DE10115276A1

DE10115276A1 - Impfstoff zum Schutze von Geflügel gegen Salmonellose und ein Verfahren zur Herstellung desselben

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Publication number: DE10115276A1
Application number: DE10115276A
Authority: DE
Original assignee: G B PANT UNIVERSITY OF AGRICUL
Current assignee: G B PANT UNIVERSITY OF AGRICUL
Priority date: 2000-03-29
Filing date: 2001-03-28
Publication date: 2001-10-18
Also published as: US6605285B2; US20030124709A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Salmonella-Impfstoff durch Behandeln von Enterotoxin und Cytotoxinen mit Formalin und Zugabe von Immunpotentiator, ausgewählt aus komplettem Freundschen Adjuvans (FCA) oder Vitamin E oder Saponin, zu den konzentrierten Toxoiden unter Erhalt des gewünschten Impfstoffes. DOLLAR A Die Erfindung stellt auch einen Salmonella-Impfstoff zum Schutze gegen Salmonellose bei Geflügel bereit.

Description

Die Erfindung betrifft einen Impfstoff zum Schutze von Geflügel gegen Salmo nellose und ein Verfahren zur Herstellung desselben.

HINTERGRUND

Salmonellose ist weltweit immer noch ein ernstes Problem für Menschen und Tie re. Trotz intensiver Forschungsanstrengungen sind viele Aspekte ihrer Pathogene se nicht bekannt. Ungeachtet des fehlenden genauen Wissens über die Virulenz mechanismen von Salmonella werden seit vielen Jahren Impfstoffe mit unter schiedlicher Wirksamkeit eingesetzt (Wray 1995). Lax et al. (1995) haben die Wirksamkeit diverser Impfstoffe gegen Salmonellose beschrieben. Demnach ist die Wirksamkeit sowohl von abgeschwächtem Lebend- als auch von Totimpfstof fen immer noch unklar. Da die bisher entwickelten Impfstoffe nicht gegen den (die) bei der Pathogenese dieser Erkrankung eine Schlüsselrolle spielenden Viru lenzfaktor(en) gerichtet waren, sind sie aus diesem Grund wahrscheinlich nicht optimal wirksam. Zudem war ihre Wirksamkeit auf homologe oder immunolo gisch verwandte Serovare begrenzt, da sich Salmonella-Serovaren in ihren Flag ellen- und somatischen Antigenen wesentlich unterscheiden.

Die U. S.-Patentschrift 4 053 036 beschreibt auch einen bakteriellen Impfstoff ge gen Salmonella-Fieber, Typhus und Paratyphus. Der genannte Impfstoff wird durch Fermentation, Extraktion und Reinigung erhalten, wobei die Impf- Membranantigene durch Kontaktieren des durch Zentrifugation erhaltenen Bakte rien-Rückstandes mit einem Lösungsmittel der Tris(hydroxyalkyl)aminoalkan- Klasse unter Rühren bei niedriger Temperatur, wobei der pH zwischen 8,4 und 8,6 eingestellt ist, für die Dauer von mindestens 60 h, danach Abtrennen durch Dekantieren und anschließendes Reinigen der Antigene und Fraktionieren durch Ultrafiltration und anschließendes Gefriertrocknen der Impf-Antigenfraktion ext rahiert werden. Diese Patentschrift offenbart nichts über die Natur des Antigens und darüber, ob ihm bei der Pathogenese von Salmonellose eine Rolle zukommt.

Die internationale Anmeldung Nr. WO 91/06317, eingereicht am 2. November 1990, offenbart Impfstoffe zur Behandlung von Individuen für Infektionen durch grammnegative Bakterien. Der Impfstoff besteht aus einer lebenden Salmonella ohne Virulenz, die in der Lage ist, gegenüber homologen und heterologen Salmo nella-Serotypen und zwei andere grammnegative Bakterien Immunität auszulö sen. Der in der internationalen Anmeldung beschriebene Impfstoff hat bezüglich heterologer Salmonella-Serotypen eine begrenzte Verwendung und ist nicht gegen den Virulenz-Hauptfaktor (Toxine) gerichtet.

Die am 14. November 1996 eingereichte internationale Anmeldung Nr. WO 97/18225 beschreibt praktisch reine von Salmonella sezernierte Proteine (Ssp), deren Sekretion von der PrgH-Expression abhängt; Verfahren zur Diagnose von Salmonella-Infektionen und abgeschwächte Lebendimpfstoff-Stämme, in denen die Ssp-Sekretion vemindert ist. Dieser Impfstoff besitzt auch im Hinblick auf heterologe Salmonella-Serotypen eine eingeschränkte Verwendung und ist nicht gegen den Virulenz-Hauptfaktor (Toxine) gerichtet.

Der in den internationalen Anmeldungen WO 91/06317 und WO 97/18225 be schriebene Impfstoff wird unter Verwendung von Bakterienzellen und nicht aus ihren bei der Pathogenese der Krankheit eine wesentliche Rolle spielenden Toxi nen hergestellt.

Neuerdings wurden aus einem einzigen Stamm von Salmonella enterica subsp enterica ser Weltevreden (S. Weltevreden) vier distinkte Cytotoxine und ein Ente rotoxin isoliert, bis zur Homogenität gereinigt und hinreichend charakterisiert. Diese Toxine lösten in Tierexperimenten übereinstimmend klinische Änderungen aus, die denjenigen entsprachen, die bei den natürlichen Fällen von Salmonellose festgestellt wurden, und sie legen für diese Toxine eine Hauptrolle bei der Patho genese der Krankheit nahe. Diese Toxine verloren ihre Toxizität bei Formalin- und Carbonatbehandlungen, behielten allerdings ihre Immunisierungsstärke bei. Singh und Sharma (1999) veröffentlichten die obigen Feststellungen in Zent. bl. Bakteriol (International Journal of Medical Microbiology).

Ziel der Erfindung ist die Herstellung eines sicheren und potenten Salmonella- Impfstoffes zum Schutz von Geflügel gegen Salmonellose.

Zum Erreichen des obigen Ziels stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zum Schutze gegen Salmonellose in Geflügel aus Enterotoxin und Cytotoxinen, die aus Salmonella sps. isoliert wurden, bereit, umfassend:

- Behandlung der Toxine mit Formalin in dem zuvor festgelegten, von der Formalin-Konzentration abhängigen Verhältnis und In kubieren für 40-50 h bei einer Temperatur von 35-38°C,
- Entfernung des Formalins durch Dialyse gegen Phosphatpuffer- Salzlösung (PBS),
- Konzentrieren des formalinbehandelten Toxoids durch Dialyse gegen Polyethylenglycol, und
- Zugabe von Immunpotentiator, ausgewählt aus komplettem Freundschen Adjuvans (FCA) oder Vitamin E oder Saponin, zu den konzentrierten formalinbehandelten Toxoiden unter Erhalt des gewünschten Impfstoffes.

Das Enterotoxin und die Cytotoxine werden aus einem einzigen Stamm von S. Weltevreden, S. Typhimurium und S. Gallinarum isoliert.

Das Enterotoxin und die Cytotoxine werden aus einem einzigen Stamm von S. Weltevreden isoliert.

Die Konzentration von Formalin beträgt 0,1-0,25%, vorzugsweise 0,2%.

Das Verhältnis der Konzentration von Formalin mit Toxin beträgt 1 : 1.

Die pH-Konzentration von Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) beträgt 7,4.

Das Polyethylenglycol ist 30%iges Polyethylenglycol-20000.

Die Konzentration des formalinbehandelten Toxoids beträgt 0,1 mg/ml.

Die Menge des FCA beträgt 0,5-1 ml des konzentrierten Toxoids, vorzugsweise 1 ml/ml.

Die Menge an Vitamin E beträgt 90-110 internationale Einheiten (IU) des kon zentrierten Toxoids, vorzugsweise 100 IU/ml.

Die Menge des Saponins beträgt 50-150 µg des konzentrierten Toxoids.

Die Menge des Saponins beträgt vorzugsweise 100 µg des konzentrierten To xoids.

Die Erfindung stellt auch einen durch das obige Verfahren hergestellten Salmo nella-Impfstoff zum Schutze gegen Salmonellose in Geflügel bereit, wobei der Impfstoff Schutz gegen homologe (S. Weltevreden) sowie heterologe (S. Typhi murium und S. Gallinarum) Serovare bietet.

Der Impfstoff bietet Schutz gegen homologe (S. Weltevreden) Serovare.

Die Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und be gleitenden Zeichnungen beschrieben:

BEISPIEL 1

Die Toxine (Enterotoxin und Cytotoxine) wurden mit 0,2% Formalin im Verhält nis 1 : 1 und Inkubation für 48 h bei einer Temperatur von 37°C behandelt. Entfer nung von Formalin durch Dialyse gegen Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS, pH 7,4) und Konzentrieren der formalinbehandelten Toxine auf die ursprüngliche Proteinkonzentration durch Dialyse gegen 30% Polyethylenglycol-20000. Zu gabe von 1 ml FCA zu dem konzentrierten Toxoid unter Erhalt des gewünschten Impfstoffes.

Der obige Impfstoff wurde auf seine Wirksamkeit bei Geflügel getestet. Die fol genden Tests wurden durchgeführt:

21 Tage alte Küken wurden mit dem obigen Impfstoff mit 2 ml pro Vogel subku tan geimpft. Die geimpften Vögel wurden 15 Tage nach der Impfung intraperito neal mit Salmonella Weltevreden, Salmonella Gallinarum und S. Typhimurium jeweils mit 2 × 109 CFU/Vogel provoziert. Die Vögel wurden wie in Tabelle 1 an gegeben auf den Schutz und die Immunreaktion getestet.

In Tabelle 1 und Fig. 1 sind die vergleichende Wirksamkeit des Impfstoffes ge gen experimentelle Salmonellose in Geflügel dargestellt. Aus Tabelle 1 kann ge sehen werden, daß der Impfstoff wirksam ist und einen 100%igen Schutz gegen homologe (Salmonella Weltevreden), sowie heterologe (Salmonella Gallinarum und S. Typhimurium) Serovare bietet. Bei den geimpften Vögeln wurde keine ungünstige Reaktion festgestellt. Dies zeigt, daß der Impfstoff sicher und potent ist.

Außerdem kontrollierte der Impfstoff auch die Ausbreitung des Provokationsor ganismus über die Faeces der geimpften Vögel. Es kann gesehen werden, daß mit diesem Impfstoff die Ausbreitung des Organismus durch die geimpften Vögel nicht erfolgt, wohingegen in der Kontrollgruppe sämtliche überlebende Vögel den Organismus verbreiteten. Dies ist im Hinblick auf die öffentliche Gesundheit wichtig, da die Verbreiter als Träger wirken und wesentlich zur Ausbreitung des Organismus beitragen.

BEISPIEL 2

Die Behandlungstoxine (Enterotoxin und Cytotoxin) wurden aus einem einzigen Stamm von S. Weltevreden mit 0,2% Formalin im Verhältnis 1 : 1 und Inkubieren für 48 h bei einer Temperatur von 37°C isoliert. Entfernung von Formalin durch Dialyse gegen Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS, pH 7,4) und Konzentrieren der formalinbehandelten Toxine auf die ursprüngliche Proteinkonzentration durch Dialyse gegen 30% Polyethylenglycol-20000. Zugabe von 100 internationalen Einheiten (IU) Vitamin E zu dem konzentrierten Toxoid unter Erhalt des ge wünschten Impfstoffes.

Der obige Impfstoff wurde auf seine Wirksamkeit in Geflügel getestet. Die fol genden Tests wurden durchgeführt:

21 Tage alte Küken wurden mit dem obigen Impfstoff bei 1 ml pro Vogel subku tan geimpft. Die geimpften Vögel wurden intraperitoneal mit Salmonella Weltev reden und Salmonella Gallinarum jeweils mit 2 × 10⁹ CFU/Vogel in unterschiedli chen Zeitintervallen, d. h. 30, 60, 120 Tage, nach der Impfung provoziert. Die Vö gel wurden auf den Schutz und die Immunreaktion wie in Tabelle 2 angegeben getestet.

Aus Tabelle 2 kann gesehen werden, daß der nach 30 Tagen zur Verfügung ste hende Schutz 90% und der nach 60 Tagen zur Verfügung stehende Schutz 100% beträgt und daß der Schutz dann mit steigender Anzahl von Tagen abnimmt. Nach 120 Tagen beträgt der Schutz 40%. Dies geht auch aus dem in Fig. 2 angegebe nen Graphen hervor. Es kann ferner gesehen werden, daß die maximale Immunre aktion nach 40 Tagen festgestellt wird und danach beginnt abzunehmen.

In Tabelle 3 ist die Vergleichswirksamkeit des Impfstoffes gegen experimentelle Salmonellose in Geflügel angegeben. Es kann gesehen werden, daß der Impfstoff gegen homologe (Salmonella Weltevreden) sowie heterologe (Salmonella Gallina rum) Serovare wirksam ist.

Bei den geimpften Vögeln wurde keine ungünstige Reaktion festgestellt. Dies zeigt, daß der Impfstoff potent und sicher ist.

Außerdem kontrollierte der Impfstoff auch die Ausbreitung des Provokationsor ganismus über die Faeces der geimpften Vögel. Es kann gesehen werden, daß mit diesem Impfstoff die Ausbreitung des Organismus durch die geimpften Vögel 10 Tage nach der Provokation nicht erfolgt, wohingegen in der Kontrollgruppe sämt liche überlebende Vögel den Organismus verbreiteten. Dies ist im Hinblick auf die öffentliche Gesundheit wichtig, da die Überträger wesentlich zur Ausbreitung des Organismus beitragen.

In Tabelle 4 und Fig. 3 wird die passive Übertragung von Immunität durch die geimpften Vögel über die Eier beschrieben. Aus der Tabelle kann geschlossen werden, daß in Küken der geimpften Vögel 24 Tage nach der Impfung Immunität festgestellt wurde, die bis zu 60 Tage nach der Impfung anhielt. Dies ist beim Schutz von Küken in ihrem frühen Lebensstadium gegen Salmonellose von Be deutung.

Tabelle 2

Dauer der Toxoid-übertragenen Immunität bei Vitamin E-Adjuvans-Zusatz

BEISPIEL 3

Die Behandlungstoxine (Enterotoxin und Cytotoxine) wurden aus einem einzigen Stamm von S. Weltevreden mit 0,2% Formalin im Verhältnis 1 : 1 und Inkubation für 48 h bei einer Temperatur von 37°C isoliert. Entfernung von Formalin durch Dialyse gegen Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS, pH 7,4) und Konzentrieren der formalinbehandelten Toxine auf die ursprüngliche Proteinkonzentration durch Dialyse gegen 30% Polyethylenglycol-20000. Zugabe von 100 µg Saponin zu dem konzentrierten Toxoid unter Erhalt des gewünschten Impfstoffes.

Der obige Impfstoff wurde auf seine Wirksamkeit bei Geflügel getestet. Es wur den die folgenden Tests durchgeführt:

21 Tage alte Küken wurden mit dem obigen Impfstoff bei 1 ml/Vogel subkutan geimpft. Die geimpften Vögel wurden 21 Tage nach der Impfung intraperitoneal mit Salmonella Weltevreden und Salmonella Gallinarum jeweils mit 2 × 10⁹ CFU/Vogel provoziert. Die Vögel wurden, wie in Tabelle 5 angegeben, auf den Schutz und die Immunreaktion getestet.

Aus Tabelle 5 und Fig. 4 kann gesehen werden, daß der 21 Tage nach der Imp fung verfügbare Schutz sowohl gegen S. Weltevreden als auch S. Gallinarum- Provokation 100% beträgt, wohingegen Saponin allein keinen Schutz bieten konnte.

In Tabelle 6 zusammen mit Fig. 4 ist die humorale Immunreaktion gegenüber dem durch Agglutinationstests und ELISA bewerteten Impfstoff dargestellt. Es kann gesehen werden, daß der Impfstoff eine wesentliche Immunreaktion sowohl hinsichtlich des Agglutinations- als auch des ELISA-Titers auslöst. Die Immunre aktion auf Saponin allein war vernachlässigbar.

Außerdem kontrollierte der Impfstoff auch die Ausbreitung des Provokationsor ganismus über die Faeces der geimpften Vögel. Es kann gesehen werden, daß mit diesem Impfstoff die Ausbreitung des Organismus durch die geimpften Vögel 10 Tage nach der Provokation nicht erfolgt (Tabelle 7), wohingegen in der Kontroll gruppe sämtliche überlebende Vögel den Organismus verbreiteten. Dies ist im Hinblick auf die öffentliche Gesundheit wichtig, da die Überträger wesentlich zur Ausbreitung des Organismus beitragen.

Tabelle 5

Schutz in Vögeln, die mit Saponin-Adjuvans versetztem Toxoid immunisiert wurden

Tabelle 6

Humorale Immunreaktion auf mit Saponin-Adjuvans versetztes Toxoid

Tabelle 7

Postprovokative Ausbreitung von Salmonella durch Vögel, die mit Saponin- Hilfsstoff versetztem Toxoid immunisiert wurden

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs aus Enterotoxin und Cytotoxi nen, die aus Salmonella sps. isoliert wurden, zum Schutze gegen Salmo nellose in Geflügel, umfassend:

- Behandlung der Toxine mit Formalin in vorbestimmtem Verhält nis, nach Maßgabe der Formalin-Konzentration, und Inkubation für 40-50 h bei einer Temperatur von 35-38°C,
- Entfernung des Formalins durch Dialyse gegen Phosphatpuffer- Salzlösung (PBS),
- Konzentrieren des formalinbehandelten Toxoids durch Dialyse gegen Polyethylenglycol, und
- Zugabe von Immunpotentiator, ausgewählt aus komplettem Freundschen Adjuvans (FCA) oder Vitamin E oder Saponin, zu den konzentrierten formalinbehandelten Toxoiden unter Erhalt des gewünschten Impfstoffes.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enterotoxin und die Cytotoxine aus einem einzigen Stamm von S. Weltevreden, S. Typhimurium und S. Galli narum isoliert werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei das Enterotoxin und die Cytotoxine aus einem einzigen Stamm von S. Weltevreden isoliert werden.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzent ration von Formalin 0,1-0,25% beträgt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzent ration von Formalin vorzugsweise 0,2% beträgt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verhält nis der Konzentration von Formalin zu Toxin 1 : 1 beträgt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die pH- Konzentration der Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) 7, 4 beträgt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Polye thylenglycol 30% Polyethylenglycol-20000 ist.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Konzent ration des formalinbehandelten Toxoids 0,1 mg/ml beträgt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge des FCA 0,5-1 ml des konzentrierten Toxoids beträgt.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge des FCA etwa 1 ml/ml des konzentrierten Toxoids beträgt.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge des Vitamin E 90-110 internationale Einheiten (IU) des konzentrierten Toxoids beträgt.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge des Vitamin E etwa 100 IU/ml des konzentrierten Toxoids beträgt.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge des Saponins 50-150 µg des konzentrierten Toxoids beträgt.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Menge des Saponins etwa 100 µg des konzentrierten Toxoids beträgt.

16. Salmonella-Impfstoff, erhältlich nach dem Verfahren nach Anspruch 1-15, zum Schutze gegen Salmonellose bei Geflügel.

17. Impfstoff nach Anspruch 16, wobei der Impfstoff Schutz gegen homologe (S. Weltevreden) sowie gegen heterologe (S. Tyhimurium und S. Gallina rum) Serovare bietet.

18. Impfstoff nach Anspruch 17, wobei der Impfstoff Schutz gegen homologe (S. Weltevreden) Serovare bietet.