ES2248825T3 - Mutantes no toxicos de bacterias patogenas gram negativas. - Google Patents

Mutantes no toxicos de bacterias patogenas gram negativas.

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ES2248825T3 ES96942080T ES96942080T ES2248825T3 ES 2248825 T3 ES2248825 T3 ES 2248825T3 ES 96942080 T ES96942080 T ES 96942080T ES 96942080 T ES96942080 T ES 96942080T ES 2248825 T3 ES2248825 T3 ES 2248825T3
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Abstract

SE PROPORCIONA UN METODO PARA IDENTIFICAR, AISLAR Y PRODUCIR MUTANTES HTRB DE PATOGENOS BACTERIANOS GRAM-NEGATIVOS. EL METODO COMPRENDE MUTAR EL GEN HTRB DE UN PATOGENO BACTERIANO GRAMNEGATIVO DE MODO QUE EXISTE UNA AUSENCIA DE PROTEINA HTRB FUNCIONAL, LO QUE TIENE COMO RESULTADO UN MUTANTE QUE CARECE DE UNA O MAS CADENAS ACILO SECUNDARIAS CONTENIDAS EN EL PATOGENO BACTERIANO GRAM-NEGATIVO DE TIPO SALVAJE, Y MUESTRA UNA TOXICIDAD SUSTANCIALMENTE REDUCIDA EN COMPARACION CON LA CEPA DE TIPO SALVAJE. ASIMISMO, LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA METODOS PARA UTILIZAR UNA FORMULACION DE VACUNA QUE CONTIENE EL MUTANTE HTRB, LA ENDOTOXINA AISLADA DEL MISMO, O LA ENDOTOXINA AISLADA DEL MISMO QUE ES A CONTINUACION CONJUGADA CON UNA PROTEINA VEHICULO PARA INMUNIZAR UN INDIVIDUO CONTRA LAS INFECCIONES CAUSADAS POR PATOGENOS BACTERIANOS GRAM-NEGATIVOS MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE UNA CANTIDAD PROFILACTICAMENTE EFICAZ DE LA FORMULACION DE VACUNA.

Description

Mutantes no tóxicos de bacterias patógenas gram negativas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones que comprenden una endotoxina alterada (lipooligosacárido (LOS); lipopolisacárido (LPS)) de patógenos bacterianos gram negativos. Más en particular, la presente invención se refiere a la fabricación, por un patógeno gram negativo manipulado por ingeniería genética, de una forma de endotoxina que carece de una porción del lípido A sustancialmente tóxica También se describen usos profilácticos y terapéuticos de la endotoxina sustancialmente detoxificada y de las bacterias mutantes gram negativas que producen la endotoxina sustancialmente detoxificada.
Antecedentes de la invención
Las bacterias gram negativas tienen una membrana externa que comprende componentes que incluyen proteínas, lipoproteínas, fosfolípidos y glicolípidos. Los glicolípidos comprenden principalmente lipopolisacáridos (LPS) o lipooligosacáridos (LOS) endotóxicos, dependiendo del género de las bacterias. Los LPS son moléculas compuestas de:
a) una porción de lípido A compuesta de un disacárido de glucosamina que está sustituido con grupos fosfato y ácidos grasos de cadena larga en enlaces éster y amida;
b) un núcleo de polisacáridos que se une al lípido A por un azúcar de ocho carbonos, KDO (cetodesoxioctanato) y heptosa, glucosa, galactosa y N-acetilglucosamina y
c) una cadena lateral específica O compuesta de unidades de oligosacáridos repetidas que, dependiendo del género y la especie de bacteria, puede contener manosa, galactosa, D-glucosa, N-acetilgalactosamina, N-acetilglucosamina, L-ramnosa y una didesoxihexosa (abecuosa, colitosa, tivelosa, paratosa, trehalosa). El LOS tiene una estructura similar al LPS, conteniendo una porción del lípido A y una estructura de carbohidrato compleja, pero difiere en que no contiene las cadenas laterales O repetidas.
Se cree que los principales determinantes antigénicos de bacterias gram negativas residen en la estructura de carbohidratos de la cadena lateral específica O de LPS y en la estructura compleja de carbohidrato de LOS. Estas estructuras de carbohidrato pueden variar entre especies diferentes del mismo género de bacterias gram negativas variando una o más de la composición de azúcar; la secuencia de oligosacáridos; los enlaces entre los oligosacáridos y las sustituciones/modificaciones de un oligosacárido (especialmente un oligosacárido terminal).
LPS y LOS se consideran como componentes bacterianos que tienen potencial como inmunógenos de vacunas debido a los determinantes antigénicos ("epítopes") que residen en sus estructuras de carbohidrato. Sin embargo, la naturaleza química de LPS y LOS impide el uso de estas moléculas en las formulaciones para vacunas; es decir, la inmunización activa con LPS o LOS es inaceptable debido a la toxicidad inherente de la porción del lípido A. Los efectos patofisiológicos inducidos (directa o indirectamente) debido al lípido A de LPS o LOS en el torrente circulatorio incluyen fiebre; leucopenia, leucocitosis, la reacción de Shwartzman, coagulación intravascular diseminada; aborto y, en dosis mayores, choque y muerte. Por lo tanto, actualmente no hay vacunas disponibles que induzcan respuestas anticorpales contra los epítopes de LPS o LOS.
Como se muestra en la Fig. 1, la porción de lípido A de la endotoxina generalmente comprende un esqueleto hidrófilo de disacáridos de glucosamina que está monofosforilada o difosforilada (posiciones 1 y 4') y que lleva al menos seis moléculas de ácidos grados unidos a ésteres y a amidas. Al esqueleto del lípido A se unen directamente cuatro moléculas de ácido (R)-3-hidroxitetradecanoato (por ejemplo, 3-hidroxi-miristoilo, ácido \beta-hidroximiristico, o \beta-OH) en las posiciones 2, 3, 2' y 3'. Los grupos hidroxilo de dos de las cuatro moléculas de \beta-OH se sustituyen con ácidos grasos normales (denominados "cadenas acilo secundarias", e incluyen dodecanoato, tetradecanoato y hexadecanoato) formando grupos aciloxiacilo.
Una aproximación a la fabricación de una molécula de endotoxina detoxificada implica aislar la endotoxina y tratar enzimáticamente la endotoxina aislada con una aciloxiacilo hidrolasa neutrófila humana (Patentes de EE.UU. Nº 4.929.604, 5.013.661 y 5.200.184). La aciloxiacilo hidrolasa hidroliza los ácidos grasos (cadenas acilo secundarias no hidroxiladas) de sus enlaces éster a grupos hidroxi de \beta-OH (hidroxilado). La endotoxina alterada resultante, a partir del tratamiento enzimático, contenía un resto de lípido A carente de ácidos grasos no hidroxilados. Esta endotoxina alterada mostraba una toxicidad reducida in vivo, pero mantenía la antigenicidad.
Otra aproximación implica un procedimiento parra modificar la endotoxina aislada eliminando selectivamente el \beta-OH que está unido al éster del extremo reducido del esqueleto de glucosamina en la posición 3 (Patente de EE.UU. Nº 4.912.094; Reexamen B1 4.912.094). La eliminación selectiva de \beta-OH se logró usando hidrólisis alcalina. La endotoxina modificada resultante mostraba una toxicidad reducida in vivo, pero mantenía la antigenicidad.
\newpage
Ambas aproximaciones implican un tratamiento químico de la endotoxina aislada. Ninguna aproximación describe la producción en un patógeno bacteriano gram negativo de una endotoxina que tenga la toxicidad sustancialmente reducida que retenga aún la antigenicidad. Adicionalmente, no se ha descrito el uso de una bacteria gram negativa que se haya manipulado genéticamente para producir una endotoxina que tenga reducida la toxicidad y que retenga aún la antigenicidad, en una vacuna profiláctica o terapéutica contra el toque endotóxico y bacteriemia gram negativa.
Resumen de la invención
Según un primer aspecto, la presente invención proporciona una formulación para vacuna que comprende una endotoxina mutante purificada a partir de un mutante htrB de patógeno bacteriano gram negativo, caracterizada porque el lípido A de la endotoxina mutante es el mismo lípido A de la endotoxina de tipo silvestre excepto por la falta de una o más cadenas acilo secundarias y en que la endotoxina mutante está conjugada con una proteína vehículo, en la que la endotoxina mutante tiene la toxicidad sustancialmente reducida cuando se compara con la endotoxina del patógeno bacteriano gram negativo de tipo silvestre.
Se ha encontrado que el lípido A producido por el mutante htrB carece de uno o de ambos ácidos grasos (cadenas acilo no hidroxiladas o secundarias), rindiendo de ese modo la endotoxina en forma aislada o llevando el patógeno bacteriano gram negativo mutante la endotoxina que tiene sustancialmente reducida la toxicidad y aún conserva la antigenicidad, en comparación con el tipo silvestre. Puede usarse la endotoxina aislada de mutantes htrB o los mutantes htrB en sí mismos (vacunas de células completas) para inmunizar a individuos con riesgo de bacteriemia gram negativa, induciendo anticuerpos contra los determinantes antigénicos principales que residen en la estructura de carbohidratos de la cadena lateral específica O de LPS y la estructura de carbohidrato complejo de LOS. Adicionalmente, los mutantes htrB puede manipularse genéticamente para expresar antígenos heterólogos de otros patógenos microbianos en la superficie del mutante htrB para su presentación al sistema inmune de un individuo vacunado en una vacuna multivalente. También, la endotoxina aislada de los mutantes htrB de la presente invención puede usarse para generar anticuerpos específicos de LPS o LOS que pueden ser útiles para inmunización pasiva y como reactivos para un ensayo diagnóstico dirigido a detectar la presencia de patógenos bacterianos gram negativos en muestras
clínicas.
Breve descripción de las figuras
La Fig. 1 es una representación esquemática de la estructura general del lípido A de bacterias gram negativas de la familia Enterobacteriaceae.
La Fig. 2A es una representación esquemática de la estructura general de una especie de lípido A, del LOS de un mutante htrB, que comprende pentaacil difosforilo lípido A.
La Fig. 2B es una representación esquemática de la estructura general de una especie de lípido A, del LOS de un mutante htrB, que comprende el tetraacil difosforilo-lípido A.
La Fig. 3 es una gráfica que muestra la toxicidad relativa de un mutante htrB (\medcirc, \Delta) en comparación con bacterias de tipo silvestre (\boxempty) en un ensayo de liberación de TNF\alpha.
La Fig. 4 es una fotografía que muestra las células epiteliales respiratorias primarias sin estimular (control), expuestas a LOS de NTHi 2019 LOS o expuesta a LOS del mutante htrB, B29, y hechas reaccionar con una sonda fluorescente que hibrida con ARNm de TNF\alpha (sonda 1) o una sonda control fluorescente (sonda 2).
La Fig. 5 es una gráfica que muestra los valores medios de anticuerpo anti-LOS contra LOS de NTHi 2019 LOS (recubierto con antígeno) en ELISA de ratones inmunizados con HTHi 2019 (Mezcla 595), LOS de mutante htrB B29 (Mezcla 597) o LOS del mutante htrB B29 conjugado con una proteína transportadora (Mezcla 606) con adyuvante.
La Fig. 6 es una gráfica que muestra los valores medios de anticuerpo anti-LOS contra el LOS del mutante htrB B29 (recubrimiento con antígeno) en ELISA a partir de ratones inmunizados con NTHi 2019 (Mezcla 595), LOS del mutante htrB B29 (Mezcla 597) o LOS del mutante htrB B29 conjugado con una proteína transportadora (Mezcla 606), con adyuvante.
La Fig. 7 es una representación esquemática comparando las estructuras del lípido A de Salmonella de tipo silvestre y el lípido A del mutante htrB.
Descripción detallada de la invención Definiciones
"Endotoxina" es un término usado en este documento con el fin de referirse en la descripción y en las reivindicaciones a LPS o LOS de patógenos bacterianos gram negativos, en los que la endotoxina está en forma asociada a la célula o aislada. "Endotoxina de htrB" y "endotoxina de mutante htrB" se refiere a la endotoxina aislada y purificada de un mutante htrB de patógeno bacteriano gram negativo.
"Candidato para vacuna o antígeno para vacuna" es una expresión usada en este documento con el fin de referirse en la descripción y en las reivindicaciones a un epítope de endotoxina que tiene una o más de las siguientes propiedades (a-d): (a) es inmunogénico; (b) está expuesto en la superficie (lo que puede demostrarse por técnicas conocidas en la técnica incluyendo ensayos de inmunofluorescencia, procedimientos de tinción para microscopía electrónica y por ensayo bactericida); (c) induce anticuerpos que tiene actividad bactericida en presencia de complemento y/o función en los mecanismos de aclaramiento inmune; (d) induce anticuerpos que neutralizan otra actividad funcional del epítope (inmunogenicidad o toxicidad, etc.).
"Patógeno bacteriano gram negativo" es un término usado en este documento con el fin de referirse en la descripción y en las reivindicaciones a uno o más bacterias patogénicas (en humanos o animales) de un género y especie, incluyendo Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, otras especies de Haemophilus, Moraxella catarrhalis, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium, otras especies de Salmonella, Shigella dysenteriae, y otras especies de Shigella y Pseudomonas aeruginosa.
"Toxicidad sustancialmente reducida" es una expresión usada en este documento con el fin de referirse en la descripción y en las reivindicaciones a una reducción en la actividad biológica en al menos de 10 veces a 100 veces y más en comparación con la endotoxina de tipo silvestre.
"Proteína vehículo" es una expresión usada en este documento con el fin de referirse en la descripción y en las reivindicaciones a una proteína que se conjuga con la endotoxina del mutante htrB. Aunque parece que la endotoxina del mutante htrB es inmunogénica por sí misma, se conoce en la técnica que la conjugación de una proteína vehículo puede facilitar la inmunogenicidad. Las proteínas que pueden utilizarse según la invención, incluye cualquier proteína que sea segura para su administración a mamíferos y que pueda servir como una proteína vehículo inmunológicamente eficaz. En realizaciones en particular, pueden usarse proteína de la superficie celular, proteínas de membrana, toxinas y toxoides. Los criterios de seguridad podrían incluir la ausencia de toxicidad primaria y el riesgo mínimo de reacción alérgica. Los toxoides de difteria y del tétano cumplen por completo estos criterios; esto es, no son tóxicos si se preparan de forma adecuada y la incidencia de reacciones alérgicas es aceptablemente baja. Aunque el riesgo de reacción alérgica puede ser significativo en adultos, éste es mínimo en los niños.
Según realizaciones particulares adicionales de la invención, las proteínas vehículo apropiadas incluyen, pero no de forma limitante, la flagelina de Salmonella, pilina de Haemophilus, pili de Pseudomonas, exotoxina de Pseudomonas, proteínas de la membrana externa de Haemophilus (proteínas de membrana de 15 kDa, 28-30 kD y 40 Kda) o de N. meningitidis o de N. gonorrhoeae, enterotoxina termolábil LTB de Escherichia coli, toxina del cólera, neumolisina de S. pneumoniae y proteínas virales que incluyen VP7 de rotavirus y proteínas F y G del virus respiratorio sincitial. Adicionalmente, hay muchas proteínas vehículo conocidas en la técnica incluyendo, pero no de forma limitante, hemocianina de lapa de bocallave, albúmina de suero bovino y proteína mutante de reacción cruzada con la toxina diftérica ("CRM"). Adicionalmente, hay varios procedimientos conocidos en la técnica para conjugar la endotoxina con una proteína vehículo. Estos procedimientos pueden incluir, pero no de forma limitante, el uso de glutaraldehido, succinimidil m-maleimidobenzoato o 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida o usando una proteína vehículo bromoacetilada (véase, por ejemplo Robey y col., 1989, Anal. Biochem. 177:373-377). La conjugación de la endotoxina de htrB a una toxina proteica vehículo puede reducir la toxicidad de la toxina proteica vehículo, pero puede permanecer una toxicidad residual. Puede realizarse una detoxificación adicional por medios conocidos en la técnica tales como emplear formalina que reaccione con sus grupos amino libres de la toxina proteica
vehículo.
De forma alternativa, la toxina proteica vehículo nativa puede detoxificarse con formalina para producir un toxoide convencional antes de la conjugación con la endotoxina del mutante htrB. Sin embargo, el tratamiento previo con formalina reduce el número de grupos amino libres disponibles para la reacción durante el procedimiento de conjugación. Las CRM tienen la ventaja de no tener toxicidad inherente aún cuando ninguno de sus grupos amino esté ocupado por la formalina. En el caso de CRM197, que es inmunológicamente idéntica a la toxina nativa, el tratamiento con formalina (aunque no se necesario detoxificarla) potencia mucho la respuesta inmunológica. Se piensa que esto es debido a la estabilización de la molécula contra la degradación por mecanismos del organismo y/o a la agregación por entrecruzamiento (la inmunogenicidad de las partículas aumenta con el tamaño). Aunque la toxina tetánica y la toxina diftérica son proteínas vehículo deseables, hay muchas otras proteínas vehículo candidatas que también pueden ser adecuadas. Estas otras candidatas a vehículos incluyen toxinas y proteínas de Pseudomonas, Staphylococcus, Streptococcus, Pertussis y E. coli.
La conjugación con la endotoxina a proteínas vehículo puede realizarse por una diversidad de procedimientos tales como conjugación directa a la proteína vehículo con bromuro de cianógeno, aminación reductora o usando enlazadores bifuncionales. Estos enlazadores bifuncionales incluyen, pero no de forma limitante, enlazadores cistamina, glutaraldehido y diaminohexano a base de N-hidroxi succinimida. La endotoxina de htrB se modifica para contener grupos sulfidrilo usando enlazadores a base de N-hidroxi succinimida o usando la condensación de cistamina mediada por carbodiimida. A continuación, los compuestos intermedios de la endotoxina de htrB que contiene sulfidrilo reaccionan con una proteína vehículo que se ha derivatizado con bromo acetato de N-hidroxi succinimidilo. Preferiblemente, en la conjugación de la endotoxina de htrB, se exponen los grupos sulfidrilo para formar un enlace tiol con la proteína vehículo bromoacetilada.
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En una realización específica de la invención, la endotoxina del mutante htrB puede conjugarse con una proteína vehículo, tal como CRM, usando sulfo N-succinimidil 3-(2-piridiltio)-propionato de cadena larga para tiolar el grupo o grupos amino primarios de la endotoxina. Se añadió sulfo N-succinimidil 3-(2-piridiltio) propionato de cadena larga a aproximadamente 13 mg del componente sacárido de la endotoxina de htrB en NaHCO_{3}, pH 7,0 en una proporción de 1:1 (v/v) y se incubó durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, se purificó la mezcla por filtración en gel. Se unieron las fracciones derivadas con sulfo N-succinimidil 3-(2-piridiltio)-propionato de cadena larga. Los disulfuros de N-piridil presentes en las fracciones derivadas se redujeron con ditiotreitol 100 mM y se purificaron por filtración en gel. Después se recogieron las fracciones de endotoxina tiolada. CRM197 se bromoacetiló añadiendo N-hidroxi succinimida de ácido bromoacético en un pequeño volumen de dimetil formamida gota a gota sobre CRM (en NaHCO_{3}, 0,1 M) en una proporción de 1:1 (p/p) a 4ºC. La solución se mezcló e incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación se purificó la mezcla de reacción por filtración en gel y se recogieron las fracciones que contenía la proteína bromoacetilada. La derivatización de los grupos amino en la proteína vehículo a grupos bromoacetil se siguió por un descenso en la cantidad de grupos amino libres. Se añadió la RM bromoacetilada en NaHCO_{3} 0,1 M a la endotoxina del mutante htrB tiolada a una proporción 1:1,5 de proteína con respecto a endotoxina (p/p) en NaHCO_{3} 0,1 M/EDTA 1 mM y la reacción se incubó durante una noche a 4ºC. A continuación se purificó el conjugado final por filtración en gel en una solución salina tamponada con fosfato a
pH 6,9.
Los procedimientos y composiciones de la presente invención se refieren a las rutas biosintéticas de LPS y LOS de patógenos bacterianos gram negativos. Más específicamente, la presente invención se refiere a mutaciones en el gen htrB de patógenos bacterianos gram negativos que dan lugar a bacterias mutantes que llevan endotoxinas que han reducido sustancialmente su toxicidad y aún retiene la antigenicidad, en comparación con bacterias de tipo silvestre de la misma especie.
La genética de biosíntesis del lípido A de bacterias entéricas, según como se conocía en el momento de la presente invención, se resume en Schnaitman y Klena (1993, Microbiol. Rev. 57:655-682). Los genes lpxA, lpxB, lpxC y lpxD codifican productos génicos cuya función en el esqueleto de glucosamina del lípido A incluye la transferencia de ácido \beta-hidroximirístico a la glucosamina. El gen htrB se describió como un gen que afecta a la estructura central interna (KDO, heptosa, fosforiletanolamina (PEA)) y que se describió durante una selección de genes necesarios para el crecimiento de Escherichia coli a temperaturas elevadas. Las mutaciones de anulación genética de htrB daban lugar a mutantes de E. coli que mostraban una sensibilidad reducida al desoxicolato, una incapacidad para crecer a temperaturas por encima de 32,5ºC y un descenso en la intensidad de la tinción para LPS (Schnaitman y col., 1993, supra; Karow y col., 1992, J. Bacteriol. 174:7407-7418). Karow y col., además informaron de que entre aproximadamente 30ºC y aproximadamente 42ºC, los mutantes htrB de E. coli cambiaban la composición de ácidos grasos tanto de LPS como de fosfolípidos, y en especial, sobreproducían fosfolípidos, en comparación con el tipo silvestre. Sin embargo, no se conocía ni se había sugerido que en los mutantes htrB faltaba una o más de las al menos seis moléculas de ácidos grasos unidos a éster o a amida en la porción del lípido A de LPS. Tampoco se había mencionado que los mutantes htrB contenían un resto de lípido A que carecía específicamente de uno o ambos ácidos grasos no hidroxilados (cadena acilo secundaria) responsables de la endotoxicidad; es decir, que el mutante htrB contenía una endotoxina alterada que exhibía toxicidad reducida in vivo, pero retenía la antigenicidad ("endotoxina de htrB") cuando se comparaba con el tipo silvestre.
Los hallazgos que comprenden la presente invención incluyen los resultados inesperados de que las mutaciones de anulación del gen htrB de bacterias gram negativas (incluyendo la familia Enterobacteriaceae) dan lugar a mutantes htrB que específicamente carecen de uno o más ácidos grasos de cadena acilo secundaria que están unidos a través de éster a los grupos hidroxilo de dos de las cuatro moléculas de \beta-OH (como se muestra en la Fig. 2). De este modo, parece que la proteína HtrB tiene actividad aciltransferasa o, directa o indirectamente, afecta a la regulación de la actividad aciltransferasa. Los ejemplos siguientes se presentan para ilustrar realizaciones preferidas de aspectos de la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención. En particular, una realización preferida es la producción de un mutante htrB de H. influenzae y los procedimientos para usar éste como una célula completa o para aislar a partir de aquí la endotoxina, en preparaciones para vacunas o para generar anticuerpos para aplicaciones terapéuticas o diagnósticas. Sin embargo, puesto que el resto del lípido A está altamente conservado entre bacterias de la familia Enterobacteriaceae y bacterias gram negativas estrechamiento relacionadas, la invención se refiere a patógenos bacterianos gram negativos, como se define previamente en este documento. Desde el punto de vista de la longitud de la cadena acilo secundaria hay microheterogeneidad (cadenas de 12 a 14 carbonos) y en el que se han sustituido los cuatro \beta-OH (1, 2 ó 4) (Erwin y col., 1991, Infect Immun 59:1881-1887); sin embargo, la naturaleza de la sustitución es la misma y de este modo, las etapas particulares (genes y productos génicos) implicadas en la ruta de biosíntesis parecen conservarse. Por ejemplo, la eliminación de las cadenas acilo secundarias a partir de diversos patógenos bacterianos gram negativos (E. coli, H. influenzae, P. aeruginosa, S. typhimurium y N. meningitidis) usando la aciloxiacilo hidrolasa humana, daba lugar a LPS desacetilados a partir de todas las especies ensayadas que tenían la actividad mitogénica significativamente reducida (Erwin y col., 1991, supra) en comparación con la respectiva cepa de tipo silvestre.
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Ejemplo 1 Identificación de un gen htrB y generación de mutantes htrB
Complementando la cepa 2019 no tipable de H. influenzae con la cepa mutante rfaE de S. typhimurium, se clonó el gen rfaE de la cepa 2019 de H. influenzae (Lee y col., 1995 Infect Immun. 63:818-824). El análisis de la secuencia de la región secuencia arriba del gen rfaE de H. influenzae reveló un marco de lectura abierto con alta homología con el gen htrB de E.coli. El gen htrB de H. influenzae está compuesto de 933 bases y codifica una proteína, HtrB, de 311 aminoácidos (SED ID Nº 1) y un tamaño molecular estimado de 36 kilodaltons (kDa). La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida de la HtrB de H. influenzae con la HtrB de E. coli revela una homología compartida (56% de identidad y 73% de similitud). La clonación del gen htrB de H. influenzae en un plásmido y, posteriormente, un análisis de transcripción-traducción in vitro, reveló que HtrB tiene un tamaño molecular aparente de 32-33 kDa.
Existen diversas técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia para mutar un gen bacteriano. Las técnicas incluyen mutagénesis dirigida a sitio y mutagénesis lanzadera usando transposones. En un aspecto de esta realización, la mutagénesis del gen htrB se realizó por mutagénesis lanzadera. Se usó un derivado del transposón bacteriano Tn3, el mini-Tn3 (Seifert y col., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:735-739) como secuencia de inserción para mutar el gen htrB. Se clonó un fragmento BglII de 2,4 kilobases (Kb), que contenía el gen htrB de H. influenzae, en un plásmido que se usó como diana para una mutagénesis por el transposón mini-Tn3. Brevemente, en una única célula bacteriana (E. coli), se introduce el plásmido que contiene el gen htrB; un plásmido inmune a la transposición de Tn3 y que contiene la transposasa (que media en la integración conjunta de Tn3 y las moléculas diana) y un plásmido que contiene mini-Tn3.
Tras permitir la transposición, las células bacterianas se juntaron con una cepa de E. coli que contiene la enzima cre que se usa para determinar los cointegrados en la mutagénesis lanzadera. Los transconjugados se seleccionaron con antibióticos (kanamicina, ampicilina y estreptomicina) y se analizaron por digestión con endonucleasas de restricción.
Se insertaron dos plásmidos, denominados pB28 y pB29, cada uno con un transposón mini-Tn3 que contenían el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) en el marco de lectura abierto en una localización diferente. Se usó cada plásmido para transformar la cepa 2019 de H. influenzae no tipable y se seleccionaron las células bacterianas transformantes por crecimiento en presencia de cloranfenicol (1,5 \mug/ml), dando lugar a la identificación de cepas mutantes denominadas NTHi B28 y B29, respectivamente. Las localizaciones de la inserción mTn3 en los cromosomas de los mutantes NTHi se reconfirmaron por hibridación genómica de tipo Southern usando el fragmento BglII de 2,4 kb como sonda. En particular, un digerido BglII del ADN de la cepa 2019 de NTHi dio lugar a un fragmento de 2,4 kb; mientras que digestiones similares del ADN de los mutantes B28 y B29 de NTHi ponían de manifiesto fragmentos de 4,0 kb. Adicionalmente, los fragmentos de 4,0 kb se digirieron con EcoRI que está presente en el mTn3.
De forma alternativa, son conocidos en la técnica los procedimientos para realizar mutagénesis dirigida a sitio en un gen bacteriano (véase por ejemplo, Halladay, 1993, J. Bacteriol. 175:684-692) y para la recombinación del gen bacteriano mutado en el cromosoma bacteriano. Puede usarse un casete de resistencia a la kanamicina seleccionable para insertar, y mutar, dentro del gen htrB contenido en un plásmido lanzadera. La posterior transformación de una célula hospedadora bacteriana con el plásmido lanzadera y la recombinación del genoma bacteriano (en el sitio de la copia genómica del gen htrB) con el casete por medio de las secuencia que flanquean a htrB, da lugar a la mutagénesis dirigida a sito del gen htrB bacteriano.
Puede usarse el análisis de la extensión de cebador para determinar la región promotora del gen htrB. La región promotora del gen htrB de H. influenzae se determinó por análisis de la extensión del cebador por crecimiento primario de la bacteria, recogida y purificación del ARN, y usando un kit comercial de extensión del cebador según las recomendaciones del fabricante. Se encontró un único sitio de transcripción usando un cebador (ID SEC Nº 2) complementario con la región 5' del marco de lectura abierto de htrB. El primer nucleótido era un resto de citosina (C) localizado 21 pb secuencia arriba del supuesto sitio de inicio de la traducción, ATG. La región secuencia arriba del sitio de inicio de la transcripción contenía una secuencia (ID SEC Nº 1, bases 13 a 19) similar a la región -10 de los promotores dependiente del \sigma^{70} bacteriano a una distancia apropiada. Un elemento (ID SEC Nº 1, bases 1 a 6) recuerda a la secuencia consenso de la región -35.
Ejemplo 2 Caracterización de los mutantes htrB Características de crecimiento
Inicialmente, se seleccionaron las cepas B28 y B29 de NTHi a 30ºC y se dejaron crecer a 37ºC. Con pases adicionales a 30ºC, los mutantes htrB de NTHi empezaron a perder sensibilidad a la temperatura y a 37ºC mostraron una lenta tasa de crecimiento, en comparación con NTHi 2019. Sin embargo, se mantenía la sensibilidad a la temperatura en los mutantes htrB a temperaturas de crecimiento iguales o superiores a 38,5ºC.
Se ha informado previamente de que los mutantes htrB de E. coli mostraban un cambio en la permeabilidad de la membrana a diversos compuestos incluyendo la kanamicina y el desoxicolato (Karow y col., 1992, supra). También se ensayó la sensibilidad de los mutantes htrB de NTHi a la kanamicina y al desoxicolato. A continuación, se diluyeron los cultivos realizados durante una la noche a 30ºC y se cultivaron en presencia de 5 \mug/ml de kanamicina a 30ºC o 37ºC. A 30ºC, no se detectaron diferencias en la tasas de crecimiento entre NTHi 2019 y las cepas mutantes htrB de NTHi en ausencia de kanamicina. Sin embargo, el crecimiento de los mutantes htrB se inhibía de forma significativa en presencia de kanamicina, mientras que NTHi 2019 no estaba afectada. En los mutantes htrB, la sensibilidad a la kanamicina era incluso mayor a 37ºC, ya que los mutantes no mostraban crecimiento en presencia de kanamicina a 37ºC. Asimismo, al 30ºC los mutantes htrB mostraban sensibilidad a concentraciones mayores de 500 \mug/ml de desoxicolato, cuando se comparaba con la cepa 2019 de NTHi y no crecía a 1000 \mug/ml. A 37ºC, los mutantes htrB mostraban casi una inhibición completa del crecimiento en presencia de sólo 250 \mug/ml de desoxicolato.
Características de la endotoxina
El LPS de los mutantes htrB de E. coli se caracterizó porque se teñía débilmente en geles de poliacrilamida teñidos con plata, pero su patrón de migración no variaba en comparación con el LPS de tipo silvestre. Por el contrario, los LOS de los mutantes B28 y B29 de NTHi migraban más rápido que la cepa 2019 de NTHi en geles teñidos con plata. De forma adicional, los LOS de los mutantes B28 y B29 mostraban un color parduzco en lugar de negro, como mostraban NTHi 2019. La reconstitución del mutante B29 de NTHi, introduciendo en el mutante un plásmido con un gen htrB intacto, confirmó que las diferencias en las características de crecimiento y en la migración y tinción de LOS eran debidas a la mutación del gen htrB.
Se analizaron el LOS del mutante htrB de NTHi y el LOS de tipo silvestre, cada uno por espectrometría de masas con ionización por electronebulización (ESI-MS) para proporcionar los perfiles de masa molecular de los diferentes componentes del LOS. En primer lugar, se aislaron los LOS de las respectivas cepas. LPS o LOS pueden aislarse por el procedimiento de fenol-agua (Westphal y col., 1965, Methods in Carbohydrate Chemistry 5: 83-91) o usando un procedimiento alternativo de purificación (usando una proteasa; Hitchcock y col., 1983, J. Bacteriol. 154:269-277). A continuación, se O-desacilaron las especies de LOS aisladas por tratamiento suave con hidrazina (37ºC durante 20 minutos; véase Phillips y col., 1990 Biomed. Environ. Mass. Spectrom. 19:731-745). El análisis por ESI-MS de las diferentes especies de LOS mostraba que mientras que los LOS O-desacilados del mutante B-29 de NTHi y NTHi 2019 eran similares en su perfil de masa molecular, pueden distinguirse claramente dos diferencias. En el mutante htrB, hay un descenso (reducción del 50%) en la cantidad de LOS que contiene dos fosfoetanolaminas (PEA) en la estructura central interior; y hay un cambio en el peso molecular de las especies de LOS que contiene más hexosas. Estos hallazgos sugieren que el grado de fosforilación puede afectar a la progresión de la cadena a partir de restos de heptosa específicos y que HtrB directa o indirectamente afecta a la fosforilación del LOS.
Se usó espectrometría de masas para analizar el lípido A. Más específicamente, se analizaron los lípidos A del LOS de mutante htrB y del LOS de tipo silvestre cada uno por espectrometría de masa iónica secundaria líquida (LSIMS) en el modo de ión negativo para proporcionar un espectro de iones moleculares de los diferentes componentes del lípido A. En primer lugar, se hidrolizó cada especie de LOS en ácido acético al 1% durante 2 horas a 100ºC a una concentración de 2 mg/ml. Se centrifugaron los hidrolizados y se retiraron los sobrenadantes. Las fracciones del crudo de lípido A soluble en agua se lavaron dos veces en agua y una vez en una mezcla orgánica (cloroformo/metanol/agua; en volumen 2:1:1) y, a continuación, se evaporaron hasta su desecación. Para el análisis, se redisolvieron las muestras de lípidos en CH_{2}Cl_{2}/CH_{3}OH (3:1, v/v) y 1 \mul de nitro-benzilalcohol/trietanolamina (1:1. v/v) y se aplicó como una matriz líquida en un espectrómetro de masas. El LSIMS del tipo silvestre (NTHi 2019) mostró un espectro que contenía dos iones moleculares desprotonados que concordaban con la estructura hexaacil del lípido A que contenía uno (hexaacil monofosforil-lípido A, P_{m} =1744) o dos fosfatos (hexaacil difosforil-lípido A, P_{m} = 1824). Este espectro es esencialmente idéntico al de la estructura informada del lípido A del LOS de H. ducreyi (Melaugh y col., 1992, J. Biol. Chem. 267:13434-13439). Se cree que los fragmentos de baja masa son iones que surge de la fragmentación inducida por LSIMS de las especies iónicos mono y difosforiladas de mayor masa.
Por el contrario, el espectro LSIMS de la preparación del lípido A del LOS del mutante htrB carece de iones moleculares correspondientes a la especie de hexaacil-lípido A de tipo silvestre. Hay dos iones de mayor masa que se corresponden con los iones moleculares para las especies mono y pentaacil difosforil-lípido A que han perdido una de las cadenas acilo secundarias (por ejemplo, resto de ácido mirístico). Adicionalmente, en las masas menores hay dos especies iónicas moleculares adicionales que corresponden con una especie mono y difosforil tetraacil-lípido A carente de ambas cadenas acilo secundarias. En resumen, la estructura del lípido A del LOS de tipo silvestre es hexaacilo; mientras que la estructura del lípido A del mutante htrB muestra dos especies, una especie tetraacilo (Fig. 2A) y un petaacilo (Fig. 2B) indicando la pérdida de al menos una, y algunas veces de ambas cadenas acilo secundarias. El mutante htrB está compuesto de aproximadamente el 90% de tetraacil-lípido A con sólo los cuatro ésteres del ácido hidroximirístico y ácidos grasos unidos a amida y aproximadamente el 10% de pentaacil-lípido A con una sustitución de ácido mirístico.
Ejemplo 3 Toxicidad sustancialmente reducida de mutantes htrB
El efecto debido a la carencia de una o más cadenas acilo secundarias en la toxicidad de un patógeno bacteriano gram negativo se examinó usando un ensayo convencional in vitro para medir la toxicidad in vivo. La línea celular similar a macrófagos murinos J774, cuando se estimulan con endotoxina, secreta TNF\alpha. La cantidad de TNF\alpha, directamente proporcional a la toxicidad de LPS o LOS estimulantes, puede medirse (a) retirando el sobrenadante libre de células que contiene el TNF\alpha; (b) añadiendo el sobrenadante a una línea celular sensible a TNF\alpha, tales como WEHI 164 y (c) midiendo la citotoxicidad resultante (véase, por ejemplo, Espevik y col., 1986, J Immunol Methods 95:99; Sakurai y col., 1985, Cancer Immunol Immunother 20:6-10; Adams y col., 1990, J Clin Microbiol 28:998-1001; Adams y col., 1990, J. Leukoc Biol 48:549-56; Tsai y col., 1992, Cell Immunol 144:203-16 y Pfister y col., 1992, Immunol 77:473-6).
En este ensayo, las células adherentes J774 se retiraron del cultivo, se lavaron con PBS-EDTA 1 mM y después, se lavaron dos veces con medio de cultivo tisular completo sin antibióticos. Se incubaron de 2 x 10^{6} a 4 x 10^{6} células J774/placa de cultivo de 100 mm en medio de cultivo tisular durante una noche en un incubador de CO_{2}. Se retiraron las células adherentes J774 con PBS-EDTA 1 mM, se lavaron tres veces en medio de cultivo tisular y se ajustaron a 5 x 10^{5}/ml. Se añadieron alícuotas de 50 \mul por pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo redondo. A continuación, la placa se incubó durante 1 hora a 37ºC en un incubador de CO_{2}. En cada pocillo se añade un mutante htrB o la cepa de tipo salvaje, a diversas unidades formadoras de colonias (ufc, dosis de infección). Después, la placa se incuba a 37ºC durante 1 hora en un incubador de CO_{2}. Tras la incubación, se añaden en cada posillo 100 \mul de medio de cultivo que contiene gentamicina a 50 \mug/ml. A continuación, la placa se incuba durante una noche a 37ºC en un incubador de CO_{2}. Se recogieron alícuotas de 50 \mul por pocillo del sobrenadante de J774 y se transfirieron a pocillos de una placa de 96 pocillos de fondo plano. Se hicieron diluciones seriadas 1:10 del sobrenadante de J774. Se incluyeron como control una dilución seriada de TNF\alpha recombinante (rTNF\alpha). Se añaden 50 \mul del clon 13 de células WEHI 164 en cada pocillo a 6x10^{5} células/ml en medio de cultivo tisular + LiCl 25 mM + actinomicina D a 2 \mug/ml y la mezcla se incubó durante una noche a 37ºC en un incubador de CO_{2}. Tras la incubación, se añaden 10 \mul de azul de alomar y 5-7 horas después se lee la densidad óptica a 570 nm. El ensayo utiliza azul de alamar como un indicador de color, es decir, las células vivas convierten el azul de alamar a un color rojo pero permanece azul si las células están muertas.
La Fig: 3 muestra una comparación entre el número de células bacterianas de la cepa 2019 de H. influenzae (tipo silvestre, \boxempty) y de células bacterianas del mutante htrB B29 de NTHi (\medcirc y \Delta) necesarias para estimular la liberación a partir de células J774 de suficiente TNF\alpha para matar la línea celular susceptible a TNF\alpha WEHI 164. B29_{hi}(\Delta) y B29_{lo} (\medcirc) se refieren a un numero alto (>3) y número bajo (<3) de pases de mutante htrB, respectivamente. Como se muestra en la Fig. 3, el mutante htrB muestra una capacidad reducida para estimular la libración de TNF\alpha; es decir, entre una reducción de aproximadamente 10 veces (B29_{lo}) a una reducción de aproximadamente 100 veces (B29_{hi}). Esta capacidad reducida para estimular TNF\alpha es una indicación de que los mutantes htrB tiene sustancialmente reducida la toxicidad debido a la falta de una o más cadenas acilo secundarias en la porción del lípido A de la endotoxina.
También se ha examinado el efecto debido a la pérdida de una o más cadenas acilo secundarias en la toxicidad de un patógeno bacteriano gram negativo usando un ensayo convencional in situ para medir la toxicidad in vivo. Las células epiteliales respiratorias humanas transformadas por SV-40 y las células epiteliales respiratorias primarias humanas, cuando se estimulan con endotoxina, producen TNF\alpha; esta producción puede demostrarse con la detección del ARNm de TNF\alpha usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia para la hibridación in situ (una modificación de MacNaul y col., 1990, J. Immunol. 145:4154-66). Las células se cultivan en monocapa en pocillos de una placa de 24 pocillos hasta aproximadamente la confluencia. Para estimular las células, se añade 1 \mug/ml de LOS y las células se incuban durante una noche a 37ºC. Se añade un contraste (por ejemplo, tinción de membrana) y después, las células se fijan con 0,5 ml de paraformaldehido al 2% en tampón de modo que el contraste se fija directamente a las células. A continuación se lleva a cabo la hibridación usando una sonda oligonucleotídica específica para el ARN de TNF\alpha (SED ID Nº 4) y una sonda control (SED ID Nº 5). La cantidad de ARNm de TNF\alpha detectado visualmente es directamente proporcional a la toxicidad del LPS estimulante. El ARNm de TNF\alpha se inducía mínimamente en las células epiteliales respiratorias humanas transformadas con SV-40 y en las células epiteliales respiratorias primarias humanas (Fig. 4), expuestas al LOS aislado del mutante htrB B29 de NTHi. Esto está en contraposición con el LOS aislado de la cepa parental 2019 de NTHi que induce altos niveles de ARNm de TNF\alpha en estas células respiratorias humanas (Fig. 4) y en líneas celulares.
La reducción sustancial de la toxicidad mostrada por el mutante htrB, como se observa en los ensayos de TNF\alpha, debido a la falta de uno o más cadenas acilo secundarias está además apoyado por ensayos informados previamente de la actividad biológica de la endotoxina tratada con aciloxiacil hidrolasa que elimina selectivamente las cadenas acilo secundarias de la endotoxina. Las endotoxinas desaciladas de E. coli, H. influenzae, N. meningitidis y S. typhimurium tenían (a) reducida de forma similar, en relación con las respectivas endotoxinas de tipo silvestre, su potencia en el ensayo del lisado de Limulus (b) reducida la capacidad para estimular la adherencia de neutrófilos a células endoteliales humanas en relación con las respectivas endotoxinas de tipo silvestre y (c) reducida la actividad mitogénica en esplenocitos murinos (Erwin y col., 1991, Infect Immun 59:1881-1887); y aún mantenían una expresión de epítopes antigénicos. De forma similar, el LPS de S. typhimurium tratado con aciloxiacil hidrolasa mostraba una reducción de 100 veces o más en la toxicidad en una reacción dérmica de Shwartzman; era menos pirogénica en un modelo de respuesta térmica; mostraba una reducción de 5 a 12 veces en la mitogenicidad de células B y mostraba una reducción de 10 a 20 veces en la liberación de prostaglandina E_{2}, cuando se compara con la endotoxina de tipo silvestre, concluyendo que el LPS desacilado al máximo era al menos 10 veces menos tóxico que la endotoxina de tipo silvestre (Patente de EE.UU. Nº 4.929.604).
Ejemplo 4 Uso de mutantes htrB como inmunógenos
En un aspecto de esta realización, el mutante htrB de un patógeno bacteriano gram negativo se usa como vacuna de células completas. El beneficio de usar bacterias vivas atenuadas (debilitadas en su capacidad para causar patogénesis) como inmunógeno en una fórmula para vacunación es que son capaces de sobrevivir y pueden persistir en el cuerpo del humano o del animal y, de este modo, conferir inmunidad prolongada contra la enfermedad. Junto con el beneficio de usar una bacteria viva para prolongar la respuesta inmune, los mutantes htrB de patógenos bacterianos gram negativos tienen el beneficio añadido de que muestran una toxicidad sustancialmente reducida. Otra ventaja, cuando se compara con una formulación para vacuna que comprende un péptido aislado que representa un antígeno bacteriano, es que un antígeno bacteriano expresado en la superficie de una célula bacteriana a menudo dará lugar a una estimulación mayor de la respuesta inmune. Esto es debido a que la superficie de las bacterias de la familia Enterobacteriaceae actúa como un adyuvante natural para potenciar la respuesta inmune contra un antígeno presentando en ésta (Wezler, 1994, Ann NY Acad Sci 730:367-370). De este modo, el uso de una vacuna bacteriana viva, tal como un mutante htrB, para expresar proteínas completas en conformación nativa (es decir, como parte de la membrana bacteriana externa) es probablemente para desencadenar una respuesta inmune más protectora que sólo con una proteína aislada.
Los vectores de vacunas bacterianas vivas de la familia Enterobacteriaceae que se han descrito previamente incluyen cepas de Salmonella atenuadas (Strocker y col., Patentes de EE.UU. Nº. 5.210.035, 4.837.151 y 4.735.801 y Curtiss y col., 1988, Vaccine 6:155-160; incorporadas en este documento como referencia) y Shigella flexneri (Sizemore y col., 1995, Science 270:299-302; incorporada en este documento como referencia). Una realización preferente es proporcionar un sistema de suministro de vacunas para patógenos de la mucosa humana o animal (dependiendo del género y especie de patógeno bacteriano gram negativo). De este modo, la inmunización por vía parenteral o por vía mucosa con una cantidad profilácticamente eficaz del mutante htrB o de un mutante htrB transformado para expresar de forma recombinante antígenos bacterianos adicionales (que no afecta de forma negativa al crecimiento o replicación del mutante htrB transformado), puede llevar a la colonización de las superficies mucosas para inducir inmunidad en mucosas contra los antígenos expuestos en la superficie o secretados por el mutante htrB. El mutante htrB resultante puede usarse en una formulación para vacuna que exprese el antígeno o antígenos bacterianos.
Pueden usarse procedimientos similares para hacer una formulación para vacuna del mutante htrB inactivado, excepto si el mutante htrB se inactiva, tal como por medios químicos conocidos en la técnica, previamente a su uso como inmunógeno y sin que afecte sustancialmente a la inmunogenicidad del inmunógeno o inmunógenos expresados. Por ejemplo, se ha estimulado la inmunidad de la mucosa bronquial humana con una vacuna aerosol que comprende H. influenzae lisado (Latil y col., 1986, J Clin Microbiol 23:1015-1021). También puede formularse una vacuna de mutante htrB vivo o una vacuna de mutante htrB inactivado con un adyuvante adecuado para potenciar de forma adicional la respuesta inmunológica del antígeno o antígenos expresados por el vector para vacunas, como se describirá más en detalle.
En otro aspecto de esta realización, se aísla la endotoxina a partir del mutante htrB usando procedimientos conocidos en la técnica y se usa la endotoxina htrB aislada en una formulación para vacuna. Como se ha mencionado previamente, se cree que los determinantes antigénicos principales de bacterias gram negativas residen en la estructura del carbohidrato de la cadena lateral específica O de LPS y la estructura del carbohidrato complejo del LOS. Sin embargo, la naturaleza química de LPS y LOS previene el uso de estas moléculas en formulaciones para vacunas; es decir, la inmunización activa con LPS o LOS es inaceptable debido a la toxicidad inherente de las cadenas acilo secundarias de la porción del lípido A de la endotoxina. La endotoxina aislada a partir de un mutante htrB de un patógeno bacteriano gram negativo carece de una o más cadenas acilo secundarias y, de este modo, muestran la toxicidad sustancialmente reducida en comparación con la endotoxina aislada a partir de la bacteria de tipo silvestre. Por tanto, puede usarse la endotoxina aislada de un mutante htrB de un patógeno bacteriano gram negativo en una formulación para vacuna para inducir inmunidad contra el patógeno bacteriano gram negativo de tipo salvaje. Pueden aislarse el LPS o el LOS por el procedimiento de fenol-agua (Westphal y col.., 1965, Methods in Carbohydrate Chemistry 5:83-91) o usando un procedimiento de purificación alternativo (usando una proteasa; Hitchcock y col, 1983, J. Bacteriol 154:269-277).
Se conocen muchos procedimientos para la introducción de una formulación para vacuna en el humano o animal (colectivamente denominado como "individuo") que va a vacunarse. Estos incluyen, pero no de forma limitante, administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, ocular, intranasal y oral. De forma convencional, las formulaciones para vacuna contiene bacterias vivas, o bacterias atenuadas o inactivadas, se administran por inyección o por administración oral. Por ejemplo, puede estimularse la inmunidad respiratoria por inmunización intestinal con antígenos de H. influenzae purificados (Cripps y col., 1992, J. Infect Dis 165S1:S199-201).
La formulación para vacuna puede comprender una solución fisiológicamente aceptable como vehículo en el cual se suspenden las células bacterianas del mutante htrB o la endotoxina aislada del mutante htrB. Se pueden usar diversos adyuvantes junto con las formulaciones para vacuna. Los adyuvantes ayudan a modular la respuesta inmune y a conseguir un nivel de inmunidad más duradero y más elevado usando cantidades más pequeñas de antígeno para vacuna o menos dosis que si se administrase sólo el antígeno para vacuna. Los ejemplos de adyuvantes incluyen el adyuvante incompleto de Freund, adyuvante 65 (que contiene aceite de cacahuete, monooleato de manida y monoestearato de aluminio), emulsiones de aceite, adyuvante de Ribi, los polioles de Pluronic, poliaminas, Avridina, Quil A, saponina, MPL; QS-21 y geles minerales tales como hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, etc. La formulación para vacuna se administra en una cantidad profilácticamente eficaz para ser inmunogénica que depende de factores que incluyen la capacidad del individuo para desarrollar una respuesta inmune, el grado de protección que se va a inducir y la vía de administración.
La formulación para vacuna de la invención puede administrarse por vía oral incluyendo ésta como parte de la comida dada al ganado de importancia económica. Como es conocido por los expertos en la materia, las especies de Haemophilus, Campylobacter, Pseudomonas y Salmonella son patogénicas para el ganado de importancia económica. Usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los siguientes ejemplos, pueden producirse mutantes htrB de estos patógenos animales. Pueden usarse los mutantes htrB resultantes, o las endotoxinas aisladas a partir de éstos, en una formulación para vacuna. Previamente se ha descrito el uso en la alimentación animal de formulaciones para vacunas, que contienen uno o más antígenos de diversos patógenos microbianos (Véase por ejemplo, Pritchard y col., 1978, Avian Dis 22:562-575).
Ejemplo 5 Mutantes htrB de H. influenzae como inmunógenos
En una realización, el mutante htrB es un mutante htrB de H. influenzae. Haemophilus influenzae es un patógeno importante del tracto respiratorio humano en enfermedades que incluyen otitis media, sinusitis crónica y enfermedad pulmonar obstructiva crónica. Ciertos componentes bacterianos expuestos en la superficie, incluyendo P2, P6 y LOS, parecen ser los antígenos que pueden conferir una respuesta inmune protectora en humanos inmunizados. Se ha demostrado que estos antígenos han sido las dianas de los anticuerpos bacterianos y la presencia de anticuerpo bactericida en el suero se asocia con la protección para la infección por H. influenzae (Faden y col., 1989; J. Infect. Dis. 160:999-1004).
5.1 En un aspecto de esta realización, la endotoxina aislada de un mutante htrB se usa como el inmunógeno en una formulación para vacuna. Como se ha demostrado en el ejemplo 3 de este documento, la endotoxina aislada de un mutante htrB de un patógeno bacteriano gram negativo carece de una o más cadenas acilo secundarias y, de este modo, muestra una toxicidad sustancialmente reducida en comparación con la endotoxina aislada de la respectiva bacteria de tipo silvestre. Además, puede usarse la endotoxina aislada de un mutante htrB de H. influenzae en una formulación para vacuna para inducir inmunidad contra la cepa respectiva de tipo silvestre. El LOS del mutante htrB puede aislarse por un procedimiento de aislamiento de LOS conocido por los expertos en la materia. El LOS del mutante htrB puede usarse en una formulación para vacuna que contiene uno o más agentes seleccionados entre el grupo compuesto por un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una solución fisiológica), un adyuvante o una proteína vehículo.
Se usó un modelo de ratón para ilustrar los efectos de la inmunización con LOS del mutante htrB. Se aislaron el LOS de NTHi 2019 y el LOS del mutante htrB B29 de NTHi, cada uno de sus cepas respectivas usando el procedimiento de fenol-agua. Se inmunizaron grupos de al menos 5 ratones Swiss Webster por vía subcutánea con 1 \mug de NTHi 2019, de LOS del mutante htrB B29 o del mutante htrB conjugado con una proteína vehículo con adyuvante QS-21. Se recogieron sueros de cada grupo 5 semanas después de la inmunización y se mezclaron los sueros de los animales incluidos en un grupo. Se evaluó el valor de anticuerpo anti-LOS en los sueros mezclados por un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima (ELISA). Los pocillos de microvaloración de las placas de ELISA se recubrieron con 10 \mug de NTHi 2019 o del LOS del mutante htrB B29. La Fig. 5 ilustra los valores medios de anticuerpo anti-LOS contra el LOS de NTHi 2019 (antígeno de recubrimiento) en ELISA de ratones inmunizados con NTHi 2019 (Mezcla 595), con LOS del mutante htrB B29 (Mezcla 597) o con LOS del mutante htrB B29 conjugado con una proteína vehículo (Mezcla 606). La Fig.6 ilustra los valores medios de anticuerpo anti-LOS contra el LOS del mutante htrB B29 (recubrimiento con antígeno) en ELISA a partir de ratones inmunizados con NTHi 2019 (Mezcla 595), con LOS del mutante htrB B29 (Mezcla 597) o con LOS del mutante htrB B29 conjugado con una proteína vehículo (Mezcla 606). También se incluyó el suero preinmune como control ("semana 0" o "tiempo 0").
A continuación se ensayó la actividad funcional del anticuerpo inducido por las diferentes preparaciones de LOS realizando ensayos bactericida usando NTHi 2019 como diana. Se añadieron 0,150 ml de tampón en los pocillos de placas de 96 pocillos, 0,040 ml de sueros humanos recogidos conjuntamente como fuente de complemento y 0,01 ml de NTHi 2019. Típicamente, el organismo se siembra sobre placas diluido (por ejemplo, de 20 a 200 ufc). En los pocillos de ensayo se añadieron los antisueros respectivos sin diluir ("puro"), dilución 1/10 o dilución 1/100. A continuación las placas se hicieron rotar enérgicamente (175-200 rpm) a 37ºC durante 30 minutos. Se sembraron sobre placas alícuotas de los pocillos respectivos en medio y se crecieron para determinar el porcentaje de supervivencia y el logaritmo de muerte. El logaritmo de muerte se calcula como el log (ufc 30 minutos/ufc tiempo 0). Los resultados del ensayo bactericida se muestran en la Tabla 1, donde el Grupo R595 son los antisueros inducidos por el LOS de NTHi 2019, el Grupo R597 son los antisueros inducidos por el LOS del mutante htrB B29 y el grupo R606 son los antisueros inducidos por el LOS del mutante htrB B29 conjugada con una proteína vehículo.
TABLA 1
Grupo semana dilución % de supervivencia log de muerte
R595 0 puro 1,00 -1,99
1/10 37,30 -0,43
1/100 87,20 -0,06
5 puro - -4,49
1/10 0,07 -3,15
1/100 20,20 -0,70
7 1/10 - -4,62
1/100 7,80 -1,11
R597 0 puro 3,50 -1,46
1/10 62,40 -0,20
1/100 108,60 0,04
5 puro - -4,49
1/10 4,40 -1,36
1/100 82,40 -0,08
7 1/10 - -4,49
1/100 99,80 0,00
R606 0 puro 0,13/110,5 -2,87/0,92
1/10 130,20 0,11
1/100 106,50 0,03
5 puro 1,5/0,1 -1,81/-2,9
1/10 25,10 -0,60
1/100 164,10 0,22
7 1/10 0,04 -3,44
1/100 185,90 0,27 
\vskip1.000000\baselineskip
Cuanto mayor es el log de muerte (el número más negativo, por ejemplo -4,49), mayor es la actividad bactericida del anticuerpo respectivo. De este modo, con fines comparativos, a la semana 7 y a una dilución 1/10, el log de muerte del antisuero inducido por el LOS de NTHi 2019 es -4,62, el log de muerte para el antisuero inducido por el LOS del mutante htrB B29 de NTHi es -4,49 y el log de muerte del antisuero inducido por LOS del mutante htrB B29 conjugado con la proteína vehículo es -3,44. Por ELISA, parece que los anticuerpos inducidos por el LOS del mutante htrB B29 tienen un valor de anticuerpo bajo; aún como se demuestra en los ensayos bactericidas, el anticuerpo funcional significativo se eleva con la inmunización con el LOS del mutante htrB B29.
5.2 En otro aspecto, las células bacterianas mutantes htrB se usan como el inmunógeno en una formulación para vacuna. Para ilustrar los efectos de la inmunización con células bacterianas del mutante htrB, se usó un modelo de crías de rata. Los expertos en la materia han aceptado el uso del modelo de crías de rata como un modelo de infecciones bacteriémicas debido a H. influenzae de tipo b (Hib) en humanos, y para determinar la virulencia de las cepas de tipo B de H. influenzae (véase por ejemplo Smith y col., 1973, Infect. Immun, 8:278-290; Moxon y col., 1974, Infect Dis. 129:154-62; Rubin y col., 1983, Infect. Immun. 41:280-284; Zwahlen y col., 1985, J. Infect. Dis. 152:485-492).
La cepa A2 de tipo b de H. influenzae ya ha sido caracterizada en el sistema de modelo de cría de rata como una cepa altamente virulenta que causa bacteriemia y meningitis tras la inoculación (por ejemplo, por vía intraperitoneal o intranasal), y como un aislado clínico a partir de humanos (se aísla a partir de un niño con meningitis debida a H. influenzae). Usando el procedimiento según el ejemplo 1, se obtuvo un mutante htrB a partir de la cepa A2 de Hib. Se inocularon crías de ratas albinas Sprague-Dawley de una semana de edad por vía intraperitoneal con 10^{7} Hib de la cepa A2 o con 10^{7} mutantes htrB de A2 y después se valoró el aclaramiento intravascular midieron el número de unidades formadoras de colonias (ufc) por ml de sangre obtenida 48 horas tras la inoculación. Los resultados mostraban que 20 de 20 crías de ratas inoculadas con la cepa A2 de Hib mostraban bacteriemia, mostrando todas las ratas más de 10^{5}ufc/ml de la cepa A2. Por el contrario, sólo 13 de 20 crías inoculadas con el mutante htrB A2 mostraban bacteriemia, mostrando sólo 10 de las 13 más de 10^{5} ufc/ml de mutante htrB de A1.
De forma similar, se inocularon crías de ratas albina Sprague-Dawley de una semana de edad por vía intranasal con 10^{7} Hib de la cepa A2 o con 10^{7} mutantes htrB de A2 y a continuación se valoró el aclaramiento intravascular. Los resultados mostraron que 8 de 20 crías de rata inoculadas con la cepa A2 de Hib mostraban bacteriemia, mostrando 7 de las 8 ratas más de 10^{5} ufc/ml de la cepa A2. Por el contrario, ninguna de las 30 crías de rata inoculadas con el mutante htrB de A2 mostraba bacteriemia. Tomado en conjunto, puede concluirse, a partir de este sistema modelo, que los mutantes htrB muestran una virulencia atenuada en comparación con su cepa de tipo silvestre, como indica el descenso de la capacidad para causar bacteriemia (por ejemplo una reducción del 30% en la aparición de bacteriemia).
Para ilustrar de forma adicional los efectos de la inmunización con células bacterianas mutantes htrB, se usó un modelo de chinchilla. Los expertos en la materia han aceptado el uso del modelo de chinchilla como modelo de infecciones del oído medio debido a H. influenzae no tipable (NTHi) en humanos y para determinar la virulencia de las cepas NTHi (véase, por ejemplo, Bakaletz y col., 1989; Acta Otolaryngol. 107:235-243; Madore y col., 1990, Pediatrics 86:527-34; Barenkamp, 1986, Infect. Immun. 52:572-78; Green y col., 1994, Methods Enzymol. 235:59-68).
NTHi 2019 es un aislado clínico descrito previamente (véase, por ejemplo, Murphy y col., 1986, Infect Immun. 54:774-779). Cada chinchilla adulta sana se inoculó, a través de la bulla epitimpánica en el espacio del oído medio con diversas dosis logarítmicas de NTHi 2019 o de mutante htrB B29 de NTHi. A continuación, se valoró el proceso de la enfermedad del oído medio mediante examen otoscópico periódico por inflamación de la membrana timpánica o infusión del oído medio y aspiración del oído medio con el cultivo posterior. Los resultados mostraron que cuando se comparan con NTHi 2019, se necesitan dosis de hasta 3 log de mutante htrB B29 de NTHi (10^{7} ufc/oído) para inducir una infección del oído medio. Puede concluirse a partir este sistema modelo que los mutantes htrB muestran una virulencia atenuada cuando se compara con su cepa de tipo silvestre, como indica el descenso de la capacidad para causar la enfermedad del oído medio.
En otro aspecto, el mutante htrB de H. influenzae se manipula genéticamente para expresar uno o más antígenos bacterianos heterólogos. Como se discutirá con más detalle a continuación, H. influenzae tiene un proceso natural de transformación genética que implica la unión del ADN linearizado, la captación a través de una o más secuencias de captación (por ejemplo, AAGTGCGGT - ID SEC Nº 3), translocación y recombinación. De este modo, un mecanismo para introducir una molécula de ADN recombinante, que contiene al menos un antígeno bacteriano heterólogo que se va a expresar, es transformar el hospedador mutante htrB de H. influenzae con una molécula de ADN recombinante linearizado que contiene el ADN que codifica al menos un antígeno bacteriano heterólogo ("la secuencia codificadora"). De forma alternativa, la molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia recombinante que se va a expresar puede insertarse en un vector plasmídico y puede introducirse como una molécula recombinante linearizada por el procedimiento de transformación natural; como un plásmido recombinante circularizado usando electroporación de mutantes htrB de H. influenzae no competente, o como un plásmido recombinante circularizado en mutantes htrB de H. influenzae competente.
Los plásmidos útiles para la clonación y la expresión en H. influenzae a partir de moléculas de ADN recombinantes son conocidos por los expertos en la materia. Esos plásmidos incluyen:
pRSF0885 confiere resistencia a ampicilina y contiene un sitio de clonación PvuII y una secuencia TnA defectuosa (Setlow y col., 1981, J. Bacteriol. 148:804-811) y puede replicarse tanto en H. influenzae como en E. coli. (Trieu y col., 1990, Gene 86:99-102).
pDM2 se construyó clonando la resistencia al cloranfenicol en pRSF0885 y pDM5 se construyó clonando la resistencia a tetraciclina en pRSF0885 (McCarthy y col., 1986, J. Bacteriol. 168:186-191).
pVT63, pVT64, pVT65 y pVT66 son vectores lanzadera mejorados para H. influenzae y E. coli basados en pDM2 (Trieu y col., 1990, Gene 86:99-102) y contiene el pUC-derivado del ColE1 ori, y el locus rep de pRSF0885 rep. De forma adicional, cada plásmido tiene marcadores de fármacos con sitios de restricción únicos para inactivación por inserción del marcador de fármaco como sigue: pVT63-ApR (HincII, PstI, ScaI), KmR (ClaI, HindIII, NruI, SmaI, XhoI); pVT64-ApR (HincII, PstI, ScaI, SspI), SpR; pVT65-ApR (HindII, PstI, ScaI, PvuI, SSpI), CmR (BalI, NcoI); pVT66-ApR (HincII, PstI, ScaI, PvuI), CmR (SmaI).
pACYC177, pACYC184, pSU2718 y pSU2719 son vectores lanzadera mejorados para H. influenzae y E. coli basados en p15A (Chandler, 1991, Plasmid 25:221-224), tiene el p15A ori, y eran compatibles con un plásmido que contiene el origen de replicación de RSF0885. De forma adicional, cada plásmido tiene sitios de restricción como sitios de clonación y marcadores de fármacos como sigue: pACYC177-ApR, KmR (Nº de Acceso X06402); pACYC184-CmR, TcR (Nº de acceso X06403); pSU2718-CmR y sitios de policlonación a partir de pUC18 (Nº de Acceso M64731) y pSU2719-CmR y el sitio de policlonación de pUC19 (Nº de acceso Nº M64732).
pQL1 es un vector lanzadera mejorado para su uso en H. influenzae y E. coli que contiene tanto el pMB1 ori como el P15a ori, KmR que está flanqueado por secuencias de captación de H. influenzae, un sitio de clonación múltiple que contiene sitos de restricción únicos para BamHI y SmaI, y que es especialmente apropiado para analizar la potencia del promotor de H. influenzae en H. influenzae (Heidecker y col; 1994, Gene 150:141-144).
En la clonación de la molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificada en un vector plasmídico, un experto en la materia apreciará que la elección de las enzimas de restricción para digerir tanto la molécula de ADN recombinante como el plásmido para dar lugar a extremos compatibles para ligamiento, depende de los sitios únicos para enzimas de restricción en los extremos de la molécula de ADN recombinante, de si son de origen natural o manipulado genéticamente tal como durante la amplificación enzimática; uno o más sitios para enzimas de restricción únicos; si la inserción en el vector plasmídico ayudará en el procedimiento de selección (véase, por ejemplo, pVT66) y si se usa solamente un promotor derivado del plásmido o además del promotor o promotores de la secuencias codificadas, para dirigir la expresión de la molécula de ADN recombinante. La selección y el análisis de los mutantes htrB de H. influenzae transformados puede llevarse a cabo por procedimientos conocidos en la técnica incluyendo la detección de la expresión de un gen marcador (por ejemplo, marcador de resistencia a fármacos) presente en el plásmido y la inmunodetección del antígeno bacteriano heterólogo mostrado. Mientras que este aspecto de la realización ilustra que la molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificada puede insertarse en un plásmido y expresarse en mutantes htrB de H. influenzae, los expertos en la materia apreciarán que pueden usarse otros vectores además de los plásmidos incluyendo, pero no de forma limitante, vectores de bacteriófagos.
La expresión satisfactoria de al menos un antígeno bacteriano heterólogo requiere que la molécula de ADN recombinante que comprende la secuencia codificadora o el vector en sí, contengan los elementos de control necesarios para la transcripción y traducción que son compatibles y reconocidos por el sistema hospedador en particular usado para la expresión. Usando procedimientos conocidos en la técnica de biología molecular, incluyendo procedimientos descritos anteriormente, pueden incorporarse diversos promotores y potenciadores dentro del vector o en la molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora para aumentar la expresión del antígeno bacteriano heterólogo, siempre que la expresión aumentada del antígeno o antígenos bacterianos heterólogos sea compatible con (por ejemplo, no tóxico) para el mutante htrB. Como se ha referido en este documento, la secuencia codificada puede contener ADN que codifique más de un antígeno bacteriano heterólogo y puede incluir secuencias de antígenos virales y/o fúngicos, para crear un antígeno multivalente de uso como composición para vacuna mejorada.
La selección del promotor dependerá del sistema de expresión usado. Por ejemplo, promotores preferidos en un sistema de expresión de H. influenzae puede ser el promotor P2 o el P6 unidos de forma operativa con la secuencia codificadora. La potencia de los promotores, es decir la capacidad para facilitar la transcripción, varía. Generalmente, con el fin de expresar un gen clonado, es deseable usar un promotor potente para obtener un nivel elevado de transcripción del gen y de expresión del producto génico. Por ejemplo, para proporcionar la transcripción de la secuencia codificadora insertada pueden usarse los promotores bacterianos, de fagos o de plásmidos conocidos en la técnica a partir de los cuales se han observado niveles elevados de transcripción en un sistema celular hospedador que comprende E. coli, incluyen el promotor lac, el promotor trp, el promotor recA, el promotor ARN ribosómico, los promotores P_{R} y P_{L}, lacUV5, ompF, bla, lpp y similares.
Otros elementos de control para una transcripción génica eficaz o para la traducción del mensajero incluyen potenciadores y señales reguladores. Las secuencias potenciadoras son elementos de ADN que parecen incrementar la eficacia de la transcripción de manera relativamente independiente de su posición y orientación con respecto a los genes vecinos. De este modo, dependiendo del sistema de vector de expresión celular hospedador usado, para aumentar la eficacia de la transcripción puede situarse un potenciador secuencia arriba o secuencia abajo a partir de la secuencia codificadora. Pueden usarse estos u otros sitios reguladores, tales como señales de iniciación de transcripción o traducción, para regular la expresión de la secuencia codificadora. Estos elementos reguladores puede insertarse en la molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora, o próximas a la secuencia de ADN del vector usando procedimientos de ADN recombinante descritos en este documento y conocidos por los expertos en la materia, para inserción de secuencias de ADN.
Por lo tanto, en un vector de expresión puede ligarse una molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora en un sitio específico en relación con los elementos promotor, control y regulador del vector de modo que, cuando se introduce el vector recombinante en el mutante htrB, el antígeno bacteriano heterólogo puede expresarse en la célula hospedadora. A continuación, se introduce el vector recombinante en el mutante htrB, se seleccionan los mutantes htrB transformados y se analizan las células que contienen el vector recombinante. La selección y el análisis pueden lograrse por procedimientos conocidos en la técnica y dependiendo del vector y sistema de expresión usados.
La introducción de una molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora (incluyendo un vector de expresión o plásmido que contiene éste) en mutantes htrB de H. influenzae, pueden lograrse por cualquiera de estos tres procedimientos: un procedimiento de transformación genética natural; transformación de células bacterianas competentes y electroporación de células bacterianas no competentes.
Procedimiento de transformación natural
El procedimiento de transformación genética natural de H. influenzae implica la unión al ADN linearizado, captación por medio de una o más secuencias de captación translocación y recombinación. De este modo, un mecanismo para introducir una molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora para expresar al menos un antígeno bacteriano heterólogo, es transformar el hospedador H. influenzae con una molécula de ADN linearizada que contiene la secuencia codificadora, o un vector linearizado que tiene insertada la molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora que se va a expresar. En este proceso natural, cuando el ADN linearizado se transloca dentro de la célula, aparentemente se degrada una de las cadena de ADN translocadas por una actividad exonucleasa (Barany y col., 1983, Proc. Natl Acad. Sci USA 80:7274-7278). Si la cadena translocada carece de homología suficiente para recombinarse con el cromosoma de H. influenzae, la cadena translocada resulta susceptible de degradación adicional (Pifer y col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3731-3735). Usando procedimientos conocidos en la técnica (por ejemplo, Barany y col., 1983, supra; incorporada en este documento como referencia), puede introducirse el ADN linearizado que contiene la secuencia codificadora en los mutantes htrB de H. influenzae. Puesto que la secuencia codificadora puede estar flanqueada por secuencias de H. influenzae, es probable que se incremente la probabilidad de recombinación de la secuencia codificadora en el genoma de los mutantes htrB de H. influenzae.
Transformación de células bacterianas competentes
Otro mecanismo para introducir una molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora que se va a expresar en al menos un antígeno bacteriano heterólogo, es transformar un hospedador competente mutantes htrB de H. influenzae con un vector circular, tal como un plásmido, que tenga insertado en éste la molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora que se va a expresar. La competencia de H. influenzae se desarrolla mejor en condiciones en las cuales se inhibe la duplicación de la célula bacteriana, tales como un cambio temporal en las condiciones anaeróbicas, por cambios fisiológicos que ocurren durante la fase logarítmica tardía de crecimiento y transferencia de las células a un medio químicamente definido pobre en nutrientes. Se han descrito en detalle estos medios definidos para el desarrollo de la competencia de H. influenzae (Herriott y col., 1970, J. Bacteriol 101:517-524; incorporada en este documento como referencia). Parece que, sólo durante un corto espacio de tiempo después de introducir H. influenzae competente, un plásmido que contienen secuencias homólogas al cromosoma bacteriana (tal como la secuencia codificadora flanqueada por secuencias de H. influenzae) puede insertar su secuencia homóloga en el cromosoma bacteriano para su expresión por medio de recombinación (Setlow y col., 1981, supra). De este modo, en esta realización, se introduce un plásmido que contiene la secuencia codificadora que es capaz de transformarse en mutantes htrB de H. influenzae por procedimientos para la transformación conocidos en la técnica (Karudapuram y col., 1995, J: Bacteriol. 177:3235-3240; Setlow y col., 1981, supra). A continuación, la secuencia codificadora puede recombinarse en el genoma de mutantes htrB de H. influenzae en el que se expresa bajo el control de su propio promotor o de un promotor de H. influenzae próximo al sitio de inserción. Se informó que esta transformación se da a una frecuencia relativamente alta (McCarthy y Cox, 1986, J. Bacteriol. 168:186-191).
De forma alternativa, la transformación de mutantes htrB de H. influenzae competentes por un plásmido circular con el origen u orígenes de replicación apropiados y que contienen la secuencia codificadora puede dar lugar al establecimiento del plásmido, es decir, un plásmido que coexiste como un elemento extracromosómico sin recombinación. Se han descrito anteriormente ejemplos de estos plásmidos. De este modo, en esta variación, se introduce un plásmido que contiene la secuencia codificadora que es capaz de ser transformado, y establecido, en mutantes htrB de H. influenzae competentes por procedimientos para transformación conocidos en la técnica. A continuación, la secuencia codificadora se expresa a partir del plásmido bajo el control de su propio promotor o un promotor del vector.
Electroporación de células bacterianas no competentes
Aún otro mecanismo para introducir una molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora que se va a expresar en al menos un antígeno bacteriano heterólogo, es introducir un vector circular, tal como un plásmido que tiene insertado por electroporación la molécula de ADN recombinante que contiene la secuencia codificadora que se va a expresar, en hospedadores mutantes htrB de H. influenzae no competentes. La electroporación se ha usado para introducir de forma eficaz un plásmido de ADN en una bacteria. Sin embargo, las condiciones óptimas pueden diferir dependiendo de la célula hospedadora usada. Se han descrito las condiciones óptimas para electroporar un plásmido de ADN en H. influenzae (Mitchell y col., 1991, Nucl. Acids Res. 19:3625-3628; incorporada en este documento como referencia). Se ha encontrado que la electroporación de un plásmido en H. influenzae hecha competente con medios definidos pobres en nutrientes era varios órdenes de magnitud menos eficaz que la electroporación en H. influenzae no competente. De este modo, en esta variación de la realización, podría preferirse que un plásmido que contiene la secuencia codificadora se electroporase en mutantes htrB de H. influenzae no competentes. El plásmido es capaz de establecerse en mutantes htrB de H. influenzae o se degrada después de que la secuencia codificadora se recombine con el genoma de mutantes htrB de H. influenzae. En cualquier caso, la secuencia codificadora está bajo el control de su propio promotor o un promotor en el vector o genoma, respectivamente.
Ejemplo 6 Mutantes htrB de Neisseria como inmunógenos
En otra realización, el mutante htrB es un mutante htrB de Neisseria seleccionado entre el grupo que incluye Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis. N. gonorrhoeae es un patógeno bacteriano gram negativo que causa la enfermedad de transmisión sexual gonorrea, que posteriormente puede llevar a la enfermedad inflamatoria pélvica en mujeres. N. meningitidis es un patógeno bacteriano gram negativo que puede causar una diversidad de infecciones clínicas incluyendo bacteriemia, septicemia, meningitis y neumonía. Se cree que las alteraciones en la glicosilación terminal del LOS de Neisseria están correlacionada con la sensibilidad sérica y la resistencia sérica del organismo. Adicionalmente, el anticuerpo bactericida protector se dirige contra antígenos específicos de tipo de N. meningitidis, en donde los antígenos específicos de tipo se han identificado como proteínas de la membrana externa, LOS o
ambos.
Usando los procedimientos de acuerdo con la presente invención, como los ilustrados en los ejemplos 1-3 y 10, pueden producirse e identificarse mutantes htrB de una especie de Neisseria. Un experto en la materia, usando el gen htrB de H. influenzae, puede aislar el gen htrB de la especie de Neisseria y producir un gen htrB mutado (incapaz de codificar una HtrB funcional) usando mutagénesis por transposón con recombinación posterior que da lugar a un mutante htrB de Neisseria carente de una o más cadenas acilo secundarias. De forma alternativa, puede haber suficiente homología entre Neisseria y Haemophilus para usar los plásmidos pB28 y pB29, cada uno con un transposón mini Tn3 que contiene el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) insertado en el marco de lectura abierto de htrB en una localización diferente, para transformar la especie de Neisseria por recombinación del gen htrB mutante dentro del gen htrB de Neisseria. A continuación se seleccionan los transformantes de Neisseria por crecimiento en presencia de cloranfenicol (1,5 \mug/ml), dando como resultado la identificación de las cepas mutantes htrB de Neisseria. Las localizaciones de la inserción mTn3 en los cromosomas de los mutantes htrB de Neisseria puede confirmarse por hibridación de tipo Southern genómico usando una sonda que contiene secuencias htrB. A continuación, puede ensayarse la toxicidad sustancialmente reducida de los mutantes htrB de Neisseria resultantes usando ensayos descritos por los expertos en la materia midiendo los efectos tóxicos inducidos por la endotoxina.
Usando los procedimientos que se ilustran en los ejemplos 4 y 5, la endotoxina aislada de un mutante htrB de Neisseria puede usarse en una formulación para vacuna en la inducción de inmunidad contra las cepas de tipo silvestre de patógenos de Neisseria. Puede aislarse el LOS del mutante htrB por un procedimiento para aislar LOS conocido por los expertos en la materia. El LOS del mutante htrB puede usarse en la formulación de una vacuna que contiene uno o más agentes seleccionados a partir del grupo compuesto de un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una solución fisiológica), un adyuvante o una proteína vehículo.
De forma alternativa, pueden usarse los mutantes htrB de Neisseria en una preparación de vacuna bacteriana viva, en una preparación de vacuna bacteriana inactivada y puede manipularse genéticamente para expresar al menos un antígeno bacteriano heterólogo en una preparación de una vacuna multivalente. Con respecto a este último aspecto, los expertos en la materia conocen plásmidos útiles para la clonación y expresión a partir de moléculas de ADN en especies de Neisseria, incluyendo;
pLES2 confiere resistencia a ampicilina, es un vector lanzadera funcional tanto en E. coli como en N. gonorrhoeae y contiene un polienlazador con sitios de restricción para EcoRI, SmaI y BamHI (Stein y col., 1983, Gene 25:241-247). Las especies de Neisseria también contienen un procedimiento natural de transformación (Rudel y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:7896-90; Goodman y col., 1991, J. Bacteriol 173:5921-5923) y también puede hacerse competente o electroporarse usando técnicas conocidos por los expertos en la materia.
Ejemplo 7 Mutantes htrB de Haemophilus ducreyi como inmunógenos
En otra realización, el mutante es un mutante htrB de H. ducreyi. H. ducreyi es un patógeno bacteriano gram negativo que causa una enfermedad ulcerosa genital, el chancroide. Usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplos 1-3 y 10, pueden producirse e identificarse mutantes htrB de H ducreyi. Un experto en la materia puede aislar el gen htrB de H. ducreyi usando el gen htrB de H. influenzae, y producir un gen htrB mutado (incapaz de codificar una HtrB funcional) usando mutagénesis por transposón con recombinación posterior dando lugar a un mutante htrB de H. ducreyi carente de una o más cadenas acilo secundarias. De forma alternativa, es probable que haya homología suficiente entre H. ducreyi y H. influenzae para usar los plásmidos pB28 y pB29, cada uno con un mini transposón Tn3 que contiene el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) insertado en el marco de lectura abierto de htrB en una localización diferente, para transformar H. ducreyi para la recombinación del gen htrB mutante en el gen htrB de H. ducreyi. A continuación se seleccionan los transformantes de H. ducreyi por crecimiento en presencia de cloranfenicol (1,5 \mug/ml), dando lugar a la identificación de cepas mutantes de htrB de H. ducreyi. Pueden confirmarse las localizaciones de la inserción mTn3 en los cromosomas de los mutantes htrB de H. ducreyi por hibridación genómica de tipo Southern usando una sonda que contiene las secuencias de htrB. A continuación, puede analizarse la toxicidad sustancialmente reducida de los mutantes htrB de H. ducreyi usando ensayos descritos por los expertos en la materia para medir los efectos tóxicos inducidos por la endotoxina.
Usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplo 4 y 5, puede usarse la endotoxina aislada de un mutante htrB de H. ducreyi en una formulación para vacuna en la inducción de inmunidad contra las cepas de tipo silvestre de H. ducreyi. Puede aislarse el LOS del mutante htrB mediante un procedimiento para el aislamiento de LOS conocido por los expertos en la materia. El LOS del mutante htrB puede usarse en una formulación para vacuna que contiene uno o más agentes seleccionados entre el grupo compuesto por un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una solución fisiológica), un adyuvante o una proteína vehículo.
De forma alternativa, pueden usarse los mutantes htrB de H. ducreyi en una preparación para vacuna bacteriana viva, en una preparación de vacuna bacteriana inactivada y puede manipularse genéticamente para expresar al menos un antígeno bacteriano heterólogo en una preparación para vacuna multivalente. Con respecto al último aspecto, los expertos en la materia conocen plásmidos útiles para la clonación y expresión de moléculas de ADN recombinante en especies de Haemophilus, como se describe en el ejemplo 5; y también pueden hacerse competentes o electroporarse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia, como se describe en el ejemplo 5.
Ejemplo 8 Mutantes htrB de Campylobacter jejuni como inmunógenos
En otra realización, el mutante es un mutante htrB de C. jejuni. Campylobacter jejuni es un patógeno bacteriano gram negativo que causa enteritis en humanos. La infección por C. jejuni también se ha asociado con la aparición de trastornos neurológicos tales como el síndrome de Guillian-Barre. Pueden producirse e identificarse mutantes htrB de C. jejuni usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplo 1-3 y 10. Un experto en la materia puede aislar el gen htrB de C. jejuni usando el gen htrB de H. influenzae y producir un gen htrB mutado (incapaz de codificar HtrB funcional) usando mutagénesis por transposón con la recombinación posterior que da lugar a un mutante htrB de C. jejuni carente de una o más cadenas acilo secundarias. De forma alternativa, puede haber homología suficiente entre C. jejuni y H. influenzae para usar los plásmidos pB28 y pB29, cada uno con un mini transposón Tn3 que contiene el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) insertado en el marco de lectura abierto de htrB en una localización diferente, para transformar C. jejuni para recombinación del gen htrB mutante en el gen htrB de C. jejuni. A continuación se seleccionan los transformantes de C. jejuni por crecimiento en presencia de cloranfenicol (1,5 \mug/ml), dando lugar a la identificación de cepas mutantes htrB de C. jejuni. Pueden confirmarse las localizaciones de la inserción mTn3 en los cromosomas de los mutantes htrB de C. jejuni por hibridación genómica de tipo Southern usando una sonda que contenga las secuencias de htrB. A continuación, puede ensayarse la toxicidad sustancialmente reducida de los mutantes htrB de C. jejuni usando ensayos descritos por los expertos en la materia para medir los efectos tóxicos inducidos por la endotoxina.
Usando los procedimientos que se ilustran en los ejemplos 4 y 5, puede usarse la endotoxina aislada de un mutante htrB de C. jejuni en una formulación para vacuna para la inducción de inmunidad contra las cepas de tipo silvestre de C. jejuni. Puede aislarse el LPS del mutante htrB por un procedimiento para aislamiento de LPS conocido por los expertos en la materia. El LPS del mutante htrB puede usarse en una formulación para vacuna que contenga uno o más agentes seleccionados entre el grupo compuesto por un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una solución fisiológica), un adyuvante o una proteína vehículo.
De forma alternativa, pueden usarse los mutantes de C. jejuni en una preparación para vacuna bacteriana viva, en una preparación para vacuna bacteriana inactivada y puede manipularse genéticamente para expresar al menos un antígeno bacteriano heterólogo en una preparación para vacuna multivalente. Con respecto a éste último aspecto, los expertos en la materia conocen plásmidos útiles para la clonación y expresión de moléculas de ADN recombinante en C. jejuni, e incluye:
pua466 confiere resistencia a la tetraciclina y contiene un sitio único para Avía y un sitio para AvaII (Taylor, 1986, J. Bacteriol 165:1037-39).
C. jejuni también pueden hacerse competentes o electroporarse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Ejemplo 9 Mutantes htrB de Moraxella catarrhalis como inmunógenos
En otra realización, el mutante es un mutante htrB de M. catarrhalis. Moraxella catarrhalis es un patógeno bacteriano gram negativo que causa otitis media en niños; sinusitis y conjuntivitis en niños y en adultos e infecciones del tracto respiratorio inferior, septicemia y meningitis en hospedadores inmunodeprimidos. Pueden producirse e identificarse mutantes htrB de M. catarrhalis usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplo 1-3 y 10. Un experto en la materia puede aislar el gen htrB de M. catarrhalis usando el gen htrB de H. influenzae, y producir un gen htrB mutado (incapaz de codificar una HtrB funcional) usando mutagénesis por transposón con recombinación posterior dando lugar a un mutante de M. catarrhalis carente de una o más cadenas acilo secundarias. De forma alternativa, puede haber homología suficiente entre M. catarrhalis y H. influenzae como para usar los plásmidos pB28 y pB29, cada uno con un mini transposón Tn3 que contenga el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) insertado en el marco de lectura abierto de htrB en una localización diferente, para transformar M. catarrhalis para recombinación del gen htrB mutante en el gen htrB de M. catarrhalis. A continuación se seleccionan los transformantes de M. catarrhalis por crecimiento en presencia de cloranfenicol (1,5 \mug/ml), dando lugar a la identificación de cepas mutantes htrB de M: catarrhalis. Pueden confirmarse las localizaciones de la inserción mTn3 en los cromosomas de los mutantes htrB de M. catarrhalis por hibridación genómica de tipo Southern usando una sonda que contengan las secuencias de htrB. A continuación, puede analizarse la toxicidad sustancialmente reducida de los mutantes htrB de M. catarrhalis resultantes usando ensayos descritos por los expertos en la materia midiendo los efectos tóxicos inducidos por la endotoxina.
Usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplo 4 y 5, puede usarse la endotoxina aislada de un mutante htrB de M. catarrhalis en una formulación para vacuna para la inducción de inmunidad contra las cepas de tipo silvestre de M. catarrhalis. Puede aislarse el LOS del mutante htrB por un procedimiento para aislamiento de LPS conocido por los expertos en la materia. El LOS del mutante htrB puede usarse en una formulación para vacuna que contenga uno o más agentes seleccionados entre el grupo compuesto por un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una solución fisiológica), un adyuvante o una proteína vehículo.
De forma alternativa, pueden usarse mutantes htrB de M. catarrhalis en una preparación para vacuna bacteriana viva, en una preparación para vacuna bacteriana inactivada y puede manipularse genéticamente para expresar al menos un antígeno bacteriano heterólogo en una preparación para vacuna multivalente. Con respecto a este último aspecto, los expertos en la materia conocen plásmidos útiles para la clonación y expresión de moléculas de ADN recombinante en M. catarrhalis. M. catarrhalis contiene un proceso de transformación natural (Juni, 1977, J. Clin Microbiol 5:227.35) y también puede hacerse competentes o electroporarse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Ejemplo 10 Mutantes htrB de Salmonella como inmunógenos
En otra realización, el mutante es un mutante htrB de Salmonella. Las especies de Salmonella comprenden bacterias gram negativas que pueden causar una diversidad de enfermedades clínicas en humanos y animales. Por ejemplo, S. typhi es el agente causante de la fiebre tifoidea en humanos. S. paratyphi en el organismo causante de una fiebre conocida como fiebre salmonela en humanos. La salmonelosis, una gastroenteritis en humanos, puede estar causada por diversas especies del género Salmonella (typhimurium, newport, heidelberg y enteritidis). Pueden producirse e identificarse mutantes htrB de Salmonella. Un experto en la materia puede producir un gen htrB mutado (incapaz de codificar una HtrB funcional) usando el gen htrB de un patógeno bacteriano gram negativo, por mutagénesis por transposón y la posterior recombinación, resultando finalmente un mutante htrB de Salmonella que tiene una modificación en una o más cadenas acilo secundarias. A continuación, puede analizarse la toxicidad sustancialmente reducida de los mutantes htrB de Salmonella usando ensayos descritos por expertos en la materia para medir los efectos tóxicos inducidos por la endotoxina.
Para ilustrar esta realización y usando procedimientos similares a los descritos en el ejemplo 1 de este documento, se realizó la mutagénesis del gen htrB por mutagénesis lanzadera por un mini Tn10 (que confiere resistencia a tetraciclina) usando como una secuencia de inserción para mutar el gen htrB. A continuación, el htrB:Tn10 se transfirió de E. coli a un S. typhimurium virulento por transducción. Usando procedimientos descritos previamente (Masters, 1996, en E. coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, vol. 2, 2ª Edición, p. 2421, ASM Press), se transdujo de forma secuencial un S. typhimurium r^{-}m^{+}, galE mutS recD (SL5283) con MST3488 (recD542:Tn10d que confiere resistencia al cloranfenicol (cm^{r})) por medio del fago de Salmonella P22 dando lugar a S. typhimurium r^{-}m^{+}, galE mutS recD cm^{r} ("MGS-1") y después con MST3063 (mutS:Tn10 que confiere resistencia a tetraciclina (tet^{r})) dando lugar a S. typhimurium r^{-}m^{+}, galE mutS recD cm^{r} tet^{r} ("MGS-3"). S. tiphimurium MGS-3 se curó de Tn10 mediante selección para la sensibilidad a tetraciclina usando procedimientos previamente descritos (Bochner y col., 1990, J. Bacteriol. 143:926-933) dando lugar a S. Typhimurium r^{-}m^{+} galE mutS recD cm^{r}("MGS-7"). Con el fin de confirmar se demostró que S. typhimurium MGS-7 mostraba la misma respuesta a la luz ultravioleta que la cepa parental MGS-3.
Se usó una cepa de E. coli ("MLK217") que contenía el htrB:mini Tn10 para transferir el htrB:Tn10 por transducción en S. typhimurium MGS-7 por medio del colifago P1 según procedimientos descritos previamente (Masters 1996, supra) y se seleccionaron por crecimiento a 30ºC en placas de medio que contenía tetraciclina. El resultado de la transducción y el posterior reaislamiento de los clones resistentes a tetraciclina fue la creación de un S. typhimurium r^{-}m^{+} galE mutS recD htrB:mini Tn10 cm^{r}tet^{r} ("MGS-23"). Se analizaron una o más propiedades fenotípicas de S. typhimurium MGS-23 asociadas con la mutación htrB, concretamente (1) sensibilidad a la temperatura; (2) filamentación y abultamiento a temperaturas no permisivas y (3) resistencia a desoxicolato. Los resultados del análisis fenotípico indicaban que MGS-23 llevaba el elemento mini Tn10 insertado en el gen htrB de S. typhimurium ya que MGS-23 era capaz de crecer a 30ºC pero no a 37ºC; formaba muchas formas filamentosas cuando se cambiaba a temperatura no permisiva y mostraba resistencia a concentraciones más elevadas de desoxicolato (de 7,5% a 10%) que el progenitor isogénico (2,5%). La mutación de htrB se confirmó adicionalmente por análisis usando la reacción en cadena de la polimerasa.
Se transdujo una cepa virulenta de S. typhimurium (SL1344) con htrB:Tn10 a partir de S. typhimurium MGS-23 por medio del fago P22 de Salmonella y por selección a 30ºC en placas con medio que contiene tetraciclina. Tras el aislamiento, se analizaron de forma adicional los clones resistentes que tenían el mismo fenotipo que MGS-23. Se demostró complementando el clon usando un plásmido con un gen htrB de tipo silvestre que uno de estos clones, el MGS-31, tenía un gen htrB mutado (Karow y col., 1991, J. Bacteriol. 173;741-50; Karow y col., 1991, Mol. Microbiol. 5:2285-2292) volviendo así el clon al fenotipo de tipo silvestre de crecimiento normal, morfología celular normal, sensibilidad a desoxicolato a 37ºC y virulencia de tipo silvestre.
Características de la endotoxina
Se uso espectrometría de masas para analizar el lípido A según los procedimientos del ejemplo 2 de este documento. Más específicamente, se analizaron el lípido A del LPS del mutante htrB de S. typhimurium y del LPS del tipo silvestre de S. typhimurium por espectrometría de masa iónica secundaria líquida (LSIMS) en modo de ión negativo para proporcionar un espectro de iones moleculares de los componentes diferentes del lípido A. El análisis químico del lípido A del mutante htrB de S. typhimurium indicaba que las modificaciones en la estructura del lípido A que se daban eran similares, pero no idénticas, a las modificaciones en la estructura del lípido A vistas en mutantes htrB de H. influenzae. El lípido A de S. typhimurium de tipo silvestre contiene seis (hexaacilo) o siete (heptaacilo) sustituciones de ácidos graso en el esqueleto de diglucosamina (Fig. 7). En la glucosamina II de la cepa de tipo silvestre, la sustitución 3' del ácido graso C14 unidos a N (hexaacilo o heptaacilo) es un ácido graso C12. Por el contrario, y como se muestra en la Fig. 7, el ácido graso C12 se sustituye con un ácido graso C16. Estos resultados indican que el gene htrB de S. typhimurium codifica una aciltransferasa responsable de colocar el ácido graso C12 en la posición 3' en el lugar del ácido graso C14 unido a N. La mutación del gen htrB de S. typhimurium da lugar a la inducción funcional de otra aciltransferasa que coloca un ácido graso C16 en la posición 3' en lugar del ácido graso C14 unido a N. Los expertos en la materia conocen que el lípido A es crucial par la supervivencia de un organismo gram negativo y para la organización apropiada de su membrana externa. De este modo, y en relación con la virulencia y toxicidad del organismo, se analizaron los efectos de la mutación del gen htrB en S. typhimurium.
Toxicidad de la endotoxina
Un sistema de modelo de ratón usado por los expertos en la técnica como relevante para enfermedades humanas, es el modelo de la D-lactosamina. En el modelo de la D-galactosamina, se aumenta la sensibilidad a LPS con la exposición a D-galactosamina (Galanos y col., 1986, Infect. Immun. 51:891-896) alcanzando así la misma letalidad e inducción de TNF con bajas dosis de LPS, es decir, con niveles de endotoxina en proporción con los identificados en la sangre de pacientes sépticos. De este modo, los ratones tratados con D-galactosamina expuestos a LPS son un sistema de modelo animal convencional aceptado por los expertos en la materia por su relevancia en choque endotóxico en humanos. En este modelo, se trataron grupos de 4 ratones con D-galactosamina (8 mg) de forma simultánea con la administración de la dosificación de LPS que se va a ensayar. Se inyectaron grupos de 4 ratones con 0,001 \mug, 0,01 \mug, 0,1 \mug, 1 \mug o 10 \mug del LPS purificado que se va a ensayar y se analizó el número de ratones que sobrevivieron a la estimulación para cada dosis cada 24 horas durante 5 días tras la inyección. A continuación se calcula la DL_{50} (dosis letal a la cual se muere el 50% de los ratones). Los LPS purificados que se ensayan por separado incluyen LPS de la cepa 1344 de S. typhimurium virulento de tipo silvestre y del mutante htrB de S. typhimurium (MGS-31). Los resultados muestran que la DL_{50} para los ratones inyectados con LPS de la cepa 1344 de S. typhimurium es de 0,01 \mug. Por el contrario, la DL_{50} para ratones inyectados con LPS del mutante htrB de S. typhimurium MGS-31 es de 0,1 \mug. De este modo, el lípido A del mutante htrB de S. typhimurium es al menos 10 veces menos toxico que el lípido A de la cepa de tipo silvestre.
Virulencia
Puesto que los ratones, como los humanos, son susceptibles por naturaleza a la infección por S. typhimurium, se usó un segundo modelo de ratón para valorar los efectos de la mutación htrB en la virulencia de S. typhimurium. Típicamente, los ratones inyectados con aproximadamente 50 ufc a 100 ufc morirán del 50 al 100%. Las cepas usadas incluyen la cepa 1344 de S. typhimurium, el mutante htrB de S, typhimurium (MGS-31) y el mutante htrB de S. typhimurium que se complementó con el plásmido que contenía el gen htrB intacto (MGS-43). Se inyectaron por vía intraperitoneal los organismos respectivos en un intervalo de dosificaciones de 5 x 10^{1} a 5 x 10^{7} ufc y se observaron durante 5 días. En general, el 100% de los animales que morían de bacteriemia lo hacía durante este periodo. Como se podía esperar, la DL_{50} de la cepa 1344 de S. typhimurium virulenta era menor de 5 x 10^{1} ufc. Por el contrario, la DL_{50} del mutante htrB de S. typhimurium MGS.31 era de 9,7 x 10^{6} ufc., una reducción de la virulencia de aproximadamente 2 x 10^{5} en comparación con la cape virulenta de tipo silvestre. El crecimiento in vivo en los ratones del mutante htrB de S. typhimurium se confirmó cultivan y ensayando el hígado y el bazo para recuento de colonias. Los resultados sugieren que la mutación htrB en Salmonella tiene un efecto más profundo en los factores de virulencia que sólo una modificación de LPS.
Usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplos 4 y 5, puede usarse la endotoxina aislada de un mutante htrB de Salmonella en una formulación para vacuna en la inducción de inmunidad contra las cepas de tipos silvestre de las especies de Salmonella. Puede aislarse el LPS del mutante htrB por un procedimiento de aislamiento de LPS conocido por los expertos en la materia. El LPS del mutante htrB puede usarse en una formulación para vacuna que contiene uno o más agentes seleccionados entre el grupo compuesto por un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una solución fisiológica), un adyuvante o una proteína vehículo.
De forma alternativa, pueden usarse los mutantes htrB de Salmonella en una preparación para vacuna bacteriana viva, en una preparación de vacuna bacteriana inactivada y puede manipularse genéticamente para expresar al menos un antígeno bacteriano heterólogo en una preparación para vacuna multivalente. Con respecto a éste último aspecto, los expertos en la materia conocen plásmidos útiles para la clonación y expresión de moléculas de ADN recombinante en Salmonella, e incluye:
pYA260 que contiene lacZ clonado en un promotor trc; y
pJW270 que se transfiere conjuntamente con la resistencia a tetraciclina y contiene lacI (Ervin y col., 1993, Microb Pathogen 15:93-101).
pB7 confiere resistencia a kanamicina y cloranfenicol y contiene un sitio de clonación flanqueado por un sitio BalI y un sitio HindIII (Purcell y col., 1983, Infect Immun 39:1122-1127).
pACK5 que contiene el replicón de pAC1 de Acetobacter pasteurianus y confiere resistencia a kanamicina (Grones y col., 1995, Biochem Biophys Res Comun 206:942-947).
pVAC468 es un vector suicida para la inserción cromosómica de antígenos heterólogos en Salmonella y contiene un polienlazador que tiene los siguientes sitios de restricción: ClaI, EcoRV, XhoI, SacI, SalI, SmaI, XbaI y BglII (Hohmann y col., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92: 2904-2908).
También se describe un sistema de bacteriófago, un "vector de expresión cromosómica" para la inserción de genes que codifican antígenos extraños en el cromosoma de Salmonella, que usa un elemento transponible defectuoso transportado en el bacteriófago lambda (Flynn y col., 1990, Mol Microb 4:2111-2118). También puede hacerse competente a Salmonella (véase por ejemplo Purcell y col., 1983, supra) o electroporarse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia (véase por ejemplo, Grones y col., 1995, supra; Coulson y col., 1994, supra).
Ejemplo 11 Mutantes htrB de Shigella como inmunógenos.
En otra realización, el mutante es un mutante htrB de una especie de Shigella. Los miembros del género Shigella son bacterias gram negativas que causan enfermedades tales como disentería (las especies patogénicas incluyen dysenteriae, sonnei y flexneri) principalmente en humanos. Pueden producirse e identificarse mutantes htrB de Shigella usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplo 1-3 y 10. Un experto en la materia puede aislar el gen htrB de Shigella usando el gen htrB de H. influenzae, y producir un gen htrB mutado (incapaz de codificar una HtrB funcional) usando mutagénesis por transposón con recombinación posterior dando lugar a un mutante htrB de Shigella carente de una o más cadenas acilo secundarias. De forma alternativa, puede haber homología suficiente entre Shigella y H. influenzae para usar los plásmidos pB28 y pB29, cada uno con un mini transposón Tn3 que contiene el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) insertado en el marco de lectura abierto de htrB en una localización diferente, para transformar Shigella para la recombinación del gen htrB mutante en el gen htrB de Shigella. A continuación se seleccionan los transformantes de Shigella por crecimiento en presencia de cloranfenicol (1,5 \mug/ml), dando lugar a la identificación de cepas mutantes htrB de Shigella. Pueden confirmarse las localizaciones de la inserción mTn3 en los cromosomas de los mutantes htrB de Shigella por hibridación genómica de tipo Southern usando una sonda que contiene secuencias de htrB. A continuación, puede ensayarse la toxicidad sustancialmente reducida de los mutantes htrB de Shigella resultantes usando ensayos descritos por los expertos en la materia para medir los efectos tóxicos inducidos por la endotoxina.
Usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplo 4 y 5, puede usarse la endotoxina aislada de un mutante htrB hecho a partir de una especie de Shigella en una formulación para vacuna para la inducción de inmunidad contra las cepas de tipo silvestre de Shigella. Puede aislarse el LPS del mutante htrB por un procedimiento para aislamiento de LPS conocido por los expertos en la materia. El LPS del mutante htrB puede usarse en una formulación para vacuna que contiene uno o más agentes seleccionados entre el grupo compuesto por un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una solución fisiológica), un adyuvante o una proteína vehículo.
De forma alternativa, pueden usarse los mutantes htrB de Shigella en la preparación para una vacuna bacteriana viva, en una preparación para vacuna bacteriana inactivada y puede manipularse genéticamente para expresar al menos un antígeno bacteriano heterólogo en una preparación para vacuna multivalente. Con respecto al último aspecto, los expertos en la materia conocen plásmidos útiles para la clonación y expresión de moléculas de ADN recombinante en Shigella , e incluyen:
pACK5 contiene el replicón de pAC1 de Acetobacter pasteurianus y confiere resistencia a kanamicina (Grones y col; 1995, supra).
También puede hacerse competente a Shigella o electroporarla usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Ejemplo 12 Mutantes htrB de Pseudomonas aeruginosa como inmunógenos
En otra realización, el mutante es un mutante htrB de Pseudomonas aeruginosa. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno bacteriano gram negativo que causa enfermedades tales como infecciones del tracto respiratorio y sepsis, especialmente en pacientes inmunodeprimidos. Entre otras especies patogénicas para humanos y animales se incluyen pseudomallei y mallei. Se usaron la espectrometría de masa y la espectroscopia por resonancia magnética nuclear para determinar la estructura del lípido A del LPS de Pseudomonas aeruginosa. Se encontró que la estructura del lípido A de P. aeruginosa era la misma que el lípido A de Enterobacterias: una estructura molecular de un disacárido glucosamina que esta monofosforilado o difosforilado (posiciones 1 y 4') y que lleva varias moléculas de ácidos grasos unidas a éster o a amida. Además de las especies de hexaacil y pentaacil-lípido A, se ha identificado una especie tetraacilo (Karunaratne y col., 1992, Arch Biochem Biophys 299:368-76).
Pueden producirse e identificarse mutantes htrB de Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa) usando los procedimientos según la presente invención, como se ilustra en los ejemplo 1-3 y 10. Un experto en la materia puede aislar el gen htrB de Pseudomonas aeruginosa usando el gen htrB de H. influenzae, y producir un gen htrB mutado (incapaz de codificar una HtrB funcional) usando mutagénesis por transposón con recombinación posterior dando lugar a un mutante htrB de P. aeruginosa carente de una o más cadenas acilo secundarias. De forma alternativa, puede haber homología suficiente entre P. aeruginosa y H. influenzae para usar los plásmidos pB28 y pB29, cada uno con un transposón mini Tn3 que contiene el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) insertado en el marco de lectura abierto de htrB en una localización diferente, para transformar P. aeruginosa para recombinación del gen htrB mutante en el gen htrB de P. aeruginosa. A continuación se seleccionan los transformantes de P. aeruginosa por crecimiento en presencia de cloranfenicol (1,5 \mug/ml), dando lugar a la identificación de cepas mutantes htrB de P. aeruginosa. Pueden confirmarse las localizaciones de la inserción mTn3 en los cromosomas de los mutantes htrB de P. aeruginosa por hibridación genómica de tipo Southern usando una sonda que contengan secuencias de htrB. A continuación, puede ensayarse la toxicidad sustancialmente reducida de los mutantes htrB de P. aeruginosa usando ensayos descritos por los expertos en la materia para medir los efectos tóxicos inducidos por la
endotoxina.
Usando los procedimientos que se ilustran en los ejemplos 4 y 5, puede usarse la endotoxina aislada de un mutante htrB de P. aeruginosa en una formulación para vacuna en la inducción de inmunidad contra las cepas de tipo silvestre de P. aeruginosa. Puede aislarse el LPS del mutante htrB por un procedimiento para aislamiento de LPS conocido por los expertos en la materia. El LPS del mutante htrB puede usarse en una formulación para vacuna que contenga uno o más agentes seleccionados entre el grupo compuesto por un vehículo farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, una solución fisiológica), un adyuvante o una proteína vehículo.
De forma alternativa, pueden usarse mutantes htrB de P aeruginosa en la preparación de una vacuna bacteriana viva, en una preparación de vacuna bacteriana inactivada y puede manipularse genéticamente para expresar al menos un antígeno bacteriano heterólogo en una preparación para vacuna multivalente. Con respecto al último aspecto, los expertos en la materia conocen plásmidos útiles para la clonación y expresión de moléculas de ADN recombinante en P. aeruginosa, e incluyen:
pPAH121 confiere resistencia a la carbenicilina y contiene un único sitio de restricción HpaI (Hoyne y col., 1992, J. Bacteriol 174:7321-7327,
P. aeruginosa también pueden hacerse competente (véase por ejemplo, Hoyne y col., 1992, supra) o electroporarse usando técnicas conocidas por los expertos en la materia.
Ejemplo 13 Formulación de vacuna de mutante htrB mutivalente
En una realización según la presente invención, como se ilustra en los ejemplo 4 y 5, el mutante se manipula genéticamente para expresar uno o más antígenos microbianos heterólogos para producir una vacuna multivalente usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia. En una realización preferente, puede incluirse un patógeno respiratorio seleccionado entre el grupo de patógenos, con los antígenos respectivos, de la Tabla 2.
TABLA 2
Patógeno Infección/Enfermedad Antígeno Protéico
H. influenzae otitis media, tracto respiratorio inferior D-15, P1, P6^{1}
Streptococcus grupo A faringitis, fiebre reumática M^{2}
Branhamella catarrhalis otitis media, tracto respiratorio inferior CD, E^{3}
Streptococcus pneumoniae neumonía, otitis media, meningitis autolisina, neumolisina^{4}.
Bordetella pertussis pertussis (tos ferina) hemaglutinina filamentosa, toxina
pertussis, Opm de 69 kDa^{5}
Pseudomonas aeruginosa tracto respiratorio Omp OprF, exotoxina A^{6}
Legionella pneumophila neumonía OmpS, Hsp60^{7}
Mycoplasma pneumoniae tracto respiratorio superior e inferior P1^{8}
Virus respiratorio sincitial tracto respiratorio inferior M2, P, F, G^{9}
Virus Influenza gripe HA, M^{10}
Adenovirus resfriado común
rinovirus resfriado común VP1, VP2, VP3^{11}
Virus parainfluenza resfriado común HN, F^{12}
Pneumocystis carinii neumonía en SIDA msg^{13}
^{1} \begin{minipage}[t]{155mm} (Flack y col., 1995 Gene 156:97-99; Panezutti y col., 1993, 61:1867-1872; Nelson y col., 1988, Rev Infect Diseases 10:S331-336).\end{minipage}
^{2} (Pruksakorn y col., 1994, Lancet 344:639-642; Dole y col., 1993, J Immunol 151:2188-94).
^{3} (Murphy y col., 1989, Infect Immun 57:2938-2941; Faden y col., 1992, Infect Immun 60:3824-3829 ).
^{4} (Lock y col., 1992, Microb Pathog 12:137-143).
^{5} \begin{minipage}[t]{155mm} (Novotny y col., 1991, Dev Biol Stand 73:243-249; Lipscombe y col., 1991, Mol Microbiol 5:1385-1392; He y col., 1993, Eur J Clin Microbiol Infect Dis 12:690-695).\end{minipage}
^{6} (Rawling y col., 1995, Infect Immun 63:38-42; Pennington y col., 1988, J Hosp Infect 11A:96-102).
^{7} (Weeratna y col., 1994, Infect Immun 62:3454-3462).
^{8} (Jacobs y col., 1990, Infect Immun 58:2464-2469; 1990. J Clin Microbiol 28:1194-1197).
^{9} \begin{minipage}[t]{155mm} (Kulkarni y col., 1995, J Virol 69:1261-1264; Leonov y col., 1994, J Gen Virol 75:1353-1359; García y col., 1993, Virology 195:239-242; Vaux-Peretz y col., 1992, Vaccine 10:113-118).\end{minipage}
^{10} (Kaly y col., 1994, Vaccine 12:753-760; Bucher y col., 1980, J Virol 36:586-590).
^{11} (Francis y col., 1987, J Gen Virol 68:2687-2691).
^{12} (Morein y col., 1983, J Gen Virol 64:1557-1569).
^{13} (Garbe y col., 1994, Infect Immun 62:3092-3101).
En otra realización preferida, un patógeno microbiano puede incluir un patógeno causante de una enfermedad de transmisión sexual seleccionado entre el grupo compuesto por los patógenos, con los antígenos respectivos, de
Tabla 3.
TABLA 3
Patógeno Infección/enfermedad Antígeno protéico
N. gonorrhoeae gonorrea proteasa de IgA1^{1}, PIB^{2}, H.8^{3}, Por^{4}
Chlamydia trachomatis uretritis no gonocócica MOMP^{5}, HSP^{6}
^{1} (Lomholt y col., 1994, Infect Immun 62:3178-83).
^{2} (Heckels y col., 1990, Vaccine 8:225-230).
^{3} (Blacker y col., 1985, J Infect Dis 151:650-657).
^{4} (Wetzler y col., 1992, Vaccine 8:225-230).
^{5} (Campos y col., 1995, Ophthamol Vis Sci 36:1477-91; Murdin y col., 1995, Infect Immun 63:1116-21).
^{6} (Taylor y col., 1990, Infect Immun 58:3061-3).
Las tablas 2 y 3, y las referencias a pie de página ilustran diversos antígenos proteicos o péptidos de los mismos, vistos por los expertos en la materia como candidatos útiles para vacunas contra los respectivos patógenos microbianos. Típicamente, la potencia inmune de un epítope, ya sea una proteína o un péptido, de un patógeno microbiano se determina controlando la respuesta inmune de un animal tras la inmunización con el epítope y/o analizando los sueros de humanos convalecientes junto con los sueros preinmunes. De este modo, un experto en la materia puede determinar los antígenos proteicos o peptídicos de patógenos microbianos que podrían ser deseables para ser incluidos como antígeno heterólogo que se expresa en un mutante htrB según la presente invención. A continuación, puede deducirse una secuencia de ácido nucleico correspondiente, la secuencia codificadora, a partir de la secuencia de aminoácidos del antígeno proteico o peptídico, cuya secuencia codificadora se introduce en el mutante htrB para expresión.
Ejemplo 14 Uso de mutantes htrB para generar antisueros
Puede usarse el mutante htrB, o la endotoxina purificada a partir de éste, para generan antisueros específicos de la endotoxina, dirigidos contra el patógeno bacteriano gram negativo en particular, que puede usarse en un inmunoensayo para detectar el antígeno (de éste patógeno bacteriano gram negativo en particular), presente en el fluido corporal de un individuo del que se sospecha que tiene una infección causada por este patógeno bacteriano gram negativo. El fluido o fluidos corporales recogidos para análisis dependen de los microorganismos que se quieren detectar, el sitio donde se sospecha que está la infección y si se sospecha que el fluido corporal contiene el antígeno o contiene antisueros. Con estas consideraciones en mente, el fluido corporal podría incluir uno o más entre esputo, sangre, líquido cefalorraquídeo, exudado de lesiones, frotis del sitio sospechoso de infección y fluidos del tracto respiratorio superior. Los inmunoensayos para esta detección comprenden cualquier inmunoensayo conocido en la técnica que incluye, pero no de forma limitante, radioinmunoensayo, ELISA, ensayo tipo "sándwich", reacción de precipitina, ensayo de aglutinación, inmunoensayo de fluorescencia e inmunoensayo basado en quimioluminiscencia.
De forma alternativa, cuando un individuo inmunodeprimido sufre de una infección que potencialmente pone en peligro su vida causada por un patógeno bacteriano gram negativo en particular, la inmunización puede ser pasiva, es decir, la inmunización comprende la administración de inmunoglobulina humana purificada que contiene anticuerpos contra un mutante htrB o endotoxina de htrB aislado de este patógeno bacteriano gram negativo en particular.
Ha de entenderse que mientras que la invención se ha descrito en detalle en este documento, los ejemplos sólo tenían fines ilustrativos. Se pretende que otras modificaciones de las realizaciones de la presente invención que son obvias para los expertos en la materia de biología molecular, diagnóstico médico y disciplinas relacionadas estén dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Michael A. Apicella
\hskip3.9cm
Melvin G. Sunshine 
\hskip3.9cm
Na-Gyong Lee 
\hskip3.9cm
Bradley Gibson 
\hskip3.9cm
Rasappa Arumugham 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Mutantes no tóxicos de bacterias patogénicas gram negativas
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Hodgson, Russ, Andrews, Woods y Goodyear
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 1800 One M&T Plaza
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Buffalo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Estados Unidos
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 14203-2391
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete, 3,5 pulgadas, 1,4 Mb de almacenamiento
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS/Microsoft Windows 3.1
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: Wordperfect para Windows 5.1
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Nelson, M. Bud
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 35.300
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 22244.0002
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: (716) 856-4000
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: (716) 849-0349
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TÉLEX: N/A
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 969 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: cadena doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: sí
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: H. influenzae 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 2019
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CÉLULA: bacteria
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(3) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 31 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: H. influenzae 
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CEPA: 2019
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
FUENTE INMEDIATA: sintetizado
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCAATATGGC GCAAAATAGG ATAGGGAAGA C 
\hfill
31 
\vskip1.000000\baselineskip
(4) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 9 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: H. influenzae 
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
OTRA INFORMACIÓN: secuencia captada para transformación
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGTGCGGT 
\hfill
9 
\vskip1.000000\baselineskip
(5) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
OTRA INFORMACIÓN: hidrida con el ARNm de TNF\alpha
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ATCTCTCAGC TCCACGCCAT TGGCCAGGAG 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip
(6) INFORMACIÓN PARA LA ID SEC Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 30 nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CADENA: cadena sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
OTRA INFORMACIÓN: no hidrida con el ARNm de TNF\alpha
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTCCTGGCCA ATGGCGTGGA GCTGAGAGAT 
\hfill
30 
\vskip1.000000\baselineskip

Claims (8)

1. Una formulación para vacuna que comprende una endotoxina mutante purificada a partir de un patógeno bacteriano gram negativo mutante htrB, caracterizado porque el lípido A de la endotoxina mutante es el mismo que el lípido A de la endotoxina de tipo silvestre excepto porque carece de una o más cadenas acilo secundarias y porque la endotoxina mutante se conjuga con una proteína vehículo, en la que la endotoxina mutante tiene la toxicidad sustancialmente reducida cuando se compara con la endotoxina del patógeno bacteriano gram negativo de tipo silvestre.
2. La formulación para vacuna según la reivindicación 1, que adicionalmente comprende un vehículo fisiológico y un adyuvante.
3. Un procedimiento de fabricación de una formulación para vacuna que comprende mutar un gen htrB que codifica una endotoxina de tipo silvestre en un patógeno bacteriano gram negativo para proporcionar una endotoxina mutante; caracterizado por purificar la endotoxina mutante y conjugar la endotoxina mutante purificada a una proteína vehículo, en el que el lípido A de la endotoxina mutante es el mismo que el lípido A de la endotoxina de tipo silvestre excepto porque carece de una o más cadenas acilo secundario y en el que la endotoxina mutante tiene la toxicidad sustancialmente reducida cuando se compara con la endotoxina del patógeno bacteriano gram negativo de tipo silvestre.
4. Un procedimiento según la reivindicación 3, que adicionalmente comprende la purificación mediante una extracción fenol/agua o una digestión con proteasa.
5. Uso de una endotoxina mutante en la fabricación de una vacuna para inmunizar a un individuo para prevenir la enfermedad causada por un patógeno bacteriano gram negativo, estando codificada dicha endotoxina mutante por un gen htrB de un patógeno bacteriano gram negativo, y en el que dicha endotoxina mutante tiene toxicidad sustancialmente reducida cuando se compara con la endotoxina del patógeno bacteriano gram negativo de tipo silvestre y se conjuga con una proteína vehículo;
caracterizado porque el lípido A de la endotoxina mutante es el mismo que el lípido A de la endotoxina de tipo silvestre excepto porque carece de uno o más cadenas acilo secundarias.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que el individuo es un ser humano.
7. Uso según la reivindicación 5, en el que el individuo es un animal, y la vacuna se formula para introducirse por una vía de administración seleccionada entre el grupo compuesto por administración intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, ocular, intranasal y oral.
8. Uso según la reivindicación 5, en el que la formulación para vacuna comprende adicionalmente un vehículo fisiológico y un adyuvante.
ES96942080T 1995-12-01 1996-11-27 Mutantes no toxicos de bacterias patogenas gram negativas. Expired - Lifetime ES2248825T3 (es)

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US08/565,943 US6887483B2 (en) 1995-12-01 1995-12-01 Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria
US09/077,572 US7005129B1 (en) 1995-12-01 1996-11-27 Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria

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