EP1019441A2 - Anti-bip-antikörper bei rheumatoider arthritis sowie verfahren und testkits zu ihrer bestimmung - Google Patents

Anti-bip-antikörper bei rheumatoider arthritis sowie verfahren und testkits zu ihrer bestimmung

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EP1019441A2
EP1019441A2 EP98958806A EP98958806A EP1019441A2 EP 1019441 A2 EP1019441 A2 EP 1019441A2 EP 98958806 A EP98958806 A EP 98958806A EP 98958806 A EP98958806 A EP 98958806A EP 1019441 A2 EP1019441 A2 EP 1019441A2
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EP
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bip
antibodies
buffer
ionic
bound
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EP98958806A
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Stefan BLÄSS
Gerd-R. Burmester
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Individual
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the invention relates to anti-heavy chain binding protein antibodies (anti-BiP antibodies) and to methods and test kits for determining anti-heavy chain binding protein (anti-Grp78) antibodies in body fluids. It relates in particular to the detection of these antibodies as autoantibodies for the serological diagnosis of rheumatoid arthritis in differential diagnosis to other diseases of the rheumatic type in vitro.
  • Rheumatoid arthritis is the most common inflammatory joint disease, which affects approximately 1-2% of the population. Autoantibodies, especially rheumatoid factors, develop in the course of the disease. Rheumatoid factors have so far been the only serological markers used to diagnose RA. However, they are also detectable in other diseases of the rheumatic type, such as systemic lupus erythematosus, systemic scleroderma and mixed collagen diseases, and even in the healthy population. The specificity of the rheumatoid factor for RA is only 74%, its frequency among RA patients 68% (Bläß St, Specker Ch, Lakomek HJ, Schneider EM, Schwochau M.
  • RA rheumatoid arth ⁇ tis
  • BiP Heavy Chain Binding Protein
  • Glucose Regulated Protein 78 is a so-called molecular chaperone that occurs in the endoplasmic reticulum and is responsible for the folding and complexation of proteins that take the secretory path. It belongs to the Hsp70 family of stress proteins and is an ubiquitously expressed, highly conserved protein that is essential in yeast. BiP was so far not associated with rheumatoid arthritis. This may be due to the fact that the anti-BiP antibodies are directed against a glycosidic epitope which is not expressed in the expression systems used hitherto.
  • the invention has for its object to provide anti-heavy chain binding protein antibodies from patients with rheumatoid arthritis, a safe method for
  • anti-BiP antibodies were obtained by binding natural (biochemically purified) or recombinant BiP to a solid phase and using them to enrich the antibodies from body fluids.
  • the antibodies are detached from the antigen-antibody complex with the aid of chaotropic substances.
  • BiP is natural (biochemically purified) or recombinantly on solid
  • the antigen in its glycosylated form is particularly preferred.
  • Body fluids consist of binding the protein BiP to solid phases and in the
  • BiP is adsorptively or covalently bound to solid phases, if necessary after prior chemical activation of the solid phase.
  • Antigen is used natural (biochemically purified) or recombinant BiP.
  • the solid phase consists of polystyrene, polyvinylidene fluoride or nitrocellulose in different geometric shapes, such as .Microtitration plates, tubes or in a spherical or sheet-like shape.
  • the anti-BiP antibodies are determined bound in the immunoassay.
  • the bound anti-BiP antibodies are detected by specific conjugates, which are directed against single immunoglobulin classes or against several.
  • the test kit according to the invention for the determination of anti-BiP antibodies is characterized by:
  • BiP in purified or recombinant form, which is bound to a solid phase by adsorption or covalently,
  • a buffer for the dilution of the biological fluid to be examined which contains non-ionic or ionic detergents or proteins,
  • a specific conjugate consisting of an antibody which is directed against human immunoglobulin IgG, IgM, IgA or more of these immunoglobulins and an enzyme or a fluorescent dye or a radioactively labeled component, a buffer for diluting the conjugate, which contains non-ionic or ionic detergents or proteins,
  • a buffer for washing (removing) the unbound immunoreactants which contains nonionic or ionic detergents or proteins
  • a substrate solution for the detection of the enzyme reaction and
  • BiP has an essential function within the cell, a connection between antibody formation and pathogenesis can be established.
  • the antibodies according to the invention represent an important finding for differential diagnosis with respect to other diseases of the rheumatic type in which these antibodies do not occur.
  • established methods such as enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), sandwich ELISA and immunoblot are used in immunology.
  • ELISA enzyme linked immunosorbent assay
  • sandwich ELISA sandwich ELISA
  • immunoblot immunoblot
  • the analysis of the antibody reactivities in the ELISA has the advantage in comparison to the immunoblot method, that it saves time and costs. That is why the ELISA is used as a screening method.
  • the immunoblot is used. Based on the detection of a serological marker (anti-bip antibody) in patients with rheumatoid arthritis, according to the invention autoantibodies against BiP in patients with rheumatoid arthritis could be detected in 66% of the cases in the ELISA and in the immunoblot.
  • Patient sera were tested for auto-reactivity against purified (natural) BiP.
  • the anti-BiP antibodies occur with high frequency in RA patients. These antibodies are primarily directed against a glycosidic epitope, the main determinant of which is N-acetylglucosamine.
  • BiP was characterized on the basis of its molecular and biochemical properties (relative molecular mass, isoelectric point, amino acid sequence).
  • Salts e.g. 3 M guanidinium isothiocyanate solution Wash and concentrate the antibodies
  • sample buffer Phosphate Buffered Saline with Nonidet P40, (PBS-NP40), 0.1%, pH 7.0
  • sample was applied (serum dilution 1:20 in sample buffer) with 50 ⁇ l / well over 3 hours at room temperature (sample application from patient sera and from control sera from healthy donors and patients of the rheumatic type).
  • sample application from patient sera and from control sera from healthy donors and patients of the rheumatic type.
  • standard serum was carried out as a calibration curve in 6 linear dilution steps, starting at 1:10.
  • the washing process was then carried out three times with washing buffer.
  • the measured antibody reactivity of the standard serum at dilution 1:20 was defined as 10,000 relative units (RE).
  • the dilution levels 1: 10, 1: 30, 1: 50, 1: 100, 1: 500 correspond to 20000RE, 6667RE, 4000RE.1000RE, 200RE.
  • the calibration curve and the serum samples were measured in triplicate. If the antibody reactivity was higher in a serum than in the standard serum, it was measured again at higher dilution levels. The resulting REs were then multiplied by the dilution factor, which was higher than 1: 100.
  • Anti-BiP antibodies were detected in the ELISA in 66% of RA patients and in 0.5% of patients with other rheumatic diagnoses, but not in healthy donors.
  • HeLa cells were lysed in a buffer containing Gardol, urea and 2-mercaptoethanol and incubated at 70 ° C for 15 min.
  • the resulting protein float was taken up in a Lyspuffer which contained the non-ionic detergent NP40 instead of the Gardol and dialyzed against 25mM Tris buffer.
  • the material was precipitated with ethanol and separated on a sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) with a 10-20% acrylamide gradient by molecular weight. Gels were electrotransferred onto polyvinylidene fluoride (PVDF).
  • PVDF polyvinylidene fluoride

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Abstract

Die Erfindung betrifft Anti-Heavy Chain Binding Protein-Antikörper (Anti-BiP-Antikörper) in Körperflüssigkeiten von Patienten mit rheumatoider Arthritis sowie den Nachweis von Anti-BiP-Antikörpern. Sie bezieht sich insbesondere auf den Nachweis dieser Antikörper als Autoantikörper für die serologische Diagnostik einer rheumatoiden Arthritis in Differentialdiagnose zu anderen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises in vitro.

Description

ANTI-BIP-ANTIKÖRPER BEI RHEUMATOIDER ARTHRITIS SOWIE VERFAHREN UND TESTKITS ZU IHRER
BESTIMMUNG
Beschreibung
Die Erfindung betrifft Anti-Heavy Chain Binding Protein-Antikörper (Anti-BiP-Antikörper) sowie Verfahren und Testkits zur Bestimmung von Anti-Heavy Chain Binding Protein (Anti- Grp78)-Antikörpern in Körperflüssigkeiten. Sie bezieht sich insbesondere auf den Nachweis dieser Antikörper als Autoantikörper für die serologische Diagnostik einer rheumatoiden Arthritis in Differentialdiagnose zu anderen Erkankungen des rheumatischen Formenkreises in vitro.
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist die häufigste entzündliche Gelenkerkrankung, von der ca. 1-2% der Bevölkerung betroffen sind. Im Verlauf der Erkrankung kommt es zur Bildung von Autoantikörpern, vor allem Rheumafaktoren. Rheumafaktoren sind bislang die einzigen serologische Marker, die zur Diagnostik der RA eingesetzt werden. Sie sind jedoch auch in anderen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises, wie dem systemischen Lupus erythematodes, der systemischen Sklerodermie und den Mischkollagenosen und sogar in der gesunden Bevölkerung nachweisbar. Die Spezifität des Rheumafaktors für die RA beträgt nur 74%, seine Häufigkeit unter RA-Patienten 68% (Bläß St, Specker Ch, Lakomek HJ, Schneider EM, Schwochau M. Novel 68k autoantigen detected by rheumatoid arthπtis (RA) specific autoantibodies. Ann Rheum Dis 1995;54:355-60). Die RA ist eine sehr heterogene und daher schwer zu diagnostizierende Erkrankung. Zur Diagnosestellung der RA existieren sieben Kriterien des American College for Rheumatism, von denen mindestens vier erfüllt sein müssen (Arnett FC, Edworthy SM, Bloch DA, McShane DJ, Fries JF, Cooper NS, Healey l_A, Kaplan SR, Liang MH, Luthra HS, Medsger TAjr, Mitchell DM, Neustadt DH, Pinals RS, Schaller JG, Sharp JT, Wilder RL, Hunder GG. The American Rheumatism Assocciation 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis. Arhtritis Rheum 1988;31 :315-24). Darunter befindet sich nur ein einziger serologischer Marker, der Rheumafaktor. Daher ist eine Verbesserung der Diagnosestellung durch weitere und ggf. spezifischere serologische Parameter insbesondere auch für eine adäquate und zeitgemäße Behandlung von größter Bedeutung.
Heavy Chain Binding Protein (BiP), ursprünglich beschrieben als Glucose Regulated Protein 78, ist ein sogenanntes molekulares Chaperon, das im endoplasmatischen Retikulum vorkommt und für die Faltung und Komplexierung von Proteinen verantwortlich ist, die den sekretorischen Weg beschreiten. Es gehört zur Hsp70-Familie der Streßproteine und ist ein ubiquitär exprimiertes, hochkonserviertes und in Hefe essentielles Protein. BiP wurde bislang nicht in Zusammenhang mit der rheumatoiden Arthritis gebracht. Dies mag seine Ursache darin haben, daß die Anti-BiP-Antikörper gegen ein glykosidisches Epitop gerichtet sind, das in den bislang eingesetzten Expressionssystemen nicht exprimiert wird.
Der Erfindung liegen die Aufgaben zugrunde, Anti-Heavy Chain Binding Protein-Antikörper von Patienten mit rheumatoider Arthritis zur Verfügung zu stellen, ein sicheres Verfahren zur
Bestimmung von Anti-BiP-Autoantikörpern bereitzustellen sowie entsprechende
Testverfahren zu entwickeln.
Die Aufgaben wurden dadurch gelöst, daß Anti-BiP-Antikörper gewonnen wurden, indem natürliches (biochemisch gereinigtes) oder rekombinantes BiP an eine feste Phase gebunden und zur Anreicherung der Antikörper aus Körperflüssigkeiten verwendet wurde.
Die Ablösung der Antikörper aus dem Antigen-Antikörper-Komplex erfogt mit Hilfe chaotroper Substanzen.
Erfindungsgemäß wird BiP natürlich (biochemisch gereinigt) oder rekombinant an feste
Phasen adsorptiv oder kovalent oder durch Elektrotransfer gebunden und zum Nachweis der Anti-BiP-Antikörper in verschiedenen Immunoassays eingesetzt. Besonders bevorzugt ist das Antigen in seiner glykosylierten Form.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Bestimmung von Anti-BiP-Antikörpern in
Körperflüssigkeiten besteht darin, das Protein BiP an feste Phasen zu binden und im
Immunoassay einzusetzen. Dabei wird BiP adsorptiv oder kovalent an feste Phasen gebunden, gegebenenfalls nach vorheriger chemischer Aktivierung der festen Phase. Als
Antigen wird natürliches (biochemisch gereinigtes) oder rekombinantes BiP eingesetzt.
Die feste Phase besteht aus Polystyren, Polyvinylidenfluorid oder Nitrocellulose in unterschiedlichen geometrischen Formen, wie .Mikrotitrationsplatten, Röhrchen oder in kugelförmiger bzw. flächenförmiger Gestalt. Die Anti-BiP-Antikörper werden gebunden im Immunoassay bestimmt. Dabei erfolgt die
Bindung der Anti-BiP-Antikörper in geeigneten Puffern, die nicht-ionische oder ionische
Detergenzien oder Proteine enthalten. Die gebundenen Anti-BiP-Antikörper werden durch spezifische Konjugate, die gegen einzelne Immunglobulinklassen oder gegen mehrere gerichtet sind, nachgewiesen. Der erfindungsgemäße Testkit zur Bestimmung von Anti-BiP-Antikörpern ist gekennzeichnet durch:
- BiP in gereinigter oder rekombinanter Form, das adsorptiv oder kovalent an eine feste Phase gebunden ist,
- einen Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, der nicht- ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- ein spezifisches Konjugat, bestehend aus einem Antikörper, der gegen humanes Immunglobulin IgG, IgM, IgA oder mehrere dieser Immunglobuline gerichtet ist und ein Enzym bzw. einen Fluoreszenzfarbstoff oder eine radioaktiv markierte Komponente, - einen Puffer zum Verdünnen des Konjugates, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- einen Puffer zum Waschen (Entfernen) der nichtgebundenen Immunreaktanten, der nichtionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält, - eine Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion und
- eine Stoplösung zum Unterbrechen der Enzymreaktion.
Durch die hohe Prävalenz der erfindungsgemäßen Anti-BiP-Antikörper liegt überraschenderweise ein neuer wichtiger diagnostischer Marker vor. Da BiP innerhalb der Zelle eine essentielle Funktion hat, kann ein Zusammenhang zwischen Antikörperbiidung und Pathogenese hergestellt werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper stellen einen wichtigen Befund zur Differentialdiagnose gegenüber anderen Erkrankungen des rheumatischen Formenkreises dar, bei denen diese Antikörper nicht auftreten. Zum Nachweis der Antikörper gegen BiP werden in der Immunologie etablierte Verfahren wie Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Sandwich-ELISA und Immunoblot eingesetzt. Die Analyse der Antikörperreaktivitäten im ELISA hat im Vergleich zu der Methode des Immunoblots vor allem den Vorteil des geringeren Zeitaufwandes und der niedrigen Kosten. Deshalb wird der ELISA als Screening-Methode eingesetzt. Wird eine Feinanalyse der Antikörperreaktivität angestrebt, so kommt der Immunoblot zum Einsatz. Auf der Basis des Nachweises eines serologischen Markers (Anti-Bip-Antikörper) bei Patienten mit rheumatoider Arthritis konnten erfindungsgemäß Autoantikörper gegen BiP bei Patienten mit rheumatoider Arthritis in 66% der Fälle im ELISA und im Immunoblot nachgewiesen werden. Dabei wurden Patientenseren hinsichtlich einer Autoreaktivität gegen gereinigtes (natürliches) BiP getestet. Erfindungsgemäß wurde angezeigt, daß die Anti-BiP-Antikörper bei RA-Patienten mit großer Häufigkeit auftreten. Diese Antikörper richten sich vorwiegend gegen ein glykosidisches Epitop, dessen Hauptdeterminante N-Acetylglucosamin ist. BiP wurde aufgrund seiner molekularen und biochemischen Eigenschaften (relative molekulare Masse, isoelektrischer Punkt, Aminosäuresequenz) charakterisiert.
Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher erläutert, die die Erfindung aber nicht auf diese beschränken sollen.
Ausführungsbeispiele
In die Untersuchungen gingen 214 Patienten mit RA, 47 Patienten mit systemischem Lupus erythematodes, 23 Patienten mit Psoriasis-Arthritis, 24 Patienten mit systemischer Sklerose, 6 Patienten mit Mischkollagenose, 13 Patienten mit Osteoarthrose, 13 mit ankylosierender Spondylitis, 4 mit reaktiver Arthritis, 10 mit Morphea, sowie 100 gesunde Spender ein. Die Reinigung des BiP erfolgte aus HeLa-Zellen, wobei die Reinigungsschritte standardisiert sind.
Beispiel 1
Gewinnung von Anti-BiP-Antikörpern aus Körperflüssigkeiten von Patienten mit RA
Kopplung von BiP an feste Phase Blockierung überzähliger Bindungsstellen Inkubation mit Körperflüssigkeiten von Patienten mit RA Waschen (Entfernen) nicht-gebundener Immunreaktanten Ablösen spezifisch gebundener Anti-BiP-Antikörper durch Behandlung mit chaotropen
Salzen, z.B. 3 M Guanidiniumisothiocyanat-Lösung Waschen und Konzentrierung der Antikörper
Beispiel 2
Herstellung des ELISA zum Nachweis von Anti-BiP-Antikörpern
Beschichtung des BiP an die feste Phase des ELISA Für die Beschichtung wurden 96-Well Polystyren-Platten verwendet. Die Beschichtung erfolgte mit 10-15ng BiP pro Well. Als Benetzungsmedium diente 50mM Carbonatpuffe, pH 9.5. Die Benetzung erfolgte über Nacht bei 4°C. Anschließend wurden die Platten entweder weiter verwendet oder bei -20°C eingefroren. Vor dem Auftrag der Proben erfolgte eine Vorblockierung der Platten mit je 100μl Probenpuffer [Phosphate Buffered Saline mit Nonidet P40, (PBS-NP40), 0.1 %, pH 7.0], anschließend der Probenauftrag (Serumverdünnung 1:20 in Probenpuffer) mit je 50μl/well über 3 Stunden bei Raumtemperatur (Probenauftragung von Patientenseren und von Kontrollseren gesunder Spender und Patienten des rheumatischen Formenkreises). Als Eichkurve wurde ein stark positives Patientenserum (Stadardserum) in 6 linearen Verdünnungsschritten, beginnend bei 1:10 mitgeführt. Anschließend erfolgte dreimal der Waschvorgang mit Waschpuffer. Konjugatzugabe
Die Inkubation mit Alkalische Phosphatase(AP)-markiertem Anti-Human-IgG erfolgte in einer Verdünnung von 1 :3000 in Probenpuffer mit jeweils 50μl/well über 3 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wurde dreimal mit dem Waschpuffer gewaschen. Substratreaktion: Die Färbung der Antigen-Antikörperreaktion erfolgte mit BCIP / NBT (5-Bromo-3-chloro- indolylphosphat / Nitro-Blue Tetrazolium) in alkalischem Puffer.
Die gemessene Antikörperreaktivität des Standardserums in der Verdünnungsstufe 1 :20 wurde mit 10000 Relativen Einheiten (RE) definiert. Die Verdünnungsstufen 1 :10, 1 :30, 1 :50, 1 :100, 1 :500 entsprechen demnach 20000RE, 6667RE, 4000RE.1000RE, 200RE. Die Messung der Eichkurve und der Serenproben erfolgte als Dreifachbestimmung. War die Antikörperreaktivität in einem Serum höher als im Standardserum, so wurde es in höheren Verdünnungsstufen erneut gemessen. Die resultierenden RE wurden dann mit dem gegenüber 1 :100 höheren Verdünnungsfaktor multipliziert. Im ELISA konnten Anti-BiP-Antikörper bei 66% der RA-Patienten und bei 0.5% der Patienten mit anderen Diagnosen des rheumatischen Formenkreises, nicht aber bei gesunden Spendern nachgewiesen werden.
Beispiel 3
HeLa-Zellen wurden in einem Puffer lysiert, der Gardol, Harnstoff und 2-Mercaptoethanol enthielt und bei 70°C für 15 min inkubiert. Die lysierten Zellen wurden mit einer gesättigten Cäsiumchloridlösung bei Raumtemperatur auf eine Dichte von r=1.6g/cm gebracht und für 2 Stunden bei 10,000g ultrazentrifugiert. Das resultierende Proteinfloat wurde in einem Lyspuffer aufgenommen, der anstelle des Gardol das nicht-ionische Detergenz NP40 enthielt und gegen 25mM Tris-Puffer dialysiert. Das Material wurde mit Ethanol gefällt und auf einer Sodium Dodecylsulfat Polyacrylamide Gelelectrophoresis (SDS-PAGE) mit einem 10-20%igen Acrylamidgradienten nach molekularer Masse aufgetrennt. Gele wurden auf Polyvinylidenfluorid (PVDF) elektrotransferiert.
Elektrotransfers wurden mit PBS-NP40 und BSA blockiert und in Streifen geschnitten. Jeder Streifen wurde mit einem in PBS-NP40 1 :20-verdünnten Serum über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Streifen in einem Waschpuffer (PBS-NP40) gewaschen und mit AP-konjugiertem Zweitantikörper inkubiert. Dessen Verdünnung betrug 1 :5,000 in PBS- NP40, seine Inkubationszeit 1 Stunde. Nach erneutem Waschen in PBS-NP40 wurde in AP- Puffer (pH 8.7) inkubiert und Substrat für die Farbreaktion (BCIP/NBT) zugegeben. Bei ausreichender Färbung der Immunreaktionen wurde mit neutralem oder saurem Puffer gestoppt.

Claims

Patentansprüche
1. Neue Anti-Heavy Chain Binding Protein-Antikörper (Anti-BiP-Antikörper) aus Homo sapiens sapiens, erhalten durch Immunadsorption an natürliches (biochemisch gereinigtes) oder rekombinantes BiP aus Homo sapiens sapiens und Ablösen der Antikörper durch Behandlung mit chaotropen Salzen.
2. Verfahren zur Bestimmung von Anti-BiP-Antikörpern nach Anspruch 1 in Körperflüssigkeiten, gekennzeichnet dadurch, daß BiP an feste Phasen gebunden und im Immunoassay eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bindung des BiP- Antigens adsorptiv oder kovalent an feste Phasen erfolgt.
4. Verfahren nach Anspruch 2 und 3, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung des BiP- Antigens adsorptiv oder kovalent nach vorheriger chemischer Aktivierung an feste
Phasen erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß als Antigen natürliches, biochemisch gereinigtes oder rekombinantes BiP eingesetzt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 2 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung des BiP über spezifische monoklonale Anti-BiP-Antikörper erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase aus Polystyren, Polyvinylidenfluorid oder Nitrocellulose besteht.
8. Verfahren nach Anspruch 2 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß die feste Phase eine unterschiedliche geometrische Form hat.
9. Verfahren nach Anspruch 2 bis 8, gekennzeichnet dadurch, daß die als feste Phase dienenden Träger in Form einer Mikrotitrationsplatte oder eines Röhrchens vorliegen oder eine kugelförmige oder flächenförmige Gestalt haben.
10. Verfahren nach Anspruch 2 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß die Anti-BiP-Antikörper gebunden im Immunoassay bestimmt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 2 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß die Bindung der Anti- BiP-Antikörper in Puffern, die nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthalten, erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 2 bis 11 , gekennzeichnet dadurch, daß die gebundenen Anti- BiP-Antikörper durch spezifische Konjugate, die gegen einzelne Immunglobulinklassen oder gegen mehrere gerichtet sind, nachgewiesen werden.
13. Verfahren nach Anspruch 2 bis 12, gekennzeichnet dadurch, daß die spezifischen Konjugate aus Antikörpern, die gegen humanes Immunglobulin G, M oder A oder mehrere dieser Immunglobuline gerichtet sind und einem Enzym oder einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer radioaktiv markierten Komponente bestehen.
14. Testkit zur Bestimmung von Anti-BiP-Antikörpern nach Anspruch 1 , bestehend aus - BiP, das an eine feste Phase gebunden ist,
- einem Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit
- einem spezifischen Konjugat
- einem Puffer zum Verdünnen des Konjugates
- einem Puffer zum Waschen der nichtgebundenen Immunreaktanten - einer Substratlösung und
- einer Stoplösung.
15. Testkit nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch
- BiP, das adsorptiv oder kovalent an eine feste Phase gebunden ist, - einen Puffer zur Verdünnung der zu untersuchenden biologischen Flüssigkeit, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- ein spezifisches Konjugat, bestehend aus einem Antikörper, der gegen humanes Immunglobulin IgG, IgM, IgA oder mehrere dieser Immunglobuline gerichtet ist, und einem Enzym oder einem Fluoreszenzfarbstoff oder einer radioaktiv markierten Komponente,
- einen Puffer zum Verdünnen des Konjugates, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält,
- einen Puffer zum Waschen (Entfernen) der nichtgebundenen Immunreaktanten, der nicht-ionische oder ionische Detergenzien oder Proteine enthält, - eine Substratlösung zum Nachweis der Enzymreaktion und
- eine Stoplösung zum Unterbrechen der Enzymreaktion.
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