JP7396569B2 - Ｃｒａ４Ｓ１遺伝子及びそれによってコードされるタンパク質と応用 - Google Patents

Description

本発明はバイオ医薬品分野に関し、具体的に、ｃｒａ４Ｓ１遺伝子及びそれによってコードされるタンパク質と応用に関する。

歯周病は、世界中で最も多く見られる口腔疾患の１つであり、中国には、様々な程度の歯周病を患っている成人が８０～９７％いる。歯周病は、冠状動脈性心臓病とその急性発作の独立した危険因子で、脳卒中の独立した危険因子であり、歯周病の病原細菌であるポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）はアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；一般的に老年性認知症と呼ばれる）との直接的関係が既に認められ、歯周病は糖尿病の合併症で、消化器や呼吸器疾患、及び、妊婦が未熟児や低体重児を出産するような臨床疾患と密接に関連しており、現在、死亡率の極めて高い多くの疾患の要因であることが既に発見され、世界保健機関により、心血管疾患と癌に次いで３番目に大きい非伝染性疾患としてリストされている。

歯周病の発症は種々の段階に分けられるが、再発しやすく、局所病変の様子が漸進的な進行状態にあることがその顕著な特徴である。現在、歯周病の治療は、病巣の局所切除、抗生物質及び外科手術に依存しているが、これらの対策は一時的に和らげるが、病原菌感染の根本的な問題を取り除くことはない。

人群における歯周病の広範な分布及びその全身性疾患との関連により、科学者らは、免疫学的方法を使用して体の免疫機能を働かせ、病原菌を抑制と除去し、歯周病／インプラント周囲炎を予防と治療し、再発を防止するワクチンの研究を探求するようになる。

ポルフィロモナスジンジバリスは、最も広く研究され、証拠が最も十分である成人の歯周病の必要な病原細菌である。ポルフィロモナスジンジバリスの候補ワクチンは、莢膜多糖類、線毛、類脂質、外膜タンパク質、熱ショックタンパク質、プロテアーゼ、不活化全菌などが含まれ、何れも現在の開発範囲にあるが、病原細菌は亜型によって分子構造、毒力因子、ＤＮＡ配列及び毒性が異なり、人群におけるポルフィロモナスジンジバリスの異なる亜型の分布規則は、まだ発見されていない。効果的なワクチンは、ある微生物抗原に対して長期的な免疫性が発生されるように体を誘導し、病原菌の再侵入を予防し、その人体に与える被害を減らすことができなければならない。病原細菌の異なる亜型の細菌感染症に対するワクチン／抗体製品の製造は、安定した予防と治療効果を生じさせることができるが、これは商業的開発の難題であり、これまで、関連製品がまだ発売されていない。

本発明は、歯周病／インプラント周囲炎を含むが、これらに限定されないポルフィロモナスジンジバリス慢性感染症による疾患を予防と治療するための安全かつ安定的で効果的なバイオ製品を開発することを目的とする。

本発明によって解決される主要技術課題は、ｃｒａ４Ｓ１遺伝子及びそれによってコードされるＣｒａ４Ｓ１タンパク質を提供することである。

本発明がさらに解決しようとする技術課題は、前記ｃｒａ４Ｓ１遺伝子又はその遺伝子断片を含む発現カセット、組み換えベクター又は細胞を提供することである。

本発明がさらに解決しようとする技術課題は、ｃｒａ４Ｓ１遺伝子、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質、前記発現カセット、組み換えベクター又は細胞の、歯周病又はインプラント周囲炎又はポルフィロモナスジンジバリス感染症関連疾患を予防又は治療するワクチン又は医薬の調製における応用を提供することである。

本発明がさらに解決しようとする技術課題は、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質又はその断片を含むワクチン又は医薬を提供することである。

本発明がさらに解決しようとする技術課題は、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質又はその断片を含む製剤が免疫動物を誘導することによって製造される特異抗体を提供することである。

本発明は、混合ワクチン及び／又はダブルターゲット特異抗体により、ポルフィロモナスジンジバリス慢性感染症による歯周病／インプラント周囲炎及びその他の関連疾患を予防と治療する。

上記技術課題を解決するために、本発明の技術案は、ヌクレオチド配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される新規のｃｒａ４Ｓ１遺伝子を提供する。

本発明の内容は、前記ｃｒａ４Ｓ１遺伝子を取得する方法をさらに含む。

本発明の内容は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示される、前記ｃｒａ４Ｓ１遺伝子によってコードされるＣｒａ４Ｓ１タンパク質をさらに含む。

本発明の内容は、前記ｃｒａ４Ｓ１遺伝子を含む発現カセット、組み換えベクター又は細胞をさらに含む。

本発明の内容は、前記ｃｒａ４Ｓ１遺伝子、人工合成遺伝子の設計、前記タンパク質、前記発現カセット、組み換えベクター又は細胞の、歯周病又はインプラント周囲炎又はポルフィロモナスジンジバリス感染症関連疾患を予防又は治療するワクチン又は医薬の調製における応用をさらに含む。

本発明の内容は、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質又はその断片を含むワクチン又は医薬をさらに含む。

ここで、前記ワクチン又は医薬は、ポルフィロモナスジンジバリスのＷ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質のうちの１種又は複数種をさらに含む。

ここで、本発明にかかるワクチンの調合法は、前記ワクチンにおけるＣｒａ４Ｓ１タンパク質とＷ５０ｒａｇＢタンパク質との質量比が１：２～８、又は前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質とＴｈａｉｒａｇＢタンパク質との質量比が１：１～６、又は前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質とＱＭＬｒａｇＢタンパク質との質量比が１：１～６、又は前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質と３８１ｒａｇＢタンパク質との質量比が１：２～９であり、又は、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質とＷ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質、３８１ｒａｇＢタンパク質の調合法は、上記質量比で最適化される。

好ましくは、前記混合ワクチンの調合法は、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質：Ｗ５０ｒａｇＢタンパク質：ＱＭＬｒａｇＢタンパク質の質量比が１：１：１である。

本発明に記載のワクチン又は医薬は、未感染の健康な人の歯周病又はインプラント周囲炎又は慢性感染性歯周病の発生の予防、若しくは歯周病又はインプラント周囲炎又は慢性感染性歯周病に感染したことがある患者の再発の予防や治療に用いられることを含むが、これらに限定されず、他のポルフィロモナスジンジバリス感染症に関連する疾患にも利用可能である。

さらに、好ましくは、前記ポルフィロモナスジンジバリスは、ポルフィロモナスジンジバリスＷ５０類亜型、Ｔｈａｉ類亜型、ＱＭＬ類亜型及び３８１類亜型を含む。

本発明の内容は、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質又はその断片を含む製剤が免疫動物を誘導することによって製造される特異抗体をさらに含む。

ここで、前記特異抗体の混合応用は、ポルフィロモナスジンジバリスのＷ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質のうちの１種又は複数種の製剤が免疫動物を誘導することによって製造されることをさらに含む。

ここで、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質、Ｗ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質の免疫接種の投与量は、何れも０．５～５０μｇである。

好ましくは、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質、Ｗ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質の免疫接種の投与量は、何れも０．５～５μｇである。

好ましくは、前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質、Ｗ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質の免疫接種の投与量は、何れも５～５０μｇである。

免疫して得られたポリクローナル抗体の投与量は、１００～２００μｇである。

本発明に記載の特異抗体は、未感染の健康な人の歯周病又はインプラント周囲炎又は慢性感染性歯周病の発生の予防、若しくは歯周病又はインプラント周囲炎又は慢性感染性歯周病に感染したことがある患者の再発の予防や治療に用いられることを含むが、これらに限定されず、他のポルフィロモナスジンジバリス感染症に関連する疾患にも利用可能である。

本発明の主旨は、まず遺伝子発現が難しいという技術的障害をうまく解消しているが、その要としては、共転写遺伝子間の分子相乗効果と相互依存性を活用して、歯周病／インプラント周囲炎を予防と治療するワクチン及び抗体製品の製造に成功したことである。

本発明の原理及び方法：
ポルフィロモナスジンジバリス細菌ゲノムＤＮＡには、ｒａｇＡとｒａｇＢ遺伝子及び両端の不規則な挿入断片で構成された（図１）ｒａｇ遺伝子座（ｒａｇ ｌｏｃｕｓ）があり、ｒａｇＡとｒａｇＢ遺伝子は、そのオープンリーディングフレームがそれぞれ独立しているが、実験により、両者に共転写関係があることが証明され、例えば、ｒａｇＡ遺伝子が人為突然変異されると、ＲａｇＢタンパク質は正常に発現できなくなり、又は、下流のｒａｇＢ遺伝子が人為突然変異されると、ＲａｇＡタンパク質は、細菌において正常に発現できなくなる（参照文献：ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９７６）。

本社の認定された特許（ＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９７６）技術を使用して、細菌の外膜タンパク質をコードするｒａｇＢ遺伝子の配列分析により、４つの異なる亜型の病原細菌は、臨床検体検査において絶対な優位性があることが判明されており、４つの異なる亜型に対応して、ポルフィロモナスジンジバリスの外膜タンパク質は、それぞれＷ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質と名付けられ、組み換えサブユニット１価と多価ワクチンの実験室でのパイロット生産規模のプロセスフローが完了した。

実質的に、ｒａｇＡ遺伝子にも高い遺伝子多型性があるが、ｒａｇＡ遺伝子のＤＮＡ多型性に対応するコードされるタンパク質の関連研究は、発表された文献がない。出願人は、従来の方法により、ゲノムＤＮＡからのｒａｇＡ遺伝子のクローニングと発現を試みたが、うまく達成できなかった。出願人は、そのＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９７６の特許技術に基づき、タンパク質配列の比較分析により、ｒａｇＡ遺伝子によってコードされるタンパク質に１つのアミノ酸保存安定配列があることを発見したが、従来の方法によりクローニングと発現してもうまく達成できなかった。

ＲａｇＡの安定領域におけるタンパク質分子の発現を得るために、出願人は、ヌクレオチドを最適化する方法によって、１つの新しい配列を設計したが、ヌクレオチドを人工的に合成する方法により１つの遺伝子配列が作成され、それはｃｒａ４Ｓ１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１を参照）と名付けられ、ポルフィロモナスジンジバリスのｒａｇＡ遺伝子に安定した保存アミノ酸配列があることを意味し、４つの主な細菌亜型が１つの共通のタンパク質配列を有することを指摘している。

本発明において、ｃｒａ４Ｓ１遺伝子断片はうまく発現ベクターにクローニングされ、誘導条件で組み換えタンパク質が生成された。クロマトグラフィーと分子篩の原理によって、精製された組み換えタンパク質が取得され（実施例３、図２、３、５、６と７）、組み換えＣｒａ４Ｓ１タンパク質は分子量が約１５ＫＤａであり、組み換えクローン化遺伝子ＤＮＡの配列決定結果は設計案と一致し、コードされるタンパク質配列は安定領域の理論配列と一致し（図４）、分子量は期待される理論値と合致している。

組み換えＣｒａ４Ｓ１タンパク質は強い抗原性を有し、少用量で動物を免疫すれば高力価の抗体を産生することができるが（実施例８では詳細に記載）、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質のみを使用して動物を免疫する場合は、免疫保護作用が認められなかった。

インビトロ実験では、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質で免疫された動物によって産生された抗体は、ポルフィロモナスジンジバリス又は／及び細菌溶解物と反応できなかったことが観察され、実験では、ＲａｇＢ抗血清及び全菌抗血清と組み換えＣｒａ４Ｓ１タンパク質との間に明らかな免疫学的反応が見られなかったことがさらに観察され、これらの実験結果により、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質は細菌表面の主な抗原ではないことが示唆されている。

興味深いことに、動物はＲａｇＢワクチンで免疫した後、ポルフィロモナスジンジバリスに攻撃されると、この時に採取された血清抗体は組み換えＣｒａ４Ｓ１タンパク質と異なる程度の免疫交差反応を示すことになる。これは、ＲａｇＢ抗体がポルフィロモナスジンジバリスの外膜タンパク質ＲａｇＢと結合すると、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質の元の空間構造が変更されて、その隠れた抗原性が暴露されることを示唆している。

具体的な実験では、組み換えＣｒａ４Ｓ１タンパク質とＲａｇＢタンパク質が混合ワクチンを形成する場合、予期しない結果が生じて、新しい調合法による混合ワクチンは、ポルフィロモナスジンジバリス感染症に対する体の免疫保護効果を向上させたが（実施例８、図１２）、これは、ＲａｇＢ抗体が細菌表面のＲａｇＢ抗原に結合すると、ｒａｇ遺伝子座タンパク質の空間構造が変更され、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質が暴露されて抗体に認識される機会が与えられ、細菌表面のダブルターゲットは同時に特異抗体により捕捉され、主な外膜タンパク質の機能が制限されることで、細菌を抑制と除去する効果が達成されることを示唆している。

混合ワクチンは実験において、製品の安定性の向上も反映しており、これはデータの標準偏差が低いままに保たれたことに表されており、標準偏差は、一群のデータの平均値の分散度の評価基準であり、小さい標準偏差の方は、これらの値が平均により近いことを意味し、予想以上の分散になるリスクが減少されることを示す。これは、ＲａｇＡとＲａｇＢのダブルターゲット抗原抗体結合による免疫効果がより安定的であることをさらに証明している。

本発明の新規点は、細菌表面抗原のマルチターゲットの特性を利用し、安定的且つ効率的なバイオ製品を製造することである。

混合ワクチンは、健康なマウスだけでなく、ポルフィロモナスジンジバリスに感染した動物にも適用され、実験結果により、混合ワクチンは感染体に顕著な免疫保護作用があることが示されており（実施例９）、これは、本発明のもう１つの新規点である。ポルフィロモナスジンジバリス感染症による歯周病／インプラント周囲炎は、慢性且つ断続的な過程であり、進行性の経過となっている。動物実験では、複数回の感染後、局所病変が悪化しつつあるだけでなく、動物の全身にも衰弱が現れることが観察された（実施例７）。臨床的に、ほとんどの人は様々な程度の歯周病を罹患しているため、本発明は慢性感染症を制御することにより、全身の健康に対する慢性感染症の被害を抑止することができ、製品は幅広い市場の見通しがある。

混合ワクチンの免疫効果と安定性の向上試験に加えて、受動免疫実験によっても、複合抗体がＣｒａ４Ｓ１タンパク質抗体と外膜タンパク質ＲａｇＢ抗体を含み、その免疫保護作用が単一の抗体をそれぞれ使用する実験群よりも強いことが同時に証明されている（実施例１０）。

感染すべき動物に対する混合ワクチンと複合抗体の能動免疫と受動免疫の保護実験は、その方法及び結果も本明細書に含まれている。

本発明は従来技術に比べて、以下の利点がある。

１．本発明は、ポルフィロモナスジンジバリスに関連するｃｒａ４Ｓ１遺伝子を初めて開示し、そして初めてｃｒａ４Ｓ１遺伝子をクローニングして大腸菌で発現させてＣｒａ４Ｓ１タンパク質を得ることに成功したが、このタンパク質はポルフィロモナスジンジバリスＲａｇＢワクチンなどの製品と併用すると、ポルフィロモナスジンジバリス感染症に対する体の免疫保護効果を強化するだけでなく、ワクチン製品の機能の安定性も向上させ、また、混合ワクチンと複合抗体は、何れも感染すべき体において顕著な免疫保護作用を示していることで、本発明は幅広い応用の見通しがあることが示唆され、製品は健康な人だけでなく、慢性感染症の患者にも適用可能である。

２．本発明にかかるワクチンは、ポルフィロモナスジンジバリスの特異的外膜タンパク質のターゲット及び新たに発見された保存領域の抗原成分を含むことで、外膜タンパク質のみ又は新たに発見された抗原のみを使用して製造されたワクチンの有効性が改善される。ポルフィロモナスジンジバリス保存領域の抗原を外膜タンパク質の誘導により産生された抗体と併用すると、抗体の免疫保護効果が大幅に向上する。また、研究の結果により、ワクチンと二重特異抗体を含む本発明の製品を使用した実験動物群は、各対照群に比べて、その実験データの標準偏差が何れも低く維持されていたことが示され、本発明の製品はインビボ実験でより良い安定性を提供できることが示唆されている。

３．本発明の内容は、抗感染免疫では、特異抗体が細菌の表面における互いに関連するターゲットと結合することで、免疫分子が保存領域抗原及び細菌の亜型を認識する特異抗原と結合する特性を利用して、抗体の効果を安定的且つ効果的に発揮し、病原菌を抑制と除去し、病気を予防と治療する目的を達成することができると指摘している。

以下、本発明のさらなる例を説明するが、これらは、見通しの予測を含むが、本発明に限定されない

ポルフィロモナスジンジバリスＷ５０の主な外膜タンパク質受容体の抗原遺伝子ｒａｇ（ｒａｇ、ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｔｉｇｅｎ ｇｅｎｅ）座である。 組み換えプラスミドベクターの構築図である。注：Ｃ５３６１ＢＨ１５０－１は標的遺伝子ｃｒａ４Ｓ１である。 組み換えプラスミド酵素消化の同定である。（Ａ）：レーン１は組み換えｃｒａ４Ｓ１－ｐＥＴ－３０ａ（＋）プラスミドであり、レーン２は酵素消化反応であり、プラスミドＤＮＡとｃｒａ４Ｓ１遺伝子バンドがあり、Ｍは１ｋｂ ＤＮＡ勾配スケール（ジェンスクリプト）であり、（Ｂ）：１ｋｂ ＤＮＡ勾配スケールとＤＬ３０００（ジェンスクリプト）分子量スケールの比較図である。 クローニングして得られた標的遺伝子に対応するアミノ酸配列と細菌の理論アミノ酸配列とは一致することである。 組み換えタンパク質の誘導後の発現検出である。レーンＭ：タンパク質分子量スケール（１５～１２０ｋＤａ）、レーン９：誘導前の細菌の全タンパク質（コロニー１）、レーン１０：誘導後の細菌の全タンパク質（コロニー１）、レーン１１：誘導前の細菌の全タンパク質（コロニー２）、レーン１２：誘導後の細菌の全タンパク質（コロニー２）。 組み換えタンパク質の誘導後の発現検出である。レーンＭ：タンパク質分子量スケール（１５～１２０ｋＤａ）、レーン１：遠心分離された上清液、レーン２：全菌の溶解液、レーン３：細菌溶解液の上清。 アフィニティークロマトグラフィーで精製されたタンパク質の収集である。レーンＭ：タンパク質分子量スケール（１５～１２０ｋＤａ）；レーンカラムの前はカラムを通る流れであり、レーン１～１０はタンパク質収集液である。 マウスの皮下と皮膚軟組織が病的に障害された動物モデルの図である。Ａは病変の写真であり、Ｂは白い線で病変の縁部が囲まれることであり、ＩｍａｇｅＪにより病変の面積が算出され、詳しくは実施例４を参照する。 細菌の攻撃用量と局所軟組織病変との関係であり、詳しくは実施例５を参照し、細菌攻撃後の１５日目の病変記録である。（Ａ）ポルフィロモナスジンジバリスの異なる亜型の毒力の調査であり、横座標はポルフィロモナスジンジバリスに攻撃された場合の様々な濃度であり、異なる亜型の攻撃細菌が順番に配列され、縦座標は皮膚と軟組織病変の面積（ｍｍ^２）である。（Ｂ）用量と病変は正の相関があり、横座標はポルフィロモナスジンジバリスの異なる亜型であり、縦座標は皮膚と軟組織病変の面積（ｍｍ^２）であり、用量が順番に配列され、攻撃用量が大きいほど、病変の面積が大きくなる。 動物の年齢と細菌への感受性との関係であり、横座標は時間で、攻撃後の日数であり、縦座標は皮膚と軟組織病変の面積（ｍｍ^２）であり、詳しくは実施例６を参照するが、図中、Ｇ１（４週齢）、Ｇ２（８週齢）、Ｇ１（１２週齢）、Ｇ４（１６週齢）及びＧ５（２０週齢）は異なる年齢群の動物をそれぞれ表している。 ポルフィロモナスジンジバリスの複数の感染による損害であり、詳しくは実施例７を参照する。（Ａ）局所病変で、初感染と複数回の感染による軟組織損傷の面積の比較であり、横座標は攻撃後の日数であり、縦座標は皮膚と軟組織病変の面積（ｍｍ^２）である。（Ｂ）複数回感染した動物（Ｇ１４８群）の回復期間の２４日目の映像記録のスクリーンショットである。（Ｃ）初感染した動物（Ｇ１４８．１群）の回復期間の２４日目の映像記録のスクリーンショットである。 混合ワクチンの免疫保護機能であり、詳しくは実施例８を参照するが、横座標は攻撃後の日数であり、縦座標は皮膚と軟組織病変の面積（ｍｍ^２）である。 感染後にワクチンを用いた局所免疫保護作用であり、詳しくは実施例９を参照するが、横座標は攻撃後の日数であり、縦座標は皮膚と軟組織病変の面積（ｍｍ^２）である。 感染後にワクチンを用いた全身免疫保護作用であり、詳しくは実施例９を参照し、細菌攻撃後の２４日目と４２日目のビデオスクリーンショットであり、Ｇ１５４群は１価ワクチンＷ５０ｒａｇＢを使用し、Ｇ１５５群は１価ワクチンＣｒａ４Ｓ１を使用し、Ｇ１５６群は混合ワクチンＷ５０ｒａｇＢ＋Ｃｒａ４Ｓ１を使用し、Ｇ１５７群はワクチンを使用しなかった感染対照群であり、Ｇ１５８群は初感染対照である。 ダブルターゲット特異抗体の受動免疫機能の調査であり、詳しくは実施例１０を参照する。（Ａ）Ｇ３７０、Ｇ３７１、Ｇ３７２、Ｇ３７３及びＧ３７４の、ポルフィロモナスジンジバリスに事前感染せず、細菌に攻撃された動物の死亡率の調査である。抗体の使用状況はそれぞれ下記の通りである。Ｇ３７０は抗ＴｈａｉｒａｇＢ血清を使用し、Ｇ３７１は複合抗体である抗ＴｈａｉｒａｇＢと抗Ｃｒａ４Ｓ１の血清を使用し、Ｇ３７２は抗Ｃｒａ４Ｓ１血清を使用し、Ｇ３７３は正常のマウス血清を使用し、Ｇ３７４はＰＢＳ対照を使用した。（Ｂ）Ｇ３６１、Ｇ３６２、Ｇ３６３、Ｇ３６４及びＧ３６９群のマウスは事前感染歴があり、細菌に攻撃された後の動物の死亡率の調査であり、各群の抗体の使用状況はそれぞれ下記の通りである。Ｇ３６１は抗ＴｈａｉｒａｇＢ血清を使用し、Ｇ３６２は複合抗体である抗ＴｈａｉｒａｇＢと抗Ｃｒａ４Ｓ１の血清を使用し、Ｇ３６３は抗Ｃｒａ４Ｓ１血清を使用し、Ｇ３６４は正常のマウス血清を使用し、Ｇ３６９はＰＢＳ対照を使用した。 初感染及び感染症の既往歴がある動物に対するダブルターゲット特異抗体の局所免疫保護作用である。（Ａ）Ｇ３７１、Ｇ３７２、Ｇ３７３及びＧ３７４は、何れもポルフィロモナスジンジバリスに感染しておらず、抗体の使用状況は図１５と同様であり、横座標は攻撃後の日数、縦座標は皮膚と軟組織病変の面積（ｍｍ^２）である。（Ｂ）Ｇ３６１、Ｇ３６２、Ｇ３６３、Ｇ３６４及びＧ３６９群のマウスは事前感染歴があり、抗体の使用状況は図１５と同様であり、横座標は攻撃後の日数、縦座標は皮膚と軟組織病変の面積（ｍｍ^２）である。

以下、図面に合わせて本発明をさらに説明する。

実施例１：ｃｒａ４Ｓ１遺伝子のヌクレオチド配列の設計
出願人はＤＮＡ配列と設計要件を提供し、南京ジェンスクリプトバイオテック社（以下、ジェンスクリプトと略称）はヌクレオチド合成のサービスを提供した。

ｃｒａ４Ｓ１遺伝子を人工的に作成する発想は、ポルフィロモナスジンジバリスのｒａｇＡ遺伝子に由来する。ｒａｇＡ（外膜タンパク質をコードし、分子量は約１１５ｋＤａである）とｒａｇＢ（外膜タンパク質の免疫源領域をコードし、分子量は約５５ｋＤａタンパク質である）は、同じ転写因子（図１）においてｒａｇ遺伝子座（ｒａｇ ｌｏｃｕｓ）を構成し、出願人は前の発明特許と発表された文献において、ｒａｇＡとｒａｇＢ遺伝子が何れも遺伝的多型特性を有することを指摘している。今まで、ｒａｇＡ遺伝子及びそれによってコードされるタンパク質に関する公開文献が報告されていない。

出願人の研究結果によって、ｒａｇＡ遺伝子によってコードされるタンパク質には、比較的保存安定領域配列があることが発見され、下記の図のＲａｇＡ配列において、下線部分は４つの主なポルフィロモナスジンジバリスの亜型が有する共通のアミノ酸配列である。

異なる亜型の細菌が同じタンパク質配列を共有することは、広域ワクチンの研究に見通しを指し示したが、従来の方法により細菌ゲノムＤＮＡから標的遺伝子断片を抽出することを試みたところ、うまくクローニングできなかった。

本発明は、宿主自身のコドン優先度を使用してヌクレオチド配列を修飾し、ヌクレオチド配列が改善された後、それによってコードされたタンパク質配列は、標的タンパク質が正確に発現されるように、標的遺伝子と一致しなければならない。人工的に合成された遺伝子配列は、ｃｒａ４Ｓ１と名付けられており、ポルフィロモナスジンジバリスのｒａｇＡ遺伝子に安定した保存アミノ酸配列があることを意味し、４つの主な細菌亜型が１つの共通のタンパク質配列を共有することを指摘している。本発明において、人工的に設計された、遺伝子合成方法により得られたヌクレオチド配列は、あらゆる知的財産権が特許出願人に帰属し、ジェンスクリプトはヌクレオチド合成のサービスしか提供しなかった。

人工的に合成されたｃｒａ４Ｓ１遺伝子のヌクレオチド配列は、以下の通りである。

このｃｒａ４Ｓ１遺伝子断片は長さが４０８ｂｐであり、３９３ｂｐの標的遺伝子が含まれており、５’末端制限酵素はＮｄｅＩ（ＣＡＴＡＴＧ、下線部分）が使用され、開始コードが制限酵素のＡＴＧであり、３’末端制限酵素はＸｈｏＩ（ＣＴＣＧＡＧ、下線部分）が使用された。標的遺伝子が正しく発現されるように、標的遺伝子の翻訳が完了した後、ＴＧＡ（太字）終止コドンの挿入を特別に設置して翻訳を直ちに終止した。プラスミドＤＮＡを宿主細胞に形質転換した後、人工的に合成された標的遺伝子の正確度を検出する必要がある。

実施例２：ｃｒａ４Ｓ１遺伝子発現ベクターの構築及び同定
Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質オープンリーディングフレームベクターを含む原核発現ベクターの構築方法は、実施例１で人工的に合成されたｃｒａ４Ｓ１遺伝子断片をベクタープラスミドｐＥＴ－３０ａ（＋）（南京ジェンスクリプトから購入）に接続することであり、組み換えプラスミドの構築は図２に示される。プラスミドと標的遺伝子は、何れも制限酵素ＮｄｅＩとＸｈｏＩで二重酵素消化され、両方の酵素消化システムは、２つの制限酵素それぞれ２μｌ、１０×Ｂｕｆｆｅｒの緩衝液４μｌ、プラスミドｐＥＴ－３０ａ（＋）１μｇ又はｃｒａ４Ｓ１遺伝子断片１μｇであり、ｄｄＨ_２Ｏで４０μｌまで補足し、３７℃で２ ｈ水浴した。ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製して回収し、ベクターと標的遺伝子断片を接続したが、接続システムは、酵素消化・回收されたベクターそれぞれ２００μｇ、ｃｒａ４Ｓ１遺伝子断片２８０μｇ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ１．０μｌ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ緩衝液２．０μｌであり、ｄｄＨ_２Ｏで２０μｌまで補足し、１６℃で１２～１６ ｈ反応させた。うまく接続された発現ベクターｃｒａ４Ｓ１－ｐＥＴ－３０ａ（＋）プラスミドを大腸菌に形質転換した。

形質転換：ｃｒａ４Ｓ１－ｐＥＴ－３０ａ（＋）プラスミド１μｌ（１００ｎｇ）をコンピテント大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ（ジェンスクリプトが購入）１００μｌに加え、氷浴に２０分間置き、４２℃で９０秒熱ショックを与えてから、すばやく氷に５分間置き、ＬＢ培養液６００μｌを加え、３７℃、２２０ｒｐｍで１時間振とうし、遠心分離後にカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＬＢプレートに培養物を塗布し、３７℃で一晩培養した。形質転換菌プレート培養皿から単一のコロニーをランダムに選択し、プラスミドＤＮＡを抽出して精製した後、酵素消化実験によりプラスミド挿入遺伝子断片（図３）を確認し、プラスミドＤＮＡ配列決定に送った。

配列決定の結果は、以下の通りである。

上記太字部分の塩基３９３ｂｐはクローニングされたｃｒａ４Ｓ１遺伝子配列であり、下線は制限酵素の消化サイトであり、終止コドンＴＧＡは終端にあり、組み換え遺伝子の配列決定結果における３５２～７４４番目のヌクレオチド配列と設計されたヌクレオチド配列とを比較すると、１００％完全に合致している。

理論アミノ酸配列は、以下の通りである：

ｒａｇＡ保存アミノ酸配列（リーダーペプチド２０ＡＡを除去）

上記の配列決定結果により翻訳されたタンパク質に対応するアミノ酸配列と理論アミノ酸配列と比較すると、比較結果は図４に示される。

結果：組み換えプラスミドにおける標的遺伝子のＤＮＡ配列と最適に設計されたｃｒａ４Ｓ１遺伝子をマッチングすると、１００％合致しており、コードされるタンパク質配列と標的理論アミノ酸配列が１００％合致すると予期される。

実施例３ Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質の誘導、発現及び精製
ＩＰＴＧ誘導：実施例２の形質転換プレートにおける２つの単一コロニーを選択し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む３ｍｌのＬＢ培養液の試験管内にそれぞれ接種し、３７℃、２００ｒｐｍで振とうして一晩放置し、翌日に１：１００で５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培養液１００ｍｌに接種し、菌体ＯＤ６００が０．６～０．８になるまで３７℃、２２０ｒｐｍで振とうし（約４ｈ）、培養物１ｍｌを取り出し、１００００ｇを室温で５ ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳ １００μｌで菌体を再懸濁して沈殿させ、準備に備えた。最終濃度が１ｍＭになるように残りの培養物にＩＰＴＧを加え、３７℃、２２０ｒｐｍで４時間振とうして組み換えタンパク質の発現を誘導し、培養物１ｍｌを取り出し、１００００ｇを室温で５ ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＰＢＳ １００μｌで菌体を再懸濁して沈殿させ、準備に備えた。残りの培養物を遠心分離して沈殿させた後に上清を捨て、湿重量を計量し、記録してファイルに保存し、－２０℃の冷蔵庫で保存した。

タンパク質発現の検出：前のステップで誘導前と誘導後の細菌懸濁液を取り、振とう後に同等体積の２×ＳＤＳローディングバッファーを加え、１００℃で５ ｍｉｎ加熱し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで電気泳動し、クマシーブリリアントブルーで染色して組み換えタンパク質を検出した（図５）。その結果、形質転換菌がＩＰＴＧの誘導で標的タンパク質を産生し、分子量１５ｋＤａの位置において強いタンパク質バンドが示され、標的タンパク質の理論値と合致し、未誘導菌にはこのタンパク質が現れなかったことが示されている。

組み換えタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーによる精製：まず、ＩＰＴＧによって誘導された菌体を超音波で破壊し、細菌の湿重量１グラム当たりにＴｒｉｓ－ＨＣＬ（ＰＨ８．０）３０ｍｌを加え、均一に懸濁させ、４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、細菌の沈殿物を３回洗浄した後、細菌を懸濁し、超音波（寧波新芝超音波破壊装置Ｙ－９２ＩＩＩ）溶解法で菌体を破壊し、菌液が入ったビーカーを氷浴に置き、超音波時間は３秒、間隔時間は５秒、超音波の総作動時間は８分間である。超音波で破壊された細菌液を４℃の条件で、１００００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清液を収集して沈殿させ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで検出した（図６）。その結果、細菌が破壊された後、組み換えタンパク質が主に遠心分離して沈殿された上清液に現れることが明らかになり、組み換えタンパク質が可溶性形態で細胞内で合成されていることが示され、その後の封入体の再生プロセスが回避される。

ＡＫＴＡ精製器（ＧＥ社）によりアフィニティークロマトグラフィーで組み換えタンパク質を精製し、クロマトグラフィーカラムとしてＤＥＡＥカラム（Ｈｕｉｙａｎ）を選択し、組み換えタンパク質を含む細菌溶解液の上清溶液を精製カラムに加え、１回のローディング体積は４０ｍｌ～１００ｍｌ（１～５ｍｇ／ｍｌ）、ローディング流速は１．５ｍｌ／ｍｉｎ、移動相Ａ溶液をＴｒｉｓ－ＨＣｌ ５０ｍＭ、ＰＨ８として使用し、流出液ＯＤ２８０の値がベースラインに達すると、移動相Ｂ溶液をＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ ５０ｍＭ、ｐＨ８．０に変換し、４ｍｌ／ｍｉｎの流速で溶出し、１０％Ｂ、１８％Ｂ、１００％Ｂの様々な勾配のＢ溶液で標的タンパク質を溶出し、流出液を収集してマークし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ電気泳動で精製されたタンパク質を検出し、図７に、最初の勾配で溶出されて収集されたタンパク質を示し、Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦカラムでさらに精製し、不純物を除去し、－２０℃で保存した。

結論：プラスミド形質転換菌は、ＩＰＴＧにより誘導された後、細胞内で組み換えタンパク質を産生することができ、菌体が溶解した後、組み換えタンパク質は主に溶解液の上清に存在することが認められ、Ｃｒａ４Ｓ１は可溶性タンパク質の形態で存在することが示されている。アフィニティークロマトグラフィーにより、精製されたＣｒａ４Ｓ１組み換えタンパク質が得られ、組み換えタンパク質の分子量は約１５ｋＤａで、予期される理論値と合致している。

実施例４ マウス軟組織病変部位の面積の計算方法
ポルフィロモナスジンジバリスの病原性を検出するために、マウスの表皮と皮下軟組織病変モデルを確立した。

簡単な説明は次の通りである。ポルフィロモナスジンジバリスは、様々な亜型の細菌（ポルフィロモナスジンジバリスＷ５０亜型、Ｔｈａｉ亜型、ＱＭＬ亜型及び３８１亜型）を含み、何れも５％の脱線維化馬血を含むＦａｓｔｉｄｉｏｕｓ嫌気性寒天（ＦＡＡ）プレートに増殖し、窒素ガス８０％、水素ガス１０％及び二酸化炭素１０％を含む３７℃の嫌気性インキュベータに入れた。コロニーを選択して５μｇ／ｍｌの塩化ヘミンを含む新たに調製されたＢＨＩ培養液（ブレインハートインフュージョン培養液）に移し、１８～２４時間増殖させ、ＯＤ６００ｎｍが１～１．２に達すると、培養物を遠心分離して回収し、２回洗浄し、ＢＨＩ培養液を使用して、実験用マウス（Ｂａｌｂ／ｃ、揚州大学動物センター購入）に接種するための一定の濃度の細菌懸濁液（２～８×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ）を調製した。マウスは異なる実験計画に従って群分けし、一般的に、６～８週齢、体重１８～２２グラムで、それぞれの群に８～１２匹を選択し、それぞれのマウスに２００μｌの細菌懸濁液を接種し、マウスの背中の脊椎の両側に皮下注射した。細菌攻撃後、マウスの体重変化、行動及び動きを記録し、皮膚と皮下軟組織の病変の様子を詳しく記録した。

具体的には、ポルフィロモナスジンジバリスＷ５０亜型でＢａｌｂ／ｃマウスを攻撃する場合、３×１０^１０ＣＦＵ／ｍの細菌懸濁液を準備し、マウスの背中の脊椎の両側に０．２ｍｌ注射した。

結果：図８には、マウスは細菌に攻撃された後、皮膚と皮下軟組織に病変が発生されたことを示しており、白い線で病変部位が囲まれている。病変の面積を計算し、最初に病変の最長縦径及び対応する横径を手動で測定し、縦径と横径を乗算して病変の面積を計算し、全ての手書きデータを記録してファイルに保存した。病変部位の特定及び面積の計算方法は２０１９年４月に改善されたが、撮影の方法により、カメラと撮影される病変部位の距離を固定し、そして写真に対してＩｍａｇｅＪ（コンピューターソフトウェア名）を使用して囲まれた範囲における病変の面積を計算する。

まとめ：本実施例で使用されるマウスの体表面軟組織損傷モデルは、創傷面の病理学的特徴、疾患の経過の進行、創傷の治癒状況及び病変の予後状態を含む局所病変の様子を動的に観察し、マウスの体重変化、精神状態及び行動特性などの指標と合わせて、ポルフィロモナスジンジバリス感染によって引き起こされる被害を総合的に判定した。撮影方法とコンピューターソフトウェアにより病変を位置決めしてその面積を計算し、個人誤差を減らし、映像記録を保存することは、起源の追跡及び元のデータのさらなる研究に役立つ。本実施例で使用される動物実験モデルは、国際上の一般的な方法に従ったもので、標準は業界で認められている。

実施例５ ポルフィロモナスジンジバリス感染の用量とマウス軟組織病変との関係
本実施例の目的は、４つの主な外膜タンパク質に対応するポルフィロモナスジンジバリスの亜型、それらの毒力の違い及び細菌感染の用量と病変との相関関係を調査することである。

具体的には、４つの異なる亜型のポルフィロモナスジンジバリスはＷ５０亜型、Ｔｈａｉ亜型、ＱＭＬ亜型及び３８１亜型を含み、実施例４に記載の方法を参照して、それぞれ５×１０^９ＣＦＵ／ｍｌ、２×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ及び８×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌである３つの異なる濃度の細菌懸濁液を調製したが、実験動物は、６～８週齢、体重１８～２４グラムのＢａｌｂ／ｃマウスで、それぞれの群に８～１２匹があり、それぞれのマウスに２００μｌの細菌懸濁液を接種し、マウスの背中の脊椎の両側に皮下注射した。細菌攻撃後、マウスの体重、行動及び局所軟組織の病変を記録した。

結果：攻撃菌の濃度の増加に伴い、動物の全身と局所病変の状況は悪化しつつあり、それは、高濃度菌の侵入による体重の減少が最も深刻であり、マウスが病的状態になり、局所病変の面積が最も大きいことに反映されている。４つの異なるポルフィロモナスジンジバリスの亜型が同じ用量の細菌に攻撃された場合、局所損害も一致しない（図９Ａと図９Ｂ）。

結論：図９Ａと図９Ｂは、試験される４つのポルフィロモナスジンジバリスの亜型菌株の毒力に一定の違いがあることを示しており、図Ａ中のＰｇＡ、ＰｇＢ、ＰｇＣ及びＰｇＤは、それぞれポルフィロモナスジンジバリスＷ５０亜型、Ｔｈａｉ亜型、ＱＭＬ亜型及び３８１亜型を表し、図Ｂ中の３つの異なる濃度の細菌懸濁液１、２、３は、それぞれ５×１０^９ＣＦＵ／ｍｌ、２×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌ及び８×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌを表す。

しかし、約２０個の異なるポルフィロモナスジンジバリス菌株（それぞれ４つの主なポルフィロモナスジンジバリスの亜型に属する）は同じ方法で動物を攻撃したが、同じ亜型内でも菌株同士が異なる毒力を有する（データが示されていない）ことが認められたため、本実施例の菌株の毒力の違いは亜型の代表的な菌の特徴を有しない。即ち、本実施例の結果は、ポルフィロモナスジンジバリスのどの亜型の毒力が最も強い又は最も弱いかが示唆できない。但し、毒力と用量との関係は試験される４つの亜型において繰り返されたが、細菌の攻撃用量が大きいほど、引き起こされる被害が大きくなる。臨床治療と合わせれば、歯周病患者の局所慢性感染症の細菌が一定の濃度に寄せ集めると、急性発作が引き起こされてしまう。

実施例６ ポルフィロモナスジンジバリス感染と実験マウスの年齢との関係
実験中に、ポルフィロモナスジンジバリスに感染したことのない２５週齢以上のマウスは、異なる亜型のポルフィロモナスジンジバリスの攻撃に対して局所の微小病変のみが発生されたことが認められたが、本実施例の目的は年齢とポルフィロモナスジンジバリス感染との関係を調査することである。

具体的には、実施例４に記載の方法に従って、ポルフィロモナスジンジバリスＷ５０亜型２×１０^１０ＣＦＵ／ｍの細菌懸濁液を調製し、各年齢群の実験マウスの背中の脊椎の両側に０．２ｍｌ皮下注射し、異なる年齢群のそれぞれには８～１０匹の動物があり、細菌攻撃後、３５日目に実験が終了するまで病変面積の進行状況を観察した。

結果：同じ用量と同じ体積の細菌懸濁液で異なる年齢群の実験マウスを攻撃した結果、ポルフィロモナスジンジバリスＷ５０亜型の攻撃による異なる年齢群の動物への損害が異なることを示している。今回の実験において、各年齢群の動物は、細菌に攻撃された後に死亡の現象が現れなかった。Ｇ１群（体重１５～１８グラム）とＧ２群（体重２２～２６グラム）の動物は、それぞれ４週齢と８週齢で幼若期にあり、発症が速く、病変が重篤であるが、幼若群の動物は自己回復が速く、治癒期間が短かった。成体マウスはＧ３群（体重２８～３２グラム）の１２週、Ｇ４群（体重３２～３６グラム）の１６週からＧ５群（体重３３～３８グラム）の２０週まで、病変過程が類似しており、病変の面積が幼若群の動物よりも明らかに小さいが、成体群の動物の予後は遅延することがある（表１、図１０）。

結論：ポルフィロモナスジンジバリスに初感染した動物は、自己治癒することがあり、幼若群の動物は感染後に迅速に治癒できるが、成体群の動物は慢性感染病巣を形成する傾向がある。この実験現象は臨床的な実際状況に一定の参照する価値があり、即ち、人群において、青少年はポルフィロモナスジンジバリス感染によって引き起こされる歯周病に罹患しやすいが、感染後に迅速に回復できるため、青少年の時期に深刻な局所損害を引き起こしてもっと注目を集めることはない。歯周病の成人における発症率が高いあり得る理由としては、成人は感染後に疾患の経過が長く、予後が不良であるためであり、それで、局所損害も増加しつつあり、その後に局所的な歯槽骨の破壊や吸収まで引き起こし、歯が緩むようになってしまう。本実施例は、ポルフィロモナスジンジバリス感染の予防が小児期ないし青年期から始まることを示唆している。

実施例７ ポルフィロモナスジンジバリスの複数回の感染による局所病変の悪化と全身状態の衰弱
実施例６の実験結果により、動物はポルフィロモナスジンジバリスに初感染すると自己治癒することがあり、年齢が小さいほど回復が早くなることが明らかになる。臨床診療では、歯周病は、断続的な進行をよく示している。本実施例の目的は、１回と複数回感染した実験動物モデルを比較することによって、複数回の慢性感染による実験動物への局所と全身の被害を調査することである。

具体的には、８～１０週齢、体重２６～３０グラムである同じ年齢のマウスを２群に分け、番号第１４８群（Ｇ１４８）には５×１０^１０ＣＦＵ／ｍの細菌懸濁液ポルフィロモナスジンジバリスＱＭＬ亜型で攻撃し、番号第１４８．１群（Ｇ１４８．１）には攻撃しなかった。４０日後、細菌に攻撃された第１４８群（Ｇ１４８）のマウスは全て治癒したが、この時、１４８．１群（Ｇ１４８．１）の動物と共に５×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌの細菌懸濁液ポルフィロモナスジンジバリスＱＭＬ亜型の感染を受け、方法は実施例４と同様である。

結果：動物の２回目の細菌攻撃を動的に観察すると、局所病変の損傷の面積は初感染群よりも大きく（表２）、また、二次感染した動物の全身状態は衰弱する傾向がり、毛が暗くなり、とげが立ち上がり、尻尾が萎れ、回復が遅くなり、予後が不良であることに表している。複数回の感染実験は、ポルフィロモナスジンジバリスの４つの主な亜型において繰り返されたが、類似の結果が得られた。局所病変は図１１Ａに示され、動物の全身状態はビデオスクリーンショットに示され、図１１Ｂは、ポルフィロモナスジンジバリスＱＭＬ亜型に感染してから２４日目のＧ１４８群の動物の全身状態のビデオスクリーンショットであり、図１１Ｃは、ポルフィロモナスジンジバリスに初感染してから２４日目のＧ１４８．１群の動物の回復状況のビデオスクリーンショットである。

結論：動物実験の結果により、ポルフィロモナスジンジバリスの持続的な感染は局所病変の状況を次第に悪化させるだけでなく、慢性感染は体の全身の健康状態に影響を与えることができることを示している。臨床的に、歯周病は歯の緩んで離れ落ちることを引き起こすだけでなく、歯周病と全身性疾患との関連については多くの臨床的及び統計学的データが発表されて、歯周病は冠状動脈性心臓病とその急性発作の独立した危険因子で、脳卒中の独立した危険因子であり、歯周病の病原細菌であるポルフィロモナスジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）とアルツハイマー病（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ；一般的に老年性認知症と呼ばれる）とのとの直接的関係が既に認められた。慢性重複ポルフィロモナスジンジバリス感染症が心血管疾患又はアルツハイマー病を直接引き起こすことができるか否かは、証明と研究のためにさらなるデータが必要である。本発明は、免疫学的方法により病原菌の慢性感染の問題を解決し、病原菌が長期間滞在して全身の健康を障害することを抑止することを目的とする。

実施例８ 混合ワクチンの発見
本実施例は、混合ワクチンの免疫保護機能を発見する最初の試みである。最初に実験の目的は、ポルフィロモナスジンジバリスの異なる亜型の外膜タンパク質ＲａｇＢの間に免疫交差保護作用があるか否かを調査することであるので、実験を設計する時、質量比１：１でＷ５０ｒａｇＢタンパク質（タンパク質配列の内容はＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９７６を参照し、タンパク質精製などのやり方は実施例３と同様である）及びＱＭＬｒａｇＢタンパク質（タンパク質配列の内容はＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９７６を参照し、タンパク質精製などのやり方は実施例３と同様である）を含むＲａｇＢ ２価ワクチンを最初に使用した。２回免疫した後、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質（実施例３で調製されたＣｒａ４Ｓ１タンパク質）をさらに加え、それぞれのタンパク質に３回の免疫の機会が与えられた。各亜型の共有する共通抗原Ｃｒａ４Ｓ１を添加することは、新しい混合ワクチンがＲａｇＢワクチンの免疫保護効果に影響を与えることができるか否かを調査するためである。

免疫案は、実施例３で精製して得られたＣｒａ４Ｓ１タンパク質及び異なる亜型ＲａｇＢタンパク質でそれぞれ動物（表３－１、表３－２）を免疫した。６～７週齢、体重１８～２２グラムのマウスは３つの大群に分けられ、第１大群（Ｇ１１、Ｇ１４及びＧ１７の３つの群別に分ける）はＱＭＬｒａｇＢタンパク質とＷ５０ｒａｇＢタンパク質で免疫され、第２大群（Ｇ１２、Ｇ１５及びＧ１８の３つの群別に分ける）はＱＭＬｒａｇＢタンパク質、Ｗ５０ｒａｇＢタンパク質及びＣｒａ４Ｓ１タンパク質を含む混合ワクチンで免疫され、第３大群（Ｇ１３、Ｇ１６及びＧ１９の３つの群別に分ける）は非免疫対照群である。本実施例の最終的な混合ワクチンの調合法は、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質：Ｗ５０ｒａｇＢタンパク質：ＱＭＬｒａｇＢタンパク質の質量比が１：１：１である。

具体的には、それぞれのマウスに組み換えタンパク質溶液１００μｌを腹腔内注射し、そのうち、第１大群（Ｇ１１、Ｇ１４及びＧ１７）は、５～５０μｇのＷ５０ｒａｇＢタンパク質、５～５０μｇのＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び２５０μｇのアルミニウム補助剤を含有する１００μｌの溶液を使用し、表３－１の免疫計画に従って実行し、第２大群（Ｇ１２、Ｇ１５及びＧ１８）は、５μｇのＣｒａ４Ｓ１タンパク質、５～５０μｇのＷ５０ｒａｇＢタンパク質、５～５０μｇのＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び２５０μｇのアルミニウム補助剤を含有する１００μｌの溶液を使用し、表３－２の免疫計画に従って実行し、第３大群（Ｇ１３、Ｇ１６及びＧ１９）は対照群であり、ワクチンを加えなかった。免疫の間隔期間は３～４週間で、追加免疫前に血清の力価を測定し、血清中の抗体の進行過程を記録した。３回免疫後、ＥＬＩＳＡ法により特異抗体の力価を測定し、抗体の力価が１：１０万を超える場合、実施例４に記載の方法に従って細菌攻撃実験を行った。

結果：Ｗ５０ｒａｇＢとＱＭＬｒａｇＢタンパク質で免疫された動物は、混合ワクチンにＣｒａ４Ｓ１タンパク質が加えられると、対応するポルフィロモナスジンジバリスの亜型（Ｗ５０亜型とＱＭＬ亜型）の攻撃に対して、動物の免疫保護機能が明らかに向上し、軟組織病変の面積は対照群よりも小さいことに反映されている（表３－３）。図１２において、横座標はＧ１７（Ｗ５０ｒａｇＢとＱＭＬｒａｇＢの混合ワクチン）、Ｇ１８（Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質、Ｗ５０ｒａｇＢタンパク質及びＱＭＬｒａｇＢタンパク質を含む混合ワクチン）、Ｇ１９（非免疫のマウス対照群）で、攻撃菌はポルフィロモナスジンジバリスＱＭＬ亜型である。

表３－３において、Ｗ５０ｒａｇＢとＱＭＬｒａｇＢの２価ワクチン又はＷ５０ｒａｇＢ、ＱＭＬｒａｇＢ及びＣｒａ４Ｓ１の３価混合ワクチンで免疫された動物は、何れもポルフィロモナスジンジバリスＴｈａｉ亜型に対する免疫保護作用が示されておらず、そのうち、３価混合ワクチンの局所損害は他の２つの群よりも深刻である。

結論と分析：本実施例は混合ワクチンの最初の試みであるが、ワクチン投与量を減らす理由としては、本実施例と同時に実施されたワクチン投与量依存実験の結果から示されるように、実際に、その後の研究で、４つのＲａｇＢタンパク質の免疫接種用量が０．５～５μｇである場合にも高力価の抗体を産生することができると認められ、実験の設計はさらに改善する必要があるが、予備試験の結果は後の研究基盤を構築した。

本実施例の結果により、混合ワクチンは免疫保護効果を向上させるとともに、製品の安定性も高くなることが示されている。この現象は、ターゲットが異なる２つのタンパク質を併用することで、製品の効果を向上できることが示唆されている。混合ワクチンによる免疫効果と安定性の向上の原理は、ＲａｇＡとＲａｇＢの２つのサブユニットが同じ転写因子によって制御されることに関連する可能性があるが、細菌の表面における２つの互いに関連するサブユニット分子のターゲットが抗体により占められると、より安定した分子構造が形成され、このような抗原と抗体の組み合わせにより、細菌の外膜タンパク質の機能が制限され、その一方、ダブルターゲット抗原と抗体の安定した組み合わせにより、より良い免疫相乗効果／協調作用を果たすように体をトリガーして病原体を除去と抑制することが容易になり得る。

最初の研究では、組み換えＣｒａ４Ｓ１タンパク質の発現がうまく達成された後、１価Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質で動物を免疫することにより、高力価の特異抗体を得ることができたが、複数回の細菌攻撃実験の結果から、何れも、免疫された動物の軟組織病変が非免疫対照群よりもひどいことが示され、これは、Ｃｒａ４Ｓ１分子が過敏反応に関与した可能性があると示唆されているため、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質は良好な候補ワクチンではないと考えられる。２年以上の期間に、インビトロ実験により、動物がＲａｇＢワクチンで免疫された後、さらにポルフィロモナスジンジバリスに攻撃されると、この時採集された血清抗体は組み換えＣｒａ４Ｓ１タンパク質と様々な程度の免疫交差反応を示すことが認められた。この現象は、ＲａｇＢ抗体がポルフィロモナスジンジバリスの外膜タンパク質ＲａｇＢに結合すると、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質の元の空間構造が変化されることで、その抗原性が暴露され、ダブルターゲットの抗原と抗体の結合のために機会が作られると示唆している。

本実施例は、ＲａｇＢワクチンが対応するポルフィロモナスジンジバリスの亜型のみを保護し、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質とＲａｇＢタンパク質の併用が対応するポルフィロモナスジンジバリスの亜型のみに対して免疫保護作用を奏することも証明している。例えば、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質とＱＭＬｒａｇＢタンパク質の混合ワクチンは、ポルフィロモナスジンジバリスＱＭＬ亜型の攻撃から体を保護するが、ポルフィロモナスジンジバリスＴｈａｉ亜型の攻撃に対しては保護作用を奏しない。

従って、本実施例に記載の混合ワクチンは、ポルフィロモナスジンジバリスＲａｇＢタンパク質（異なる亜型）とＣｒａ４Ｓ１を含む必要があり、２つの分子を組み合わせて初めて免疫保護機能と安定性を高めることができるが、混合ワクチンは真新しい概念であり、下記の実施例は混合ワクチンのさらなる検証と応用である。

実施例９ 感染後の混合ワクチンによる動物への免疫保護作用の調査
臨床的に、歯周病／インプラント周囲炎の患者のほとんどは、不快な症状で医師の診察を受ける時、感染症や感染症による局所病変がすでに深刻になることがよくある。本実施例は、ポルフィロモナスジンジバリスに感染した体内での混合ワクチンの免疫保護作用を複数の観点から検討する。

具体的には、３～４週齢、体重１２～１６グラムのマウスを５群に分け（表４）、それぞれの群は５～６匹があり、そのうち、４群のマウスは、２００μｌの低用量ポルフィロモナスジンジバリスＷ５０亜型の細菌懸濁液（５×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ）を背部に皮下注射し、軽度の感染を引き起こし、感染されたマウスは通常の通り飲食と行動するが、細菌攻撃後の２日目に一部の動物にわずかな体重減少が起こり、その後、体重が継続的に増加し、１週間後、感染されたマウスはわずかな局所的軽度の皮膚病変が生じ得る。５群目のマウスは対照群として感染されなかった。マウスを４週間飼育し続けた後、ワクチン免疫計画を開始した。

感染した動物を４群に分け、表４の用量と時間を含む計画に従って動物を免疫したが、番号Ｇ１５４群のマウスはＷ５０ｒａｇＢタンパク質で免疫され、番号Ｇ１５５群のマウスはＣｒａ４Ｓ１タンパク質で免疫され、番号Ｇ１５６群のマウスはＣｒａ４Ｓ１タンパク質とＷ５０ｒａｇＢタンパク質の混合物である混合ワクチンで免疫され、番号Ｇ１５７群は軽度の感染があるが、ワクチンが注射されない対照群であり、番号Ｇ１５８群のマウスは同じ年齢の非感染対照群である。

３回免疫後、１群あたりに１匹のマウスを取って採血し、抗体の力価を検出し、その後、実施例４に記載の方法に従って、ポルフィロモナスジンジバリスＷ５０亜型を使用して細菌攻撃実験を実施し、細菌懸濁液の濃度は５×１０^１０ＣＦＵ／ｍｌであり、背部に２００μｌを皮下注射した。細菌攻撃後、マウスの体重、行動及び局所軟組織病変を記録し、全身状態の映像が定期的にファイルに記録された。

結果：軽度に感染された実験動物群は、１価又は混合ワクチンを使用すると、局所軟組織損害が同様に感染した対照群よりも低いとともに、病変損害も感染していない対照群よりも低いことが示され（表５と図１３）、ワクチンを接種した動物群は、感染後の２４日目の記録においてすでに治癒し、その中で、混合ワクチン群の各有益な指標は全て１価ワクチンよりも優れているが、対照群の病状は長期化している。

本実施例は、同時に、実施例７に記載の現象、即ち、ポルフィロモナスジンジバリスに複数回感染した動物の局所損害がより深刻であることも観察した（表５と図１３、図１４）。特に注意すべきことは、動物の回復過程において、図１４の映像データから動物の姿勢が観察されるが、ワクチンを使用したマウスの全身状態が良好であり、毛が明るくて、格好が良く、自由に動くことができるが、対照群のマウスは体表の潰瘍が治癒しにくく、毛が暗くて、動きが遅い。実験群と対照群の体重は有意に変化しなかった。

結論：実施例７の動物実験の結果により、ポルフィロモナスジンジバリスに繰り返して感染すると、局所損害がますます深刻になるだけでなく、実際には全身の健康にも影響を与えることが示唆されている。表５は、混合ワクチンを感染後の動物の免疫に使用することを記録しているが、動物が細菌に再攻撃される場合、局所病変の程度が減少され、病変面積の平均値（ＡＶＧ）が低下し、実験データの標準偏差（ＳＴＤＥＶ）が低く維持され、動物の全身状態が良好であることが示されている。これらのことにより、混合ワクチンが健康な体又はすでに感染した体に対して効果的な免疫保護作用を発揮できることが示されている。４つの主なポルフィロモナスジンジバリスの亜型は何れも同様の実験を行ったが、本発明の特許技術にかかる混合ワクチンの使用は全身の健康に役立ち、幅広い市場の需要があることが示されている。

実施例１０ 特異的ダブルターゲット抗体の受動免疫保護機能の調査
この実験の目的は、受動免疫（即ち、特異抗体の注射）が安全的且つ効果的な免疫保護作用を果たすことができるか否かを調査することである。実際に、抗体は治療薬として、通常、すでに感染した患者を対象としているため、本実施例は感染していない動物と感染した動物の両方を同時に分析した。

具体的に、マウスの特異的抗血清の免疫計画は表６－１に示され（ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質配列はＰＣＴ／ＧＢ２００５／００１９７６を参照し、タンパク質精製などのやり方は実施例３と同じ、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質は実施例３で調製される）、３回免疫後、間接ＥＬＩＳＡ方法により血清中の特異抗体の力価を測定し、最終的に採血し、血清分離後にポリクローナル抗体を取得し、－２０℃の冷蔵庫に保存した。

動物実験の群分けは表６－２に示される。番号Ｇ３６１、Ｇ３６２、Ｇ３６３、Ｇ３６４及びＧ３６９群のマウスは、事前感染歴があり、２００μｌのポルフィロモナスジンジバリスＴｈａｉ亜型の細菌懸濁液（５×１０^８ＣＦＵ／ｍｌ）をマウスの背中に皮下注射し、Ｇ３７０、Ｇ３７１、Ｇ３７２、Ｇ３７３及びＧ３７４の合計５群のマウスは、ポルフィロモナスジンジバリスに感染していない対照群である。

具体的に、９～１０週齢、体重２８～３２グラムのマウスは、細菌攻撃の４日前と１日前に、表６の実験計画に従って、実験マウスに２００μｇのマウス血清を含む１００μｌの抗体溶液を腹腔内注射し、その後、計画に従って細菌攻撃実験を実施したが、具体的な過程は実施例４に記載されたように、攻撃前後のマウスの体重と行動を観察と記録し、攻撃された動物の皮下軟組織病変の進行状況を記録し、皮膚病変の面積を測定した（表７）。

結果：まず、本実施例において、従来の用量で動物を攻撃したが、実験動物の死亡率は予想よりも高く、本実施例における全ての動物は腹腔内注射のステップがあると指摘すべきである。このプロジェクトで設計されたポルフィロモナスジンジバリスの攻撃用量は数回繰り返して実験したものであり、感染した動物が亡くなることは比較的少ない。本実施例において、図１５Ａは、人為的ポルフィロモナスジンジバリス感染歴がない非感染対照群の動物の場合に、抗ＴｈａｉＲａｇＢ実験群Ｇ３７０、抗Ｃｒａ４Ｓ１実験群Ｇ３７２、正常の血清を腹腔内注射したＧ３７３及びＰＢＳを注射したＧ３７４対照群は何れも動物の死亡が発生され、死亡率がそれぞれ７５％（３／４）、４０％（２／５）、３３．３％（２／６）及び５０％（３／６）であるが、複合抗体群（抗ＴｈａｉＲａｇＢと抗Ｃｒａ４Ｓ１）の場合に、血清を注射したＧ３７１の動物群は動物の死亡が発生されなかったことが示されている。本実施例において、図１５Ｂは、事前感染対照群の動物の場合に、正常の血清を腹腔内注射した群Ｇ３６４及びＰＢＳを腹腔内注射した対照群Ｇ３６９が何れも高い死亡率を有し、それぞれ３７．５％（３／８）と６２．５％（５／８）であるが、特異抗体を注射した実験群においては、抗ＴｈａｉＲａｇＢ抗体Ｇ３６１、複合抗体（抗ＴｈａｉｒａｇＢと抗Ｃｒａ４Ｓ１）Ｇ３６２の死亡率がそれぞれ２５％（２／８）と１２．５％（１／８）であり、抗Ｃｒａ４Ｓ１抗体の実験群Ｇ３６３の動物が全て生存していることが示されている。

図１６ＡとＢには、特異的複合抗体は事前感染群動物と非感染群動物の実験において、他の実験群の生存動物よりも局所病変範囲が低いことが示されており、２つの実験では、複合抗体は事前感染群の動物において１匹の死亡が発生された。抗ＴｈａｉＲａｇＢ血清実験群では、事前感染の動物における局所病変の重症度が対照群よりも低いが、健康群の実験では、１匹の動物のみが生存し、群全体の判断に影響を与えた。抗Ｃｒａ４Ｓ１実験群は、感染した動物の体内に抗体を注射し、動物は細菌に攻撃された後に生存率が最も高く、死亡の現象が発生されなかったが、局所病変は抗ＴｈａｉＲａｇＢ実験群と複合抗体（抗ＴｈａｉＲａｇＢと抗Ｃｒａ４Ｓ１）の実験群よりも重度であった（図１６ＡとＢ）という特別な現象を示している。

結論：実施例１０の実験結果により、複合抗体（抗ＴｈａｉＲａｇＢと抗Ｃｒａ４Ｓ１）は、ポルフィロモナスジンジバリス感染に対する抵抗機能が安定的、安全的且つ効果的であり、感染されていないと感染した実験動物の両方に対して免疫保護作用を有することが示されている（図１６Ａと図１６Ｂ）。抗ＴｈａｉＲａｇＢ抗体と抗Ｃｒａ４Ｓ１抗体をそれぞれ個別に使用すれば、効果が確実ではない。本実施例の実験結果により、単一の抗体が細菌表面の抗原分子に結合すると、構造的に安定しない要因があり得るため、抗体の有効性に欠陥があることになると示唆されている。ダブルターゲット特異抗体を使用する場合、複合抗体は主な外膜タンパク質の抗原ダブルターゲットを特異的に占有し、外膜タンパク質の機能を抑制することにより、細菌を抑制と除去し、細菌の毒力を低減させる効果を達成する。

要するに、本発明はポルフィロモナスジンジバリスの重要な外膜タンパク質成分Ｃｒａ４Ｓ１を発見して証明し、Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質の発現遺伝子を作成したとともに、新しいターゲットＣｒａ４Ｓ１を細菌の特異的／特徴的な外膜タンパク質ＲａｇＢに結合することを利用して、混合ワクチン及びダブルターゲット特異抗体の理論を提出し、新しい製品が効果的且つ安定的な細菌抑制効果を有することを実験データで証明したが、新しい技術は幅広い産業上の利用可能性を示している。

以上、本発明の好ましい実施形態のみを記載したが、当業者にとっては、本発明の原理から逸脱することなく、さらに幾つかの改良と修飾を行うことができ、これらの改良と修飾も本発明の保護範囲とされるべきであると指摘すべきである。

Claims (3)

1. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列からなるＣｒａ４Ｓ１タンパク質を含む、ワクチン又は医薬であって、ポルフィロモナスジンジバリスのＷ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質のうちの１種又は複数種をさらに含む、またはポルフィロモナスジンジバリスのＷ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質のうちの１種又は複数種と併用される、ワクチン又は医薬、ここで、前記ワクチン又は医薬は、未感染の健康な人の歯周病又はインプラント周囲炎又はポルフィロモナスジンジバリス感染症の発生の予防、若しくは歯周病又はインプラント周囲炎又はポルフィロモナスジンジバリス感染症関連疾患に罹患したことがある患者の再発の防止または治療に用いられ、前記歯周病又はインプラント周囲炎又はポルフィロモナスジンジバリス感染症又はポルフィロモナスジンジバリス感染症関連疾患が前記１種又は複数種のｒａｇＢタンパク質のいずれかの由来と対応するポルフィロモナスジンジバリスの亜型によるものである。
2. 前記ワクチン又は医薬におけるＣｒａ４Ｓ１タンパク質とＷ５０ｒａｇＢタンパク質との質量比は１：２～８、又は前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質とＴｈａｉｒａｇＢタンパク質との質量比は１：１～６、又は前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質とＱＭＬｒａｇＢタンパク質との質量比は１：１～６、又は前記Ｃｒａ４Ｓ１タンパク質と３８１ｒａｇＢタンパク質との質量比は１：２～９である、請求項１に記載のワクチン又は医薬。
3. ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２に示されるアミノ酸配列からなるＣｒａ４Ｓ１タンパク質に特異的な抗体を含む医薬であって、ポルフィロモナスジンジバリスのＷ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質のうちの１種又は複数種に特異的な抗体をさらに含む、またはポルフィロモナスジンジバリスのＷ５０ｒａｇＢタンパク質、ＴｈａｉｒａｇＢタンパク質、ＱＭＬｒａｇＢタンパク質及び３８１ｒａｇＢタンパク質のうちの１種又は複数種に特異的な抗体と併用される、医薬、ここで、前記医薬は、未感染の健康な人の歯周病又はインプラント周囲炎又はポルフィロモナスジンジバリス感染症の発生の予防、若しくは歯周病又はインプラント周囲炎又はポルフィロモナスジンジバリス感染症関連疾患に罹患したことがある患者の再発の防止または治療に用いられ、前記歯周病又はインプラント周囲炎又はポルフィロモナスジンジバリス感染症又はポルフィロモナスジンジバリス感染症関連疾患が前記１種又は複数種のｒａｇＢタンパク質のいずれかの由来と対応するポルフィロモナスジンジバリスの亜型によるものである。