JP2003523167A

JP2003523167A - 炎症疾患の治療

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Publication number: JP2003523167A
Application number: JP2000575897A
Authority: JP
Inventors: スタブロスパナイ，ガブリエル; メリーコーリギャル，バレリ; ダンカンボードマン−スミス，マーク; スチュワートフィフ，マーク; シャーンランチバリ，ジェレミー
Original assignee: Kings College London
Current assignee: Kings College London
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2003-08-05
Anticipated expiration: 2019-10-08
Also published as: DE69934324D1; ATE347561T1; US6995240B1; GB9822115D0; DE69934324T2; WO2000021995A1; CA2344590C; DK1117685T3; CA2344590A1; AU754888B2; JP4435422B2; ES2277449T3; EP1117685B1; AU6215499A; CN1253470C; EP1117685A1; CN1322213A

Abstract

(57)【要約】【課題】リウマチ様関節炎の治療及びその存在を示す試薬の提供。【解決手段】免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）又はそれから由来するペプチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、炎症疾患に関し、そしてさらに特にリウマチ様関節炎に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとしている課題】

リウマチ様関節炎（ＲＡ）は、関節の破壊、不能そして若死に導く滑膜性関節
の慢性の炎症疾患である。ＲＡの原因は現在知られていないが、関節軟骨に特有
的に見いだされるタイプＩＩコラーゲンがＲＡに対する可能な自己抗原であるこ
とが示唆されている。ｇｐ３９即ち３９ＫＤ糖蛋白とそれから由来するペプチド
とがこれら自己抗原であることが、最近提案されている。しかし、この仮説を支
持するデータは限られており、それに対するｇｐ３９の役割は、不確かのままで
ある。

【０００３】本発明は、関節軟骨の特殊化された細胞である軟骨細胞の研究に基づく異なる
アプローチに基づく。本発明者らは、ＲＡ患者の血清に存在する抗体と反応しそ
して推定自己抗原に関する認められた基準に適合するヒト軟骨細胞及びヒト軟骨
肉腫細胞系からの蛋白を単離した。この精製された蛋白は、Ｔ細胞の増殖につい
てテストされ、そしてＲＡの患者から滑膜Ｔ細胞を選択的に増殖することが示さ
れている。この蛋白は、免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）である
。

【０００４】国際特許出願ＷＯ９９／１８１３１号は、ＲＡの診断上の指標としてヘラ細胞
から由来するＢｉＰに対する抗体の検出を提案している。しかし、この従来の文
献は、再現可能なやり方でヘラ細胞からのＢｉＰの抽出を記述しておらず、その
ため実際の適用には不十分である。

【０００５】

【課題を解決するための手段】

本発明者らは、正確なＲＡ自己抗原を入手し同定し、そしてこの発見がこの疾
患に関する予後及び診断のテスト並びに特異的な治療の開発を導く。本発明者ら
は、この蛋白に関するＤＮＡを単離し配列を明らかにした。本発明者らは、また
このＤＮＡをクローンし発現した。アミノ酸及びＤＮＡ配列は新規であり、そし
てこの明細書の配列リストに示される。ＢｉＰ蛋白のアミノ酸配列は、二つのパ
ージョンＳＥ１とＳＥ２との配列リストとして示され、その何れも本発明により
テスト試薬として使用できる。ＳＥ１に関するｃＤＮＡは、配列リストＳＥ３と
して示される。この配列は、寄託番号ＡＦ１８８６１１としてＧＥＮＢＡＮＫに
寄託されている。この配列とＧＥＮＢＡＮＫ寄託番号Ｘ８７９４９のそれとの比
較は、以下に与えられる。

【０００６】以下の記述の第一のパートは、この自己抗原の分析に関し、第二のそれは、蛋
白のクローニング、配列決定及び発現に関し、そして第三のパートは、自己抗原
に対する疾患（リウマチ様関節炎）及び組織（滑膜区画）のＴ細胞特異性の立証
に関する。

【０００７】パート１：自己抗原の分析軟骨細胞／軟骨肉腫細胞軟骨細胞は、関節の置換中に得られた軟骨から単離された。軟骨は、細かくミ
ンチされ、そして１ｍｇ／ｍＬのコラーゲナーゼ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）に
より消化された。消化後、細胞を３００ｇで遠心分離し、１０％のウシ胎仔血清
（ＦＣＳ）（ＨａｒｌａｎＳｅｒａ−Ｌａｂ、Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、英
国）により強化されたＤｕｌｂｅｃｃｏｓ最低必須培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｉｆｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｐｒａｉｓｌｅｙ、英国）に再懸濁した。２４時
間後、細胞の破砕物を洗って付着した細胞を除き、そして密集になるまで成長さ
せた。細胞をトリプシン（０．２５％）を使用して継代培養をし、１：３に分け
た。

【０００８】軟骨肉腫の細胞（ＨＴＢ９４）（ＳＷ１３５３）を、ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙ
ｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎＡＴＣＣ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ
、Ｍａｒｙｌａｎｄ、米国）によりそしてＪ．Ｂｌｏｃｋ博士、ＲｕｓｈＵｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｃｈｉｃａｇｏ、米国（個人的に贈与）により得た。これら
の細胞を１０％のＦＣＳを加えたＤＭＥＭで培養し、そして密集になったとき、
おだやかなトリプシン化（０．２５％のトリプシン、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｉｅｓ、Ｐｒａｉｓｌｅｙ、英国）後１：３に分けた。

【０００９】細胞ライゼートの製造細胞をフラスコの表面からはがし、ホモゲナイズし、プロティナーゼ阻害剤Ｐ
ＭＳＦ（２ｍＭ）、ロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）（２００μｇ／ｍＬ）
及びアプロチニン（５０μｇ／ｍＬ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、英国）の存在
下超音波処理した。

【００１０】ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、英国
）を添加して最終濃度を１％とし、そして蛋白を１時間室温で溶解した。蛋白の
濃度は、標準の蛋白としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してビシンコニ
ン酸（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ）アッセイにより評価され、そし
て細胞ライゼートは１０μｇ／穴当量で使用された。

【００１１】ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットＭｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎシステム（ＢｉｏＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ，ＨｅｍｅｌＨｅｍｐｓｔｅａｄ、英国）を使用してゲルを処理した。５、
７．５又は１０％のＳＤＳポリアクリルアミド変性ゲル（厚さ１．５ｍｍ）を作
った（付録１参照）。ゲルを１０μｇ蛋白／穴で負荷するか、又は同等物を調製
ゲルに負荷した。電気泳動を一定の１００Ｖで行い、広域カレイドスコープマー
カー（ＢｉｏＲａｄ）を細胞ライゼートと平行に流した。

【００１２】電気泳動後、蛋白を１時間一定の１００Ｖでニトロセルローズ上にブロットし
た（付録１参照）。ニトロセルローズを次に３％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｐｏｏｌ
ｅ、英国）によりブロックし、１晩４℃で放置した。標品ゲル膜を必要時に１６
枚の薄い片に切断したが、それぞれは、同じ蛋白プロフィルを有した。膜を、室
温で１時間患者の血清（１／１００希釈）又は特定のモノクローナル抗体（要求
された濃度で）によりプローブし、次にＴＴＢＳで１時間３回洗った（付録１参
照）。二次抗体であるヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ²）セイヨウワサビペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）共役物（Ｓｉｇｍａ）を１／１０００希釈で添加し、室温で１
時間インキュベートした。膜を次にＴＴＢＳで１時間３回洗った。増強した化学
蛍光（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用してシステムを現像し、抗原−抗体ＨＲＰ錯体
が、現像されたとき写真フィルムに明確なバンドとして現れた。

【００１３】推定自己抗原ｐ７８の単離問題のバンドは、前記のように細胞ライゼートをスクリーンするのに使用され
たリウマチ様関節炎の血清の約３０％に見られた。

【００１４】蛋白を単離するために、細胞ライゼートを、３００００ＭＷカットオフフィル
ター（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して２３倍に濃縮した。この蛋白を次に
平行で５％及び７．５％ゲルに負荷した。それぞれの一つのレーンは１規定（ｎ
ｏｒｍａｌ）濃度で負荷され、一方二つの他のレーンは蛋白を過剰に負荷された
。カレイドスコープマーカーは、テストレーンの何れかのレーンに負荷された。
７００００ＭＷ蛋白が流去（ｒｕｎ−ｏｆｆ）点に可能な限り近くゲルの底の３
分の１にあることをカレイドスコープマーカーが示すまで、ゲルを次に前述のよ
うに処理した。ゲルを次にＰＶＤＦ膜（ＩｍｍｏｂｉｌｏｎＰ，Ｍｉｌｉｐｏ
ｒｅ）上にブロットし、それは蛋白の移動が完了した後蒸留水に直ぐに入れた。
正常の負荷を有する片を蛋白のバンドの免疫検出のために使用した。この免疫検
出の現像されたフィルム及び過剰に負荷された片のＰｏｎｃｅａｕレッド染色を
使用して次に風乾された膜上のバンドを同定した。

【００１５】これらの片を、次にマトリックス補助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）分
光法を使用して蛋白を分離し配列決定するために採取した。

【００１６】エレクトロブロットされた蛋白を、急速染色プロトコール（１）を使用してＰ
ｏｎｃｅａｕＳ（０．０５％ｗ／ｖ水性メタノール／０．１％酢酸）により染
色した。乾燥し染色した蛋白を次にトリプシン（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，変性）
によりその場で消化し、ペプチドを１：１ｖ／ｖギ酸：エタノールにより抽出し
た（２）。一つの０．２μＬの部分（全消化物の約５％）をサンプルとし、Ｌａ
ｓｅｒＭａｔ２０００質量分析計（ＴｅｒｍｏＢｉｏａｎａｌｙｓｉｓ、英
国）を使用してマトリックス補助レーザー脱着イオン化（ＭＡＬＤＩ）飛行時間
型質量分析により直接分析した。第二の０．２μＬの部分をメタノール中１％ｖ
／ｖ塩化チオニルを使用して定量的にエステル化し、そしてまたＭＡＬＤＩによ
り分析して酸性の残存物の組成をえた（４）。未処理とエステル化とのペプチド
を次にＭＯＷＳＥペプチドマスフィンガープリントデータベースについてスクリ
ーニングした（５）。残りの消化したペプチド（全消化物の９０％）を次にｂ−
イオン存在量を増加させそしてタンデム質量分析による配列の分析を助けるため
に、Ｎ−サクシンイミジル−２（３−ピリジル）アセテート（ＳＰＡ）と反応さ
せた（６）。乾燥したペプチドのフラクションを、氷上２０分間１５％ｖ／ｖア
セトニトリルを含む０．５ＭＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨによりｐＨ７．８）中の１
％ｗ／ｖＮ−サクシンイミジル−２（３−ピリジル）アセテート７μＬにより処
理した。反応を１μＬのヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）により停止させ、溶液
を、３μＬ／分で流れる２％ｖ／ｖアセトニトリル／０．０５％ｖ／ｖＴＦＡで
平衡したＰＯＲＯＳＲ２／Ｈ物質（ＰｅｒｓｅｐｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅ
ｍｓ，ＭＡ）を充填した毛管逆相カラム（３００μｍ×１５ｃｍ）に直ぐに注入
した。吸着されたペプチドを、３μＬ／分で３０分間１０％ｖ／ｖアセトニトリ
ル／０．０５％ｖ／ｖＴＦＡにより無勾配的に洗って、過剰の試薬とＨＥＰＥＳ
バッファーとを溶離した。誘導体化されたペプチドを次に単一段階の勾配で７５
％ｖ／ｖアセトニトリル／０．１％ｖ／ｖギ酸に対して溶離し、そして単一の４
μＬのフラクションを集めた。誘導体化されたペプチドを次にナノエレクトロス
プレイ源を備えたＦｉｎｎｉｇａｎＭＡＴＴＳＱ７０００を使用して低エネ
ルギー衝突作動解離（ＣＡＤ）により配列決定した（７、８）。ＣＡＤは、−１
８Ｖと−２８Ｖとの間の衝突オフセット電圧で２．５ｍトルのアルゴンを使用し
て行われた。生成物−イオンのスペクトルを５００ａｍｕ／秒でスキャニングし
たＱ３で集めた。

【００１７】結果７．５％ゲル（単一バンド）から得た配列のデータＧＲ７８ヒト特定の同定ペプチド：ＮＱＬＴＳＮＰＥＮＴＶＦＤＡＫ８２−９６ＳＤＩＤＥＩＶＬＶＧＧＳＴＲ３５３−３６６ＴＷＮＤＰＳＶＱＱＤＩＫ１０７−１１３同定したヒト蛋白ＧＲ７８：Ｋｄグルコース関連蛋白プレカーサー（ＧＲＰ７８）免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白（ＢＩＰ）

【００１８】パート２：ｐ７８のクローニング、シーケーシング及び発現１）同定されたｍＲＮＡ単離及びＰＣＲ増幅ヒト軟骨細胞を前記のように単離しそして３週間培養した。ポリ（Ａ）ｍＲＮ
Ａ（１−２μｇ）を、合計１−２×１０⁶ 細胞からＭｉｃｒｏ−Ｆａｓｔｒａｃ
ｋキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により抽出した。得られたｍＲＮＡ１ミクロ
ｇを、１μＬのモロニーマウス白血病ウィルス逆転写酵素（２００ｕ／μＬ）；
５×一次鎖バッファー（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．３、２５０ｍＭ；ＫＣｌ３
７５ｍＭ；ＭｇＣｌ１５ｍＭ）；０．１ＭＤＴＴ；オリゴｄＴ（１２−１８
）２０ｎｇ／μＬ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；及びｄＮＴＰミッ
クス１００ｍＭ（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃ，Ｕｐ
ｐｓａｌａ、スウェーデン）を使用して１時間４５℃で２０μＬの容積でｃＤＮ
Ａ中に逆転写した。

【００１９】ＰＣＲを、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓサーマルサイクラーＰＥ２４００を使用して標準条件（下記参照）下５０μＬ
の反応容積で行った。プライマー配列は、免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白Ｂｉｐ（
ｇｒｐ７８）に関するヒト遺伝子に相当するＧｅｎＢａｎｋデータベース配列か
ら由来した（寄託番号Ｘ８７９４９）。特定のプライマーを合成して、軟骨細胞
ｃＤＮＡから推定（ｐｕｔａｔｉｖｅ）自己抗原遺伝子を増幅した。領域をコー
ドするｇｒｐ７８の殆どからなる得られたＰＣＲ生成物は、未翻訳領域、シグナ
ル配列及び停止コドンを含まない（ｇｒｐ７８データベース配列のヌクレオチド
位置２７９−２１６９）。

【００２０】ＰＣＲに関するプライマーのセットは、組み込まれた制限部位によりデザイン
されて、細菌の発現ベクターへのｃＤＮＡの急速なサブクローニングを行った。
前進プライマーはＮｄｅｌ部位をエンコードし、そして逆プライマーはＸｈｏｌ
制限部位を含んだ。前進プライマーに関する配列リストは、以下においてＳＥ４
として示され、逆プライマーに関するそれはＳＥ５として示される。

【００２１】Ｂｉｐ前進プライマー５´ＴＡＴＡＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡ
ＡＧＧＡＧＧＡＣＧ３´（３２ｍｅｒ）Ｂｉｐ逆プライマー５´ＣＣＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＧＣＴＧＴＡＴＣＣＴ
ＣＴＴＣＡＣＣＡ３´（３２ｍｅｒ）

【００２２】２分間９６℃での最初の変性後、ＰＣＲを、３０秒間９４℃、３０秒間６０℃
そして２分間７２℃のサイクルプロフィル、さらに７分間７２℃での最後の伸張
を使用して２８サイクルを行った。ＰＣＲの反応は、１８９０ｂｐの単一の特異
的なＢｉｐフラグメントを生じた。

【００２３】２）ＰＣＲ発生フラグメントのクローニングＰＣＲ反応に使用された前進及び逆プライマー中に作成した制限部位は、それ
らの特定のエンドヌクレアーゼ（Ｎｄｅｌ及びＸｈｏｌ）により認識されるよう
にそれらに関するフランキングＤＮＡを要した。このフランキングＤＮＡをもた
らすために、ＰＣＲ発生フラグメントをＰＣＲクローニングベクターｐＣＲ２．
１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローンした。リゲートされたプラ
スミドを、ミニプレップ精製カラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した免疫応
答を起こしうるＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）及び
プラスミドＤＮＡ中に変換した。クローンのための精製されたプラスミドＤＮＡ
をＢｉｐ−Ｔｏｐｏと命名した。これらのＤＮＡサンプルを−２０℃で貯蔵した
。Ｂｉｐ−Ｔｏｐｏのための精製されたプラスミドＤＮＡをＮｄｅｌ及びＸｈｏ
ｌにより消化した。制限されたフラグメントをアガロースゲル電気泳動により分
離し、ＱｉａｇｅｎＤＮＡゲル抽出キットを使用して精製した。

【００２４】３）細菌発現ベクター中への制限された遺伝子フラグメントのサブクローニングクローンのための精製されたフラグメントを、Ｎｄｅｌ／Ｘｈｏｌ予備消化細
菌発現ベクターｐＥＴ３０ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ）中にリゲートした。リゲーショ
ンは、Ｔ４リガーゼ（２０単位）及び１／１０容量の１０×リガーゼバッファー
（ＰｒｏｍｅｇａからＴ４リガーゼ酵素とともに提供される）の存在下１晩１２
℃で行われた。リゲートされたプラスミドは、免疫応答を起こしうるＥ．ｃｏｌ
ｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に変換され、Ｂｉｐ特定プラ
イマーを使用してコロニー−ＰＣＲによりスクリーニングされた。必要な組み換
えプラスミドを有する正の形質転換細胞を精製し、免疫応答を起こしうるＥ．ｃ
ｏｌｉ発現株ＢＬ２１−（ＤＥ３）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に変換した。ク
ローニングが、細菌、昆虫の細胞及び哺乳動物の細胞を含む原核又は真核の宿主
で行うことができることは、もちろん理解されるだろう。好ましい宿主は、発現
された生成物のグリコシル化を確実にするものである。

【００２５】４）１８９０ｂｐｐＥＴ：：Ｂｉｐサブクローンの配列決定ｐＥＴ：：Ｂｉｐクローンの５´及び３´末端の配列決定は、組み換えＤＮＡ
分子がｐＥＴ３０ベクターのＡＴＧ出発コドンとイン・フレームであること、そ
してこの部位からのリードスルーがＢｉｐ遺伝子を経て続き、発現ベクターの３
´アームに位置する停止コドン及び６ＸＨｉｓ残基で終わることを確認した。

【００２６】拡張ＤＮＡ配列決定は、Ｂｉｐサブクローンの全長に及ぶ合成オリゴヌクレオ
チドプライマーを使用して行われた。新しくサブクローンしたＢｉｐ遺伝子フラ
グメントの配列分析は、データベースからの現存のｇｒｐ７８配列（寄託番号Ｘ
８７９４９）に対する比較の列により行った。二つの配列間の多数の相違が、Ｄ
ＮＡと蛋白のレベルとの両者で検出された（付録２参照）。不一致のこれらの領
域は、（ｇｒｐ７８の）初めのＤＮＡ配列における誤りの結果であるか、又はそ
れらがゲノムにおける追加の関連するがわずかに異なるＢｉｐ遺伝子の存在を示
すかの何れかであろう。

【００２７】すべてのＤＮＡ配列決定は、ｄＲｈｏｄａｍｉｎｅダイ・ターミネーターキッ
ト（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使
用してＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＡＢＩ３７７自動化ＤＮＡシ
ーケンサーで行われた。

【００２８】細菌及び精製組み換え体の蛋白の発現組み換えｐＥＴ３０ａ−Ｂｉｐプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ発現株ＢＬ２１
−（ＤＥ３）を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地で３７℃で成
長させた。細胞が０．６単位のＯＤ₆₀₀に達したとき、イソプロピルβ−Ｄ−チ
オガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（１ｍＭ）を培地に添加して、発現ベクター
のＩＰＴＧ誘導可能なプロモーターにより駆動される組み換え蛋白の発現を誘導
した。組み換え蛋白の最大の発現を行うために、培養物を３７℃でさらに４時間
インキュベートした。細胞を遠心分離によりペレットにし、−７０℃で貯蔵した
。

【００２９】組み換え細菌蛋白の精製のために、細菌のペレットを結合バッファー（２０ｍ
ＭＮａＰＯ₄ 、５００ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、１ｍＭＰＭ
ＳＦ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、５単位／ｍＬＤＮＡｓｅ、０．１％トリ
トンＸ−１００、ｐＨ７．４）で溶解した。ライゼートを、不溶物及び細胞破
砕物を除くために遠心分離により透明にした。透明にしたライゼートを、５ｍＬ
の床容積の結合バッファーにより平衡にされたキレート化Ｈｉ−ｔｒａｐアフィ
ニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通した。非特異的に結合した蛋白を、
一連の３回の洗浄バッファーを使用して厳密な条件下カラムから洗った。最初の
洗浄は、１００ｍＬの結合バッファーを使用して行った。これは、高緊縮低ｐＨ
洗浄（２０ｍＭＮａＰＯ₄ 、５００ｍＭＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−
１００、ｐＨ５．５）、そして１００ｍＬの２０ｍＭＮａＰＯ₄ 、５００ｍＭ
ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７
．４）を使用する追加の高緊縮洗浄を伴った。

【００３０】ヒスチジン標識組み換え蛋白を、５０ｍＭＥＤＴＡによりストリッピングす
ることによってカラムから溶離した。溶離された蛋白を１×ＰＢＳで１晩透析し
てＥＤＴＡ及びＮｉ混入物を除いた。精製された蛋白を濃縮し、５００００ＭＷ
カットオフ濃縮カラム（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を使用して滅菌ＰＢＳで洗った。蛋
白の合計量を、ビシンコニン酸アッセイにより標準としてＢＳＡを使用して分光
測光により測定した。

【００３１】実験的関節炎における免疫学上の検討実験的関節炎におけるｐ７８に対する抗体反応コラーゲン関節炎（ＣＩＡ）及びプリスタン関節炎（ＰＩＡ）を、本発明者の
既に記述したプロトコールに従ってＤＢＡ／１マウスに誘発した。マウスを、関
節炎の誘発前（１５匹）、ＣＩＡの開始時（１６匹）そしてＰＩＡの開始時（１
４匹）に飼育した。ｐ７８に対するマウス血清の抗体を、組み換えｐ７８により
酵素結合免疫イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。ヌ
ンク９６穴ＥＬＩＳＡプレート（ＦｉｓｈｅｒＢｉｏｔｅｃｈ，Ｏｒａｎｇｅ
ｂｕｒｇ，ＮＹ）を、１穴あたり５００ｎｇ（５％脱脂牛乳／ＰＢＳの１００ｍ
Ｌ）で、ｐ７８により４℃で１晩被覆した。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含
む燐酸塩緩衝塩水（ＰＢＳ）により３回洗浄した後、プレートを、４℃で１晩５
％脱脂牛乳／ＰＢＳによりブロックした。マウスの血清を、牛乳／ＰＢＳ中１：
２００希釈で穴中に加え、４℃で１晩インキュベートした。プレートを洗い、１
００ｍＬのアルカリ性ホスファターゼと共役したヤギ抗マウスＩｇ（抗−Ｉｇ−
ＡＫ；牛乳／ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０中１：５００希釈、ＦｉｓｈｅｒＢｉ
ｏｔｅｃ）を３７℃で６０分間添加した。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０による３回
の洗浄後、ジアチルアノラミンバッファー中のパラニトロフェニルホスフェート
溶液（ＰＮＰＰ錠剤、ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
Ｏ）１００ｍＬを各穴に添加した。反応を暗所で３０分間続けさせ、プレートを
分光光度計（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，Ｃ
Ａ）で４０５ｎｍで読みとった。データを、ＳＯＦＴｍａｘ分析ソフトウェアパ
ッケージを使用して分析した。特異的結合は、非被覆ブランク及び非血清ブラン
クからのＯＤを減じたｐ７８コート穴からのＯＤ読み取りであった。抗体のレベ
ルは、ＯＤ₄₀₅ 単位として表示された。

【００３２】結果自己抗原の同定ＲＡとコントロールとの血清を軟骨細胞抽出物に対してブロットしたとき、１
０％のコントロールの血清に比較して、３０％のＲＡの血清が７８Ｋｄ蛋白と反
応した（図１）。低エネルギーＣＡＤによる３種のトリプシン関連のペプチドの
配列決定は、免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白（Ｂｉｐ）としても知られている、７
８ｋＤグルコース調節蛋白として７８ｋＤバンドの一つの成分を同定した。関節
の軟骨細胞ｃＤＮＡからのｐ７８のＤＮＡ配列分析は、発表された配列（寄託番
号Ｘ８７９４９）から多くの偏りを示した。合計６個の単一のヌクレオチド置換
及びコドン挿入は、ｐ７８の位置８３４−８３６におけるアルギニン挿入及び３
個のアミノ酸置換を生ずる（寄託番号ＡＦ１８８６１１）。

【００３３】リウマチ様関節炎の免疫学的テストＴ細胞増殖反応は、リウマチ様関節炎の２３人の患者から得た一対の末梢血及
び滑液のサンプル、並びに１２人の疾患コントロールからの単核細胞の標品につ
いて測定された。ＲＡにかかった２３人の患者の１２人（５２％）そして疾患コ
ントロールの１２人の２人のみ（１７％）が、増加した滑膜の増殖を示した（図
２）。ＲＡ滑膜Ｔ細胞のｐ７８に対する増殖反応は、一対の末梢血のそれよりも
有意に高かった（刺激指数、平均±ＳＥＭ；ＳＦ３．５±０．７；ＰＢ１．６±
０．２；ｐ＜０．０１Ｗｉｌｃｏｘｏｎ対比テスト）。有意な差は、またＲＡ
患者と疾患コントロールとの間のｐ７８に対する滑液の反応間に見られた（ＳＩ
：ＲＡ３．５±０．７；ＯＩＪＤ１．４±０．２；ｐ＝０．０３ＭａｎｎＷｈ
ｉｔｎｅｙＵテスト）。５０％の応答個体及び非応答個体がＨＬＡ−ＤＲ４ポ
ジティブであった（データは示さず）ので、ＨＬＡ−ＤＲと関連がなかった。ｐ
７８に対するリウマチ様滑液Ｔ細胞増殖は、抗−ＨＬＡ−ＤＲモノクローナル抗
体Ｌ２４３（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）により６６−８４％阻害さ
れた（データは示さず）。

【００３４】０．０１ｎｇ／ｍＬに感受性のＥＬＩＳＡを使用したにもかかわらず、ＩＦＮ
ｇは、一対の滑液及び末梢血の単核細胞からの上清では測定できなかった（デー
タは示さず）。ＩＦＮｇは、ｐ７８による刺激後、ＲＡ患者（ｎ＝７）又は健康
なコントロール（ｎ＝２）の末梢血Ｔ細胞中の細胞内蛍光により検出できなかっ
た（データは示さず）。これらの結果は、対応するＴ細胞がＴＨ１サブセット｛
１４６１｝を生成する典型的なＩＦＮｇに属さないと思われることを意味する。

【００３５】実験的関節炎における免疫学的研究ｐ７８による実験的関節炎の誘発Ｆｒｅｕｎｄの完全なアジュバント（ＣＦＡ）のｐ７８によるＤＢＡ／１、Ｃ
５７ＢＬマウス及びＬｅｗｉｓラットの免疫化は、関節炎の発生を導かなかった
（データは示さず）。ＨＬＡ−ＤＲ１^+/+ （０／１０マウス）中又はＨＬＡ−Ｄ
Ｒ４^+/- （０／５）マウス中に注入されたとき、ｐ７８の関節炎原性（ａｒｔｈ
ｒｉｔｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を同様に欠いた。

【００３６】実験的関節炎におけるｐ７８に対する免疫応答ｐ７８により動物を免疫化することにより関節炎を誘発することに失敗したが
、本発明者らは、ＤＢＡ／１マウスがコラーゲン（ＣＩＡ）又はプリスタン（Ｐ
ＩＡ）誘発関節炎の間ｐ７８に対する抗体を発生させるかどうかを検討した（図
４）。マウスは、採血前の血清（０．０７０±０．０１９；それぞれｐ＜対ＣＩ
Ａ及びｐ＜対ＰＩＡ）と比較したとき、コラーゲン関節炎（ＯＤ₄₀₅ ０．１８９
±０．０４２、ｍ±ｓｅｍ）そしてプリスタン誘発関節炎（０．５０４±０．０
７４）の開始時血清抗−ｐ７８抗体を発生した。さらに、これらの抗体の濃度は
、ＣＩＡマウスに比較してＰＩＡにおいて有意に高かった（ｐ）。各グループに
おいて１４匹のマウスが存在した。

【００３７】ｐ７８の静脈内投与によるコラーゲン誘発関節炎の予防ＣＩＡ又はＰＩＡによるマウスの血清中のｐ７８に対する抗体の存在は、ｐ７
８に対する免疫応答を操作することが傍観者（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ）現象により
ＣＩＡの次の発生を予防するかもしれないことを示唆した。ＨＬＡ−ＤＲ１^+/+
トランスジェニックマウスに、１週間後ＣＦＡ中のタイプＩＩコラーゲンによる
免疫化前に、１ｍｇのｐ７８を静脈内注射した（表６）。８３％の動物が、塩水
により予備処理されたとき８週でそれらの四肢の４６％が関節炎にかかったが、
静脈内にｐ７８を既に投与されたグループではわずか１０％の動物がそれらの四
肢の３％が関節炎にかかったに過ぎなかった。これらの相違は、極めて有意であ
る（ｐ≦０．００８そしてｐ≦０．０００１）。表６は、またコントロールに対
して３分の１のレベルでｐ７８予備処置動物の抗コラーゲン抗体に有意な低下が
あったことを示す。低下は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２イソタイプにおいて等しかっ
た（表７）。これらの動物の関節の組織（図６）は、ｐ７８予備処置マウスの関
節では滑膜炎がなかったという臨床上の所見を確かなものにした。

【００３８】本発明者らは、ＲＡにかかった患者の３０％がヒトシャペロニン（ｃｈａｐｅ
ｒｏｎｉｎ）Ｂｉｐ／ＧＲＰ７８に対するウエスタンブロットにより検出され、
そして本発明者らによりｐ７８と命名された抗体を有することをこの研究により
示した。その上、リウマチ滑液からのＴ細胞はｐ７８に選択的に増殖した。同じ
患者の末梢血からのＴ細胞では、最低の応答が存在した。他の炎症性関節炎にか
かった患者からのＴ細胞は、滑液からでも又は末梢血からでも、ｐ７８に対して
有意に増殖しなかった。最後に、増殖性の応答は、抗−ＨＬＡ−ＤＲモノクロー
ナル抗体により阻害され、それは、ＣＤ４＋ポジティブＴ細胞がＨＬＡ−ＤＲに
関連してもたらす抗原ペプチドに応答しつつあることを示唆した。このポリクロ
ーナルＴ細胞応答は、ＨＬＡ−ＤＲ４により制限されなかった。従って、Ｔ細胞
増殖のｐ７８刺激は、リウマチ自己抗原を予想させる二つの特徴、即ちそれが関
節と疾患とに特異的であるということを有する。

【００３９】これらの観察に基づいて、本発明者らは、ｐ７８に対する免疫応答からはずれ
ることが傍観者メカニズムによりＣＩＡの発生を予防するであろうという仮説を
テストするために、ｐ７８によるマウスの静脈内免疫化を行った。これは、ＨＬ
Ａ−ＤＲ１^+/+トランスジェニックマウスにおけるＣＩＡの誘発に対する殆ど完
全な予防のケースであることをまさに証明するものであった。過去において、種
々のタイプの実験的関節炎が、細菌性そして特にマイコバクテリア性の熱ショッ
ク蛋白例えばＨＳＰ６０、又は全ＨＳＰ６０或いは特定のペプチド｛２１０３、
２２８０、２２８２、２２８３、２２８４、２２８１｝に応答するＴ細胞の投与
により予防又は治療されてきている。しかし、自己ＨＳＰ６０ペプチドはこれら
の保護的作用を示さないことに注意することが重要である｛２２８１｝。それゆ
え、ＣＩＡを予防するｐ７８の能力は、基本的に重要である。この研究で記述さ
れた観察は、本発明者らの知るところでは、ＲＡの発生機序及び実験的関節炎の
免疫治療において内在性シャペロンを意味する最初のものである。ＲＡの免疫治
療の可能性は、明確に明らかである。

【００４０】２．生物学的液体又は培養液上清におけるｐ７８に対する抗体の検出のためのテ
ストの使用いくつかの手法例えば凝集、ウエスタン・ブロット、ＥＬＩＳＡが使用できる
。血清中のｐ７８に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡプロトコールＥＬＩＳＡプレートを、室温で４時間、重炭酸塩バッファー中のｐ７８で半分
そして重炭酸塩バッファーのみで半分覆う。ＰＢＳによる２回の洗浄後、プレー
トを、蛋白の非特異性結合を停止させるために、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を
含むＰＢＳ中の１０％ヤギ血清によって、室温で２時間ブロックする。さらに２
回洗浄した後、希釈した血清（ＰＢＳ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中
）を、プレートのｐ７８を覆ったそして覆ってない面の両方にまったく同一で加
える。４回の洗浄後、ビオチン共役抗ヒト免疫グロブリン（ＰＢＳ／１％ヤギ血
清／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中で１／１００００希釈）をプレートに添加する。プ
レートを６回洗う。結合したビオチニル化抗体を、ストレプタビジン共役セイヨ
ウワサビペルオキシダーゼ（ＰＢＳ／１％ヤギ血清／０．０５％Ｔｗｅｅｎ中１
／８００）及び好適な基体により検出する。ｐ７８に対する抗体を含む血清は、
分光測光で測定する。このテストは、リウマチ様関節炎に関する診断及び／又は
予後のテストの基礎を形成する。

【００４１】３．治療上の応用組み換え蛋白又はベクターの投与の多くの経路が可能であり、静脈内、筋肉内
、経鼻、経口、皮下、そして局所を含む。治療の目的でｐ７８又は誘導体を使用
するいくつかのアプローチが存在し、以下のものを含む。

【００４２】（ａ）粘膜の寛容性の誘発例えば小腸又は鼻の粘膜を通る粘膜の経路によるｐ７８自己抗原又はそれから
由来するペプチドの伝達は、患者の免疫系をそのままにしたまま疾患の活性を下
方に調節することにより免疫応答を変える。別に、ｐ７８又はｐ７８ペプチドは
、適切な哺乳動物の発現ベクターによりそれらをエンコードするＤＮＡプラスミ
ドとして伝達できる。

【００４３】（ｂ）ＴＣＲペプチドによるワクチン化Ｔ細胞受容体Ｖアルファ及びＶベータ鎖のＣＤＲ３領域のペプチドは、合成で
きそして経皮又は筋肉内の注射による伝達のワクチンとして使用できる。これら
のペプチドをエンコードするプラスミドは、同じやり方で使用できる。

【００４４】（ｃ）未処理又は変化したペプチドによるＭＨＣ閉鎖ｐ７８ペプチドは、ＭＨＣそして特にＨＬＡ−ＤＲ４をブロックしそれにより
Ｔ細胞の活性化及び疾患の抑制を導くようにアミノ酸置換及び／又は化学基の付
着により変性されているか又は変性されていない適切な場合に、非経口的又は経
口的に投与できる。未処理か又は変化されたかの何れかのｐ７８ペプチドは、可
溶性ＨＬＡ−ＤＲ４分子と結合し、そして非経口的又は経口的に適用できる。

【００４５】（ｄ）プラスミドＤＮＡ免疫化による寛容性の誘発全ｐ７８蛋白についてコードしたＤＮＡからなるプラスミド、又は哺乳動物発
現ベクターに結合したそのペプチドは、注射により与えることができる。単一で
又は任意の組合せで配合されるヒトＩＬ−１０、ＩＬ−４、ＩＬ−１１又はＴＧ
Ｆ−ベータについてコードしたＤＮＡは、疾患を抑制するためにＴＨ２モードに
向かってｐ７８への免疫応答を変更するのに使用できる。

【００４６】上記の治療処方において、蛋白又は誘導ペプチドは、約０．１ミクロｇ−約１
ｇに及ぶ量又はプラスミド又はワクチンの製剤の場合はその相当量を伝達する適
切な組成物で投与できる。

【００４７】付録１ゲル電気泳動の方法アクリルアミドゲル：１０％６．０７５ｍＬアクリルアミド（４０％）（ＢＤＨ、Ｐｏｏｌｅ、英国）３．３５ｍＬメチレンビスアクリルアミド（２％）（ＰｈａｒｍａｃｉａＢ
ｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）６．２５ｍＬアクリルアミドゲルバッファー（下記参照）９ｍＬ蒸留水（実験室内で生成）２５０μＬ過硫酸アンモニウム（ＡＭＰＥＲＳ）（２５０μＬの蒸留水中の０
．０２５ｍｇ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）２５μＬＮＮＮ´Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（Ｓｉ
ｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）アクリルアミドゲルバッファー：ｐＨ８．８１．５Ｍトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−Ａ
ｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）濃塩酸によるｐＨ滴定０．４％ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐ
ｏｏｌｅ、英国）

【００４８】濃縮用ゲル：１．２ｍＬアクリルアミド（４０％）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英
国）０．６５ｍＬビスアクリルアミド（２％）（ＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅ
ｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデン）３．１５ｍＬ濃縮用ゲルバッファー（下記参照）７．５ｍＬ蒸留水（実験室内で生成）１２５μＬ過硫酸アンモニウム（ＡＭＰＥＲＳ）（０．０２５ｍｇ／２５０μ
Ｌ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）１２．５μＬＮＮＮ´Ｎ´−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）（
Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）

【００４９】濃縮用ゲルバッファー：ｐＨ６．８：０．５Ｍトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−Ａ
ｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）濃塩酸によるｐＨ滴定０．４％ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐ
ｏｏｌｅ、英国）

【００５０】負荷用バッファー：２ｍＬグリセロール２ｍＬ１０％ナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃ
ｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）０．２５ｍｇブロモフェノール・ブルー２．５ｍＬ４倍に濃縮した濃縮用ゲルバッファー（０．５Ｍトリス；０．
４％ＳＤＳ；ｐＨ６．８）０．５ｍＬ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏ
ｌｅ、英国）

【００５１】電気泳動／ランニングバッファー：３ｇ／Ｌトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）１４．４ｇ／Ｌグリシン（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）１ｇ／Ｌナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、
Ｐｏｏｌｅ、英国）

【００５２】転移用バッファー：３ｇ／Ｌトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍａ−
Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）１４．４ｇ／Ｌグリシン（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）１ｇ／Ｌナトリウムドデシルサルフェート（ＳＤＳ）（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、
Ｐｏｏｌｅ、英国）１４．４ｇ／Ｌグリシン（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）１０％メタノール（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）

【００５３】トリスＴｗｅｅｎ緩衝塩水（ＴＴＢＳ）：２．４ｇ／Ｌトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）（Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）２９ｇ／Ｌ塩化ナトリウム（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国）５００μＬＴｗｅｅｎ−２０（ポリオキシエチレン−ソルビタンモノ−ラウ
レート）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｐｏｏｌｅ、英国）

【００５４】３％ウシ血清アルブミン溶液（ＢＳＡ）：３ｇアルブミンウシフラクション５（ＢＤＨ−Ｍｅｒｃｋ、Ｐｏｏｌｅ、英国
）１００ｍＬＴＴＢＳ（上記参照）

【００５５】付録２発現されたＢｉｐ組み換えヒト蛋白のアミノ酸配列。合計１９１７ヌクレオチド
。メチオニンで始まり（出発コドン）、６×Ｈｉｓｔａｇで終わる。分子量７０９３７．５０ダルトン６３９アミノ酸８６強塩基性（＋）アミノ酸（Ｋ、Ｒ）１０８強酸性（−）アミノ酸（Ｄ、Ｅ）２０４疎水性アミノ酸（Ａ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｗ、Ｖ）１４２極性アミノ酸（Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、Ｙ）５．１７３等電点ｐＨ７．０で−２０．０４１電荷

【００５６】

【表１】

【００５７】付録３組み換えヒト蛋白の発現に使用されるＲＴ−ＰＣＲクローン化且つ配列決定さ
れたｇｒｐ７８（Ｂｉｐ）フラグメント。合計１９１７ヌクレオチド。ＡＴＧ出
発コドンで始まり、６×Ｈｉｓｔａｇで終わる。

【００５８】

【表２】

【００５９】付録４組み換えヒト蛋白の発現に使用されるＲＴ−ＰＣＲクローン化且つ配列決定さ
れたｇｒｐ７８（Ｂｉｐ）フラグメント。合計１９１７ヌクレオチド。ＡＴＧ出
発コドンで始まり、６×Ｈｉｓｔａｇで終わる。

【００６０】

【表３】

【００６１】データベースからのＢｉｐ（ｇｒｐ７８）に関する元の全ｃＤＮＡ。寄託番号
Ｘ８７９４９。全長２５５４ヌクレオチド。（既に発表）。

【００６２】

【表４】

【００６３】

【表５】

【００６４】^a ＨＬＡ−ＤＲ１^+/+ トランスジェニックマウスは、ＰＢＳ（負のコントロール
）又は組み換えｐ８の何れかを静脈内に注射された。０．１ｍＬのＰＢＳに溶解
した蛋白１ｍｇ又は０．１ｍＬのＰＢＳの何れかを静脈内に投与し、マウスを静
脈内投与後７日間ＣＦＡ中のタイプＩＩコラーゲンにより免疫化した。^b 関節炎の頻度は、免疫化後８週で報告されている。^c 抗体は、免疫後８週で集められた血清を使用して１グループあたり平均の単位
を表す。ＥＬＩＳＡが行われ、結果を５０単位の活性を有するものとして恣意的
に定義された標準の血清とのテスト血清の比較により誘導される活性の単位とし
て報告される。血清は、個々に分析されそして結果は動物の各グループについて
平均±ＳＤとして示される。^* ｐ≦０．００８（フィッシャーの直接法） ^** ≦０．０００１（フィッシャ
ーの直接法） ^*** ＜０．０５（スチューデントテスト）

【００６５】

【表６】

【００６６】^a ＨＬＡ−ＤＲ１^+/+トランスジェニックマウスは、ＰＢＳ（負のコントロール
）又は組み換えｐ８の何れかを静脈内に注射され、次に１週間後ＣＦＡ中のコラ
ーゲンタイプＩＩにより免疫化した。^b ＥＬＩＳＡは、表５に記載されたように行われた。^* ｐ＜０．０５（スチューデントテスト）

【００６７】

【表７】

【００６８】

【表８】

【００６９】

【表９】

【００７０】

【表１０】

【図面の簡単な説明】

【図１】軟骨肉腫と反応する６種のリウマチ血清（レーン１−６）、５種の正常な血清
（レーン７−１１）及び４種の疾患コントロール（レーン１２−１５）を示すウ
エスタンブロッティング。分子量マーカーを示す。

【図２】刺激指数として表される６日間培養された単核細胞におけるリンパ球の増殖。
ｐ７８の存在下の増殖／培地のみの存在下の増殖。≧２．５の刺激を有意と考え
た。ＲＡＰＢ、リウマチ様関節炎の末梢血；ＲＡＳＦ、リウマチ様関節炎の滑液
；ＯＩＪＤＰＢ、他の炎症性関節疾患の末梢血；ＯＩＪＤＳＦ、他の炎症性関節
疾患の滑液。

【図３】ＥＬＩＳＡにより測定されそしてＯＤ₄₀₅として表示されるマウスの血清中の
組み換えヒトｐ７８に対する抗体。示されているのは、実験的関節炎の誘発前（
前採血）、そしてコラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）の開始時及びプリスタン誘発
関節炎（ＰＩＡ）の開始時に採血された動物の値である。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｈ０４５ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 5/10 33/50 ＴＣ１２Ｑ 1/68 ＺＧ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者コーリギャル，バレリメリーイギリス国サーレイケイティ20 ５キュウエスタドワースコープレイウエイ 25 (72)発明者ボードマン−スミス，マークダンカンイギリス国ロンドンエヌ２８ジェイダブリューイーストフィンチェリーロングレーン 285エイ (72)発明者フィフ，マークスチュワートイギリス国ロンドンエスダブリュー２２エイジェイブリックストンアーチビスホープスプレイス 28 (72)発明者ランチバリ，ジェレミーシャーンイギリス国ケントティエヌ１１エスゼットトンブリッジウエルズクラレモントロード 10 Ｆターム(参考） 2G045 AA25 AA40 DA36 DA37 DA77 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 CA07 CA20 DA06 EA04 GA11 HA03 HA17 4B063 QA01 QA19 QQ03 QQ79 QQ96 QR32 QR36 QR40 QR48 QR55 QS33 QS38 QX02 QX10 4B065 AA01X AA26X AA58X AA72X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA01 BB01 BC03 BD01 BD15 CA24 CA44 CA46 4C084 AA01 AA02 AA07 BA01 BA08 BA22 CA18 CA34 CA56 DC50 MA66 NA14 ZB152 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA86 EA20 EA50 FA74 GA01 GA15 GA26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】リウマチ様関節炎の存在を示す試薬としての免疫グロブリン
Ｈ鎖結合蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）又はそれから由来するペプチドの使用。
【請求項２】蛋白が配列リストＳＥ１又はＳＥ２のアミノ酸配列を有する
請求項１記載の蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）の使用。
【請求項３】配列リストＳＥ１又はＳＥ２のアミノ酸配列を有する蛋白Ｂ
ｉＰ（７８ＫＤ）。
【請求項４】組み換え蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）。
【請求項５】体液をテストするテスト試薬が免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白
ＢｉＰ（７８ＫＤ）又はそれから由来するペプチドであるＲＡ用の予後又は診断
テスト。
【請求項６】ＥＬＩＳＡアッセイである請求項４記載のテスト。
【請求項７】ウエスタンブロットである請求項４記載のテスト。
【請求項８】治療に用いられる免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（７８
ＫＤ）又はそれから由来するペプチド。
【請求項９】リウマチ様関節炎の治療に使用される免疫グロブリンＨ鎖結
合蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）又はそれから由来するペプチド。
【請求項１０】治療に使用される免疫グロブリンＨ鎖結合蛋白ＢｉＰ（７
８ＫＤ）又はそれから由来するペプチドをコードするＤＮＡ配列。
【請求項１１】リウマチ様関節炎の治療に使用される免疫グロブリンＨ鎖
結合蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）又はそれから由来するペプチドをコードするＤＮＡ
配列。
【請求項１２】配列リストＳＥ３のヌクレオチド配列を有する又は含むＤ
ＮＡ配列。
【請求項１３】請求項１２のＤＮＡ配列を含む組み換えベクター。
【請求項１４】蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）又はそれについてコードするｃＤ
ＮＡ配列を使用して該蛋白に対する抗体の存在を決定することを特徴とするＲＡ
をテストする方法。
【請求項１５】蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）又はそれについてコードするＤＮ
Ａ配列を投与することからなるＲＡを治療する方法。
【請求項１６】投与が、静脈内、経鼻、経口又は皮下の経路による請求項
１５記載の方法。
【請求項１７】蛋白ＢｉＰ（７８ＫＤ）を発現することのできる組み換え
生物。