ES2262159T3 - Imnunidad contra las toxinas rtx de actinobacillus pl europneumoniae apx. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN MICROORGANISMO MODIFICADO QUE PRODUCE UNA TOXINA RTX, DONDE ESTA TOXINA SE INACTIVA PARCIAL O TOTALMENTE. EN UNA REALIZACION DE LA PRESENTE INVENCION, SE PROPORCIONA UN MICROORGANISMO MODIFICADO EN EL QUE UN GEN DE LA TOXINA RTX QUE INCLUYE UN GEN ESTRUCTURAL RTX Y/O UN ACTIVADOR POSTRADUCCIONAL DEL ORGANISMO SE INACTIVA PARCIAL O TOTALMENTE. LOS PRESENTES SOLICITANTES HAN ENCONTRADO QUE UN PRECURSOR DE UNA TOXINA RTX POSEE UNA ACTIVIDAD TOXICA REDUCIDA. LLAMA LA ATENCION QUE EL PRECURSOR DE LA TOXINA RTX ES CAPAZ DE INDUCIR UNA RESPUESTA INMUNITARIA EN UN ANIMAL QUE OFRECE PROTECCION CRUZADA FRENTE A UNA PROVOCACION HETEROLOGA CON UN MICROORGANISMO QUE PRODUCE LA TOXINA RTX. PUEDE SINTETIZARSE POR INGENIERIA UN MICROORGANISMO QUE PRODUCE DE FORMA NATURAL UNA TOXINA RTX PARA PRODUCIR UN PRECURSOR DE LA TOXINA RTX INACTIVA MEDIANTE LA ELIMINACION DEL ACTIVADOR POSTRADUCCIONAL DEL PRODUCTO PRECURSOR. ASIMISMO, EN UNA REALIZACION PREFERIDA, EL MICROORGANISMO ES INCAPAZ DE PRODUCIR UN ACTIVADOR POSTRADUCCIONAL DEL PRECURSOR DE LA TOXINA RTX O PRODUCE UN ACTIVADOR POSTRADUCCIONAL INACTIVADO DEL PRECURSOR DE LA TOXINA RTX. EL ACTIVADOR POSTRADUCCIONAL PUEDE SER UN PRODUCTO DE UN GEN C RTX. EN OTRO ASPECTO, LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN VECTOR PLASMIDO RECOMBINANTE PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS HETEROLOGAS EN ACTINOBACILLUS U ORGANISMOS RELACIONADOS. EN UNA REALIZACION PREFERIDA, EL VECTOR PLASMIDO RECOMBINANTE ES DERIVADO DE UN PLASMIDO NATURAL DE ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE. EL PLASMIDO RECOMBINANTE PUEDE INCLUIR UNA SECUENCIA DE DNA QUE CODIFICA UN PRECURSOR DE LA TOXINA RTX. EL PLASMIDO RECOMBINANTE PUEDE INCLUIR UN GEN A RTX. ALTERNATIVAMENTE, EL PLASMIDO RECOMBINANTE PUEDE INCLUIR UN GEN C RTX O UN FRAGMENTO DEL MISMO.

Description

Inmunidad contra las toxinas RTX de Actinobacillus pleuropneumoniae APX.

La presente invención se refiere a microorganismos modificados apropiados para su utilización como vacunas vivas. La presente invención se refiere asimismo generalmente a la utilización de microorganismos modificados como vectores biológicos. La presente invención se refiere además a composiciones de vacuna. En particular, la presente invención se refiere a composiciones apropiadas para inducir una respuesta inmune contra toxinas RTX.

Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), es un miembro de la familia Pasteurellaceae, y es el agente etiológico de la pleuroneumonía porcina, una infección aguda o crónica de los cerdos, caracterizada por lesiones pulmonares hemorrágicas, de fibrina y necróticas (Pohl et al., 1983; Kilian y Biberstein, 1984). La enfermedad es muy contagiosa, y está asociada a todas las edades de los cerdos en desarrollo, dando lugar a pérdidas económicas importantes para la industria del cerdo. El modo directo de transmisión de APP significa que la infección es más frecuente bajo condiciones de cría intensiva, pero afortunadamente la gama de huéspedes de APP se limita a los cerdos, reduciéndose de este modo las fuentes potenciales de la infección. Hasta la fecha, se han identificado doce serovares de APP en el mundo (serovares 1-12), representando los serovares 1, 7 y 12 el 90% aproximadamente de los aislamientos Australianos (Kamp y Shope, 1964). Se han identificado diversos factores potenciales de virulencia, incluyendo las proteínas externas de las membranas (Mulks y Thacker, 1988; Rapp y Ross, 1988), lipopolisacáridos (Udeze et al., 1987; Fenwick y Osbum, 1986), las cápsulas (Inzana et al., 1988; Rosendale y Macinnes, 1990; Lenser et al,1988) y las toxinas secretadas (Rycroft et al., 1991; Bhatia et al., 1991; Fedorka-Crey et al., 1990). Las toxinas secretadas, o toxinas APX, son miembros de la familia RTX de toxinas (Frey et al., 1993, 1994).

Las toxinas RTX son producidas por diversas bacterias gram negativas que incluyen Actinobacillus spp, Proteus vulgaris, Morganella morganii, Bordetella pertussis, Pasteurella haemolytica, y las más caracterizadas del grupo producidas por E. coli (Welch, 1991). Todas las toxinas RTX funcionan produciendo poros en las células diana, interrumpiendo por tanto el equilibrio osmótico, que conduce a la ruptura de la célula diana.

Aunque el modo de acción es idéntico para las toxinas RTX, sus células diana varían mucho en el tipo y en la especificidad del cruzamiento de las especies. Estructuralmente, esta familia de toxinas se caracteriza por la presencia de estructuras repetitivas ricas en glicina en el interior de la toxina, que se unen al calcio y pueden tener un papel en el reconocimiento de y en la unión a las células diana, una región de dominios hidrofóbicos que está implicada en la formación de poros, el requerimiento para la activación post traduccional, y la dependencia de una secuencia señal C-terminal para la secreción (Revisado: Coote, 1992).

Tres toxinas distintas APX se producen, por lo menos, por APP, denominadas APX1, APX2 y APX3. APX1 muestra una intensa y APX2 una relativamente suave actividad hemolítica, ambas son citotóxicas y activas contra una amplia gama de células de distintos tipos y especies (Frey y Nicolet, 1988; Rosendale et al., 1988; Kamp et al., 1991). APX3 no es hemolítica, pero es intensamente citotóxica, con una gama de huéspedes que incluye macrófagos alveolares porcinos y neutrófilos (Rycroft et al., 1991; Kamp et al., 1991). Ningún serovar de APP produce las tres toxinas APX, produciendo la mayoría dos (APX1 y 2; serovares 1, 5, 9 y 11; APX2 y 3: 2, 3, 4, 6 y 11) con un pequeño número (APX 1:10, APX 2:7 y 12) que producen sólo una APX (Frey y Nicolet, 1990; Frey et al 1992, 1993, 1994; Kamp et al, 1991; Rycroft et al, 1991). El patrón de la producción de APX parece estar asociado con la virulencia, siendo los serovares que producen APX1 y 2 los más virulentos (Frey et al, 1944; Komal y Mittal, 1990). La producción y secreción de las toxinas RTX activas requiere de la actividad de por lo menos cuatro genes, C, A, B y D. El gen A codifica la toxina estructural, el gen C codifica el activador post-traduccional y los genes B y D codifican proteínas que son necesarias para la secreción de la toxina activada (Issartel et al, 1991; Welch, 1991; Felmlee et al., 1985). APX1 y 3 son codificadas por operones que están formados por los cuatro genes contiguos (CABD), mientras que el operón APX2 contiene sólo los genes C y A, y en algunos casos restos del gen B. La secreción de APX2 depende de la actividad de los productos de los genes APX1B y D. (Revisado por Frey et al.,
1994).

El análisis de la virulencia de mutantes no hemolíticos, espontáneos, y químicamente inducidos, indicó un papel de las toxinas APX en la virulencia, que se ha confirmado recientemente utilizando mutagénesis transposónica (Anderson et al 1991; Gerlach et al., 1992; Inzana et al., 1991; Rycroft et al, 1991a,b: Tacon et al., 1993, 1994). La protección completa de la enfermedad y/o del estado de portador no puede obtenerse utilizando vacunas que comprenden bacterias inactivadas químicamente, o vacunas subunitarias purificadas que comprenden proteínas externas de membranas, lipopolisacáridos o cápsulas. En comparación, la protección completa de la enfermedad en los ratones se obtuvo después de la vacunación con APX purificada combinada con células completas formalizadas, que indica un papel para las toxinas APX en la inmunidad protectora (Bhatia et al., 1991).

La vacunación contra la pleuroneumonía, que resulta de la infección de los cerdos por APP, ha utilizado, hasta ahora, bacterinas o vacunas subunitarias basadas en varios componentes de las bacterias. Los resultados obtenidos con vacunas inactivas han ofrecido, como mucho, protección homóloga contra los serovares utilizados para preparar el material de la vacuna. Existen habitualmente, doce serovares conocidos de APP, de virulencia variable, necesitando cada uno una preparación vacunal distinta. Hasta la fecha, las vacunas comerciales se han formulado para contener diversos serovares, que ofrecen protección contra los serovares más ampliamente observados en la localización geográfica. En contraste con las vacunas inactivas, la infección natural con cualquier serovar, ofrece protección contra la reinfección con cualquier otro serovar, indicando el potencial de una vacuna viva para ofrecer protección cruzada contra los serovares APP.

Un objetivo de la presente invención consiste en paliar uno o más de los problemas de la técnica anterior.

De acuerdo con esto, en un aspecto, la presente invención proporciona un Actinobacillus pleuropneumoniae genéticamente modificado (APP) que comprende un operón de una toxina RTX que incluye un gen estructural RTX y un gen RTX activador post-traduccional parcial o completamente inactivado que produce una toxina RTX en la que dicha toxina RTX está parcial o completamente inactivada.

El término "genéticamente modificada" incluye una modificación mediante técnicas de ADN recombinante u otras técnicas tales como mutagénesis inducida químicamente o mediante radiación. Allí donde las técnicas del ADN recombinante implican la introducción de ADN extraño en las células huésped, el ADN puede introducirse mediante cualquier procedimiento apropiado. Los procedimientos apropiados incluyen la transformación de las células competentes, la transducción, la conjugación y la electroporación.

En otra forma de realización de la presente invención, se proporciona un microorganismo modificado en el que un gen de la toxina RTX que incluye un gen estructural RTX y/o un activador pos traduccional del organismo, se inactiva parcial o completamente.

El término "operón de la toxina RTX" tal como se utiliza en la presente memoria en las reivindicaciones y en la descripción, tiene el propósito de incluir los genes implicados en la expresión de una toxina RTX que es producto del operón de la toxina RTX. Los genes incluidos en el operón de la toxina RTX incluyen el gen activador postraduccional (C), el gen estructural (A) y los genes B y D que codifican proteínas que son necesarias para la secreción de la toxina RTX activada.

La expresión "parcial o completamente inactivada", tal como se utiliza en la presente memoria en las reivindicaciones y en la descripción, incluye la modificación de un gen mediante técnicas de ADN recombinante, que incluyen la introducción y deleción del ADN del gen, que incluyen la sustitución nucleótida múltiple o única, la adición y/o deleción que incluyen la deleción total o parcial del gen, utilizando un constructo diana o la segregación plasmídica; y la mutagénesis sitio específica inducida químicamente o mediante radiación.

En una forma de realización preferida, el APP genéticamente modificado induce en un huésped una inmunidad protectora para el polipéptido estructural RTX y para la infección por el Actinobacillus pleuropneumoniae.

Los presentes solicitantes han descubierto que un precursor de una toxina RTX posee una actividad tóxica reducida. De modo sorprendente, los solicitantes han descubierto asimismo que el precursor de la toxina RTX es capaz de inducir una respuesta inmune en un animal que ofrece protección cruzada contra una estimulación heteróloga con un microorganismo que produce la toxina RTX.

De acuerdo con esto, en una forma de realización preferida de la invención, la toxina RTX inactivada es un precursor de una toxina RTX. El precursor puede ser un producto de expresión no procesado de un gen estructural RTX. El gen estructural RTX puede ser un gen RTX A. La toxina RTX puede ser una toxina APX. La toxina APX puede ser APX1, APX2, o APX3.

Los solicitantes han descubierto que al APP, que naturalmente produce una toxina RTX, se le pueden aplicar técnicas de ingeniería genética, para producir un precursor inactivo de la toxina RTX eliminando el activador post-traduccional del producto precursor. De acuerdo con esto, en una forma de realización preferida, el APP genéticamente modificado no puede producir un activador post-traduccional del precursor de la toxina RTX, o produce un activador post-traduccional inactivado del precursor de la toxina RTX. El activador post-traduccional puede ser un producto de un gen RTX C.

En una forma de realización preferida, el gen RTX C de APP, es inactivado o parcial o completamente eliminado. El gen RTX C puede ser inactivado mediante mutagénesis sitio específica. El gen RTX C puede ser inactivado mediante cualquier sustitución, adición y/o deleción nucleótida múltiple o única. Preferentemente, el gen RTX C es inactivado mediante recombinación homóloga, utilizando un constructo diana. El constructo diana puede incluir un marcador seleccionable franqueado por secuencias homólogas para las secuencias que franquean el sitio deseado de inserción. El marcador seleccionable puede ser un gen que confiera resistencia a una sustancia tóxica tal como el mercurio, o puede ser un determinante de resistencia antibiótica. El determinante de resistencia antibiótica puede ser un gen que codifica la resistencia a la ampicilina, la kanamicina o la estreptomicina.

En algunas circunstancias, puede no ser deseable tener un gen funcional de resistencia antibiótica incorporado a un microorganismo modificado. De acuerdo con esto, la presente invención contempla un constructo diana que incluye elementos genéticos tales como secuencias repetitivas, que facilitan la escisión del gen de resistencia antibiótica una vez que el constructo diana ha experimentado una recombinación homóloga con el cromosoma huésped.

La presente invención contempla asimismo un constructo diana que no incluye un marcador seleccionable. Por ejemplo, el constructo diana puede incluir un segmento del gen RTX C que contiene una deleción. La recombinación homóloga del constructo diana con el cromosoma del huésped puede dar lugar a la introducción de una deleción en el gen RTX C cromosómico. La selección de los recombinantes puede entonces basarse en la ausencia de la producción de la toxina RTX.

El constructo diana puede ser introducido directamente en un APP de forma lineal. Alternativamente, el constructo diana puede ser introducido a través de un vector suicida o de uno que no experimente replicación. El vector suicida puede ser cualquier plásmido que no experimente replicación en un APP. Los APP, que naturalmente producen toxinas RTX, no son a menudo huéspedes permisivos para los vectores pEP. De acuerdo con esto, los vectores pEP son ejemplos de vectores suicidas que pueden utilizarse en la presente invención. El vector plasmídico suicida puede ser pEP-C^{-}Amp^{f}.

En otra forma de realización, la mutagénesis sitio específica puede obtenerse mediante la técnica de la segregación plasmídica. Por ejemplo, un plásmido que contiene un fragmento de un gen RTX C interrumpido mediante un gen marcador seleccionable, puede ser introducido en un APP. Un APP puede transformarse a continuación con un segundo plásmido que contiene un segundo gen marcador seleccionable. Al APP que contiene ambos plásmidos puede entonces hacérsele atravesar medios que seleccionen sólo el segundo plásmido. La selección del segundo plásmido puede actuar contra el mantenimiento del primer plásmido. El primer plásmido puede, por tanto, perderse, pero en algunos casos, puede tener lugar la recombinación del fragmento del gen RTX C interrumpido que contiene el marcador seleccionable en el cromosoma. Este proceso por tanto, puede alentar la recombinación del gen RTX C interrumpido en el gen RTX C cromosómico, inactivando de este modo el gen RTX C cromosómico.

El producto del gen RTX A puede expresarse a partir de un gen RTX A cromosómico. El gen RTX A cromosómico puede localizarse en su posición natural en el cromosoma, o puede insertarse en el cromosoma en una posición distinta que la de su localización natural. Además, el producto del gen RTX puede expresarse a partir de un gen RTX A localizado en un elemento extracromosómico tal como un plásmido. Por tanto, un elemento extracromosómico que contiene un gen RTX A puede introducirse en un APP, que tiene un gen RTX A cromosómico funcional y un gen RTX C cromosómico inactivado. El producto de RTX A que se expresa a partir del elemento extracromosómico puede suplementar al producto RTX A que se expresa a partir del gen cromosómico.

Alternativamente, el producto del gen RTX A puede expresarse completamente a partir de un gen RTX A o de genes localizados en elementos extracromosómicos tales como plásmidos. Los genes RTX A localizados en elementos extracromosómicos puede expresarse en presencia o ausencia de selección para el elemento extracromosómico. De este modo, un elemento extracromosómico que contiene un gen RTX A puede introducirse en un APP al que le faltan los genes RTX C y RTX A funcionales cromosómicos. El microorganismo al que le faltan los genes RTX C y RTX A funcionales puede producirse mediante mutagénesis del APP. La mutagénesis puede dar lugar a la deleción de los genes RTX C y RTX A o de sus porciones.

El elemento extracromosómico puede ser un vector recombinante de expresión que incluye el gen RTX A. El vector recombinante de expresión permite la expresión del gen RTX A en APP. El vector recombinante de expresión puede derivarse de un plásmido pIG. El plásmido recombinante puede derivarse de plG3B. El plásmido recombinante puede ser plG38-TIK.

Los sistemas bacterianos vectoriales que se basan en APP (Ph) proporcionan un medio alternativo para suministrar moléculas vacunales de "ADN desnudo" a células huésped. Dichos sistemas va vacunales/de expresión del ADN desnudo incluirían un plásmido capaz de experimentar la replicación en el sistema bacteriano, y un promotor eucariótico que controlaría la expresión del gen extraño/recombinante de interés.

En una forma de realización preferida, el APP genéticamente modificado es capaz de producir una o más proteínas funcionales que facilitan la secreción de las moléculas de la toxina RTX. El APP genéticamente modificado puede tener genes funcionales RTX B y/o RTX D. En otra forma de realización, el APP genéticamente modificado no puede producir por lo menos una de las proteínas implicadas en la secreción de las moléculas de la toxina RTX, o produce por lo menos una proteína inactiva implicada en la secreción de las moléculas de la toxina RTX. El microorganismo puede tener un gen inactivo RTX B y/o RTX D. Así, el microorganismo puede ser incapaz de secretar las moléculas de la toxina RTX activa o inactiva.

Los vectores plasmídicos recombinantes pueden utilizarse para la expresión de proteínas heterólogas en APP. Preferentemente, el vector plasmídico recombinante se deriva de un plásmido que se encuentra de modo natural en Actinobacillus pleuropneumoniae. El plásmido recombinante puede incluir una secuencia de ADN que codifica un precursor de la toxina RTX. El plásmido recombinante puede incluir un gen RTX A. Alternativamente, el plásmido recombinante puede incluir un gen RTX C o un fragmento suyo. EL gen RTX C o un fragmento génico puede ser interrumpido por una secuencia de intervención de ADN. La secuencia de intervención de ADN puede codificar un marcador seleccionable tal como un gen de resistencia a un antibiótico. El plásmido que se encuentra de modo natural puede ser plG3. Preferentemente, el vector plasmídico recombinante incluye además secuencias nucleótidas que facilitan la transferencia del ADN a E. coli. Las secuencias nucleótidas pueden incluir por lo menos un sitio de clonación múltiple y el gen lac o su porción. El vector plasmídico recombinante puede seleccionarse a partir de plG317, plG3B o plG3B-T1K.

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La presente invención proporciona además una composición de vacuna para inducir una respuesta inmunológica en un animal huésped inoculado con dicha composición de vacuna, incluyendo dicha composición de vacuna un Actinobacillus pleuropneumoniae genéticamente modificado (APP) que comprende un operón de la toxina RTX que incluye un gen estructural RTX y un gen RTX activador post-traduccional parcial o completamente inactivado que produce una toxina RTX en la que dicha toxina RTX está parcial o completamente inactivada. Preferentemente, la toxina RTX inactivada es un precursor de una toxina RTX. El precursor puede ser un producto de expresión sin procesar de un gen estructural RTX. El gen estructural RTX puede ser un gen RTX A. Preferentemente, el gen RTX C del microorganismo es inactivado o suprimido.

En una forma de realización preferida, la composición de vacuna que incluye un APP modificado genéticamente, es una vacuna viva.

Una composición de vacuna de la presente invención, puede incorporarse a cualquier vehículo farmacéuticamente aceptable con o sin adición de adyuvantes o moléculas inmunoestimuladoras.

El adyuvante puede ser de cualquier tipo apropiado. El adyuvante puede seleccionarse de entre aceites vegetales o sus emulsiones, sustancias activas superficiales, por ejemplo, hexadecilamina, octadecil amino ácido ésteres, octadecilamina, lisolecitina, bromuro de dimetil-dioctadecil-amonio, N, N-dicoctadecil-N'-N'bis (2-hidroxietil-propano diamina), metoxihexadecilglicerol, y polipoles plurónicos; poliaminas, por ejemplo, pirano, dextransulfato, poli IC, carbopol; péptidos, por ejemplo, muramil dipéptido, dimetilglicina, tuftesina; complejos de estimulación inmune (ISCOMS); emulsiones de aceite; y geles minerales y suspensiones. Una suspensión mineral tal como alumbre, es decir, hidróxido de aluminio (Al(OH)_{3}), prefiriéndose fosfato de aluminio o sulfato de aluminio. El adyuvante puede estar presente en cantidades de entre 1 y 75% en peso, basadas en el peso total de la composición de vacuna.

Se apreciará que una vacuna según la presente invención, que incluye un APP genéticamente modificado capaz de producir un precursor de la toxina RTX, posea el potencial para proporcionar protección contra una gama de serovares de un microorganismo que produce la correspondiente toxina RTX.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un vector biológico que incluye un Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) genéticamente modificado, que comprende un operón de la toxina RTX que incluye un gen estructural RTX y un gen RTX activador post-traduccional parcial o totalmente inactivado, que produce una toxina RTX, en la que dicha toxina RTX está parcial o completamente inactivada.

La toxina RTX puede ser una toxina APX. La toxina APX puede ser APX1, APX2, o APX3. Preferentemente, la toxina RTX inactiva es un precursor de la toxina RTX. Preferentemente, el precursor de la toxina RTX es un producto del gen RTX A.

En una forma de realización preferida, el APP modificado genéticamente no puede producir un activador post-traduccional del precursor de la toxina RTX, o produce un activador post-traduccional inactivado del precursor de la toxina RTX. El activador post-traduccional puede ser un producto de un gen RTXC. En una forma de realización preferida, el gen RTX C del APP modificado genéticamente, es inactivado o suprimido. El gen RTX C puede ser inactivado mediante cualquier sustitución múltiple o única de nucleótidos, mediante su adición y/o supresión.

El gen RTX C puede inactivarse introduciendo un constructo diana que contiene un marcador seleccionable en el gen cromosómico RTX C, mediante recombinación sitio específica. El constructo diana puede incluir elementos genéticos, tales como unidades de repetición, que facilitan la escisión del gen de resistencia antibiótica, una vez que el constructo diana ha experimentado recombinación homóloga con el cromosoma huésped. Alternativamente un constructo diana que no contiene un marcador seleccionable, puede utilizarse para introducir una deleción en el gen cromosómico RTX C.

El producto del gen RTX A puede expresarse a partir de un gen RTX A cromosómico. El gen RTX A cromosómico puede localizarse en su posición natural en el cromosoma, o puede insertarse en el cromosoma en una posición distinta que la de su localización natural. Además, el producto del gen RTX puede expresarse a partir de un gen RTX A localizado en un elemento extracromosómico tal como un plásmido.

Alternativamente, el producto del gen RTX A puede expresarse completamente a partir de un gen RTX A o genes localizados en elementos extracromosómicos tales como plásmidos.

En una forma de realización preferida, el APP genéticamente modificado es capaz de producir una o más proteínas funcionales que facilitan la secreción de las moléculas de la toxina RTX. El APP modificado genéticamente puede tener genes funcionales RTX D y/o RTX B. En otra forma de realización, el APP modificado genéticamente no puede producir por lo menos una de las proteínas implicadas en la secreción de las moléculas de toxina RTX, o produce por lo menos una proteína inactiva implicada en la secreción de moléculas de la toxina RTX.

El término "vector biológico" se utiliza en su sentido más amplio para incluir un medio biológico apropiado para la expresión de moléculas biológicamente activas. Estos medios biológicos son preferentemente un microorganismo viable, aunque los organismos muertos también utilizarse. El vector biológico puede no ser patogénico o volverse avirulento, o puede darse en cantidades efectivas avirulentas o no patogénicas. El término "moléculas biológicamente activas" incluye moléculas funcionales tales como factores de crecimiento, hormonas, enzimas, antígenos o sus partes antigénicas, citoquinas tales como interleuquinas, interferones y factores de necrosis tumoral. Las moléculas pueden expresarse de modo natural mediante el vector biológico. Alternativamente, las moléculas pueden ser moléculas recombinantes que se expresan transformando el vector biológico con un plásmido que lleva un gen o genes que codifican la molécula biológicamente activa que se expresa entonces; o en las que el plásmido y/o gen o genes y/o sus partes, están integradas en el genoma del huésped, que incluye el cromosoma y/o cualquier elemento extracromosómico que se presenta natural o no naturalmente, en el que el gen o genes o sus partes se expresan.

Se apreciará que un vector biológico de la presente invención puede utilizarse para proporcionar una o más proteínas útiles al animal huésped. Las proteínas proporcionadas de esta forma puede actuar sinérgicamente para obtener una mejora de la reacción en el animal huésped. Por ejemplo, el vector biológico puede producir un antígeno en combinación con una molécula que potencie una respuesta inmunogénica en el animal huésped para el antígeno. La molécula que potencia la respuesta inmunogénica puede ser una citoquina.

También se apreciará que un vector biológico de la presente invención puede utilizarse para proporcionar una vacuna multivalente. El término "vacuna multivalente" se utiliza en su sentido más amplio y comprende un microorganismo capaz de inducir una respuesta inmune para dos o más epítopos antigénicos distintos o que se expresan mediante el microorganismo modificado, en el que los dos o más epítopos son autóctonos para el microorganismo modificado. Más habitualmente, sin embargo, una vacuna multivalente incluye un microorganismo modificado capaz de inducir una respuesta inmune para formas virulentas de dicho microorganismo, así como para antígenos heterólogos que se expresan mediante dichos microorganismo (tal como antígenos recombinantes o los introducidos mediante transducción conjugación o transformación), y que no son autóctonos para el microorganismo. A este respecto, una vacuna multivalente puede dirigirse a dos o más agentes patogénicos. Las vacunas multivalentes preferidas son las capaces de inducir una respuesta inmune contra una toxina RTX y para, por lo menos, un epítopo antigénico de uno o más agentes patogénicos. Los agentes patogénicos pueden seleccionarse de entre patógenos bacterianos tales como Haemophilus spp, Serpulina hyodysenteriae, Pasteurella spp, Bordetella bronchiseptica, Leptospira spp, Streptococus spp, Salmonella spp, Escherichia coli, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae. Alternativamente, los agentes patogénicos pueden seleccionarse de entre patógenos víricos tales como HCV, PRRSV, PRV, TGEV, PPV.

La presente invención proporciona además un procedimiento para producir un Actinobacillus pleuropneumoniae que produce una toxina RTX, en la que dicha toxina RTX está parcial o completamente inactivada, comprendiendo dicho procedimiento suministrar un Actinobacillus pleuropneumoniae; inactivar parcial o completamente un gen RTX activador post-traduccional en el operón de la toxina RTX de dicho Actinobacillus pleuropneumoniae.

La invención, todavía en otro aspecto proporciona un procedimiento para vacunar un animal contra un microorganismo que produce una toxina RTX, incluyendo dicho procedimiento la administración a dicho animal de una cantidad inmunológicamente efectiva de una vacuna según la presente invención.

El procedimiento de vacunación puede utilizarse en el tratamiento de animales productivos tales como cerdos, ovejas, cabras y ganado. El procedimiento de vacunación puede utilizarse asimismo en el tratamiento de animales de compañía tales como caballos, perros y gatos. El procedimiento de vacunación puede también utilizarse en el tratamiento del hombre. En una forma de realización preferida, el procedimiento de vacunación se utiliza en el tratamiento de cerdos. Preferentemente, el procedimiento de vacunación se utiliza en el tratamiento de la pleuroneumonía porcina.

La administración de una vacuna o vector vacunal según la presente invención puede realizarse por cualquier vía apropiada tal como la oral o la parenteral. La administración puede ser mucosa, tal como nasal o vaginal. Alternativamente, la administración puede ser intramuscular, intradérmica, subcutánea o intraperitoneal. La preparación puede ser en forma líquida o seca. La vía de administración escogida puede necesitar asimismo componentes adicionales tales como inhibidores de la proteasa, anti-inflamatorios y similares.

La invención, todavía en otro aspecto, proporciona un procedimiento para vacunar un animal contra un organismo patogénico, incluyendo dicho procedimiento la administración a dicho animal de una cantidad efectiva de un vector vacunal según la presente invención, en el que dicho vector vacunal sintetiza una cantidad inmunológicamente efectiva de un antígeno de dicho organismo patogénico.

Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de una toxina RTX inactiva, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de un microorganismo APP modificado genéticamente según la presente invención y recuperar la toxina inactiva producida por dicho microorganismo. La toxina RTX inactiva producida por este procedimiento puede, por ejemplo, utilizarse como inmunógeno activo en una vacuna, para estimular una respuesta inmune protectora contra una toxina RTX.

Desde el principio al fin de la descripción y de las reivindicaciones de esta memoria, la palabra "comprender" y variaciones de la palabra, tales como "que comprende" y "comprende", no tiene la intención de excluir otros aditivos, componentes, etapas o números enteros.

Para que la invención pueda entenderse más fácilmente se proporcionan los ejemplos siguientes no limitativos.

Descripción breve de las figuras

Figura 1. Mapa enzimático de restricción parcial de plG3 (Figura 1A), un plásmido de 4,2 kb que codifica la resistencia a la estreptomicina, aislado de una cepa australiana de APP. Se encontró que un fragmento PstI de 2,3 kb (plG317; Figura 1B) que era suficiente para codificar la replicación del plásmido y conferir resistencia a la estreptomicina cuando se autoligó, y se transformó en E. coli de APP. El vector plasmídico plG3B, que contiene un sitio de clonación múltiple (MCS) y una porción del gen lac, se construyó introduciendo el fragmento HaeII de plC19R en el único sitio EcoRI de plG317 (Figura 1C). Los sitios enzimáticos únicos de restricción se indican para plG3B (Figura 1C), con la excepción de PstI que corta en el MCS y la estructura plasmídica.

Figura 2. Construcción de un casete de expresión APX1A para utilizar en APP. El casete de expresión APX1A, unida al gen de resistencia a la kanamicina, a partir de pQE-T1K, se aisló como una fragmento enzimático de restricción SalI y se clonó en el único sitio SalI de plG3B. No se indican, en el sitio de clonación múltiple de plG3B, todos los sitios únicos enzimáticos de restricción.

Figura 3. Construcción del casete de expresión APX1 para E. coli. Se obtuvo un gen completo APX1A fusionando material (\blacksquare) derivado de PCR y un clon 100 genómico en un único sitio HindIII. El gen completo se clonó en pQE, en un marco de lectura con la secuencia conductora polyHIS para permitir la purificación de APX1A. El gen de resistencia a la kanamicina de pUC4K, se clonó en un único sitio de restricción XhoI, en el extremo 5' de las secuencias promotoras/reguladoras de pQE-T1. El plásmido resultante, pQE-T1K, contiene el gen APX1A, bajo expresión regulada, unido al gen de resistencia a la kanamicina.

Figura 4. Análisis de transferencia Western de recombinantes Ade APP. Muestras de la cepa Tox^{-} de APP con (Tox^{-} 17-QET1) y sin (HS93Tox-) el casete de expresión APXA, se examinaron mediante transferencia Western junto a las cepas parentales HS93. La transferencia se sondeó con antisuero de conejo, producido en nuestro laboratorio, contra las toxinas APX. A partir de la figura, puede apreciarse que la cepa Tox^{-} no reacciona con el suero anti-APX, mientras que tanto la cepa parental, HS93, como la cepa Tox^{-} que contiene el casete de expresión APXA, producen polipéptidos únicos que reaccionan específicamente con el suero.

Figura 5. Construcción de casetes de recombinación utilizadas para la manipulación del cromosoma APP.

Figura 5A. El gen APX1B se inactivó en el cromosoma APP utilizando el plásmido plG-BKr. Un fragmento de restricción EcoRI, que contenía una porción de los genes APX 1B y D, se aisló del cromosoma APP, y se clonó en plC19R. El gen de la kanamicina se insertó en los sitios BamHI del gen APX1B. El gen APX1B con el gen interno de la kanamicina se subclonó en plG317 como un fragmento EcoRI para formar el casete recombinante plG-3BK^{r}. Los sitios de unión de los oligonucleótidos utilizados para caracterizar el mutante deficitario en la secreción, se indican (B_{5} y B_{3}). Nótese la unión de dos de estos oligonucleótidos por fuera del fragmento EcoRI utilizado en el casete de recombinación.

Figura 5B. El gen APX2C se inactivó en el cromosoma utilizando el fragmento PCR A del vector plasmídico pEP2C^{-}Amp^{r} que contenía el gen APX2C, y se clonó una porción del gen APX2A, insertándose el gen Amp^{r} en un único sitio XbaI en el interior del gen APX2C, El fragmento EcoRI resultante se subclonó en pEP2 para formar el casete suicida pEP2C^{-}Amp^{r}.

Figura 6. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utilizó para caracterizar los mutantes cromosómicos, HS22B^{-}Kan^{r} (Figura 6A) y HS93C^{-}Amp^{r} (Figura 6B). El ADN genómico de cada uno de los mutantes se aisló y utilizó como matriz para PCR. Los oligonucleótidos que expandieron el sitio de inserción (Figura 5), produjeron bandas únicas que correspondían al tamaño predicho para cada una de las cepas parentales y de los mutantes genómicos. Cada uno de los mutantes produjo un producto PCR más voluminoso, que correspondía a un aumento en el tamaño equivalente al gen de resistencia antibiótica insertado, comparado con el de la cepa parental. Los productos PCR obtenidos fueron sometidos a transferencia Southern y sondeados con, bien el gen APX dirigido a inserción, o el gen de resistencia antibiótica, utilizado para la selección.

Figura 7. Mediante transferencia Western junto a la cepa parental HS93, se examinaron las proteínas secretadas (sup), y las proteínas totales del cultivo (son) de la cepa Tox^{-} de APP (HS93C^{-}A^{-}) y de la cepa mutante HS93C^{-}Amp^{r}. La transferencia se sondeó con antisuero de conejo, producido en nuestro laboratorio, contra las toxinas APX. A partir de la figura, puede apreciarse que la cepa Tox^{-} no reacciona con el suero anti-APX, mientras que tanto la cepa parental, HS93, como la cepa recombinante HS93CAmp^{r} producen polipéptidos únicos que son secretados y reaccionan específicamente con el suero.

Figura 8. Casetes basadas en plG para la expresión de proteínas extrañas en APP. Se construyeron una serie de casettes de expresión basadas en pIG para la expresión de proteínas extrañas a partir de APP. Los genes que codifican proteínas extrañas, IL6 (Figura 8A) y CAT (Figura 8B), se clonaron junto con promotores apropiados, en plásmidos basados en pIG, para permitir la expresión en APP.

Figura 9. Expresión de IL6 porcina de APP. La IL6 porcina se clonó en un vector plasmídico apropiado (plG-IL6) para obtener la expresión en E. coli (E. coli/plG3-IL6) y APP (HS93/plG-IL6). Muestras de cultivos nocturnos de APP HS93 (1), APP HS93/plG-IL6 (2), E. coli/plG-IL6 (3 y 4), IL6 purificada (5 y 6), junto con un control E. coli negativo (7), se analizaron mediante transferencia Western utilizando anticuerpos específicos para IL6.

Ejemplo 1 Materiales y métodos Cepas bacterianas y condiciones del crecimiento

Las cepas bacterianas de APP que se utilizan en este estudio fueron proporcionadas amablemente por el Dr. Pat Blackall (Animal research institute, Moorooka, QLD, Aust.). Cepas de APP se hicieron crecer en medio líquido de infusión de corazón cerebro, suplementado con nicotinamida adenina dinucleótido y una concentración final de 10 \mug/ml (Sigma Chemical Co., St. Louis, M.O.) a 37ºC, agitando continuamente. Se preparó agar sangre añadiendo hematíes de caballo desfibrinados estériles al 5% al agar BHI. Se utilizaron antibióticos hasta una concentración final de kanamicina de 25 \mug/ml, de estreptomicina 50 \mug/ml, o de ampicilina de 5 \mug/ml, si no se establece en el texto de manera distinta. La cepa DH5\alpha de E. coli se utilizó a través de este estudio, utilizando técnicas estándar como se da a conocer en Sambrook et al., (1989).

Aislamiento del ADN genómico de APP

Las bacterias presentes en 1 ml de un cultivo nocturno de APP HS25, que se desarrolló en medio BHI suplementado con NAD (10 \mug/ml), se recuperaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se descartó. El sedimento se volvió a suspender en 1 ml de TE(10 mM Tris-HCl pH 8,5/1 mM EDTA), que contenía lisozima (7,5 mg/ml), y se incubó a 37ºC durante 2 horas, después de lo cual, la solución se ajustó a una concentración final de 0,1 M NaCl, SDS al 1% y 2,5 \mug/ml de ProteinasaK, continuando la incubación durante la noche a 50ºC. Al día siguiente, la preparación se ajustó a 0,5 M NaCl y se extrajo dos veces con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (100:99:1, vol/vol/vol), precipitándose entonces el ADN genómico añadiendo 0,6 volúmenes de isopropanol.

Aislamiento y clonación del gen APX1A

La amplificación del gen APX1A se llevó a cabo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las reacciones se realizaron en volúmenes de 50 \mul que comprendían 50 \etag de ADN genómico de APP (HS25), 3 \etag del iniciador oligonucleótido, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl_{2}, 200 mg/ml BSA, 200 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, más 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus, USA). Las reacciones se cubrieron con un volumen idéntico de aceite de parafina y se calentaron hasta 94ºC durante 1 minuto, se enfriaron hasta 55ºC durante 2 minutos y se calentaron hasta 72ºC durante 5 minutos. Este ciclo se repitió 35 veces utilizando un Ciclador Térmico de ADN de Perkin-Elmer-Cetus. Se diseñaron oligonucleótidos específicos basándose en la secuencia publicada del gen APX1 (Frey et al, 1991). La secuencia de los dos oligonucleótidos fue 5'GGA GGA TCC ATG GCT AAC TCT3' y 5'ACC TAC CCG GGA TAG GAT TGC TAT TT3', y se diseñaron para producir un producto PCR con un sitio BamHI en el extremo 5', y un sitio SmaI en el extremo 3', para facilitar la clonación. Los oligonucleótidos se sintetizaron utilizando un Sintetizador de ADN génico Assembler Plus (Pharmacia, Suecia). Los productos de las reacciones PCR, que corresponden al peso molecular predicho del gen APX1, se aislaron de los geles de agarosa mediante lavado génico (BRESATech, Australia), se sometieron a digestión enzimática de restricción con BamHI y SmaI, y se clonaron en los sitios BamHI y SmaI de pUC18 (Yanish-Perron et al, 1985). La confirmación de clones que contenían el gen APX1 se obtuvo mediante secuenciación bicatenaria (resultados no representados).

Aislamiento del gen APX1A del cromosoma de APP

Basándose en datos publicados, los 3'2 kb del gen APX1a se codifica en un fragmento HindIII de aproximadamente 5 kb (Frey et al., 1993). Para aislar este fragmento, el ADN genómico APP HS25 se sometió a digestión para finalizar con la enzima de restricción HindIII, fraccionándose en distintos tamaños, en un gel de agarosa. El ADN digerido se visualizó mediante tinción con bromuro de etidio y la región a la que correspondían aproximadamente 5 kb, tal como se estimó utilizando los pesos moleculares estándares del ADN (Progen, Australia), se extrajo y el ADN se purificó, utilizando el lavado génico (BRESAtech, Australia). El ADN genómico seleccionado por el tamaño se clonó en pUC18 y se transformó en E. coli. La biblioteca resultante de E. coli se sondeó con el fragmento PCR APX1A y se seleccionaron los clones positivos. Los digestos enzimáticos de restricción, se utilizaron para confirmar la autenticidad de los clones identificados por hibridización.

Transformación de APP con vectores plasmídicos

La preparación del APP electrocompetente, y las condiciones para la introducción del ADN plasmídico en estas células mediante electroporación (cubetas de 0,2 cm, 400 SL, 1,25 kv y 25 \muF), fueron tal como se ha descrito por Frey (1992), con la excepción de que alícuotas de 200 \mul de células competentes, se utilizaron para la electroporación. El ADN plasmídico se aisló a partir de cultivos nocturnos de APP, se desarrollaron bajo selección antibiótica, utilizando minipreparaciones mágicas Promega).

Aislamiento de regiones del cromosoma de APP utilizando PCR

La amplificación de regiones del cromosoma APP se llevó a cabo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). las reacciones se llevaron a cabo en volúmenes de 50 \mul, que comprendían 50 \etag de ADN genómico, 3 \etag del iniciador oligonucleótido, 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 2,5 mM MgCl_{2}, 2200 mg/ml BSA, 200 mM de cada dATP, dCTP, dGTP y dTTP, más 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Perkin Elmer Cetus, USA). La preparación del ADN genómico de APP se realizó tal como se describe en Prideaux et al (1995), utilizando SDS y proteinasaK. Las reacciones se cubrieron con un volumen idéntico de aceite de parafina y se calentaron hasta 94ºC durante 1 minuto, se enfriaron hasta 55ºC durante 2 minutos y se calentaron hasta 72ºC durante 5 minutos. Se sintetizaron oligonucleótidos específicos utilizando un Sintetizador de ADN Assembler Plus (Pharmacia, Suecia). Los productos de las reacciones PCR se resolvieron sobre geles de agarosa y se visualizaron mediante tinción con bromuro de etidio.

Mutagénesis del cromosoma de APP en el interior del gen A PX1B

El plásmido pIG3-BK^{r} de recombinación, diseñado para la inactivación del gen APX1B, se sometió a electroporación en APP HS22, tal como se describe por Prideaux et al. (1997), y los transformantes se seleccionaron sobre agar BHI/NAD que contenía kanamicina. Los transformantes APP que contenían el plásmido de recombinación, se sometieron entonces a electroporación con pIG3-Amp^{r}, se aislaron del APP, seleccionándose los transformantes sobre placas BHI/NAD que contenían kanamicina y ampicilina. La presencia de ambos plásmidos se confirmó aislando otra vez los plásmidos, utilizando protocolos de minipreparaciones mágicas (Promega), y llevando a cabo análisis de restricción enzimática. Un transformante que contenía ambos plásmidos se hizo crecer durante la noche con agitación en BHI/NAD que contenía ampicilina y kanamicina. El cultivo se diluyó 1:100 en 10 ml de BHI/NAD que contenía ampicilina (50 \mug/ml), agitándose durante la noche. El procedimiento de subcultivo se repitió un total de 6 veces, después de lo cual se sembraron en placas diluciones del cultivo sobre placas agar sangre BHI/NAD que contenían kanamicina. Las colonias que no produjeron zonas de hemólisis sobre las placas de agar sangre se identificaron y aislaron para una ulterior caracterización.

Análisis de transferencia Southern de productos PCR

Los productos de las reacciones PCR se resolvieron en geles de agarosa al 1%, junto con marcadores de peso molecular del ADN (Progen, Australia), para permitir llevar a cabo estimaciones del tamaño, después de tinción con bromuro de etidio. El ADN fraccionado se transfirió a membranas Hybond-N (Amersham), utilizando un sistema de transferencia de vacío (Pharmacia) según las instrucciones de los fabricantes. Las membranas se hibridizaron por la noche a 65ºC en tampón que contenía 5xSSPE (1xSSPE: 0,18M NaCl, 10 mM fosfato sódico, 1 mM EDTA, pH 7,7), 5x solución de Denhardt (1x de Denhardt: BSA al 0,02%, Ficoll al 0,02%, y polivinilpirrolidona al 0,02%), y SDS al 0,5%. Las sondas para la hibridización se marcaron utilizando el sistema de iniciadores hexaméricos al azar (BRESAtech, Adelaida, Australia), según las instrucciones del fabricante. Después de la hibridización, las membranas se lavaron hasta alcanzar una rigurosidad final de 0,1 SDS/0,1xSSPE a 65ºC durante 10 minutos, exponiéndose a una película de rayos X (Fuji RX).

Producción de antisueros

Los cultivos nocturnos de APP HS25 se diluyeron 1 en 20 y se hicieron crecer a 37ºC con agitación, hasta que se alcanzó una OD_{600} de 0,8. En este momento, los cultivos se centrifugaron a 12.000 rpm durante 12 minutos a 4ºC, purificándose las proteínas del sobrenadante utilizando el procedimiento de Fedorka-Cray et al (1990). Se administró a los conejos un total de tres dosis de proteína purificada (100 \mug) a intervalos de dos semanas, la primera de las cuales se realizó en adyuvante completo de Freund, con vacunaciones subsiguientes en adyuvante incompleto de Freund. Se recuperó el suero para utilizar dos semanas después de la revacunación final.

Análisis de transferencia Western

Se llevó a cabo un análisis de transferencia Western (inmunotransferencia) mediante el procedimiento de Sambrook et al (1989). El suero de conejos producido contra las proteínas del sobrenadante del cultivo de APP HS25, se utilizó para la detección de las proteínas APX a una dilución 1:50. El suero de conejos se preabsorbió contra APP Tox^{-} para eliminar las reacciones cruzadas y los anticuerpos no APX antes de la utilización. El conjugado, que se utilizó a una dilución de 1:1000, fue antisuero Ig de oveja anticonejo conjugado con HRP aislado por afinidad (Silenus) con tetrametilbencidina (McKim-Breschkin, 1990) como sustrato. Las muestras bacterianas para el análisis de transferencia Western se prepararon diluyendo (en una proporción 1:20) cultivos durante la noche en el medio de crecimiento apropiado, e incubando a 37ºC con agitación vigorosa hasta que se alcanzó una OD_{600} de 0,8. En este momento, las muestras que contenían 20 \mul del cultivo total, se analizaron mediante SDS-PAGE, y las proteínas se transfirieron a nitrocelulosa
(Bio-Rad), utilizando una Célula de Transferencia BioRad, tal como se describe en las especificaciones del fabricante.

Vacunación y estimulación de los ratones

Ratones Balb-C hembras de seis semanas de edad, obtenidas del Walter and Elisa Hall Institute of Medical Research (Parkville, Vic), se mantuvieron en la Division CSIRO of Animal Health (Parkville, Vic, Australia), bajo instalaciones PC2 con agua y alimentos ad libitum. A los ratones se les inyectó intraperitonealmente (IP) con 200 \mul de la preparación APP en los días 0 y 14, y recibieron una estimulación IP en el día 28. Los ratones de control recibieron 200 \mul del caldo de cultivo BHI, por vía IP. Se registró el número de ratones supervivientes durante 24 horas después de la estimulación, y se consideró que se habían protegido bien de la estimulación, o recibieron una dosis subletal.

Ensayo de anticuerpos

A todos los ratones se les tomaron muestras de sangre en la cola antes de la vacunación y antes de la revacunación, o de la estimulación. Las respuestas de los anticuerpos a APX 1A o 2A, se midieron mediante un ensayo inmunoenzimático (ELISA) con 0,5 ug de APX por pocillo purificado por poly-His, tal como se describe por Prideaux et al,. (1995). Los títulos se expresaron como la dilución máxima que proporcionó densidades ópticas superiores a las de los sueros de los ratones no tratados.

Ejemplo 2 Desarrollo de un vector plasmídico para APP

Una seguimiento de 14 cepas de APP (proporcionado por el Dr. Pat Blackall; Animal Research Institute, Moorooka, QLD, Aust.) identificó dos cepas que albergaban plásmidos que podían detectarse utilizando el aislamiento plasmídico mediante minipreparaciones mágicas (Promega) combinado con la detección mediante gel de agarosa/bromuro de etidio (resultados no representados). Se descubrió que una de estas cepas, HS205, era resistente a la estreptomicina, y se descubrió que el ADN plasmídico aislado de esta bacteria confería resistencia a la estreptomicina tanto para E. coli como para APP, cuando se introdujo mediante electroporación.

El análisis de restricción enzimática del ADN plasmídico aislado de un E. coli que se había transformado con el ADN plasmídico aislado de HS205 y se había seleccionado sobre estreptomicina, identificó un plásmido de 4,2 kb (plG3) que codifica su propia replicación y la resistencia a la estreptomicina (Figura 1A). Se generó para plG3 un mapa enzimático de restricción y mediante un procedimiento de digestión enzimática de restricción y de unión, se descubrió que cuando un Pstl de 2,3 kb o un subfragmento de plG3 se autoligó (plG317), y se transformó en E. coli, los transformantes resultantes eran resistentes a la estreptomicina (Figura 1B).

Para aumentar la versatilidad de este plásmido para transportar ADN extraño a tanto E. coli como APP, el fragmento Haell de 450 pares de bases de plC19R, que contenía el sitio de clonación múltiple y el gen lac (Marsh et al., 1984), se subclonó en el único sitio EcoRI de plG317, localizado 300 pares de bases corriente abajo del sitio Pstl (plG3B; Figura 1B). REl plásmido resultante, plG3B (Figura 1C), posee un sitio de clonación múltiple apropiado para la inserción del ADN extraño en el plásmido, y un gen lac para permitir la selección rápida de plásmidos que transporten ADN extraño basados en la selección azul/blanco en presencia de X-gal en E. coli.

Ejemplo 3 Expresión del gen APX1A en E. Coli

Para minimizar cualesquiera errores que pudieran haberse introducido en el marco abierto de lectura (ORF) de APX1A durante a PCR, y para permitir la alineación correcta de ORF en el interior del vector de expresión, el fragmento genómico se utilizó en conjunción con el fragmento PCR para construir el plásmido de expresión pQE-T1, tal como se esquematiza en la Figura 2. Esta estrategia permitió que APX1A ORF se insertara en pQE30 (QIAGEN Inc., Chatsworth, CA, USA) en marco con la señal de purificación poly-His, y que estuviera formado por una mayoría de ADN genómico.

La expresión de APX1A a partir de pQE-T1 estuvo bajo el control de un elemento promotor/operador regulable, formado por el promotor T5 del fago de E. coli y dos secuencias operadoras lac. La expresión óptima de APX1A a partir de pQE-Tl se alcanzó mediante el crecimiento de un cultivo nocturno de E. coli que contenía el vector de expresión, en presencia de ampercilina (100 \mug/ml). Al día siguiente, se llevó a cabo una dilución 1:50 del cultivo, incubándose a 37ºC con agitación vigorosa, hasta que se alcanzó una OD_{600} de 0,8. En este momento, la inducción de la toxina se alcanzó añadiendo IPTG a una concentración final de 2 mM, desarrollando el cultivo durante otras 5 horas, después de lo cual se recuperó E. coli centrifugando a 8.000 rpm durante 12 minutos.

La purificación de APX1A se alcanzó utilizando cromatografía de afinidad del quelato Ni inmovilizado bajo condiciones desnaturalizantes, como por las instrucciones del fabricante (QIAGEN Inc,. California, USA). Este sistema aprovecha la señalización de 6-His que se encuentra en las proteínas expresadas utilizando el sistema pQE.

Ejemplo 4 Construcción de un casete de expresión de APX1A para APP

Para facilitar la construcción de las casetes de expresión APX1 basadas en pIG, se aisló de pUC4K el gen de resistencia a la kanamicina (Pharmacia) y se transportó a través de plC20R antes de clonarse en pQE-T1 tal como se esquematiza en la Figura 3. El plásmido resultante, pQET1K, contenía el gen de resistencia a la kanamicina y el gen APX1A, unido al promotor T5, franqueados ambos por los sitios SalI enzimáticos de restricción. Se aisló el fragmento SalI y se unió con plG3B, que se había digerido previamente con SalI, y se transformó en E. coli. El clon deseado se identificó seleccionando transformantes que eran resistentes a la kanamicina y producían colonias blancas en presencia de X-Gal. El ADN plasmídico se aisló y el análisis enzimático de restricción se utilizó para confirmar el perfil predicho de plG3B-TlK (Figura 3).

Ejemplo 5 Construcción de la cepa vacunal APP

Durante un procedimiento de mutagénesis sitio específica del cromosoma HS93 APP (serovar 7: sólo producción de APX2), diseñado para suprimir una pequeña porción del gen APX2C, se obtuvo un aislamiento que fue incapaz de producir una zona de hemólisis en placas de agar sangre. Una caracterización posterior de este aislamiento (APP Tox^{-}) mostró que había perdido una gran parte del cromosoma que rodeaba al sitio deseado de deleción. La cepa resultante APP Tox^{-} no contiene genes estructurales APX o activantes, aunque produce todavía las proteínas necesarias requeridas para la secreción de APX, pues estos genes se localizan en otra parte en el cromosoma de APP.

La cepa APP Tox^{-} fue transformada con plG3B-TlK, tal como se describe en Materiales y Métodos, utilizando la selección de kanamicina. El ADN plasmídico se aisló de las colonias resistentes a la kanamicina y se analizó mediante digestión emzimática de restricción para confirmar los perfiles predichos de plG3B-TlK.

Ejemplo 6 Caracterización de la cepa vacunal de APP

Cultivos nocturnos de la cepa APP Tox^{-} que contenían plG3 B-TlK, así como la cepa APP Tox^{-} y HS93, se examinaron mediante transferencia Western utilizando antisueros producidos en conejos contra las proteínas secretadas de HS25 (es decir, APX1 y 2). A partir de la transferencia Western (Figura 4), puede apreciarse que la cepa APP Tox^{-} no se unió a ningún anticuerpo presente en el suero, mientras que tanto el tipo salvaje HS93 como APP Tox^{-}/plG3B-TlK, mostraron ambos una banda única. La banda detectada con Tox^{-} plG3B-TlK es mayor que la apreciada con su cepa parenteral HS93, ya que la cepa parenteral expresa APX2 (PM aparente de 103-105 kDA), mientras que Tox/p163B-TIK produce APX1 (Pm aparente de 105-110 kDa).

Ejemplo 7 Comparación de la virulencia de las cepas de APP en ratones

Cultivos nocturnos de APP HS93, HS25 y Tox^{-} se hicieron crecer con agitación vigorosa a 37ºC en caldo de cultivo BHI suplementado con NAD (10 \mug/ml). Al día siguiente, se llevó a cabo una dilución 1:20 de los cultivos, incubándose los nuevos cultivos hasta que se alcanzó una OD_{600} de 0,8, siendo el contaje viable de APP, con este valor de la OD_{600}, de 1x10^{9} por ml (datos no representados). Se prepararon varias diluciones del cultivo en medio líquido de cultivo BHI, suplementado con NAD (10 \mug/ml) y se administraron por vía intraperitoneal a ratones 200 \mul. Después de la estimulación, se observaron los animales, y se registraron las muertes totales después de 24 horas. Bajo estas condiciones, ningún ratón sucumbió a la infección por APP después de este período, presentándose los resultados obtenidos en la Tabla 1. Una comparación de las muertes obtenidas con cada serovar indicará que HS25, que pertenece al serovar 1 y produce tanto APX1 como 2, es la cepa de APP más virulenta (100% de muertes en 1x10^{7}), seguido por HS93 (100% de muertes en 2x10^{8}), que pertenece al serovar 7 y produce sólo APX 2, mientras que la cepa Tox^{-} (serovar 7) no pudo matar a ningún ratón, incluso con las dosis más altas utilizadas. Este resultado está de acuerdo con observaciones de brotes de pleuroneumonía en cerdos, en los que los brotes más graves se asocian con serovares APP que producen APX1 y 2.

TABLA 1 Virulencia de las cepas APP en ratones

	Porcentaje de Muertes
Nivel de estimulación (x10^{6})	HS25	HS93	Tox^{-}
200		100	0
20	100	15
10	100	0
4	33
2	0

Tabla 1. A los ratones se les inyectó con 200 \mul de suspensión bacteriana que contenía niveles varios de cepas APP, HS25, HS93 o la cepa Tox^{-}. Las muertes se registraron después de 24 horas y se expresan como porcentaje de población total.

Ejemplo 8 Protección de los ratones de la estimulación letal de APP

Se prepararon cultivos nocturnos de HS93 y Tox^{-} y al día siguiente se llevó a cabo una dilución 1 en 20 y se realizó el crecimiento hasta alcanzar una OD_{600} de 0,8. Las diluciones de cada bacteria se realizaron de forma que una vacunación de 200 \mul contenía bien 2x10^{7} HS93, o 2x10^{8} Tox^{-}, seleccionándose estos valores para maximizar la dosis de vacunación, pero manteniendo todavía una estimulación subletal, recibiendo los ratones de control 200 \mul de caldo de cultivo BHI. Los ratones se vacunaron vía intraperitoneal en los días 0 y 14 y se estimularon con bien 1x10^{8} HS25 o 5x108 HS93 en el día 20, registrándose las muertes después de 24 horas (Tabla 2). De estos resultados puede apreciarse que tanto HS93 como Tox^{-} ofrecieron una protección completa contra la estimulación homóloga, mientras que HS93 ofreció alguna protección contra la estimulación heteróloga. La cepa Tox^{-} no ofreció protección contra la estimulación heteróloga, que se observa asimismo con las vacunas inactivadas basadas en la bacterina, indicando un papel para las toxinas APX como antígenos protectores de los serotipos de cruzamiento.

Para evaluar la capacidad de APP Tox^{-} para expresar la forma inactivada de APX1 a partir de un plásmido para proteger a los ratones contra una estimulación heteróloga letal de APP, se vacunaron los ratones con APP Tox^{-} o APP Tox^{-}/plG3B-TlK según el siguiente esquema. En el día 1, se sangraron los ratones en la vena y se vacunaron intraperitonealmente entonces con 200 \mul de BHI que contenía 2x10^{8} Tox^{-} o Tox^{-}/plG3B-TlK. El procedimiento se repitió en el día 14 y, en el día 28, los ratones se sangraron en la cola, y se estimularon con 5x10^{8,} o 1x10^{8}, APP HS25. Los sueros que se recuperaron de los ratones, se utilizaron en un ELISA para medir los anticuerpos dirigidos contra APX1, tal como se esquematiza en Materiales y Métodos. El suero de control se recuperó de los ratones que habían recibido dos dosis de HS93 (2x10^{8}) o HS25 (2x10^{6}) vía intraperitoneal a intervalos de dos semanas.

Los resultados ELISA que se presentan en la Tabla 3 indican que una dosis única de Tox^{-}/plG3B-T1K es suficiente para producir una buena respuesta de los anticuerpos en los ratones, equivalente a la obtenida después de dos dosis de HS25, a un nivel reducido. La respuesta anti-APX1 aumentó considerablemente después de una segunda vacunación con Tox^{-}/plG3B-TlK, mientras que vacunaciones múltiples con HS93 o Tox^{-} no produjeron valores de anticuerpos mencionados anteriormente. La incapacidad para detectar los anticuerpos que reconocieron a APX1 después de múltiples vacunaciones con HS93, que produce APX2, indicaría una incapacidad para los anticuerpos dirigidos contra APX2 de reaccionar cruzadamente con APX1, contrastando esto con la capacidad de HS93 que expresa APX2 para ofrecer un grado de protección contra la estimulación heteróloga y puede reflejar la diferencia entre Ag expresado por E. coli y derivado de APP.

Los ratones estimulados con 10 ID_{50} de HS25 no mostraron protección después de vacunación con Tox^{-}, mientras que los vacunados con Tox^{-} pIG3B-T1K demostraron una protección del 60%. Cuando el nivel de estimulación se redujo a 5 ID_{50} de HS25, no se observó otra vez protección con Tox^{-} solo, mientras que el gen APX 1A que expresa Tox^{-} de un plásmido (Tox^{-}/plG3B-TlK) demostró una protección del 100% (Tabla 4).

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TABLA 2 Vacunación de ratones con APP Tox^{-}

	Porcentaje de Muertes
Cepa de estimulación	Control	Tox^{-}	HS93
HS93 (2 x 10^{8})	100	0	0
HS25 (1 x 10^{8})	100	100	30

Tabla 2. Los ratones se vacunaron dos veces con 2x10^{8} APP Tox^{-} o con 2x10^{7} de la cepa parental HS93, intraperitonealmente, a intervalos de dos semanas, estimulándolas dos semanas después con HS93 (homóloga) o HS25 (heteróloga). Los ratones de control recibieron 200 \mul de caldo de cultivo BHI. Las muertes que siguieron a la estimulación se registraron como porcentaje de ratones dentro de cada grupo que murió dentro de las 24 horas.

TABLA 3 Inducción de anticuerpos específicos de APX1A en los ratones vacunados

Inoculación	Título de anticuerpos APX1A
Vacunación única
Tox^{-}	3.000
Tox^{-}/plG3B-T1K	25.000
Dos vacunaciones
Tox^{-}	3.000
Tox^{-}/plG3B-T1K	>200.000
HS93	3.000
HS25	25.000

Tabla 3. Los ratones se vacunaron dos veces con 2x10^{8} Tox^{-}, o con Tox^{-}/plG3B-T1K por vía intraperitoneal a intervalos de dos semanas, y se recuperó el suero antes de y dos semanas después de la revacunación. Los ratones de control recibieron dos dosis de 2x10^{7} HS93 ó 2x10^{6} HS25. Los anticuerpos específicos de APX1A se midieron en un ELISA, y el título se expresó como el recíproco de la última dilución que proporcionó valores de absorbancia mayores que los anteriores.

TABLA 4 Protección de los ratones contra la estimulación heteróloga con APP, después de vacunación con Tox^{-}/plG3B-T1K

	Cepa vacunal
Estimulación HS25	Controles	Tox^{-}	Tox^{-}/plG38-T1K
10 ID_{50}% protección	0	0	60
5 ID_{50}% protección	0	0	100

Tabla 4. Los ratones se vacunaron intraperitonealmente, dos veces en intervalos de dos semanas, con la cepa Tox^{-} de APP con y sin el plásmido plG3B-T1K, que codifica la expresión de la proteína APX1A. Los ratones de control recibieron dos dosis del caldo de cultivo BHI. Dos semanas después de la vacunación final, se suministró a los ratones una estimulación heteróloga de APP HS25.

Ejemplo 9 Mutagénesis del gen APX1B Construcción de los plásmidos de recombinación

Un casete de recombinación, diseñado para permitir la mutagénesis sitio específica del gen APX1B, se construyó clonando un fragmento EcoRI de 2,4 kb que transporta el gen APXB (Frey et al 1993) en plCl9R (Marsh et al, 1984). Un fragmento BamHI de 1,2 kb que transporta el gen de resistencia a la kanamicina (Kan^{r}) de pUC4K (Pharmacia) se clonó en el gen APX1B que se había suprimido con BamHI (Figura 5A). El gen APX1B, con el gen interno de Kan^{r} se aisló como un fragmento EcoRI y se clonó en el sitio EcoRI del vector plasmídico de APP, plG317 (Prideaux et al, 1995) para formar el casete de recombinación plG3-BK^{r}.

El plásmido plG3-AMP^{r} se utilizó en la segregación plasmídica para facilitar la recombinación entre plG3-BK^{r} y el cromosoma APP. Este plásmido se construyó clonando el gen de resistencia a la ampicilina (Amp^{r}) (Murphy et al) en el sitio de clonación múltiple de plG317.

La mutagénesis del gen APX1B utilizó el casete de recombinación plG3-BK^{r,} que comprendía un fragmento EcoRI del gen APX1B interrumpido por un marcador del gen Kan^{r}, en el vector plasmídico de APP, plG317 (Figura 5A). El APP HS22 de tipo salvaje (serovar: APX1 y APX2) se transformó con plG3-BK^{r} y subsiguientemente con un derivado resistente a la ampicilina de plG317 (plG3-Amp^{r}). Las células transformadas con ambos plásmidos se seleccionaron en medios que contenían tanto ampicilina como la kanamicina. Para mantener plG3-Amp^{r} y promover la pérdida de plG3-BKr mediante la segregación plasmídica, las células que contenían ambos plásmidos se hicieron pasar por medios que contenían sólo ampicilina. Para identificar las células en las que había tenido lugar la recombinación entre plG3-BK^{r} y el cromosoma APP, los cultivos se sembraron en placas de agar sangre BHI/NAD que contenían kanamicina. Cualquier colonia bacteriana que no produjo zonas de hemólisis en las placas de agar sangre, se parcheó sobre placas de agar sangre recién preparadas que contenían kanamicina. Se identificó una sola colonia (HS22B^{-})que era resistente a la kanamicina y no producía una zona de hemólisis. Esta colonia creció en un caldo de cultivo BHI/NAD que contenía kanamicina, preparándose el ADN genómico tal como se ha descrito anteriormente (Prideaux et al., 1997).

El ADN genómico se aisló de HS22B^{-} y de la cepa huésped HS22 que contenía plG3-BKr, y se examinó mediante PCR utilizando oligonucleótidos B5' :GCATTTTGGAACAAG: B3': CGGTGATCAAATAGC) que fueron diseñados para hibridizarse al genoma de APP por fuera de la región contenida en el interior del casete de recombinación (Figura 5A). Los productos de la reacción PCR se analizaron mediante análisis de transferencia Southern, tal como se describe en Materiales y Métodos, utilizando los genes Kan^{r} o APX1B aislados como sondas (Figura 6A). En la Figura 6A puede apreciarse que la región del cromosoma APP que contiene el gen APX1B, amplificada mediante PCR, es aproximadamente 1,2 kb más voluminosa (equivalente al tamaño del gen Kan^{r}) en el recombinante HS22B^{-} no hemolítico/resistente a la kanamicina que la cepa parental HS22. El análisis de los productos PCR mediante transferencia Southern confirmó que los productos amplificados representaban la región del cromosoma de APP que contenía al gen APX1B, y en el caso de HS22B^{-} esta región agrandada, se hibridizaba asimismo específicamente al gen Kan^{r}. Estos resultados confirman que la recombinación homóloga ha tenido lugar entre el cromosoma APP y plG3-BK^{r} dando lugar a la transferencia sitio específica del gen Kan' al cromosoma de APP.

Ejemplo 10 Mutagénesis del gen APX2C

El plásmido pEP-C^{-}Amp^{r} (Figura 5B) se construyó para utilizar en la mutagénesis sitio específica del gen APP APX2C. Un fragmento de 3,4 kb que contiene el gen APX2C, las primeras 700 pares de bases del gen APX2A, así como la región inmediatamente 5' del operón APX2, se aisló utilizando PCR, sintetizándose los oligos utilizando un Sintetizador de ADN génico Assembler Plus de Pharmacia (5'CGCACCATGGTCGGGC, 3'ACGTGATCGACAATC), basado en la secuencia publicada (Frey et al, 1991). El fragmento PCR se clonó en el vector lanzadera pEP2 de Mycobacterium/E. coli (Radford y Hodgson, 1991). El plásmido resultante, pEP2=CA, contiene un único sitio de restricción XbaI localizado aproximadamente a medio camino en el marco de lectura abierto de APXC, en el cual se insertó el gen de resistencia a la ampicilina, para generar el plásmido de recombinación pEP-C^{-}Amp^{r}.

La mutagénesis sitio específica del gen APX2C utilizó el casete de recombinación pEP-C^{-}Amp^{r} (Figura 5B), basándose este casete en el vector lanzadera pEP2 de Corynebacterium-E. coli. Distintos intentos en nuestro laboratorio habían no habían tenido éxito para transformar APP con pEP2, llevándonos a la conclusión de que APP constituye un huésped no permisivo para este vector plasmídico, y es por tanto un vector suicida apropiado para utilizar en APP. El pEP-C^{-}Amp^{r} ADN purificado mediante cloruro de cesio se aisló de E. coli y se linearizó con ClaI. Después de la digestión, el ADN se purificó mediante extracción feno/clorofórmica y se precipitó con etanol. Un total de 3 \mug del ADN linearizado se sometieron a electroporación en APP HS93 (serovar 7: APX2) utilizando el protocolo descrito previamente por Prideaux et al (1997), sembrándose los productos de la electroporación en placas de agar sangre BHI/NAD que contenían ampicilina a una concentración de 1 \mug/ml. Se aisló una única colonia que fue tanto resistente a la ampicilina como incapaz de producir una zona de hemólisis en las placas de agar sangre.

Se extrajo el ADN genómico del mutante HS93C^{-}A^{r} resistente a la no zonación/ampicilina y de la cepa parental HS93. Se utilizó la reacción en cadena de la polimerasa para examinar la región del cromosoma de APP que contenía el gen APX2C, utilizando oligonucleótidos que se unieron al operón de APX2 (5'TACAGAACGTTGGTA, 3'ACGTGATCGACAATC) en las localizaciones que se indican en la Figura 5B. Los productos de las reacciones PCR se caracterizaron mediante la hibridización de transferencia Southern, tal como se describe en Materiales y Métodos, utilizando los genes Amp^{r} o APX2C como sondas (Figura 6b). Los resultados que se presentan en la Figura 6B muestran que el mutante HS93C^{-}A^{r} produce un producto PCR que es aproximadamente 1,5 kb (el tamaño del gen Amp^{r}) más grande que la cepa HS93 parental. Los productos PCR de ambas bacterias se hibridizaron con el gen APX2C, pero sólo el de la cepa mutante se hibridizó con el gen Amp^{r}. Estos resultados indicaron que tuvo lugar la recombinación homóloga entre el cromosoma de APP HS93 y el vector del plásmido suicida pEP-C^{-}A^{r}, dando lugar a la transferencia del gen Amp^{r} al cromosoma APP de una forma sitio específica.

Los cultivos logarítmicos de cada una de las cepas mutantes, y sus cepas parentales, se examinaron mediante transferencia Western utilizando antisueros que se produjeron en conejos contra las proteínas secretadas de APP HS25 (es decir, los serovares: APX1 y 2), tal como se describe en Materiales y Métodos.

Ejemplo 11 Comparación de la virulencia de las cepas APP en ratones

Cultivos nocturnos de APP HS93, HS22 y de las dos cepas mutantes se hicieron crecer durante la noche con agitación vigorosa a 37ºC en un caldo de cultivo BHI suplementado con NAD (10 \mug/ml). Al día siguiente, se llevó a cabo una dilución 1:20 de los cultivos, incubándose los nuevos cultivos hasta que se alcanzó una OD_{600} de 0,8, siendo el contaje viable de APP, con esta densidad óptica, de 1x10^{9} c.f.u./ml (datos no representados). Se prepararon varias diluciones de los cultivos en caldo BHI y se administraron intraperitonealmente 200 \mul a los ratones de 6 semanas de edad. Se observaron los animales durante las 24 horas siguientes, después de lo cual se registró el porcentaje de muertes. Bajo nuestras condiciones, ningún ratón sucumbió a la infección por APP después de este período de tiempo, presentándose los resultados obtenidos en la Tabla 5.

TABLA 5 Virulencia de las cepas mutantes y parentales de APP en ratones

	Porcentaje de muertes
Nivel de estimulación (x10^{6})	HS22	HS93	Tox^{-}	HS93 C^{-}/Amp^{r}	HS22 B^{-}/Kan^{r}
200		100	0	0	0
40	100
20		15
10	100	0
4	100

A los ratones se les inoculó intraperitonealmente con varios niveles de la cepa parental APP, y con las cepas mutantes. Los ratones que no sucumbieron a la infección en el plazo de 24 horas, se consideró que habían recibido una dosis subletal. Los resultados se registran como porcentaje de la población que no sucumbió a la infección.

Ejemplo 12 Protección de los cerdos contra la estimulación heteróloga con APP

Se presangraron cerdos de seis semanas de edad para rastrear la existencia contra APP HS93 (serovar 7) y APX2 antes de que se incorporara a los animales a los grupos experimentales. Nueve cerdos de 6 semanas de edad recibieron 1x10^{9} c.f.u. de APP. HS93C^{-}A^{r}, en 1 ml de medio de crecimiento, vía intranasal de inoculación aerosólica en el día 0. La vacuna se preparó inoculando 10 ml de BHI/NAD (10 \mug/ml) con una única colonia de HS93C^{-}A^{r} y creciendo con agitación vigorosa a 37ºC hasta alcanzar una OD_{600} de 0,8. El esquema de vacunación se repitió en el día 14 como en el día 0.

En el día 28 los cerdos se distribuyeron en grupos(tal como se esquematiza a continuación) y se estimularon con 2x10^{9} APP HS25 (serovar 1), en 2 ml de medio de crecimiento, a través de la vía intranasal, o se les administró 2 ml de caldo de cultivo BHI de una forma similar. La cepa de estimulación se preparó inoculando una única colonia de HS25 en caldo de cultivo BHI/NAD ((10 \mug/ml) y que creció hasta alcanzar una OD_{600} de 0,8. En cuyo momento el contaje viable fue de 1 x 10^{9} c.f.u./ml.

El número de cerdos en cada grupo y el perfil de vacunación/estimulación fueron:

Grupo 1
No vacunados y no estimulados	3 cerdos
Grupo 2
vacunados y no estimulados	3 cerdos
Grupo 3
no vacunados y estimulados	6 cerdos
Grupo 4
vacunados y estimulados	6 cerdos

El número y gravedad de las lesiones pulmonares presentes en cada grupo después de la autopsia, 5 días después de la estimulación, se dan a conocer en la tabla 6. Estos resultados demuestran claramente que la vacunación con HS93C^{-}A^{r} protegió a los animales de la estimulación con la cepa heteróloga de APP, HS25. Los tres cerdos que ni se vacunaron ni fueron estimulados, no presentaron lesiones pulmonares detectables en la autopsia, indicando que las lesiones en estos órganos que se encontraban en otros grupos de animales, al llevar a cabo la autopsia, provenían de su tratamiento después del comienzo del ensayo vacunal. Los tres cerdos que fueron vacunados y no estimulados no mostraron tampoco lesiones después de la autopsia, indicando que la cepa vacunal no induce lesiones pulmonares en los animales, que son evidentes a las 2 semanas después de la inoculación. Previamente se les administraron cepas deficitarias en toxinas de APP a los cerdos, a dosis similares a las de los animales estimulados en este experimento, no observándose lesiones en el día 5 en los animales a los que se les practicó la autopsia. Los seis cerdos no vacunados que fueron estimulados con HS25, mostraron todos numerosas lesiones pulmonares después de la autopsia, indicando que el nivel de estimulación empleado en este experimento era suficiente para inducir lesiones en los animales desprotegidos. En contraste con los seis controles no vacunados, de los seis cerdos que habían sido vacunados con HS93C^{-}A^{r} antes de la estimulación, sólo uno presentó algún síntoma de lesiones después de la autopsia. Éste fue en forma de una única adhesión, en un animal, entre el pulmón y la parrilla torácica, y después de un examen más detallado, esta adhesión pareció ser más antigua que los cinco días transcurridos desde la estimulación. La bacteria se aisló de esta adhesión y no se descubrió que fuera APP (es decir, no necesitó NAD para crecer). Sin tener en cuenta si esta lesión se originó a partir de la estimulación con APP HS25, este resultado demuestra claramente el potencial de HS93C^{-}A^{r} para proteger a los cerdos contra una estimulación heteróloga del APP virulento.

Discusión

La cepa HS93 serovar 7 de APP se modificó mediante mutagénesis sitio específica para inactivar el gen APXC, mediante la inserción del gen Amp^{r}, sin interrumpir la expresión de los genes APX A, B o D, produciendo la cepa vacunal HS93C^{-}A^{r}. La evaluación de la cepa vacunal en los ratones mostró que era de una virulencia reducida, comparada con la cepa parental HS93 (Tabla 5). La única evaluación verdadera de una vacuna es su capacidad para proteger contra la enfermedad en las especies diana. Para demostrar esto, vacunamos a los cerdos con BS93C^{-}A^{r} por vía intranasal y proporcionamos una estimulación de serovares cruzados. La cepa estimuladora utilizada fue HS25, que pertenece al serovar 1, y produce tanto APX 1 como 2. Esta combinación de la producción de APX se sabe que está asociada con los brotes más graves de la pleuroneumonía. Los cerdos no vacunados presentaban numerosos síntomas de infección por APP después de la autopsia, presentando tanto adhesiones pulmonares como lesiones (Tabla 6). En contraste, sólo uno de los seis animales vacunados mostraba algún síntoma de infección, con una única adhesión pulmonar, que era improbable que fuera el resultado de la estimulación. Este resultado demuestra claramente lo apropiado que es que la cepa HS93C^{-}A^{r} se utilice como una vacuna viva contra la pleuroneumonía porcina. La capacidad de la vacuna para suministrarse por vía intranasal se demostró asimismo, junto con la capacidad para proteger a los animales contra una estimulación serovar cruzada. Éste es el primer informe de una cepa vacunal viva de APP apropiado para utilizar en cerdos que ofrece una protección para serovares cruzados.

Ejemplo 13 Expresión de proteínas extrañas a partir de vectores APP

El potencial para expresar genes extraños de APP se demostró temprano en este documento, en el que el gen APX1 se aisló a partir de una cepa de APP de serovar 1, HS25, y se expresó a partir de un plásmido en la cepa de APP de serovar 7 modificada , Toxina^{-} HS93. Las cepas de APP de serovar 7 no codifican genes APX1 y la construcción de la cepa Tox^{-}/plG3B-TlK, y la subsiguiente evaluación, representa una expresión del gen extraño de APP (Figura 4). Esta cepa se caracterizó posteriormente y mostró que podía inducir anticuerpos anti-APX1 en ratones, en comparación con la cepa salvaje HS93 o la Toxina^{-} HS93 modificada (Tabla 3). La expresión del gen APX1 a partir de la cepa Tox^{-} produjo asimismo una vacuna viva, que se mostró capaz de proteger a los ratones contra una estimulación heteróloga de APP, contrariamente otra vez a la cepa Tox^{-} parental (Tabla 4).

Para demostrar ulteriormente el potencial de APP para actuar como un vector bacteriano, se construyó una serie de casetes de expresión basadas en pIG para la expresión de diversas proteínas extrañas de APP, tal como se esquematiza en la Figura 8. Los genes que codifican proteínas extrañas se clonaron junto con promotores apropiados, en plásmidos basados en pIG, para permitir la expresión en APP. Después de la construcción y caracterización en E. coli, los plásmidos de expresión se transformaron en APP, tal como se describe en Materiales y Métodos. El ADN plasmídico se aisló a partir de colonias resistentes a antibióticos, y se analizó mediante digestión enzimática de restricción para confirmar los perfiles predichos.

Las citoquinas son las hormonas del sistema inmunitario que controlan y determinan la efectividad de las respuestas inmunológicas después de una infección y vacunación. Las citoquinas pueden utilizarse par aumentar la respuesta inmune a un antígeno dado y para dirigir la respuesta inmune en la dirección que sea más apropiada (humoral o celular), para inducir inmunidad protectora. La expresión de las citoquinas a partir de los vectores APP puede proporcionar medios para optimizar la respuesta inmune a APP, y a cualquier antígeno extraño adicional, y que se co-exprese. El gen IL6 porcino se obtuvo del Dr. David Strom, CCSIRO Division of Animal Health, y se clonó en un vector plasmídico apropiado (Figura 8, plG-IL6) para obtener la expresión en APP (HS93/plG-IL6). En el caso de la IL6 porcina, la expresión a partir de los vectores se detectó utilizando un anticuerpo monoclonal (proporcionado por el Dr. David Strom, CSIRO Division of Animal Health). En la Figura 9 puede apreciarse que el anticuerpo monoclonal reacciona con una proteína única en APP/3B-IL6, del tamaño esperado (22 kDaltons) e idéntica en tamaño al material derivado de E. coli. Contrariamente, HS93 sin el casete de expresión no reacciona con el anticuerpo
monoclonal.

El gen de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT) codifica una enzima que ofrece resistencia al antibiótico cloranfenicol, y se cuantifica fácilmente en reacciones enzimáticas. Se construyó un plásmido para alcanzar un alto nivel de expresión de CAT a partir de APP (Figura 8B), y ofreció cepas APP que transportan esta resistencia del plásmido al cloranfenicol.

El desarrollo de APP como un vector bacteriano proporcionará medios para suministrar moléculas significativas comercialmente para el tracto respiratorio de los cerdos. Estas moléculas incluyen citoquinas, para regular el sistema inmune, y antígenos protectores de otras bacterias patogénicas, proporcionando los medios para construir vacunas multivalentes. Dichas vacunas tienen el potencial de ofrecer protección contra más que una enfermedad, después de una vacunación única.

TABLA 6 Lesiones pulmonares que se encuentra en cerdos después de la autopsia

Los cerdos se vacunaron dos veces con APP HS93C^{-}A^{r} a intervalos de dos semanas, y se les administró entonces un serovar cruzado estimulado con APP HS25, dos semanas después de la vacunación final.

Los exámenes post-mortem se realizaron cinco días después de la estimulación y se registraron las lesiones pulmonares.

Lesiones pulmonares presentes en cerdos después de la autopsia

Grupo 1:

No vacunados y no estimulados

1.

Sin evidencia de lesiones

2.

Sin evidencia de lesiones

3.

Sin evidencia de lesiones

\vskip1.000000\baselineskip

Grupo 2:

Vacunados y no estimulados

1.

Sin lesiones evidentes

2.

Sin lesiones evidentes

3.

Sin lesiones evidentes

\vskip1.000000\baselineskip

Grupo 3:

Vacunados y estimulados

1.

Sin lesiones evidentes

2.

Sin lesiones evidentes

3.

Sin lesiones evidentes

4.

Sin lesiones evidentes

5.

Sin lesiones evidentes

6.

Pequeña adhesión revestida en el lado izquierdo del pulmón, pareció más antigua de 5 años, (se aisló la bacteria, que se descubrió que no era APP)

\vskip1.000000\baselineskip

Grupo 4:

No vacunados y estimulados

1.

Adhesión del lóbulo diafragmático derecho, lesión de 5 cm de diámetro en el lóbulo cardíaco izquierdo

2.

2 adhesiones del lóbulo diafragmático derecho, lesión localizada (absceso) en el lóbulo diafragmático derecho, lesión del lóbulo diafragmático ventral derecha adhesión del lóbulo diafragmático dorsal izquierdo, 2 lesiones (0,5 cm) del lóbulo cardíaco dorsal lesiones del lóbulo diafragmático medio-izquierdo

3.

Pequeña adhesión del lóbulo apical posterior derecho, pleuritis a través del lóbulo diafragmático dorsal izquierdo,

4.

Pequeña adhesión del lóbulo apical derecho, lesión (4 cm) del lóbulo diafragmático dorsal derecho, absceso (1 cm) del lóbulo cardíaco derecho, lesiones (7 x 1 cm) a través del lado izquierdo del pulmón.

5.

Pleuritis exudativa e inflamación del pericardio, (pericarditis difusa) adhesión del lóbulo diafragmático derecho

6.

Pleuritis adhesiva del lóbulo diafragmático derecho lesión (1 cm) del lóbulo diafragmático ventral izquierdo.

\vskip1.000000\baselineskip

Finalmente, debe entenderse que pueden introducirse varias alternancias, modificaciones y/o adiciones en las construcciones y disposiciones de las partes descritas anteriormente, sin apartarse del espíritu o del alcance de la invención.

Referencias

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Claims (25)

1. Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) modificado genéticamente que comprende un operón de la toxina RTX que incluye un gen estructural RTX y un gen activador RTX post-traduccional parcial o completamente inactivado, que produce una toxina RTX en el que dicha toxina RTX está parcial o completamente inactivada.

2. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según la reivindicación 1, que induce en un huésped inmunidad protectora para el polipéptido estructural RTX y la infección por Actinobacillus pleuropneumoniae.

3. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según la reivindicación 1 o 2, en el que la toxina RTX parcial o completamente inactivada es un precursor de una toxina RTX.

4. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la toxina RTX parcial o completamente inactivada es un producto de expresión no procesado de un gen estructural RTX.

5. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el gen estructural es un gen RTX A.

6. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el activador post-traduccional está parcial o completamente suprimido.

7. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el activador post-traduccional es un producto de un gen RTX C.

8. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el gen activador post-traduccional está parcial o completamente inactivado mediante técnicas del ADN recombinante que comprenden la introducción y la deleción del ADN del gen que codifica el gen activador post-traduccional, que incluye la sustitución nucleótida única o múltiple, la adición y/o la deleción, que incluye la deleción parcial o total del gen, la recombinación homóloga que utiliza un constructo diana o la segregación plasmídica; y la mutagénesis sitioespecífica inducida mediante radiación o químicamente.

9. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que la toxina RTX producida es una toxina APX seleccionada de entre el grupo constituido por APX 1, APX 2 o APX 3.

10. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el microorganismo es incapaz de producir por lo menos una de las proteínas implicadas en la secreción de un producto del gen de la toxina RTX.

11. Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según la reivindicación 10, en el que el microorganismo posee un gen RTX B parcial o completamente inactivado y/o un gen RTX D parcial o completamente inactivado.

12. Composición de vacuna para inducir una respuesta inmunológica para una toxina RTX en un animal huésped, incluyendo dicha composición de vacuna el Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. Composición de vacuna según la reivindicación 12 para inducir una respuesta inmunológica para una gama de serovares de un microorganismo que produce la toxina RTX correspondiente.

14. Composición de vacuna según la reivindicación 13, en la que la toxina APX es seleccionada de entre el grupo constituido por APX 1, APX 2 y APX 3.

15. Vector biológico que incluye un Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Vector biológico según la reivindicación 15, que proporciona además moléculas biológicamente activas capaces de potenciar una respuesta en un animal huésped.

17. Vector biológico según la reivindicación 16, en el que dicha molécula biológicamente activa es seleccionada de entre el grupo constituido por moléculas funcionales tales como factores de crecimiento, hormonas, enzimas, antígenos o sus partes antigénicas, citoquinas tales como interleuquinas, interferones y factores de necrosis tumoral.

18. Vector biológico según la reivindicación 15 ó 16, en el que dicha molécula biológicamente activa se expresa mediante el vector biológico con un plásmido que lleva un gen que codifica la molécula biológicamente activa.

19. Vector biológico según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, en el que dicho Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente es capaz de inducir una respuesta inmune para dos o más epítopos antigénicos autóctonos para Actinobacillus pleuropneumoniae.

20. Vector biológico según la reivindicación 19, en el que dicha respuesta inmune se induce para una forma virulenta de Actinobacillus pleuropneumoniae y para antígenos heterólogos expresados por Actinobacillus pleuropneumoniae.

21. Vector biológico según la reivindicación 20, en el que dicha respuesta inmune se induce contra una toxina RTX y por lo menos un epítopo antigénico de uno o más agentes patogénicos seleccionados de entre patógenos bacterianos que incluyen Haemophilus spp, Serpulina hyodysenteriae, Pasteurella spp, Bordetella bronchiseptica, Leptospira spp, Streptococus spp, Salmonella spp, Escherichia coli, Mycoplasma hyopneumoniae, Erysipelothrix rhusiopathiae. o patógenos víricos que incluyen HCV, PRRSV, PRV, TGEV, PPV.

22. Procedimiento para producir un Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente que produce una toxina RTX, en el que dicha toxina RTX está parcial o completamente inactivada, comprendiendo dicho procedimiento

proporcionar un Actinobacillus pleuropneumoniae; e

inactivar parcial o totalmente un gen RTX activador post-traduccional en el operón de la toxina RTX de dicho Actinobacillus pleuropneumoniae.

23. Utilización de una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la preparación de un medicamento para vacunar a un animal contra un microorganismo que produce la toxina RTX.

24. Utilización de una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en la preparación de un medicamento destinado a su utilización en el tratamiento de la pleuroneumonía porcina.

25. Procedimiento para la producción de una toxina RTX inactiva, comprendiendo dicho procedimiento el cultivo de un Actinobacillus pleuropneumoniae modificado genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, y recuperar la toxina parcial o completamente inactiva producida por dicho microorganismo.