DE4111531A1

DE4111531A1 - Plasmide zur fha-expression und wirte

Info

Publication number: DE4111531A1
Application number: DE4111531A
Authority: DE
Inventors: Kenneth N Prof Dr Timmis; Carlos Dr Guzman; Mark Dr Walker
Original assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Current assignee: GESELLSCHAFT fur BIOTECHNOLOGISCHE FORSCHUNG MBH (GBF) 3300 BRAUNSCHWEIG DE
Priority date: 1991-04-09
Filing date: 1991-04-09
Publication date: 1992-10-29
Also published as: WO1992018624A1; JPH06506587A; EP0579685A1

Description

Plasmide zur hochwirksamen Expression von unfusioniertem fila mentösen Haemagglutinin aus Bordetella Pertussis für die Her stellung von azellularen und oralen Lebend-Impfstoffen gegen Keuchhusten sowie Wirte für diese Plasmide.

Bordetella pertussis ist für die Entstehung von Keuchhusten ver antwortlich, eine Erkrankung der Atmungswege vor allem bei Kin dern, die bei stärkster Ausbildung zu ernsten Komplikationen und zum Tode führen kann. Obgleich Gesamtzellimpfstoffzubereitungen, die routinemäßig in Kombination mit Diphtherie- und Tetanus toxoiden verabreicht werden, einen guten Schutz gegen eine ernsthafte Erkrankung bieten, macht man sich zunehmend Sorgen um die Nebenwirkungen der Impfstoffe, was dazu geführt hat, daß die Anzahl der geimpften Kinder abgenommen hat und dementsprechend Keuchhusten zunimmt.

Bordetella pertussis liefert eine Anzahl von virulenten Fakto ren, deren Synthese positiv durch die Produkte des bvg-Locus (1) reguliert wird, zu denen Pertussis-Toxin, Adenylat-Cyclase, fi lamentöses Haemagglutinin (FHA), Fimbriae und Hauptproteine der Außenmembran gehören (2). Einige dieser Determinanten sind po tentielle Antigene zur Einfügung in eine neue Generation azellu larer, atoxischer, nicht-reaktogenischer Impfstoffe. Eine der erfolgversprechendsten Komponenten für einen derartigen Impf stoff ist FHA, das eine Hauptrolle bei der Anlagerung von Bakte rien und der nachfolgenden Besiedlung des epithelialen At mungstrakts während der frühen Erkrankungsstadien spielt. Ferner kann FHA die Superinfektionen begünstigen, die üblicherweise die Erkrankung erschweren, da sich andere Bakterien dieses brücken bildenden Adhesins (3) bedienen können und da die Makrophagen antwort als Folge spezifischer Wechselwirkungen beeinträchtigt werden kann, die durch FHA vermittelt werden (4).

Bei der Herstellung von FHA für acellulare Impfstoffe sind die Fermentierung von B. pertussis, einem humanen pathologischen Er reger (Probleme der sicheren Herstellung) und heiklen Mikroorga nismus (erfordert ein teures Medium) mit langsamen Wachstums raten (lange Fermentationszeiten, geringe Ausbeuten), und die Verunreinigung von FHA-Präparationen mit anderen Krankeitsfakto ren problematisch, die zu einigen Nebenwirkungen beitragen kön nen, die beim Impfen beobachtet worden sind. Es sind rekom binante Hybridproteine gebildet worden, die FHA-Sequenzen ent halten (5 und 6), obgleich Hybridproteine, die Antigene umfas sen, die in keiner Beziehung zur spezifischen Immunantwort ste hen, im allgemeinen als für Impfungszwecke unerwünscht angesehen werden.

Gemäß einer Ausführungsform wird erfindungsgemäß ein Expressionsplasmid (bzw. rekombinantes Plasmid) zur Expression von FHA in Escherichia coli oder Salmonella (insbesondere Salmonella typhimurium) vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um ein Plasmid zur Expression von Strukturgenen handelt, und das Plasmid

- einen DNA-Bereich, der FHA kodiert, sowie
- in Leserichtung vor diesem DNA-Bereich zwei Cistrons derart umfaßt, daß das Ribosom am Startkodon dieses DNA-Bereichs (er neut) mit Translation beginnt.

Ein erfindungsgemäßes Plasmid zur Expression von FHA in Escherichia coli oder Salmonella (insbesondere Salmonella typhi murium) kann in Leserichtung die folgenden Merkmale vorsehen:

- Promotor,
- Shine-Dalgarno-Sequenz,
- Erstes Cistron beginnend mit einem Startkodon und endend mit einem Stopkodon,
- Intercistronischer Bereich,
- Zweites Cistron, beginnend mit oder bestehend aus einem Start kodon,
- DNA-Bereich, der FHA kodiert, und
- mindestens ein Stopkodon.

Ein DNA-Bereich, der FHA (Wildtyp-FHA) kodiert, liegt in pRMB2 vor. Unter DNA-Bereich werden im vorliegenden Zusammenhang fer ner DNA-Sequenzen verstanden, die gleichfalls Wildtyp-FHA ko dieren, jedoch von dem in pRMB2 vorliegenden DNA-Bereich abwei chen.

Bei dem erfindungsgemäßen Plasmid kann dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, der bvg-Locus von B. pertussis fehlen.

Das erfindungsgemäße Plasmid kann unter Verwendung eines pEX- Vektors konstruierbar sein, beispielsweise des Vektors pEX31A.

Das erfindungsgemäße Plasmid kann durch den Lambda-Promotor (P_L und/oder durch die Shine-Dalgarno-Sequenz der Polymerase des Bakteriophagen MS2 gekennzeichnet sein.

Bei dem erfindungsgemäßen Plasmid kann das erste Cistron zwischen dem Start- und dem Stopkodon die Sequenz oder eine Teilsequenz der Polymerase des Bakteriophagen MS2 aufweisen.

Das erfindungsgemäße Plasmid kann durch einen intercistronischen Bereich von 1 bis 50, insbesondere 1 bis 10 und beispielsweise etwa 5 Kodons gekennzeichnet sein.

Bei dem erfindungsgemäßen Plasmid kann das zweite Cistron etwa 3 bis 10 Basen umfassen.

Bei dem erfindungsgemäßen Plasmid kann das mindestens eine Stop kodon von dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, unmittelbar folgen oder durch einen Spacer mit etwa 5 bis 100, insbesondere etwa 10 bis 50 Basen getrennt sein.

Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Plasmid zur Expression von FHA in Escherichia coli oder Salmonella (insbesondere Salmonella typhimurium) vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es sich um ein Plasmid zur Ex pression von Strukturgenen handelt, das

- den atpE-Translationsstartbereich von Escherichia coli und
- einen DNA-Bereich umfaßt, der FHA kodiert.

Diesem DNA-Bereich, der FHA kodiert, kann der bvg-Locus von B. pertussis fehlen.

Das erfindungsgemäße Plasmid kann dadurch gekennzeichnet sein, daß es aus pJLA 503 konstruiert worden ist.

Bei dem erfindungsgemäßen Plasmid kann in Leserichtung hinter dem atpE-Translationsstartbereich von E. coli ein Linker vorgesehen sein, in den der DNA-Bereich eingefügt ist oder auf den der DNA-Bereich folgt, der FHA kodiert.

Dabei kann es sich um den Linker von Fig. 2B handeln. Auch kann bei dem erfindungsgemäßen Plasmid vor dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, ein Linker gemäß Fig. 2B und hinter diesem DNA- Bereich ein Linker gemäß Fig. 2E vorgesehen sein.

Das erfindungsgemäße Plasmid kann ferner dadurch gekennzeichnet sein, daß bei dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, derjenige Unter bereich, der N-terminal die erste bis maximal die fünfzehnte Aminosäure kodiert, gegenüber dem FHA-Wildtyp modifiziert ist, ohne die Aminosäuresequenz des Wildtyps abzuändern. Dabei kann es sich um eine Modifikation gemäß Fig. 2D handeln.

Erfindungsgemäß wird eine effiziente und direkte Expression von nicht-fusioniertem FHA in Escherichia coli vorgesehen. Die bio logische Abtrennung von FHA von anderen virulenten B.-pertussis- Determinanten, die dadurch erreicht wird, bietet eine Lösung hinsichtlich des Problems, daß FHA-Präparationen mit anderen virulenten Bordetella-Determinanten verunreinigt sind. Die Ex pression von FHA in E. coli löst auch die Schwierigkeiten, die mit dem Fermentieren großer Mengen des heiklen langsam wachsen den humanen Erregers verbunden sind.

Ferner wird erfindungsgemäß die Expression von FHA in Salmonella typhimurium aro A erreicht. Die Konstruktion eines Lebend- Impfstoffträgerstamms dieser Salmonella Subspecies, die B. pertussis-Antigene exprimiert, kann dazu führen, orale Impf stoffe gegen Keuchhusten vorzusehen, die sowohl eine mukosale als auch eine systemische Immunität stimulieren. Damit öffnen sich neue Perspektiven für die Entwicklung sowohl von Unterein heit-Impfstoffen als auch von Gesamt-Impfstoffen und für die Verwendung gereinigter Antigene bei der Entwicklung von Kits für serodiagnostische oder epidemiologische Studien über Keuch husten.

Gemäß weiteren Ausführungsformen der Erfindung werden E. coli und Salmonella, beispielsweise Salmonella typhimurium, als Wirt für ein erfindungsgemäßes Plasmid vorgesehen.

Nachstehend wird die Erfindung anhand experimenteller Daten und Figuren näher erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Herstellung von FHA in einem Zwei-Cistron-System;

Fig. 2 die Konstruktion eines Plasmids für die direkte Ex pression von FHA;

Fig. 3 die direkte Expression von FHA in E. coli und in Salmo nella typhimurium aro A.

Das Cosmid pRMB2 (7) enthält die genetische Information, die die ersten 3277 Aminosäuren des fhaB-Gens kodiert (5, 6). Eine Kom plementierung dieses Gens mit dem bvg-locus, der positiv die FHA-Expression in B. pertussis reguliert, führt nicht zu seiner Expresion in E. coli. Es wurden zwei verschiedene Strategien an gewandt, um eine effiziente Expression von FHA in E. coli zu er reichen.

Zwei-Cistron-Sytem

Üblicherweise bedient man sich der pEX31-Plasmid-Klonierreihe (8), um Genfusionen mit den ersten 98 Aminosäureresten des NH₂- Terminus des Replikaseproteins des Bakteriophagen MS2 zu errei chen, dessen Expression durch den Lambda-P_L-Promotor kontrol liert wird. Es werden FHA Genfusionen in pCG17 (Aminosäuren 882 bis 1670), pCG22 (Aminosäuren 1670 bis 3241) und pCG24 (Amino säuren 2028-3241) gebildet. Diese Genfusionen werden benutzt, um die Region darzustellen, die das Epitop (Aminosäuren 1670 bis 2028) enthält, das von dem monoklonalem Antikörper P12H3 (9) er kannt wird, das benutzt wird, um eine FHA-Expression zu ermit teln. Es wird ein Zwei-Cistron-System zur FHA-Produktion verwen det, das nicht mit der MS2-Polymerase fusioniert ist, um sich in vorteilhafter Weise des effizienten Lambda-P_L-Promotors und der hohen ribosomalen Translationsinitiationsrate der MS2-Polymerase Shine-Dalgarno-Sequenz zu bedienen. Beim Klon pCG16 wird das 8,4 kb SphI-SphI-DNA-Fragment, das die Aminosäuren 16 bis 2853 ko diert, in Leserichtung hinter dem TAG-Stopkodon kloniert, das an der XbaI-Stelle der Mehrfachklonierstelle (multiple cloning site) des Vektors pUC18NotI vorliegt. Dieses Stopkodon liegt im Leserahmen mit der MS2-Sequenz von pEX31A. Die intercistronische Region hat eine Länge von 15 Nukleotiden; nach translationaler Termination am TAG-Stopkodon überträgt das Ribosom unmittelbar zum ATG-Startkodon innerhalb der SphdI-Stelle des FHA-Fragments; die Translation des zweiten Cistrons beginnt. Danach wird die Translation an dem doppeltem Stopkodon (TGA-TGA) abgebrochen, das im Plasmid vorliegt; vgl. Fig. 1.

Direkte Expression von FHA

Der Expressionsvektor pJLA503 (10), der die hitze- bzw. wärmere gulierten Tandempromotoren P_R und P_L sowie die hocheffiziente E.-coli-atpE-Translationsstartregion umfaßt, wird modifiziert, um zusätzliche Restriktionsstellen vorzusehen, um das Subklonie ren des FHA-Gens und die Positionierung der im Leserahmen lie genden Stopkodons für die Beendigung der Translation zu ermögli chen. Dieses neue Expressionsplasmid wird pJLACG1 genannt. Man modifiziert die ersten 15 Aminosäuren des fhaB-Gens durch linkergerichtete Mutagenesen, um die zu erwartende RNA-Sekundär struktur um die Ribosombindungsstelle abzubauen, jedoch die Aminosäuresequenz des zu exprimierenden Produktes zu sichern; vgl. Fig. 2.

Man transformiert die Expressionsplasmide pCG18 (Aminosäuren 16 bis 2853), pCG32 (Aminosäuren 1 bis 2853) und pCG26 (Aminosäuren 1 bis 3277) in E. coli CAG629 (von Dr. C. Gross), E. coli EC538 (von Dr J. McCarthy) und E. coli EC876 (von Dr. R. Brownlie) und in S. typhimurium aro A SL3261 (11). Nach Induktion bei 42°C werden die gesamten Zellextrakte einer Polyacrylamidgel-Elek trophorese unterworfen; man prüft die Anwesenheit von rekom binantem FHA nach dem Western-Blot-Test; vgl. Fig. 3. Eine maxi male Expression von FHA in E. coli wird mit EC538 pCG26 er reicht. Dieses Konstrukt exprimiert auch hohe Niveaus von FHA in S. typhimurium aro A. Das Plasmid pCG26 exprimiert ein nicht fusioniertes rekombinantes Protein mit einem ungefähren Moleku largewicht von 220 kD. Dieses Protein deckt die kodierenden Se quenzen von FHA ab, die zur Expression aller Epitope erforder lich sind, die bei der Immunantwort gegen Wildtyp-FHA erkannt werden.

Experimentelle Daten in Verbindung mit Fig. 1:

FHA-Produktion in einem Zwei-Cistron-System.

A) Der Bereich, der das Epitop kodiert, das von dem monoklona len Antikörper P12H3 (von Dr. C. Parker) erkannt wird, ist durch den schwarzen Balken dargestellt. Schattierte Balken entsprechen der fhaB-Gen-Sequenz, die durch pCG22, pCG24 und pCG17 in Form von Fusionsproteinen oder im Zwei-Cistron- System (pCG16) kodiert wird. Das Pluszeichen und das Minus zeichen repräsentieren die Anwesenheit bzw. Abwesenheit ei ner Reaktion auf die Proteine, die durch Klone mit dem mono klonalen Antikörper P12H3 oder ein polyklonales Anti-FHA-An tiserum in Western-Blot-Tests anfallen.
B) SDS-PAGE von Gesamtzellextrakten, die mit Coomasie-Blue an gefärbt worden sind. Streifen 1: Molekulargewichts-Stan dards; Streifen 2 bis 6: E. coli 537(pCI 857^TS) mit einem Gehalt an pCG24, pCG22, pCG17, pCG16 bzw. pEX31A; Pfeile weisen auf die Hauptfusionsproteine hin.
C) Western-Blot-Analysen unter Verwendung des monoklonalen An tikörpers P12H3. Streifen 1: Molekulargewichts-Marker;, Streifen 2: gereinigtes FHA von B. pertussis (Tohama-Stamm); Streifen 3 bis 7: E. coli 537 (pCI857^TS) mit einem Gehalt an pEX31A (Steifen 3), pCG22 (Streifen 4 und 5), pCG16 (Strei fen 5 und 6). Für die Streifen 4 und 6 wurde 30 min. lang induziert, während bei den Streifen 3, 5 und 7 2 h lang in duziert wurde.
D) Western-Blot-Analysen unter Verwendung von polyklonalem Antiserum gegen FHA. Streifen 1: Molokulargewichts-Stan dards; Streifen 2: gereinigtes FHA von B. pertussis; Strei fen 3 bis 11: E. coli 537(pCI857^TS) mit einem Gehalt an pCG24 (Streifen 3 und 7), pCG22 (Streifen 4 und 8), pCG17 (Streifen 5 und 9), pCG16 (Streifen 6 und 10), pEX31A (Streifen 11). Bei den Streifen 3 bis 6 wurde 30 min. lang induziert, während bei den Streifen 7 bis 11 2 h lang indu ziert wurde. Molekulargewichts-Standards (Größen in kD) sind durch Pfeile bezeichnet.
E) Graphische Darstellung des Zwei-Cistron-Systems im Klon pCG16.

Experimentelle Daten in Verbindung mit Fig. 2: Konstruktion von Plasmiden für die direkte Expression von FHA.

A) Expressionsplasmid pJLACG1, das die Lambda-Promotoren P_R und P_L in Tandem-Anordnung (schwarze Pfeile), den atpE-Trans lationsinitiations-Bereich (schwarze Strecken), den FD- Transscriptions-Terminator, das β-Lactamase-Gen und die NdeI/SalI-Mehrfachklonierstelle (MCS) umfaßt.
B) SphI/SalI-Linker, der zum Modifizieren der Mehrfachklonier- Stelle von pJLA503 verwendet wurde, um pJLACG1 zu konstruie ren und ein Subklonieren verschiedener DNA-Fragmente für eine Klonierung von FHA im Expressionsplasmid zu ermöglichen.
C) und D) Ursprüngliche Kodierregion (C) und modifizierte Kodierregion (D) des NdeI/SphI-Linkers. Die Nukleotidsequenz des N-termi nalen FHA-Bereichs ist in der Ein-Buchstaben-Schreibweise wiedergegeben. Die NdeI-Restriktionsstelle (CATATG) und die SphI-Restriktionsstelle (GCATGC) sind näher bezeichnet. Ba senpaar-Veränderungen, die Unterschieden zwischen der ur sprünglichen Nukleotidsequenz und dem synthetischen Olio nukleotid-Linker NdeI/SphI entsprechen, sind durch kleine Pfeile bezeichnet, wobei die großen Pfeile einen Teil des atpE-Translationsinitiations-Bereichs fortführen, der vom Expressionsplasmid pJLA5O3 kodiert wird. Ferner ist die RNA- Stabilität +/- 50 Basen vom ATG-Startkodon aus angegeben.
E) SphI/EcoRI-Linker für pCG32.

Experimentelle Daten in Verbindung mit Fig. 3: Direkte Expres sion von FHA in E. coli und Salmonella typhimurium aro A.

A) Graphische Darstellung der Klone pCG26, pCG18 und pCG32 zur Expression von FHA. Die Anwesenheit oder Abwesenheit des NdeI/SphI-Linkers ist durch schwarze Balken gegeben. Schat tierte Balken entsprechen der fhaB-Gensequenz, die durch pCG26, pCG18 und pCG32 kodiert wird. Das Niveau der FHA-Ex pression, das durch Western-Blot-Analysen mit dem monoklona len Antikörper P12H3 bestimmt wurde, reicht von geringem Ni veau (+/-) bis zu intensivem Niveau (+++).
B) Gesamtzellextrakte von Klonen, die Western-Blot-Analysen un terworfen wurden. Streifen 1: Molekulargewichts-Standards; Streifen 2: Gereinigtes FHA; Streifen 3: B. pertussis (Stamm Tohama); Streifen 4 bis 7: E. coli CAG629 mit einem Gehalt an pJLACG1, pCG18, pCG32 und pCG26; Streifen 8 bis 10: E. coli 876 mit einem Gehalt an pCG18, pCG32 und pCG26; Strei fen 11 bis 13, E. coli EC538 mit einem Gehalt an pCG18, pCG32 und pCG26; Streifen 14 bis 17: Salmonella typhimurium aro A SL3261 mit einem Gehalt an pJLACG1, pCG18, pCG26 und pCG32.

References

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Claims

1. Plasmid zur Expression von FHA in Escherichia coli oder Salmonella (insbesondere Salmonella typhimurium), dadurch ge kennzeichnet, daß es sich um ein Plasmid zur Expression von Strukturgenen handelt und das Plasmid

2. Plasmid zur Expression von FHA in Escherichia coli oder Salmonella (insbesondere Salmonella typhimurium) mit den folgen den Merkmalen in Leserichtung:

- Promotor,
- Shine-Dalgarno-Sequenz,
- Erstes Cistron, beginnend mit einem Startkodon und endend mit einem Stopkodon,
- Intercistronischer Bereich,
- Zweites Cistron, beginnend mit oder bestehend aus einem Stop kodon,
- DNA-Bereich, der FHA kodiert, und
- mindestens ein Stopkodon.

3. Plasmid nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, der bvg-Locus von B. pertussis fehlt.

4. Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, konstruier bar unter Verwendung eines pEX-Vektors, beispielsweise des Vek tors pEX31A.

5. Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeich net durch den Lambda-Promotor (P_L).

6. Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeich net durch die Shine-Dalgarno-Sequenz der Polymerase des Bak teriophagen MS2.

7. Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, daß das erste Cistron zwischen dem Start- und dem Stopkodon die Sequenz oder eine Teilsequenz der Polymerase des Bakteriophagen MS2 aufweist.

8. Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeich net durch einen intercistronischen Bereich von 1 bis 50, insbe sondere 1 bis 10 und beispielsweise etwa 5 Kodons.

9. Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, daß das zweite Cistron etwa 3 bis 10 Basen umfaßt.

10. Plasmid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, daß das mindestens eine Stopkodon dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, unmittelbar folgt oder durch einen Spacer mit etwa 5 bis 100, insbesondere etwa 10 bis 50 Basen getrennt ist.

11. Escherichia coli, umfassend ein Plasmid gemäß einem der An sprüche 1 bis 10.

12. Salmonella, beispielsweise Salmonella typhimurium, umfassend ein Plasmid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10.

13. Plasmid zur Expression von FHA in Escherichia coli oder Salmonella (insbesondere Salmonella typhimurium), dadurch ge kennzeichnet, daß es sich um ein Plasmid zur Expression von Strukturgenen handelt, das

14. Plasmid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, der bvg-Locus von B. pertussis fehlt.

15. Plasmid nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß er aus pJLA 503 konstruiert worden ist.

16. Plasmid nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekenn zeichnet, daß in Leserichtung hinter dem atpE-Translationsstart bereich von E. coli ein Linker vorgesehen ist, in den der DNA- Bereich eingefügt ist oder auf den der DNA-Bereich folgt, der FHA kodiert.

17. Plasmid nach Anspruch 16, gekennzeichnet durch den Linker von Fig. 2B.

18. Plasmid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß in Le serichtung vor dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, ein Linker ge mäß Fig. 2B und hinter dem DNA-Bereich ein Linker gemäß Fig. 2 E vorgesehen ist.

19. Plasmid nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekenn zeichnet, daß bei dem DNA-Bereich, der FHA kodiert, derjenige Unterbereich, der N-terminal die erste bis maximal die fünf zehnte Aminosäure kodiert, gegenüber dem FHA-Wildtyp modifiziert ist, ohne die Aminosäuresequenz des Wildtyps abzuändern.

20. Plasmid nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch eine Modifikation gemäß Fig. 2 D.

21. E. coli, umfassend ein Plasmid gemäß einem der Ansprüche 13 bis 20.

22. Salmonella, beispielsweise Salmonella typhimurium, umfassend ein Plasmid gemäß einem der Ansprüche 13 bis 20.