegenden Erfindung ist das Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers nicht besonders eingeschränkt, solange das Verfahren die Schritte des in-Kontakt-Bringens einer Probe mit einer Antigenkomponente umfasst, die spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper binden kann, und des Nachweisens der Bildung eines Immunkomplexes, der aus der Reaktion des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers mit der Antigenkomponente, die spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper binden kann, resultiert, und schließt die Western Blotting-Technik, Immunoassays unter Verwendung verschiedener Markierungen, den Latex-Agglutinierungstest unter Verwendung von Latex-Trägerpartikeln und ähnliche ein.
Der Immunuassay unter Verwendung verschiedener Markierungen schließt z.B. Radioimmunoassay (RIA), Fluoreszenzimmunoassay (FIA), Lumineszenzimmunoassay, enzymverknüpftes Immunoadsorbensassay (ELISA), Immunochromatographie und ähnliches ein.
Das Verfahren zum Nachweisen eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers mittels der Western Blotting-Technik kann z.B. ausgeführt werden, indem die oben genannten Reg-Proteine mittels Elektrophorese getrennt werden, auf eine pörse Membran transkribiert werden, die poröse Membran (im Folgenden als Transkriptionsmembran bezeichnet) geblockt wird, um nicht-spezifische Reaktionen mit einer Probe zu inhibieren, die Transkriptionsmembran eine gewisse Zeit lang mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, wobei durch diesen Vorgang ein Anti-Reg-Protein-Autoantikörper in der Probe, falls einer vorliegt, an ein Antigen gebunden wird, das auf der oben genannten Transkriptionsmembran immobilisiert ist, wobei sich ein Immunkomplex bildet; falls nötig wird gewaschen und dann wird er mit einem markierten zweiten Antikörper in Kontakt gebracht, welcher an den Anti-Reg-Protein-Antikörper binden kann (in manchen Fällen kann man die Probe gleichzeitig mit dem markierten zweiten Antikörper in Kontakt bringen).
Wenn der oben genannte Immunkomplex gebildet wird, wird ein markierter zweiter Antikörper daran gebunden, wodurch der zweite markierte Antikörper auch auf der Transkriptionsmembran fixiert wird. Anschließend wird die Menge des an die Transkriptionsmembran gebundenen zweiten Antikörpers entsprechend eines Messverfahrens bestimmt, das von der verwendeten Markierung abhängt, und das Vorliegen oder die Menge des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers kann bestätigt werden bzw. aus den gemessenen Werten erhalten werden.
Das Vorliegen oder die Menge des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers kann z.B. bestimmt werden, indem gleichzeitig eine Probe, die keinen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper enthält, und eine Probe, die eine vorher fixierte Menge Anti-Reg-Protein-Autoantikörper enthält, gleichzeitig mit der Messung einer zu testenden Probe gemessen werden und die Werte der respektiven Proben verglichen werden. So kann der Titer des Anti-Reg-Protein-Autoimmunantikörpers als Wert ausgedrückt werden, der auf Standard-Werte bezogen wurde.
Bei der vorliegenden Erfindung bedeutet „Messung" nicht nur quantitativer oder halbquantitativer Nachweis, sondern auch qualitativer Nachweis.
Elektrophorese von Anti-Regproteinen kann z.B. mittels verschiedener bekannter Elektrophoreseverfahren wie SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese, Elektrophorese mit nativem Polyacrylamidgel, isoelektrische Gel-Fokusierung etc. erreicht werden. Unter diesen ist SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese bevorzugt, weil die Proteine basierend auf ihrem Molekülgewicht aufgetrennt werden können und die Transkription effizient ist.
Verfahren anschließend an die Transkription des Proteinmoleküls, das mittels Elektrophorese auf einer porösen Membran aufgetrennt wurde, schließen z.B. wohlbekannte Verfahren unter Verwendung von Kapillarphänomenen (Kapillarverfahren), Verfahren unter Verwendung der natürlichen Diffusionsfähigkeit (Diffusionsverfahren) und Verfahren unter Verwendung von Elektrophorese (Elektrophorese) und ähnliche ein. Unter diesen ist Elektrophorese im Hinblick auf den Zeitaufwand zur Durchführung als auch auf den quantitativen Aspekt und die Reproduzierbarkeit des Nachweises bevorzugt.
Was die poröse Membran betrifft, kann eine bei der Western Blotting Technik verwendete wohlbekannte Membran wie eine Nitrocellulosemembran, eine Polyvinylidendifluoridmembran (PVDF), etc. verwendet werden. Vorzugsweise wird eine PVDF-Membran im Hinblick auf ihre hohe Bindungskapazität an Proteine bei der Transkription verwendet.
Als Blockierungs-Agens für Transkriptionsmembranen kann z.B. eine bei der Western Blotting Technik verwendete, wohlbekannte Lösung verwendet werden wie eine Lösung von Casein haltigem Material einschließlich fettfreier Mich, eine Lösung von Gelatinematerial, eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA), etc.
Man kann die Probe direkt mit der Transkriptionsmembran reagieren lassen, und wenn der Antikörper-Titer hoch ist, kann sie verdünnt werden. Wenn eine verdünnte Probe verwendet wird, kann eine bei der Western Blotting Technik verwendete wohlbekannte Lösung wie phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung (im Folgenden mit PBS abgekürzt), Phosphatpuffer etc. verwendet werden, aber es ist bevorzugt, im Hinblick auf das Verringern nicht-spezifischer Adsorption die selbe Lösung zu verwenden, wie beim Blocken.
Als Waschlösung zum Waschen nach der Reaktion mit einer Probe kann eine bei der Western Blotting Technik verwendete, wohlbekannte Lösung verwendet werden wie z.B. PBS, Phosphatpuffer, etc. Zusätzlich kann eine Pufferlösung verwendet werden, die einen nicht-ionischen oberflächenaktiven Stoff wie Tween 20 in einer Konzentration von 0,05–5 Gew.-% enthält.
Als markierter zweiter Antikörper, der zum Nachweis der Bildung eines Immunkomplexes verwendet wird, welcher aus der Reaktion eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers mit einer Antigenkomponente resultiert, die an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper spezifisch binden kann, können Antikörper verwendet werden, die hergestellt wurden, indem z.B. Antikörper gegen einen Autoantikörper in einer Probe mit einer Vielzahl von Markierungsmaterialien markiert werden, obwohl es keine Einschränkung gibt, solange sie als zweiter markierter Antikörper an den Anti-Reg-Proteinantikörper auf einer Transkriptionsmembran binden können. Markierbare Antikörper schließen z.B. Anti-IgG-Antikörper. Anti-IgM-Antikörper, Anti-IgA-Antikörper, Anti-IgE-Antikörper etc., oder ihre teilweise zersetzten Fragmente (F(ab')₂, Fab, etc.) ein. Die für die respektiven Autoantikörper spezifischen zweiten Antikörper können alleine oder in Kombination verwendet werden. Die zweiten Antikörper können entweder polyclonal oder monoclonal sein, aber im Hinblick auf die Empfindlichkeit sind polyclonale Antikörper bevorzugt. Darüber hinaus ist ein Antikörper, der mittels Affinitätsreinigung mit einem Antikörpermolekül als Liganden aufgereinigt worden ist, im Hinblick auf Empfindlichkeit weiter bevorzugt.
Was das Markierungsmaterial betrifft, das zur Markierung der zweiten Antikörper verwendet wird, kann z.B. ein Enzym oder ein radioaktives Isotop verwendet werden. Das Enzym schließt z.B. Maleatdehydrogenase (Enzym Nr. 1.1.1.37), Glucose-6-phosphatdehydrogenase (Enzym Nr. 1.1.1.49), Glucoseoxidase (Enzym Nr. 1.1.3.4), Meerrettichperoxidase (Enzym Nr. 1.11.1.7), Acetylcholinesterase (Enzym Nr. 3.1.1.7), alkalische Phosphatase (Enzym Nr. 3.1.3.1), Glucoamylase (Enzym Nr. 3.2.1.3), Lysozym (Enzym Nr. 3.2.1.17), β-Galactosidase (Enzym Nr. 3.2.1.23) und ähnliche ein. Unter diesen ist das Markieren mit Meerrettichperoxidase bevorzugt, weil es in einem hochgradig empfindlichen Nachweissystem verwendet werden kann, bei dem Licht aus Luminol durch Zugabe von Wasserstoffperoxid zu einem Substrat emittiert wird, dem ein Röntgenfilm ausgesetzt ist.
Alternativ man kann statt eines Enzyms RI an den zweiten Antikörper anhaften lassen, um ein Signal durch Rio-Aktivität zu erhalten.
Als Lösung bei der Reaktion des zweiten Antikörpers mit der Transkriptionsmembran kann eine wohlbekannte, bei der Western Blotting-Reaktion verwendete Lösung verwendet werden, wie eine Blocklierlösung, PBS, oder Tris-Pufferlösung. Zum Waschen nach der Reaktion des zweiten Antikörpers können die vorgenannten verschiedenen Waschlösungen verwendet werden.
Um den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper mittels Immunoassay unter Verwendung einer Vielzahl von Markierungsmaterialien nachzuweisen, wird z.B. das Reg-Protein physikalisch oder chemisch auf einem Träger immobilisiert, so dass ein immobilisiertes Antigen erhalten wird, das unter Erwärmen eine gewisse Zeit lang mit einer Probe in Kontakt treten kann. Wenn der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper in der Probe vorliegt, wird der Autoantikörper an das immobilisierte Antigen gebunden, so dass sich ein Immunkomplex auf dem Träger bildet. Dieser wird, falls nötig, gewaschen und dann lässt man ihn mit einem markierten zweiten Antikörper gegen den oben genannten Antikörper in der Probe in Kontakt kommen (in einigen Fällen kann man die Probe mit dem markierten zweiten Antikörper zur selben Zeit in Kontakt kommen lassen).
Wenn ein Immunkomplex gebildet wird, wird der markierte zweite Antikörper daran gebunden, und er ist damit auf dem Träger immobilisiert. Anschließend wird der an den Träger gebundene, markierte zweite Antikörper oder der trägerfreie, markierte zweite Antikörper gemäß eines von seiner Markierung abhängigen Nachweisverfahrens analysiert. So können das Vorliegen oder die Menge des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers aus den Messwerten bestätigt werden.
Der Träger, der nicht besonders eingeschränkt ist, solange er das Antigen immobilisieren kann, schließt z.B. Kunststoffe wie Polystyrol, Vinylchlorid etc., Fasermaterial wie Cellulose, Nitrocellulose, Nylon, etc., anorganische Materialien wie Glas, Silicagel etc., Erythozyten, Liposome, PDVF und ähnliche ein. Sie können die Form von Mikrotiterplatten, Kugeln, magnetischen Kugeln, Papierplatten, Membranen, Bändern und ähnlichem haben. Im Hinblick auf die Bequemlichkeit werden Polystyrolperlen oder Mikrotiterplatten bevorzugt verwendet, und eine Mikrotiterplatte ist bevorzugt.
Um das Reg-Protein physikalisch auf einem Träger zu immobilisieren, lässt man z.B. eine das Reg-Protein enthaltende Lösung bei niedriger Temperatur (z.B. 4°C) über Nacht mit einem Träger in Kontakt kommen.
Um das oben genannte Reg-Protein chemisch auf einem Träger zu immobilisieren, wird das Reg-Protein z.B. mit einem Carbodiimid und einem Träger mit Carboxylgruppen auf der Oberfläche gemischt, und man lässt das Gemisch stehen.
Um zu verhindern, dass andere Antikörper und ähnliches unspezifisch an eine Probe auf dem Träger binden, ist es sinnvoll, vor der Zugabe der Probe die Oberfläche des Trägers mit fettfreier Milch, Rinderserumalbumin (BSA), etc. zu Blocken.
Als Waschlösung kann z.B. ein Tris-Puffer oder ein Phosphatpuffer, die einen oberflächenaktiven Stoff enthalten, verwendet werden.
Als Beispiel für den zu verwendenden, markierten zweiten Antikörper kann ein zu markierender Antikörper, der bei der Western Blott-Technik verwendet wird, angeführt werden.
Als zur Markierung des markierten zweiten Antikörpers verwendetes Markierungsmaterial können zusätzlich zu den als Beispielen bei der Western Blotting Technik angeführten Markierungsmaterialien fluoreszierende Materialien wie Fluorescein, Metallkolloide wie Goldkolloid, Nichtmetallkolloide wie Selenkolloid, gefärbte Partikel wie gefärbte Harzpartikel, gefärbte Liposom-Farbstoffpartikel und ähnliche verwendet werden.
Unter diesen Markierungsmaterialien ist es im Hinblick auf die Empfindlichkeit, Sicherheit und Bequemlichkeit bevorzugt, ein Enzym zu verwenden. Was die Enzym markierten Antikörper betrifft, so werden im Hinblick auf die Tatsache, dass eine einfache und hochgradig empfindliche Messung möglich ist, mit alkalischer Phosphatase oder Meerrettichperoxidase markierte Antikörper bevorzugt verwendet. Diese enzymmarkierten Antikörper sind kommerziell erhältlich.
Um den Antikörper an das Markierungsmaterial zu binden, kann chemisches Material wie Biotin, Avidin, Streptoavidin, Digoxigenin etc. zwischen den Antikörper und das Markierungsmaterial eingefügt sein.
Zum Nachweis der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper unter Verwendung eines Latex-Verklumpungsverfahrens, wird z.B. eine Antigenkomponente, die spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper binden kann, physikalisch oder chemisch auf Latexpartikeln (Träger) immobilisiert, um ein immobilisiertes Antigen herzustellen, das man dann unter Erwärmen eine bestimmte Zeit lang mit einer Probe in Kontakt kommen lässt, und es wird die Trübung des Gemisches aus Probe und immobilisiertem Antigen gemessen. Der Kontakt des immobilisierten Antigens mit der Probe könnte, wenn ein Anti-Reg-Protein-Autoantikörper in der Probe vorliegt, zur Bildung eines Immunkomplexes durch eine Antigen-Antikörperreaktion führen.
Bei dieser Reaktion wirkt das Antikörpermolekül, weil es zwei mit dem Antigen bindende Stellen hat, als Verzweigungsagens und verursacht eine Verklumpungsreaktion. Diese Reaktion steigert die Trübung des Gemisches aus Probe und immobilisiertem Antigen und die Trübung wird visuell oder mit einem Absorptiometer gemessen.
Satt Latexpartikeln beim Latex-Verklumpungsverfahren können andere verschiedene Partikel wie Erythrozyten oder Liposome verwendet werden.
Bei den erfindungsgemäßen Reagenzien zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten, Diabetes mellitus, insulin-abhängigem Diabetes mellitus und nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus ist die Zusammensetzung des Reagenzes variabel und hängt vom Nachweisverfahren des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers ab. Jedoch, solange das Reagens als Hauptwirkungsbestandteil eine Antigenkomponente enthält, die spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper binden kann, gibt es keine bestimmte Einschränkung für die Zusammensetzung des Reagenzes zum Nachweis der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper, wie oben genannt.
Was die Antigenkomponente betrifft, die spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper binden kann, können die Antigenkomponenten, die beim oben genannten Verfahren zum Nachweis von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern als Beispiele gegeben wurden, verwendet werden.
Was die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Diagnosereagenzes betrifft, kann z.B. wenn die Western Blotting Technik verwendet wird, ein Reagens, das getrennt voneinander ein für eine SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese hergestelltes Reg-Protein-Agens und einen markierten zweiten Antikörper, der mit dem nachzuweisenden Anti-Reg-Protein-Autoantikörper reagiert, umfasst, als Beispiel gegeben werden. Als Beispiel für ein Diagnoseagens für Anti-Reg-Protein-Autoantikörper unter Verwendung unterschiedlicher markierter Materialien kann ein Reagens, das getrennt einen Träger, auf dem ein Reg-Protein immobilisiert ist, und einen markierten zweiten Antikörper, der mit dem nachzuweisenden Anti-Reg-Protein-Autoantikörper reagiert, umfasst, genannt werden. Was die in einer Probe zu verwendenden markierten zweiten Antikörper betrifft, ist es vorteilhaft, einen oder mehrere der markierten Antikörper gegen alle Antikörperklassen zu verwenden. Diese markierten zweiten Antikörper können getrennt oder als Gemisch verwendet werden.
Beim erfindungsgemäßen Diagnosereagens können zusätzlich zu der oben genannten Zusammensetzung des Reagenzes andere Hilfsreagenzien oder Hilfsmatierialien in Kombination mit Diagnosesets verwendet werden.
Z.B. schließt die andere Komponente bei den oben genannten Diagnosereagenzien unter Verwendung der Western Blotting Technik z.B. Gel zur Elektrophorese, Membranen zur Transkription, Blockierlösung, eine Probe für die negative Blindprobe, eine Probe für die positive Blindprobe, Waschlösung, Reaktionssubstrat, wenn das Markierungsmaterial ein Enzym und ähnliches ist, Verdünnungsmittel, Mittel zum Steigern der Empfindlichkeit, Agenzien zum Beenden der Reaktion und ähnliches ein. Diese können alleine oder in Kombination verwendet werden. Die Form des Reagenzes kann z.B. ein Set sein, das die nötigen Mengen der oben genannten Komponenten einschließt. Bei den Diagnosereagenzien unter Verwendung eines Immunoassays mit den oben genannten verschiedenen Markierungsmaterialien schließt die andere Komponente z.B. eine Probe für die negative Blindprobe, eine Probe für die positive Blindprobe, Waschlösung, Reaktionssubstrat, bei dem das Markierungsmaterial ein Enzym oder ähnliches ist, Verdünner, Mittel zum Steigern der Empfindlichkeit, Agenzien zum Beenden der Reaktion und ähnliches ein. Diese können alleine oder in Kombination verwendet werden. Die Form des Reagenzes kann z.B. ein Set sein, das die nötigen Mengen der oben genannten Komponenten oder eine größere Menge eines einzelnen dieser Reagenzien einschließt.
Bei den Diagnosereagenzien unter Verwendung der oben genannten Verklumpung von Latex, schließt die andere Komponente z.B. eine Probe für die negative Blindprobe, eine Probe für die positive Blindprobe, Mittel zum Steigern der Empfindlichkeit, und ähnliches ein. Das Mittel zum Steigern der Empfindlichkeit schließt z.B. Rinderserumalbumin, Polyethylenglycol und ähnliches ein.
Bei den erfindungsgemäßen Nachweisreagenzien schließen die Zielkrankheiten, die diagnostiziert oder vorhergesagt werden sollen und die nicht besonders eingeschränkt sind, solange sie Autoimmunerkrankungen sind, diejenigen, die durch das Vorhandensein der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper verursacht werden ein, und schließen z.B. Diabetes mellitus, insulinabhängigen Diabetes mellitus, nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus, Leberkrebs, Darmkrebs, Dünndarmkrebs, Bauspeicheldrüsenentzündung, Magengeschwüre und die Alzheimer-Krankheit ein. Unter diesen ist Diabetes mellitus im Hinblick auf die hohe positive Rate bevorzugt, und noch bevorzugter sind insulinabhängiger Diabetes mellitus und nicht-insulinabhängiger Diabetes mellitus.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph, der die Verteilung der relativen Antikörper-Titer der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper bei Patienten mit insulinabhängigem Diabetes mellitus und bei gesunden Probanden zeigt, und
2 ist ein Graph, der die Verteilung der relativen Antikörper-Titer der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper bei Patienten mit nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus und bei gesunden Probanden zeigt.
Bevorzugte Ausführungsform der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird mittels der folgenden Beispiele detaillierter beschrieben.
Beispiel 1
Messung von Seren von IDDM-Patienten und gesunden Probanden mittels der Western Blotting-Technik
(1) Probe
Als Proben wurden von 75 gesunden Probanden (Nicht-DM) und 202 IDDM-Patienten gewonnene Seren verwendet.
(2) Verfahren zur Herstellung des Reg-Proteins
Humane REG Iα cDNS wurde in voller Länge in einen pPIC 3.5-Vektor (erworben von Funakoshi Co., Ltd; hergestellt von Invitorgen Corp.) eingeführt. Der resultierende Expressionsvektor wurde in die Hefe Pichia pastoris GS115 überführt (erworben von Funakoshi Co., Ltd; hergestellt von Invitorgen Corp.), um rekombinante Hefe zu erhalten, die humanes Reg-Protein in Kulturmedium ausscheidet.
Diese rekombinante Hefe Pichia pastoris GS115 (Human REG Iα-13), die einen Vektor enthielt, in den die oben genannte humane REG Iα-cDNS eingeführt worden war, ist an der Agency of Industrial Science and Technology, National Institute of Bioscience and Human-Technology (Postleitzahl 305-8566; 1-3, Higashi 1-chome, Tukuba city, Ibaragi, Japan) unter der Zugriffsnummer FERM P-17358 am 5. April 1999 hinterlegt worden und zur internationalen Hinterlegungsstelle unter dem Budapester Abkommen als FERM BP-7111 am 30. März 2000 überführt worden.
Diese rekombinante Hefe wurde in einer Kulturbrühe aus BMGY-Medium (Hefeextrakt 1%, Pepton 2%, 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0), Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren 1,34%, Biotin 4 × 10^–5%, Glycerin 1%) bei 30°C 18 Stunden lang inkubiert. Die kultivierte Brühe wurde zentrifugiert, die als Niederschlag erhaltenen resultierenden Zellen wurden in einer Kulturbrühe aus BMMY-Medium suspendiert (Hefeextrakt 1%, Pepton 2%, 100 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,0), Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (YNB) 1,34%, Biotin 4 × 10^–5%, Methanol 1%) und bei 30°C 72 Stunden lang inkubiert. Während der Inkubation wurde alle 24 Stunden Methanol in einer Menge zugegeben, die 0,5% der Kulturbrühe entsprach.
Nach dem Ende der Inkubation wurde die Kulturbrühe in einer Zentrifuge aufgetrennt, um die Zellen als Niederschlag zu entfernen. Der Überstand wurde durch Zugabe von Essigsäure auf pH 3,5 eingestellt und die Reg-Proteine wurden an einer Ionenaustauschsäule unter Verwendung einer Inonenaustauschsäulenchromatographie-Vorrichtung STREAMLINE SP (Pharmacia Biotec Co., Ltd.) adsorbiert. Die Säule wurde mit 50 mM Natriumacetat (pH 3,5) gewaschen und dann mit 50 mM 1 M NaCl enthaltendem Natriumacetat eluiert, um Reg-Protein zu erhalten.
(3) Nachweis des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers mittels der Western Blotting-Technik.
Reg-Protein (20 μg) wurde in einem wohlbekannten Verfahren mit SDS behandelt, dann einer Elektrophorese an einem 15% SDS Polyacrylamidgel (9 × 6 cm) unterzogen, und dann elektrisch auf eine hydrophobe PVDF-Membran transkribiert (Japan Millipore Co., Ltd). Diese transkribierte Membran wurde in 5% fettfreier Milchlösung geblockt.
Das Serum als Probe wurde dann 1000–20000 fach mit 5% fettfreier Milchlösung verdünnt und unter Verwendung eines Screener Blotter Mini 56 mit der geblockten Transkriptionsmembran inkubiert. Nach sanftem Waschen lies man die Transkriptionsmembran mit einem mit Meerrettich-Peroxidase markierten Kaninchen-anti-humanen Antikörper reagieren (hergestellt von American Qualex International, Inc.; vertrieben von Cosmo Bio Co., Ltd.), der 1000–20000 fach verdünnt war. Mit einem Nachweis-Set, nämlich dem ECL Western Blotting Nachweissystem (Amersham Co.) wurde eine Licht reflektierende Reaktion durchgeführt, bei der für die Western Blotting Technik Chemolumineszenz verwendet wurde, und ein Röntgenfilm belichtet wurde. Nach dem Entwickeln des Filmes wurde dieser getrocknet und mit einem Scanner gescannt, um die Daten als Bilddaten im Computer zu verarbeiten.
Anti-Reg-Protein-Autoantikörper wurden mit Anti-Reg-Proteinen verknüpft und bildeten einen Immunkomplex, an den der markierte zweite Antikörper gebunden war. Daher emittierte das Substrat Licht, das auf einem ihm ausgesetzten Röntgenfilm Banden hinterließ. Die Reflektionsabsorption der resultierenden Banden wurde mittels einer NIH-Bild-Software (dem „Very easy practice! Image Analysis Text" – NIH Image New Course, Kojima et al., Hrsg., Yodo-sha (1997) begefügt) gemessen. Die Absorption einer Probe eines gesunden Probanden, die dem Durchschnittswert am nächsten war, wurde auf 1 gesetzt und die gemessene Absorption wurde als relativer Antikörper-Titer der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper ausgedrückt. Tabelle 1 und 1 zeigen die Verteilung der relativen Antikörper-Titer der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper bei den Patienten mit insulinabhängigem Diabetes mellitus und den gesunden Probanden. Der Durchschnittswert der relativen Antikörper-Titer bei den gesunden Probanden betrug 1,34, die Standardabweichung (SD) betrug 1,59. Patienten, deren relativer Antikörper-Titer mehr als 3 SD vom Durchschnittswert des Antikörper-Titers der gesunden Probanden abwich, d.h. 6,12 oder mehr des relativen Antikörper-Titers betrug, wurden als positiv auf Anti-Reg-Protein-Autoantikörper eingestuft. Tabelle 2 zeigt die Anzahl positiver und negativer Personen unter den Patienten mit insulinabhängigem Diabetes mellitus und unter den gesunden Probanden ebenso wie die positive Rate. Die Anzahl an Personen, die positiv auf Anti-Reg-Protein-Autoantikörper waren, betrug 49 in einer Gruppe mit Diabetes mellitus und die Rate positiver Ergebnisse betrug 24%. Andererseits betrug die Anzahl an Antikörper positiven Personen bei den gesunden Probanden lediglich 2, und die Rate positiver Ergebnisse betrug 3% oder darunter.
Tabelle 1: Verteilung der relativen Antikörper-Titer von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern
Tabelle 2: positive Rate
Beispiel 2
Messung von Seren von NIDDM-Patienten mittels der Western Blotting-Technik
(1) Proben
Als Proben wurden Seren verwendet, die von 75 gesunden Probanden (Nicht-DM) und 368 NIDDM-Patienten gewonnen worden waren.
(2) Nachweis von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern mittels der Western Blotting-Technik
Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurde der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper mittels der Western Blotting-Technik nachgewiesen. Die Reflektions-Absorption von Banden, die durch die Exposition eines Röntgenfilms entstanden waren, wurden auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 mittels einer NIH-Software gemessen. Die Absorption einer in Beispiel 1 verwendeten Probe eines gesunden Probanden, die dem Durchschnittswert am nächsten war, wurde als 1 gesetzt und die gemessene Absorption wurde als relativer Antikörper-Titer der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper ausgedrückt. Tabelle 3 und 2 zeigen die Verteilung der relativen Antikörper-Titer von Anti-Reg-Protein-Autoantikörper bei Patienten mit nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus und bei den gesunden Probanden. Auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 wurden die Patienten, deren relativer Antikörper-Titer mehr als 3 SD des Mittelwerts des Antikörper-Titers der gesunden Probanden, d.h. 6,12 oder mehr des relativen Antikörper-Titers betrug, als Anti-Reg-Protein-Autoantikörper positiv eingestuft. Tabelle 4 zeigt die Anzahl positiver und negativer Personen unter den Patienten mit nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus und unter den gesunden Probanden ebenso wie die Positivrate. Während die Anzahl von Antikörper positiven Personen bei den gesunden Probanden lediglich 2 betrug und die Positivrate 3% oder weniger betrug, betrug die Anzahl an Personen, die als Anti-Reg-Protein-Autoantikörper positiv bestimmt wurden bei Patienten mit nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus 55, d.h. 15%.
Die obigen Ergebnisse zeigen, dass 24% oder mehr der Patienten mit nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus unter Autoimun-Diabetes mellitus litten, der durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht war. Bislang war der oben genannte Fall unbekannt. Die in Tabelle 2 gezeigten Ergebnisse lassen vermuten, dass die beiden gesunden Probanden, bei denen der Anti-Reg-Protein-Autoantikörper nachgewiesen worden ist, in der Zukunft Autoimmun-Diabetes mellitus oder insulinabhängigen Diabetes mellitus oder nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus entwickeln könnten. Der Nachweis von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern gemäß der Erfindung erlaubt die Diagnose von Krankheiten, von denen bislang nicht bekannt war, dass sie durch Autoimmunreaktion verursacht werden, nämlich Diabetes mellitus oder insulin abhängigen Diabetes mellitus oder nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus, oder er erlaubt die Vorhersage ihrer Wahrscheinlichkeit in der Zukunft.
Tabelle 3: Verteilung der relativen Antikörper-Titer von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern
Tabelle 4: positive Rate
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Beurteilung von Autoimmunerkrankungen ist es möglich, Autoimmunerkrankungen bislang unbekannter Ursache zu diagnostizieren, die durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht werden.
Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Beurteilung von Diabetes mellitus ist es möglich, Diabetes mellitus bislang unbekannter Ursache zu diagnostizieren, der durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht wird.
Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Beurteilung von insulinabhängigem Diabetes mellitus ist es möglich, insulinabhängigen Diabetes mellitus bislang unbekannter Ursache zu diagnostizieren, der durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht wird.
Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Beurteilung von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus ist es möglich, nicht-insulinabhängigen Diabetes mellitus bislang unbekannter Ursache zu diagnostizieren, der durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht wird.
Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern ist es möglich, ein Verfahren zum Nachweis zur Verfügung zu stellen, das zur Diagnose von Autoimmunerkrankungen, Diabetes mellitus, insulinabhängigem Diabetes mellitus und nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus zur Verfügung zu stellen, die bislang unbekannte Ursache haben und durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht werden.
Das erfindungsgemäße Reagens zum Nachweis von Autoimmunerkrankungen erlaubt die Diagnose von Autoimmunerkrankungen bislang unbekannter Ursache, die durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht werden.
Das in der Erfindung beschriebene Reagens zum Nachweis von Diabetes mellitus erlaubt die Diagnose von Diabetes mellitus bislang unbekannter Ursache, der durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht wird.
Das erfindungsgemäße Reagens zum Nachweis von insulinabhängigem Diabetes mellitus erlaubt die Diagnose von insulinabhängigem Diabetes mellitus bislang unbekannter Ursache, der durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht wird.
Das erfindungsgemäße Reagens zum Nachweis von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus erlaubt die Diagnose von nicht-insulinabhängigem Diabetes mellitus bislang unbekannter Ursache, der durch die Existenz von Anti-Reg-Protein-Autoantikörpern verursacht wird.

Claims

Verfahren zur Diagnose oder Vorhersage des Ausbruchs einer Autoimmunkrankheit, das den Schritt des Nachweisens der Existenz eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers in einer Körperflüssigkeits- oder Gewebeprobe umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Krankheit Diabetes mellitus ist.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Diabetes mellitus insulinabhängiger Diabetes mellitus oder nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus ist.
Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers, das den Schritt des In-Kontaktbringens einer Probe mit einer Antigenkomponente umfasst, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, und das Nachweisen der Bildung eines Immunkomplexes, der durch die Reaktion des Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers mit der Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, entsteht.
Verfahren zum Nachweis eines Anti-Reg-Protein-Autoantikörpers nach Anspruch 4, bei dem die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein Reg-Protein ist, ein Teil eines Reg-Proteins oder ein künstlich synthetisiertes Reg-Protein.
Verwendung einer Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, zur Herstellung eines Reagenzes zur Diagnose einer Autoimmunkrankheit.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei die Krankheit Diabetes mellitus ist.
Verwendung nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Antigenkomponente, die in der Lage ist, spezifisch an den Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, ein Reg-Protein ist, ein Teil eines Reg-Proteins oder ein künstlich synthetisiertes Reg-Protein.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Diabetes mellitus insulinabhängiger Diabetes mellitus oder nicht insulinabhängiger Diabetes mellitus ist.
Latex-Partikel umfassendes Reagenz, bei dem ein menschliches Reg-Protein, das in der Lage ist, spezifisch an einen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, physikalisch oder chemisch auf den Latexpartikeln immobilisiert ist.
Reagenz, das ein menschliches Reg-Protein umfasst, das in der Lage ist, spezifisch an einen menschlichen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper zu binden, und einen markierten zweiten Antikörper, der mit dem menschlichen Anti-Reg-Protein-Autoantikörper reagiert.
Reagenz nach Anspruch 10 oder 11, bei dem das menschliche Reg-Protein ein künstlich synthetisiertes Reg-Protein ist.