WO2000062066A1 - PROCEDE D'EVALUATION DE MALADIES AUTO-IMMUNES, PROCEDE DE DETECTION D'ANTICORPS DE PROTEINE ANTI-Reg ET DIAGNOSTICS POUR MALADIES AUTO-IMMUNES - Google Patents

PROCEDE D'EVALUATION DE MALADIES AUTO-IMMUNES, PROCEDE DE DETECTION D'ANTICORPS DE PROTEINE ANTI-Reg ET DIAGNOSTICS POUR MALADIES AUTO-IMMUNES Download PDF

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reg
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Hiroshi Okamoto
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Definitions

  • the present invention relates to a method for judging an autoimmune disease, a method for detecting an anti-Reg protein autoantibody, and a reagent for diagnosing an autoimmune disease.
  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to an autoimmune disease, diabetes (insulin-dependent diabetes, non-insulin-dependent). Diabetics).
  • the present invention also relates to a method for detecting an anti-Reg protein autoantibody, a reagent for diagnosing an autoimmune disease, and diabetes (such as insulin-dependent diabetes and non-insulin-dependent diabetes).
  • Background Art In autoimmune diseases, the immune system does not work normally, causing a humoral or cellular immune response to own cells and tissues, and autoantibodies reacting to own cells and tissues appear It is a disease caused by
  • Autoantibodies are known to cause autoimmune diseases by attacking their own cells and tissues and impairing their functions. Moreover, autoantibodies have recently been reported to be detected in the serum of patients before the onset of autoimmune disease.
  • detection of autoantibodies enables early detection of the onset of an autoimmune disease, prediction of the onset of the disease, and prediction of the exacerbation of the condition, thereby enabling early treatment and prevention of the autoimmune disease. Treatment is possible.
  • I slet cel l antibody hereinafter abbreviated as ICA
  • ICSA I scel cel l surface antibody
  • Antibodies anti-glutamic acid decarboxylase antibodies, anti-ganglioside antibodies, anti-peat milk albumin antibodies, anti-Tung cytokeratin antibodies, etc. have been reported.
  • ICA I slet cel l antibody
  • ICSA I scel cel l surface antibody
  • Antibodies anti-glutamic acid decarboxylase antibodies
  • anti-ganglioside antibodies anti-ganglioside antibodies
  • anti-peat milk albumin antibodies anti-Tung cytokeratin antibodies, etc.
  • 108 and 1. 38 is the Inn It is frequently detected in the serum of patients during the onset of insulin-dependent diabetes mellitus (Insulin-Dependent Diabetes Mellitus).
  • ICA is also detected in the serum of patients before the onset of IDDM, and is known as a marker that predicts the onset of IDDM.
  • IDDM As described above, with regard to IDDM, it is thought that there are many autoimmune diabeteses that develop by an autoimmune mechanism, but there are also reports of patients in whom clear autoantibodies are not detected.
  • NID DM non-insulin-dependent diabetes mellitus
  • the prevalence of ICA in ID DM patients is more than 40%.
  • less than 3% of patients with NID DM are described in Kobayashi et al., Diabetes, Vol. 35, pp. 335-340 (1986) (Kobayashi T et al., Diabetes, Vol. 35, 335-340 (1986)). ) ".
  • no autoantibodies with a low positive rate in NIDDM and effective as diagnostic indicators for NIDDM have been reported.
  • Reg (regeneration gene) protein is remarkably expressed when Langerhans islands are regenerated by administering nicotinic acid amide to La 'soto, whose kidney has been excised by about 90%.
  • "Terazono et al., Journal of Biological Chemistry, Volume 263, 2111-2114, (1988)” (Journal of Biological Chemistry, 263: 2111-2114, (1988) j .
  • Reg proteins have been discovered in humans, rats, mice, mice and hamsters, and are now known based on homology of the primary structure and the presence or absence of an inserted sequence of 7 or 5 amino acid residues.
  • gll and Reg II I are classified into three subtypes.
  • Reg protein is found not only in the above-mentioned Langerhans islet cells, but also in cancer cells in the liver, intestine, and kidney, and in the mucous membrane of the small intestine. It is reported to be involved in the regeneration and proliferation of internal organs.
  • One of the objects of the present invention is to provide a method for determining an autoimmune disease. More specifically, it is an object of the present invention to provide a method for determining diabetes, and more specifically, a method for determining insulin-dependent diabetes and non-insulin-dependent diabetes.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting an antibody that can be used for diagnosing an autoimmune disease.
  • the present invention provides a diagnostic reagent for an autoimmune disease. More specifically, the present invention provides a diagnostic reagent for diabetes, and more specifically, a diagnostic reagent for insulin-dependent diabetes mellitus and non-insulin-dependent diabetes mellitus.
  • the present invention relates to the following (1) to (24).
  • a method for determining an autoimmune disease which comprises detecting the presence of an anti-Reg protein autoantibody in a sample.
  • a method for determining diabetes mellitus which comprises detecting the presence of an anti-Reg protein autoantibody in a sample.
  • a method for determining insulin-dependent diabetes which comprises detecting the presence of an anti-Reg protein autoantibody in a sample.
  • a method for determining insulin-independent diabetes which comprises detecting the presence of an anti-Reg protein autoantibody in a sample.
  • a diagnostic reagent for an autoimmune disease comprising an antigen component capable of specifically binding to an anti-Reg protein autoantibody.
  • a diagnostic reagent for diabetes comprising an antigen component capable of specifically binding to an anti-Reg protein autoantibody.
  • a diagnostic reagent for insulin-dependent diabetes comprising an antigen component capable of specifically binding to an anti-Reg protein autoantibody.
  • the method for determining an autoimmune disease in the present invention diagnoses or predicts an autoimmune disease caused by an anti-Reg protein autoantibody by detecting the presence of an anti-Reg protein autoantibody in a sample. Things.
  • An autoimmune disease that can be diagnosed or predicted by detecting the presence of an anti-Reg protein autoantibody is particularly limited as long as the disease is caused by the presence of an anti-Reg protein autoantibody.
  • Examples include, but are not limited to, diabetes, insulin-dependent diabetes, non-insulin-dependent diabetes, liver cancer, large intestine cancer, small intestine cancer, Tengitis, gastric ulcer, and Alzheimer's disease. Diabetes is preferred from the viewpoint of a high rate, and insulin-dependent diabetes and insulin-independent diabetes are more preferred.
  • the anti-Reg protein autoantibody to be detected is not particularly limited as long as it is an antibody that reacts with the Reg protein.
  • an IgG antibody that reacts with the Reg protein Classes include IgM antibody, IgA antibody, IgD antibody and IgE antibody.
  • IgG antibodies and IgM antibodies it is preferable to detect IgG antibodies and IgM antibodies from the viewpoint that they are frequently found in patients with autoimmune diseases.
  • the anti-Reg protein autoantibody to be detected one or more of the above antibody classes may be detected in combination.
  • a sample to be used includes an anti-Reg protein autoantibody.
  • an anti-Reg protein autoantibody There is no particular limitation as long as there is a possibility that the specimen may be collected. Examples include tissues such as cancer cells. Among the above samples, blood, serum, plasma, and urine are preferable from the viewpoint of easy availability of the sample.
  • the antigen component used is not particularly limited as long as it is a component that can specifically bind to the anti-Reg protein autoantibody.
  • the protein is preferably a Reg protein, and more preferably a part of the Reg protein.
  • the Reg protein is artificially synthesized by a method such as a genetic recombination method or a chemical synthesis method.
  • Reno proteins include genes reported as the Reg gene family, "Umino et al., Japanese clinical study 55, 817-821 (1997)", "Yonekura et al., Edited by Flat et al., Frontiers. 'Ob' Insulin 'Secretion' and 'Noncreativity. Beessel. Research, Smith-Golden, London, pp. 581-588 (Yonekur a H, et al, In: Flatt PR et al. eds) Frontiers of Insulin Secretion and Pancreatic B-Cell Research. Smith-Golden, London, pp581-588), " ⁇ shitara.
  • the above Reg protein can be appropriately selected according to the type of autoimmune disease to be detected.
  • the Reg protein present in the organ causing the disorder is considered.
  • the Reg protein when diabetes, insulin-dependent diabetes mellitus and non-insulin-dependent diabetes mellitus are the diseases to be diagnosed, it is preferably human Regyl spleen protein.
  • the antigen components used include: detection sensitivity and specificity of the anti-Reg protein autoantibody, and antigen activity when stored as a diagnostic reagent for a long time.
  • the Reg protein is fragmented by a known enzymatic method or a genetic recombination technique, and the Reg protein is fragmented by a known enzymatic or genetic recombination technique.
  • a partially modified Re protein can be used.
  • the anti-Reg protein used for detecting the anti-Reg protein autoantibody one or more of the above-described Reg proteins may be used in combination.
  • the method for producing the above-mentioned Reg protein is not particularly limited.
  • it is produced artificially by a method such as a genetic recombination method or a chemical synthesis method, or is purified from organs, body fluids, secretions and the like. Can be manufactured.
  • a method for producing a Reg protein by a genetic recombination method for example, a recombinant vector is prepared by inserting the above-described DNA encoding the Reg protein into a vector, and then inserting it into a host. To produce a transformant, culturing the transformant, and using the transformant itself or a culture supernatant.
  • the DNA encoding the Reg protein to be inserted into the recombination vector may be DNA encoding the full length of the Reg protein, or may be DNA encoding a part thereof.
  • the recombinant vector can be prepared by inserting a DNA encoding the above-described Reg protein into a plasmid vector, a phage vector, or the like that can be replicated in a host cell according to a well-known method. At that time, a linker can be used if necessary.
  • a transformant having the recombinant vector to be prepared can be easily screened, and the kanamycin resistance gene and the ampicillin resistance can be stably maintained in the host cell. It preferably has a drug resistance gene such as a gene.
  • plasmid vector examples include plasmid pPIC3.5K, ⁇ IC9K :, pA0815, pYX011, pYXlll, pUC118, pUB110. And the like.
  • pPIC3.5K, pPIC9K, pA0815 are from Funakoshi Co., Ltd., ⁇ 011, ⁇ 111 are from Cosmo Bio Inc., pUC118, pUBll0 are Takara Shuzo Can be purchased from a stock company.
  • phage vector examples include human gt11 phage and gt10 phage.
  • Human gt11 phage and Lgt10 phage can be purchased from Funakoshi Co., Ltd. In each case, a recombinant vector corresponding to the parent vector used is obtained.
  • a transformant can be prepared by inserting the recombinant plasmid into a host.
  • the host is not particularly limited as long as it expresses the Reg protein DNA in the recombinant plasmid.
  • Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris Escherichia coli such as Escherichia coli
  • Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis.
  • Methods for inserting the recombinant plasmid into the host include, for example, A method is to insert a recombinant plasmid by electroporation, calcium chloride method, tris-PEG (Tris-PEG) method, etc., after converting into spheroplast or protoplast. And it is appropriately selected depending on the type of host.
  • kits are commercially available for the purpose of producing transformants using recombinant plasmids.
  • a kit using Vicia's pastris of yeast is Funakoshi Co., Ltd. It is commercially available (catalog number: IV-175-001, manufacturer: Invitrogen Corp.), and is transformed by operating according to the instruction manual attached to this kit. A body can also be made.
  • transformant for producing the Reg protein using the transformant include a recombinant yeast Bacillus pastoris GS1 having a vector into which human REGI cDNA has been inserted.
  • GS115 Human REG I Hiichi 13 was established on April 5, 1999 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal code: 305-8566, Tsukuba, Higashi 1-chome, Ibaraki, Japan) No. 1 3), deposited as FE RM P—17 358, transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty on March 30, 2000, and deposited under FE RM BP—7111.
  • An accession number has been assigned.
  • a method in which the transformant is placed in a medium in which the transformant can grow, and shaken or allowed to stand at an appropriate temperature can be used.
  • a medium containing a carbon source and a nitrogen source can be used.
  • the carbon source include sugars, alcohols, and organic acids.
  • sugars include glucose, starch, dextros, molasses, and the like.
  • alcohols include methanol, ethanol, and glycerol.
  • organic acids such as citric acid and malonic acid.
  • the nitrogen source include an organic nitrogen source and an inorganic nitrogen source.
  • the organic nitrogen source include peptone, casein, polypeptone, pact.tripton, meat extract, yeast extract, casamino acid, and glycine.
  • the inorganic nitrogen source include ammonium sulfate and ammonium nitrate. I can do it.
  • auxotrophy add nutrients necessary for its growth to the culture medium.
  • nutrients include, for example, amino acids, vitamins, nucleic acids, salts, and the like.
  • a synthetic medium mainly composed of an alcohol and an organic nitrogen source can be used.
  • an antibiotic can be added to the medium in order to stably maintain the recombinant plasmid and suppress the growth of a strain that does not have the recombinant plasmid.
  • antibiotics include penicillin, erythromycin, kanamycin, neomycin, chloramphenicol, nocitracin, D-cycloserine, ambicilin and the like.
  • soybean oil, lard oil, various surfactants and the like may be added to the medium as an antifoaming agent.
  • the pH of the medium is usually 4 to 9 from the viewpoint that the transformant can grow, and 5.0 to 7.0 when yeast Viscia pastris is used as a host. Is preferred.
  • the culture temperature is, for example, usually 15 to 42 ° C, and preferably 24 to 37 ° C.
  • the cultivation time varies depending on the type of host, the physical state of the medium (solid or liquid), the cultivation apparatus, the cultivation temperature, and the like.
  • the culture time is usually 12 to 96 hours, preferably 60 to 84 hours.
  • the transformant into which the gene encoding the Reg protein has been introduced as described above is cultured, and the Reg protein is produced and accumulated in the culture solution after the culture and in the culture comprising the transformant. And the desired Reg protein can be purified from the culture.
  • the signal of the transformant may be used.
  • the signal sequence is removed from the fusion protein by nalpeptidase, and the Reg protein is secreted from the transformant.
  • a culture after culturing the transformant a culture supernatant is obtained. It is preferable to use a simple method for purifying Reg protein from the cinnamon.
  • a method of obtaining a cultured transformant as a culture, crushing or dissolving to obtain a crushed solution or a lysate, and purifying Reg protein from the crushed or lysed solution may also be mentioned.
  • the yield of the desired Reg protein can be improved by using a combination of a culture solution and a purification method from the cultured transformant.
  • Examples of a method for disrupting the transformant include a method for physically disrupting the transformant.For example, a method in which the transformant is suspended in a buffer and irradiated with ultrasonic waves, A method in which the body is kneaded with quartz sand and suspended in a buffer solution can be used.
  • examples of a method of lysing a transformant include a method of lysing the transformant with an enzyme that lyses the cell wall of the transformant and a surfactant, and when the host of the transformant is Escherichia coli. Lysozyme can be used as this enzyme, and sodium dodecyl sulfate (SDS) can be used as a surfactant.
  • a method for purifying the target Reg protein from the obtained crushed liquid or lysate for example, centrifugation of the crushed liquid or lysate to remove cell debris, obtain a supernatant, and obtain Reg protein Add ammonium sulfite at a concentration that does not precipitate, stir and centrifuge.This removes the precipitate, obtain the supernatant, and add ammonium sulfate to the supernatant at a concentration at which Reg protein precipitates. Then, a method of obtaining a precipitate by centrifugation can be used. In the final centrifugation, the desired Reg protein may be contained in the supernatant.Sampling should be performed to confirm the presence of Reg protein in the supernatant and sediment fractions.
  • a method for purifying the target Reg protein from the culture supernatant after culturing the transformant for example, removing the cells as a precipitate by centrifuging the culture solution and adding acetic acid Adjust the pH of the supernatant to 3.5, apply to the ion-exchange column, adsorb the Reg protein, wash with sodium acetate buffer, and add 1 M NaC1 in sodium acetate buffer. Is added to the column and eluted. Is obtained.
  • a continuous 10 to 30 sequence of the amino acid sequence of a part of the Reg protein can be synthesized by a well-known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method include a solid phase method in which a peptide chain is extended from the C-terminus on an insoluble polymer carrier, or a liquid phase method using no carrier.
  • Peptide synthesis by the solid phase method described above can be performed using a commercially available peptide synthesizer.
  • a protein can be obtained by linking one or more of the peptide chains synthesized as described above.
  • the organ, body fluid, and secretion used as a raw material are not particularly limited as long as the Reg protein is present.
  • examples include kidney, Langerhans islet cells, Teng's excretory gland, nerve cells and cancer cells such as liver cancer, colon cancer, and small intestine cancer.
  • the method described in the method for crushing and dissolving the transformant can be used.
  • the purification method described in the method for producing Reg protein from the transformant can be used.
  • a sample is contacted with an antigen component capable of specifically binding to the anti-Reg protein autoantibody, and the anti-Reg protein autoantibody is specifically reacted with the anti-Reg protein autoantibody.
  • the detection of the formation of an immune complex resulting from the reaction with an antigen component capable of binding to the autoantibody to the protein is not particularly limited, and examples thereof include, but are not limited to, western blotting, immunoassay using various labels, and latex. Latex agglomeration method using carrier particles is exemplified.
  • immunoassays using various labeled substances include radioimmunoassay (radioimmunoassey, RIA), immunofluorescence assay (fluorescence immunoassay, FIA), immunoluminescence assay (Luminescent Atsusei), and enzyme immunoassay. (ELISA method), immunochromatography and the like.
  • the Reg protein is separated by electrophoresis, transferred to a porous membrane, and then transferred to a porous membrane (hereinafter, referred to as “porous membrane”).
  • porous membrane a porous membrane
  • the transfer membrane is blocked to suppress non-specific reaction with the sample, and the transfer membrane is kept in contact with the sample for a certain period of time, so that anti-Reg protein autoantibodies are present in the sample.
  • the antibody is bound to the antigen immobilized on the transfer membrane to form an immune complex, washed if necessary, and then contacted with a labeled secondary antibody capable of binding to the anti-Reg protein autoantibody.
  • sample and the labeled secondary antibody may be contacted simultaneously.
  • the labeled secondary antibody When the immune complex is formed, the labeled secondary antibody further binds to the complex, and the labeled secondary antibody is also immobilized on the transfer membrane. Then, the target bound to the transfer membrane
  • the amount of the labeled secondary antibody can be measured by a measuring method according to the labeled substance, and the presence or amount of the anti-Reg protein autoantibody in the sample can be determined from the value.
  • a method of expressing the presence or amount of anti-Reg protein autoantibodies for example, a sample not containing anti-Reg protein autoantibodies, a sample containing a known amount of anti-Reg protein autoantibodies, etc.
  • the antibody titer of an anti-Re protein autoantibody is expressed as a value converted into a standard value by measuring and comparing the measured value with the value of the subject.
  • measurement means not only quantitative or semi-quantitative detection but also qualitative detection.
  • Examples of methods for electrophoresis of Reg protein include various well-known electrophoresis methods such as SDS polyacrylamide electrophoresis, native polyacrylamide gel electrophoresis, gel isoelectric focusing, and the like.
  • SDS polyacrylamide electrophoresis is preferred from the viewpoint of the separation ability that can be separated depending on the molecular weight and the efficiency of transfer.
  • a transfer method for transferring the protein molecules separated by electrophoresis from the gel to a porous membrane for example, a method using a well-known capillary phenomenon (capillary method), a method using a natural diffusion force ( Diffusion method) and method using electrophoresis (electrophoresis method) can be used, but electrophoresis method is preferable from the viewpoint of operation time and quantitative and reproducible detection.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • a blocking material for the transfer membrane for example, a well-known solution used in the western blotting method such as a casein-based solution such as a non-fat milk solution, a gelatin-based solution, and a bovine serum albumin (BSA) -based solution can be used.
  • a casein-based solution such as a non-fat milk solution, a gelatin-based solution, and a bovine serum albumin (BSA) -based solution
  • BSA bovine serum albumin
  • the sample may be allowed to react with the transfer membrane as it is, but may be diluted if the antibody titer is high.
  • phosphate buffer saline hereinafter abbreviated as PBS
  • phosphate buffer may be used as the diluent.
  • PBS phosphate buffer saline
  • phosphate buffer phosphate buffer
  • well-known solutions used for the Western plot method it is preferable to use the same solution as used for blocking from the viewpoint of reducing non-specific adsorption.
  • a well-known washing solution used in the western blotting method can be applied as a washing solution to be used, and examples thereof include PBS and a phosphate buffer solution.
  • a solution containing a nonionic surfactant such as Tween 20 (Tween 20) in a concentration of 0.05 to 5% by weight to these buffers may be used.
  • Labeled secondary antibodies used to detect the formation of an immune complex resulting from the reaction of an anti-Reg protein autoantibody with an antigen component capable of specifically binding to the anti-Reg protein autoantibody include anti-Reg protein autoantibodies on the transfer membrane.
  • Antibodies to be labeled include, for example, anti-IgG antibody, anti-IgM antibody, anti-IgA antibody, anti-IgE antibody and the like or partially degraded products thereof (F (ab,) 2 , Fab, etc.).
  • Secondary antibodies specific to autoantibodies can be used alone or in combination.
  • a polyclonal antibody or a monoclonal antibody can be used, but from the viewpoint of sensitivity, a polyclonal antibody is preferable. Further, those purified by an affinity purification method using an antibody molecule as a ligand are more preferable from the viewpoint of sensitivity.
  • an enzyme for example, an enzyme, a radioisotope (R I) or the like can be used.
  • enzymes include malate dehydrogenase (enzyme number 1.1.1.37), glucose 16-phosphate dehydrogenase (enzyme number 1.1.1.49), glucosoxidase (enzyme number 1.1.3.4), and Western ⁇ Saviver oxidase (enzyme number 1.11.1.7), acetylcholinesterase (enzyme number 3.1.1.7), alkaline phosphatase (enzyme number 3.1.3.1), glucoamylase (enzyme number 3.2.1.3), lysozyme ( Enzyme number 3.2.1.17) and?
  • -Galactosidase (enzyme number 3.2.1.23).
  • horseradish peroxidase labeling is preferable from the viewpoint that a highly sensitive system for detecting luminol by emitting luminol using hydrogen peroxide as a substrate and exposing it to an X-ray film can be used.
  • RI can be bound to the secondary antibody to obtain a signal of RI activity.
  • a solution for reacting the secondary antibody and the transfer membrane ⁇ Well-known solutions used in the stamp-lot method, such as blocking solution, PBS, and Tris buffer, can be used.
  • the above-described various washing solutions can be used.
  • immobilized antigen is prepared by physically or chemically immobilizing the Reg protein on a carrier.
  • the immobilized antigen is brought into contact with the sample and incubated for a certain period of time, whereby, if an anti-Reg protein autoantibody is present in the sample, the antibody is bound to the immobilized antigen to transfer the immune complex to the carrier.
  • a method can be used in which a sample is formed on the sample, washed if necessary, and then contacted with a labeled secondary antibody against the antibody in the sample (in some cases, the sample and the labeled secondary antibody may be contacted simultaneously).
  • the labeled secondary antibody When the immune complex is formed, the labeled secondary antibody further binds to the complex, and the labeled secondary antibody is also immobilized on the carrier. Then, the amount of labeled substance on the labeled secondary antibody bound to the carrier or unlabeled secondary antibody is measured by a measurement method according to the labeled substance, and the presence or absence of the anti-Reg protein autoantibody in the sample is determined from the value. The amount can be determined.
  • the carrier is not particularly limited as long as the antigen can be immobilized thereon.
  • examples thereof include plastic materials such as polystyrene and vinyl chloride, fiber materials such as cellulose, nitrocellulose, and nylon, glass, and silica gel.
  • Inorganic materials such as erythrocytes, liposomes, PDVF, etc. can be used, and the shape can be any shape such as micro tie plate, beads, magnetic beads, paper disc, membrane, thread, etc. From the viewpoint of simplicity, it is preferable to use polystyrene beads or a microtiter plate, and a polystyrene microtiter plate is more preferable.
  • a method for physically immobilizing the Reg protein on a carrier for example, a method in which the solution containing the Reg protein is brought into contact with the carrier and left overnight at a low temperature (for example, 4 ° C) is used. Can be.
  • a method of chemically immobilizing the Reg protein on a carrier for example, a method of mixing the Reg protein with a carrier having a carboxyl group on its surface and a carpoimide can be used. From the viewpoint of preventing non-specific binding of other antibodies in the sample to the carrier, it is preferable to block the surface of the carrier with non-fat milk, bovine serum albumin (BSA), etc. before adding the sample. .
  • BSA bovine serum albumin
  • washing solution for example, tris containing a surfactant, a phosphate buffer, or the like can be used.
  • the antibodies exemplified in the Istanbul blot method can be used.
  • labeling substance used for labeling the secondary antibody examples include fluorescent substances such as fluorescine, metal colloids such as gold colloid, and selenium colloid in addition to the labeling substances exemplified in the western blotting method. Colored fine particles such as non-metallic colloids, colored resin fine particles, and colored liposome dye fine particles can also be used.
  • an enzyme in terms of sensitivity, safety, simplicity and the like.
  • an enzyme-labeled antibody it is preferable to use an alfa phosphatase-labeled antibody or a horseradish peroxidase-labeled antibody because simple and highly sensitive measurement is possible. It is commercially available.
  • a chemical substance such as biotin, avidin, streptoavidin, digoxigenin, etc. is interposed between the antibody and the label. Is also good.
  • an antigen component capable of specifically binding to anti-Reg protein autoantibodies is physically or chemically attached to latex particles (carrier).
  • the immobilized antigen is prepared by immobilization, the immobilized antigen is brought into contact with the specimen, the temperature is kept for a certain time, and the turbidity of the mixed solution of the specimen and the immobilized antigen is measured.
  • an anti-Reg protein autoantibody is present in the sample, an immune complex is formed by an antigen-antibody reaction, in which case the antibody molecule has a portion that binds to the antigen.
  • an agglutination reaction occurs when the antibody molecule functions as a cross-linking agent. This reaction increases the turbidity of the mixed solution of the sample and the immobilized antigen, and the turbidity is measured visually or using an absorption photometer.
  • latex particles instead of latex particles in the latex agglutination method, erythrocytes, ribosomes, etc. Other various fine particles can also be used.
  • the composition of the diagnostic reagent for autoimmune disease, diabetes, insulin-dependent diabetes and non-insulin-dependent diabetes is different depending on the method of detecting anti-Reg protein autoantibody.
  • No particular limitation is imposed on the constituent reagents of the anti-Reg protein autoantibody detection method as long as it contains an antigen component capable of specifically binding to the anti-Reg protein autoantibody as a main active ingredient.
  • the antigen component capable of specifically binding to the anti-Reg protein autoantibody the antigen component exemplified in the above-described method for detecting an anti-Reg protein autoantibody can be used.
  • the configuration of the diagnostic reagent of the present invention may be, for example, a diagnostic reagent using the Western prosote method, such as a Reg protein reagent prepared for SDS polyacrylamide electrophoresis and a detection reagent.
  • Reagents that react with anti-Reg protein autoantibodies to be labeled are included separately from secondary antibody reagents, and are used in diagnostic reagents for anti-Reg protein autoantibodies using immunoassays using various labels.
  • the reagent include a reagent in which a carrier on which the Reg protein is immobilized and a labeled secondary antibody reagent that reacts with the anti-Reg protein self-antibody to be detected are separately contained.
  • examples of a diagnostic reagent for anti-Reg protein autoantibody using the latex agglutination method include a latex particle (carrier) reagent on which Reg protein is immobilized.
  • the labeled secondary antibody used in the diagnostic reagent As the labeled secondary antibody used in the diagnostic reagent, the labeled secondary antibody exemplified in the above-described method for detecting an anti-Reg protein autoantibody can be used.
  • the labeled secondary antibody to be used it is preferable to use one or more kinds of labeled antibodies for any one class of antibodies per sample. These labeled secondary antibodies may be prepared separately or in a mixture.
  • auxiliary reagents and auxiliary materials can be combined to form a diagnostic kit.
  • other components include, for example, an electrophoresis gel, a transfer membrane, a blocking solution, a negative control sample-a positive control sample, a washing solution, and a labeling substance which is an enzyme. And the like, a reaction substrate, a diluting solution, a sensitizer, a reaction terminating solution, etc., and these may be used alone or in combination.
  • the form of the reagent may be, for example, a kit in which the required amount of the above components is enclosed.
  • the other components may be, for example, a negative control sample.
  • a positive control sample a washing solution, a reaction substrate when the labeling substance is an enzyme, etc., a diluting solution, a sensitizer, a reaction terminating solution, and the like. These may be used alone or in combination. Examples thereof include kits in which the above-mentioned components are contained in necessary amounts, and bulks of these individual products.
  • examples of the other components include a negative control sample, a positive control sample, and a sensitizer.
  • examples of the sensitizer include serum albumin, polyethylene glycol, and the like.
  • the target disease to be diagnosed or predicted is not particularly limited as long as it is an autoimmune disease caused by the presence of an anti-Reg protein autoantibody.
  • To diabetes more preferably insulin-dependent diabetes mellitus and insulin-independent diabetes.
  • FIG. 1 shows the distribution of relative antibody titers of anti-Reg protein autoantibodies in insulin-dependent diabetic patients and healthy subjects.
  • FIG. 2 is a diagram showing the distribution of relative antibody titers of anti-Reg protein autoantibodies in non-insulin-dependent diabetic patients and healthy subjects.
  • BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.
  • Example 1 Measurement of serum from ID DM patients and healthy subjects by the Wesseven blot method (1) Sample
  • the recombinant yeast B. pastoris GS115 strain (Human REG IHI13) having the vector into which the above human REGI acD D was inserted was obtained on April 5, 1999. Deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology and Industrial Technology (Postal code 305-8566, 1-3-1 Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan) under the accession number FE RM P—1 7 3 58, March 2000 It was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty on 30th and given a deposit number of FERM BP—7111.
  • This recombinant yeast was used in a BMGY medium (1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), containing no yeast nitrogen-based amino acids).
  • the culture was centrifuged to remove the cells as a precipitate, and acetic acid was added to the supernatant to adjust the pH to 3.5, followed by ion exchange column chromatography and a streamliner ES.
  • '' STREAMLINE SP Pulsham '' Biotech Stock was used to adsorb the Reg protein onto the ion exchange column. After washing the column with 50 mM sodium acetate (pH 3.5), the column was eluted with 50 mM sodium acetate (pH 3.5) containing 1 M NaCl to obtain Reg protein.
  • the sample serum was diluted 1000- to 2000-fold with a 5% non-fat milk solution, and the transfer membrane and incubation were screened using a screener 'Blotter' Mini 56. did.
  • the transfer membrane was diluted 1000- to 2000-fold to produce a horseshoe sibiotic oxidase-labeled heron anti-human antibody (American Qualex International, Inc.). Reaction with Cosmo Biotechnology Co., Ltd.) and a luminescence reaction using a detection kit using chemiluminescence for the western plot method and an ECL western blotting detection system (Amersham Co., Ltd.).
  • the film was exposed. After the film was developed, the film was dried, and the image was taken by a scanner as a whole image at a convenience store.
  • the anti-Reg protein autoantibody binds to the Reg protein and forms an immune complex, and the labeled secondary antibody binds, the substrate emits light, and the X-ray film is exposed to light.
  • the measured absorbance was expressed as the relative antibody titer of the anti-Reg protein autoantibody, taking the absorbance of one of the most average samples of healthy subjects as 1.
  • the distribution of relative antibody titers of anti-Reg protein autoantibodies in insulin-dependent diabetic patients and healthy subjects is shown in Table 1 and FIG.
  • the average relative antibody titer of the healthy group was 1.34, and the standard deviation (SD) was 1.59.
  • Anti-Reg protein autoantibodies were identified as having a relative antibody titer of 3 SD or more, that is, a relative antibody titer of 6.12 or more relative to the average of the relative antibody titers of the healthy subjects.
  • Table 2 shows the number of positive and negative patients and the positive rate of insulin-dependent diabetic patients and healthy subjects. In the diabetic group, 49 patients, 24% anti-Reg Patients with positive protein autoantibodies were found. On the other hand, only two healthy people had antibody positives and the positive rate was 3% or less.
  • Anti-Reg protein autoantibodies were detected by the Western blot method in the same manner as in Example 1.
  • the reflection absorbance of the band generated by exposure of the X-ray film was measured by NIH image software in the same manner as in Example 1, and the average absorbance of one sample of the healthy subjects used in Example 1 was calculated as 1
  • the measured absorbance was expressed as the relative antibody titer of the anti-Reg protein autoantibody.
  • the distribution of relative antibody titers of anti-Reg protein autoantibodies in non-insulin-dependent diabetic patients and healthy subjects is shown in Table 3 and FIG.
  • Example 1 those having a relative antibody titer of 3 SD or more, that is, a relative antibody titer of 6.12 or more with respect to the average value of the relative antibody titers of the healthy subjects were defined as anti-Reg protein autoantibody positives.
  • Table 4 shows the number of positive and negative patients and the positive rate of non-insulin-dependent diabetic patients and healthy subjects. Only 2 healthy subjects had antibody-positive rate of 3% or less, whereas 55- and 15% of non-insulin-dependent diabetes patients had anti-Reg protein autoantibody-positive subjects. .
  • an autoimmune disease of the present invention it is possible to diagnose an autoimmune disease of unknown cause caused by the presence of an anti-Reg protein autoantibody.
  • the method for determining diabetes of the present invention it is possible to diagnose diabetes of unknown cause, which has been caused by the presence of an anti-Reg protein autoantibody.
  • the method for determining insulin-dependent diabetes mellitus of the present invention it is possible to diagnose insulin-dependent diabetes mellitus, which is caused by the presence of an anti-Reg protein autoantibody and whose cause is unknown until now.
  • the method for determining insulin-independent diabetes of the present invention it is possible to diagnose insulin-independent diabetes of unknown cause, which has been caused by the presence of anti-Reg protein autoantibodies.
  • an anti-Reg protein autoantibody of the present invention According to the method for detecting an anti-Reg protein autoantibody of the present invention, autoimmune diseases, glucoseuria, insulin-dependent diabetes mellitus and insulin-independence, which have been caused by the presence of the anti-Reg protein autoantibody, are unknown. A detection method that can be used for diagnosis of diabetes becomes possible.
  • the diagnostic reagent for an autoimmune disease of the present invention enables the diagnosis of an autoimmune disease of unknown cause caused by the presence of an anti-Reg protein autoantibody (diagnosis of diabetes described in the present invention). Reagent is based on the presence of anti-Reg protein autoantibodies.
  • the present invention enables the diagnosis of diabetes of unknown cause that has been caused until now.
  • INDUSTRIAL APPLICABILITY The diagnostic reagent for insulin-dependent diabetes of the present invention enables diagnosis of insulin-dependent diabetes of unknown cause, which has been caused by the presence of an anti-Reg protein autoantibody.
  • the diagnostic reagent for insulin-independent diabetes of the present invention enables diagnosis of insulin-independent diabetes of unknown origin, which has been caused by the presence of anti-Reg protein autoantibody.

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Description

明細書 自己免疫疾患の判定方法、 抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法及び自己免疫疾 患の診断用試薬 技術分野 本発明は、 自己免疫疾患、 糖尿病 （インスリ ン依存性糖尿病、 イ ンスリ ン非依 存性糖尿病など） の判定方法に関する。 また、 本発明は、 抗 R e gタンパク自己 抗体の検出方法、 自己免疫疾患、 糖尿病 （インスリ ン依存性糖尿病、 イ ンスリ ン 非依存性糖尿病など） の診断用試薬に関する。 背景技術 自己免疫疾患は、 免疫機構が正常に働かず、 自己の細胞や組織に対して液性あ るいは細胞性の免疫応答が生じ、 自己の細胞や組織に対して反応する自己抗体が 出現することにより引き起こされる疾患である。
自己抗体は、 自己の細胞や組織を攻撃し、 その機能に障害を起こすことにより、 自己免疫疾患を引き起こすことが知られている。 しかも、 自己抗体は、 自己免疫 疾患の発症前に、 患者の血清中に検出されることが近年報告されている。
すなわち、 自己抗体の検出は、 自己免疫疾患の発症を早期発見したり、 発症を 予知したり、 さらには病状の増悪の予知を可能とし、 それによつて、 自己免疫疾 患の早期の治療や予防的な治療を可能とする。
このような知見に基づき、 臨床検査において様々な自己抗原に対する自己抗体 が発見され、 自己抗原に対する自己抗体の測定が行われている。
例えば、 自己免疫性の糖尿病の場合は、 これまでに、 関連する自己抗体として. I slet cel l antibody (以下 I C Aと略す) 、 I slet cel l surface antibody (以下 I C S Aと略す） 、 抗イ ンスりン抗体、 抗グルタミン酸脱炭酸酵素抗体、 抗ガングリオシド抗体、 抗ゥシ乳アルブミン抗体、 抗滕サイ トケラチン抗体など が報告されている。 上記自己免疫性の糖尿病の中で、 1 〇八と 1 。 3八は、 イン ス リ ン依存性糖尿病 （Insulin- Dependent Diabetes Mellitus, 以下 I D DMと略 す） の発症時に高い頻度で患者血清中に検出される。 特に、 I CAは、 I DDM を発症する以前の患者血清中からも検出され、 I D DMの発症を予知するマーカ 一として知られている。
以上のように、 I DDMに関しては、 自己免疫的機序で発症する自己免疫性の 糖尿病が多いと考えられているが、 明確な自己抗体が検出されない患者も報告さ れている。
それに対し、 イ ンス リ ン非依存性糖尿病 （Non-Insulin-Dependent Diabetes M ellitus, 以下 N I D DMと略す） に関しては、 例えば、 I CAの I D DM患者に おけるの存在率は 40 %以上であるのに対し、 N I D DM患者では約 3 %に満た ない 「小林ら、 ダイアビーテイス、 35卷、 335-340頁（1986) (Kobayashi T et al.， Diabetes, Vol.35, 335-340(1986)) 」 とされている。 このように、 I DDMで 陽性率の高い自己抗体でも、 N I DDMでは、 陽性率が低く、 N I DDMの診断 指標として有効な自己抗体は報告されていない。
一方、 R e g (regeneration gene) タンパクは、 脬臓を 90 %程度切除したラ 'ソ トにニコチン酸アミ ドを投与することにより、 ランゲルハンス島の再生がされ る際に、 顕著に発現が認められる遺伝子から発見されたタンパクである 「寺園ら、 ジャーナル · ォブ . バイオロジカル · ケミス ト リー、 263巻、 2111-2114,(1988) (Journal of Biological Chemistry, 263: 2111-2114, (1988) j 。
R e gタンパクは、 ヒト、 ラ ヅ 卜、 マウス、 ゥシ及びハムスター等から発見さ れ、 現在では一次構造の相同性と、 7又は 5アミノ酸残基の挿入配列の有無から、 R e g l、 R e gll及び R e g II Iの三種類のサブタィプに分類されている。
R e gタンパクは、 上記ランゲルハンス島細胞だけでなく、 肝臓、 腸、 脬臓の ガン細胞や小腸の粘膜にも見出され、 さらに、 神経の再生時、 胃壁の再生時及び 脬炎の発症時などに存在していることが報告されており、 広く体内臓器の再生 · 増殖に関与していると考えられている。
しかしながら、 これまでに、 R e gタンパクに対する自己抗体の存在、 それに より引き起こされる自己免疫疾患については、 全く報告されていない。 発明の開示 本発明の課題の一つは、 自己免疫疾患の判定方法を提供することである。 詳し くは、 糖尿病の判定方法、 より詳しくはインスリン依存性糖尿病及びイ ンスリン 非依存性糖尿病の判定方法を提供することである。
また、 本発明の他の課題は、 自己免疫疾患の診断に用いることのできる抗体の 検出方法を提供することである。
本発明のさらなる課題は、 自己免疫疾患の診断用試薬を提供することである。 詳しくは糖尿病の診断用試薬、 より詳しくはイ ンスリン依存性糖尿病及びィンス リン非依存性糖尿病の診断用試薬を提供することである。 本発明は、 下記 （ 1 ) 〜 （ 24 ) に関する。
( 1 ) 検体中の抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することを特徴とする自 己免疫疾患の判定方法。
( 2 ) 検体中の抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することを特徴とする糖 尿病の判定方法。
(3 ) 検体中の抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することを特徴とするィ ンス リ ン依存性糖尿病の判定方法。
(4 ) 検体中の抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することを特徴とするィ ンスリン非依存性糖尿病の判定方法。
(5 ) 検体と抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分とを接触 させ、 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に抗 R e gタンパク自己抗体と結合し うる抗原成分との反応の結果生じる免疫複合体の形成を検出することを特徴とす る抗 R e g夕ンパク自己抗体の検出方法。
( 6 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クである上記 （5 ) 記載の抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法。
(7 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クの一部である上記 （ 5 ) 記載の抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法。
(8 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合成 された R e gタンパクである上記 （ 6 ) 又は （ 7 ) に記載の抗 R e gタンパク自 己抗体の検出方法。
(9 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分を含有してなる 自己免疫疾患の診断用試薬。
( 1 0 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタン パクである上記 （ 9 ) 記載の自己免疫疾患の診断用試薬。
( 1 1 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタン パクの一部である上記 （ 9 ) 記載の自己免疫疾患の診断用試薬。
( 1 2 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合 成された R e gタンパクである上記 （ 1 0 ) 又は （ 1 1 ) に記載の自己免疫疾患 の診断用試薬。
( 1 3) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分を含有してな る糖尿病の診断用試薬。
( 14) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタン パクである上記 （ 1 3 ) 記載の糖尿病の診断用試薬。
( 1 5 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタン パクの一部である上記 （ 1 3 ) 記載の糖尿病の診断用試薬。
( 1 6 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合 成された R e gタンパクである上記 （ 1 4 ) 又は （ 1 5 ) に記載の糖尿病の診断 用試薬。
( 1 7 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分を含有してな るインスリン依存性糖尿病の診断用試薬。
( 1 8 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタン パクである上記 （ 1 7 ) 記載のィンスリン依存性糖尿病の診断用試薬。
( 1 9 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタン パクの一部である上記 （ 1 7 ) 記載のィンスリン依存性糖尿病の診断用試薬。
( 2 0 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合 成された R e gタンパクである上記 （ 1 8 ) 又は （ 1 9 ) に記載のィンスリン依 存性糖尿病の診断用試薬。 ( 2 1 ) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分を含有してな るイ ンスリン非依存性糖尿病の診断用試薬。
( 22) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタン パクである上記 （ 2 1 ) 記載のィンスリン非依存性糖尿病の診断用試薬。
( 23) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタン パクの一部である上記 （ 2 1 ) 記載のィンスリン非依存性糖尿病の診断用試薬。
(24) 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合 成された R e gタンパクである上記 （ 22 ) 又は （ 23 ) に記載のィンスリン非 依存性糖尿病の診断用試薬。 本発明における自己免疫疾患の判定方法は、 検体中の抗 R e gタンパク自己抗 体の存在を検出することにより、 抗 R e gタンパク自己抗体によって引き起こさ れる自己免疫疾患を診断したり、 予知したりするものである。
抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することにより診断したり、 予知した りできる自己免疫疾患としては、 抗 R e gタンパク自己抗体が存在することによ り引き起こされる疾患であれば特に制限されるものではないが、 例えば、 糖尿病、 インスリ ン依存性糖尿病、 イ ンスリ ン非依存性糖尿病、 肝ガン、 大腸ガン、 小腸 ガン、 滕炎、 胃潰瘍及びアルツハイマー病などが挙げられ、 上記の中では、 陽性 率が高いなどの点から糖尿病が好ましく、 インスリン依存性糖尿病及びィンスリ ン非依存性糖尿病がより好ましい。
本発明において、 検出すべき抗 R e gタンパク自己抗体としては、 R e gタン パクに反応する抗体であれば特に制限されるものではないが、 例えば、 R e g夕 ンパクに反応する I g G抗体、 I gM抗体、 I gA抗体、 I gD抗体及び I gE 抗体などのクラスが挙げられる。 上記 R e g夕ンパクに反応する抗体のクラスの 中では、 自己免疫疾患の患者に多く見出される観点から I g G抗体、 I gM抗体 を検出することが好ましい。
なお、 本発明において、 検出する抗 R e gタンパク自己抗体としては、 上記抗 体のクラス中の 1種又は 2種以上を組み合わせて検出してもよい。
本発明において、 使用する検体としては、 抗 R e gタンパク自己抗体が存在す る可能性のある検体であれば特に制限されるものではないが、 例えば、 血液、 血 清、 血漿、 尿及び髄液などの体液、 ランゲルハンス島細胞、 滕臓、 滕外分泌腺、 神経細胞及び各種ガン細胞などの組織が挙げられる。 上記検体の中では、 検体の 入手の容易性の観点から、 血液、 血清、 血漿及び尿が好ましい。
本発明の抗 R e g夕ンパク自己抗体の検出方法において、 使用する抗原成分と しては、 特異的に抗 R e gタンパク自己抗体と結合しうる成分であれば特に制限 されるものではないが、 特異性の観点から、 R e gタンパクであることが好まし く、 R e gタンパクの一部であることがより好ましい。 また、 品質の安定した R e gタンパクが得られる観点から、 遺伝子組換え法や化学合成法などの方法によ り人工的に合成された R e gタンパクであることが好ましい。
R e gタンパクとしては、 R e g遺伝子ファミ リ一として報告されている遺伝 子 「海野ら、 日本臨床 55巻、 817- 821頁（1997)」 、 「米倉ら、 フラッ ト他編集、 フ ロンティア一ズ ' ォブ ' イ ンス リ ン ' セクレシヨン · アン ド ' ノ ンクレアティ ヅ ク . ビーセル . リサーチ、 スミス—ゴールデン、 ロン ドン、 581-588頁 （Yonekur a H, et al, In: Flatt PR et al . (eds) Frontiers of Insulin Secretion and Pancreatic B - Cell Research. Smith-Golden, London, pp581 - 588)」 、 「宫下ら. エフィービーエス · レター、 377卷、 429-433頁（ 1995) (Miyashita H et al., FE BS Letter Vol.377, p.429-433( 1995 )) 」 の産物である R e gタンパクであれば 特に制限されないが、 例えば、 ヒ トの R e g lひ、 R e g I 5、 H I P (a ge ne expressed m hepatocellular carcinoma, intestine, pancreas) 、 PAP (the gene for pancreatitis associated protein) 、 R S (Reg-related sequ ence) 、 ラッ トの R e g l、 PAP I、 II、 III、 マウスの R e g l、 II 、 IIIひ . ΙΙΙ ？ IIIァ、 ΙΙΙά、 ノヽムス夕一の I NGAP (islet neogenesis associated protein) 、 ゥシの P TP (Pancreatic Thread Protein) などが挙げられる。 ヒ ト R e gタンパクについては、 「寺園ら、 ジャーナル ' ォブ ' バイオロジカ ル ' ケミス ト リ一、 263卷、 2111- 2114頁（1988) (Journal of Biological Chemi stry, Vol.263, 2111-2114(1988)) 」 、 「森泉ら、 バイオケミカ · ェ ·バイオフ イジ力 ·ァクタ、 1217卷、 199-202頁（1994) (Moriizumi S et al. , Biochimica et Biophysica Acta, Vol.1217, 199-202(1994)) 」 、 「ラッセ一ルら、 キャンサ — · リサーチ、 52卷、 5089-5095頁、 （1992) (Lasserre C et al .， Cancer Resea rch， Vol.52, 5089- 5095(1992)) 」 、 「ラッセ一ルら、 ョ一口ビアン ' ジャーナ ル . ォブ .バイオケミス トリ一、 224卷、 29-38頁（1994) (Lasserre C et al., E uropean Journal of Biochemistry, Vol.224, 29-38(1994)) 」 などに配列等が詳 しく記載されている。
上記 R e gタンパクは、 検出対象とする自己免疫疾患の種類に応じて適宜選択 できるが、 抗 R e gタンパク自己抗体の検出の特異性の観点から、 障害を起こし ている臓器に存在する R e gタンパクであることが好ましく、 例えば、 糖尿病、 インスリン依存性糖尿病及びィンスリン非依存性糖尿病が診断対象となる疾患で ある場合は、 ヒ ト R e g l ひタンパクであることが好ましい。
また、 本発明の抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法において、 使用する抗原 成分としては、 抗 R e gタンパク自己抗体に対する検出感度及び検出の特異性、 診断用試薬として長期間保存したときの抗原活性の安定性の観点から、 上記 R e gタンパクを周知の酵素学的手法又は遺伝子組換え的手法によって断片化した R e gタンパク、 上記 R e gタンパクを周知の酵素学的又は遺伝子組換え的手法に よって一部改変した R e タンパクが使用できる。
なお、 本発明において、 抗 R e gタンパク自己抗体の検出に使用する抗 R e g タンパクとしては、 上記 R e gタンパクの 1種又は 2種以上を組み合わせて使用 してもよい。
本発明において、 上記 R e gタンパクを製造する方法は、 特に制限されないが、 例えば、 遺伝子組換え法や化学的合成法などの方法により人工的により製造した り、 臓器、 体液及び分泌液などから精製することにより製造することができる。 遺伝子組換え法により、 R e gタンパクを製造する方法としては、 例えば、 前 記の R e gタンパクをコードする DN Aをべクタ一に挿入して組換えベクターを 作製し、 それを宿主に挿入して形質転換体を作製し、 その形質転換体を培養し、 その形質転換体自体又は培養上清を利用する方法が挙げられる。
組換えべクタ一に挿入する R e gタンパクをコードする D N Aは、 前記 R e g タンパクの全長をコードする D NAでもよく、 その一部をコードする DNAであ つてもよい。 組換えべクタ一は、 前記の R e gタンパクをコードする D N Aを、 周知の方法 に従って宿主細胞の中で複製可能なブラスミ ドベクタ一やファージベクター等に 挿入して作製することができる。 その際、 必要に応じ、 リンカ一を使用すること もできる。
ブラスミ ドベクターとしては、 作製する組換えべクタ一を保有する形質転換体 を容易にスクリーニングでき、 また、 宿主細胞の中で組換えベクターを安定に保 持させる点から、 カナマイシン耐性遺伝子、 アンピシリン耐性遺伝子等の薬剤耐 性遺伝子を保有するものであることが好ましい。
プラスミ ドベクターの具体例としては、 プラスミ ド p P I C 3. 5 K、 ρ Ρ I C 9 K：、 p A 08 1 5 , p YX 0 1 1、 pYX l l l、 pUC 1 1 8、 p U B 1 1 0等が挙げられる。 p P I C 3. 5 K、 pP I C 9 K、 pA08 1 5はフナコ シ株式会社より、 ρΥΧ 0 1 1、 ρ ΥΧ 1 1 1はコスモ ·バイオ株式会社より、 pUC 1 1 8、 pUB l l 0は宝酒造株式会社から購入することができる。
ファージベクタ一の具体例としては、 人 gt 1 1ファージ、 入 g t 1 0ファー ジ等が挙げられる。 人 g t 1 1ファージ、 L g t 1 0ファージはフナコシ株式会 社から購入することができる。 いずれも、 使用した親ベクターに対応する組換え ベクターが得られる。
組換えブラスミ ド作製の一般的手法は、 「モレキュラー ' クローニング、 サム プロック他編集、 第 2版 （コールド · スブリング · ハーバ一 · ラボラ トリー） （1 989年) (J.Samblook et al . , Molecular Cloning 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)、 以下、 本文献を文献 " モレキュラー ' クローニング " という） 」 に記載されている。
形質転換体は、 前記組換えブラスミ ドを宿主に挿入して作製することができる。 宿主としては、 組換えプラスミ ド中の R e gタンパク DN Aが発現するもので あれば特に制限されるものではなく、 例えば、 サヅカロミセス ·セレビジェ （Sa ccharomyces cerevisiae) 、 ビシァ - ノ ス 卜リス (Pichia pastoris) などの酵母 菌、 ェシエリシァ ' コーラィ （Escherichia coli) などのェシエリシァ属細菌、 バチルス ' サチルス （Bacillus subtilis) などのバチルス属細菌が挙げられる。 組換えプラスミ ドを宿主に挿入する方法としては、 例えば、 宿主細胞をスフエ ロブラス ト （Spheroplast) 又はプロ トプラス ト （Protoplast) とした後、 電気パ ルス （Electroporation) 法、 塩化カルシウム法、 ト リスー P E G (Tris-PEG ) 法等の方法により組換えプラスミ ドを挿入する方法が挙げられ、 宿主の種類によ つて適宜選択される。
組換えブラスミ ドを利用して形質転換体を作製する一般的手法は、 文献〃 モレ キユラ— . クロ—ニング〃 等に詳細に記載されている。 また、 組換えプラスミ ド を利用して形質転換体を作製することを目的として、 種々のキッ トが市販されて おり、 例えば、 酵母菌のビシァ 'パス ト リスを用いたキッ トがフナコシ株式会社 より市販 （カタ口グ番号 ： I V— 1 7 5 0— 0 1、 製造元： インビトロゲン社 (Invitrogen Corp.) ) されており、 本キッ ト添付の取扱説明書に従って操作す ることにより、 形質転換体を作製することもできる。
また、 R e gタンパクを形質転換体を用いて製造するための形質転換体の具体 例としては、 ヒト RE G Iひ c D N Aが挿入されたベクターを有する組換え酵 母菌ビシァ ' パス ト リス GS 1 1 5株 （Human R E G I «— 1 3 ) が挙 げられる。 GS 1 1 5株 （Human REG Iひ一 1 3 ) は、 1 9 99年 4月 5日に工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305-8566 日本国茨城県つく ば巿東一丁目 1番 3 ) に受託番号 F E RM P— 1 7 3 58として寄託され、 2 00 0年 3月 30日にブダぺス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 F E RM BP— 7 1 1 1の受託番号が付与されている。
形質転換体の培養は、 例えば、 その形質転換体が成長できる培地に形質転換体 を入れ、 適温で振とう又は静置する方法が使用できる。
培地としては、 炭素源及び窒素源が含有されるものが使用できる。 炭素源とし ては、 例えば、 糖、 アルコール及び有機酸等が挙げられ、 糖としては、 例えば、 グルコース、 澱粉、 デキス トロ一ス、 糖蜜等が挙げられ、 アルコールとしてはメ 夕ノール、 エタノール、 グリセロール等が挙げられ、 有機酸としてはクェン酸、 マロン酸等が挙げられる。 窒素源としては、 例えば、 有機窒素源、 無機窒素源等 が挙げられ、 有機窒素源としては、 例えば、 ペプトン、 カゼイン、 ポリペプトン、 パク ト . トリプトン、 肉エキス、 酵母エキス、 カザミノ酸、 グリシン等が挙げら れ、 無機窒素源としては、 例えば、 硫酸アンモニゥム、 硝酸アンモニゥム等が挙 げられる。
また、 形質転換体が栄養要求性を示す場合は、 その生育に必要な栄養物質を培 地に添加する。 このような栄養物質としては、 例えば、 アミノ酸、 ビタミン類、 核酸、 塩類等が挙げられる。
培地としては、 例えば、 アルコールと有機窒素源を主体とする合成培地を使用 することができる。
培地として固体培地を使用する場合は、 さらに寒天を添加する。
また、 組換えプラス ミ ドを安定に保持させ、 組換えブラスミ ドを保有しない株 の成育を抑制する点から、 培地に抗生物質を添加することもできる。 このような 抗生物質としては、 例えば、 ペニシリ ン、 エリスロマイシン、 カナマイシン、 ネ ォマイシン、 クロラムフエニコ一ル、 ノ シ トラシン、 D—サイクロセリ ン、 アン ビシリン等が挙げられる。
さらに、 必要により、 消泡剤として、 大豆油、 ラード油及び各種界面活性剤等 を培地に添加してもよい。
培地の pHは、 形質転換体が生育可能な点から、 通常、 4〜 9であり、 宿主とし て酵母菌のビシァ 'パス ト リスを使用する場合は、 5 . 0〜 7 . 0であることが 好ましい。
培養温度は、 例えば、 通常、 1 5〜 4 2 °Cであり、 2 4〜 3 7 °Cとすることが 好ましい。
培養時間は、 宿主の種類、 培地の物理的状態 （固体又は液体） 、 培養装置、 培 養温度等によって異なるが、 例えば、 宿主として酵母菌のビシァ · パス トリスを 使用し、 培養温度が 1 5〜 4 2 °Cである場合、 培養時間は、 通常、 1 2〜 9 6時 間であり、 6 0〜 8 4時間とすることが好ましい。
上記のように R e gタンパクをコ一ドする遺伝子を導入した形質転換体を培養 し、 培養後の培養液及び形質転換体からなる培養物中に R e gタンパクを生成蓄 積させ、 この培養物を取得し、 培養物から目的の R e gタンパクを精製すること ができる。
例えば、 宿主内で得られる R e g夕ンパクがシグナル配列と R e g夕ンパクの ァミノ酸配列との融合されたタンパク質となっている場合は、 形質転換体のシグ ナルぺプチダーゼにより融合夕ンパク質からシグナル配列が除去され、 R e g夕 ンパクが形質転換体から分泌されるので、 形質転換体の培養後の培養物として、 培養上清を取得し、 その培養上清から R e g夕ンパクを精製する簡便な方法を使 用することが好ましい。
また、 培養した形質転換体を培養物として取得し、 破砕又は溶解して破砕液又 は溶解液とし、 その破碎液又は溶解液から R e gタンパクを精製する方法が挙げ られる。
なお、 培養物として、 培養液及び培養した形質転換体からの精製方法を併用し、 目的の R e gタンパクの収率を向上することもできる。
形質転換体を破砕する方法としては、 例えば、 形質転換体を物理的に破砕する 方法が挙げられ、 例えば、 形質転換体を緩衝液に懸濁してこれに超音波を照射す る方法、 形質転換体を石英砂と混練し、 これを緩衝液に懸濁する方法等挙げられ る。 一方、 形質転換体を溶解する方法としては、 例えば、 形質転換体の細胞壁を 溶解する酵素と界面活性剤等で形質転換体を溶解する方法が挙げられ、 形質転換 体の宿主が大腸菌の場合は、 この酵素としてリゾチームを、 界面活性剤としてド デシル硫酸ナトリウム （以下 S D Sと略す） を使用することができる。
得られた破砕液又は溶解液から目的の R e gタンパクを精製する方法としては、 例えば、 前記破砕液又は溶解液を遠心分離して細胞残渣を除去し、 上清を取得し、 R e g夕ンパクが沈殿しない濃度の亜硫酸アンモニゥムを添加して撹拌し、 遠心 分離し、 これにより沈殿物を除去し、 上清を取得し、 この上清にさらに R e g夕 ンパクが沈殿する濃度の硫酸アンモニゥムを添加して撹拌し、 遠心分離して沈殿 を取得する方法を使用することができる。 なお、 最後の遠心分離においては、 目 的の R e g夕ンパクが上清に含まれていることもあるので、 サンプリングして、 上清と沈殿の画分における R e gタンパクの有無を確認することが好ましい。 また、 形質転換体の培養後の培養上清から、 目的の R e gタンパクを精製する方 法としては、 例えば、 培養液を遠心分離操作により菌体を沈殿として取り除いた 後、 酢酸を添加することにより上清の pHを 3 . 5に調製してイオン交換カラムに 添加し、 R e gタンパクを吸着させ、 酢酸ナト リウム緩衝液で洗浄後、 1 MのN a C 1を含む酢酸ナト リゥム緩衝液をカラムに添加して溶出し、 R e gタンパク を得る方法が挙げられる。
なお、 形質転換体培養後の破砕液、 溶解液又は上清から、 目的の R e gタンパ クを精製する上記以外の方法としては、 塩析法、 エタノール沈殿法、 ゲル濾過法、 ァフィ二ティーク口マトグラム法、 疎水ク口マトグラム法等で分画して精製する 方法が挙げられ、 上記精製方法を単独で又は組合わせて使用してもよい。 上記夕 ンパク精製方法は、 文献" モレキュラー ' クロ一ニング" や、 「蛋白質 '酵素の 基礎実験法 改訂第 2版、 梶尾武一編、 南江堂（1994)」 等に詳細に記載されてい る。
遺伝子組換え法を用いる R e gタンパクの具体的な製造例としては、 特開平 1 - 1 3 7 9 9 4号公報、 特開平 6— 2 9 9 6 3号公報に記載の方法に従い R e g タンパクを製造することもできる。
化学合成法により R e gタンパクを製造する方法としては、 前記 R e gタンパ クの一部のアミノ酸配列の連続した 1 0から 3 0の配列を周知のぺプチド合成法 により合成することができる。 ペプチド合成法としては、 例えば、 不溶性の高分 子担体上でぺブチド鎖を C末端から伸長していく固相法又は担体を用いない液相 法が挙げられる。 上記固相法による、 ペプチド合成は、 市販のペプチド合成機を 使用して合成することができる。 また、 上記のようにして合成されたペプチド鎖 の 1種又は 2種以上を連結することによりタンパクとすることもできる。
臓器、 体液、 分泌液から R e gタンパクを精製して R e gタンパクを製造する 方法において、 原料として使用する臓器、 体液、 分泌液は、 R e gタンパクが存 在していれば特に制限されないが、 例えば、 脬臓、 ランゲルハンス島細胞、 滕外 分泌腺、 神経細胞及び肝ガン、 大腸ガン、 小腸ガン等のガン細胞などが挙げられ る。
臓器から破砕液、 溶解液を得る方法としては、 前記形質転換体を破砕、 溶解す る方法において記載した方法を使用することができる。
臓器、 体液、 分泌液から R e gタンパク精製する方法としては、 前記形質転換 体から R e gタンパクを製造する方法において記載した精製方法を使用すること ができる。
さらに具体的な R e gタンパクの精製法としては、 「ガイークロッテら、 バイ オケミカル · アン ド · バイオフィジカル · リサーチ · コ ミュニケーションズ、 12 5巻、 516 - 523頁 ( 1984) (Guy-Crotte et al . , Biochemical and Biophysical Rese arch Communications, Vol.125, 516-523(1984)) 」 、 「デ ' カロら、 ョ一口ビア ン · ジャーナル ' ォブ . バイオケミス ト リ一、 168卷、 201-207頁（1987) (De Car o AM et al., European Journal of Biochemistry, Vol.168, 201-207(1987)) 」 、
「デ · カロら、 バイオケミカ ' ェ *バイオフイジ力 · ァク夕、 994卷、 281-284頁 (1989) (De Caro AM et al., Biochimica et Biophysica Acta, Vol.994, 281-2 84(1989)) 」 などに記載の方法が挙げられる。
本発明において、 抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法としては、 検体と特異 的に抗 R e gタンパク自己抗体と結合しうる抗原成分とを接触させ、 抗 R e g夕 ンパク自己抗体と特異的に抗 R e gタンパク自己抗体と結合しうる抗原成分との 反応の結果生じる免疫複合体の形成を検出すれば、 特に制限されないが、 例えば、 ウエスタンプロッ ト法、 各種標識物を利用した免疫測定法、 ラテックス担体粒子 を用いたラテックス凝集法等が挙げられる。
各種標識物を利用した免疫測定法としては、 例えば放射免疫測定法 （ラジオィ ムノアツセィ、 R I A) 、 免疫蛍光測定法 （蛍光ィムノアツセィ、 F I A) 、 免 疫発光アツセィ （ルミネセン ト · アツセィ） 、 酵素免疫測定法 （E L I S A法） 、 ィムノクロマト法などが挙げられる。
ウエスタンプロッ ト法を用いて抗 R e gタンパク自己抗体を検出する方法とし ては、 例えば、 前記 R e gタンパクを電気泳動によって分離し、 多孔質膜へ転写 して転写後の多孔質膜 （以後、 転写膜という） を検体との非特異的反応を抑制す るためにブロッキングし、 この転写膜を検体と接触させて一定時間保持し、 これ により、 検体中に抗 R e gタンパク自己抗体が存在する場合にはその抗体を前記 転写膜上に固定化された抗原と結合させて免疫複合体を形成させ、 必要により洗 浄し、 次いで抗 R e gタンパク自己抗体に結合できる標識 2次抗体を接触させる
(場合により、 検体と標識 2次抗体を同時に接触させてもよい） 方法を使用する ことができる。
前記免疫複合体が形成されていると、 これにさらに標識 2次抗体が結合し、 標 識 2次抗体も転写膜上に固定化されることになる。 その後、 転写膜に結合した標 識 2次抗体の標識物量を標識物に応じた測定方法により測定し、 その値から検体 中における抗 R e gタンパク自己抗体の存在又はその量を求めることができる。 抗 R e gタンパク自己抗体の存在又はその量を表現する方法としては、 例えば、 抗 R e gタンパク自己抗体を含まない検体、 既知量の抗 R e gタンパク自己抗体 を含む検体などを、 被検体と同時に測定し、 これと被検体の値を比較することで その標準値に換算された値として抗 R e タンパク自己抗体の抗体価を表現する 方法が挙げられる。
なお、 本発明において、 「測定」 は定量的又は半定量的な検出だけでなく、 定 性的な検出も意味する。
R e gタンパクを電気泳動する方法としては、 例えば、 S D Sポリアクリルァ ミ ド電気泳動、 ネイティブ · ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、 ゲル等電点電気 泳動等など周知の各種電気泳動法が挙げられるが、 蛋白質を分子量により分離で きる分離能の観点と、 転写時の効率の観点から、 S D Sポリアクリルアミ ド電気 泳動が好ましい。
次に、 ゲルから、 電気泳動で分離されたタンパク分子を多孔質膜へ転写する転 写方法として、 例えば、 周知の毛管現象を利用する方法 （毛管法） 、 自然の拡散 力を利用する方法 （拡散法） 及び電気泳動を利用する方法 （電気泳動法） 等が利 用可能だが、 操作時間と検出における定量性と再現性の観点から電気泳動法が好 ましい。
多孔質膜としては、 ニトロセルロース膜、 ポリビニリデンジフルオライ ド （P V D F ) 膜等、 ゥ Iスタンブロッ ト法に用いられる周知のものが利用可能である が、 転写の際のタンパクに対する高い結合容量の観点から、 P V D F膜が好まし い。
転写膜に対するブロッキング材としては、 例えば、 ノンフアッ ト ミルク溶液等 のカゼイン系物質溶液、 ゼラチン系物質溶液、 牛血清アルブミン （B S A ) 系物 質溶液などウエスタンプロッ ト法に用いられる周知の溶液を利用できる。
検体は、 そのまま転写膜に対し反応させてもよいが、 抗体価が高い場合には希 釈することもできる。 希釈した検体を使用する場合、 希釈液としてはリン酸緩衝 化生理食塩水 （phosphate buffer sal ine, 以下 P B Sと略す） 、 リン酸緩衝液な どウエスタンプロッ ト法に用いられる周知の溶液を利用可能であるが、 非特異的 吸着を低下させる観点からブロッキングと同じ溶液を用いることが好ましい。 検体との反応後の洗浄操作において、 利用する洗浄液は、 ウェスタンプロッ ト 法に用いられる周知の洗浄液が応用可能で、 例えば、 P B S、 リン酸緩衝液など が挙げられる。 さらにこれら緩衝液にツイ一ン 2 0 (T we e n 20 ) 等の非ィ オン性界面活性剤を 0. 0 5— 5重量％の濃度で含む溶液を用いてもよい。
抗 R e gタンパク自己抗体と抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる 抗原成分の反応の結果生じる免疫複合体の形成を検出するために用いる標識 2次 抗体としては、 転写膜上の抗 R e gタンパク自己抗体に結合しうる標識した 2次 抗体であれば特に制限されないが、 検体中の自己抗体に対する抗体を各種標識物 質で標識したものが挙げられる。 標識される抗体としては、 例えば、 抗 I gG抗 体、 抗 I gM抗体、 抗 I gA抗体、 抗 I g E抗体等又はこれらの部分分解物 （F (ab，）2、 F ab等） 等が挙げられ、 自己抗体にそれそれ特異的な 2次抗体を単 独で、 又は組合わせて用いることができる。 また、 2次抗体はポリクロ一ナル抗 体、 モノクローナル抗体どちらでも利用できるが、 感度の観点から、 ポリクロ一 ナル抗体が好ましい。 さらに、 抗体分子をリガンドとしたァフィ二ティー精製法 によって精製されたものが感度の観点からより好ましい。
2次抗体の標識に用いる標識物質としては、 例えば酵素、 放射性同位元素 （R I ) 等が利用できる。 酵素としては、 例えば、 マレートデヒ ドロゲナ一ゼ （酵素 番号 1.1.1.37) 、 グルコース一 6—リン酸脱水素酵素 （酵素番号 1.1.1.49) 、 グ ルコ一スォキシダ一ゼ （酵素番号 1.1.3.4) 、 西洋ヮサビバーオキシダ一ゼ （酵素 番号 1.11.1.7) 、 アセチルコ リ ンエステラーゼ （酵素番号 3.1.1.7) 、 アルカリフ ォスファタ一ゼ （酵素番号 3.1.3.1) 、 グルコアミラーゼ （酵素番号 3.2.1.3) 、 リゾチーム （酵素番号 3.2.1.17) 、 ?—ガラク トシダ一ゼ （酵素番号 3.2.1.23) などが挙げられる。 中でも、 西洋ヮサビパーォキシダーゼ標識が、 基質に過酸化 水素を用いてルミノールを発光させ X線フィルムに感光させて検出する高感度の 系を利用できる観点から好ましい。
また、 酵素の代わりに、 2次抗体に R Iを結合させておき、 R I活性のシグナ ルを得ることも可能である。 2次抗体と転写膜を反応させる際の溶液としては、 ブロッキング溶液、 P B S、 ト リス緩衝液等、 ゥヱスタンプロッ ト法に用いられ る周知のものが利用可能である。 2次抗体との反応後の洗浄操作には、 上述の各 種洗浄液が利用可能である。
各種標識物を利用した免疫測定法を用いて抗 R e gタンパク自己抗体を検出す る方法としては、 例えば、 前記 R e gタンパクを物理的又は化学的に担体に固定 化して固定化抗原を作製し、 この固定化抗原を検体と接触させて一定時間保温し、 これにより、 検体中に抗 R e gタンパク自己抗体が存在する場合にはその抗体を 前記固定化抗原と結合させて免疫複合体を担体上に形成させ、 必要により洗浄し、 次いで検体中の前記抗体に対する標識 2次抗体を接触させる （場合により、 検体 と標識 2次抗体を同時に接触させてもよい） 方法を使用することができる。
前記免疫複合体が形成されていると、 これにさらに標識 2次抗体が結合し、 標 識 2次抗体も担体上に固定化されることになる。 その後、 担体上に結合した標識 2次抗体又は結合しない標識 2次抗体上の標識物量を標識物に応じた測定方法に より測定し、 その値から検体中における抗 R e gタンパク自己抗体の存在又はそ の量を求めることができる。
担体としては、 抗原を固定することができるものであれば特に制限されるもの ではないが、 例えば、 ポリスチレン、 塩化ビニール等のプラスチヅク材料、 セル ロース、 ニトロセルロース、 ナイロン等の繊維材料、 ガラス、 シリカゲル等の無 機材料、 赤血球、 リポソ一ム、 P D V Fなどを用いることができ、 その形状は、 マイクロタイ夕一プレート、 ビーズ、 磁性ビーズ、 ペーパーディスク、 膜、 糸な どのあらゆる形が可能であるが、 簡便である点からポリスチレン製のビーズ又は マイクロタイタ一プレートを使用することが好ましく、 ポリスチレン製のマイク ロタイタ一プレートがより好ましい。
前記 R e gタンパクを物理的に担体に固定化する方法としては、 例えば、 前記 R e gタンパク含有溶液を担体と接触させ、 低温 （例えば、 4 °C ) で一晩放置す る方法を使用することができる。
前記 R e gタンパクを化学的に担体に固定する方法としては、 例えば、 前記 R e gタンパクと表面にカルボキシル基を有する担体及びカルポジィ ミ ドを混合し て放置する方法等を利用することができる。 検体中の他の抗体等が担体に非特異的に結合するのを防止する観点から、 検体 の添加前に、 ノンフアツ ト ミルク、 牛血清アルブミン （ B S A ) 等で担体の表面 をブロッキングすることが好ましい。
洗浄液としては、 例えば、 界面活性剤を含むト リス又はリン酸緩衝液等を利用 することができる。
使用する標識 2次抗体において、 標識される抗体としては、 ゥヱスタンブロッ ト法において例示した抗体を使用することができる。
2次抗体の標識に使用する標識物質としては、 ウエスタンブロヅ ト法において 例示した標識物質に加えて、 フルォレセイン （Fluorescine) 等の蛍光物質ゃ金コ ロイ ド等の金属コロイ ド、 セレニウムコロイ ド等の非金属コロイ ド、 着色樹脂微 粒子、 着色リポソ一ム染料微粒子等の着色微粒子なども使用できる。
これらの標識物質の中では、 感度、 安全性、 簡便性等の点から、 酵素を用いる ことが好ましい。 酵素標識抗体としては、 簡易で高感度な測定が可能である点か ら、 アル力リフォスファターゼ標識抗体又は西洋ヮサビパーォキシダ一ゼ標識抗 体を用いることが好ましく、 これらの酵素標識抗体は市販されている。
なお、 抗体と標識物を結合させるために、 抗体と標識物の間にピオチン （Biot in) 、 アビジン （Avidin) 、 ス ト レブトァビジン （ Streptoavidin) 、 ディゴキシ ゲニン （Digoxigenin) 等の化学物質を介在させてもよい。
ラテックス凝集法を利用して抗 R e gタンパク自己抗体を検出する方法として は、 例えば、 特異的に抗 R e gタンパク自己抗体と結合しうる抗原成分を物理的 又は化学的にラテックス粒子 （担体） に固定化して固定化抗原を作製し、 上記固 定化抗原と検体とを接触させて一定時間保温し、 検体と固定化抗原の混合溶液の 濁度を測定する方法が挙げられる。 固定化抗原を検体と接触させることにより、 検体中に抗 R e gタンパク自己抗体が存在する場合は、 抗原抗体反応による免疫 複合体が形成され、 その際、 抗体分子には抗原と結合する部分が 2箇所存在する ため、 抗体分子が架橋剤として機能することにより、 凝集反応が発生する。 この 反応により、 検体と固定化抗原の混合溶液の濁度が増加するので、 この濁度を目 視により又は吸収光度計を用いて測定する。
なお、 ラテックス凝集法のラテックス粒子の代わりに、 赤血球やリボソーム等 の他の各種微粒子を使用することもできる。
本発明において、 自己免疫疾患、 糖尿病、 インスリン依存性糖尿病及びインス リン非依存性糖尿病の診断用試薬としては、 抗 R e gタンパク自己抗体の検出方 法により、 試薬の構成は異なるが、 前記に例示した抗 R e gタンパク自己抗体の 検出方法の構成試薬として、 特異的に抗 R e gタンパク自己抗体と結合しうる抗 原成分を主要な有効成分として含有していれば特に制限されない。
特異的に抗 R e gタンパク自己抗体と結合しうる抗原成分としては、 前記の抗 R e g夕ンパク自己抗体の検出方法に例示した抗原成分が使用できる。
本発明の診断用試薬の構成としては、 例えば、 ウエスタンプロ 'ソ ト法を利用し た診断用試薬においては、 例えば、 S D Sポリアクリルアミ ド電気泳動用に調製 された R e gタンパク試薬と、 検出すべき抗 R e gタンパク自己抗体に反応する 標識 2次抗体試薬とが別々に含まれる試薬が挙げられ、 各種標識物を用いた免疫 測定法を利用した抗 R e gタンパク自己抗体の診断用試薬においては、 例えば、 R e gタンパクが固定された担体と、 検出しょうとする抗 R e gタンパク自己抗 体に反応する標識 2次抗体試薬とが別々に含まれる試薬が挙げられる。 また、 ラ テックス凝集法を利用する抗 R e g夕ンパク自己抗体の診断用試薬においては、 例えば、 R e gタンパクが固定化されたラテックス粒子 （担体） 試薬などが挙げ られる。
上記診断用試薬に用いる標識 2次抗体としては、 前記の抗 R e gタンパク自己 抗体の検出方法に例示した標識 2次抗体が使用できる。 使用する標識 2次抗体は、 1検体に対して、 抗体のいずれかのクラスに対する標識抗体のいずれか 1種類以 上を使用することが好ましい。 これらの標識 2次抗体は、 別々に用意されていて も混合物となっていてもよい。
本発明の診断用試薬において、 上記構成試薬に加え、 必要に応じてその他の補 助的試薬や補助的材料を組合わせ診断用キッ トとすることができる。
例えば、 上記ウエスタンプロッ ト法を用いた診断用試薬の場合、 その他の成分 としては、 例えば、 電気泳動用ゲル、 転写用膜、 ブロッキング液、 陰性対照試料- 陽性対照試料、 洗浄液、 標識物質が酵素等の場合における反応基質、 希釈液、 増 感剤、 反応停止液などが挙げられ、 これらは単独で又は組み合わせて用いられ、 試薬の形態としては、 例えば、 上記成分が必要量同封されたキッ トが挙げられる 上記各種標識物を利用した免疫測定法を用いる診断用試薬の場合、 その他の成分 としては、 例えば、 陰性対照試料、 陽性対照試料、 洗浄液、 標識物質が酵素等の 場合における反応基質、 希釈液、 増感剤、 反応停止液などが挙げられ、 これらは 単独で又は組み合わせて用いられ、 試薬の形態としては、 例えば、 上記成分が必 要量同封されたキッ ト、 これらの単品のバルクなどが挙げられる。
また、 前記ラテックス凝集法を用いる診断用試薬の場合、 その他の成分として は、 例えば、 陰性対照試料、 陽性対照試料、 増感剤などが挙げられる。 なお、 こ の増感剤としては、 例えば、 ゥシ血清アルブミンやポリエチレングリコール等が 挙げられる。
本発明の診断用試薬において、 診断したり、 予知したりする対象疾患としては、 抗 R e gタンパク自己抗体が存在することにより引き起こされる自己免疫疾患で あれば特に制限されるものではないが、 例えば、 糖尿病、 インスリン依存性糖尿 病、 インスリ ン非依存性糖尿病、 肝ガン、 大腸ガン、 小腸ガン、 滕炎、 胃潰瘍及 びアルツハイマー病などが挙げられ、 上記の中では、 陽性率が高いなどの点から 糖尿病であることが好ましく、 インス りン依存性糖尿病及びィンスリン非依存性 糖尿病であることがより好ましい。 図面の簡単な説明 図 1は、 イ ンスリン依存性糖尿病患者及び健常者の抗 R e gタンパク自己抗体 の相対的抗体価の分布を示した図である。
図 2は、 ィンスリン非依存性糖尿病患者及び健常者の抗 R e gタンパク自己抗 体の相対的抗体価の分布を示した図である。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明を実施例により更に詳細に説明する。 実施例 1 I D DM患者及び健常者血清のウェス夕ンブロッ ト法による測定 ( 1 ) 検体
検体としては、 健常者 （No n— DM) 75名及び I D DM患者 2 02名の血 清を用いた。
( 2 ) R e gタンパクの製造方法
ヒト RE G Iひ c D N Aの全長を p P I C 3. 5ベクター （インビトロゲン社 (Invitrogen Corp.) 製造、 フナコシ株式会社より購入） に挿入した発現べクタ —で酵母菌ピシァ ' パス ト リス G S 1 1 5株 （Pichia pastoris GS115) (イン ビトロゲン社 （Invitrogen Corp.) 製造、 フナコシ株式会社より購入） を形質転 換してヒ ト R e gタンパクを培養培地に産生 ·分泌する組換え酵母を得た。
この上記ヒ ト R E G I a c D Ν Αが挿入されたべクタ一を有する組換え酵母 菌ビシァ . パス ト リス GS 1 1 5株 （Human REG Iひ一 1 3 ) は、 1 99 9年 4月 5日に工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305- 8566 日本 国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3 ) に受託番号 FE RM P— 1 7 3 58として 寄託され、 2 00 0年 3月 3 0日にブダぺス ト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM B P— 7 1 1 1の受託番号が付与されている。
この組換え酵母を、 BMGY培地 （酵母エキス 1 %、 ペプトン 2 %、 1 0 0 mMリン酸カリゥム緩衝液 （pH6. 0 ) 、 酵母ニトロゲンベースアミノ酸不含
1. 34 %、 ピオチン 4 x l 0—5%、 グリセロール 1 %) の培養液で 30 °C、 1 8時間培養した。 培養液を遠心分離器にかけ、 沈殿として得た菌体を BM MY培地 （酵母エキス 1 %、 ペプトン 2%、 1 0 0 mMリン酸カリウム緩衝 液 （pH6. 0 ) 、 酵母二トロゲンベースアミノ酸不含 （YNB) 1. 34 %、 ピオチン 4 X 1 0— 5%、 メタノール 1 %) の培養液に懸濁し、 3 0°C、 7 2 時間培養した。 培養中、 24時間ごとに、 培養液の 0. 5 %相当量のメタノール を加えた。
培養終了後、 培養液を遠心分離操作により、 菌体を沈殿として除いた後、 上清 に酢酸を加えて pHを 3. 5とし、 イオン交換カラムクロマトグラフィー装置、 ス ト リ一ムライ ン ' エス ' ピー （STREAMLINE SP) (フアルマシア ' バイオテク株式 会社） を用いて、 イオン交換カラムに R e gタンパクを吸着させた。 5 0 mM酢 酸ナトリウム （pH3. 5 ) でカラムを洗浄後、 1 M N a C lを含む 5 0 mM酢 酸ナトリウム （pH3. 5 ) で溶出し、 R e gタンパクを得た。
( 3 ) ウェスタンプロヅ ト法による抗 R e g夕ンパク自己抗体の検出
2 0〃 gの R e gタンパクを周知の方法で S D S化処理を行い、 1 5 % S D S ポリアクリルアミ ドゲル （ 9 X 6cm) を用いて電気泳動を行った後、 疎水性 PV D F膜 （日本ミリポア株式会社） に電気的に転写した。 この転写膜を 5 %のノン フアツ ト ミルク溶液中でブロヅキングした。
次に検体血清を 5 %ノ ンフアツ ト ミルク溶液を用いて 1 0 0 0〜 2 0 0 0 0倍 に希釈し、 スクリーナ一 ' ブロッター ' ミニ 5 6を用いてプロッキングした転写 膜とィンキュベ一ションした。 軽く洗浄後、 転写膜を 1 0 0 0〜 2 0 0 0 0倍に 希釈した西洋ヮサビバ一ォキシダ一ゼ標識ゥサギ抗ヒト抗体 （アメ リカン · コ一 レックス社 (American Qualex International, Inc.) 製造、 コスモ 'バイオ株式 会社販売） と反応させ、 ウエスタンプロッ ト法用の化学発光を用いた検出用キッ ト、 E C Lウェスタンブロヅティ ング検出システム （アマシャム株式会社） によ り発光反応を行い、 X線フィルムに露光した。 フィルムを現像後、 乾燥させ、 こ れをスキャナ一により画像デ一夕としてコンビュ一夕一に取り込んだ。
R e gタンパクに抗 R e gタンパク自己抗体が結合し、 免疫複合体が形成され たことにより、 標識 2次抗体が結合して基質が発光して X線フィルムが感光され て生じたバンドの反射吸光度を N I Hイメージ ' ソフ トウェア （らく らく実践！ 画像解析テキス ト— N I H I ma g e新講座、 小島ら編、 洋土社（1997)添付の ソフ トウェア） により測定した。 健常者の最も平均的な 1検体の吸光度を 1とし て、 測定された吸光度を抗 R e gタンパク自己抗体の相対的抗体価として表した。 インスリン依存性糖尿病患者及び健常者における抗 R e gタンパク自己抗体の相 対的抗体価の分布を表 1及び図 1に示した。 健常者群の相対的抗体価の平均値は 1. 34、 標準偏差 （ S D) は 1. 5 9であった。 健常者群の相対的抗体価の平 均値に対し 3 S D以上、 つまり相対的抗体価 6. 1 2以上を持つものを抗 R e g タンパク自己抗体陽性とした。 ィンスリン依存性糖尿病患者及び健常者の陽性、 陰性者数及び陽性率を表 2に示した。 糖尿病群では 4 9名、 2 4 %に抗 R e g夕 ンパク自己抗体陽性者が認められた。 一方、 健常者の抗体陽性者は 2名のみで陽 性率は 3 %以下であった。
表 1 抗 R e gタンパク自己抗体の相対的抗体価の分布
Figure imgf000024_0001
表 2 陽 性 率
Figure imgf000025_0001
実施例 2 N I D DM患者血清のウェスタンブロッ ト法による測定
( 1 ) 検体
検体としては、 健常者 （N o n— DM) 7 5名及び 1 D DM患者 36 8名の 血清を用いた。
( 2 ) ウエスタンプロッ ト法による抗 R e gタンパク自己抗体の検出
実施例 1と同様にウェスタンブロッ ト法による抗 R e gタンパク自己抗体の検 出を行った。 X線フィルムが感光されて生じたバン ドの反射吸光度を実施例 1と 同様に N I Hイメージ . ソフ トゥヱァにより測定し、 実施例 1において用いた健 常者の最も平均的な 1検体の吸光度を 1として、 測定された吸光度を抗 R e g夕 ンパク自己抗体の相対的抗体価として表した。 ィンスリン非依存性糖尿病患者及 び健常者における抗 R e gタンパク自己抗体の相対的抗体価の分布を表 3及び図 2に示した。 実施例 1と同様に、 健常者群の相対的抗体価の平均値に対し、 3 S D以上、 つまり相対的抗体価 6. 1 2以上を持つものを抗 R e gタンパク自己抗 体陽性とした。 イ ンスリン非依存性糖尿病患者及び健常者の陽性、 陰性者数及び 陽性率を表 4に示した。 健常者の抗体陽性者は 2名のみで陽性率は 3 %以下であ るのに対し、 インスリン非依存性糖尿病では 5 5名、 1 5 %に抗 R e gタンパク 自己抗体陽性者が認められた。 以上の結果より、 抗 R e gタンパク自己抗体を検出することにより、 従来原因 不明であったインスリ ン依存性糖尿病患者のうちの 2 4 %以上、 またインスリン 非依存性糖尿病患者の 1 5 %以上が抗 R e gタンパク自己抗体の存在によって引 き起こされた自己免疫性の糖尿病であることが判明した。 また、 表 2の結果にお いて、 健常者で抗 R e gタンパク自己抗体が検出された 2人においては、 将来、 自己免疫性の糖尿病、 ィンスリン依存性糖尿病またはィンスリン非依存性糖尿病 を発症する可能性があると予想される。 本発明による抗 R e gタンパク自己抗体 の検出を行うことにより、 従来原因不明であった疾患を自己免疫性の糖尿病、 ィ ンスリン依存性糖尿病またはィンスリン非依存性糖尿病であると診断したり、 将 来の可能性を予知することが可能である。
表 3 抗 R e gタンパク自己抗体の相対的抗体価の分布
Figure imgf000027_0001
表 4 陽 性 率
Figure imgf000028_0001
皿上の利用可 til生 本発明の自己免疫疾患の判定方法によれば、 抗 R e gタンパク自己抗体の存在 によって引き起こされるこれまで原因不明であった自己免疫疾患の診断が可能と なる。
本発明の糖尿病の判定方法によれば、 抗 R e gタンパク自己抗体の存在によつ て引き起こされるこれまで原因不明であった糖尿病の診断が可能となる。
本発明のィンスリン依存性糖尿病の判定方法よれば、 抗 R e gタンパク自己抗 体の存在によって引き起こされるこれまで原因不明であったイ ンス りン依存性糖 尿病の診断が可能となる。
本発明のィンスリン非依存性糖尿病の判定方法よれば、 抗 R e gタンパク自 己抗体の存在によって引き起こされるこれまで原因不明であったィンスリン非依 存性糖尿病の診断が可能となる。
本発明の抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法よれば、 抗 R e gタンパク自己 抗体の存在によって引き起こされるこれまで原因不明であった自己免疫疾患、 糖 尿病、 ィンスリン依存性糖尿病及びィンスリン非依存性糖尿病の診断に用いるこ とのできる検出方法が可能となる。
本発明の自己免疫疾患の診断用試薬は、 抗 R e gタンパク自己抗体の存在によ つて引き起こされるこれまで原因不明であった自己免疫疾患の診断を可能とする ( 本発明に記載の糖尿病の診断用試薬は、 抗 R e gタンパク自己抗体の存在によ つて引き起こされるこれまで原因不明であった糖尿病の診断を可能とする。 本発明のィンスリン依存性糖尿病の診断用試薬は、 抗 R e gタンパク自己抗体 の存在によって引き起こされるこれまで原因不明であったィンスリン依存性糖尿 病の診断を可能とする。
本発明のィンスリン非依存性糖尿病の診断用試薬は、 抗 R e gタンパク自己抗 体の存在によって引き起こされるこれまで原因不明であったインスりン非依存性 糖尿病の診断を可能とする。

Claims

請求の範囲
1 . 検体中の抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することを特徴とする自己 免疫疾患の判定方法。
2 . 検体中の抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することを特徴とする糖尿 病の判定方法。
3 . 検体中の抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することを特徴とするィン スリン依存性糖尿病の判定方法。
4 . 検体中の抗 R e gタンパク自己抗体の存在を検出することを特徴とするィン スリン非依存性糖尿病の判定方法。
5 . 検体と抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分とを接触さ せ、 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に抗 R e gタンパク自己抗体と結合しう る抗原成分との反応の結果生じる免疫複合体の形成を検出することを特徴とする 抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法。
6 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパク である請求項 5記載の抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法。
7 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパク の一部である請求項 5記載の抗 R e gタンパク自己抗体の検出方法。
8 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合成さ れた R e gタンパクである請求項 6又は 7に記載の抗 R e gタンパク自己抗体の 検出方法。
9 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分を含有してなる自 己免疫疾患の診断用試薬。
1 0 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クである請求項 9記載の自己免疫疾患の診断用試薬。
1 1. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クの一部である請求項 9記載の自己免疫疾患の診断用試薬。
1 2. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合成 された R e gタンパクである請求項 1 0又は 1 1に記載の自己免疫疾患の診断用
1 3. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分を含有してなる 糖尿病の診断用試薬。
14. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クである請求項 1 3記載の糖尿病の診断用試薬。
1 5. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クの一部である請求項 1 3記載の糖尿病の診断用試薬。
1 6. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合成 された R e gタンパクである請求項 1 4又は 1 5に記載の糖尿病の診断用試薬。
1 7. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分を含有してなる インスリン依存性糖尿病の診断用試薬。
1 8. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クである請求項 1 7記載のィンスリン依存性糖尿病の診断用試薬。
1 9. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クの一部である請求項 1 7記載のィンスリン依存性糖尿病の診断用試薬。
20. 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合成 された R e gタンパクである請求項 1 8又は 1 9に記載のィンスリン依存性糖尿 病の診断用試薬。
2 1 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分を含有してなる インスりン非依存性糖尿病の診断用試薬。
2 2 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クである請求項 2 1記載のィンスリン非依存性糖尿病の診断用試薬。
2 3 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が R e gタンパ クの一部である請求項 2 1記載のィンスリン非依存性糖尿病の診断用試薬。
2 4 . 抗 R e gタンパク自己抗体と特異的に結合しうる抗原成分が人工的に合成 された R e gタンパクである請求項 2 2又は 2 3に記載のィンス リン非依存性糖 尿病の診断用試薬。
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