JP2001500363A - 病原性グラム陰性細菌の非毒性変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体を同定し、単離し、そして生成するための方法が提供される。前記方法は、機能的htrBタンパク質の欠失が存在するようグラム陰性細菌病原体のhtrB遺伝子を突然変異誘発することを含んで成り、野生型グラム陰性細菌病原体に含まれる１又は複数の第二アシル鎖を欠いており、そして野生型株に比較して、実質的に低められた毒性を示す突然変異体をもらたす。また、本発明は、ワクチン調製物の予防的有効量を投与することによって、グラム陰性細菌病原体により引き起こされる感染に対して個人を免疫化するために、htrB変異体、それから単離された内毒素、又はキャリヤータンパク質に接合されている、それから単離された内毒素を含むワクチン調製物を使用するための方法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 病原性グラム陰性細菌の非毒性変異体 発明の分野 本発明は、グラム陰性細菌病原体の変更された内毒素(endotoxin)(リポオリゴ 糖(LOS)；リポ多糖(LPS))を含んで成る組成物に関する。より具体的には、本発 明は、実質的に毒性の脂質Ａ部分を欠いている、遺伝子操作されたグラム陰性病 原体による内毒素形の製造に関する。実質的に解毒された内毒素、及びその実質 的に解毒された内毒素を生成するグラム陰性細菌変異株の予防的及び治療的使用 がまた、開示される。 発明の背景 グラム陰性細菌は、たとえばタンパク質、リポタンパク質、リン脂質及び糖脂 質のごとき成分から成る外層膜(outer membrance)を有する。糖脂質は、細菌の 属に依存して、主に内毒素−リポ多糖類(LPS)又はリポオリゴ糖類(LOS)を含んで 成る。LPSは、 ａ）エステル及びアミド結合においてリン酸基及び長鎖脂肪酸 により置換されているグルコサミン二糖から成るリピドＡ部分； ｂ）８炭糖、すなわちKDO(キトデオキシオクトノエート）、及びヘプトース、 グルコース、ガラクトース、及びＮ−アセチルグルコサミンによりリピドＡに結 合されるコア多糖；及び ｃ）細菌の属及び種に依存して、マンノース、ガラクトース、Ｄ−グルコース 、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｌ−ラムノース、 及びジデオキシヘキソース（アベクオース、コリトース、チベロース、パラトー ス、トレハロース）を含む ことができる反復オリゴ−糖単位から成るＯ−特異的側鎖から成る。LOSは、リ ピドＡ部分及び複合糖質構造体を含む、LPSと類似する構造を有するが、しかし それは反復Ｏ−側鎖を含まないことにおいて異なる。 グラム陰性細菌の主要抗原決定因子は、LPSのＯ−特異的側鎖の糖質構造体及 びLOSの複合糖質構造体に存在すると思われる。それらの糖質構造体は、糖組成 ；オリゴ糖の配列；オリゴ糖間の結合；及びオリゴ糖（特に末端オリゴ糖）の置 換／修飾の１つ又は複数を変えることによってグラム陰性細菌の同じ属の異なっ た種のために変化することができる。 LPS及びLOSは、それらの糖質構造体に存在する抗原決定因子（“エピトープ” ）のためにワクチン免疫原としての可能性を有する細菌成分として考えられて来 た。しかしながら、LPS及びLOSの化学的性質は、ワクチン配合物におけるそれら の分子の使用を妨げ、すなわちLPS又はLOSによる活性免疫化はリピドＡ部分の固 有毒性により許容できない。血流におけるLPS又はLOSのリピドＡにより（直接的 に又は間接的に）誘発される病理生理学効果は、発熱；白血球減少症；白血球増 加症；Shwartzman反応；散在性血管内凝固；流産；及びより多くの用量でのショ ック及び死を包含する。従って、LPS又はLOSエピトープに対する抗体応答を誘発 する現在利用できるワクチンは存在しない。 図１に示されるように、内毒素のリピドＡ部分は一般的に、一リン酸化される か又は二リン酸化され（位置１及び４’）；そしてエステル−及びアミド−結合 された脂肪酸の少なくとも６個の分子を担持するグルコサミン二糖の親水性主鎖 を含んで成る。（Ｒ）−３−ヒドロキシテトラデカノエート（たとえば３−ヒド ロキシ−ミリストイル又はβ−ヒドロキシミリスチル酸又はβ−OH）の４種の分 子が、位置２，３，２’、及び３’でリピドＡ主鎖に対して直接的に結合される 。β−OHの４種の分子のうち２種のヒドロキシ基は、アシルオキシアシル基を形 成することにおいて通常の脂肪酸（“第２アシル鎖”と称し、そしてドデカノエ ート、テトラデカノエート及びヘキサデカノエートを包含する）により置換され る。 解毒された内毒素分子を製造するための１つのアプローチは、内毒素の単離、 及びヒト好中性アシルオキシアシルヒドロラーゼにより前記単離された内毒素の 酵素的処理を含む（アメリカ特許第4,929,604号、第5,013,601号及び第5,200,18 4号）。前記アシルオキシアシルヒドロラーゼは脂肪酸（非ヒドロキシル化、第 二アシル鎖）を、そのエステル結合からβ−OH(ヒドロキシル化）のヒドロキシ 基に加水分解する。酵素処理から得られる変更された内毒素は非ヒドロキシル化 脂肪酸を欠くリピドＡ−を含んでいた。この変更された内毒素は低下した生体内 毒性を示したが、抗原性を維持していた。 もう１つのアプローチは、位置３で還元性末端グルコサミン主鎖にエステル結 合しているβ−OHを選択的に除去することによって、単離された内毒素を修飾す る方法を包含する（アメリカ特許第4,912,094号；アメリカ再発行特許B1 4,912, 094号）。β−OHの選択的除去は、アルカリ加水分解を用いて達成される。得ら れる修飾された内毒素は減じられたインビボ毒性を示すが、しかし抗原性を保持 した。 両アプローチは、単離された内毒素を化学的に処理することを包含する。いず れのアプローチは、実質的に減じられた毒性を有するが、まだ抗原性を保持して いる内毒素のグラム陰性細菌病原体における生成を開示しない。さらに、実質的 に減じられた毒性を有するが、まだ抗原性を保持している内毒素を生成するため に構築された グラム陰性細菌の、内毒素ショック及びグラム陰性菌血症に対する予防又は治療 用のワクチンへの使用の開示は存在していない。 発明の要約 本発明は、野生型内毒素に比較して実質的に減じられた毒性を示し、そしてそ の対応する野生型内毒素の抗原性を保持するLPS又はLOSを、変異体グラム陰性病 原体において生成するための方法に向けられる。前記方法は、突然変異誘発され たグラム陰性細菌病原体において機能的HtrBタンパク質の欠失が存在するようグ ラム陰性細菌病原体のhtrB遺伝子に突然変異を創造することを含んで成る。htrB 変異体により生成されたリピドＡは脂肪酸（ヒドロキシル化されていない又は第 二アシル鎖）の１つ又は両者を欠いており、それにより内毒素を単離された形で 示し、又は変異体グラム陰性細菌病原体が野生型に比較して、毒性において実質 的に減じられているが、まだ抗原性を保持している内毒素を生成することが見出 された。htrB変異体から単離された内毒素、又はhtrB変異体自体（完全な細胞ワ クチン）は、LPSのＯ−変異的側鎖の糖質構造体及びLOSの複合糖質構造体に存在 する主要抗原性決定因子に対する抗体を誘発することによって、グラム陰性菌血 症の危険性を有する個人を免疫化するために使用され得る。さらに、htrB変異体 は、多価ワクチンでの予防接種された個人の免疫系への提示のためにhtrB変異体 の表面で他の微生物病原体の異種抗原を発現するために構築され得る。また、本 発明のhtrB変異体から単離された内毒素は、受動免疫のために、及び臨床検体に おけるグラム陰性細菌病原体の存在の検出に向けられる診断アッセイのための試 薬として有用であり得るLPS−又はLOS−特異的抗体を生成するために使用され得 る。 図面の簡単な説明 図１は、エンテロバクテリアセアエ（Enttrobacteriaceae）科のグラム陰性細 菌のリピドＡの一般的構造の図である。 図２Ａは、ペンタアシルジホスホリルリピドＡを含んで成る、htrB変異体のLO SからのリピドＡの種の一般構造の図である。 図２Ｂは、テトラアシルジホスホリルリピドＡを含んで成る、htrB変異体のLO SからのリピドＡの種の一般構造の図である。 図３は、TNFα開放アッセイにおける、野生型細菌（□）と比較して、htrB変 異体（○，△）の相対的毒性を示すグラフである。 図４は、刺激されていないか（対照）、NTHi 20l9 LOSに暴露されているか又 はhtrB変異体B29 LOSに暴露されており、そしてTNFα mRNAに対してハイブリダ イスする螢光プローブ（プローブ１）又は対照螢光プローブと反応するヒト一次 呼吸上皮細胞を示すグラフである。 図５は、NTHi 20l9(プール595)、htrB変異体B29 LOS(プール597)、又はキャリ ヤータンパク質に接合されたhtrB変異体B29 LOS(プール606)とアジュバンドとに より免疫化されたマウスからのELISAにおけるNTHI 20l9 LOS(抗原被膜）に対す る抗−LOS抗体の平均力価を示すグラフである。 図６は、NTHi 2019(プール595)、htrB変異体B29 LOS(プール597)、又はキャリ ヤータンパク質に接合されたhtrB変異体B29 LOS(プール606)とアジュバンドとに より免疫化されたマウスからのELISAにおけるhtrB変異体B29 LOS(抗原被膜）に 対する抗−LOS抗体の平均力価を示すグラフである。 図７は、野生型サルモネラ（Salmonella）リピドＡ及びhtrB変異体リピドＡの 構造を比較する図である。 発明の詳細な説明定義 “内毒素”は、グラム陰性細菌病原体のLPS又はLOSに言及するために明細書及 び請求の範囲において使用される用語であり、ここで内毒素は細胞結合形又は単 離された形のいづれかで存在する。“htrB内毒素”及び“htrB変異体内毒素”と は、グラム陰性細菌病原体htrB変異体から単離され、そして精製された内毒素を 意味する。 “ワクチン候補又はワクチン抗原”は、次の性質（ａ）−（ｄ）の１又は複数 を有する内毒素エピトープに言及するために明細書及び請求の範囲に使用される 用語である：（ａ）免疫原性である；（ｂ）表面が露出している（当業界におい て知られている技法、たとえば免疫螢光アッセイ、電子顕微鏡染色法、及び殺細 菌アッセイにより示され得る）；（ｃ）補体の存在下で殺細菌活性を有する抗体 を誘導し、そして／又は免疫クリアランス機構において機能する；（ｄ）エピト ープの他の機能的活性（免疫原性又は毒性、等）を中和する抗体を誘発する。 “グラム陰性細菌病原体”とは、次のものを包含する属及び種の１又は複数の 病原性（ヒト又は動物に対して）細菌について本明細書で使用される用語である ：ネイセリア メニンジチジス（Neisseria meningitidis）、ネイセリア ゴノ ルホエアエ(Neisseria gonorrhoeae)、ハエモフィラス インフルエンザエ（Hae mophilus influenzae）、ハエモフィラス ジュクレイ(Haemophilus ducreyi)、 他のハエモフィラス種、モラキセラ カタルハリス(Moraxellaｃatarrhalis)、 カムピイロバクター ジェジュニ（Campylobacterjejuni）、サルモネラ チピ ミリウム（Salmonella typhimurium）、他のサルモネラ種、シゲラ ジセンタリ アエ（Shigella dysentariae）及び他のシゲラ種、及びプソイドモナス アエル ギノサ（Ps eudomonas aeruginosa）。 “毒性の実質的な低下”とは、野生型内毒素に比較して、少なくとも10倍〜10 0倍又はそれ以上の生物活性の低下に言及するために本明細書及び請求の範囲に おいて使用される用語である。 “キャリヤータンパク質”とは、htrB変異体内毒素に接合されるタンパク質に 言及するために本明細書及び請求の範囲において使用される用語である。htrB変 異体内毒素はそれ自体、免疫原性であると思われるが、キャリヤータンパク質に 対する接合が免疫原性を促進できることは当業界において知られている。本発明 に従って利用され得るタンパク質は、哺乳類に対する投与のために安全であり、 そして免疫学的に効果的なキャリヤータンパク質として作用することができるい づれかのタンパク質を包含する。特定の態様においては、細胞表面タンパク質、 膜タンパク質、毒素及びトキソイドが使用され得る。安全性についての基準は、 一次毒性の不在及びアレルギー反応の最小の危険性を包含するであろう。ジフテ リア及び破傷風トキソイドはそれらの基準を満たし；すなわち、適切に調製され る場合、それらは非毒性であり、そしてアレルギー反応の発生率は許容できる低 さである。アレルギー反応の危険性は成人に関しては有意義であるが、それは幼 児に関しては最小である。 本発明のさらなる特定の態様によれば、適切なキャリヤータンパク質は、サル モネラ・フラゲリン（Salmonella flagellin）、ハエモフィラス・ピリン(Haemo philus pilin)、シュードモナス・ピリ（Pseudomonaspili）、シュードモナス・ エキソトキシン（Pseudomonas exotoxin）、ハエモフィラスの外層膜タンパク質 (15KDa、28〜30KDa及び40KDaの膜タンパク質）、又はＮ．メニンギチジス(N．me ningitidis)又はＮ．ゴノルヘアエ(N．gonorrheae)、エスシェリヒア・コリ（Es cherichia coli）熱不安定エンテロトキシンL TB、コレラ毒素、Ｓ．ニウモニアエ(S．pneumoniae)のニウモリシン(Pneumolysi n)、及び種々のタンパク質、たとえばロタウィルスVP７及び呼吸シンチシウムウ ィルスＰ及びＧタンパク質を包含するが、但しこれらだけには限定されない。さ らに、当業界において知られている多くのキャリヤータンパク質、たとえばキー ホールリッペット・ヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、及びジフテリア・トキ シン架橋反応性変異体タンパク質(“CRM”)が存在するが、但しこれらだけには 限定されない。さらに、内毒素をキャリヤータンパク質に接合するための当業界 において知られているいくつかの方法が存在する。そのような方法は、グルタル アルデヒド、又はスクシンイミジンｍ−マレイミドベンゾエート、又は１−エチ ル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドの使用、又はブロモア セチル化されたキャリヤータンパク質の使用を包含するが、但しそれらだけには 限定されない（たとえば、Robeyなど.，1989，Anal.Biochem．177：373-377を参 照のこと）。キャリヤータンパク質毒素へのhtrB内毒素の接合は、キャリヤータ ンパク質毒素の毒性を減じることができるが、しかし残留毒性は存続する。さら なる解毒は、当業界において知られている手段、たとえばキャリヤータンパク質 毒素の遊離アミノ基と反応するホルマリンを用いることによって達成され得る。 あるいは、生来のキャリヤータンパク質毒素は、htrB変異体内毒素への接合の 前、従来のトキソイドを生成するためにホルマリンにより解毒され得る。しかし ながら、従来のホルマリン処理は、接合工程の間、反応のために利用できる遊離 アミノ基の数を減じる。CRMは、それらが、それらのアミノ基のどれもまだホル マリンにより支配されていない固有の毒性を有さないことにおいて利点を有する 。生来の毒素に対して免疫学的に同一であるCRM197の場合、ホルマ リンによる処理は（解毒するための必要性は存在しないけれども）、免疫学的応 答をひじょうに増強する。これは、身体の機構及び／又は架橋による凝集（粒子 の免疫性はサイズと共に上昇する）による分解に対する分子の安定化によると思 われる。破傷風菌及びジフテリア毒素は望ましいキャリヤータンパク質であるが 、また適切であり得る他の候補キャリヤータンパク質が存在する。キャリヤーの ためのそのような他の候補は、シュードモナス(Pseudomonas)、スタフィロコッ カス（Staphylococcus）、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ペルツシス(Pe rtussis)及びＥ．コリ(E．coli)の毒素及びタンパク質を包含する。 キャリヤータンパク質に対する内毒素の接合は、種々の方法により、たとえば 臭化シアン、還元性アミノ化、又は二官能価リンカーの使用によるキャリヤータ ンパク質への直接的な接合により実施され得る。そのような二官能価リンカーは 、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドに基づくリンカー、すなわちシスタミン、グル タルアルデヒド及びジアミノヘキサンを包含するが、但しそれらだけには限定さ れない。htrB内毒素はＮ−ヒドロキシスクシンイミドに基づくリンカーの使用に より、又はシスタミンのカルボジイミドー介在の縮合の使用によりスルフヒドリ ル基を含むように修飾される。次に、スルフヒドリル含有htrB内毒素中間体が、 Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルブロモアセテートにより誘導体化されたキャリ ヤータンパク質に反応せしめられる。好ましくは、スルフヒドリル基は、ブロモ アセチル化されたキャリヤータンパク質とのチオール結合を製造するために、接 合するhtrB内毒素に対して暴露される。 本発明の特定の態様においては、htrB変異体内毒素は、その内毒素の第一アミ ノ基をチオール化するために、長鎖のスルホＮ−スクシンイミジル３−（２−ピ リジルチオ）−プロピオネートを用いる ことにより、キャリヤータンパク質、たとえばCRMに接合され得る。長鎖のスル ホＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルチオ)−プロピオネートが、１：１ （ｗ／ｗ）の比で、0.1ＭのNaHCO₃（pH7.0）におけるhtrB内毒素の糖成分約13mg に添加され、そして室温で１時間インキュベートされる。次に、その混合物がゲ ル濾過により精製される。長鎖のスルホＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジ ルチオ）−プロピオネート誘導体化画分がプールされた。その誘導体化された画 分に存在するＮ−ピリジルジスルフィドが100mMのジチオトレイトールにより還 元され、そしてゲル濾過により精製された。次に、チオール化された内毒素画分 が集められた。CRM197が、４℃で１：１（ｗ／ｗ）の比で、CRM（0.1ＭのNaHCO₃ における）に少体積のジメチルホルムアミド液滴におけるブロモ酢酸Ｎヒドロキ シスクシンイミドを添加することによってブロモアセチル化された。その溶液が 混合され、そして室温で１時間インキュベートされた。次に、その反応混合物が ゲル濾過により精製され、そしてブロモアセチル化されたタンパク質を含む画分 が集められた。ブロモアセチル基へのキャリヤータンパク質上のアミノ基の誘導 体化は、遊離アミノ基の量の低下によりモニターされた。0.1ＭのNaHCO₃におけ るブロモアセチルCRMが、0.1ＭのNaHCO₃／1mMのEDTAにおける１：1.5(ｗ／ｗ)の タンパク質：内毒素の比でチオール化されたhtrB変異体内毒素に添加され、そし てその反応が４℃で一晩、インキュベートされた。次に、最終接合体がリン酸緩 衝溶液（pH6.9）においてゲル濾過により精製された。 本発明の方法及び組成物は、グラム陰性細菌病原体のLPS及びLOS生合成路に関 する。より具体的には、本発明は、同じ種の野生型細菌を比較して、実質的に減 じられた毒性であるが、まだ抗原性を保持する内毒素を生成する変異体細菌をも たらすグラム陰性細菌病 原体のhtrB遺伝子における突然変異誘発に関する。 腸内細菌のリピドＡ生合成の遺伝学は、本発明の時点では知られているので、 Schnaitman and Klena（1993，Microbiol.Rev．57：655-682）に要約されている 。遺伝子1 pxA，1 pxB，1 pxC、及び1 pxDは、グルコサミンへのβ−ヒドロキシ ミリスチン酸の移行を包含するリピドＡのグルコサミン主鎖に対して機能する遺 伝子生成物をコードする。htrB遺伝子は、高温でＥ．コリの増殖のために必要な 遺伝子についてのスクリーンの間、発見された内部コア構造体(KDO、ヘプトース 、ホスホリルエタノールアミン(PEA))に影響を及ぼす遺伝子として説明されてい る。htrBのノックアウト突然変異誘発は、デオキシコレートに対する減じられた 感受性、32.5℃以上の温度で増殖しない能力、及びLPS染色の強さの低下を示す 変異体Ｅ．コリをもたらした（Schnaitmanなど.，1993、前記；Karowなど.，199 2，J.Bacteriol．174：7407-7418）。Karowなどは、さらに、約30℃〜約42℃の 間で、Ｅ．コリhtrB変異体がLPS及びリン脂質の両者の脂肪酸組成の変化を有し 、そして特に、野生型に比較して、リン脂質を過剰生成することを示した。しか しながら、エステル−又はアミド結合の脂肪酸の少なくとも６個の分子のうち１ 又は複数の分子がhtrB変異体のLPSのリピドＡ部分に欠失していることは知られ ても、又は提案されてもいない。また、htrB変異体が内毒素を担当する１又は両 者の非ヒドロキシル化された（第二アシル鎖）脂肪酸を特別に欠いているリピド Ａ成分を含んでいること、すなわちhtrB変異体が野生型に比較して、減じられた インビボ毒性を示すが、しかし抗原性（“htrB内毒素”）を保持している変更さ れた内毒素を含むことは言及されていなかった。 本発明を含んで成る発見は、グラム陰性細菌（エンテロバクテリアセアエ科を 包含する）のhtrB遺伝子のノックアウト突然変異誘発 が、β−OHの４個の分子の２個のヒドロキシル基にエステル結合される１又は複 数の第二アシル鎖脂肪酸を特異的に欠いているhtrB変異体をもたらす予測できな い結果を包含する（図２に示されるような）。従って、HtrBタンパク質がアシル トランスフェラーゼ活性を有するか、又はアシルトランスフェラーゼ活性の調節 に間接的に又は直接的に影響を及ぼすと思われる。次の例は、本発明の観点の好 ましい態様を例示するために提供されており、そして本発明の範囲を制限するも のではない。特に、好ましい態様は、Ｈ．インフルエンザエhtrB変異体の製造で あり、そして完全な細胞として前記変異体をワクチン調製物に使用し、又はそれ から内毒素を単離し、又は治療又は診断用途のための抗体を生成する方法である 。しかしながら、リピドＡ成分は、エンテロバクテリアセアエ科の細菌及び密接 に関連するグラム陰性細菌間で高く保存されるので、本発明は、前に本明細書に おいて定義されたように、グラム陰性細菌病原体に関する。第二アシル鎖の長さ （12又は14個の炭素鎖）に関して微小不均質性が存在し、そしてそのアシル鎖に 対して、前記４個のβ−OHの１，２又は４個のヒドロキシル基が置換されている が(Erwinなど.，1991， Infect Immun 59:1880-1887)；しかしながら、その置 換の性質は同じであり、そして従って生合成路に関与する特定の段階（遺伝子及 び遺伝子生成物）は保存されているように思える。たとえば、ヒトアシルオキシ アシルヒドロラーゼを用いての種々のグラム陰性細菌病原体（Ｅ．コリ、Ｈ．イ ンフルエンザエ、Ｐ．アエルギノサ、Ｓ．チピミリウム及びＮ．メニンギチジス ）からの第二アシル鎖の除去は、それぞれの野生型株に比較して、有意に減じら れたマイトジェン活性を有する、試験されたすべての種からの除アシル化された LPSをもたらした(Erwinなど.，1991、前記)。例 １ htrB遺伝子の同定、及びhtrB変異体の生成 Ｓ．チピミリウムrfaE変異体株により、分類できないＨ．インフルエンザエ株 2019を補完することによって、Ｈ．インフルエンザエ株2019のrfaE遺伝子をクロ ーン化した(Leeなど.，1995，Infect Immun 63：818-824)。Ｈ．インフルエンザ エrfaE遺伝子の上流領域の配列分析は、Ｅ．コリhtrB遺伝子に対して高い相同性 のオープンリーディングフレームを示した。Ｈ．インフルエンザエhtrB遺伝子は 、933個の塩基を含んで成り、そして311個のアミノ酸（配列番号1）及び36KDaの 推定分子サイズのタンパク質、すなわちHtrBをコードする。Ｅ．コリHtrBとＨ． インフルエンザエHtrBとの推定されるアミノ酸配列の比較は、共有された相同性 （56％の同一性及び73％の類似性）を示した。プラスミド中へのＨ．インフルエ ンザエのhtrB遺伝子のクローニング、及び続くインビトロ転写−翻訳分析は、Ht rBが32〜33KDaの見掛け分子サイズを有することを示した。 細菌遺伝子を突然変異誘発するための種々の標準技法は、当業界において知ら れている。それらの技法は部位特定突然変異誘発、及びトランスポゾンを用いて のシャトル突然変異誘発を包含する。この態様の１つの観点においては、htrB遺 伝子の突然変異誘発を、シャトル突然変異誘発により実施した。細菌トランスポ ゾンTn３の誘導体、すなわちmini-Tn3(Seifertなど.，1986，Proc.Natl.Acad.Sc ｉ．USA83：735-739)を、挿入配列として使用し、htrB遺伝子を突然変異誘発し た。Ｈ．インフルエンザエからのhtrB遺伝子を含む2.4kbのBalIIを、mini-Tn3ト ランスポゾン突然変異誘発のための標的物として使用されるプラスミド中にクロ ーン化した。手短に言及すれば、htrB遺伝子を含むプラスミド；Tn３トランスポ ジションに対して免疫性の及びトランスポザーゼ（Tn３と標的分子との間の同 時組込みを仲介する）を含むプラスミド；及びmini-Tn3を含むプラスミドを、単 一の細菌細胞（Ｅ．コリ）中に導入する。 トランスポジションを可能にした後、細菌細胞を、シャトル突然変異誘発にお ける同時組込みを決定するために使用されるcre酵素を含むＥ．コリ株と接合す る。トランス接合体を、抗生物質（カナマイシン、アンピシリン及びストレプト マイシン）により選択し、そして制限エンドヌクレアーゼ消化により分析した。 クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を含むmini-Tn 3トランスポゾンを個々に有する、pB28及びpB29と称する２種のプラスミドを、 異なった位置でhtrBオープンリーディングフレーム中に挿入した。個々のプラス ミドを分類できないＨ．インフルエンザエ株2019を形質転換するために使用し、 そして細菌細胞形質転換体をクロラムフェニコール(1.5μｇ／ml)の存在下での 増殖により選択し、それぞれNTHi B28及びＢ29と称する変異体株の同定をもたら した。NTHi変異体の染色体におけるmTn3挿入の位置を、プローブとして2.4kbのB glIIフラグメントを用いてゲノムサザンハイブリダイゼーションにより確かめた 。特に、NTHi株2019 DNAのBglII消化物が2.4kbのフラグメントをもたらし；そし て変異体NTHi B28及びB29からのDNAの類似する消化物が4.0kbのフラグメントを 表わした。さらに、前記4.0kbのフラグメントを、mTn3に存在するEcoRＩにより 消化した。 あるいは、細菌遺伝子中への部位特定突然変異誘発（たとえば、Halladay，19 93，J.Bacteriol．175：684-692を参照のこと）及び細菌染色体中への突然変異 誘発された細菌遺伝子の組換えを実施するための方法は、当業界において知られ ている。選択可能なカナマイシン耐性カセットを、シャトルプスラミド内に含ま れるhtrB遺伝子中に挿入し、そしてそれを突然変異誘発するために使用すること ができる。シャトルプラスミドによる細菌宿主細胞の続く形質転換、及びhtrBフ ランキング配列を通しての前記カセットによる細菌ゲノムの組換え（htrB遺伝子 のゲノムコピーの部位での）は、細菌htrB遺伝子の特定部位の突然変異誘発をも たらす。 プライマー延長分析を用いて、htrB遺伝子のプロモーター領域を決定した。Ｈ ．インフルエンザエhtrBプロモーター領域を、細菌をまず増殖せしめ、RNAを収 穫し、そして精製し、そして製造業者の提案に従って市販のプライマー延長キッ トを用いることによってプライマー延長分析により決定した。単一の転写部位を 、htrBオープンリーディングフレームの５’側領域に対して相補的なプライマー （配列番号２）を用いて見出した。第１のヌクレオチドは、推定上の翻訳開始部 位をATGの21bp上流に位置するシトシン（Ｃ）であった。転写開始部位の上流の 領域は、適切な距離での細菌δ⁷⁰−依存性プロモーターのコンセンサス−10領域 に類似する配列（配列番号１、塩基13〜29）を含んだ。要素（配列番号１、塩基 １〜６）は、−35領域のコンセンサス配列に類似する。例 ２ htrB変異体の特徴化増殖特徴 NTHi B28及びB29株をまず、30℃で選択し、そしてそれらの株は37℃で増殖す ることができなかった。30℃でのさらなる継代により、NTHi htrB変異体は温度 感受性を失ない始め、そしてNTHi 2019に比較して、37℃で、遅い増殖速度を示 した。しかしながら、38.5℃よりも高いか又は等しい増殖温度に関しては、温度 感受性はhtrB変異体について存続した。 Ｅ．コリhtrB変異体がカナマイシン及びデオキシコレートを包含する種々の化 合物に対する膜透過能力の変化を示したことはすでに 報告されている(Karowなど.，1992、前記)。NTHi htrB変異体をまた、カナマイ シン及びデオキシコレートに対する感受性について試験した。30℃で増殖した一 晩培養物を希釈し、そして30℃又は37℃で５μｇ／mlのカナマイシンの存在下で の増殖を許容した。30℃で、カナマイシンの不在下でNTHi 2019とNTHi htrB変異 体株との間での増殖速度における差異は検出されなかった。しかしながら、htrB 変異体の増殖は、カナマイシンの存在下で有意に阻害されたが、NTHi 2019は影 響されなかった。htrB変異体に関しては、カナマイシンに対する感受性は37℃で さらに高かった。なぜならば、前記変異体は37℃でカナマイシンの存在下で増殖 を示さなかったからであった。同様に、30℃で、htrB変異体は、NTHi株2019に比 較して、500μｇ／mlよりも高いデオキシコレート濃度で感受性を示し、そして1 000μｇ／mlで増殖しなかった。37℃で、htrB変異体は、わずか250μｇ／mlのデ オキシコレートの存在下で増殖のほとんど完全な阻害を示した。エンドトキシンの特徴 Ｅ．コリhtrB変異体のLPSは、銀−染色されたポリアクリルアミドゲル上で弱 く染色されるものとして特徴づけられているが、しかしその移動パターンは、野 生型からのLPSと比較して、異ならなかった。対照的に、NTHi変異体Ｂ28及びＢ2 9からのLOSは、銀−染色されたゲル上でNTHi株2019からのLOSよりも早く移動し た。さらに、Ｂ28及びＢ29変異体からのLOSは、NTHi 2019により示されるように 、黒色よりもむしろ茶色がかった色を示した。無償のhtrB遺伝子を有するプラス ミドを変異体中に導入することによるNTHi変異体Ｂ29の再構成により、増殖特徴 並びにLOS移動及び染色の差異がhtrB遺伝子の突然変異によることが確認された 。 LOSの異なる成分についての分子質量プロフィールを提供するた めに、NTHi htrB変異体LOS及び野生型LOSがエレクトロスプレーイオン化−質量 スペクトル計（ESI-MS）によりそれぞれ分析された。最初に、LOSをそれぞれの 株から単離した。LPS及びLOSを、フェノールー水法（Westphalなど.，1965，Met hods in Carbohydyrate Chemistry 5:83-91）により；又はそれに代る精製方法 （プロテアーゼを用いる；Hitchockなど.，1983，J.Bacteriol．154：269-277） を用いて、単離することができる。次に、単離されたLOS種を温和なヒドラジン 処理によりＯ−除アシル化した（37℃で20分間；Phillipsなど.，1990，Biomed. Environ．Mass Spectrom．19：731-745を参照のこと）。異なるLOS種のESI-MSに よる分析が示すところによれば、NtHi変異体B29及びNTHi 20l9からのＯ−除アシ ル化されたLOSは分子質量プロフィールにおいて類似するが、２種の差異は明白 に識別され得た。htrB変異体においては、内部コア構造体に２つのホスホエタノ ールアミン(PEA)を含むLOSの量の低下（50％の低下）が存在し；そしてより多く のヘキソースを含む高分子量LOS種への移行が存在する。それらの発見は、リン 酸化の程度が特定のヘプトース成分からの鎖進行に影響を及ぼすことができ、そ してHtrBがLOSのリン酸化に直接的に又は間接的に影響を及ぼすことを示唆する 。 質量スペクトル計を用いてリピドＡを分析した。より具体的には、htrB変異体 LOS及び野生型LOSからのリピドＡを、異なった成分リピドＡのための分子イオン のスペクトルを提供するために、負のイオンモードで液体第二イオン質量スペク トル計(LSIMS)によりそれぞれ分析した。最初に、LOS種を、２mg／mlの濃度で、 １％酢酸中で100℃で２時間、それぞれ加水分解した。その加水分解物を遠心分 離し、そしてその上清液を除去した。水溶解性粗リピドＡ画分を水により２度、 及び有機混合物（２：１：１の体積比でのクロロ ホルム／メタノール／水）により１度洗浄し、そして次に、蒸発乾燥せしめた。 分析のために、リピドサンプルを、CH₂Cl₂／CH₃OH(３：１、ｖ／ｖ）及び１μｌ のニトロ−べンジルアルコール／トリエタノールアミン(１：１、ｖ／ｖ）に再 溶解し、そして次に、質量スペクトル計上に液体マトリックスとして適用した。 野生型(NTHi2019)のLSIMSは、１つ（ヘキサアシルモノホスホリルリピドＡ、Mr= 1744)又は２個（ヘキサアシルジホスホリルリピドＡ、Mr＝1824)のホスフェート を含むヘキサアシルリピドＡ構造体と適合する２つの保護解除された分子イオン を含むスペクトルを示した。このスペクトルは、Ｈ．ジュクレイ（H．ducreyi） のLOSのリピドＡ構造について報告されるスペクトルと実質的に同一である（Mel aughなど.，1992，J.Biol.Chem．267：13434-13439）。より低い質量のフラグメ ントは、より高い質量の一及び二リン酸化された分子イオン種のLSIMS−誘発さ れた断片化を通して生じるイオンであると思われる。 対照的に、htrB変異体LOSからのリピドＡ調製物のためのLSIMSスペクトルは、 野生型ヘキサアシルリピドＡ種に対応する分子イオンを欠いしている。１つの第 二アシル鎖（たとえばミリスチン酸成分）を欠いているモノ−及びジホスホリル ペンタアシルリピドＡ種のための分子イオンに対応する２種の高い質量のイオン が存在する。さらに、低い質量で、両第二アシル鎖を欠いているモノ−及びジホ スホリルテトラアシルリピドＡ種に対応する２種の追加の分子イオン種が存在す る。要約すれば、野生型のLOSのリピドＡ構造体はヘキサアシルであり；そしてh trB変異体のリピドＡ構造体は２つの種、すなわち少なくとも１つの及び時々、 両者の第二アシル鎖の損失を示すテトラアシル（図２Ａ）及びペンタアシル種（ 図２Ｂ）を示す。htrB変異体は、４個のヒドロキシミリスチン酸エステル及び アミド結合された脂肪酸のみを有する約90％のテトラアシルリピドＡ、及び１つ のミリスチン酸置換を有する約10％のペンタアシルリピドＡから成る。 例 ３ htrB変異体の実質的に減じられた毒性 グラム陰性細菌病原体の毒性に対する１又は複数の第二アシル鎖の欠失による 効果を、インビボ毒性を測定するために標準的インビトロアッセイを用いて試験 した。ネズミマクロファージ様細胞系J774は、内毒素により剌激される場合、TN Fαを分泌する。刺激性LPS及びLOSの毒性に対して直接的に比例するTNFαの量が 、（ａ）TNFαを含む細胞フリーの上清液を除去し；（ｂ）その上清液をTNFα− 感受性細胞系、たとえばWEHI164に添加し；そして（ｃ）その得られる細胞毒性 を測定することによって測定され得る（たとえば、Espevikなど.，1986，Ｊ.Imm unol Methods 95:99;Sakuraiなど.，1985，Cancer Immunol Immunother 20:6-10 ;Adamsなど.，1990，J Clin Microbiol 28:998-1001;Adamsなど.，1990，J Leuk oc Biol 48:549-56;Tsaiなど.，1992，Cell Immunol 144:203-16;及びPfisterな ど.，1992，Immunol 77：473-6を参照のこと）。 このアッセイにおいては、付着性J774細胞を培養物から除去し、PBS−１mMのE DTAにより洗浄し、そして次に、抗生物質を含まない完全組織培養培地により２ 度洗浄した。100mmの培養皿当たり２×10⁶〜４×10⁶個のJ774細胞を、CO₂インキ ュベーター内で、組織培養培地において一晩インキュベートした。付着性J774細 胞をPBS−１mMのEDTAにより除去し、組織培養培地により３度洗浄し、そして５ ×10⁵／mlに調節した。50μｌのアリコートを、丸底の96ウェルプレートのウェ ル当たりに添加した。次に、プレートをCO₂イン キュベーター内で１時間37℃でインキュベートした。htrB変異体又は野生型株の いづれかをウェル当たり種々のコロニー形成単位(cfu、感染用量）で添加する。 次に、プレートをCO₂インキュベーター内で１時間37℃でインキュベートする。 インキュベーションの後、50μｇ／mlのゲンタマイシンを含む培養培地をウェル 当たり100μｌ添加する。次に、プレートをCO₂インキュベーター内で一晩、37℃ でインキュベートする。J774上清液50μｌのアリコートをウェル当たり除去し、 そして平底の96ウェルプレートのウェル中に移した。連続的10倍希釈溶液をJ774 上清液から調整した。組換えTNFα（rTNFα）の希釈溶液シリーズが対照として 包含される。組織培養培地＋25mMのLiCl+２μｇ／mlのアクチノマイシンＤにお ける６×10⁵個の細胞／mlでのWEHI164クローンＢ細胞50μｌをウェル当たりに添 加し；そしてその混合物をCO₂インキュベーター内で一晩37℃でインキュベート した。インキュベーションの後、アロマーブルー10μｌを添加し、そして５〜７ 時間後、光学密度を570nmで読み取る。このアッセイは色彩インジケーターとし てアロマーブルーを用い；すなわちアロマーブルーは生存細胞により赤色に転換 されるが、しかし細胞が殺される場合、青色のままである。 図３は、TNFα−感受性細胞系WEHI164を殺すためにJ774細胞からの十分なTNF αの放出を剌激するために必要な、Ｈ．インフルエンザエ株2019(野生型、□） の細菌細胞の数とhtrB変異体NTHi B29（○及び△）の細菌細胞の数との間の比較 を示す。B29_hi（△）及びB29_LO（○）は、それぞれ、htrB変異体の継代の高い数 （＞3）及び低い数（＜3）を意味する。図３に示されるように、htrB変異体は、 TNFα放出を剌激する減じられた能力、すなわち約10倍の低下(B29_LO)〜約100倍 の低下(B29_hi)を示す。TNFαを刺激するこの減じられた能力は、内毒素のリピド Ａ部分における１又は複数の 第二アシル鎖の欠失による毒性の実質的な低下であるhtrB変異体の１つの表示で ある。 グラム陰性細菌病原性の毒性に対する１又は複数の第二アシル鎖の欠失による 効果をまた、インビボ毒性を測定するために標準の現場アッセイを用いて試験し た。SV-40形質転換されたヒト呼吸上皮細胞及びヒト一次呼吸上皮細胞は、内毒 素により剌激される場合、TNFαを生成し、この生成は、現場ハイブリダイゼー ションについて当業者に知られている方法を用いてのTNFα mRNAの検出により例 示され得る(MacNaulなど.，1990，Ｊ．Immunol．145：4154-66の変法）。細胞を 、ほぼ集密的(confluent)になるまで、24−ウェルプレートのウェル内で単層と して増殖する。細胞を剌激するために、lμｇ／mlのLOSを添加し、そしてその細 胞を37℃で一晩インキュベートする。対比染料（たとえば膜染色）を添加し、そ して次に、細胞を緩衝液における２％パラホルムアルデヒド0.5mlにより固定し 、その結果、対比染料を細胞中に直接的に固定する。次に、ハイブリダイゼーシ ョンを、TNFα RNAに対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブ（配列番号４ ）及び対照プローブ（配列番号５）を用いて実施する。視覚的に検出されるTNF α mRNAの量は、刺激性LPSの毒性に直接的に比例する。htrB変異体NTHi B29から 単離されたLOSに暴露された、SV-40形質転換されたヒト呼吸上皮細胞及びヒト一 次呼吸上皮細胞（図４）において、TNFα mRNAは、わずかに誘発した。これは、 それらのヒト呼吸細胞（図４）及び細胞系において高レベルのTNFα mRNAを誘発 した親株NTHi2019から単離されたLOSと対照的である。 TNFαアッセイにより観察されるように、１又は複数の第二アシル鎖の欠失に よる、htrB変異体により示される毒性の実質的な低下は、内毒素から第二アシル 鎖を選択的に除去するアシルオキシアシ ルヒドロラーゼにより処理された内毒素の生物活性のこれまでに報告されたアッ セイによりさらに支持される。Ｈ．インフルエンザエ、Ｎ．メニンギチジス及び Ｓ．チピミリウムからの除アシル化された内毒素は、（ａ）それぞれの野生型内 毒素に関して、Limulus溶解物試験において性能を同様に減じられ；（ｂ）それ ぞれの野生型内毒素に関して、ヒト内皮細胞に対する好中球付着を刺激する能力 を減じられ；そして（ｃ）ネズミ脾臓細胞に関するマイトジェン活性を減じられ るが(Erwinなど.，1991，Infect Immun 59：1881-1887)；まだ、抗原エピトープ の発現を保持されていた。同様に、アシルオキシアシルヒドロラーゼにより処理 されたＳ．チピミリウムは、皮膚Shwartzman反応において100倍又はそれ以上、 毒性の低下を示し；熱応答モデルにおいてほとんど発熱性ではなく；Ｂ−細胞マ イトジェン性において5〜12倍の低下を示し；そして野生型内毒素に比較して、 プロスタグランジンＥ₂の開放において10〜20倍の低下を示し、最大に除アシル 化されたLPSが野生型内毒素よりも少なくとも10倍低い毒性であることを結論づ けた（アメリカ特許第4,929,604号）。 例 ４ 免疫原としてのhtrB変異体の使用 この態様の１つの観点においては、グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体が完全 な細胞ワクチンとして使用される。ワクチン配合において免疫原としての生存弱 毒（病原を引き起こすその能力を弱められた）細菌の使用の利点は、それらが生 存することができ、そしてヒト又は動物本体において存続することができ、そし て従って、疾病に対して長期の免疫性を付与できることである。免疫応答を延長 するためへの生存細菌の使用の利点に関しては、グラム陰性細菌病原体htrB変異 体は、それらが実質的に減じられた毒性を示すことに おいて追加の利点を有する。細菌抗原を示す単離されたペプチドを含んで成るワ クチン配合物と比較して、もう１つの利点は、細菌細胞の表面上に発現される細 菌抗原がしばしば、免疫応答のより高い刺激をもたらすであろうことである。こ れは、エンテロバクテリアセアエ科の細菌の表面が、その上に提示される抗原に 対する免疫応答を増強するために天然のアジュバンドとして作用するからである (Wezler，1994，Ann NY Acad Sci 730:367-370)。従って、生来のコンホメーシ ョンで（すなわち細菌外層膜の一部として）完全なタンパク質を発現するためへ の生存細胞ワクチン、たとえばhtrB変異体の使用は、単離されたタンパク質のみ よりも、一層の保護免疫応答を誘発する傾向がある。 前に記載されたエンテロバクテリアセアエ科の生存細菌ワクチンベクターは、 弱毒サルモネラ株(Stockerなど.，アメリカ特許第5,210,035号；第4,837,151号 ；及び第4,735,801号；及びCurtissなど.，1988，Vaccine 6:155-160;それらは 引用により本明細書に組込まれる）、及びシゲラ・フレキセネリ(Shigella flex neri)(Sizemoreなど.，1995，Science 270:299-302;引用により本明細書に組込 まれる)を包含する。１つの好ましい態様は、ヒト又は動物（グラム陰性細菌病 原体の属及び種に依存する）粘膜病原体のためのワクチン供給系を提供すること である。従って、予防的有効量のhtrB変異体、又は追加の細菌抗原（形質転換さ れたhtrB変異体の増殖又は複製に対して負の効果を与えない）を組換え的に発現 するために形質転換されたhtrB変異体による非経口路又は粘膜路による免疫化は 、htrB変異体の表面上に示されるか、又はその変異体により分泌された抗原に対 する粘膜免疫性を誘発するために粘膜表面のコロニー化を導びくことができる。 その得られるhtrB変異体は、細菌抗原を発現するワクチン配合物に使用され得る 。 類似する方法が、不活性化されたhtrB変異休ワクチン配合物の構成に使用され 得るが、但し、htrB変異体は、免疫原としての使用の前及び発現される免疫原の 免疫原性に対して実質的に影響を及ぼさないで、当業界において知られている化 学的手段により不活性化される。たとえば、ヒト気管支粘膜免疫性は、溶解され たＨ．インフルエンザエを含んで成るエアゾールワクチンにより刺激されて来た (Latilなど.，1986，J Clin Microbiol 23:1015-1021)。生存htrB変異体ワクチ ン又は不活性化されたhtrB変異体ワクチンのいづれかが、この後、より詳細に記 載されるように、ワクチンベクターにより発現される抗原に対する免疫学的応答 をさらに増強するために適切なアジュバントと共に配合され得る。 この態様のもう１つの観点においては、内毒素は当業界において知られている 方法を用いてhtrB変異体から単離され、そしてその単離されたhtrB内毒素がワク チン配合に使用される。前で言及されたように、グラム陰性細菌の主要抗原決定 基は、LPSのＯ−特異的側鎖の糖質構造体及びLOSの複合糖質構造体に存在すると 思われる。しかしながら、LPS及びLOSの化学的性質がワクチン配合物におけるそ れらの分子の使用を妨げ；すなわちLPS又はLOSによる活性免疫化は内毒素のリピ ドＡ部分の第二アシル鎖の固有の毒性のために許容できない。グラム陰性細菌病 原体のhtrB変異体から単離された内毒素は、１又は複数の第二アシル鎖を欠いて おり、そして従って、それぞれの野生型細菌から単離された内毒素に比較して、 実質的に減じられた毒性を示す。従って、グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体か ら単離された内毒素は、それぞれの野生型グラム陰性細菌病原体に対する免疫性 を誘発することにおいてワクチン配合で使用され得る。LPS又はLOSは、フェノー ル−水方法(Westphalなど.，1965，Methods in Carbohydrate Chemistry 5:83-9 1)により；又は 二者択一の精製方法（プロテアーゼを使用する；Hitchcockなど.，1983，J.Bact eriol．154：269-277）を用いて、単離され得る。 予防接種されるべきヒト又は動物（“個人”として集合的に言及される）中へ のワクチン配合物の導入のための多くの方法は知られている。それらは、経皮内 、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、眼内、鼻腔内及び経口投与を包含するが、但 しそれらだけには限定されない。従来においては、生存細菌、又は弱毒化された 又は不活性化された細菌のいづれかを含むワクチン配合物が、注射又は経口投与 により投与される。たとえば、呼吸免疫性は、精製されたＨ．インフルエンザエ 抗原による腸内免疫化により刺激され得る（Crippsなど.，1992，J.Infect Dis 165S1:S199-201;引用により本明細書に組込まれる）。そのワクチン配合物は、h trB変異体細菌細胞又は単離されたhtrB変異体内毒素が懸濁されるキャリヤーと して生理学的に許容される溶液を含むことができる。種々のアジュバントがワク チン配合物に関して使用され得る。アジュバントは、免疫応答を調整することに より、及びワクチン抗原が単独で投与される場合よりも少量のワクチン抗原又は 少ない用量を用いて、より永続性の且つより高いレベルの免疫性を達成すること において助力する。アジュバントの例は、不完全フロイントアジュバント、アジ ュバント65（落花生油、マンニドモノオレエート及びアルミニウムモノステアレ ートを含む）、オイルエマルジョン、Ribiアジュバント、プルロニックポリオー ル、ポリアミン、アブリジン(Avridine)、Quil A、サポニン、MPL，QS-21及び鉱 物ゲル、たとえば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、等を包含する。ワ クチン配合物は、免疫応答を開始する個人の能力、誘発されるべき保護の程度、 及び投与の経路を包含する要因に依存して、免疫原性であるべき予備的に有効な 量で投与される。 本発明のもう１つの観点においては、ワクチン配合物は、経済的に重要な家畜 に与えられる飼料の一部としてそれを含むことによって経口投与され得る。当業 者により知られているように、ハエモフィラス、カムピイロバクター、プソイド モナス及びサルモネラの種は、経済的に重要な家畜のための病原体である。本発 明の方法を用いれば、次の例に例示されるように、そのような動物病原体のhtrB 変異体が生成され得る。その得られるhtrB変異体、又はそれから単離された内毒 素は、ワクチン配合物に使用され得る。動物飼料への種々の微生物病原体の１又 は複数の抗原を含むワクチン配合物の使用は、これまで記載されている（たとえ ば、Pritchardなど.，1978，Avian Dis 22:562-575を参照のこと）。 例 ５ 免疫原としてのＨ．インフルエンザエhtrB変異体 １つの態様において、htrB変異体は、Ｈ．インフルエンザエhtrB変異体である 。ハエモフィラス インフルエンザエは、中耳炎、慢性副鼻腔炎及び慢性閉塞性 肺疾患を包含する疾病における重要な呼吸気管病原体である。Ｐ２，Ｐ６及びLO Sを包含する一定の表面−暴露された細菌成分は、免疫化されたヒトにおいて保 護免疫応答を付与することができる抗原であると思われる。そのような抗原は殺 細菌抗体の標的物であることが示されており、血清殺細菌抗体の存在はＨ．イン フルエンザエによる感染からの保護に関連している(Fadenなど.，1989，Ｊ．Inf ect.Dis．160：999-1004)。 5.1この態様の１つの観点においては、htrB変異体から単離された内毒素はワ クチン配合物において免疫原として使用される。本明細書の例３に示されるよう に、グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離された内毒素は、１又は複数の 第二アシル鎖を欠いており、そして従って、それぞれの野生型細菌病原体から単 離された内毒 素に比較して、実質的に減じられた毒性を示す。従って、Ｈ．インフルエンザエ のhtrB変異体から単離された内毒素は、それぞれの野生型株に対する免疫性を誘 発することにおいてワクチン配合物に使用され得る。htrB変異体LOSは、LOSを単 離するための当業者に知られている方法により単離され得る。htrB変異体LOSは 、医薬的に許容できるキャリヤー（たとえば、生理学的溶液）、アジュバント又 はキャリヤータンパク質から成る群から選択された１又は複数の剤を含むワクチ ン配合物に使用され得る。 htrB変異体LOSによる免疫化の効果を示すためには、マウスモデルが使用され た。NTHi 2019 LOS及びhtrB変異体NTHi B29 LOSを、フェノール−水方法を用い て、それらのそれぞれの株から個々に単離した。少なくとも５匹のSwiss Webste rマウスのグループを、アジュバントQS-21と共に、１μｇのNTHi 2019，htrB変 異体B29 LOS、又はキャリヤータンパク質に接合されるhtrB変異体のいづれかに より皮下免疫下した。血清を、免疫化の５週間後、個々のグループから集め、そ してグループを含んで成る動物からの血清をプールした。そのプールされた血清 を、酵素結合されたイムノソルベントアッセイ(ELISA)により抗−LOS抗体の力価 について評価した。ELISAプレートのマイクロタイタープレートを、10μｇのNTH i 20l9、又はhtrB変異体B29 LOSのいづれかにより被覆した。図５は、NTHi 2019 (プール595)、htrB変異体B29 LOS(プール597)、又はキャリヤータンパク質に接 合されるhtrB変異体B29 LOS(プール606)により免疫化されたマウスからの、ELIS AにおけるNTHI 2019 LOS(抗原被膜）に対する抗−LOS抗体の平均力価を示す。図 ６は、NTHi 2019(プール595)、htrB変異体B29 LOS(プール597)、又はキャリヤー タンパク質に接合されるhtrB変異体B29 LOS(プール606)により免疫化されたマウ スからの、ELISAにおけるhtrB変異体B29 LOS(抗原被膜） に対する抗−LOS抗体の平均力価を示す。プレー免疫血清をまた、対照として包 含した（“ゼロ週目”又は“時間ゼロ”）。 次に、異なったLOS調製物により誘発された抗体を、標的物としてNTHi 2019を 用いて殺細菌アッセイを実施することによって、機能的活性について試験した。 96−ウェルプレートのウェル中に、0.150mlの緩衝液、補体源としてのプールさ れたヒト血清0.040ml及び0.0lmlのNTHi 2019を添加した。典型的には、生物を希 釈溶液（たとえば20〜200cfu）にプレートする。試験ウェル中に、希釈されてい ない（“生の”）、1/10倍希釈度、又は1/100倍希釈度のそれぞれの抗血清を添 加する。次に、プレートを37℃で30分間、激しく(175−200rpm)回転せしめる。 それぞれのウェルからのアリコートを、培地上にプレートし、そして増殖せしめ 、％生存率及び対数殺害度を決定する。対数殺害度は対数(30分でのcfu／ゼロ時 でのcfu)として計算される。殺細菌アッセイの結果は表１に示されており、ここ でグループR595はNTHI 2019 LOSにより誘発された抗血清であり、グループR597 はhtrB変異体B29 LOSにより誘発された抗血清であり、そしてグループR606はキ ャリヤータンパク質に接合されるhtrB変異体B29 LOSにより誘発された抗血清で ある。 対数殺害度が高くなるほど（より負の数字、たとえば−4.49）、それぞれの抗 体の殺細菌活性が高くなる。従って、比較のために、第７週及び１／10希釈度で は、NTHi 2019 LOSにより誘発された抗血清についての対数殺害度は−4.62であ り、NTHi htrB変異体B29 LOSにより誘発された抗血清についての対数殺害度は− 4.49であり、そしてキャリヤータンパク質に接合されるhtrB変異体B29 LOSによ り誘発された抗血清の対数殺害度は−3.44である。ELISAによれば、htrB変異体B 29 LOS抗体により誘発された抗血清は力価において低いように思え；さらに、殺 細菌アッセイにより示される場合、有意な機能的抗体はhtrB変異体B29 LOSによ る免疫化により高められる。 5.2この態様のもう１つの観点においては、htrB変異体細菌細胞がワクチン配 合において免疫原として使用される。htrB変異体細菌細胞による免疫化の効果を 示すために、幼児ラットモデルが使用された。ヒトにおけるタイプｂのＨ．イン フルエンザエ(Hib)による菌血性感染のモデルとしての及びタイプｂのＨ．イン フルエンザエ株のビルレンスを決定するためへの幼児ラットモデルの使用は、当 業者により許容されている（たとえば、Smithなど.，1973，Infect．Immun．8:2 78-290;Moxonなど.，1974，J．Infect.Dis．129:154-62;Rubinなど.，1983，Inf ect.Immun．41:280-284;Zwahlenなど.，1985，J．Infect.Dis．152:485-492を参 照のこと）。 Ｈ．インフルエンザエのタイプｂ株Ａ２は、接種（たとえば腹腔内又は鼻腔内 ）の後、菌血症及び髄膜炎を引き起こす幼児ラットモデルシステムにおける高い 毒性の株として、及びヒトからの臨床学的単離物（それは、Ｈ．インフルエンザ エのために髄膜炎を有する子供から単離された）としてすでに特徴づけられてい る。例１の方法を用いて、htrB変異体をHib株Ａ２から製造した。生後１週間の 幼児Sprague-Dawley albinoラットを、10⁷個のHib株Ａ２又は10⁷個のhtrB A2変 異体のいづれかにより腹腔内接種し、そして次に、接種後48時間で得られた血液 １ml当たりのコロニー形成単位(cfu)の数を測定することによって血管内クリア ランスについて評価した。その結果は、Hib株Ａ２により接種された20匹の幼児 ラットのうち20匹が菌血症を示し、そしてすべてのラットが10⁵個のcfu／mlより も高い株Ａ２を示したことを示した。対照的に、htrB A2変異体により接種され た20匹の幼児ラットのうちわずか13匹が菌血症を示し、そしてその13匹のうちわ ずか10匹が10⁵個のcfu／mlよりも高いhtrB A2変異体を示した。 同様に、生後１週目の幼児Sprague-Dawley albinoラットを、10⁷個のHib株Ａ ２又は10⁷個のhtrB A2変異体のいづれかにより鼻腔内接種し、そして次に、血管 内クリアランスについて評価した。その結果は、Hib株Ａ２により接種された20 匹の幼児ラットのうち８匹が菌血症を示し、そしてそれらの８匹のうち７匹が10⁵ 個のcfu／mlよりも高い株Ａ２を示したことを示した。対照的に、htrB A2変異 体により接種された30匹の幼児ラットのうちどのラットも菌血症を示さなかった 。一緒に考慮する場合、htrB変異体は、菌血症を引き起こす能力の低下（たとえ ば、菌血症の発生において30％の低下）により示される場合、その野生型株に比 較して、弱毒化された毒性を示すことがこのモデルシステムから結論づけられ得 る。 htrB変異体細菌細胞による免疫化の効果をさらに示すために、チンチラモデル を使用した。ヒトにおける分類できないＨ．インフルエンザエ（NTHi）による中 耳感染のモデルとしての、及びNTHi株のビルレンスを決定するためのチンチラモ デルの使用は、当業者により許容されている（たとえば、Bakaletzなど.，1989 ，Acta Otolaryngol．107:235-243;Madoreなど.，1990，Pediatrics 86:527- 34;Barenkamp，1986，Infect．Immun．52:572-78;Greenなど.，1994，Methods E nzymol．235:59-68を参照のこと）。 NTHi 2019は、前に記載された臨床学的単離物である（たとえば、Murphyなど. ，1986，Infect．Immun．54：774-779を参照のこと）。個々の健康な成熟したチ ンチラを、NTHi 2019又はhtrB変異体NTHi B29のいづれかの種々の対数用量によ り、中耳空間中に鼓室を通して接種した。次に、中耳疾病の経路を、鼓膜炎症に ついての定期的な耳鏡試験又は中耳注入、及び続く培養を伴っての中耳からの吸 引により評価した。その結果は、NTHi 2019に比較される場合、中耳感染を誘発 するためには、htrB変異体NTHi B29の３対数高い用量（10⁷個のcfu／耳）を取る ことを示した。htrB変異体は、中耳疾患を引き起こす低められた能力により示さ れる場合、その野生型株に比較して、弱毒化されたビルレンスを示すことがこの モデルシステムから結論づけられ得る。 この態様のもう１つの観点においては、Ｈ．インフルエンザエhtrB変異体は、 １又は複数の異種細菌抗原を発現するよう遺伝子的に構築される。下記でより詳 細に論ぜられるであろうように、Ｈ．インフルエンザエは、線状化されたDNA結 合、１又は複数の摂取配列（たとえば、AAGTGCGGT−配列番号３）を通しての摂 取、トランスロケーション及び組換えを包含する天然の遺伝子形質転換方法を有 する。従って、発現されるべき少なくとも１つの異種細菌抗原を含む組換えDNA 分子を導入するためのｌつの機構は、少なくとも１つの異種細菌抗原をコードす るDNA(“コード配列”)を含む線状化された組換えDNAにより宿主Ｈ．インフルエ ンザエhtrB変異体を形質転換することである。他方では、発現されるべきコード 配列を含む組換えDNA分子を、プラスミドベクター中に挿入し、そして天然の形 質転換方法により、線状化された組換え分子として；非コンピテ ントＨ．インフルエンザエhtrB変異体のエレクトロポレーションを用いて、環状 化された組換えプラスミドとして；又はコンピテントＨ．インフルエンザエhtrB 変異体に形質転換される環状化された組換えプラスミドとして導入することがで きる。 Ｈ．インフルエンザエにおける組換えDNA分子からのクローニング及び発現の ために有用なプラスミドは、当業者に知られている。そのようなプラスミドは、 次のものを包含する： pRSF0885は、耐アンピシリン性を付与し、そしてPvuIIクローニング部位及び 欠損TnA配列を含み（Setlowなど.，1981，J.Bacteriol．148:804-811）、そして Ｈ．インフルエンザエ及びＥ．コリの両者において複製することができる(Trieu など.，1990，Gene 86:99-102)。 pDM2は、pRSF0885中に耐クロラムフェニコール性をクローニングすることによ って構成され；そしてpDM5は、pRSF0885中に耐テトラサイクリン性をクローニン グすることによって構成された（McCarthyなど.，1986，J.Bacteriol．168:186- 191）。 pVT63，pVT64，pVT65，pVT66は、pDM2に基づくＨ．インフルエンザエ及びＥ． コリのための改良されたシャトルベクターであり、そしてColE1 oriのpUC−誘導 体及びpRSF0885複製遺伝子座を含む。さらに、個々のプラスミドは、次のような 薬物マーカーの挿入不活性化のためのユニーク制限部位を有する薬物マーカーを 有する:pVT63-ApR(HincII，PstＩ，ScaＩ)，KmR(ClaＩ，HindIII，NruＩ，SmaＩ ，XhoＩ)；pVT64-ApR(HincII，PstＩ，ScaＩ，SspＩ)，SpR；pVT65-ApR(HincII ，PstＩ，ScaＩ，PvuＩ，SspＩ),CmR(BalＩ，NcoＩ)；pVT66-ApR(HincII，PstＩ ，ScaＩ，PvuＩ)，CmR(SmaＩ)。 pACYC177，pACYC184，pSU2718，pSU2719は、p15Aに基づくＨ． インフルエンザエ及びＥ．コリのための改良されたシャトルベクターであり(Cha ndler，1991，Plasmid 25:221-224)、p15A oriを有し、そして複製のRSF0885起 点を含むプラスミドと適合した。さらに、個々のプラスミドは、次のような複製 のクローニング部位、制限部位、及び薬物マーカーを有する：pACYC177-ApR，Km R(受託番号X06402)；pACYC184-CmR，TcR(受託番号X06403)；pSU2718-CmR及びpUC 18からのポリクローニング部位（受託番号M64731）；及びpSU2719-CmR及びpUC19 からのポリクローニング部位（受託番号M64732）。 pQL1は、pMB1 ori、及びP15a ori，KmRの両者を含むＨ．インフルエンザエ及 びＥ．コリへの使用のための改良されたシャトルベクターであり、ここで前記P1 5a ori，KmRはＨ．インフルエンザエ摂取配列、すなわちユニークBamHＩ及びSma Ｉ制限部位を含む複数のクローニング部位を端に有し、そしてＨ．インフルエン ザエにおけるＨ．インフルエンザエプロモーターの強さを分析するために特に適 合されている(Heideckerなど.，1994，Gene 150:141-144)。 コード配列を含む組換えDNA分子をプラスミドベクター中にクローニングする 場合、組換えDNA分子、及び速結のための適合できる末端をもたらすプラスミド の両者を消化するための制限酵素の選択は、組換えDNA分子の末端でのユニーク 制限酵素部位；天然に存在するか又はたとえば酵素増幅の間に生じるかどうか； プラスミドベクター内の１又は複数のユニーク制限酵素部位；プラスミドベクタ ー中への挿入が選択工程を援助するかどうか（たとえば、pVT66を参照のこと） ；及び組換えDNA分子からの発現を駆動するために、ブラスミド由来のプロモー ターが単独で使用されるか、又はコード配列のプロモーターと共に使用されるか どうかに依存することを、当業者は理解するであろう。形質転換されたＨ．イン フルエンザエ htrB変異体の選択及びスクリーニングは、マーカー遺伝子（たとえば耐薬物性マ ーカー）の発現の検出、及び発現され、そして表わされた異種細菌抗原の免疫検 出を包含する、当業界において知られている方法により達成され得る。この態様 の観点は、コード配列を含む組換えDNA分子がプラスミド中に挿入され、そして Ｈ．インフルエンザエhtrB変異体において発現されることを示すけれども、プラ スミド以外のベクター、たとえばバクテリオファージベクター（但し、それらに 限定されない）が使用され得ることは、当業者により理解されるであろう。 少なくとも１つの異種細菌抗原の好結果をもたらす発現は、コード配列を含ん で成る組換えDNA分子又はベクター自体のいづれかが発現のために使用される特 定の宿主システムと適合でき、そしてそのシステムにより認識される、転写及び 翻訳のための必要な制御要素を含むことを必要とする。分子生物の分野において 知られている方法、たとえば上記の方法を用いる場合、種々のプロモーター及び エンハンサーが、ベクター、又は異種細菌抗原の発現を高めるためのコード配列 を含む組換えDNA分子中に組込まれ得るが、但し、異種細菌抗原の高められた発 現はhtrB変異体と適合できるべきである（たとえば、非毒性であるべきである） 。本明細書において言及されたように、コード配列は１つよりも多くの異種細菌 抗原をコードするDNAを含むことができ、そして改良されたワクチン組成物とし ての使用のための多価抗原を創造するために、ウィルス及び／又は菌類抗原をコ ードする配列を含むことができる。 プロモーターの選択は、使用される発現システムに依存するであろう。たとえ ば、Ｈ．インフルエンザエ発現システムにおける好ましいプロモーターは、コー ド配列に操作可能的に連結されるＰ２又はＰ６プロモーターであり得る。プロモ ーターは、強さ、すなわち 転写を促進する能力において異なる。一般的に、クローン化された遺伝子を発現 するためには、遺伝子の高レベル転写及び遺伝子生成物中への発現を得るために 強いプロモーターを使用することが所望される。たとえば、高レベルの転写がＥ ．コリを含んで成る宿主細胞システムにおいて観察される、当業界において知ら れている細菌、ファージ、又はプラスミドプロモーターは、lacプロモーター、t rpプロモーター、recAプロモーター、リボソームRNAプロモーター、Ｐ_R及びＰ_L プロモーター、lacUVS，ompF，bla，lpp、及び同様のものを包含し、それらは挿 入されたコード配列の転写を付与するために使用され得る。 効果的な遺伝子転写又は情報翻訳のための他の制御要素は、エンハンサー及び 調節シグナルを包含する。エンハンサー配列は、近くの遺伝子に対してのそれら の位置及び配向に比較的無関係な態様で転写効率を高めるように思えるDNA要素 である。従って、使用される宿主細胞発現ベクターに依存して、エンハンサーは 、転写効率を高めるためにコード配列から上流に又は下流に配置され得る。それ らの又は他の調節部位、たとえば転写又は翻訳開始シグナルは、コード配列の発 現を調節するために使用され得る。そのような調節要素は、DNA配列の挿入につ いて本明細書に記載され、そして当業者に知られている組換えDNA法を用いて、 コード配列、又は近くのベクターDNA配列を含む組換えDNA分子に挿入され得る。 従って、コード配列を含む組換えDNA分子が、ベクターのプロモーター、制御 及び調節要素に関して特異的部位で発現ベクター中に連結され得、その結果、組 換えベクターがhtrB変異体中に導入される場合、異種細菌抗原が宿主細胞におい て発現され得る。次に、組換えベクターをhtrB変異体中に導入し、そして形質転 換されたhtrB変異体を選択し、そして組換えベクターを含むそれらの細胞につい てスクリーンする。選択及びスクリーニングは、当業界において知られている方 法により、及び使用されるベクター及び発現システムに依存して達成され得る。 コード配列を含む組換えDNA分子（コード配列を含む発現ベクター又はプラス ミドを包含する）のＨ．インフルエンザエhtrB変異体の導入は、次の３種の方法 のいづれか１つにより達成され得る：天然の遺伝子形質転換法；コンピテント細 菌細胞の形質転換；及び非コンピテント細菌細胞のエレクトロポレーション。天然の形質転換法 Ｈ．インフルエンザエの天然の遺伝子形質転換法は、線状化されたDNAの結合 、１又は複数の摂取(uptake)配列を通しての摂取、トランスロケーション、及び 組換えを包含する。従って、発現されるべきコード配列を含む組換えDNA分子を 少なくとも１つの異種細菌抗原中に導入するための１つの機構は、コード配列を 含む線状化された組換えDNA分子；又は発現されるべきコード配列を含む組換えD NA分子をその中に挿入している線状化されたベクターにより宿主Ｈ．インフルエ ンザエを形質転換することである。この天然の方法においては、線状化されたDN Aが細胞内トランスロケートされる場合、DNAのトランスロケートされた鎖の１つ がエキソヌクレアーゼ活性により明らかに分解される（Baranyなど.，1983，Pro c.Natl.Acad.Sci．USA 80:7274-7278）。トランスロケートされた鎖がＨ．イン フルエンザエ染色体中への組換えのために十分な相同性を欠いている場合、その トランスロケートされた鎖はさらなる分解に対して敏感になる(Piferなど.，198 5，Proc.Natl.Acad.Sci．USA 82:3731-3735)。当業界において知られている方法 （たとえば、Baranyなど.，1983、前記；引用により本明細書に組込まれる）を 用いて、コード配列を含む線状化されたDNAがＨ．インフルエンザエhtrB 変異体中に導入され得る。コード配列はＨ．インフルエンザエの配列を端に有す ることができるので、Ｈ．インフルエンザエhtrB変異体のゲノム中へのコード配 列の組換えの見込みを高めることがたぶん存在する。コンピテント細菌細胞の形質転換 発現されるべきコード配列を含む組換えDNA分子を少なくとも１つの異種細菌 抗原中に導入するためのもう１つの機構は、環状ベクター、たとえば発現される べきコード配列を含む組換えDNA分子をその中に挿入しているプラスミドにより コンピテント宿主のＨ．インフルエンザエhtrB変異体を形質転換することである 。Ｈ．インフルエンザエの能力は、細菌細胞の複製が阻害される条件、たとえば 嫌気性条件下への一時的な移行の条件下で、後期−対数相増殖の間に生じる生理 学的変化及び栄養物が良好でない化学的に定義された培地中への細胞の移行によ り良好に発育する。Ｈ．インフルエンザエの能力の発育のためのそのような定義 された培地は、前で詳細に記載されている（Herriottなど.，1970，J.Bacteriol ．101:517-524;引用により本明細書に組込まれる）。コンピテントＨ．インフル エンザエに侵入した後、短時間で、細菌染色体に対して相同の配列を含むプラス ミドが、その相同配列（たとえば、Ｈ．インフルエンザエ配列を端に有するコー ド配列）を、発現のために組換えを通して染色体中に挿入することができる（Se tlowなど.，1981、前記）。従って、この態様においては、コンピテントＨ．イ ンフルエンザエhtrB変異体中に形質転換され得るコード配列を含むプラスミドは 、当業界において知られている形質転換のための方法により導入される(Karudap uramなど.，1995，J.Bacteriol．177:3235-3240;Setlowなど.，1981、前記；そ れらは引用により本明細書に組込まれる)。次に、コード配列が、それ自体のプ ロモーター又は挿入の 部位近くのＨ．インフルエンザエのプロモーターの制御下で発現される場合、Ｈ ．インフルエンザエhtrB変異体のゲノム中に組換えられ得る。そのような形質転 換は、比較的高い頻度で存在することが報告されている（McCarthy and Cox，19 86，J.Bacteriol.，168:186-191）。 あるいは、複製の適切な起点を有し、そしてコード配列を含む環状プラスミド によるコンピテントＨ．インフルエンザエhtrB変異体の形質転換は、プラスミド の確立、すなわち組換えを有さない染色体外要素として同時存在するプラスミド をもたらす。そのようなプラスミドの例は上記に説明されている。従って、この 態様の変法においては、コンピテントＨ．インフルエンザエhtrB変異体中に形質 転換され得、そしてそこにおいて確立され得るコード配列を含むプラスミドは、 当業界において知られている形質転換のための方法により挿入される。次に、そ のコード配列は、それ自体のプロモーター又はベクター内のプロモーターの制御 下でプラスミドから発現される。非コンピテント細菌細胞のエレクトロポレーション 発現されるべきコード配列を含む組換えDNA分子を、少なくとも１つの異種細 菌抗原中に導入するためのさらにもう１つの機構は、環状ベクター、たとえば発 現されるべきコード配列を含む組換えDNA分子をその中に挿入しているプラスミ ドを、エレクトロポレーションにより非コンピテント宿主Ｈ．インフルエンザエ htrB変異体中に導入することである。エレクトロポレーションは、プラスミドDN Aを細菌中に効果的に導入するために使用されて来た。しかしながら、最適な条 件は、使用される宿主細胞に依存して異なることができる。プラスミドDNAをＨ ．インフルエンザエ中にエレクトロポレートするための最適な条件は記載されて いる（Mitchellなど.，199 1，Nucl.Acids Res．19:3625-3628;引用により本明細書に組込まれる）。定義さ れた栄養不良培地によりコンピテントにされたＨ．インフルエンザエ中へのプラ スミドのエレクトロポレーションは、非コンピテントＨ．インフルエンザエ中へ のエレクトロポレーションよりも数倍低い有効性を有することが見出された。従 って、この態様の変法においては、コード配列を含むプラスミドが非コンピテン トＨ．インフルエンザエhtrB変異体中にエレクトロポレートされることが好まし い。プラスミドは、Ｈ．インフルエンザエhtrB変異体において確立され得、又は コード配列がＨ．インフルエンザエhtrB変異体のゲノム中に組換えした後、分解 され得る。いづれの場合においても、コード配列はそれ自体のプロモーター；又 はベクター又はゲノム内のプロモーターのそれぞれの制御下にある。 例 ６ 免疫原としてのネイセリアhtrB変異体 もう１つの態様においては、htrB変異体は、ネイセリア・ゴノルホエアエ及び ネイセリア・メニンジチジスを包含する群から選択されたネイセリアhtrB変異体 である。ネイセリア・ゴノルホエアエは、女性において骨盤炎症疾患を続いて導 びくことができる、性的に伝達された疾病である淋病を引き起こすグラム陰性細 菌病原体である。Ｎ．メニンジチジスは、種々の臨床学的感染、たとえば菌血症 、敗血症、髄膜炎及び肺炎を引き起こすことができるグラム陰性細菌病原体であ る。ネイセリアのLOSの末端グリコシル化における変更は、生物の血清感受性及 び血清耐性と相互関係していると思われる。さらに、保護殺細菌抗体は、Ｎ．メ ニンジチジスのタイプ−特異的抗原に対して向けられ、ここでそのタイプ−特異 的抗原は外層膜タンパク質、又はLOS、もしくは両者として同定されている。 例１〜３及び10に例示されるように、本発明の方法を用いて、ネ イセリア種のhtrB変異体を生成し、そして同定することができる。Ｈ．インフル エンザエのhtrB遺伝子を用いて、当業者は、ネイセリア種のhtrB遺伝子を単離し 、そしてトランスポゾン突然変異誘発を用いて、突然変異誘発されたhtrB遺伝子 （機能的なHtrBをコードすることができない）を生成することができ、そして続 く組換えが１又は複数の第二アシル鎖を欠いてるネイセリアhtrB変異体をもたら す。他方では、プラスミドpB28及びpB29を用いるために、ネイセリアとハエモフ ィラスとの間に十分な相同性が存在し、ここで個々のプラスミドは、ネイセリア htrB遺伝子中への変異体htrB遺伝子の組換えのためにネイセリア種を形質転換す るために、異なった位置でhtrBオープンリーディングフレーム中に挿入されるク ロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を含むmini-Tn3 トランスポゾンを有する。次に、ネイセリア形質転換体を、ネイセリアhtrB変異 体株の同定をもたらすクロラムフェニコール(1.5μｇ／ml)の存在下での増殖に より選択する。ネイセリアhtrB変異体の染色体におけるmTn3挿入体の位置を、ht rB配列を含むプローブを用いて、ゲノムサザンハイブリダイゼーションにより確 することができる。次に、得られるネイセリアhtrB変異体が、内毒素により誘発 される毒性効果を測定するために当業者により記載されるアッセイを用いて、実 質的に減じられた毒性について試験され得る。 例４及び５に例示されるような本発明の方法を用いて、ネイセリアhtrB変異体 から単離された内毒素が、ネイセリア病原体の野生型株に対する免疫性を誘発す ることにおいてワクチン配合物に使用され得る。htrB変異体LOSを、LOSを単離す るための当業者に知られている方法により単離することができる。htrB変異体LO Sは、医薬的に許容できるキャリヤー（たとえば、生理学的溶液）、アジュバン ト又はキャリヤータンパク質から成る群から選択された１又は複 数の剤を含むワクチン配合物に使用され得る。 あるいは、ネイセリアhtrB変異体は、生存細菌ワクチン調製物又は不活性化さ れた細菌ワクチン調製物に使用され、そして多価ワクチン調製物において少なく とも１つの異種細菌抗原を発現するよう遺伝的に構築され得る。後者の観点に関 しては、ネイセリア種中への組換えDNA分子のクローニング及びその分子からの 発現のために有用なプラスミドは、当業者に知られており、次のものを包含する ： pLES2は、耐アンピシリン性を付与し、Ｅ．コリ及びＮ．ゴノルホエアエの両 者において機能的なシャトルベクターであり、そしてEcoRＩ，SmaＩ及びBamHＩ のための制限部位を有するポリリンカーを含む(Steinなど.，1983，Gene 25:241 -247)。ネイセリア種はまた、天然の形質転換法を含み(Rudelなど.，1995，Proc NatI Acad Sci USA 92:7896-90;Goodmanなど.，1991，J Bacteriol 173:5921-5 923)；そしてまた、当業者に知られている技術を用いて、コンピテントにされ得 、又はエレクトロポレートされ得る。 例 ７ 免疫原としてのハエモフィラス・ジュクレイhtrB変異体 もう１つの態様においては、前記変異体はＨ．ジュクレイhtrB変異体である。 Ｈ．ジュクレイは、生殖器潰瘍疾患、すなわち軟性下疳を引き起こすグラム陰性 細菌病原体である。例１〜３及び10に例示されるような本発明の方法を用いて、 Ｈ．ジュクレイhtrB変異体を生成し，そして同定することができる。当業者は、 Ｈ．インフルエンザエのhtrB遺伝子を用いて、Ｈ．ジュクレイのhtrB遺伝子を単 離し、そしてトランスポゾン突然変異誘発を用いて、突然変異誘発されたhtrB遺 伝子（機能的なHtrBをコードすることができない）を生成し、そして続く組換え が１又は複数の第二アシル鎖を欠いてい るＨ．ジュクレイhtrB変異体をもたらす。他方では、プラスミドpB28及びpB29を 用いるために、Ｈ．ジュクレイとＨ．インフルエンザエとの間に十分な相同性が 存在し、ここで個々のプラスミドは、Ｈ．ジュクレイhtrB遺伝子中への変異体ht rB遺伝子の組換えのためにＨ．ジュクレイを形質転換するために、異なった位置 でhtrBオープンリーディングフレーム中に挿入されるクロラムフェニコール ア セチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を含むmini-Tn3トランスポゾンを有する 。次に、Ｈ．ジュクレイ形質転換体を、Ｈ．ジュクレイhtrB変異体株の同定をも らたすクロラムフェニコール(1.5μｇ／ml)の存在下での増殖により選択する。 Ｈ．ジュクレイhtrB変異体の染色体におけるmTn3挿入体の位置を、htrB配列を含 むプローブを用いて、ゲノムサザンハイブリダイゼーションにより確することが できる。次に、得られるＨ．ジュクレイhtrB変異体が、内毒素により誘発される 毒性効果を測定するために当業者により記載されるアッセイを用いて、実質的に 減じられた毒性について試験され得る。 例４及び５に例示されるような本発明の方法を用いて、Ｈ．ジュクレイhtrB変 異体から単離された内毒素が、Ｈ．ジュクレイの野生型株に対する免疫性を誘発 することにおいてワクチン配合物に使用され得る。htrB変異体LOSを、LOSを単離 するための当業者に知られている方法により単離することができる。htrB変異体 LOSは、医薬的に許容できるキャリヤー（たとえば、生理学的溶液）、アジュバ ント又はキャリヤータンパク質から成る群から選択された１又は複数の剤を含む ワクチン配合物に使用され得る。 あるいは、Ｈ．ジュクレイhtrB変異体は、生存細菌ワクチン調製物又は不活性 化された細菌ワクチン調製物に使用され、そして多価ワクチン調製物において少 なくとも１つの異種細菌抗原を発現するよう遺伝的に構築され得る。後者の観点 に関しては、ネイセリア種 中への組換えDNA分子のクローニング及びその分子からの発現のために有用なプ ラスミドは、例５に開示されるように当業者に知られており；そして例５に開示 されるように当業者に知られている技法を用いて、コンピテントにされ得、又は エレクトロポレートされ得る。 例 ８ 免疫原としてのカムピイロバクター・ジェジュニ(Campylobacter jejuni)htrB 変異体 もう１つの態様において、変異体はＣ．ジェジュニhtrB変異体である。カムピ イロバクター・ジェジュニは、ヒト腸炎を引き起こすグラム陰性細菌病原体であ る。Ｃ．ジェジュニによる感染はまた、神経障害、たとえばGuillian-Barre症候 群の開始に関連している。Ｃ．ジェジュニhtrB変異体は、例１〜３及び10に例示 されるように、本発明の方法を用いて生成され、そして同定され得る。Ｈ．イン フルエンザエのhtrB遺伝子を用いて、当業者は、Ｃ．ジェジュニのhtrB遺伝子を 単離し、そしてトランスポゾン突然変異誘発を用いて、突然変異誘発されたhtrB 遺伝子（機能的なHtrBをコードすることができない）を生成することができ、そ して続く組換えが１又は複数の第二アシル鎖を欠いているＣ．ジェジュニhtrB変 異体をもたらす。他方では、プラスミドpB28及びpB29を用いるために、Ｃ．ジェ ジュニとＨ．インフルエンザエとの間に十分な相同性が存在し、ここで個々のプ ラスミドは、Ｃ．ジェジュニhtrB遺伝子中への変異体htrB遺伝子の組換えのため にＣ．ジェジュニを形質転換するために、異なった位置でhtrBオープンリーディ ングフレーム中に挿入されるクロラムフェニコール アセチルトランスフェラー ゼ(CAT)遺伝子を含むmini-Tn3トランスポゾンを有する。次に、Ｃ．ジェジュニ 形質転換体を、Ｃ．ジェジュニhtrB変異体株の同定をもたらすクロ ラムフェニコール(1.5μｇ／ml)の存在下での増殖により選択する。Ｃ．ジェジ ュニhtrB変異体の染色体におけるmTn3挿入体の位置を、htrB配列を含むプローブ を用いて、ゲノムサザンハイブリダイゼーションにより確することができる。次 に、得られるＣ．ジェジュニhtrB変異休が、内毒素により誘発される毒性効果を 測定するために当業者により記載されるアッセイを用いて、実質的に減じられた 毒性について試験され得る。 例４及び５に例示されるような本発明の方法を用いて、Ｃ．ジェジュニhtrB変 異体から単離された内毒素が、Ｃ．ジェジュニの野生型株に対する免疫性を誘発 することにおいてワクチン配合物に使用され得る。htrB変異体LPSを、LPSを単離 するための当業者に知られている方法により単離することができる。htrB変異体 LPSは、医薬的に許容できるキャリヤー（たとえば、生理学的溶液）、アジュバ ント又はキャリヤータンパク質から成る群から選択された１又は複数の剤を含む ワクチン配合物に使用され得る。 他方では、Ｃ．ジェジュニhtrB変異体は、生存細菌ワクチン調製物又は不活性 化された細菌ワクチン調製物に使用され、そして多価ワクチン調製物において少 なくとも１つの異種細菌抗原を発現するよう遺伝的に構築され得る。後者の観点 に関しては、Ｃ．ジェジュニ中への組換えDNA分子のクローニング及びその分子 からの発現のために有用なプラスミドは、当業者に知られており、次のものを包 含する： pUA466は、耐テトラサイクリン性を付与し、そしてユニークAvaＩ部位及びAva II部位を含む（Taylor，1986，J.Bacteriol 165:1037-39）。Ｃ．ジェジュニは また、当業者に知られている技法を用いて、コンピテントにされ得、又はエレク トロポレートされ得る。 例 ９ 免疫原としてのモラキセラ・カタルハリスhtrB変異体 もう１つの態様において、変異体は、Ｍ．カタルハリスhtrB変異体である。モ ラキセラ カタルハリスは、子供における耳炎；子供及び成人における副鼻腔炎 ；及び免疫無防備状態の宿主における下部呼吸気管感染、敗血症及び髄膜炎を引 き起こすグラム陰性細菌病原体である。Ｍ．カタルハリスhtrB変異体は、例１〜 ３及び10に例示されるように、本発明の方法に従って生成され、同定され得る。 Ｈ．インフルエンザエのhtrB遺伝子を用いて、当業者は、Ｍ．カタルハリスのht rB遺伝子を単離し、そしてトランスポゾン突然変異誘発を用いて、突然変異誘発 されたhtrB遺伝子（機能的なHtrBをコードすることができない）を生成すること ができ、そして続く組換えが１又は複数の第二アシル鎖を欠いているＭ．カタル ハリスhtrB変異体をもたらす。他方では、プラスミドpB28及びpB29を用いるため に、Ｍ．カタルハリスとＨ．インフルエンザエとの間に十分な相同性が存在し、 ここで個々のプラスミドは、Ｍ．カタルハリスhtrB遺伝子中への変異体htrB遺伝 子の組換えのためにＭ．カタルハリスを形質転換するために、異なった位置でht rBオープンリーディングフレーム中に挿入されるクロラムフェニコール アセチ ルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を含むmini-Tn3トランスポゾンを有する。次 に、Ｍ．カタルハリス形質転換体を、Ｍ．カタルハリスhtrB変異体株の同定をも たらすクロラムフェニコール(1.5μ１ml)の存在下での増殖により選択する。Ｍ ．カタルハリスhtrB変異体の染色体におけるmTn3挿入体の位置を、htrB配列を含 むプローブを用いて、ゲノムサザンハイブリダイゼーションにより確することが できる。次に、得られるＭ．カタルハリスhtrB変異体が、内毒素により誘発され る毒性効果を測定するために当業者により記載されるアッセイを用いて、実質的 に減じられた毒性について試験され得る。 例４及び５に例示されるような本発明の方法を用いて、Ｍ．カタルハリスhtrB 変異体から単離された内毒素が、Ｍ．カタルハリスの野生型株に対する免疫性を 誘発することにおいてワクチン配合物に使用され得る。htrB変異体LOSを、LOSを 単離するための当業者に知られている方法により単離することができる。htrB変 異体LOSは、医薬的に許容できるキャリヤー（たとえば、生理学的溶液）、アジ ュバント又はキャリヤータンパク質から成る群から選択された１又は複数の剤を 含むワクチン配合物に使用され得る。 他方では、Ｍ．カタルハリスhtrB変異体は、生存細菌ワクチン調製物又は不活 性化された細菌ワクチン調製物に使用され、そして多価ワクチン調製物において 少なくとも１つの異種細菌抗原を発現するよう遺伝的に構築され得る。後者の観 点に関しては、Ｍ．カタルハリス中への組換えDNA分子のクローニング及びその 分子からの発現のために有用なプラスミドは、当業者に知られている。Ｍ．カタ ルハリスは、天然の形質転換法を含み（Juni，1977，J Clin Microbiol 5:227-3 5）、そしてまた、当業者に知られている技法を用いて、コンピテントにされ得 、又はエレクトロポレートされ得る。 例 10 免疫原としてのサルモネラhtrB変異体 もう１つの観点においては、変異体はサルモネラhtrB変異体である。サルモネ ラ種は、ヒト及び動物において種々の臨床学的疾病を引き起こすことができるグ ラム陰性細菌を含んで成る。たとえば、Ｓ．チピ（S．tyPhi）は、ヒトにおいて チフス性発熱の原因物質である。Ｓ．パラチピ（S．paratyphi）は、ヒトにおい てサルモネラ熱として知られている発熱の原因生物である。ヒトにおけるサルモ ネラ症、すなわち胃腸炎は、サルモネラ属における種々の種〔チピミリウム(typ himurium)、ニューポート(newport)、ヘイデルベル グ（heidelberg）及びエンテリチジス(enteritidis)〕により引き起こされ得る 。サルモネラhtrB変異体は生成され、そして同定され得る。グラム陰性細菌病原 体のhtrB遺伝子を用いて、当業者は、トランスポゾン突然変異誘発及び続く組換 えにより、突然変異誘発されたhtrB遺伝子（機能的HtrBをコードすることができ ない）を生成することができ、究極的には、１又は複数の第二アシル鎖における 修飾を有するサルモネラhtrB変異体をもたらす。次に、その得られるサルモネラ htrB変異体は、内毒素により誘発される毒性効果を測定するために、当業者によ り記載されるアッセイを用いて、実質的に減じられた毒性について試験され得る 。 この態様を例示するために、及び本明細書の例１における方法に類似する方法 を用いて、htrB遺伝子の突然変異誘発が、htrB遺伝子を突然変異誘発するための 挿入配列として使用されるmini-Tn10(耐テトラサイクリル性を付与する)による シャトル突然変異誘発により実施された。次に、htrB：Tn10を、トランスダクシ ョンにより毒性Ｓ．チピミリウムにＥ．コリから移した。これまでに記載される 方法(Masters，1996，E ．coli and Salmonella Cellular and Molecular Biolog y ，vol.2，2nd Edition，p.2421，ASM Press)を用いてγ^-m⁺ga1E mutS recD S． チピミリウム（SL5283）を、γ^-m⁺ga1E mutS recD cm^r S.チピミリウム(“MGS-1 ”）をもたらす、サルモネラファージＰ22を通してのMST3488(耐クロラムフェニ コール性（cm^r）を付与するrecD542：Tn10d)により、及び次に、γ^-m+ga1E mutS recD cm^rS.チピミリウム(“MGS-3”）をもたらすMST3063(耐テトラサイクリン 性(tet^r)を付与するmutS：Tn10)により連続的にトランスダクトした。Ｓ．チピ ミリウムMGS-3を、これまでに記載されている方法(Bochnerなど.，1990，J.Bact eriol．143:926-933)を用いて、培地上でのテトラサイクリン感受性について の選択によって、Tn10により処理し、γ^-m⁺ga1E mutS recD cm^rS.チピミリウム( “MGS-7”）をもたらした。確認目的のために、Ｓ．チピミリウムMGS-7が、親株 MGS-3と同じ紫外線に対する応答を示したことが示された。 htrB：mini Tn10を含むＥ．コリ株（“MLK217”）を、前に記載された方法(Ma sters，1996、前記）に従って、大腸菌ファージＰ１を通してＳ．チピミリウムM GS-7中へのトランスダクションによりhtrB：Tn10をトランスファーするために使 用し、そしてテトラサイクリンを含む培養プレート上で、30℃での増殖により選 択した。耐テトラサイクリン性クローンについての再単離の後、トランスダクシ ョンの結果は、γ−m⁺ga1E mutS recD htrB：mini Tn10 cm^r tet^rS.チピミリウ ム（“MGS-23”）の創造であった。Ｓ．チピミリウムMGS-23を、htrB突然変異に 関連する１又は複数の表現型の性質、すなわち（１）温度感受性；（２）非許容 性温度でのフィラメント化及び隆起；及び（３）デオキシコレート耐性について 試験した。この表現型分析の結果は、MGS-23が、30℃で増殖するが、しかし37℃ では増殖できないので、Ｓ．チピミリウムhtrB遺伝子内に挿入されるmini Tn10 要素を担持し；許容できる温度に変えられる場合、多くのフィラメント形を形成 し；そして同系の親の濃度(2.5％)よりも高い濃度(7.5％〜10％)のデオキシコレ ートに対しての耐性を示したこと示唆した。htrBの突然変異をさらに、ポリメラ ーゼ鎖反応を用いての分析により確かめた。 毒性(virulent)Ｓ．チピミリウム株（SL1344）を、サルモネラ・ファージＰ22 を通して、Ｓ．チピミリウムMGS-23からhtrB：Tn10にトランスダクトし、そして テトラサイクリンを含む培地プレート上で、30℃で選択した。単離の後、MGS-23 と同じ表現型を有するその得られる耐テトラサイクリン性クローンをさらに分析 した。１つの そのようなクローン、すなわちMGS-31は、野生型htrB遺伝子を有するプラスミド を用いてクローンを補足し(Karowなど.，1991，J.Bacteriol．173:741-50;Karow など.，1991，Mol.Microbiol．5:2285-2292)、それにより、前記クローンを、正 常な増殖の野生型表現型、正常な細胞形態、37℃でのデオキシコレート感受性、 及び野生型ビルランスに戻すことによって、突然変異誘発されたhtrB遺伝子を有 することが示された。内毒素の特徴付け 質量スペクトル計を用いて、本明細書における例２の方法に従って、リピドＡ を分析した。より特定には、Ｓ．チピミリウムhtrB変異体LPS及び野生型Ｓ．チ ピミリウムLPSからのリピドＡを、異なった成分リピドＡについての分子イオン の範囲を提供するために負のイオンモードで液体第二イオン質量分光計(LSIMS) により分析した。Ｓ．チピミリウムhtrB変異体のリピドＡの化学分析は、生じた リピドＡ構造体における修飾が、Ｈ．インフルエンザエhtrB変異体に見られるリ ピドＡ構造体における修飾に類似するが、しかし同一ではないことを示唆した。 野生型Ｓ．チピミリウムにおいては、リピドＡはジグルコサミン主鎖からの６個 （ヘキサアシル）又は７個（ヘプタアシル）の脂肪酸置換を含む（図７）。野生 型株において、グルコサミンIIに基づけば、Ｎ−結合されたＣ14脂肪酸上の３’ 置換（ヘキサアシル又はヘプタアシル）は、Ｃ12脂肪酸である。対照的に、及び 図７に示されるように、Ｃ12脂肪酸は、Ｃ16脂肪酸により置換される。それらは 、Ｓ．チピミリウムhtrB遺伝子がＮ−結合されたＣ14脂肪酸上への３’位置での Ｃ12脂肪酸の配置を担当するアシルトランスフェラーゼをコードすることを示唆 する。Ｓ．チピミリウムhtrB遺伝子の突然変異は、Ｎ−結合されたＣ14脂肪酸上 に３’位置でＣ16脂肪酸を配置するもう１つのアシルトランスフェ ラーゼの機能的誘発をもらたす。リピドＡが、グラム陰性生物の生存のために、 及びその外層膜の適切な構成のために決定的であることは当業者に知られている 。従って、及び生物のビルランス及び毒性に関して、Ｓ．チピミリウムにかける htrB遺伝子突然変異の効果が分析された。内毒素の毒性 ヒト疾患に関して、当業者により使用されるマウスモデルシステムは、Ｄ−ガ ラクトサミンモデルである。Ｄ−ガラクトサミンモデルにおいては、LPSに対す る感度はＤ−ガラクトサミンへの暴露により高められ(Galanosなど.，1986，Inf ect．Immun．51:891-896)、それにより、LPSの低い用量により、すなわち敗血症 患者の血液に同定されるレベルと同一基準の内毒素のレベルにより同じ致死性及 びTNF誘発を達成する。従って、LPSに暴露され、且つＤ−ガラクトサミン−処理 されたマウスは、ヒトにおける内毒素ショックに関して、当業者に許容される標 準の動物モデルシステムである。このモデルにおいては、４匹のマウスのグルー プが、試験されるべきLPSの用量の投与と共に、Ｄ−ガラクトサミン（８mg）に より同時処理された。４匹のマウスのグループは、試験されるべき精製されたLP S 0.001μｇ、0.01μｇ、0.1μｇ、１μｇ又は10μｇにより個々に注射され、 そして個々の用量での挑戦に対して生存するマウスの数が注射の後５日間、24時 間ごとに調べられた。次に、LD₅₀（マウスの50％を殺害する致死量）を計算した 。別々に試験されるべき精製されたLPSは、野生型ビルラントＳ．チピミリウム 株1344及びＳ．チピミリウムhtrB変異体（MGS-31）からのLPSを包含する。結果 は、Ｓ．チピミリウム株1344からのLPSにより注射されたマウスについてのLD₅₀ は0.01μｇであることを示す。対照的に、Ｓ．チピミリウムhtrB変異体MGS-31か らのLPSにより注射されたマウスに ついてのLD₅₀は0.1μｇである。従って、Ｓ．チピミリウムhtrB変異体からのリ ピドＡは、野生型株のリピドＡよりも少なくとも10倍低い毒性である。ビルレンス マウスは、ヒトのように、Ｓ．チピミリウムによる感染に対して天然において 敏感であるので、第２のマウスモデルが、Ｓ．チピミリウムのビルレンスに対す るhtrB突然変異の効果を評価するために使用された。典型的には、およそ50cfu 〜100cfuが、注射されたマウスの50〜100％を殺害するであろう。使用される株 は、Ｓ．チピミリウム株1344；Ｓ．チピミリウムhtrB変異体（MGS-31）；及び損 なわれていないhtrB遺伝子を含むプラスミドにより補足されたＳ．チピミリウム htrB変異体（MGS-43）を包含した。それぞれの生物は、５×10¹〜５×10⁷cfuの 範囲の用量で腹腔内注射され、そして５日間にわたって調べられた。一般的に、 菌血症により死亡するであろう動物の100％は、その期間内で死亡する。予測さ れ得るように、毒性Ｓ．チピミリウム株1344についてのLD₅₀は、５×10¹cfuより も低かった。同様に、損なわれていないhtrB遺伝子により補足されたＳ．チピミ リウムhtrB変異体（MGS-43）についてのLD₅₀もまた、５×10¹cfuよりも低かった 。対照的に、Ｓ．チピミリウムhtrB変異体MGS-31についてのLD₅₀は、9.7×10⁶cf uであり、野生型株に比較して、約２×10⁵のビルレンスの低下が存在した。マウ スにおいてのＳ．チピミリウムhtrB変異体のインビボ増殖を、培養し、そして細 菌計数について肝臓及び脾臓をアッセイすることによって確かめた。その結果は 、サルモネラにおけるhtrB突然変異がLPSの修飾よりもビルレンス因子に対して より強い効果を有することを示唆する。 例４及び５に例示されるように、本発明の方法を用いて、サルモ ネラhtrB変異体から単離された内毒素が、サルモネラ種の野生型株に対する免疫 性を誘発することにおいてワクチン配合物に使用され得る。htrB変異体LPSを、L PSを単離することに関して当業者に知られている方法により単離することができ る。htrB変異体LPSは、医薬的に許容できるキャリヤー（たとえば生理学的溶液 ）、アジュバント又はキャリヤータンパク質から成る群から選択された１又は複 数の剤を含むワクチン配合物に使用され得る。 あるいは、サルモネラhtrB変異体は、生存細菌ワクチン調製物又は不活性化さ れた細菌ワクチン調製物に使用され得、そして多価ワクチン調製物において少な くとも１つの異種細菌抗原を発現するよう遺伝的に構築され得る。後者の観点に 関して、サルモネラ中への組換えDNA分子のクローニング及びその分子からの発 現のために有用なプラスミドは、当業者に知られており、そして下記のものを包 含する： trcプロモーター中にクローン化されるlacZを含むpYA260；及び耐テトラサイ クリン性を付与し、そしてlacＩを含むpJW270(Ervinなど.，1993 Microb Pathog en 15:93-101)。pB ７は、耐カナマイシン性及び耐クロラムフェニコール性を付 与し、そしてBalＩ部位及びHindIII部位を端に有するクローニング部位を含む(P urcellなど.，1983，Infect Immun 39:1122-1127)。 pACK5は、アセトバクター パステウリアナス（Acetobacter pasteurianas） からのpAClのレプリコンを含み、そして耐カナマイシン性を付与する（Gronesな ど.，1995，Biochem Biophys Res Commun 206:942-947）。pVAC468は、サルモネ ラ中への異種抗原の染色体挿入のための自殺ベクターであり、そして次の制限部 位を有するポリリンカーを含む：ClaＩ，EcoRＶ，XhoＩ，SacＩ，SalＩ，SmaＩ ，XbaＩ及びBglII(Hohmannなど.，1995，Proc Natl Acad Sci USA 92:2904-2908)。バクテリオファージシステム、すなわちバクテリオフ ァージλ上に担持される欠損性転移可能要素を用いる、サルモネラの染色体中に 外来性抗原をコードする遺伝子を挿入するための“染色体発現ベクター”もまた 開示されている(Flynnなど.，1990，Mol Microb 4:2111-2118)。サルモネラはま た、当業者に知られている技法を用いて、コンピテントにされ得（たとえば、Pu rcellなど.，1983、前記を参照のこと）、又はエレクトロポレートされ得る（た とえば、Gronesなど.，1995、前記；Coulsonなど.，1994、前記を参照のこと） 。 例 11 免疫原としてのシゲラhtrB変異体 もう１つの態様において、変異体はシゲラ種htrB変異体である。シゲラ属のメ ンバーは、ヒトにおいて主に赤痢を引き起こすグラム陰性細菌〔病原種はダイセ ンテリアエ(dysenteriae)、ソネイ（sonnei）及びフレキシネリ（flexneri）〕 である。シゲラhtrB変異体は、例１〜３及び10に例示されるような方法を用いて 調製され、そして同定され得る。Ｈ．インフルエンザエのhtrB遺伝子を用いて、 当業者は、シゲラのhtrB遺伝子を単離し、そしてトランスポゾン突然変異誘発を 用いて、突然変異誘発されたhtrB遺伝子（機能的なHtrBをコードすることができ ない）を生成することができ、そして続く組換えが１又は複数の第二アシル鎖を 欠いているシゲラhtrB変異体をもたらす。他方では、プラスミドpB28及びpB29を 用いるために、シゲラとＨ．インフルエンザエとの間に十分な相同性が存在し、 ここで個々のプラスミドは、シゲラhtrB遺伝子中への変異体htrB遺伝子の組換え のためにシゲラを形質転換するために、異なった位置でhtrBオープンリーディン グフレーム中に挿入されるクロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ (CAT)遺伝子を含むmini-T n3トランスポゾンを有する。次に、シゲラ形質転換体を、シゲラhtrB変異体株の 同定をもたらすクロラムフェニコール(1.5μｇ／ml)の存在下での増殖により選 択する。シゲラhtrB変異休の染色休におけるmTn3挿入体の位置を、htrB配列を含 むプローブを用いて、ゲノムサザンハイブリダイゼーションにより確することが できる。次に、得られるシゲラhtrB変異体が、内毒素により誘発される毒性効果 を測定するために当業者により記載されるアッセイを用いて、実質的に減じられ た毒性について試験され得る。 例４及び５に例示されるような本発明の方法を用いて、シゲラhtrB変異体から 単離された内毒素が、シゲラの野生型株に対する免疫性を誘発することにおいて ワクチン配合物に使用され得る。htrB変異体LPSを、LPSを単離するための当業者 に知られている方法により単離することができる。htrB変異体LPSは、医薬的に 許容できるキャリヤー（たとえば、生理学的溶液）、アジュバント又はキャリヤ ータンパク質から成る群から選択された１又は複数の剤を含むワクチン配合物に 使用され得る。 あるいは、シゲラhtrB変異体は、生存細菌ワクチン調製物又は不活性化された 細菌ワクチン調製物に使用され、そして多価ワクチン調製物において少なくとも １つの異種細菌抗原を発現するよう遺伝的に構築され得る。後者の観点に関して は、シゲラ中への組換えDNA分子のクローニング及びその分子からの発現のため に有用なプラスミドは、当業者に知られており、次のものを包含する： pACK5は、アセトバクター パステウリアナスからのpAC1のレプリンコを含み 、そして耐カラマイシン性を付与する（Gronesなど.，1995、前記）。シゲラは また、当業者に知られている技法を用いて、コンピテントにされ得、又はエレク トロポレートされ得る。 例 12 免疫原としてのシュードモナス・アエルギノサhtrB変異体 もう１つの態様において、変異体はシュードモナス・アエルギノサhtrB変異体 である。シュードモナス・アエルギノサは特に、免疫無防備状態の患者において 呼吸器管感染及び敗血症を引き起こすグラム陰性細菌病原体である。ヒト及び動 物に関する他の病原種は、シュードマレイ（pseudomallei）及びマレイ（mallei ）を包含する。質量分光計及び核磁気共鳴分光計を用いて、シュードモナス・ア エルギノサLPSのリピドＡの構造を測定した。Ｐ．アエルギノサリピドＡの構造 は、腸内細菌のリピドＡ：−リン酸化されているか、又は二リン酸化されている （位置１及び４’）かのいづれかであり、そしてエステル−及びアミド−結合の 脂肪酸のいくつかの分子を担持するグルコサミン二糖の主鎖と同じであることが 見出された。ヘキサアシル及びペンタアシルリピドＡ種の他に、テトラアシル種 が同定された(Karunaratneなど.，1992，Arch Biochem Biophys 299:368-76)。 シュードモナスhtrB変異体（たとえば、Ｐ．アエルギノサ）は、例１〜３及び 10に例示されるような本発明の方法を用いて、生成され得、そして同定され得る 。Ｈ．インフルエンザエのhtrB遺伝子を用いて、当業者は、シュードモナス・ア エルギノサのhtrB遺伝子を単離し、そしてトランスポゾン突然変異誘発を用いて 、突然変異誘発されたhtrB遺伝子（機能的なHtrBをコードすることができない） を生成することができ、そして続く組換えが１又は複数の第二アシル鎖を欠いて るＰ．アエルギノサhtrB変異体をもたらす。他方では、プラスミドpB28及びpB29 を用いるために、Ｐ．アエルギノサとＨ．インフルエンザエとの間に十分な相同 性が存在し、ここで個々のプラスミドは、Ｐ．アエルギノサhtrB遺伝子中への変 異体htrB遺伝子の組換えのためにＰ．アエルギノサを形質転換するために、異な った位置でhtrBオープンリーディングフレーム中に挿入されるクロラムフェニコ ール アセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子を含むmini-Tn3トランスポゾン を有する。次に、Ｐ．アエルギノサ形質転換体を、Ｐ．アエルギノサhtrB変異体 株の同定をもたらすクロラムフェニコール(1.5μｇ／ml)の存在下での増殖によ り選択する。Ｐ．アエルギノサhtrB変異体の染色体におけるmTn3挿入体の位置を 、htrB配列を含むプローブを用いて、ゲノムサザンハイブリダイゼーションによ り確することができる。次に、得られるＰ．アエルギノサhtrB変異体が、内毒素 により誘発される毒性効果を測定するために当業者により記載されるアッセイを 用いて、実質的に減じられた毒性について試験され得る。 例４及び５に例示されるような本発明の方法を用いて、Ｐ．アエルギノサhtrB 変異体から単離された内毒素が、Ｐ．アエルギノサの野生型株に対する免疫性を 誘発することにおいてワクチン配合物に使用され得る。htrB変異体LPSを、LPSを 単離するための当業者に知られている方法により単離することができる。htrB変 異体LPSは、医薬的に許容できるキャリヤー（たとえば、生理学的溶液）、アジ ュバント又はキャリヤータンパク質から成る群から選択された１又は複数の剤を 含むワクチン配合物に使用され得る。 他方では、Ｐ．アエルギノサhtrB変異体は、生存細菌ワクチン調製物又は不活 性化された細菌ワクチン調製物に使用され、そして多価ワクチン調製物において 少なくとも１つの異種細菌抗原を発現するよう遺伝的に構築され得る。後者の観 点に関しては、Ｐ．アエルギノサ中への組換えDNA分子のクローニング及びその 分子からの発現のために有用なプラスミドは、当業者に知られており、次のもの を包含する： pPAR121は、耐カルベニシリン性を付与し、そしてユニークHpa Ｉ制限部位を含む(Hoyneなど.，1992，J Bacteriol 174:7321-7327)。Ｐ．アエ ルギノサはまた、当業者に知られている技法を用いて、コンピテントにされ得（ たとえば、Hoyneなど.，1992、前記を参照のこと）、又はエレクトロポレートさ れ得る。 例 13 多価htrB変異体ワクチン調製物 例４及び５に例示されるような本発明の１つの態様においては、htrB変異体が 、当業者に知られている方法を用いて多価ワクチンを生成するさいに、１又は複 数の異種微生物抗原を発現するよう遺伝的に構築される。好ましい態様において は、微生物病原体は、それぞれの抗原に関して、病原体の群から選択された呼吸 気管病原体を表２に包含する。 ¹-(Flack et al.，1995 Gene 156:97−99;Panezutti et al.，1993，61:1867- 1872;Nelson et al.，1988，Rev Infect Diseases 10:S331-336)． ²-(Pruksakorn et al.，1994，Lancet 344:639-642;Dole et al.，1993，J Im munol 151:2188-94)．³-(Murphy et al.，1989，Infect Immun 57:2938-2941;Faden et al.，1992 ，Infect Immun 60:3824-3829)． ⁴-(Lock et al.，1992，Microb Pathog 12:137-143)． ⁵-(Novotny et al.，1991，Dev Biol Stand 73:243-249;Lips combe et al.， 1991，Mo1 Microbiol 5:1385-1392;He et al.，1993，Eur J Clin Microbiol Infect Dis 12:690-695)． ⁶-(Rawling et al.，1995，Infect Immun 63:38-42;Pennington et al.，198 8，J Hosp Intect 11A:96-102)． ⁷-(Weeratna et al.，1994，Infect Immun 62:3454-3462)． ⁸-(Jacobe et al.，1990，Infect Immun 58:2464-2469;1990，J Clin Microbi ol 28:1194−1197)． ⁹-(Kulkarni et al.，1995，ＪVirol 69:1261-1264;Leonov et al.，1994，J Gen Virol 75:1353-1359;Garcia et al.，1993，Virology 195:239-242;Vaux-Pe retz et al.，1992，Vaccine 10:113-118)．¹⁰ -(Kaly et al.，1994，Vaccine 12:753-760;Bucher et al.，1980，J Virol 3 6:586−590)．¹¹ -(Francis et al.，1987，J Gen Virol 68:2687-2691)．¹² -(Morein et al.，1983，J Gen Virol 64:1557-1569)．¹³ -(Garbe et al.，1994，Infect Immun 62:3092-3101)． もう１つの態様においては、微生物病原体は、それぞれの抗原に関して、病原 体の群から選択された性的に伝達された疾病を引き起こす病原体を表３に包含す る。 ¹-(Lomholt et al.，1994，Infect Immun 62:3178-83)．²-(Heckels et al.，1990，Vaccine 8:225-230)． ³-(Blacker et al.，1985，J Infect Dis 151:650-657)． ⁴-(Wetzler et al.，1992，Vaccine 8:225-230)． ⁵-(Campos et al.，1995，Ophthamol Vis Sci 36:1477-91;Murdin et al.，19 95，Infect Immun 63:1116−21)． ⁶-(Taylor et al.，1990，Infect Immun 58:3061-3)． 表２及び３、及び引用により本明細書に組込まれる脚注された参照は、それぞ れの微生物病原体に対するワクチン候補体として有用であることが当業者により 見出された、種々のタンパク質抗原、又はそのペプチドを例示する。典型的には 、微生物病原体のタンパク質又はペプチドからのエピトープの免疫能力は、エピ トープによる免疫化に続いて、動物の免疫応答をモニターすることによって、及 び／又はプレー免疫血清に関して、ヒト回復期血清を分析することによって決定 される。従って、当業者は、本発明のhtrB変異体により発現されるべき異種抗原 として包含することが所望される、微生物病原体からのタンパク質又はペプチド を決定することができる。次に、対応する核酸配列、そのコード配列は、タンパ ク質又はペプチド抗原のアミノ酸配列から推定され得、ここで前記コード配列は 、発現のためにhtrB変異休中に導入されている。 例 14 抗血清を生成するためへのhtrB変異体の使用 htrB変異体又はそれから精製された内毒素は、グラム陰性細菌病原体により引 き起こされる感染を有すると思われる個人の体液に存在する抗原（特にグラム陰 性細菌病原体）を検出するためにイムノアッセイに使用され得る、特定のグラム 陰性細菌病原体に向けられる内毒素−特異的抗血清を生成するために使用され得 る。分析のために採取された体液は、検出されるべき微生物に、感染の疑わしい 部位に、及び体液が抗原を含むと思われるか又は抗血清を含むと思われるかどう かに依存する。それらの考慮によれば、体液は、１又は複数の痰、血液、脳脊髄 液、損傷部滲出液、疑わしい感染部位からのスワブされた物質、及び上部呼吸気 管からの流体を包含する。そのような検出のためのイムノアッセイは、当業界に おいて知られているイムノアッセイ、たとえばラジオイムノアッセイ、ELISA、 “サンドイッチ”アッセイ、沈降素反応、凝集アッセイ、螢光イムノアッセイ及 び化学発光に基づくイムノアッセイを包含するが、但し、これらだけには限定さ れない。 他方では、免疫無防備状態の個人が特定のグラム陰性細菌病原体により引き起 こされる可能性ある生命脅威の感染を有する場合、免疫化は受動的であり、すな わち免疫化は特定のグラム陰性細菌病原体のhtrB変異体又は単離されたhtrB内毒 素に対する、精製されたヒト免疫グロブリン含有抗体の投与を含んで成る。 本発明は本明細書において詳細に記載されて来たが、前記例が単に例示的目的 のためであることは理解されるべきである。分子生物学、医学的診断及び関連す る学問分野の当業者に明白である本発明の態様の他の修飾は、発明の範囲内で実 施され得る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 (71)出願人 アメリカン サイアナミド カンパニー アメリカ合衆国，ニュージャージー 07940，マディソン，ファイブ ジラルダ ファームス (72)発明者 アピセラ，マイケル エー. アメリカ合衆国，アイオワ 52333，ソロ ン，ノース イースト，ジョンソンズ ク ロッシング 2646 (72)発明者 サンシャイン，メルビン ジー. アメリカ合衆国，アイオワ 52245，アイ オワ シティ，ラベン ストリート 340 (72)発明者 リー，ナ―ギョング 大韓民国，インチェオン，シンドング― ア，ナム―グ ハキク―２―ドング，アパ ートメント 27―1309 (72)発明者 アルムガム，ラサパ アメリカ合衆国，ニューヨーク 14534, ピッツフォード，エラティア サークル 15 (72)発明者 ギブソン，ブラッドフォード ダブリュ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94702, バークレイ，ペラルタ アベニュ 1324

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グラム陰性細菌病原体により引き起こされる疾病を予防するために個体を 免疫するための方法であって、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体、前記グ ラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離された内毒素、前記グラム陰性細菌病 原体のhtrB変異体から単離された、キャリヤータンパク質に接合される内毒素、 及び少なくとも１つの異種ワクチン抗原を発現するよう遺伝子操作された前記グ ラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から成る群から選択された活性成分を含んで成 るワクチン調製物の予防的有効量により個体をワクチン処理することを含んで成 り、ここで前記htrB変異体が、グラム陰性細菌病原体のリピドＡに比較される場 合、実質的に低められた毒性をもたらす、前記グラム陰性細菌病原体に含まれる リピドＡの少なくとも１又は複数の第二アシル鎖を欠いてることを特徴とする方 法。 ２．前記個人がヒトであり、そして前記ワクチン調製物が皮内、筋肉内、腹腔 内、静脈内、皮下、眼、鼻腔内、及び経口投与から成る群から選択された投与路 により導入される請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記ワクチン調製物が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から実質 的に成る活性成分を含んで成る請求の範囲第２項記載の方法。 ４．前記ワクチン調製物が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離 された内毒素から実質的に成る活性成分を含んで成る請求の範囲第２項記載の方 法。 ５．前記ワクチン調製物が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離 された、キャリヤータンパク質に接合された内毒素か ら実質的に成る活性成分を含んで成る請求の範囲第２項記載の方法。 ６．前記ワクチン調製物が、微生物病原体から少なくとも１つの異種抗原を発 現するよう遺伝子操作された、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から実質 的に成る活性成分を含んで成る請求の範囲第２項記載の方法。 ７．前記ワクチン調製物が、生理学的キャリヤー及びアジュバントをさらに含 んで成る請求の範囲第２項記載の方法。 ８．前記個人が動物であり、そして前記ワクチン調製物が皮内、筋肉内、腹腔 内、静脈内、皮下、眼、鼻腔内、及び経口投与から成る群から選択された投与路 により導入される請求の範囲第１項記載の方法。 ９．前記ワクチン調製物が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から実質 的に成る活性成分を含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。 10．前記ワクチン調製物が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離 された内毒素から実質的に成る活性成分を含んで成る請求の範囲第８項記載の方 法。 11．前記ワクチン調製物が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離 された、キャリヤータンパク質に接合された内毒素から実質的に成る活性成分を 含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。 12．前記ワクチン調製物が、微生物病原体から少なくとも１つの異種抗原を発 現するよう遺伝子的に構築された、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から 実質的に成る活性成分を含んで成る請求の範囲第８項記載の方法。 13．前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体が動物飼料への添加 物として経口投与される請求の範囲第８項記載の方法。 14．微生物病原体から少なくとも１つの異種抗原を発現するよう遺伝子操作さ れた前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体が動物飼料への添加物として経口投 与される請求の範囲第12項記載の方法。 15．前記ワクチン調製物が、生理学的キャリヤー及びアジュバントをさらに含 んで成る請求の範囲第８項記載の方法。 16．グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体、前記グラム陰性病原体のhtrB変異体 から単離された内毒素、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離された 、キャリヤータンパク質に接合された内毒素、及び少なくとも１つの異種ワクチ ン抗原を発現するよう遺伝子操作された、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異 体から成る群から選択された活性成分を含んで成るワクチン調製物であって、こ こで前記htrB変異体が、グラム陰性細菌病原体のリピドＡに比較される場合、実 質的に低められた毒性をもたらす、前記グラム陰性細菌病原体に含まれるリピド Ａの少なくとも１又は複数の第二アシル鎖を欠いていることを特徴とするワクチ ン調製物。 17．前記活性成分が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から実質的に成 る請求の範囲第16項記載のワクチン調製物。 18．前記活性成分が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離された 内毒素から実質的に成る請求の範囲第16項記載のワクチン調製物。 19．前記活性成分が、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離された 、キャリヤータンパク質に接合される内毒素から実質的に成る請求の範囲第16項 記載のワクチン調製物。 20．前記活性成分が、微生物病原体から少なくとも１つの異種抗原を発現する よう遺伝子操作された、前記グラム陰性細菌病原体の htrB変異体から実質的に成る請求の範囲第16項記載のワクチン調製物。 21．生理学的キャリヤー及びアジュバントをさらに含んで成る請求の範囲第16 項記載のワクチン調製物。 22．野生型グラム陰性細菌病原体の内毒素に比較される場合、実質的に低めら れた毒性の変異体内毒素をグラム陰性細菌病原体において製造するための方法で あって、前記グラム陰性細菌病原体内のhtrB遺伝子を突然変異誘発することを含 んで成り、ここで前記突然変異誘発が前記グラム陰性細菌病原体に含まれるリピ ドＡの１又は複数の第二アシル鎖を欠いている変異体内毒素により特徴づけられ る、得られるhtrB変異体の表現型を引き起こすことを特徴とする方法。 23．請求の範囲第22項記載の方法に従って製造される、実質的に低められた毒 性の変異体内毒素であって、前記実質的に低められた毒性を有する変異体内毒素 がフェノール／水抽出、及びプロテアーゼ消化から成る群から選択された方法に よりhtrB変異体から精製されており；そして実質的に低められた毒性を有する前 記精製された変異体内毒素が内毒素−特異的抗体を生成するために使用されるこ とを特徴とする変異体内毒素。 24．キャリヤータンパク質に対する接合をさらに含んで成る請求の範囲第23項 記載の変異体内毒素。 25．請求の範囲第22項記載の方法に従って製造された、実質的に低められた毒 性の変異体内毒素。 26．キャリヤータンパク質に対する接合をさらに含んで成る請求の範囲第25項 記載の変異体内毒素。 27．野生型グラム陰性細菌病原体に比較される場合、実質的に低められた毒性 を有する、野生型グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体 を製造するための方法であって、前記グラム陰性細菌病原体内のhtrB遺伝子を突 然変異誘発することを含んで成り、ここで前記突然変異誘発が前記野生型グラム 陰性細菌病原体に含まれるリピドＡ上のｌ又は複数の第二アシル鎖を欠いている 内毒素により特徴づけられる、得られるhtrB変異体の表現型を引き起こすことを 特徴とする方法。 28．請求の範囲第27項記載の方法に従って製造された、実質的に低められた毒 性の変異体グラム陰性細菌病原体であって、ここで前記実質的に低められた毒性 を有するグラム陰性細菌病原体が内毒素−特異的抗体を生成するために使用され ることを特徴とするグラム陰性細菌病原体。 29．診断アッセイへの、及び受動的免疫化のためへの、から成る群から選択さ れた使用のための内毒素−特異的抗血清を生成するための方法であって、前記グ ラム陰性細菌病原体のhtrB変異体、前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から 単離された内毒素、及び前記グラム陰性細菌病原体のhtrB変異体から単離された 、キャリヤータンパク質に接合される内毒素から成る群から選択された活性成分 を含んで成るワクチン調製物により個人を免疫化し、そして前記免疫化された個 人から生成される抗体を集めることを含んで成り、ここで前記htrB変異体が、野 生型グラム陰性細菌病原体のリピドＡに比較される場合、実質的に低められた毒 性をもたらす、前記野生型グラム陰性細菌病原体に含まれるリピドＡの少なくと も１又は複数の第二アシル鎖を欠いていることを特徴とする方法。