JPH01132388A

JPH01132388A - ｒｅｇ遺伝子および該遺伝子にコードされる蛋白質

Info

Publication number: JPH01132388A
Application number: JP7167188A
Authority: JP
Inventors: Hiroshi Okamoto; 宏岡本
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1987-04-09
Filing date: 1988-03-24
Publication date: 1989-05-24

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は哺乳類のｒｅｇ遺伝子および該遺伝子にコード
きれる蛋白質に関する。更に詳細には、ラット再生ラン
ゲルハンス島Ｂ細胞で特異的に発現される２７８１０ｇ
遺伝子、該２７８１０ｇ遺伝子をプローブとして得られ
るヒトｒｅｇ遺伝子およびそれらにコードきれる蛋白質
に関する。

更米久弦遭従来、インスリンを産生ずる膵うンゲルハンス島Ｂ細胞
は極めて再性能に乏しく、これが、−旦Ｂ細胞が傷害さ
れ壊死に陥るとインスリン不足から糖尿病が発症するこ
との主要因と考えられてきた。１９８４年、開本らは９
０％膵切除ラットにニコチン酸アミドなどのポリＡＤＰ
−リボース合成酵素阻害物質を連日投与することにより
膵うンゲルハンス島Ｂ細胞の再生を誘導することに初め
て成功した（　Ｙｏｎｅｍｕｒａ、　Ｙ、　ｅｔ　ａｌ
、、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３３、４０１　（１９８４）
）。また、最近ニコチン酸アミドの大量経口投与により
ヒトインスリン依存性糖尿病の寛解期が延長されること
も報告されてきている（　Ｐｈ、　Ｖａｇｕｅ、　ａｔ
　ａｌ、　Ｌａｎｃｅｔ　Ｖｏｌ、　Ｉ　Ｎｏ、　８５
３３、６１９−６２０．１９８７）。

本発明で用いるデイファレンシ〜ルハインリダイゼイシ
ョンに必要な技術はＴａｋａｓａｗａらによって既に確
立されている（ｒａｋａｓａｗａ、　Ｓ、　ｅｔ　ａｌ
、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３５．１１７８．１９８６）。

即ち、ラット膵Ｂ細胞腫から作成したｃＤＮＡライブラ
リーを、膵Ｂ細胞腫ｐｏｌｙ（Ａ＞”ＲＮＡから調製し
たｃＤＮＡと正常群ランゲルハンス島ｐｏｌｙ（Ａ）”
ＲＮＡから調製したｃＤＮＡをプローブとしたディファ
レンシャルハイプリダイゼイションによりスクリーニン
グし、膵Ｂ細胞腫で特異的に発現する遺伝子の単離に成
功している。

明が解決しようとする問題点従来、糖尿病の治療法としては、インスリン投与という
対症的療法しかない。−時有効性が期待すしたスルホニ
ルウレアなどの経口糖尿病薬は長期投与によりかえって
膵Ｂ細胞のインスリン産生能を障害し、冠動脈硬化症を
誘発するなどの副作用がある。

上記の通りニコチン酸アミドなどのポリＡＤＰ−リボー
ス合成酵素阻害物質を連日投与することにより膵うンゲ
ルハンス島Ｂ細胞が再生することが知られているが、そ
の原因の遺伝子レベルでの解明は全く為きれていなかっ
た。

問題点を解決するだめの手段本発明者は、膵うンゲルハンス島Ｂ細胞の再生増殖機構
を遺伝子レベルで解明するため、ラット再生膵うンゲル
ハンス島Ｂ細胞で特異的に発現される遺伝子を探索し、
ラッｈｒｅｇ遺伝子と命名する遺伝子を見出し、さらに
該２７８１０ｇ遺伝子をプローブとしてヒトにおけるｒ
ｅｇ遺伝子を探索し、ヒト膵ｃＤＮＡライブラリーから
ヒトｒｅｇ遺伝子を見出し、本発明を完成するに至った
。

まず、再生膵Ｂ細胞を得るために９０％膵切除ラットを
調製する。この方法は、Ｆｏｇｌｉａ、　Ｖ、　Ｇ。

（Ｒｅｖ、　Ｓｏｃ、　Ａｒｇｅｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　
２０．２１−３７．１９４４＞により確立されている。

９０％膵切除をうけたラットは１ケ月以内に糠床病状態
に陥るが、ニコチン酸アミドを９０％膵切除約１週間前
から約３ケ月後まで連日投与（約ｏ、５ｇ／ｋｇ体重）
することにより、残存群中でランゲルハンス島の再生が
誘導きれる。再生群ランゲルハンス島は公知のコラゲナ
ーゼ法（Ｏｋａｍｏｔｏ、　Ｈ，ｅｔ　ａｌ、　ＦＥＢ
Ｓ　Ｌｅｔｔ５４、１０３　（１９７５）；由来博、開
本宏内分泌実験講座第３巻、２７８　（１９８２Ｌ講談
社サイエンティフィク）により分離する。

得られた分離再生ランゲルハンス島をホモジネートシ、
濃度勾配遠心分離などによってＲＮＡを回収する。これ
はＣｈｉｒｇｗｉｎらの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ１９７９；　ｔｓ：　５２９４−９９）に従えばよい
。

回収されたＲＮＡから、公知のオリゴ（ｄＴ）セルロー
スクロマトグラフィーによりｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡを
分離した。これは、１ＡｖｉｖとＰ、　Ｌｅｄｅｒの方
法（Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ
、　６９．１４０８−１４１２．１９７２〉　に従う。

分離したｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡを鋳型として、逆転写
酵素によってｃＤＮＡを合成し、ＣＤＮＡＲＮＡのハイ
ブリッドをＲＮａｓｅｌとＤＮＡポリメラーゼで処理し
て２本鎖ＣＤＮＡを得る。これは基本的にＵ、　Ｇｕｂ
ｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ荏、　２６３−２６９．１９
８３）による。また、市販のＣＤＮＡ調製用のキット（
例えば、Ａｍｅｒｓｈ、ａｍ社製ｃＤＮＡ合成システム
）を用いれば容易にｃＤＮＡが調製できる。

得られた２本鎖ＣＤＮＡは適当なりローニゲベクターに
挿入し、得られたベクターを適当な宿主に導入して増殖
させ、ラット再生ランゲルハンス島ＯＮＡライブラリー
とする。適切なりローニゲベクターとしては、λｇｔｌ
ｏなどのファージベクター、ｐＮ０１５２３、ｐＫＢｌ
ｌｌ、ｐＢＲ３２２、ｐＵｃ、　Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅ
ｒｇ。

Ｃｏ１Ｅ１、Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ−Ｍｅｓｓｉｎｇなど
のプラスミドベクターが挙げられ、適切な宿主としては
、ｐ：、ｃｏｌｉＫ−１２ＨＢ１０１株、Ｃ６００株、
Ｌ８７株、ＮＭ５１４株などがか挙げられる。上記のベ
クターおよび宿主は市販されており容易に入手できる。

また、市販のｃＤＮＡクローニングシステム（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ社）などを用いれば容易にｃＤＮＡがクローニ
ングできる。

再生群Ｂ細胞で特異的に発現きれる遺伝子を見出すため
には、まずｃＤＮＡライブラリーから、インスリンｃＤ
ＮＡクローンを除いておくことが好ましい。なぜならば
、Ｂ細胞中に存在するｍＲＮＡの多くはインスリンｍＲ
ＮＡであり、これは再生群Ｂ細胞で特異的に発現きれる
遺伝子のスクリーニングの障害になる。よって、まず各
ｃＤＮＡライブラリーの一部をニトロセルロースフィル
ターに固定し、ラットインスリンｃＤＮＡ（代謝ＶＯＬ
、　１７　Ｎｏ。

７、１１８５　（１９８０））とハイブリダイズさせ、
ハイブリダイズしなかった非インスリンｃＤＮＡクロー
ンを以下のスクリーニングに供する。

再生ランゲルハンス島Ｂ細胞で特異的に発現きれる遺伝
子をスクリーニングするためには、公知のディファレン
シャルスクリーニング法（Ｔａｋａｓａｗａ、　Ｓ、　
ｅｔ　ａｌ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３５．１１７８　（
１９８６）などで用いられている）を適応すればよい。

即ち、ｃＤＮＡライブラリーから、それぞれのサンプル
を２組のニトロセルロースフィルターに固定スる。１組
のフィルターはラット再生ランゲルハンス島ｐｏｌｙ（
Ａ）”ＲＮＡから調製したｃＤＮＡをプローブとし、他
の１組は正常ランゲルハンス島１）０１ｙ（Ａ）”ＲＮ
Ａから調製したｃＤＮＡをプローブとしてハイブリダイ
ズさせる。２組のフィルターのオートラジオダラムを比
較して、再生ランゲルハンス島から調製したプローブの
みがハイブリダイズしたクローンを選択し、再生ランゲ
ルハンス島Ｂ細胞で特異的に発現される遺伝子のｃＤＮ
Ａクローンを得る。

本発明を追試する時には、このスクリーニングは第１図
に示される塩基配列を参照してプローブを作成し使用す
れば、容易に行ない得る。

本発明においては、１種類のラット再生ランゲルハンス
島Ｂ細胞で特異的に発現される遺伝子のｃＤＮＡクロー
ンが得られた。この遺伝子はランゲルハンス島Ｂ細胞の
再生（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　）に深く関与してい
るものと考えられｒｅｇ遺伝子と命名された。

このｃＤＮＡの塩基配列を公知のＭ１３ヘクター系を用
いたＳａｎｇｅｒらの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙｌｏｌ、　２０−７８．１９８３）
により決定した（第１図）。

この塩基配列および推定きれるアミノ酸配列に関して各
種のホモジネートを行なったが、５０％以上のホモロジ
ーを示すものは無く、全く新規なりＮＡおよび蛋白質で
あることが判明した。また、ラットｒｅｇ遺伝子ｍＲＮ
Ａの発現レベルを、ラット正常ランゲルハンス島、肝臓
、腎臓、脳、インスリノーマで分析したところ、極めて
低かった。

、本発明のラットｒｅｇ蛋白質は、第１図に示されるア
ミノ酸配列を有する蛋白質に限定されるものではなく、
多少のアミノ酸残基の置換、脱離、挿入、付加によって
も、またその一部でも、その活性は保持されるものと考
えられ、そのような同等の活性を有する蛋白質も、本発
明の範囲内である。また、ラットｒｅｇ遺伝子に関して
も、第１図に示される塩基配列を有するものに限定され
るものではなく、上記のような種々の蛋白質をコードす
る種々の遺伝子も本発明の範囲内と考えられる。

さらに、ラットｒｅｇ蛋白質はそのＮ末端が疎水性のア
ミノ酸に富み、シグナルシーケンスであると推定される
。すなわち、本発明のラットｒｅｇ遺伝子にコードされ
る成熟蛋白質は、第１図中の２２番目のアミノ酸残基Ｇ
ｌｎに始まり１６５番目のＡｌａで終わる配列からなる
。また、Ｎ末端のＭ　ｅ　ｔは細胞中で除去され、ｒｅ
ｇ蛋白質の活性には直接関係しない可能性があるため、
第１図中のＭ　ｅ　ｔ　（１番目）、Ｔｈｒ（２番目）
またはＧｌｎ（２２番目）に始まりＡｌａ（１６５番目
）で終わる配列を有する蛋白質と同等の活性を有する蛋
白質も、本発明に包含される。同様に、本発明は、上記
３種の蛋白質をコードする遺伝子すなわち、第１図中の
第１番目のコドンＡＴＧ。

２番目のコドンＡＣＴまたは２２番目のコドンＣＡＧに
始まり１６５番目のコドンＧＣＣまたは終止コドンで終
わる塩基配列を包含する。ラットｒｅｇ蛋白質を遺伝子
工学的に製造する場合には、５′末端に開始コドンＡＴ
Ｇ（Ｍｅｔをコードする）を有する配列を用いるのが好
ましい場合があり、よって、上記の種々の遺伝子の５′
末端にさらにＡＴＧが連結された遺伝子も、本発明の範
囲内である。同様に、上記の種々の蛋白質のＮ末端にさ
らにＭ　ｅ　ｔが付加された蛋白質も本発明に包含され
る。

ヒトｒｅｇは上記のラットｒｅｇの塩基配列の一部また
は全部をプローブとして利用することによりヒト膵ｃＤ
ＮＡライブラリーから調製することができる。

ヒトＰＩ＃ｃＤＮＡライブラリーは以下のようにして調
製される。

ヒト手術摘出群をホモジネートし、濃度勾配遠心分離な
どによってＲＮＡを回収する。これはＣｈｉｒｇｗｉｎ
らの方法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７９：　１
８：　５２９４−９９）に従えばよい。

回収されたＲＮＡから、公知のオリゴ（ｄＴ）セルロー
スクロマトグラフィーによりｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡを
分離した。これは、Ｈ，ＡｖｉｖとＰ、　Ｌｅｄｅｒの
方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　６９．１４０８−１４１２．１９７２）に従う。

分離したｐｏｌｙ（Ａ）″ＲＮＡを鋳型として、逆転写
酵素によってｃＤＮＡを合成し、ｃＤＮＡ・ＲＮＡのノ
ーイプリ・ンドをＲＮａｓｅ）ＩとＤＮＡポリメラーゼ
で処理して２本鎖ＣＤＮＡを得る。これは基本的にＵ、
　Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２
６９．１９８３＞による。また、市販のｃＤＮＡ調製用
のキット（例えば、Ａｍａｒｓｈａｍ社製ωＮＡ合成シ
ステム）を用いれば容易にｃＤＮＡが調製できる。

得られた２本鎖ＣＤＮＡは適当なりローニゲベクターに
挿入し、得られたベクターを適当な宿主に導入して増殖
させ、ヒト膵ｃＤＮＡライブラリーとする。適切なりロ
ーニゲベクターとしては、λ匹１０などのファージベク
ター、ｐＮ０１５２３、ｐＫＢｌｌｌ、ｐＢＲ３２２、
ｐＵｃ、　Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ、　Ｃｏ１Ｅ１、
Ｈｅｉｄｅｃｋｅｒ−１ｉｅｓｓｉｎｇなどのプラスミ
ドベクターが挙げられ、適切な宿主としては、Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ−１２Ｈ８１０１株、Ｃ６００株、Ｌ８７株、
ＮＭ５１４株などがが挙げられる。上記のベクターおよ
び宿主は市販きれており容易に入手できる。また、市販
のｃＤＮＡクローニングシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ社
）などを用いれば容易にｃＤＮＡがクローニングできる
。

得られたｃＤＮＡライブラリーから上記のラットｒｅｇ
遺伝子を用いたプローブによりヒトｒｅｇ遺伝子を検出
する。該プローブは、上記で得られたラットｒｅｇ遺伝
子を適当に制限酵素などを用いて切断したり、適当な部
分をＤＮＡ自動合成機により作製して得られたＤＮＡ断
片をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼなどを用いて標識す
ることにより調製できる。このプローブを上記のｃＤＮ
Ａライブラリーとハイブリダイズさせる。陽性のクロー
ンのうち最長のＤＮＡインサートを含むクローンからＤ
ＮＡを分離し、塩基配列を決定したところ、該遺伝子は
ラットｒｅｇ遺伝子と７７％のホモロジーを示し、ヒト
ｒｅｇ遺伝子であると確認された。両遺伝子から推定さ
れるアミノ酸配列も６８％のホモロジーを示した。該ヒ
トｒｅｇ遺伝子の塩基配列およびそれから推定きれるア
ミノ酸配列を第３図に示す。

ヒトｒｅｇ遺伝子から推定されるアミノ酸配列は、その
Ｎ末端付近が疎水性アミノ酸に富み、シグナルシーケン
スであると推定される。よって、該ヒｈｒｅｇ遺伝子が
コードする成熟蛋白質は、第３図に示されるアミノ酸配
列のうち、Ｎ末端から２１番目のＧｌｙ、２２番目のＧ
ｌｎ、２４番目のＡｌａ、２５番目のＧｌｎ、３０番目
のＧｌｎまたは３１番目のＡｌａからはじまるものであ
ると考えられる。従って、本発明はこれら成熟蛋白質を
も提供するものである。またこれらの蛋白質を遺伝子組
換技術を用いて製造する場合、そのＮ末端に開始コドン
由来のＭ　ｅ　ｔが付随することがある。よって本発明
はさらに上記蛋白質のＮ末端にＭ　ｅ　ｔを有する蛋白
質を包含する。

同様に、本発明は、第３図に示されるアミノ酸配列のう
ち、Ｎ末端から１番目のＡｌａ、２１番目のＧｌｙ、２
２番目のＧｌｎ、２４番目のＡｌａ、２５番目のＧｌｎ
、３０番目のＧｌｎまたは３１番目のＡｌａから始まり
１６５番目のＡｓｎで終わるアミノ酸配列をコードする
遺伝子、もしくは、該遺伝子の５°末端に開始コドンお
よび／または３゛末端に終止コドンを接続した遺伝子、
およびこれらの遺伝子を含む発現ベクターなどの遺伝子
を包含する。きらに詳しくは、第３図に示詐れる塩基配
列のうち、５°末端から工番目のコドンＧＣＴ、２１番
目のコピ２０００１２２番目のコドンＣＡＡ、２４番目
のコドンＧＣＣ，２５番目のコドンＣＡＧ、３０番目の
コドンＣＡＧまたは３１番目のコドンＧＣＣから始まり
１６５番目のコドンＡＡＣで終わる塩基配列からなる遺
伝子、もしくは、該遺伝子の５゛末端に開始コドンおよ
び／または３′末端に終止コドンを接続した遺伝子、お
よびこれらの遺伝子を含む遺伝子を提供するものである
が、上記蛋白質の発現においては、上記アミノ酸配列を
コードしているものであれば使用でき、これらの特定の
遺伝子に限定されるものではない。

周知の通り、本明細書中でいう開始コドンはＡＴＧを、
終止コドンはＴＡＡ、ＴＡＧまたはＴＧＡを意味する。

また、本発明のｒｅｇ遺伝子にコードきれるｒｅ’ｇ蛋
白質は、第３図に示されるアミノ酸配列を有する蛋白質
に限定されるものではなく、多少のアミノ酸残基の置換
、脱離、挿入、付加によっても、またその一部でも、そ
の活性は保持されるものと考えられ、そのような同等の
活性を有する蛋白質も、本発明の範囲内である。また、
ｒｅｇ遺伝子に関しても、第３図に示される塩基配列を
有するものに限定詐れるものではなく、上記のような種
々の蛋白質をコードする種々の遺伝子も本発明の範囲内
と考えられる。

得られたｃＤＮＡは、公知の方法により発現できる。例
えば、該ｃＤＮＡを適切なプロモーター（ｌａｃ、　Ｔ
ａｃ、　Ｔｒｐｓ　ＰＬなど）の制御下に適切な発現ベ
クター（ｐＫＫ２２３−３、ｐＢｓ、　ｐＤＲ５４０、
ｐＤＲ７２０、ｐＰＬ−１ａｍｂｄａなど）に挿入し、
宿主（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２ＡＧ−１、ＭＭ２９４、
Ｄ）＋１、）ＩＢＩＯＩ、Ｃ６００など）に導入して発
現させればよい。ｒｅｇ遺伝子にコードきれるｒｅｇ蛋
白質が糖鎖を有している場合には、宿主として酵母や猿
細胞などの真核細胞を用いるのが好ましい。例えば、酵
母を用いる場合には、発現ベクタ〜とじてｐＧＰＤ−１
、ｐＭＦα８、ＡＡＲ６、ＡＢａｄｅ８、Ａ）１５、Ｙ
Ｅｐ５２、ｐＡｃＦ３０１、ｐＡＭ８２など様々な公知
のべフターが使用可能である。ＣｏＳ猿細脳細胞用する
場合には、ｐＫｓＶ−１０などの発現ベクターが使用で
きる。上記の宿主−ベクター系に限らず公知の宿主−ベ
クター系はほとんどｒｅｇ蛋白質の発現に適応できるも
のと考えられる。

発現されたｒｅｇ蛋白質は、従来の精製法に従い、遠心
分離、クロマトグラフィー、透析、塩析などを適当に組
み合わせて精製すれば良い。

さらに、本発明は、上記のヒトまたはラットｒｅｇおよ
びその遺伝子産物に限定されるものではなく、ヒトｒｅ
ｇとラットｒｅｇが、また、それらがコードする蛋白質
が高い相同性を示すことを考慮すれば、当然他種の哺乳
類にもｒｅｇ様遺伝子が存在すると推定され、特にその
膵臓において発現されインスリン産生ランゲルハンス島
の再生増殖に関与している可能性がある。よって、本発
明は、そのような他種の哺乳類のｒｅｇおよびその産物
も包含する。言い換えれば、本発明は、本明細書中で特
定されるヒトまたはラットｒｅｇの塩基配列を参照して
調製きれるプローブとハイブリダイズする遺伝子を含む
。即ち、本発明のヒトｒｅｇの調製法と同様にして、ヒ
トまたはラットｒｅｇまたはその一部をプローブすれば
、他種の哺乳類の膵臓のｃＤＮＡライブラリーから、ヒ
トまたはラッ）ｒｅｇに高い相同性を示す遺伝子を調製
することができる。使用するプローブとしては、ヒトま
たはラットｒｅｇの全部または一部（２０〜１００塩基
が好ましい）からなるラベルされたヌクレオチドが望ま
しい。本発明は、当然そのような遺伝子にコードきれる
蛋白質も包含する。

従って、本明細書中、ｒｅｇ遺伝子およびｒｅｇ蛋白質
とは、ヒトおよびラットだけでなく全ての哺乳類のもの
を意味する。

衷及■ユ ■、ラット再生膵ランゲルハンス島の分離（１）９０％
膵切除体重２００〜３００ｇのＷｉｓｔａｒ系雄ラットをエー
テル麻酔下に開腹後、帝胆管分節（ｐａｒａｂｉｌｉａ
ｒｙ　ｓａｇｍｅｎｔ）を除く膵（群全体の９０％に相
当）を切除して開腹した。この９０％膵切除術は、Ｆｏ
ｇｌｉａ、　ｖ、　Ｇ、　（Ｒｅｖ、　Ｓｏｃ、　Ａｒ
ｇｅｎｔ、　Ｂｉｏｌ、　２０、２１−３７．１９４４
）により確立され、インスリン依存性糖尿病モデルの作
製に広く用いられている。

９０％膵切除をうけたラットは１ケ月以内に糖尿病状態
に陥る。

（２）　　ニコチン酸アミドの投与９０％膵切除７日前より術後３ケ月まで、０゜５ｇ／ｋ
ｇ体重のニコチン酸アミド（５０ｍｇ／ｍ＋生理食塩水
）を−日一回腹腔内に投与した。

このニコチン酸アミド投与により９０％膵切除ラットの
糖尿病状態が予防改善される。

■）再生ランゲルハンス島の分離上記（１）、（２）により、残存群中でランゲルハンス
島の再生が誘導され、膵単位体積あたりの数、ランゲル
ハンス島１個あたりのサイズとも増加する。増加した細
胞の大部分はインスリン産生Ｂ細胞であり、グルカゴン
産生Ａ細胞およびソマトスタチン産生り細胞の数は不変
である（　Ｙｏｎｅｍｕｒａ。

Ｙ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｄｉａｂｅｔｅｓ　３３．４０１
　（１９８４））。術後３ケ月目に、９０％膵切除・ニ
コチン酸アミド投与ラットを、ネンプタール麻酔下に開
腹し、残存膵をハンクス液で膨化きせた後摘出した。摘
出群を、２残存膵当り５ｍｌのハンクス液中で細切後、
１５０ｍｇの牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ。

Ｔｙｐｅ　Ｖ　）および４０　ｍ　ｇのコラゲナーゼ（
Ｔｙｐｅ■、和光純薬製）を加え、３７°Ｃで３〜５分
間振とうして消化した。消化後５０ｍ１のハンクス液中
テ懸濁し、５分間静置させてランゲルハンス島を沈降さ
せた後、上層の半量を捨て、新たに２５ｍ１のハンクス
液を加え再懸濁した。この懸濁・静置操作を８回繰り返
した後、実体顕微鏡下で再生ランゲルハンス島を採取し
た。３２匹の９０％膵切除・ニコチン酸アミド投与ラッ
トから１３５５個の再生ランゲルハンス島が回収された
。上記の方法は、基本的に白木と開本の方法（内分泌実
験講座第３巻、２７８　（１９８２）　、講談社サイエ
ンティフィック）に従う。

■、ラット再生膵ランゲルハンス島ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ　ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）ラ
イブラリーの作製（１）　　ＲＮＡの分離分離再生ランゲルハンス島を４Ｍチオシアン酸グアニジ
ン、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．
５％ラウリルサルコシンナトリウム、０．１Ｍ２−メル
カプトエタノールＡｎｔｉｆｏａｍ　Ａ　（Ｓｉｇｍａ
）中で超音波によりホモジネート後、密ｉ１．６　４の
セシウムトリプルオロ酢酸（　Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）
上に重着し、２５″′Ｃ、４４．００Ｏｒｐｍで工４〜
１６時間遠心した。遠心後、ＲＮＡ沈殿を回収した。１
３５５個の再生ランゲルハンス島から８８５μｇのＲＮ
Ａが得られた（　Ｃｈｉｒｇｗｉｎ，　Ｊ．　Ｍ．ら、
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７９；　１８：５２９
４−９９参照）。

（２）　　Ｐｏｌｙ（Ａ）“ＲＮＡの分離（１）で得ら
れたＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）セルロースカラムクロマ
トグラフィーにより１７．２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）”Ｒ
ＮＡを分離した（　Ｈ．　Ａｖｉｖ　＆　Ｐ．　Ｌｅｄ
ｅｒ。

Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｌｌ
．Ｓ．Ａ．　６９．　１４０８−１４１２。

１９７２参照）。

（３）　　ｃＤＮＡライブラリーの作製２μｇの再生ラ
ンゲルハンス島ｐＯ１ｙ（Ａ）”ＲＮＡを鋳型とし、オ
リゴ（ｄＴ）をブライマーとして、４０単位の逆転写酵
素と４２℃、１時間反応させて１８２ｎｇのｃＤＮＡ　
（ｆｉｒｓｔ　’ｓｔｒａｎｄ）を合成した。得られた
ｃＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを０．７５単位のＲＮａ
ｓｅＨ，４６単位のＤＮＡポリポリーゼＬ　４．＃ｆ位
のＴ４ＤＮＡポリメラーゼで処理し、２８４ｎｇの２末
鎖Ｃ［）ＮＡを得た。上記のｃＤＮＡの合成は基本的に
Ｕ．　Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ　２５，　２６
３−２６９　（１９８３））による。

ｃＤＮＡ（２本鎖）を１５ｊｌｔ位のＥｃｏＲＩメチラ
ーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＬａｂｓ）で処
理後、ＥｃｏＲＩリンカ−　（４５０ｎｇ）と１７５単
位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）で１３°Ｃ４５時間
反応許せ連結した。

上記産物を７６単位のＥｃｏＲＩ　（宝酒造）で３７℃
２時間消化後、セファクリルｓ−１０００（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　）にかけ、ｃＤＮＡと消化リンカ−とを分離
した。ここまでのステップで２１４ｎｇのＥｃｏ　ＲＩ
メチラーゼ処理ＥｃｏＲＩ断片・２末鎖ｃＤＮＡが回収
された。

上記のｃＤＮＡのうち２０ｎｇを１．２３μｇのλｇｔ
ｌｏ　ａｒｍｓ　（ＥｃｏＲＩ消化後ア消化リアルカリ
フォスファターゼを脱リン酸化したもの．　Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社製）とＴ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造、１１
６単位）で、１３℃１５時間で連結させた。連結したλ
匹１〇ー再生うンゲルハンス島ｃＤＮＡを、Ｇｉｇａｐ
ａｃｋ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてパッケー
ジング後、Ｅ．ｃｏｌｉ　Ｋ１２由来のＹ１０８９　（
ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ．　ｖｏｌ．　Ｌ４９−７８．
　１９８５，　ＵＲＬ　Ｐｒｅｓｓ）に感染させ、総計
２、８Ｘ１０’の形質転換体を得た。

■．再生ラうゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリーのディ
ファレンシャルスクリーニング：再生ランゲルハンス島
で特異的に発現される遺伝子の単離上記■で作製したラ
ット再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリーのうち
任意に選んだ５０００個の独立プラークから、個々にフ
ァージをマイクロタイタープレート（９６穴）中の０．
５０Ｄａｏｏ相当のＹ１０８９を含むＮＺＹ−０．２％
マルトース培地（１％ＮＺアミン、０．５％バクトイ−
ストエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム、０．２
％マルトース）につまようじを用いて接種し、３７℃で
１夜インキユベートして増殖させた。

得られたファージ液を２μｍずっニトロセルロースフィ
ルター（　Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　Ｓｃｈｕｅ
１社、ＢａＢ４）にスポットし、ニックトランスレーシ
ョン法によＩ）ｓ！Ｐで標識したラットインスリンＩ［
　ｃＤＮＡ　トハインリダイズさせた。この結果、１６
％のクローンがインスリンｃＤＮＡクローンとして同定
され、残る８４％の非インスリンｃＤＮＡクローンを以
下のスクリーニングに供した。

ラット再生ランゲルハンス島または無処置ラット正常ラ
ンゲルハンス島ｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡ（　１　５　０
　ｎｇ）を４１ｎｇのオリゴ（ｄＴ）＋＊−１ｍ，　２
　０　ｍＭ　ｄＡＴＰ，２０ｍＭｄＴＴＰ，２０ｍＭｄ
ＧＴＰ。

２　　μ　ＭｄｃＴＰ，　　６０　　μ　ｃ−ｉ　　［
　ａ−”Ｐ　　コ　ｄＣＴＰ　（　Ａｍｅｒｓｈａｍ社
）の存在下に１５単位の逆転写酵素（生化学工業）と、
３７°Ｃで２時間インキュベートスル。０．３Ｎ水酸化
ナトリウムでＲＮＡ鎖ヲ分解（１００’Ｃ，２分ン後、
生成きれた３１ｐ標識ｌ末鎖ｃＤＮＡをエタノール沈殿
法で回収した。この方法により１〜２　Ｘ　１０　’ｃ
ｐｍ／μｇ　ｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡの比活性を有する
プローブが得られた。

非インスリンｃＤＮＡクローンのファージ液を２μＩｆ
つ２組のニトロセルロースフィルターにスポットし、フ
ィルターを０．５Ｍ水酸化ナトリウム／１．５Ｍ塩化ナ
トリウム、次いで０．５Ｍトリス塩酸（ｐＨ８，０）／
１．５Ｍ塩化ナトリウムで、室温で各５分間処理後、２
ＸＳＳＣ（ｔＸｓＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０
．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に浸した後、８０℃で
２時間固定した。

ＤＮＡを固定したニトロセルロースフィルターを３ＸＳ
ＳＣ中で６５℃３０分、３ＸＳＳＣおよびＩ　Ｘ　Ｆ　
Ｂ　Ｐ　（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ、
　０．０２％Ｆｉｃｏ１１４００．０．０２％牛血清ア
ルブミン、０．０２％ポリビニルピロリドン）中で６５
℃１時間反応させた後、１Ｍ塩化ナトリウム、５０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ７，４）、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．１
％ＳＤＳ、ＩＸＦＢＰ、１０μｇ　／　ｍ　１サケ皐丸
ＤＮＡ、　　２５０μｇ／ｍｌ　ｐｏｌｙ（Ｕ）　（７
フルマシア）中で、６５℃１時間プレハイブリダイゼー
ションさせた。１組のフィルターはラット再生ランゲル
ハンス島ｐｏｌｙ（Ａ）″ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ
（１゜５Ｘ１０’ｃｐｍ）をプローブ（前記）とし、他
の１組は無処置ラットから分離した正常ランゲルハンス
島ｐｏｌｙ（Ａ）”ＲＮＡから調製したｃＤＮＡ　（１
、５Ｘ１０’ｃｐｍ）をプローブ（前記）として、１Ｍ
塩化ナトリウム、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７゜４）、
１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８，０）、ｏ、ｉ％ＳＤＳ、２
５０μｇ　／　ｍ　Ｉ　ｐｏｌｙ（Ｕ）中で、６５℃で
１６時間ハイブリダイズさせた。

ハイブリダイゼーション後、フィルターを２×ＳＳＣで
室温で１〜２分間２回洗浄し、０．１×５ＳＣ１０，１
％ＳＤＳ中で６５℃、４０分、４回洗浄後、８０°Ｃで
１時間乾燥許せた後、−８０℃で１夜オートラジオグラ
フイーを行なった。

その結果、再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡと特異的にハ
イブリダイズする１種類のクローンが得られた。

■、再生ラうゲルハンス島Ｂ細胞で特異的に発現される
遺伝子の構造決定上記■で得られた再生ランゲルハンス島で特異的に発現
される遺伝子のｃＤＮＡクローンからファージＤＮＡを
精製後（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ参照）、
ＥｃｏＲ工で消化し、１％アガロースゲル電気泳動でｃ
ＤＮＡ挿入物をファージベクターａｒｍｓから分離した
。

分離したｃＤＮＡの塩基配列をＭ１３ベクター系（ｍｐ
１８、ｍｐ１９．７フルマシア）を用いたＳａｎｇｅｒ
法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１
０１．２０−７８．１９８３）により決定した。

その結果、再生ランゲルハンス島で特異的に発現される
転写物は、ポリ（Ａ）部分を除き、全長７４９ヌクレオ
チドで、メチオニンに始まりアラニンに終わる１６５ア
ミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていた。全塩基配
列および推定されるアミノ酸配列を第２図に示す。

Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（）Ｉｅｉｄｅｒｂｅｒｇ）
　、ＧｅｎＢａｎｋ　（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ。

Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）　、Ｎａｔｉｏｎａｌ　
ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｆｏｕｎｄａ
ｔｉｏｎ　（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　ＤＣ）の核酸・
蛋白質データベースのコンピューター探索（Ｗｉｂｕｒ
、劉Ｊ、　＆　Ｌｉｐｍａｎ、　Ｄ、　Ｊ、、Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　１９８３．８０．７２
６−７３０の方法による）の結果、今回クローン化され
たｃＤＮＡの塩基配列および推定されたアミノ酸配列は
いずれの既知の遺伝子・遺伝子産物とも異なっており、
５０％以上のｈｏｍｏｌｏｇｙを示す遺伝子・遺伝子産
物はデータベース中に見出されなかった。

従って、今回再生ランゲルハンス島ｃＤＮＡライブラリ
ーからクローン化きれたｃＤＮＡは従来報告きれていな
い全く新しい遺伝子と対応するものと考えられ、この遺
伝子をｒｅｇ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ　　ｇｅｎｅ
）と命名した。

Ｖ、ｒｅｇ　　ｍＲＮＡの検討ラット再生ランゲルハンス島、正常ランゲルハンス島か
らＩ［−（１）の方法でＲＮＡを分離し、各４μｇを１
，１Ｍホルマリンで変性後、１．１Ｍホルマリンを含む
１．５％アガロース電電気泳動ユニトロセルロースフィ
ルター移した。フィルターヲ８０°Ｃで２時間固定後、
５０％ホルムアミド、５ＸＦＢＰ、５ＸＳＳＰＥ（ｌＸ
５ＳＰＥ：　０．１８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，７）、１ｍＭＥＤＴＡ）
、２５０ｙｇ／ｍ＋サケ率丸ＤＮＡ、０．１％ＳＤＳ中
で４２℃、４時間プレハイブリダイズし、次いでニック
トランスレーションでｓｔｐ標識したｒｅｇ　ｃＤＮＡ
（２０Ｄｇ／ｍｌ）を含む５０％ホルムアミド、ＩＸＦ
ＢＰ、５ＸＳＳＰＥ、、０．１％ＳＤＳ、１００８ｇ　
／　ｍ　１サケ率丸ＤＮＡ溶液中で４２℃２０時間ハイ
ブリダイズし、２ＸＳＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で室温３
０分２回、０．ｌＸ５ＳＣ１０，１％ＳＤＳ中で３７°
Ｃ１時間２回洗浄後、オートラジオグラフィー（−８０
°Ｃ）を行なった。

その結果、ｒｅｇ　ｍＲＮＡは鎖長約９００ヌクレオチ
ドで、その含量は再生ランゲルハンス島で高く、正常ラ
ンゲルハンス島では極めて低かった。

上記と同じ方法で、ラット肝臓、腎臓、脳、インスリノ
ーマ（Ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ誘発）のｍＲＮＡ
を分析した結果、これらの組織でのｒｅｇ　ｍＲＮＡレ
ベルは極めて低かった。

衷厘里１ａ）ヒトで再生ランゲルハンス島を調製することは困難
であるため、ヒト手術摘出群からｃＤＮＡライブラリー
を作製した。ラットでは膵組織中にｒｅｇｍＲＮＡが検
出されている。

ｂ）ＲＮＡの分離手術摘出膵を４Ｍチオシアン酸グアニジン、１０ｍＭク
エン酸ナトリウム（ｐＨ７，０）、０．５　　・％ラウ
リルサルコシンナトリウム、０．１Ｍ２−メルカプトエ
タノール、１％Ａｎｔｉｆｏａｍ　Ａ（Ｓｉｇｍａ）中
でポリトロンによりホモジネート後、密度１．６４のセ
シウムトリフルオロ酢酸（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）上に
重層し、２５℃、４４．００　Ｏｒｐｍで１４〜１６時
間遠心した。遠心後、ＲＮＡ沈殿を回収した。５００ｍ
ｇの膵組織から２゜５２６ｍｇのＲＮＡが得られた（　
Ｃｈｉｒｇｗｉｎ、　Ｊ。

毘ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１９７９；　１８：
５２９４−９９参照）。

ｃ　）　Ｐｏ１ｙ（Ａ）”ＲＮＡの分離ｂ）で得られた
ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ’）セルロースカラムクロマト
グラフィーにより１７．５６μｇのｐｏ　ｌｙ　（Ａ　
）　”　ＲＮＡを分離した（　Ｈ，Ａｖｉｖ　＆　Ｐ、
　Ｌｅｄｅｒ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、
Ｓ、Ａ、　６９．１４０８−１４１２、１９７２参照）
。

ｄ）ｃＤＮＡライブラリーの作製１μｇのヒト膵ｐｏｌｙ（ＡνＲＮＡを鋳型とし、オリ
ゴ（ｄｌ）をブライマーとして、４０単位の逆転写酵素
と４２℃、１時間反応きせて約１１００ｎの♂ＮＡ　（
ｆｉｒｓｔ　５ｔｒａｎｄ）を合成した。得られたＣＤ
ＮＡ・ＲＮＡハイブリッドを０．７５単位のＲＮａｓｅ
Ｈ１４６単位のＤＮＡポリポリーゼＩ、４単位のＩ　４
ＤＮＡポリメラーゼで処理し、約１５０ｎｇの２木鎖ｃ
ＤＮＡを得た。上記のｃＤＮＡの合成は基本的にＵ、　
Ｇｕｂｌｅｒらの方法（Ｇｅｎｅ　２５．２６３−２６
９　（１９８３））による。

ｃＤＮＡ（２本鎖）を１５単位の）：ｃｏＲＩメチラー
ゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理
後、ＥＣｏＲ１リンカ（４５０ｎｇ）と１７５単位のＴ
４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造）で１３°Ｃ４５時間反応さ
せ連結した。

上記産物を７６単位のＥｃｏＲＩ　（宝酒造）で３７’
Ｃ２時間消化後、セファクリルＳ−１００５−１Ｏ００
（Ｐｈａｒ　）にかけ、ｃＤＮＡと消化リンカ−とを分
離した。ここまでのステップで１７．６　ｎ　ｇのＥｃ
ｏＲＩメチラーゼ処理ＥｃｏＲＩ断片・２木鎖ｃＤＮＡ
が回収きれた。

上記のｃＤＮＡを１．０ｙｇのλｇｔｌｏ　ａｒｍｓ　
（ＥｃｏＲＩ消化後ア消化リアルカリフォスファターゼ
を脱リン酸化したもの、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）と
Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（宝酒造、１１６単位）で、１３℃
１５時間で連結させた。連結した入ｇｔｌＯ−ヒト膵ｃ
ＤＮＡを、Ｇｉｇａｐａｃｋ　（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ
社製）を用いてパッケージング後、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１
２由来のＹ１０８９　（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

ｖｏｌ、　１．４９−７８．１９８５．　ＵＲＬ　Ｐｒ
ｅｓｓ）に感染させ、総計６Ｘ１０’の形質転換体を得
た。

ａ）ヒト膵ｃＤＮＡライブラリーを０．５０Ｄ、。。

相当の大腸菌Ｙ１０８９を含むマルトース培地（０，２
％マルトース、１％ＮＺアミン、０．５％バクトイ−ス
トエキストラクト、０．５％塩化ナトリウム）中で３７
℃にて１晩増殖させた後、直径１５０ｍｍの寒天培地に
１０６個のプラークを発育許セニトロセルロースフィル
ターに移した。

ｂ）ラットｒｅｇの塩基番号７６−１３５（第１図参照
）に相当する６０塩基のオリゴデオキシリボヌクレオチ
ドをアプライドバイオシステムズモデル３８０Ｂ　　Ｄ
ＮＡ合成機で人工合成し、その５′末端を［７Ｓａｐコ
ＡＴＰとＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて３！Ｐ
標識した。

Ｃ）ａ）のフィルターを、０．５Ｎ水酸化ナトリウム／
１．５Ｍ塩化ナトリウム、０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ
８，０）／１．５Ｍ塩化ナトリウムで室温で各５分間処
理後、２ＸＳＳＣ（ｌＸ５ＳＣ；０．１５Ｍ塩化ナトリ
ウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）に浸した後、
８０℃で２時間焼結した。このフィルターを６ＸＳＳＣ
，５ＸＦＢＰ（ＩＸＦＢＰ；　０．０２％フィコール４
００．０゜０２％牛血清アルブミン、０．０２％ポリポ
リルヒロリドン）、０．１％ＳＤＳ、２００１１ｇ／ｍ
１大腸菌ｔＲＮＡ溶液中で５０°Ｃで４時間プレハイブ
リダイズさせた後、２ｎｇ／ｍｌのＳＩＰ標識オリゴデ
オキシリボヌクレオチドを含む６ＸＳＳＣ，ＩＸＦＢＰ
、０．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍ１大腸菌ｔＲＮＡ溶
液中で５０℃で１２〜１６時間ハイブリダイズさせ、６
ＸＳＳＣ，０，１％ＳＤＳで５０℃にて３０分間４回洗
浄した。

ｄ）その結果、１０８個のヒト膵ｃＤＮＡクローン中５
８個のクローンが６０塩基のラットｒｅｇプローブとハ
イブリダイズした。

ｅ）これら陽性クローンのうち最長のｃＤＮＡｉ　ｎ５
ｅｒｔ（約９００ヌクレオチド）を有するクローンから
ＤＮＡを分離し、ＥｃｏＲＩで消化後、ｐＢｓベクター
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）のＥｃ。

Ｒ１部位にサブクローニングした。

■、ヒトｒｅ　　　ｃＤＮＡ塩基配列の決定ａ）ｐＢｓ
ベクターにサブクローニングしたｃＤＮＡの塩基配列を
Ｓａｎｇｅｒ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　ｌｏｔ、　２０−７８．１９８３）により決定
した。

ｂ）その結果、ヒトｒｅｇ　　ｃＤＮＡはポリ（Ａ）を
除き、全長７４９ヌクレオチドで、メチオニンにはじま
りアスパラギンで終わる１６６アミノ酸残基からなる蛋
白質をコードしていた。

Ｃ）ヒトｒｅｇ遺伝子がコードする蛋白質はラットｒｅ
ｇ遺伝子がコードする１６５アミノ酸残基の蛋白質より
１アミノ酸残基分長く、コード域のホモロジーは塩基配
列で７５％、アミノ酸配列で６８％であった。

ｄ）ヒトｒｅｇ蛋白質のＮ末端には、疎水性アミノ酸に
富む配列が存在しており、これは分泌蛋白質にみられる
シグナルペプチドに特徴的なものである。即ち、ヒトｒ
ｅｇ蛋白質に於ては、Ｍｅｔ（−１）に始まりＧｌｎ（
２０）、Ｇｌｙ（２１）、Ｇｌｕ（２３）、Ａｌａ（２
４）、Ｐｒ。

（２９）または５ｅｔ（３０）までの配列がシグナルペ
プチドであると推定された。

発明の効果本発明のｒｅｇ遺伝子はインスリン産生群Ｂ細胞の再生
に密接に関与すると考えられ、この遺伝子のコードする
蛋白質を大量生産し、投与可能な医薬として開発するこ
とにより、糖尿病患者自身の膵Ｂ細胞の再生賦活という
、従来のインスリン投与法に優る糖尿病治療の断方向が
開かれる。

また、膵Ｂ細胞の再生増殖機構については全く不明であ
ったが、ｒｅｇ遺伝子が単離きれたことにより、これを
細胞レベル、分子レベルで明らかにする手がかりが得ら
れた。

本発明のｒｅｇ遺伝子をプローブとして利用すれば、ヒ
トおよびラット以外の哺乳類の同等の遺伝子を得て、さ
らにその遺伝子産物を得ることも可能である。

【図面の簡単な説明】

第１図はラットｒｅｇ遺伝子の塩基配列および該塩基配
列から推定されるアミノ酸配列を示す。第２図はラッｈｒｅｇ遺伝子ｃＤＮＡの全塩基配列およ
び該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を示す。第３
図はヒトｒｅｇ遺伝子ｃＤＮＡの塩基配列および該塩基
配列から推定されるアミノ酸配列を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）第１図または第３図に示すアミノ酸配列をコード
する塩基配列の全部または一部からなるプローブとハイ
ブリダイズする遺伝子。
（２）該塩基配列が第１図または第３図に示す塩基配列
からなることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子。
（３）該遺伝子が哺乳類の膵臓で発現されることを特徴
とする請求項１または２に記載の遺伝子。
（４）該哺乳類がヒトまたはラットであることを特徴と
する請求項３に記載の遺伝子。
（５）第１図に示されるアミノ酸配列の一部または全部
を有する蛋白質と同等の活性を有する蛋白質をコードす
る遺伝子。
（６）第１図に示されるアミノ酸配列の一部または全部
を有する蛋白質をコードすることを特徴とする請求項５
に記載の遺伝子。
（７）該アミノ酸配列が第１図中のＭｅｔ（１位）、Ｔ
ｈｒ（２位）、Ｇｌｎ（２２位）またはＭｅｔ−Ｇｌｎ
（２２位）に始まりＡｌａ（１６５位）に終わることを
特徴とする請求項５または６に記載の遺伝子。
（８）第１図に示される塩基配列の一部または全部を有
することを特徴とする請求項５〜７のいずれかに記載の
遺伝子。
（９）該塩基配列が第１図中のコドンＡＴＧ（１位）、
コドンＡＣＴ（２位）、コドンＣＡＧ（２２位）または
コドンＡＴＧ−ＣＡＧ（２２位）に始まりコドンＧＣＣ
（１６５位）または終止コドンで終わることを特徴とす
る請求項８に記載の遺伝子。
（１０）第３図に示されるアミノ酸配列の一部または全
部を有する蛋白質と同等の活性を有する蛋白質をコード
する遺伝子。
（１１）第３図に示されるアミノ酸配列の一部または全
部を有する蛋白質をコードすることを特徴とする請求項
１０に記載の遺伝子。
（１２）該アミノ酸配列が第３図中のＡｌａ（１位）、
Ｇｌｙ（２１位）、Ｇｌｎ（２２位）、Ａｌａ（２４位
）、Ｇｌｎ（２５位）、Ｇｌｎ（３０位）またはＡｌａ
（３１位）から始まりＡｓｎ（１６５位）で終わること
を特徴とする請求項１０または１１に記載の遺伝子。
（１３）該遺伝子が、第３図に示される塩基配列の５’
末端から１番目のコドンＧＣＴ、２１番目のコドンＧＧ
Ｃ、２２番目のコドンＣＡＡ、２４番目のコドンＧＣＣ
、２５番目のコドンＣＡＧ、３０番目のコドンＣＡＧま
たは３１番目のコドンＧＣＣから始まり１６５番目のコ
ドンＡＡＣで終わる塩基配列からなることを特徴とする
請求項１０〜１２のいずれかに記載の遺伝子。
（１４）請求項１０〜１３のいずれかに記載の遺伝子の
５’末端に開始コドンおよび／または３’末端に終止コ
ドンを接続した遺伝子。
（１５）請求項１〜１４のいずれかに記載の遺伝子にコ
ードされる蛋白質。