ES2270817T3 - Metodo para evaluar enfermedades autoinmunes, metodo para detectar autoanticuerpos de la proteina anti-reg y diagnosticos para enfermedades autoinmunes. - Google Patents
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Abstract
Un método para diagnosticar o predecir el inicio de una enfermedad autoinmune, que comprende la etapa de detectar la existencia de un autoanticuerpo de la proteína anti-Reg en un espécimen de fluido corporal o tejido.
Description
Método para evaluar enfermedades autoinmunes,
método para detectar autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg y diagnósticos para enfermedades
autoinmunes.
La presente invención se refiere a un método
para evaluar enfermedades autoinmunes y diabetes mellitus
(incluyendo la diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes
mellitus no dependiente de insulina, etc.). La presente invención
también se refiere a un método para detectar un autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg, y un reactivo de diagnostico para
enfermedades autoinmunes y diabetes mellitus (incluyendo la diabetes
mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus no dependiente
de insulina, etc.).
Las enfermedades autoinmunes son enfermedades
causadas por un sistema inmunológico anormal en las que el sistema
inmunológico no funciona normalmente produciendo una respuesta
inmune humoral o celular en sus propias células o tejidos y en las
que aparecen autoanticuerpos que responden a sus propias células y
tejidos.
Se sabe que los autoanticuerpos atacan a las
autocélulas o a los autotejidos perjudicando su función y como
resultado causan las enfermedades autoinmunes. Además, recientemente
se ha publicado que los autoanticuerpos se detectan en el suero de
pacientes antes de aparecer la enfermedad autoinmune.
Esto significa que la detección de los
autoanticuerpos permite un descubrimiento previo o precognición de
la presencia de una enfermedad autoinmune, o una precognición de la
deterioración de la condición de enfermedad, lo que permite un
tratamiento precoz o una terapia preventiva de la enfermedad
autoinmune.
Basado en estas conclusiones, se ha descubierto
una variedad de autoanticuerpos contra autoantígenos y se han medido
autoanticuerpos contra autoantígenos en análisis clínicos.
Por ejemplo, en un caso de diabetes mellitus
autoinmune, se han publicado autoanticuerpos relevantes, un
anticuerpo de célula de islote (en lo sucesivo en este documento
abreviado como ICA), anticuerpo de superficie de célula de islote
(en lo sucesivo en este documento abreviado como ICSA), anticuerpo
de antiinsulina, anticuerpo de ácido antiglutámico descarboxilasa,
anticuerpo anti-gangliosido, anticuerpo antibovino
de lactoalbumina, anticuerpo antipancreático de citoqueratina, y
similares. En la diabetes mellitus autoinmune anteriormente
mencionada, los ICA y ICSA pueden ser detectados en suero de
pacientes a una alta frecuencia en el momento del desarrollo de la
diabetes mellitus dependiente de insulina (en lo sucesivo en este
documento abreviado como DMDI). Particularmente, los ICA pueden ser
detectados en suero de pacientes antes del desarrollo de DMDI, lo
que de acuerdo con esto se conoce como marcador que preconcibe el
desarrollo de DMDI.
Como se menciona anteriormente, muchos de los
pacientes de DMDI son considerados como tal debido a la diabetes
mellitus autoinmune desarrollada en el sistema autoinmune, aunque se
diga que en algunos pacientes no pueda ser detectado ningún
autoanticuerpo.
A la inversa, como para la diabetes mellitus no
dependiente de insulina (en lo sucesivo en este documento abrebiada
como NDMDI), por ejemplo, la tasa de existencia de ICA en pacientes
de DMDI es de un 40% o más, mientras que en pacientes de NDMDI es
considerado menor de aproximadamente el 3% (Kobayashi T et
al., Diabetes, vol. 35, 335-340
(1986)). Así, aunque la tasa positiva de autoanticuerpos sea alta en
DMDI, es baja en NDMDI, y no existe ninguna publicación sobre ningún
autoanticuerpo eficaz como marcador de diagnóstico para NDMDI.
Por otra parte, la proteína Reg (gen de
regeneración) era una proteína descubierta a partir del gen en el
cual la expresión es reconocida ampliamente durante la regeneración
de los islotes de Langerhans administrando nicotinamida a
aproximadamente el 90% del páncreas extirpado en ratas (Terazono
et al., Journal of Biological Chemistry, 263;
2111-2114 (1988)).
Las proteínas Reg se encuentran en seres
humanos, ratas, ratones, reses y hámster y se clasifican actualmente
en tres subtipos, es decir, Reg I, Reg II y Reg III, a partir de la
homología de sus estructuras primarias y de la presencia de la
secuencia de inserción de 7 ó 5 restos de aminoácidos.
Las proteínas Reg pueden ser encontradas no sólo
en las células de islote de Langerhans anteriormente mencionadas,
sino que también en células del hígado, intestino, cáncer en el
páncreas, y en la membrana mucosa del intestino delgado, y según se
dice aparecen durante la regeneración de los nervios o en la pared
gástrica o en el momento del desarrollo de la pancreatitis. En
consecuencia, se considerada que las proteínas Reg están ampliamente
implicadas en la regeneración y la proliferación de órganos
intracorpóreos.
Sin embargo, hasta ahora no ha habido ninguna
publicación sobre la existencia de autoanticuerpos contra proteínas
Reg y enfermedades autoinmunes causadas por ello.
Uno de los objetos de la presente invención es
proporcionar un método para evaluar una enfermedad autoinmune.
Particularmente, es proporcionar un método para evaluar la diabetes
mellitus, más particularmente, un método para detectar la diabetes
mellitus dependiente de insulina y la diabetes mellitus no
dependiente de insulina.
Otro objeto de la presente invención es
proporcionar un método para detectar un anticuerpo que pueda ser
usado en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes.
Otro objeto más de la presente invención es
proporcionar un reactivo para diagnosticar enfermedades autoinmunes.
Particularmente, es proporcionar un reactivo para diagnosticar la
diabetes mellitus, más particularmente, un reactivo para
diagnosticar la diabetes mellitus dependiente de insulina y la
diabetes mellitus no dependiente de insulina.
La presente invención se refiere a los puntos
(1) - (24) siguientes:
(1) Un método para evaluar una enfermedad
autoinmune, que comprende la etapa de detectar la existencia de un
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg en un
espécimen.
(2) Un método para evaluar la diabetes mellitus,
que comprende la etapa de detectar la existencia de un
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg en un
espécimen.
(3) Un método para evaluar la diabetes mellitus
dependiente de insulina, que comprende la etapa de detectar la
existencia de un autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg en un espécimen.
(4) Un método para evaluar la diabetes mellitus
no dependiente de insulina, que comprende la etapa de detectar la
existencia de un autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg en un espécimen.
(5) Un método para detectar un autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg, que comprende la etapas de
poner en contacto un espécimen con un componente de antígeno capaz
de unirse específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg y detectar la formación de un complejo
inmune que es el resultado de la reacción del autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg con el componente de antígeno
capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg.
(6) Un método para detectar un autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg de acuerdo con (5), en el que
el componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una
proteína Reg.
(7) Un método para detectar un autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg de acuerdo con (5), en el que
el componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una parte
de la proteína Reg.
(8) Un método para detectar un autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg de acuerdo con (6) o (7), en el
que el componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una
proteína Reg sintetizada artificialmente.
(9) Un reactivo para diagnosticar una enfermedad
autoinmune, que comprende un componente de antígeno capaz de unirse
específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg.
(10) Un reactivo para diagnosticar una
enfermedad autoinmune de acuerdo con (9), en el que el componente de
antígeno capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg es una proteína Reg.
(11) Un reactivo para diagnosticar una
enfermedad autoinmune de acuerdo con (9), en el que el componente de
antígeno capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg es una parte de la proteína
Reg.
(12) Un reactivo para diagnosticar una
enfermedad autoinmune de acuerdo con (10) o (11), en el que el
componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una
proteína Reg sintetizada artificialmente.
(13) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus, que comprende un componente de antígeno capaz de unirse
específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg.
(14) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus de acuerdo con (13), en el que el componente de antígeno
capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg es una proteína Reg.
(15) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus de acuerdo con (13), en el que el componente de antígeno
capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg es una parte de la proteína Reg.
(16) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus de acuerdo con (14) o (15), en el que el componente de
antígeno capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg es una proteína Reg sintetizada
artificialmente.
(17) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus dependiente de insulina, que comprende un componente de
antígeno capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg.
(18) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus dependiente de insulina de acuerdo con (17), en el que el
componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una
proteína Reg.
(19) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus dependiente de insulina de acuerdo con (17), en el que el
componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una parte
de la proteína Reg.
(20) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus dependiente de insulina de acuerdo con (18) o (19), en el
que el componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una
proteína Reg sintetizada artificialmente.
(21) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus no dependiente de insulina, que comprende un componente de
antígeno capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg.
(22) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus no dependiente de insulina de acuerdo con (21), en el que
el componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una
proteína Reg.
(23) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus no dependiente de insulina de acuerdo con (21), en el que
el componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una parte
de la proteína Reg.
(24) Un reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus no dependiente de insulina de acuerdo con (22) o (23), en
el que el componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg es una
proteína Reg sintetizada artificialmente.
El método para evaluar enfermedades autoinmunes
en la presente invención se refiere a diagnosticar o predecir
enfermedades autoinmunes causadas por un autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg detectando la existencia del
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg en un
espécimen.
Las enfermedades autoinmunes que pueden ser
diagnosticadas o predichas por la detección de la existencia del
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg, que
particularmente no está limitadas siempre que estén causadas por la
existencia del autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg, incluyen, por ejemplo, diabetes mellitus,
diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus no
dependiente de insulina, hepatoma, cáncer de colon, cáncer de
intestino delgado, pancreatitis, úlcera gástrica y la enfermedad de
Alzheimer. Entre ellas, se prefiere la diabetes mellitus en vista
de su alta tasa positiva, y se prefiere más la diabetes mellitus
dependiente de insulina y la diabetes mellitus no dependiente de
insulina.
En la presente invención, los autoanticuerpos de
la proteína anti-Reg que se detectan, que
particularmente no están limitados siempre que reaccionen con
proteínas Reg, incluyen, por ejemplo, las clases de anticuerpo IgG,
anticuerpo IgM, anticuerpo IgA, anticuerpo IgD y anticuerpo IgE, que
reaccionan con las proteínas Reg. Entre las clases anteriores de
anticuerpos que reaccionan con las proteínas Reg, se prefieren para
detectar un anticuerpo IgG o un anticuerpo IgM ya que se encuentran
en abundancia en pacientes que sufren de enfermedades
autoinmunes.
En la presente invención, como anticuerpo de la
proteína anti-Reg usado en la detección, cualquiera
de las clases anteriores de anticuerpo pueden ser detectadas solas o
en una combinación de dos o más.
Los especímenes que se usan en la presente
invención, que particularmente no están limitados siempre que
contengan posiblemente el autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg, incluyen, por ejemplo, fluidos corporales
tales como la sangre, el suero, el plasma, la orina y el fluido
cerebrospinal, y tejidos tales como células de islote de
Langerhans, páncreas, glándulas pancreáticas exocrinas, neuronas y
varias células cancerosas. Entre ellos, son preferidos la sangre, el
suero, el plasma y la orina porque los especímenes están fácilmente
disponibles.
Los componentes de antígeno usados en el método
para detectar un autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg de la presente invención, que
particularmente no están limitados siempre que puedan unirse
específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg, preferiblemente incluyen proteínas Reg en
vista de su especificidad. Más particularmente, se prefiere una
parte de la proteína Reg. Además, las proteínas Reg que
artificialmente son producidas por recombinación genética o
síntesis químicas son preferidas ya que pueden ser obtenidas en una
forma estable de calidad.
Como proteínas Reg, no hay ninguna limitación
siempre que sea usado un producto genético de la proteína Reg a
partir del gen mencionado como de una familia del gen de Reg (Umino
et al., Nippon Rinsho, vol. 55, págs.
817-821; Yonekura H, et al., en: Flatt PR
et al. (eds.) "Frontiers of Insulin Secretion and
Pancreatic B-cell Investigation",
Smith-Golden, Londres, págs.
581-588; Miyashita H et al., FEBS
Letter, vol. 377, pág. 429-433 (1995)).
Por ejemplo, se incluyen la proteína Reg I\alphahumana, Reg
I\beta, HIP (un gen expresado en carcinoma hepatocelular,
intestino, páncreas), PAP (el gen para la proteína asociada a la
pancreatitis), RS (la secuencia relacionada con Reg), Reg I de rata,
PAP I, II, III, Reg I murino, II, III\alpha, III\beta,
III\gamma, III\delta, INGAP de hámster (proteína asociada a la
neogenesis de islote), PTP bovino (proteína del conducto
pancreático) y similares.
Como proteínas Reg humanas, Terazono et
al. (Journal of Biological Chemistry, vol. 263,
2111-2114 (1988)), Moriizumi S et al.
(Biochimica et Biophysica Acta, vol. 1217,
199-202 (1994)), Lasserre C et al. (Cancer
Research, vol. 52, 5089-5095 (1992)) y
Lasserre C et al. (European Journal of Biochemistry,
vol. 224, 29-38 (1994)) describen sus
secuencias y similares detalladamente.
Las proteínas Reg anteriormente mencionadas
pueden ser seleccionadas de manera apropiada de acuerdo con el tipo
de enfermedades autoinmunes que se detecten. En vista de la
especificidad de la detección del autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg, las proteínas Reg que existen en los
órganos dañados son preferidas. Por ejemplo, cuando la enfermedad
que se diagnostica es la diabetes mellitus, diabetes mellitus
dependiente de insulina o la diabetes mellitus no dependiente de
insulina, la proteína Reg I\alpha humana es preferida.
Como componentes de antígeno usados en el método
para la detección de un autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg de la presente invención, es posible usar
las proteínas Reg fragmentadas mediante procedimientos enzimáticos
conocidos o técnicas de recombinación genética o las proteínas Reg
parcialmente modificadas mediante procedimientos enzimáticos
conocidos o técnicas de recombinación genética, en vista de su
sensibilidad y especificidad en la detección del autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg así como la estabilidad de la
actividad antígena durante la preservación como reactivo de
diagnóstico durante un período largo.
En la presente invención, como proteína
anti-Reg usada en la detección del autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg, pueden ser usadas cualquiera
de las proteínas Reg anteriores solas o en una combinación de dos o
más.
Como método para producir las proteínas Reg
anteriormente mencionadas de la presente invención, aunque no haya
ninguna limitación particular, puede ser adaptado un método
artificial tal como una recombinación genética o síntesis química,
o purificación a partir de órganos, de fluido corporal o
secreciones.
En el método para producir proteínas Reg
mediante recombinación genética, por ejemplo, se inserta una ADN que
codifica para la proteína Reg anterior en un vector para producir un
vector recombinante. Esto entonces se transforma en un huésped
para formar un transformante, que entonces se incuba para utilizar
el transformante en sí o el sobrenadante del cultivo.
El ADN que codifica para una proteína Reg, que
se inserta en un vector recombinante, puede ser un ADN que codifique
para la longitud completa de la proteína Reg anterior o una parte de
ella.
El vector recombinante puede prepararse
insertando un ADN que codifique para la proteína Reg anterior en un
vector de plásmido o vector de fago que pueda ser replicado en una
célula huésped de una manera convencional. En esta operación, si
fuera necesario, puede ser usado un conector.
Como vectores del plásmido, aquellos que
contienen un gen resistente a fármaco tal como el gen resistente a
la kanamicina, el gen resistente a la ampicilina, etc., pueden ser
usados preferiblemente porque tales vectores permiten un rastreo
fácil del transformante que contiene el vector recombinante que se
hace y porque mantiene el vector recombinante establemente en una
célula huésped.
Los ejemplos específicos de vectores de plásmido
incluyen los plásmidos pPIC3.5K, pPIC9K, pAO815, pYX011, pYX111,
pUC118, pUB110, y otros similares. PPIC3.5K, pPIC9K, y pAO815 pueden
ser comprados en la compañía Funakoshi, Ltd., pYX011 y pYX111 en la
compañía cosmo Bio, Ltd., y pUC118 y pUB110 en la compañía Takara
Shuzo, Ltd., respectivamente.
Los ejemplos específicos de vectores de fago
incluyen el fago \lambdagt11, el fago \lambdagt10, y otros
similares. El fago \lambdagt11 y el fago \lambdagt10 pueden ser
comprados en la compañía Funakoshi, Ltd. En cualquier caso, puede
ser obtenido un vector recombinante correspondiente al vector
relativo usado.
Un procedimiento general para preparar plásmidos
recombinantes se describe en J. Samblook et al., "Molecular
Cloning" 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (en
lo sucesivo en este documento este libro se denomina "Clonación
Molecular").
El transformante puede prepararse insertando el
plásmido recombinante anterior en un huésped.
El huésped, que particularmente no está limitado
siempre que el ADN de la proteína Reg en el plásmido recombinante se
exprese, incluye, por ejemplo, levaduras tales como Saccharomyces
cerevisiae, Pichia pastoris, etc., bacterias de
Escherichia tales como Escherichia coli, etc.,
bacterias de Bacillus tales como Bacillus subtilis,
etc. En la inserción de un plásmido recombinante en un huésped, por
ejemplo, una célula huésped es convertida en esferoplasto o
protoplasto, en el cual el plásmido recombinante es insertado
mediante electroporación, transformación con cloruro de calcio o el
método de Tris-PEG. Estas operaciones pueden ser
seleccionadas de manera apropiada de acuerdo con el tipo de
huésped.
Un procedimiento general para preparar un
transformante utilizando un plásmido recombinante se describe
detalladamente en las publicaciones, "Clonación Molecular",
etcétera. Para preparar un transformante utilizando un plásmido
recombinante, una variedad de kits están disponibles en el comercio.
Por ejemplo, un kit que usa levadura, Pichia pastoris, está
disponible en el comercio en la compañía Funakoshi, Ltd. (Nº. de
Catálogo IV-1750-01; fabricante:
Invitrogen Corp.), y puede prepararse un transformante de acuerdo
con un manual de instrucciones adjunto al kit.
Un ejemplo específico de transformantes usados
en la preparación de proteínas Reg usando transformantes incluye una
levadura recombinante, cepa de Pichia pastoris GS115
f(REGI\alpha-13 humana) que contiene un
vector en el cual el cDNA de REGI\alpha humano ha sido insertado.
La cepa de GS115 (REGI\alpha-13 humana) fue
depositada en la Agencia de Ciencia Industrial y Tecnología,
Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (código postal
305-8566; 1-3, Higashi
1-chome, ciudad de Tukuba, Ibaragi, Japón) con el
Nº. de entrada FERM P-17358 el 5 de Abril de 1999, y
fue transferida al deposito internacional como FERM
BP-7111 el 30 de Marzo de 2000 bajo las normas del
Tratado de Budapest.
La incubación del transformante se lleva a cabo
colocando un transformante en un medio de cultivo en el cual el
transformante pueda ser cultivado, y luego se agita o se deja
reposar a una temperatura adecuada.
Como medio de cultivo, pueden ser usados los que
contienen fuentes de carbono y fuentes de nitrógeno. La fuente de
carbono incluye, por ejemplo, azúcar, alcohol, ácido orgánico, y
similares; el azúcar es ejemplificado por glucosa, almidón,
dextrosa, melaza, etc., el alcohol por metanol, etanol, glicerol,
etc., y el ácido orgánico por ácido cítrico, ácido malónico, etc. La
fuente de nitrógeno incluye, por ejemplo, una fuente de nitrógeno
orgánica, una fuente de nitrógeno inorgánica, etc.; la fuente de
nitrógeno orgánica es ejemplificada por peptona, caseína,
polipeptona, bacto-triptona, extracto de carne,
extracto de levadura, ácido casamino, glicina, etc.; la fuente de
nitrógeno inorgánica por sulfato de amonio, nitrato de amonio,
etc.
Cuando el transformante es auxotrófico, los
materiales alimenticios requeridos para el crecimiento son añadidos
al medio. Tales materiales alimenticios incluyen, por ejemplo,
aminoácidos, vitaminas, ácidos nucleicos, sales, y otros
similares
Como medio, por ejemplo, puede ser usado un
medio sintético principalmente compuesto de alcoholes y fuentes de
nitrógeno orgánicas.
Cuando se usa como medio un medio sólido, se
añade además agar.
Para mantener el plásmido recombinante
establemente y que el crecimiento de inhibición de cepas no tenga
ningún plásmido recombinante, pueden ser añadidos al medio un
antibiótico o antibióticos. Tales antibióticos incluyen, por
ejemplo, penicilina, eritromicina, kanamicina, neomicina,
cloramfenicol, bacitracina, D-cicloserina,
ampicilina, y otros similares.
Además, de ser requerido, pueden ser añadidos
como agente espumante aceite de soja, manteca de cerdo, diversos
agentes tensioactivos, etc.
El pH del medio por lo general es mantenido en
el intervalo de 4-9, en el cual el transformante
puede crecer. Cuando la levadura Pichia pastoris se usa como
huésped, el medio preferiblemente es mantenido a un pH de
5,0-7,0.
La temperatura de incubación por lo general es
mantenida, por ejemplo, a 15-42ºC, preferiblemente a
24-37ºC.
El tiempo de incubación es variable dependiendo
del tipo de huésped, el estado físico del medio (sólido o líquido),
el aparato de incubación, la temperatura de incubación, etc. Por
ejemplo, cuando la levadura Pichia pastoris se usa como
huésped a una temperatura de incubación de 15-42ºC,
el tiempo de incubación es por lo general 12-96
horas, preferiblemente 60-84 horas.
Como se describe anteriormente, el transformante
en el que un gen que codifica para una proteína Reg ha sido
introducido es incubado para acumular la proteína Reg en un cultivo
que comprende el caldo de cultivo y el transformante después de la
incubación; el cultivo se recupera, a partir de lo cual la proteína
Reg objetivo se puede purificar.
Por ejemplo, cuando la proteína Reg generada en
el huésped es una proteína fusionada compuesta de una secuencia
señal y una secuencia de aminoácidos de la proteína Reg, la
secuencia señal es eliminada de la proteína fusionada por la
peptidasa señal del transformante, y la proteína Reg es secretada a
partir del transformante. Así, el sobrenadante es recogido como un
cultivo después de la incubación del transformante, a partir del
cual la proteína Reg es purificada preferiblemente de manera
convencional.
De forma alternativa, el transformante incubado
se recoge como cultivo, que se machaca o disuelve para dar un
líquido machacado o solución, a partir del cual la proteína Reg es
purificada.
Además, la purificación a partir del caldo de
cultivo y a partir del transformante incubado como para un cultivo
puede ser combinada para mejorar el rendimiento de la proteína Reg
objetivo.
El machacado del transformante puede ser llevado
a cabo, por ejemplo, por un método de machacado físico del
transformante. Por ejemplo, el transformante se suspende en un
tampón, el cual es irradiado con una onda ultrasónica, o el
transformante mezclado con arena de cuarzo se suspende en un tampón.
Por otra parte, la disolución del transformante puede ser lograda,
por ejemplo, por un método para disolver la pared celular del
transformante con una enzima y un tensioactivo. Cuando el huésped
del transformante es Escherichia coli, pueden ser usadas una
enzima tal como la lisozima y el dodecil-sulfato de
sodio (en lo sucesivo en este documento abreviado como SDS)
como
tensioactivo.
tensioactivo.
En la purificación de la proteína Reg objetivo a
partir del líquido machacado resultante o de la solución disuelta,
por ejemplo, el líquido machacado o la solución disuelta se
centrifuga para eliminar el residuo de células y obtener un
sobrenadante, el sobrenadante resultante se trata con adición de
sulfito de amonio a una concentración en la cual ningún precipitado
de proteína Reg sea generado. La mezcla se agita, se centrifuga
para eliminar el precipitado y obtener el sobrenadante, al cual se
añade además sulfato de amonio a una concentración a la cual el
precipitado de proteína Reg sea generado. El precipitado generado
después de agitar puede ser recuperado por centrifugación. Es
preferible confirmar la presencia de proteínas Reg en el
sobrenadante y la fracción precipitada muestreando en la
centrifugación final ya que el sobrenadante a veces contiene la
proteína Reg objetivo. En la purificación de la proteína Reg
objetivo a partir del sobrenadante del cultivo después de la
incubación del transformante, por ejemplo, el caldo de cultivo se
centrifuga para eliminar las células como un precipitado, y el
sobrenadante se ajusta a pH 3,5 con la adición de ácido acético y se
monta en una columna de intercambio iónico para absorber la
proteína Reg. Después del lavado de la columna con un tampón acetato
de sodio, la proteína Reg adsorbida se eluye con un tampón de
acetato de sodio que contiene NaCl 1 M para obtener la proteína
Reg.
Otro método alternativo a los métodos
anteriormente mencionados para purificar la proteína Reg objetivo a
partir del líquido machacado, solución disuelta o del sobrenadante
después de la incubación del transformante, incluye el
fraccionamiento por precipitación salina, precipitación con etanol,
filtración de gel, cromatografía de afinidad, cromatografía
hidrófoba, y otros similares Estos métodos de purificación pueden
ser usados solos o en una combinación de dos o más. Los métodos
anteriores para la purificación de proteínas se describen
detalladamente en las publicaciones "Clonación Molecular" y
"Basic Experimental Method for Proteins and Enzymes" (2ª
edición revisada, ed. Buichi Kajio, compañía Nankodo, Ltd.
(1994)).
En los ejemplos específicos de producción de
proteínas Reg usando recombinación genética, las proteínas Reg
también pueden ser producidas de acuerdo con los métodos que se
describen en la solicitud de patente japonesa abierta a la consulta
del público Nº. Hei 1-137994/1989 y la solicitud de
patente japonesa abierta a la consulta del público Nº. Hei
6-29963/1994.
En la producción de proteínas Reg mediante
síntesis químicas, una secuencia de 10 a 30 aminoácidos secuencial
como una parte de la secuencia de aminoácidos de proteína Reg puede
ser sintetizada de acuerdo con un método conocido para la síntesis
de péptidos. La síntesis del péptido puede ser lograda, por ejemplo,
por un método en fase sólida en el cual una cadena de péptido es
ampliada a partir del extremo C-terminal en un
vehículo de polímero, o por un método en fase líquida sin usar
ningún vehículo. En el método anterior en fase sólida, la síntesis
del péptido puede ser lograda usando un sintetizador de péptidos
disponible en el comercio. Además, pueden ser unidas entre sí una o
dos o más de las cadenas del péptido sintetizadas como se describe
anteriormente para formar una
proteína.
proteína.
En la producción de las proteínas Reg
purificadas a partir de órganos, fluido corporal o secreciones, los
órganos, el fluido corporal o las secreciones usadas como materias
primas, que particularmente no están limitadas siempre que
contengan proteínas Reg, incluyen el páncreas, células Langerhans de
islote, glándulas pancreáticas exocrinas, neuronas y varias células
de cáncer incluyendo hepatoma, cáncer de colon, cáncer de intestino
delgado, etc.
Como método para obtener una solución machacada
o disuelta a partir de órganos, puede ser utilizado el método
anteriormente mencionado para machacar o disolver el
transformante.
Como método para purificar las proteínas Reg a
partir de órganos, fluido corporal o secreciones, puede ser
utilizado el mismo método que se describió anteriormente para la
purificación de las proteínas Reg a partir del transformante.
Los ejemplos más específicos del método para
purificar proteínas Reg incluyen métodos como se describe en
Guy-Crotte et al., Biochemical and
Biophisical Research Communications, vol. 125,
516-523 (1984); De Caro AM et al.,
European Journal of Biochemistry, vol. 168,
201-207 (1987); y De Caro AM et al.,
Biochimica et Biophysica Acta, vol. 994,
281-284 (1989).
En la presente invención, un método para
detectar un autoanticuerpo de la proteína anti-Reg,
que particularmente no está limitado siempre que el método comprenda
las etapas de poner en contacto un espécimen con un componente de
antígeno capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg y detectar la formación de un
complejo inmune que sea el resultado de la reacción del
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg con el
componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg, incluye la
técnica de inmunotransferencia, inmunoensayo utilizando varios
marcajes, ensayo de aglutinación de látex usando partículas de
vehículo de látex, y otros similares.
El inmunoensayo que utiliza varias marcajes
incluye, por ejemplo, el radioinmunoensayo (RIA), inmunoensayo
fluorescente (FIA), inmunoensayo luminiscente, ensayo de
inmunoadsorción de enzimas ligadas (ELISA), inmunocromatografía, y
otros similares.
Un método para detectar un autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg mediante la técnica de
inmunotransferencia puede ser llevado a cabo, por ejemplo, separando
las proteínas Reg anteriores por electroforesis, transcribiendo en
una membrana porosa, bloqueando la membrana porosa (denominada de
aquí en adelante en este documento membrana transcripcional) para
inhibir la reacción no específica con un espécimen, poniendo en
contacto la membrana transcripcional con un espécimen durante un
cierto período de tiempo, por cuya operación un autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg en el espécimen, si existe
alguno, se une a un antígeno inmovilizado en la membrana
transcripcional anteriormente mencionada para formar un complejo
inmune, si se requiere lavándolo, y luego ponerlo en contacto con
un segundo anticuerpo marcado capaz de unirse al autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg (en algunos casos, puede
permitirse al espécimen ponerse en contacto con el segundo
anticuerpo marcado al mismo tiempo). Si se forma el complejo inmune
anterior, un segundo anticuerpo marcado se une a éste, por lo cual
el segundo anticuerpo marcado también se fija en la membrana
transcripcional. A partir de ahí, la cantidad del segundo anticuerpo
marcado que se une a la membrana transcripcional es determinada de
acuerdo con el método de medida dependiendo del marcaje usado, y la
existencia o la cantidad del autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg puede ser confirmada u obtenida a partir de
los valores medidos.
La existencia o la cantidad del autoanticuerpo
de la proteína anti-Reg puede ser determinada, por
ejemplo, midiendo un espécimen que no contenga el autoanticuerpo de
la proteína anti-Reg y un espécimen que contenga
una cantidad prefijada de autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg simultáneamente con la medida de un
espécimen que se analice, y comparando los valores de los
especímenes respectivos. Así, el título del autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg puede ser expresado como los
valores convertidos en los valores estándar.
En la presente invención, "medida"
significa la detección no sólo cuantitativa o semicuantitativa, sino
también la detección cualitativa.
La electroforesis de proteínas Reg puede ser
lograda, por ejemplo, por una variedad de electroforesis conocidas
tales como la electroforesis de poliacrilamida SDS, la
electroforesis de gel de poliacrilamida nativo, el enfoque
isoeléctrico por gel, etc. Entre ellos, la electroforesis de
poliacrilamida SDS se prefiere ya que las proteínas pueden ser
separadas basado en su peso molecular y la transcripción es
eficiente.
Como método de transcripción subsecuente de la
molécula de proteína separada por electroforesis en una membrana
porosa, por ejemplo, se incluyen un método conocido que utilice un
fenómeno capilar (método capilar), un método que utilice la
capacidad de difusión natural (método de difusión) y un método que
utilice la electroforesis (electroforesis), y los similares. Entre
ellos, la electroforesis es preferida en vista del tiempo de
operación así como de las características cuantitativas y la
reproducibilidad en la detección.
Como membrana porosa, puede ser utilizada una
membrana conocida usada en la técnica de inmunotransferencia tal
como la membrana de nitrocelulosa, la membrana de
poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF), etc. Preferiblemente,
la membrana de PVDF es preferida en vista de su alta capacidad de
unión a las proteínas en la transcrip-
ción.
ción.
Como agente bloqueante para membranas
transcripcionales, por ejemplo, puede ser utilizada una solución
conocida usada en la técnica de inmunotransferencia tal como una
solución de material de caseína incluyendo leche sin grasa, una
solución de material de gelatina, una solución de material de
albúmina de suero bovino (BSA),
etc.
etc.
Puede permitirse que un espécimen reaccione
directamente con una membrana transcripcional, y cuando el título
del anticuerpo sea alto, puede ser diluido. Cuando se usa un
espécimen diluido, puede ser utilizada una solución conocida usada
en la técnica de inmunotransferencia tal como una solución salina de
fosfato tamponada (en lo sucesivo en este documento abreviado como
PBS), tampón de fosfato, etc., pero se prefiere usar la misma
solución que se usa en el bloqueo en vista de la disminución de la
adsorción no específica.
Como solución lavadora en el lavado usado
después de la reacción con un espécimen, puede ser utilizada una
solución conocida usada en la técnica de inmunotransferencia,
incluyendo, por ejemplo, PBS, tampón fosfato, etc. Además, puede
ser usada una solución tampón que contenga un tensioactivo no iónico
tal como Tween 20 a una concentración de 0,05-5% en
peso.
Como segundo anticuerpo marcado que se usa para
detectar la formación de un complejo inmune que sea el resultado de
la reacción de un autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg con un componente de antígeno capaz de
unirse específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg, los anticuerpos preparados marcando un
anticuerpo contra un autoanticuerpo en un espécimen con una variedad
de materiales de marcaje es ejemplificado, aunque no haya ninguna
limitación, siempre que puedan unirse como segundos anticuerpos
marcados al autoanticuerpo de la proteína anti-Reg
en una membrana transcripcional. El anticuerpo que puede marcar se
incluye, por ejemplo, el anticuerpo anti-IgG, el
anticuerpo anti-IgM, el anticuerpo
anti-IgA, el anticuerpo anti-IgE,
etc., o sus fragmentos parcialmente descompuestos
(F(ab')_{2}, Fab, etc.), Los segundos anticuerpos
específicos en autoanticuerpos respectivos pueden ser usados solos
o en combinación. Los segundos anticuerpos pueden ser policlonales o
monoclonales, pero los anticuerpos policlonales son preferidos en
vista de su sensibilidad. Además, el anticuerpo que ha sido
purificado por la purificación de afinidad con una molécula de
anticuerpo como ligando es más preferido en vista de su
sensibilidad.
sensibilidad.
Como material de marcaje usado en el marcaje de
los segundos anticuerpos, por ejemplo, pueden ser utilizados una
enzima o un isótopo radiactivo. La enzima incluye, por ejemplo,
maleato deshidrogenasa (enzima Nº 1.1.1.37),
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa
(enzima Nº 1.1.1.49), glucosa oxidasa (enzima Nº 1.1.3.4),
peroxidasa de rábano picante (enzima Nº 1.11.1.7), acetilcolina
esterasa (enzima Nº 3.1.1.7), fosfatasa alcalina (enzima Nº
3.1.3.1), glucoamilasa (enzima Nº 3.2.1.3), lisozima (enzima Nº
3.2.1.17), \beta-galactosidasa (enzima Nº
3.2.1.23), y otras similares. Entre ellos, el marcaje con la
peroxidasa de rábano picante se prefiere ya que puede ser usada en
un sistema de detección altamente sensible en el cual la luz es
emitida con luminol añadiendo peróxido de hidrógeno a un sustrato
para exponer la película de rayos X.
De forma alternativa, en lugar de una enzima, el
RI puede ser hecho unido al segundo anticuerpo para obtener una
señal de actividad de RI. Como solución usada en la reacción del
segundo anticuerpo con la membrana de transcripción, puede ser usada
una solución conocida usada en la técnica de inmunotransferencia tal
como solución de bloqueo, PBS, solución
trío-tampón. En la operación de lavado después de la
reacción del segundo anticuerpo, pueden ser utilizadas las diversas
soluciones de lavado anteriormente mencionadas.
Para detectar el autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg por inmunoensayo utilizando una variedad de
materiales de marcaje, por ejemplo, la proteína Reg se inmoviliza
físicamente o químicamente en un vehículo para proporcionar un
antígeno inmovilizado, lo cual permite poner en contacto con un
espécimen en calentamiento durante un cierto período de tiempo.
Así, si el autoanticuerpo de la proteína anti-Reg
existe en el espécimen, el autoanticuerpo se une al antígeno
inmovilizado para formar un complejo inmune en el vehículo. Esto es,
de ser requerido, se lava, y luego se permite poner en contacto con
un segundo anticuerpo marcado contra el anticuerpo anteriormente
mencionado en el espécimen (en algunos casos, se puede permitir al
espécimen ponerse en contacto con el segundo anticuerpo marcado al
mismo tiempo).
Si se forma el complejo inmune, el segundo
anticuerpo marcado se une a ello, que así es inmovilizado en el
vehículo. A partir de ahí, el segundo anticuerpo marcado unido al
vehículo o el segundo anticuerpo marcado sin vehículo se analiza
cuantitativamente de acuerdo con un método de medida dependiendo de
su marcaje. Así, puede confirmarse la existencia o la cantidad del
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg a partir de
los valores medi-
dos.
dos.
Los vehículos, que particularmente no están
limitados siempre que sean capaces de inmovilizar el antígeno,
incluyen, por ejemplo, materiales plásticos tales como poliestireno,
cloruro de vinilo, etc., materiales de fibra tales como celulosa,
nitrocelulosa, nilón, etc., materiales inorgánicos tales como
vidrio, gel de sílice, etc., eritrocitos, liposoma, PDVF, y otros
similares La forma de ellos puede ser cualquier forma de placa de
microtítulo, perlas, perlas magnéticas, disco de papel, membranas,
cuerdas, y otros similares. En vista de la conveniencia,
preferiblemente son usadas las perlas de poliestireno o placas de
microtítulo, y una placa de microtítulo es más preferi-
ble.
ble.
Para inmovilizar la proteína Reg físicamente en
un vehículo, por ejemplo, se permite que una solución que contiene
la proteína Reg se ponga en contacto con un vehículo a una
temperatura baja (por ejemplo, 4ºC) de la noche a la mañana.
Para inmovilizar la proteína Reg anteriormente
mencionada químicamente en un vehículo, por ejemplo, la proteína
Reg se mezcla con una carbodiimida y un vehículo que tenga grupos
carboxilo en la superficie, y se deja a la mezcla reposar.
Para prevenir la unión no específica de otros
anticuerpos y similares en un espécimen en el vehículo, es apropiado
bloquear la superficie del vehículo con leche sin grasa, albúmina
de suero bovino (BSA), etc., antes de la adición del espécimen.
Como solución lavadora, por ejemplo, puede ser
usada tris-tampón o tampón fosfato que contenga un
tensioactivo.
En el segundo anticuerpo marcado que se usa, el
anticuerpo que se marca puede ser el anticuerpo ejemplificado en la
técnica de inmunotransferencia.
Como materiales de marcaje usados en el marcaje
del segundo anticuerpo, pueden ser usados materiales fluorescentes
tales como fluoresceina, coloides metálicos tales como coloide de
oro, coloides no metálicos tales como coloide de selenio,
partículas coloreadas tales como partículas de resina coloreadas,
partículas de tinte de liposoma coloreadas, y similares, además de
los materiales de marcaje que se ejemplifican en la técnica de
inmunotransfe-
rencia.
rencia.
Entre estos materiales de marcaje, es preferible
usar una enzima en vista de la sensibilidad, seguridad y
conveniencia, etc. Como anticuerpos marcados por enzima, se usan
preferiblemente anticuerpos marcados con fosfatasa alcalina o
anticuerpos marcados con peroxidasa de rábano picante en vista del
punto de que una medida fácil y alta de la sensibilidad es posible.
Estos anticuerpos marcados con enzima están disponibles en el
comercio.
Para unir el anticuerpo al material de marcaje,
un material químico tal como la biotina, avidina, estreptoavidina,
digoxigenina, etc., puede hacerse para que intervenga entre el
anticuerpo y el material de marcaje.
En la detección de los autoanticuerpos de la
proteína anti-Reg utilizando un método de
aglutinación de látex, por ejemplo, se inmoviliza un componente de
antígeno capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg físicamente o químicamente en
partículas de látex (vehículo) para preparar un antígeno
inmovilizado, al cual entonces se permite ponerse en contacto con un
espécimen con calentamiento durante un cierto período de tiempo, y
se mide la turbiedad de la mezcla del espécimen y el antígeno
inmovilizado. El contacto del antígeno inmovilizado con el
espécimen, si un autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg existe en el espécimen, podría conducir a
la formación de un complejo inmune por la reacción del anticuerpo y
del antígeno. Durante esta reacción, ya que la molécula de
anticuerpo tiene dos sitios de unión al antígeno, esto funciona
como un agente de reticulación para generar la reacción de
aglutinación. Esta reacción aumenta la turbiedad de la mezcla del
espécimen y el antígeno inmovilizado, y la turbiedad se mide
visualmente o con adsorciometría.
En lugar de partículas de látex en el método de
aglutinación de látex, pueden ser usadas otras diversas partículas
tales como eritrocitos o liposomas.
En los reactivos para diagnosticar enfermedades
autoinmunes, diabetes mellitus, diabetes mellitus dependiente de
insulina, y diabetes mellitus no dependiente de insulina de la
presente invención, la composición del reactivo es variable
dependiendo del método con el que se detecte el autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg. Sin embargo, siempre que el
reactivo contenga un componente de antígeno capaz de unirse
específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg como componente principal eficaz, no hay
ninguna limitación particular en la composición del reactivo para
detectar los autoanticuerpos de la proteína anti-Reg
como se menciona anteriormente.
Como componente de antígeno capaz de unirse
específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg, pueden ser usados los componentes de
antígeno que se ilustran en el método anteriormente mencionado para
detectar los autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg.
Como composición del reactivo de diagnóstico de
la presente invención, por ejemplo, cuando se usa la técnica de
inmunotransferencia, puede ser ejemplificado un reactivo que
comprende separadamente a un agente de proteína Reg preparado para
la electroforesis de poliacrilamida SDS y un segundo anticuerpo
marcado que reacciona con el autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg que se detecta. En el reactivo de
diagnóstico para los autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg utilizando un inmunoensayo usando una
variedad de materiales marcados, por ejemplo, puede ser
ejemplificado un reactivo que comprenda separadamente un vehículo en
el cual una proteína Reg se inmoviliza y un segundo anticuerpo
marcado que reaccione con el autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg que se detecta. En los reactivos de
diagnóstico para los autoanticuerpos de proteína
anti-Reg utilizando la aglutinación de látex, por
ejemplo, puede ser ejemplificado un reactivo de partículas de látex
(vehículo) en el cual se inmoviliza una proteína
Reg.
Reg.
Como segundo anticuerpo marcado usado en los
reactivos de diagnóstico anteriores, puede ser usado el segundo
anticuerpo marcado como se ejemplifica en el método anteriormente
mencionado para detectar los autoanticuerpos de proteína
anti-Reg. Como segundos anticuerpos marcados que se
usan en un espécimen, es preferible usar uno o varios de los
anticuerpos marcados contra cualquier clase de anticuerpos. Estos
segundos anticuerpos marcados pueden ser proporcionados
separadamente o como una mezcla.
En los reactivos de diagnóstico de la presente
invención, además de la composición anterior del reactivo, pueden
ser usados otros agentes auxiliares o materiales auxiliares en
combinación con kits de diagnóstico.
Por ejemplo, en los reactivos de diagnóstico
anteriores que utilizan la técnica de inmunotransferencia, el otro
componente incluye, por ejemplo, gel para electroforesis, membrana
para la transcripción, solución de bloqueo, espécimen de control
negativo, espécimen de control positivo, solución de lavado,
sustrato de reacción en el que el material de marcaje es una enzima
y similares, diluyente, activador, agente de terminación de la
reacción, y otros similares Estos pueden ser usados solos o en
combinación. La forma del reactivo puede ser, por ejemplo, en un
kit que contenga las cantidades necesarias de los componentes
anteriores. En los reactivos de diagnóstico que usan un
inmunoensayo con los diversos materiales de marcaje anteriores, el
otro componente incluye, por ejemplo, el espécimen de control
negativo, el espécimen de control positivo, la solución de lavado,
el sustrato de reacción en el que el material de marcaje es una
enzima y similares, el diluyente, el activador, el agente de
terminación de la reacción, y otros similares. Estos pueden ser
usados solos o en combinación. La forma del reactivo puede ser, por
ejemplo, un kit que contenga las cantidades necesarias de los
componentes anteriores, o el producto a granel solo de estos
reactivos.
reactivos.
En los reactivos de diagnóstico que usan la
aglutinación de látex anterior, el otro componente incluye, por
ejemplo, el espécimen de control negativo, el espécimen de control
positivo, el activador, y otros similares. El activador incluye, por
ejemplo, albúmina de suero bovino, polietilenglicol, y otros
similares.
En los reactivos de diagnóstico de la presente
invención, las enfermedades objetivas que se diagnostican o
predicen, que particularmente no están limitadas siempre que las
enfermedades sean enfermedades autoinmunes causadas por la
existencia de los autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg, incluyen, por ejemplo, diabetes mellitus,
diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus no
dependiente de insulina, hepatoma, cáncer de colon, cáncer de
intestino delgado, pancreatitis, úlcera gástrica, y la enfermedad de
Alzheimer. Entre ellas, la diabetes mellitus se prefiere en vista de
su alta tasa positiva, y más preferidas son la diabetes mellitus
dependiente de insulina y la diabetes mellitus no dependiente de
insulina.
La Figura 1 es un gráfico que muestra la
distribución de los títulos de anticuerpo relativos de
autoanticuerpos de la proteína anti-Reg en pacientes
de diabetes mellitus dependiente de insulina y en voluntarios sanos;
y
La Figura 2 es un gráfico que muestra la
distribución de los títulos de anticuerpo relativos de
autoanticuerpos de la proteína anti-Reg en pacientes
de diabetes mellitus no dependiente de insulina y en voluntarios
sanos.
La presente invención será explicada más
detalladamente mediante los Ejemplos siguientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Como especímenes, fueron usados sueros recogidos
de 75 voluntarios sanos (No DM) y 202 pacientes de DMDI.
Fue insertado cDNA de REG I\alpha humano de
longitud completa en el vector pPIC 3.5 (comprado en la compañía
Funakoshi, Ltd.; fabricado por Invitrogen Corp.). El vector de
expresión resultante fue transformado en la levadura Pichia
pastoria GS115 (comprado en la compañía Funakoshi, Ltd.;
fabricado por Invitrogen Corp.) para proporcionar la levadura
recombinante que produce y secreta la proteína Reg humana en el
medio de cultivo.
Esta levadura recombinante de Pichia
pastoria GS115 (REG I\alpha-13 humana) que
contiene un vector en el cual fue insertado el cDNA de REG
I\alpha-13 humana fue depositado en la Agencia de
Ciencia Industrial y Tecnología, Instituto Nacional de Biociencia y
Tecnología humana (código postal 305-8566;
1-3, Higashi 1-chome, ciudad
Tukuba, Ibaragi, Japón) como el Nº. de entrada
FERMP-17358 el 5 de Abril de 1999, y fue transferido
al deposito internacional como FERM BP-7111 el 30 de
Marzo de 2000 bajo el Tratado de Budapest.
Esta levadura recombinante fue incubada en un
caldo de cultivo de medio BMGY (extracto de levadura del 1%,
peptona del 2%, tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0), base de
nitrógeno de levadura sin aminoácidos del 1,34%, biotina
4x10^{-5}%, glicerol del 1%) a 30ºC durante 18 horas. El caldo
cultivado fue sometido a una centrifugadora, las células
resultantes obtenidas como precipitado fueron suspendidas en un
caldo de cultivo de medio BMMY (extracto de levadura del 1%, peptona
del 2%, tampón fosfato de potasio 100 mM (pH 6,0), base de
nitrógeno de levadura sin aminoácidos (YNB) del 1,34%, biotina
4x10^{-5}%, glicerol, metanol del 1%) y fueron incubadas a 30ºC
durante 72 horas. Durante la incubación, fue añadido metanol en una
cantidad correspondiente al 0,5% del caldo de cultivo cada 24
horas.
Después de la terminación de la incubación, el
caldo de cultivo fue sometido a separación centrífuga para eliminar
las células como un precipitado. El sobrenadante fue ajustado a pH
3,5 con la adición de ácido acético, y las proteínas Reg fueron
adsorbidas en una columna de intercambio iónico usando un aparato de
cromatografía de columna de intercambio iónico STREAMLINE SP
(compañía Pharmacia Biotec, Ltd.). La columna fue lavada con
acetato de sodio 50 mM (pH 3,5) y luego fue eluida con acetato de
sodio 50 mM (pH 3,5) que contenía NaCl 1 M para proporcionar la
proteína Reg.
La proteína Reg (20 \mug) fue tratada con SDS
por un método conocido, luego fue sometida a electroforesis en gel
de poliacrilamida SDS del 15% (9x6 cm), y luego fue transcrita
eléctricamente en una membrana de PVDF hidrófoba (compañía Japan
Millipore, Ltd.). Esta membrana transcrita fue bloqueada en una
solución de leche sin grasa del
5%.
5%.
El suero como espécimen entonces fue diluido
1000 - 20000 veces con la solución de leche sin grasa del 5%, y fue
incubado con la membrana de transcripción bloqueada utilizando un
Screener Blotter Mini 56. Después de un lavado suave, se dejó a la
membrana de transcripción reaccionar con un anticuerpo antihumano
marcado con peroxidasa de rábano picante de conejo (Fabricado por
American Qualex Internacional, Inc.; comercializada por la compañía
Cosmo Bio, Ltd.) diluído 1000 - 20000 veces. La reacción luminosa
fue llevada a cabo con un kit de detección, ECL Western Blotting
Detection System (compañía Amersham, Ltd.) utilizando
quimiluminiscencia para la técnica de inmunotransferencia y fue
expuesto en una película de rayos X. Después del desarrollo de la
película, la película fue secada, y explorada con un explorador para
tomar los datos en un ordenador como datos de
imagen.
imagen.
El autoanticuerpo de la proteína
Anti-Reg fue unido a la proteína Reg para formar un
complejo inmune, por el cual fue unido el segundo anticuerpo
marcado. Por lo tanto, el sustrato emitió luz, por lo cual fue
expuesto a una película de rayos X para dar las bandas. La
absorbancia de la reflexión de las bandas resultantes fue medida
con un software de imagen NIH (adjunto a "Very easy practicet
Image Analysis Text" - NIH Image New Course, Kojima et
al., ed., Yodo-sha (1997)). La absorbancia de un
espécimen de voluntarios sanos, que era la más cercana al valor
promedio, fue asumida como 1, y la absorbancia medida fue expresada
como un título de anticuerpo relativo de los autoanticuerpos de la
proteína anti-Reg. La Tabla 1 y la Figura 1 muestran
la distribución de los títulos de anticuerpo relativos de
autoanticuerpos de proteína anti-Reg en pacientes de
diabetes mellitus dependiente de insulina y en voluntarios sanos. El
valor promedio de títulos de anticuerpo relativos en los
voluntarios sanos fue 1,34, y la desviación típica (SD) fue 1,59.
Así, los pacientes cuyo título de anticuerpo relativo era mayor de
3SD frente al valor promedio del título de anticuerpo relativo de
los voluntarios sanos, es decir, 6.12 o más del título del
anticuerpo relativo, según se juzgó, eran positivos de
autoanticuerpos de proteína anti-Reg. La Tabla 2
muestra el número de personas positivas y negativas en los pacientes
de diabetes mellitus dependiente de insulina y en los voluntarios
sanos así como la tasa positiva. El número de personas positivas
respecto a los autoanticuerpos de proteína anti-Reg
fue 49 en un grupo de diabetes mellitus, y la tasa positiva fue del
24%. Por otra parte, el número de personas positivas de anticuerpo
en los voluntarios sanos fue sólo 2, y la tasa positiva fue del 3% o
menos.
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siguiente)
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Ejemplo
2
Como especímenes, fueron usados sueros recogidos
de 75 voluntarios sanos (No DM) y 368 pacientes de
NDMDI.
NDMDI.
De la misma manera que en el Ejemplo 1, el
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg fue detectado
mediante la técnica de inmunotransferencia. La absorbancia de
reflexión de las bandas dadas por la exposición de una película de
rayos X fue medida mediante un software de imagen NIH de la misma
manera que en el Ejemplo 1. La absorbancia de un espécimen de
voluntarios sanos usados en el Ejemplo 1, que era la más cercana al
valor promedio, fue asumida como 1, y la absorbancia medida fue
expresada como un título del anticuerpo relativo de los
autoanticuerpos de la proteína anti-Reg. La Tabla 3
y la Figura 2 muestran la distribución de los títulos de anticuerpos
relativos de autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg en pacientes de diabetes mellitus no
dependiente de insulina y en voluntarios sanos. De la misma manera
que en el Ejemplo 1, los pacientes cuyo título de anticuerpo
relativo era mayor de 3SD frente al valor promedio del título del
anticuerpo relativo de los voluntarios sanos, es decir, 6,12 o más
del título del anticuerpo relativo, según se juzgó, eran positivos
de autoanticuerpos de la proteína anti-Reg. La
Tabla 4 muestra el número de personas positivas y negativas en
pacientes de diabetes mellitus no dependiente de insulina y
voluntarios sanos así como la tasa positiva. Mientras que el número
de personas positivas de anticuerpo en los voluntarios sanos era
sólo 2, y la tasa positiva era del 3% o menos, el número de
personas que fueron reconocidas positivas respecto a los
autoanticuerpos de la proteína anti-Reg era 55, es
decir, el 15%, en diabetes mellitus no dependiente de
insulina.
insulina.
A partir de los resultados anteriores, fue
encontrado que el 24% o más de los pacientes, de diabetes mellitus
dependiente de insulina y el 15% o más de los pacientes de diabetes
mellitus no dependiente de insulina era debido a diabetes mellitus
autoinmune causada por la existencia de autoanticuerpos de la
proteína anti-Reg. La causa anterior era hasta
ahora desconocida. A partir de los resultados mostrados en la Tabla
2, es supuesto que en dos voluntarios sanos en los que el
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg fue
detectado, la diabetes mellitus autoinmune o diabetes mellitus
dependiente de insulina o la diabetes mellitus no dependiente de
insulina podría ser desarrollada en el futuro. La detección de los
autoanticuerpos de la proteína anti-Reg de acuerdo
con la presente invención permite el diagnóstico de enfermedades de
causa hasta ahora desconocida que son la diabetes mellitus
autoinmune o la diabetes mellitus dependiente de insulina o la
diabetes mellitus no dependiente de insulina, o permite la
predicción de una futura posibilidad de ellas.
De acuerdo con el método para evaluar las
enfermedades autoinmunes de la presente invención, es posible
diagnosticar enfermedades autoinmunes de causa hasta ahora
desconocida cuyas enfermedades están causadas por la existencia de
autoanticuerpos de la proteína anti-Reg.
De acuerdo con el método para evaluar la
diabetes mellitus de la presente invención, es posible diagnosticar
la diabetes mellitus de causa hasta ahora desconocida cuya
enfermedad está causada por la existencia de autoanticuerpos de la
proteína anti-Reg.
De acuerdo con el método para evaluar la
diabetes mellitus dependiente de insulina de la presente invención,
es posible diagnosticar la diabetes mellitus dependiente de insulina
de causa hasta ahora desconocida cuya enfermedad está causada por la
existencia de autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg.
De acuerdo con el método para evaluar la
diabetes mellitus no dependiente de insulina de la presente
invención, es posible diagnosticar la diabetes mellitus no
dependiente de insulina de causa hasta ahora desconocida cuya
enfermedad está causada por la existencia de autoanticuerpos de la
proteína anti-Reg.
De acuerdo con el método para detectar
anticuerpos de la proteína anti-Reg, es posible
proporcionar un método para la detección que puede ser usado para
diagnosticar enfermedades autoinmunes, diabetes mellitus, diabetes
mellitus dependiente de insulina y diabetes mellitus no dependiente
de insulina de causa hasta ahora desconocida cuyas enfermedades
están causadas por la existencia de autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg.
El reactivo para diagnosticar las enfermedades
autoinmunes de la presente invención permite el diagnóstico de
enfermedades autoinmunes de causa hasta ahora desconocida cuyas
enfermedades están causadas por la existencia de autoanticuerpos de
la proteína anti-Reg.
El reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus como se describe en la presente invención permite el
diagnóstico de diabetes mellitus de causa hasta ahora desconocida
cuya enfermedad está causada por la existencia de autoanticuerpos de
la proteína anti-Reg.
El reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus dependiente de insulina de la presente invención permite
el diagnóstico de diabetes mellitus dependiente de insulina de causa
hasta ahora desconocida cuya enfermedad está causada por la
existencia de autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg.
El reactivo para diagnosticar la diabetes
mellitus no dependiente de insulina de la presente invención permite
el diagnóstico de diabetes mellitus no dependiente de insulina de
causa hasta ahora desconocida cuya enfermedad está causada por la
existencia de autoanticuerpos de la proteína
anti-Reg.
Claims (12)
1. Un método para diagnosticar o
predecir el inicio de una enfermedad autoinmune, que comprende la
etapa de detectar la existencia de un autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg en un espécimen de fluido corporal o
tejido.
2. Un método de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que la enfermedad es la diabetes
mellitus.
3. El método de acuerdo con la
reivindicación 2, en el que la diabetes mellitus es la diabetes
mellitus dependiente de insulina o la diabetes mellitus no
dependiente de insulina.
4. Un método para detectar un
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg, que
comprende la etapa de poner en contacto un espécimen con un
componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg y detectar
la formulación de un complejo inmune que es el resultado de la
reacción del autoanticuerpo de la proteína anti-Reg
con el componente de antígeno capaz de unirse específicamente al
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg.
5. Un método para detectar un
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg de acuerdo
con la reivindicación 4, en el que el componente de antígeno capaz
de unirse específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg es una proteína Reg, parte de la proteína
Reg o una proteína Reg sintetizada artificialmente.
6. El uso de un componente de antígeno
capaz de unirse específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg para preparar un reactivo para diagnosticar
una enfermedad autoinmune.
7. El uso de acuerdo con la
reivindicación 6, en el que la enfermedad es la diabetes
mellitus.
8. El uso de acuerdo con la
reivindicación 6 ó 7, en el que el componente de antígeno capaz de
unirse específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg es una proteína Reg, parte de la proteína
Reg o una proteína Reg sintetizada artificialmente.
9. El uso de acuerdo con la
reivindicación 7, en el que la diabetes mellitus es la diabetes
mellitus dependiente de insulina o la diabetes mellitus no
dependiente de insulina.
10. Un reactivo que comprende partículas
de látex, en el que una proteína Reg humana capaz de unirse
específicamente al autoanticuerpo de la proteína
anti-Reg humana es físicamente o químicamente
inmovilizada en la partícula de látex.
11. Un reactivo que comprende a una
proteína Reg humana capaz de unirse específicamente a un
autoanticuerpo de la proteína anti-Reg humana y un
segundo anticuerpo marcado que reacciona con el autoanticuerpo de la
proteína anti-Reg humana.
12. El reactivo de acuerdo con la
reivindicación 10 ó 11, en el que la proteína Reg humana es una
proteína Reg sintetizada artificialmente.
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