ES2294821T3 - Lps de toxicidad reducida obtenido a partir de bacterias gram negativas modificadas geneticamente. - Google Patents

Abstract

LPS con un lípido A incluyendo un número reducido de cadenas acilo secundarias por molécula de LPS en comparación con la molécula correspondiente de LPS no modificada y conteniendo al menos una cadena acilo secundaria ligada a una cadena acilo primaria en el extremo reductor del disacárido de glucosamina.

Description

LPS de toxicidad reducida obtenido a partir de bacterias Gram negativas modificadas genéticamente.

Antecedentes de la invención

La presente invención se incluye en el campo de las vacunas y más específicamente provee nuevos compuestos que pueden ser usados en forma de adyuvantes en vacunas. Muchos adyuvantes han sido descritos por ejemplo emulsiones de aceite mineral tipo Freund, sales de aluminio, saponinas, muramil dipéptido y derivados MPL, MF59 etc. No obstante, en realidad sólo algunos están autorizados para su uso en seres humanos. Esto se debe generalmente a una proporción desfavorable entre una acción inmunoestimuladora versus la toxicidad. Una referencia general relativa a los adyuvantes puede ser encontrada en The Theory and Practical Application of Adjuvants (D.E.S. Stewart-Tull ed. John Wiley & Sons 1995) y la información está incorporada aquí como referencia. La técnica anterior expone también varios organismos cuyo tratamiento enzimático de LPS puede producir una toxicidad reducida. Los LPS ilustrados que han sido sometidos a este tratamiento son: Salmonella typhimurium y Salmonella minnesota. También se ha sugerido que las siguientes los presentan: todas las bacterias Gram negativas y específicamente Salmonella, Escherichia, Haemophilus, Moraxella, Campylobacter y Neisseria. No obstante, no se han provisto detalles en referencia a una prueba de la actividad adyuvante.

Fijándonos más detalladamente en esta técnica anterior se constata que Munford et al (en la patente US 4,929,604 publicada en 1990) exponen un LPS S typhimurium donde el 95% de los grupos acilo secundarios ha sido eliminado por medio de un tratamiento enzimático. El tratamiento Munford no puede eliminar específicamente las cadenas de acilo secundarias asegurando sólo una desacilación parcial. El método Munford no puede proporcionar un producto uniforme y en el mejor de los casos casi todos los grupos acilo secundarios serán eliminados.

Éstos sugieren que una actividad adyuvante puede estar presente debido a una prueba de mitogenicidad en las células B. La prueba de mitogenicidad en las células B es sin embargo una prueba fiable para indicar la actividad adyuvante. Probablemente tal producto no exhiba una actividad adyuvante. El método Munford en realidad muestra sólo la eliminación de las cadenas acilo secundarias del extremo no reductor del LIDS. El producto resultante no contiene ningún grupo acilo secundario en el extremo reductor del LPS. El producto Munford presenta una carencia de cadenas laterales secundarias del miristoilo y lauroilo. El método Munford no puede eliminar específicamente sólo miristoilo o sólo lauroilo. El método Munford no puede eliminar solamente una cadena de acilo secundaria de una ubicación especifica. El método Munford está previsto para ser aplicado también a Escherichia, Haemophilus y Neisseria.

Éstos muestran un LPS de Salmonella con un grupo fosfato sobre el extremo no reductor y otro sobre el extremo reductor. El LPS de Salmonella posee 1 grupo miristoilo y 1 lauroilo sobre el extremo no reductor. El LPS de Salmonella no posee ningún grupo acilo secundario sobre el extremo reductor.

Myers et al en la patente US 4,912,094 utilizan una hidrólisis alcalina en condiciones controladas para eliminar únicamente el residuo acilo beta-hidroximirístico que está ligado por éster a la glucosamina del extremo reductor en la posición 3. Asimismo se describe un producto donde una de las cadenas acilo primarias ha sido eliminada químicamente. No se ha mencionado nada respecto a la eliminación de la cadena acilo secundaria. El producto resultante está considerado menos tóxico y mantiene propiedades antigénicas. Esto se establece simplemente en base a la mitogenicidad reducida de MPL A (ácido hidrolizado) con respecto a la proliferación en las células B para la versión desacetilada. No obstante, la prueba de mitogenicidad en las células B no es una prueba fiable para indicar una actividad adyuvante. La Echerichia coli y el LPS de Salmonella minnesota están proporcionados como ejemplos. No obstante, sólo los datos de la actividad biológica están proporcionados para el LPS de Salmonella minnesota. Éstos sugieren que el método deba ser aplicado a todos los LPS pero no ofrecen soporte de los mismos.

El mismo tema está citado en un artículo de Erwin et al con Munford como coautor (1991). Según el resumen del mismo articulo de Erwin, el texto siguiente está comentado en el resumen "Estos estudios indican que la contribución de las cadenas acilo secundarias en las bioactividades de un LPS dado no puede ser prevista de manera segura a partir de las relaciones de estructura-actividad expuesta del lípido A o del comportamiento de otro LPS desacilado".

Los genes implicados en la aciloxiacilación del lípido A son conocidos en la técnica. Recientemente dos aciltransferasas de funcionamiento tardío de biosíntesis del lípido A en Escherichia coli fueron identificadas como los productos de los genes htrB y msbB (Clementz et al., 1996,1997); el gen hrtB fue descrito previamente según se requería para el crecimiento en medios ricos por encima de 33ºC, y el gen msbB como un supresor multicopia de htrB. En la reacción óptima, el HtrB transfiere laurato al (KDO)2-Lípido IVA, después de lo cual el MsbB puede añadir miristato para completar la acilación del lípido A (Fig. 1). Los productos predominantes formados por los mutantes htrB y msbB son especies tetra- y penta-acilo, respectivamente. Los genes presentan el 27,5% de identidad; un tercer gen perteneciente a esta familia está presente también en el cromosoma de E. coli, pero su función en la biosíntesis del lípido A todavía debe ser demostrada.

WO9725061 expone mutantes de las bacterias Gram negativas 1 pxF (msbB) que carecen de la fracción del ácido mirístico del lípido A en forma de huéspedes para la producción de inmunogenes o proteínas heterólogas. Hones et al., 1998, J. Hum. Virol. 1: 251-256 muestran que el LPS aislado de los mutantes HtrB y MsbB de E. coli mantiene la capacidad de inducir una secreción de beta-quimiocina sin la activación concomitante de citoquinas pirogénicas.

La secuencia del genoma de Haemophilus influenzae contiene ambos homólogos htrB y msbB; la mutación de htrB está asociada a una modificación de la fosforilación y de la acilación del LPS (Lee et al., 1995), sugiriendo un efecto pleiotrópico de la pérdida de las cadenas aciloxiacilo de cecoración de la cadena oligosacárida. Una mutación knock-out en el gen htrB cíe H. influenzae exponía una reducción de la toxicidad asociada al LPS (Nichols et al., 1997).

Apicella (también autor del documento citado de Lee et al) et al describen también un mutante knock-out htrB en WO97/19688. Estos describen un mutante tetraacilo de H. influenzae obtenido a través de una mutación de htrB, dicho LPS del mutante presentando supuestamente una toxicidad sustancialmente reducida aún con antigenicidad retenida.

Éstos utilizaron una homología de la secuencia de htrB de E coli para encontrar una secuencia similar de Haemophilus. Esta secuencia similar tenía el 56% de identidad y era un 73% similar a la secuencia de htrB de E. coli. Unos mutantes de H. influenzae fueron producidos y crecidos. Un análisis del LPS del mutante de Haemophilus reveló una reducción de fosfoetanolaminas, 50% menos con dos en el núcleo interno. Una especie como un lípido A mono o difosforilo pentaacilo de H. influenzae desprovisto de una de las cadenas acilo secundarias (p. ej. fracción de ácido mirisitico) en aproximadamente un 10% es también revelada por Apicella. Además se ilustró un tetraacilo presente en aproximadamente un 90%. Por ello, el método Apicella produce una mezcla de estructuras de LPS de H. influenzae recombinante donde la mayor parte del producto no contiene cadenas acilo secundarias. Unos ensayos bactericidas de preparaciones LOS son provistas por Apicella en forma de inmunizaciones de crías de ratas y de chinchilla usando la cepa mutante de H. influenzae. En las pruebas se utiliza LPS per se como inmunógeno, éstas no ilustran o sugieren nada con respecto a una actividad adyuvante. La respuesta inmunológica contra el LPS per se está expuesta en las pruebas de Apicella et al.

Un mutante de Salmonella está descrito también. Se consiguió este mutante siguiendo el método de forma análoga al método del mutante de H. influenzae. El mutante de Salmonella provee un LPS donde la substitución 3' en el C14 enlazado a N es un C16 preferiblemente a un ácido !graso C12. Esta forma de realización resultó ser diez veces menos tóxica que un tipo salvaje. No se proporciona ningún detalle de antigenicidad para esta sustancia.

Éstos sugieren que el método puede ser aplicado también a Neisseria, Moraxella, y Campylobacter. En el ejemplo 6 por ejemplo, Apicella sugería que unas fases análogas para H. influenzae pudieran ser efectuadas para Neisseria pero no se ha ilustrado nada al respecto y evidentemente el método no se ha llevado a cabo. Hasta hoy no se ha encontrado ninguna enseñanza en referencia a tal gen en una síntesis del lípido A de Neisseria y no se ha provisto ningún detalle de pruebas en las que el gen esté implicado en esta fase de síntesis del lípido A de Neisseria.

El documento de la técnica anterior de Apicella revela que la mutación en Salmonella produce la inducción de otra aciltransferasa preferiblemente en vez de proporcionar la omisión de una acilación secundaria en contraste con el resultado provisto para H. influenzae. Esto ilustra la imprevisibilidad del resultado durante la mutación de genes asociada a una síntesis del lípido A en varios organismos Gram negativos y en relación también con la enseñanza de Erwin y Munford.

El producto de Salmonella es un hepta o hexaacilo es decir que tiene el mismo número de cadenas acilo secundarias y primarias que el no mutante. El producto de H. influenzae está desprovisto principalmente (90%) de cadenas acilo secundarias pero también proporciona una mezcla de estructuras de pentacilo. No está provista o indicada ninguna diferencia de actividad para ninguna de las distintas estructuras.

La estructura del lípido A de Neisseria meningitidis fue analizada anteriormente por Kulshin et al en 1992. No obstante no se conoce nada en referencia a un programa genético de Neisseria en relación con la presencia o ausencia de un gen htrB o identidad del mismo. Además no se sabe nada de la influencia de una mutación cualquiera en dicho gen, y si se encontrara, ésta se produciría en una cepa mutante resultante o en el producto o productos resultantes.

Resumen de la invención

Hemos investigado e identificado una secuencia genética implicada con una acilación secundaria de LPS. Se encontraron dos secuencias diferentes en el genoma de Neisseria meningitidis. En base a esta información i.a. hemos establecido la hipótesis de la existencia de dos transferasas de aciloxiacilo que pueden funcionar de muchas formas. Tal forma puede implicar que sólo una de estas transferasas catalice un análogo adicional en el proceso de E. coli, es decir HtrB (figura 1). De forma alternativa, una única enzima puede catalizar ambas acilaciones, mientras que el lípido A meningococo tiene una estructura simétrica. De esta manera realizamos mutaciones en la síntesis de genes del lípido A de Neisseria meningitidis y descubrimos que las cepas mutantes eran viables. También descubrimos que estas cepas producían un LPS mutado. Este LPS mutado presentaba una toxicidad reducida. No obstante la mutación en el gen htrB2 producía un producto que no mantenía ninguna actividad inmunoestimuladora. Se obtuvo un producto que resultaría inútil para una vacuna. Se obtuvo un producto que no podría ser usado como adyuvante en una vacuna.

Sorprendentemente descubrimos sin embargo que unas mutaciones en el gen htrB1 de Neisseria meningitidis proporcionaron un producto que era menos tóxico y que proporcionaba además una actividad adyuvante. Se analizó la estructura molecular de los productos resultantes y se llegó a la conclusión de que las moléculas correspondientes a otras bacterias Gram negativas podían ser útiles de manera análoga. Se descubrió que no sólo la toxicidad sino también la actividad adyuvante estaba estrechamente relacionada con la estructura de la molécula. En particular la composición de acilo secundaria era particularmente importante. También se descubrió que el modelo de fosforilación era importante.

En consecuencia, se provee ahora un método para producir específicamente derivados de LPS menos tóxicos con una actividad adyuvante evidente, dichos derivados no habiendo sido perceptibles previamente en la técnica anterior y presentando características desconocidas e imprevisibles de la técnica anterior.

Descripción detallada de la invención

La invención está dirigida a formas nuevas de LPS menos tóxicas que son obtenidas por medio de bacterias Gram negativas modificadas genéticamente. Estas nuevas estructuras de LPS presentan una actividad adyuvante.

Las nuevas estructuras de LPS están definidas como LPS recombinantes con un número reducido de cadenas acilo secundarias por molécula de LPS con respecto a la molécula de LPS no modificada correspondiente, dichas cadenas acilo secundarias siendo enlazadas a cadenas acilo primarias, dichas cadenas acilo primarias siendo enlazadas a la glucosamina de dicha molécula de LPS recombinante, dicho LPS recombinante siendo homogéneo en un modelo de acilación. A diferencia de la técnica anterior donde se ha descrito el LPS modificado químicamente y el LPS de H. influenzae creado genéticamente según Apicella, el nuevo LPS según la invención puede ser obtenido para garantizar la homogeneidad del modelo de acilación, específicamente también el modelo de acilación secundario. Naturalmente esto provee una base mejor para la adición a un a vacuna a la vista de realizar una estandardización pero también a la vista de realizar un análisis de actividad del producto de expresión resultante. De forma bastante específica, un LPS adecuado según la invención es una molécula de LPS recombinante con un número reducido de cadenas acilo secundarias con respecto a la molécula de LPS no modificado correspondiente, dichas cadenas acilo secundarias estando enlazadas a cadenas acilo primarias, dichas cadenas acilo primarias estando enlazadas a la glucosamina en dicha molécula de LPS recombinante, y dicha molécula de LPS recombinante teniendo al menos una cadena acilo secundaria enlazada a una cadena acilo primaria ligada a la glucosamina sobre el extremo reductor de dicha molécula de LPS recombinante. Un LPS recombinante según la invención en cualquiera de las formas de realización provistas puede tener el mismo número de cadenas acilo primarias que el LPS no modificado. Un LPS recombinante según la invención puede tener la misma composición de cadenas acilo primarias que el LPS no modificado. Por ejemplo un LPS recombinante según cualquiera de las formas de realización de la invención mencionadas anteriormente posee 2 cadenas acilo primarias ligadas a la glucosamina en el extremo reductor por molécula de LPS recombinante. En una forma de realización adecuada el LPS según la invención tendrá una cadena acilo primaria presente en la posición 3 de la glucosamina en el extremo reductor por molécula de LPS recombinante. De manera bastante específica la acilación de lauroilo es el objetivo de rectificación del LPS recombinante con respecto al LPS no modificado. Tal LPS recombinante puede tener un número reducido de cadenas lauroilo secundarias por molécula de LPS recombinante en comparación con el LPS no modificado. De manera adecuada un LPS recombinante según la invención puede tener un número reducido de cadenas lauroilo secundarias ligadas al extremo no reductor de la molécula de LPS recombinante por molécula de LPS recombinante en comparación con el LPS no modificado. Una forma de realización según la invención de cualquiera de los tipos descritos anteriormente ha resultado adecuada en la que el LPS recombinante tiene al menos una cadena lauroilo secundaria fijada a una cadena acilo primaria en el extremo reductor de la molécula de LPS por molécula de LPS recombinante. Por ejemplo tal LPS recombinante posee una cadena lauroilo secundaria en la cadena acilo primaria en la posición 2 de la glucosamina en el extremo reductor de la molécula de LPS por molécula de LPS recombinante. En particular un LPS recombinante según cualquiera de las formas de realización precedentes, dicho LPS recombinante teniendo una cadena acilo secundaria sobre la cadena acilo primaria en la posición 2 de la glucosamina en el extremo reductor de la molécula de LPS por molécula de LPS recombinante ha resultado tener cierto interés. Otra forma de realización interesante es una molécula de LPS recombinante que según cualquiera de las definiciones anteriores de la invención posee 5 cadenas acilo en total por molécula de LPS recombinante. En una forma de realización alternativa adecuada, el LPS recombinante según las formas de realización anteriores de la invención tiene un grupo fosfato ligado a la glucosamina en el extremo no reductor de la molécula de LPS y un grupo fosfato ligado a la glucosamina en el extremo reductor de la molécula por molécula de LPS recombinante. Además de lo citado anteriormente, otra forma de realización de la invención consiste en un LPS recombinante con un grupo fosfoetanolamina por molécula de LPS recombinante. También un LPS realizable según la invención tiene un grupo fosfoetanolamina por molécula de LPS recombinante. Un LPS recombinante incluyendo un grupo fosfato ligado a la glucosamina en el extremo no reductor de la molécula de LPS y un grupo fosfato ligado a la glucosamina en el extremo reductor de la molécula, dicho grupo fosfato estando también ligado a la fosfoetanolamina en el extremo reductor de la molécula por molécula de LPS recombinante representa una forma de realización particularmente adecuada. Hay que tener en cuenta que cualquier combinación del elemento descrito de las distintas formas de realización de LPS también forma parte del objetivo de la invención. Cualquier bacteria Gram negativa puede ser una fuente para un LPS recombinante según la invención. Específicamente en este aspecto una bacteria seleccionada del grupo comprendiendo las siguientes bacterias Neisseria, Bordetella, Salmonella y Haemophilus está considerada una fuente adecuada. Los organismos Neisseria y Bordetella son particularmente nocivos y se prefieren los LPS derivados de tales bacterias. Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoae son dos candidatos adecuados de bacterias pertenecientes al grupo de bacterias incluido en la definición de Neisseria. En los ejemplos usamos LPS derivados de la cepa Neisseria meningitis H44/76. En base a esa cepa se descubrió que la siguiente estructura de LPS era extremadamente útil:

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Como se ha indicado el LPS recombinante según la invención expone una toxicidad reducida. La toxicidad reducida puede ser determinada mediante el uso de ensayos comunes para determinar la toxicidad de los cuales se provee un número en los ejemplos pero de los cuales cualquier número de otros será evidente para un experto en la técnica. Un LPS recombinante según cualquiera de las formas de realización de la invención presentará una toxicidad reducida con respecto al LPS no modificado correspondiente. Otra sustancia contra la cual se puede comparar la toxicidad reducida es el MPL cuando se compara mediante el uso de los ensayos correspondientes. Un LPS recombinante según cualquiera de las formas de realización de la invención exhibe una actividad adyuvante. Una sustancia con la que la actividad adyuvante puede ser comparada es el MPL cuando se somete a una prueba mediante el uso de los ensayos correspondientes. Un LPS recombinante según la invención exhibe una actividad adyuvante superior a la del MPL cuando se somete a una prueba mediante el uso de los ensayos correspondientes. De manera alternativa la actividad adyuvante puede ser compararla a la del LPS de Rhodobacter sphaeroides y cuando se somete a una prueba mediante el uso de los ensayos correspondientes el LPS según la invención muestra una actividad adyuvante superior. Otra forma de probar la actividad adyuvante de un LPS recombinante según la invención es con respecto al LPS meningococo hidrolizado alcalino. Un LPS recombinante adecuado según la invención exhibirá una actividad adyuvante superior a la de un LPS meningococo hidrolizado alcalino cuando se somete a una prueba mediante el uso de los ensayos correspondientes. La actividad adyuvante puede ser determinada con un antígeno dirigido contra el mismo grupo bacteriano del cual derivó el LPS no modificado. La actividad adyuvante puede ser determinada también con un antígeno dirigido contra un organismo diferente a un organismo perteneciente al grupo bacteriano del cual derivó el LPS no modificado. Los ejemplos proporcionan una ilustración de una prueba de la actividad adyuvante. El LPS recombinante según la invención puede ser sustancialmente aislado y purificado mediante el uso de metodologías estándar para el aislamiento de LPS de los cultivos bacterianos.

La presente invención no sólo está dirigida al LPS per se tal y como se ha definido en cualquiera de las formas de realización mencionadas del LPS recombinante según la invención sino que también se dirige a una composición comprendiendo tal LPS recombinante. Tal composición puede ser una composición para estimular una reacción inmunológica. De manera bastante específica, tal composición puede ser una vacuna con el LPS recombinante en forma de componente activo en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. Una composición según la invención y específicamente una vacuna según la invención comprende el LPS recombinante como adyuvante. La composición sirve preferiblemente para estimular una reacción inmunológica contra una bacteria Gram negativa. La composición puede ser usada para combatir infecciones causadas por otros organismos aparte del organismo correspondiente al organismo del cual derivó el LPS correspondiente al del LPS recombinante. No obstante esta última puede ser usada de manera adecuada para combatir el mismo tipo de organismo. Un LPS de Neisseria puede ser usado en una vacuna para combatir una infección por Neisseria pero también para combatir una infección por Bordetella. También se prevé que una vacuna contra el sarampión pueda comprender un LPS recombinante según la invención ya que una composición de adyuvante A según la invención puede estar desprovista de otros adyuvantes. Específicamente una composición según la invención, preferiblemente una vacuna está desprovista de cualquiera de los adyuvantes comúnmente usados en las vacunas comerciales. De manera adecuada una composición según la invención está desprovista de los siguientes adyuvantes de emulsiones de aceite mineral de tipo Freund, sales de aluminio, saponinas, muramil dipéptido y derivados de MPL y MF59. De manera alternativa, una vacuna según la invención comprende los adyuvantes comerciales usados comúnmente en dosis inferiores a las que se usan habitualmente en la práctica para las preparaciones de vacunas comerciales, exhibiendo así una toxicidad inferior a la de la vacuna correspondiente sin el LPS según la invención y la composición y cantidad de adyuvante normales. Para que una composición según la invención tenga una acción estimuladora inmunológica y sea útil en forma de vacuna es preferible que la composición comprenda un antígeno además del adyuvante para estimular la reacción inmunológica. De manera adecuada el antígeno es específico para obtener la estimulación de la reacción inmunológica contra un organismo aparte del organismo correspondiente a aquel del cual derivó el LPS correspondiente a aquel del LPS recombinante. Una forma de realización se refiere también a una composición según la invención que comprende un antígeno además del adyuvante para estimular la reacción inmunológica, dicho antígeno siendo específico para obtener la estimulación de la reacción inmunológica contra un organismo, correspondiente al grupo de organismos del cual derivó el LPS correspondiente a aquel del LPS recombinante. Por ejemplo un antígeno de Neisseria y un LPS recombinante de Neisseria según la invención. No es necesario necesariamente que sea de la misma especie, aunque puede serlo. Por ello, un LPS recombinante de Neisseria meningitidis puede estar presente junto con un antígeno de Neisseria meningitidis. No obstante el LPS puede derivar también de una especie de Neisseria gonorrhoeae o de Bordetella. De manera adecuada una composición según la invención se presentará en forma de dosis medicinal. Por ejemplo una dosis inyectable. Preferiblemente la composición según la invención se producirá en una forma sistémicamente aceptable. El adyuvante y cualquier antígeno adicional estará presente en cantidades adecuadas para proporcionar una reacción inmunológica estimuladora en un humano o en un animal. Estará presente en una cantidad no tóxica o en una cantidad tolerablemente tóxica. Se prefiere una aplicación de vacuna que no tenga efectos secundarios de naturaleza peligrosa. La invención comprende también el uso de un LPS recombinante según cualquiera de las formas de realización de la invención como adyuvante en una composición para la estimulación de una reacción inmunológica específicamente en una formulación de vacuna. La invención cubre también un método de tratamiento para la estimulación del sistema inmunológico de un humano o de un animal mediante la administración de un LPS recombinante o de una composición comprendiendo este último en cualquiera de las formas de realización descritas para una composición según la invención en una dosis suficiente para proporcionar la estimulación inmunológica, un experto en la técnica de las vacunas podrá comprobar, en base al objeto y/o a la enfermedad o infección por combatir, qué formulaciones y regímenes de dosis pueden ser aplicados. Unos antígenos comúnmente disponibles y portadores de vacunas pueden ser usados análogamente en las vacunas conocidas. Una solución tampón es un ejemplo adecuado para un portador. El método de administración puede ser cualquier método común por ejemplo la administración parenteral (por ejemplo intravenosa o intramuscular) u oral (por ejemplo usando células bacterianas tifoideas para encapsular la(s) sustancia(s) activa(s)).

La presente invención proporciona también un método para la producción de un LPS recombinante según la invención. El método comprende el cultivo de una bacteria Gram negativa recombinante, dicha bacteria Gram negativa recombinante comprendiendo una mutación en la vía cle la síntesis del lípido A al nivel de la adición de cadenas acilo secundarias a las cadenas acilo primarias ligadas a la glucosamina de la molécula de LPS seguida opcionalmente del aislamiento y de la purificación del L.PS resultante. Específicamente la mutación es una mutación en un gen que codifica una enzima asociada con la adición acilo secundaria. Como se ha descrito anteriormente varias vías de síntesis están disponibles en la técnica para varias bacterias Gram negativas. Mediante el uso de los datos presentes en la técnica anterior en combinación con el objeto descrito en el documento expuesto, se pueden conseguir varios métodos para varios organismos Gram negativos para proveer un LPS recombinante según la invención. Mediante el uso de los datos de la secuencia de htrB provistos para una cepa H44/76 de Neisseria meningitidis, se pueden conseguir secuencias corresponclientes en otros organismos por ejemplo otras Neisseria. La introducción de una mutación que elimina la expresión de un producto de expresión de htrB1 activo en tal organismo asegurará la producción del LPS recombinante deseado. La ubicación e identificación del gen htrB1 están provistas en detalle en los ejemplos de la cepa H44/76 de Neisseria meningitidis. Los datos de la secuencia generados pueden ser extrapolados a otras cepas. La utilización de los datos de la secuencia disponibles y la homología de la sonda utilizada en el ejemplo o la consideración de otra sonda en base a la secuencia de codificación total o parcial de htrB1 de la cepa H44/76 de Neisseria meningitidis puede proporcionar la indicación de secuencias de htrB alternativas en otros organismos. Además de lo citado anteriormente para los organismos Neisseria, se ha descubierto que el htrB1 está situado abajo del gen ruvc, por ello cualquier secuencia de codificación del gen htr hacia abajo de una secuencia de ruvc es una ubicación adecuada para la introducción de una mutación. Cualquier secuencia genética exhibiendo más del 60% de homología a la secuencia codificante de la figura 2 en un organismo Gram negativo de los géneros Neisseria o Bordetella, representa una ubicación potencial para que la mutación proporcione un LPS recombinante según la invención. Cuanto más cerca esté la homología del 100% sobre una extensión de al rnenos 500 bp y más preferiblemente sobre la longitud total de la secuencia codificante mejor. De manera alternativa o en combinación, se puede buscar una secuencia codificante de la misma o una secuencia de aminoácidos cercana y mutar la secuencia correspondiente para que no se produzca ningún producto activo de expresión. De forma bastante adecuada, la secuencia está situada abajo de una secuencia ruvc. Preferiblemente la mutación elegida es una mutación en un gen que codifica una enzima asociada a una adición acilo secundaria de cadenas acilo primarias en el extremo reductor del LPS. Como se puede ver en los ejemplos, adecuadamente, puede tratarse de una mutación en un gen que codifica una enzima asociada a la adición lauroilo secundaria. Una mutación adecuada específica está en un gen que codifica una enzima asociada a la adición de cadena acilo secundaria a la cadena acilo primaria presente en la posición 2' de la glucosamina en el extremo no reductor de la molécula de LPS.

En una forma de realización según la invención el LPS recombinante es aislado y purificado para que esté desprovisto de cualquier otra forma de LPS. En un método de formulación de una vacuna se prefiere en primer lugar aislar el LPS para conseguir una formulación exacta de la vacuna. De manera adecuada un método según la invención consiste en proveer un LPS recombinante con un número reducido de cadenas lauroilo secundarias por molécula de LPS recombinante en comparación con el LPS no modificado cuyo LPS recombinante es aislado y purificado para que éste no contenga ninguna otra forma de LPS. En una forma de realización preferida, el LIDS recombinante está provisto de un número reducido de cadenas lauroilo secundarias ligadas al extremo no reductor de la molécula de LPS recombinante por molécula de LPS recombinante en comparación con el LPS no modificado. En una forma de realización preferida el LPS recombinante provisto tiene al menos una cadena lauroilo secundaria ligada a una cadena acilo primaria en el extremo reductor de la molécula de LPS por molécula de LPS recombinante. De manera adecuada en este método la mutación puede ser tal que el LPS recombinante tenga una cadena acilo secundaria en la cadena acilo primaria en la posición 2 de la glucosamina en el extremo reductor de la molécula de LIDS por molécula de LPS recombinante. De manera adecuada la cadena acilo secundaria es una cadena lauroilo secundaria. Un método preferido implica un proceso de mutación para producir un LPS recombinante según la invención que tenga 5 cadenas acilo en total por molécula de LPS recombinante. Un método alternativo de la invención consiste en producir un LPS recombinante incluyendo un grupo fosfato ligado a la glucosamina en el extremo no reductor de la molécula de LPS y un grupo fosfato ligado a la glucosamira en el extremo reductor de la molécula por molécula de LPS recombinante. De manera adecuada el producto LPS es aislado y purificado para ser desprovisto de cualquier otra forma de LPS. De manera alternativa el método puede comprender la producción de un LPS recombinante incluyendo un grupo fosfoetanolamina por molécula de LPS recombinante que es adecuadamente aislado y purificado para ser desprovisto de cualquier otra forma de LPS.

Un método en el que se produce el LPS recombinante incluyendo un grupo fosfato ligado a la glucosamina en el extremo no reductor de la molécula de LPS y un grupo fosfato ligado a la glucosamina en el extremo reductor de la molécula, esta última estando ligada también a la fosfoetanolamina en el extremo reductor de la molécula por molécula de LPS recombinante y preferiblemente es aislado y purificado para ser desprovisto de cualquier otra forma de LPS provista por la invención.

La invención está posteriormente ilustrada por los ejemplos que no representan una restricción del objetivo de la invención. Las numerosas variantes del LPS y de sus usos según la invención serán evidentes para un experto en la técnica en base a una información proporcionada en las reivindicaciones, en la descripción y en las figuras en combinación con un conocimiento general común del campo de la ingeniería genética, específicamente de las bacterias Gram negativas y de la producción de vacunas. Específicamente las referencias citadas y la información de las bases de datos de ADN accesibles al público con secuencias genómicas Gram negativas, accesibles previamente a la fecha de depósito, están incorporadas aquí como referencia. Cuando se mencionan métodos o procesos de aislamiento, de purificación, éstos son comunes en la técnica y análogos a otros procedimientos bien conocidos. El mismo comentario es válido para la introducción de una mutación en el gen htrB1. Esto puede ocurrir a través de la inserción, deleción o sustitución de manera conocida per se una vez que ha localizado en un organismo una secuencia de ADN de elección para ser mutada. El método de formulación de una vacuna y la administración de la misma también son procedimientos comunes que no precisan ninguna otra aclaración. Los términos usados son términos reconocidos en la técnica por un experto en la técnica que pueden derivar de libros de texto generales referentes al campo de la ingeniería genética, a las bacterias Gram negativas y a la inmunología y/o de las referencias citadas.

Ejemplo 1 Construcción del mutante htrB1 de Neisseria meningitidis con un lípido A alterado

Mediante el uso de las secuencias del gen htrB/msbB de Escherichia coli y Haemophilus influenzae, realizamos una investigación BLAST sobre las secuencias del genoma gonococo disponibles en Internet por la Universidad de Oklahoma. Varias secuencias contiguas con una homología significante fueron identificadas, y unos cebadores de PCR fueron diseñados en base a estas secuencias. Con el ADN cromosómico meningococo como molde, los cebadores pr447-2 y pr670-1 proporcionaban aprox. 500 bp de producto de PCR, el cual tras una clonación en el vector pCRII y de una secuenciación, resultó ser homólogo a unas secuencias de htrB/msbB de varias especies bacterianas (33% y 31% respectivamente para los genes de E. coli). Este fragmento fue usado como sonda para el aislamiento de un fragmento cromosómico más grande conteniendo el gen htrB1 completo de Neisseria meningitidis (Fig. 2). Inmediatamente por encima de este gen se encontraba un marco de lectura abierto con una homología al gen ruvC de E. coli, el cual está implicado presumiblemente en la reparación y recombinación del ADN y no en la biosíntesis del LPS.

Un casete de resistencia a la canamicina fue insertado en el sitio BglI situado dentro del producto de la PCR del htrB1 clonado, y el constructo obtenido (el plásmido pBSNK6, conteniendo también la secuencia de absorción de Neisseria) fue usado para que la cepa H44/76 de menigococo se volviera resistente a la canamicina. Se utilizó la PCR para verificar que se producía el intercambio alélico correcto con el gen cromosómico htrB1. Todos los transformantes obtenidos de esta manera mostraron una movilidad en aumento de sus LPS analizados por Tricina-SDS-PAGE seguido de una coloración con plata (Fig. 3).

La unión de anticuerpos monoclonales específicos para la parte oligosacárida del LPS meningococo no se vio afectada por la mutación, sugiriendo que sólo la parte del lípido A debía haber sido alterarla.

Ejemplo 2 Análisis estructural del lípido A del mutante htrB1

Un análisis de los ácidos grasos por cromatografía de gases/espectrometría de masas de células enteras presentó una proporción reducida de C12: 0/C12:0 3-OH en el mutante htrB1 en comparación con la cepa parental de tipo salvaje, indicando una pérdida (parcial) de la(s) cadena(s) acilo secundaria(s) C12:0. El LPS de este mutante fue purificado a través de una extracción del fenol/agua caliente, y la fracción del lípido A fue obtenida después de una hidrólisis en ácido y de una extracción del clorcformo/metanol. Su estructura fue posteriormente investigada usando una espectrometría de masas en serie.

El análisis reveló especies penta-acilo mayores donde la cadena de aciloxiacilo C12:0 estaba ausente del extremo reductor de la molécula (Fig. 4).

Otra diferencia de la cepa parental se encuentra en el modelo de fosforilación en el extremo reductor del disacárido, donde está presente otro grupo fosfato. Esta molécula de lípido A del mutante tiene una estructura única no encontrada en ninguno de los mutantes descritos previamente para otras bacterias Gram negativas.

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Ejemplo 3 Actividad biológica del LPS del mutante htrB1

Células enteras del mutante htrB1 de la cepa fueron sometidas a pruebas para determinar su actividad biológica asociada con el LPS mediante unos ensayos de inducción por el lisado del amebocito de Limulus (LAL) y por factor-a de necrosis tumoral (TNF-a). En el ensayo de LAL, una reducción de la actividad de 7 veces fue observada para las células enteras del mutante en comparación con el tipo salvaje. Para la inducción de TNF-a por células MM6, unas células bacterianas de htrB1 mostraron al menos una reducción de la actividad de 100 veces en comparación con el tipo salvaje, similar a la reducción encontrada previamente para células enteras de un mutante totalmente deficiente en LPS (Fig. 5) (L. Steeghs et al 1998). La inmunización de ratones con complejos de membranas externas aislados del mutante meningococo deficiente en LPS fue usada para comparar la actividad adyuvante de varias preparaciones de LPS. Las respuestas de los anticuerpos fueron medidas en un ELISA de una célula entera y un ensayo bactericida contra una cepa parental H44/76.

La inmunogenicidad de las proteínas mayores de la membrana externa fue restablecida a niveles normales por LPS de tipo salvaje y del mutante htrB1, pero asimismo menos por el LPS atóxico de especies del lípido A monofosforilo (MPL), LPS de Rhodobacter sphaeroides y LPS meningococo alcalino-hidrolizado (Fig. 6) (Nakano M. y Matsuura M.). Por lo que el LPS del mutante htrB1 mantenía la actividad adyuvante a pesar cle la toxicidad reducida.

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Ejemplo 4 Propiedades del mutante htrB2 del lípido A

Otro gen con homología a htrB/msbB de E. coli y H. influenzae fue identificado de manera similar e inactivado como en los ejemplos precedentes para el htrB1. A diferencia del htrB1 sin embargo, el LPS de este mutante (denominado htrB2) redujo fuertemente la actividad adyuvante así como la toxicidad reducida (Fig. 6). También en contraste con el htrB1, esta mutación puede no ser introducida al interior de una cepa H44/76 con LPS de tipo salvaje sino sólo en un derivado de galE con una cadena oligosacárida truncada, deficiente en galactosa.

Métodos Cepas bacterianas y plásmidos

Las cepas NM522 y INVaF' de E. coli crecieron en un medio LB a 37ºC. La cepa H44/76 de N. meningitidis y sus derivados crecieron a 37ºC en una base de medio GC (Difco) donde se añadió IsoVitaleX (Becton Dickinson) en una atmósfera húmeda conteniendo el 5% de CO2, o en un medio líquido tal y como se ha descrito anteriormente (van der Ley et al.,1993). Para una selección de transformantes meningococos (van der Ley et al., 1996) se usó canamicina en una concentración de 75-100 microgramos/ml. Con E. coli, se usaron antibióticos en las concentraciones siguientes:

ampicilina, 100 microgramos/ml; canamicina, 100 microgramos/ml.

Para una clonación de fragmentos de PCR, se utilizó el kit de clonación TA con el vector pCRII (Invitrogen).

Técnicas de ADN recombinante

Muchas técnicas de ADN recombinante fueron tal y como se describe en Sambrook et al.(1989). El ADN plásmido fue aislado mediante el uso del kit pLASmix (Talent). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue realizada en un sistema de PCR 9600 GeneAmp de Perkin Elmer con Taq polimerasa. Un análisis de secuencias fue realizado con un secuenciador automático de Applied Biosystems en moldes de ADN plásmido bicatenario (aislados con columnas Qiagen) y con un protocolo de secuenciación por ciclo.

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Análisis de LPS

Una electroforesis en gel de poliacrilamida de Tricina dodecil sulfato de sodio fue realizada en geles con un apilamiento del 4% y una separación del 16% tal y como se describe por Lesse et al. (1990). Unas células bacterianas hervidas y tratadas con proteinasa K, fueron usadas como muestras. Los geles fueron formados durante 17 h en una corriente constante de 20 mA, y coloreados con plata por el método de Tsai y Frasch (1982). El ensayo de LAL cromogénico para determinar la actividad endotoxina fue realizado mediante el uso del kit QCL-1000 de BioWhittaker Inc. (Walkersville, MD, E=EUU) según las instrucciones del fabricante. Durante toda una noche se diluyerob los cultivos en un medio meningococo hasta una OD de 620 nm de 0,1, y las diluciones en serie de estas reservas fueron usadas como muestras en el ensayo de LAL. La inducción de TNF-a por suspensiones bacterianas fue evaluada con la línea de células MM6 macrófaga humana y cuantificada a partir de los sobrenadantes del cultivo usando la línea celular WEHI 164 sensible al TNF-a (Espevik y Nissen, 1986). Para un análisis de ácidos grasos por GC-MS, unas muestras de OMC fueron acetiladas durante 3 h a 900ºC en piridina y ácido acético anhidro para disolver completamente el LPS. Las muestras fueron posteriormente calentadas durante 3 h a 650ºC en tetrahidrofurano en presencia de LiAIH4 para reducir los ácidos grasos O-enlazados a los alcoholes libres. Éstas fueron derivatizadas en TMS éteres durante 1 h a 600ºC con BSTFA + 1% de TMCS en piridina, y analizadas por GC-MS en un Autospec (Micromass, Manchester, UK) en el modo de impacto de electrones. La cantidad de 3-OH C12 en las muestras fue cuantificada usando 2-OH C12 como estándar interno. El LPS fue aislado por el método de extracción del fenol-agua caliente (Westphal y Jann, 1965). Para el aislamiento del lípido A, el LPS fue sometido a una hidrólisis con un medio ácido (1% de ácido acético, 2,5 h 1000ºC), seguido de una precipitación y fraccionamiento final en cloroformo- metanol-agua. Un análisis estructural del lípido A purificado fue realizado con una espectrometría de masas en serie por electrospray. La espectrometría de masas se efectuó en un instrumento de trampa de iones cuadrupolo (LCQ Finnigan Corp. San Jose EEUU) dispuesto con una fuente fónica por nanoelectrospray activada a 600 V. La temperatura del capilar de entrada fue establecida en 200ºC, el número máximo de iones en la trampa fue de 1,0 x 10^{7} y el tiempo de inyección máximo fue de 150 ms. Las agujas del nanoelectrospray fueron rellenadas con 2 microlitros de solución de muestra. Unos espectros completos MS fueron registrados en la gama de 150-1850 amu. Unos espectros MS(n) completos siempre fueron precedidos por una exploración zoom del ión parental para determinar de manera más precisa la proporción m/z del ión parental así como su estado de carga. Unos espectros MS/MS fueron registrados con una ventana para una selección del ión parental de 3 amu. La energía de excitación fue ajustada hasta que la proporción de intensidad del valor máximo básico del ión parental se encontrara entre 5 y 20. Excepto para las exploraciones zoom los espectros fueron registrados en modo centroide.

Caracterización de composición OMC

El enlace de mAbs específicos para OMPs de clase 1, 3 y 4 y para la parte oligosacárida del LPS de inmunotipo L3 fue evaluado en una célula entera por ELISA (van der Ley et al., 1995, 1996). El aislamiento de OMCs por extracción con sarkosyl y su análisis con SDS-PAGE fueron efectuados según se ha descrito previamente (van der Ley et al., 1993).

Inmunización de ratones

Unos ratones de seis a ocho semanas de vida BaIB/C, con cinco animales en cada grupo, fueron inmunizados el día 0 subcutáneamente con 20 microgramos de OMCs de H44/76 deficientes en LPS con un suplemento de adyuvante y disueltos en 0,5 ml de PBS. El día 14 y día 28 se repitió la inmunización y los ratones fueron desangrados el día 42. Los sueros fueron recogidos y almacenados a 4ºC. La actividad bactericida del suero contra la cepa H44/76 fue evaluada tal y como se ha descrito en Hoogerhout et al. (1995), usando una concentración final del 20% de complemento de conejo. La graduación bactericida fue medida como la dilución de suero recíproca exponiendo más del 90% de muertes.

Referencias

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Leyendas de las figuras

Figura 1. Función de los productos genéticos htrB y msbB en la biosíntesis de lípido A de Escherichia coli.

Figura 2. Organización (A) y secuencia (B) del gen htrl3l de Neisseria meningitidis.

Figura 3. Análisis tricina-SDS-PAGE de LPS de transformantes de H44/76 de tipo salvaje y resistentes a la canamicina obtenidos con el plásmido pBSNK6.

Figura 4. Análisis estructural por espectrometría de masas del lípido A a partir de H44/76 de tipo salvaje (A) y el mutante htrB1 (B).

Figura 5. Inducción con TNF-a en células MM6 por bacterias enteras de la cepa H44/76, mutante htrB1 y cepa pLAK33 deficiente en LPS.

Figura 6. Comparación de actividad adyuvante de variar preparaciones de LPS cuando se usan para la inmunización de ratones junto con OMCs deficientes en LPS.

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Referencias citadas en la descripción

Esta lista de referencias citada por el solicitante ha sido recopilada exclusivamente para la información del lector. No forma parte del documento de patente europea. La misma ha sido confeccionada con la mayor diligencia; la OEP sin embargo no asume responsabilidad alguna por eventuales errores u omisiones.

Documentos de patente citados en la descripción

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- WO 9725061 A [0008]

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Documentos de literatura no patentada citados en la descripción

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Claims (12)

1. LPS con un lípido A incluyendo un número reducido de cadenas acilo secundarias por molécula de LPS en comparación con la molécula correspondiente de LPS no modificada y conteniendo al menos una cadena acilo secundaria ligada a una cadena acilo primaria en el extremo reductor del disacárido de glucosamina.

2. LPS según la reivindicación 1, donde el lípido A tiene el mismo número de cadenas acilo primarias que la molécula de LPS no modificada.

3. LPS según las reivindicaciones 1 o 2, donde el lípido A tiene una cadena acilo secundaria en la cadena acilo primaria en la posición 2 de la glucosamina en el extremo reductor del disacárido de glucosamina.

4. LPS según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la cadena acilo secundaria es una cadena de lauroilo.

5. LPS según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con un lípido A que posee una fosfoetanolamina ligada a un grupo fosfato en el extremo reductor.

6. LPS según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, con un lípido A que tiene la estructura molecular

2

7. Composición comprendiendo LPS tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. Composición según las reivindicaciones 7, comprendiendo un antígeno añadido al LPS.

9. Método para la producción de LPS tal y como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-6, dicho método comprende el cultivo de una bacteria de los géneros Neisseria o Bordotella, mediante el cual la bacteria comprende una mutación que elimina la expresión de un gen que posee más del 60% de homología con la secuencia codificante del gen htrB1 de la figura 2.

10. Método según la reivindicación 9, donde la bacteria pertenece a las especies Neisseria meningitidis o Neisseria gonorrhoae.

11. Método según la reivindicación 9 o 10, donde la bacteria es una cepa H44/76 de Neisseria meningitidis y donde el gen tiene la secuencia codificante de la figura 2.

12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 9-11 comprendiendo además el aislamiento y la purificación del LPS.