JP2000083676A - 歯周病細菌ギンギバリス菌の組換え外膜蛋白質、それをコードする遺伝子及び検出用のプライマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、歯周病細菌の外膜蛋白質の特異性
に着目し、歯周病細菌の簡便で高感度な最初の実用的な
検出方法を提供する。 【解決手段】 本発明は、歯周病細菌ギンギバリス菌の
組換え外膜蛋白質に関する。また、本発明は、前記歯周
病細菌ギンギバリス菌の外膜蛋白質をコードする塩基配
列を有する核酸、前記の核酸の塩基配列の連続する１５
塩基以上からなるＰＣＲ増幅法のためのプライマー、前
記の核酸の塩基配列の連続する１４塩基以上からなる歯
周病細菌ギンギバリス菌の外膜蛋白質をコードする核酸
を検出するためのプローブに関する。さらに、本発明
は、検体中のＤＮＡを前記したプライマーを用いて増幅
し、増幅されたＤＮＡから歯周病細菌ギンギバリス菌の
外膜蛋白質をコードするＤＮＡを検出する方法に関す
る。また、本発明は、歯周病細菌ギンギバリス菌の外膜
蛋白質の全部又は一部に対して免疫応答を示す抗体に関
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、歯周病細菌ギンギ
バリス菌の組換え外膜蛋白質、それをコードする核酸、
その全部又は一部を増幅するためのプライマー、それを
検出するためのプローブ、その検出方法、及び、当該蛋
白質に対する抗体に関する。

【０００２】

【従来の技術】日本人の食生活の欧米化、高齢化に伴
い、若年層から高年齢層の広さにわたり歯周病の発症の
増加が社会間題となっている。歯周病のおもな症状は歯
肉の炎症（腫れ、出血）、歯を支える骨（歯槽骨）の吸
収や歯周組織の破壊などである。歯周病は歯周ポケット
内の歯肉緑下プラーク中のある特定のグラム陰性嫌気性
細菌が増殖し、それに対する宿王の抵抗力（免疫力）の
バランスが崩れて、発症し、進行する感染症である。現
在、歯周病は口腔局所の炎症にとどまらず、全身疾患
（肺炎、心内膜炎、敗皿症など）へと波及することが明
らかとなり、高齢者や抵抗力の落ちた患者（白血病、臓
器移植、糖尿病）の歯周病治療、口腔衛生管理が重要視
されている。

【０００３】歯周ポケット内グラム陰性嫌気性細菌の中
でも特にポルフィロモナス ギンギバリス（Porphyromo
nas gingivalis（以下、ギンギバリス菌という。））が
歯周病の発症と進行に深く関わる有力な歯周病細菌とし
て特定された。歯周炎病巣局所の細菌叢をこの歯周病細
菌ギンギバリス菌を指標にして細菌検査によって調べる
ことができれば、日常の歯科臨床において１）歯周治療
の特に必要な部位の特定、２）治療方針の決定が行え
る。さらに病巣からの歯周病関連細菌の排除（駆逐）の
良否が細菌検査により明らかになれば、３）治療効果、
メインテナンスの判定も的確に行うことができる。

【０００４】しかしながら、歯周病細菌ギンギバリス菌
が偏性嫌気性細菌であるため、歯周炎病巣における数千
ともいわれる複数の細菌種の中からギンギバリス菌を検
出、同定することは、従来の一般細菌検査方法では困難
であった。

【０００５】もし歯周ポケット内細菌の中からギンギバ
リス菌を特定し、追跡するための良い細菌特異マーカー
が得られたなら、日常の歯科臨床に応用できる歯周病細
菌検査が確立でき、さらにこれまでのところ、不明だっ
た歯周病細菌ギンギバリス菌の感染様態・伝播経路も明
らかにできる。さらには歯周病予防のためのワクチンの
開発にも応用できる。

【０００６】これまで、私共は歯周病の発症と進行に深
く関係するグラム陰性口腔内嫌気性細菌ギンギバリス菌
について研究を進めてきた。その結果、歯周病患者血清
と強く反応するギンギバリス菌に特異的な分子量５３ｋ
Ｄａと６７ｋＤａの２つの外膜蛋白を特定し（K.Kato,e
t al.,J.Gen.Microbiol.,133:1033-1043(1987) ; S.Kok
eguchi,et al.,Dentistry in Japan,27:29-34(1990) ;
H.Kurihara,et al.,Infect,& Immun.,59:4599-4605(199
1) ; S.Kokeguchi,et al.,Microbios,77:247-252(199
4)）、その遺伝子をクロー二ングし、全塩基配列を決定
した（H.Hongyo,et al.,Microbios,92:47-57(1997)(１
９９８年３月１６日発行)）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】多くの細菌感染症はそ
の病因となる細菌の検出さらにその細菌に対する抗体価
の上昇が確定診断となるので、ギンギバリス菌に特異的
な外膜蛋白は歯周病の診断に特に有用と考える。すなわ
ち、ギンギバリス菌に特異的な外膜蛋白には以下のよう
な特徴や利点が挙げられる。 １）この外膜蛋白に対する歯周病患者の血清抗体を調べ
ることで歯周病患者におけるギンギバリス菌の感染様態
を明らかにできる。 ２）この外膜蛋白を指標にして、口腔内のギンギバリス
菌を検出、同定できる。全塩基配列を決定したことで、
ＰＣＲによる高感度で、迅速なギンギバリス菌の検出、
同定も可能となった。さらに、これまで不明だった歯周
病細菌ギンギバリス菌の感染、伝播経路を解明でさる
（別紙１−４）。 ３）将来、歯周病予防のワクチン抗原の候補として有力
であろう。

【０００８】これにより、歯周病細菌ギンギバリス菌の
菌特異マーカーとして特定した菌特異的な外膜蛋白に基
づく、歯周病細菌の迅速で簡便な検出法さらには、感染
・伝播経路の解明また歯周病発症予防のための受動免疫
やワクチンの開発研究に応用できればと考えている。歯
周病細菌ギンギバリス菌の菌特異マーカーとして特定し
た外膜蛋白外膜蛋白またその遺伝子の全塩基配列さらに
は外膜蛋白遺伝子を検出するためのＰＣＲ用のプライマ
ーの塩基配列について特許を申請できないものかと 考
えている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明は、配列表の配列
番号１又は３に示されるアミノ酸配列、又は、これらの
アミノ酸の一部が欠失し、他のアミノ酸で置換され、及
び／又は他のアミノ酸が付加したアミノ酸配列を有す
る、歯周病細菌ギンギバリス菌の組換え外膜蛋白質に関
する。また、本発明は、前記歯周病細菌ギンギバリス菌
の外膜蛋白質をコードする塩基配列を有する核酸、好ま
しくは、塩基配列が配列表の配列番号２又は３で示され
る核酸に関する。本発明の核酸としてはＤＮＡが好まし
い。

【００１０】また、本発明は、前記の核酸の塩基配列の
連続する１５塩基以上からなるＰＣＲ増幅法のためのプ
ライマー、好ましくは塩基配列が配列表の配列番号５、
６、７又は８で示されるプライマーに関する。本発明
は、前記の核酸の塩基配列の連続する１４塩基以上から
なる歯周病細菌ギンギバリス菌の外膜蛋白質をコードす
る核酸を検出するためのプローブに関する。さらに、本
発明は、検体中のＤＮＡを前記したプライマーを用いて
増幅し、増幅されたＤＮＡから歯周病細菌ギンギバリス
菌の外膜蛋白質をコードするＤＮＡを検出する方法に関
する。また、本発明は、歯周病細菌ギンギバリス菌の外
膜蛋白質の全部又は一部に対して免疫応答を示す抗体に
関する。

【００１１】歯周病患者血清と強い反応を有する分子量
５３−ｋＤａと６７−ｋＤａの２種類の外膜蛋白を歯周
病細菌ギンギバリス菌ＦＤＣ３８１株とＡＴＣＣ３３２
７７株からそれぞれ特定し、単離した。これらは歯周病
細菌ギンギバリス菌を同定する上で特に有益な菌特異マ
ー力ーとしての特徴をもっている。歯周病細菌ギンギバ
リス菌は分子量５３−ｋＤａあるいは６７−ｋＤａの外
膜蛋白のどちらか一方を保有しており、外膜蛋白の種類
に基づいて２種類の菌株群に分類される。また歯周病患
者はどちらか一方の菌株群の歯周病細菌ギンギバリス菌
の感染をうけていることが明らかとなった。

【００１２】次に５３−ｋＤａと６７−ｋＤａそれぞれ
の外膜蛋白遺伝子をギンギバリス菌ＦＤＣ３８１株とＡ
ＴＣＣ３３２７７株からクローニングし、全塩基配列を
決定した。両外膜遺伝子の塩基配列の相同性を比較し、
歯周病細菌ギンギバリス菌それぞれの外膜蛋白遺伝子を
ＰＣＲにより同時に増幅し、区別できるＰＣＲプライマ
ーを設計し、合成した。

【００１３】これらの結果、本明細書に添付する配列表
に記載の配列番号１〜１６のアミノ酸配列又は塩基配列
を次に説明しておく。 配列番号１： ５３−ｋＤａの蛋白質の全アミノ酸配
列。 配列番号２： ５３−ｋＤａの蛋白質をコードする塩基
配列。 配列番号３： ６７−ｋＤａの蛋白質の全アミノ酸配
列。 配列番号４： ６７−ｋＤａの蛋白質をコードする塩基
配列。

【００１４】 配列番号５： Ｆ１プライマーの塩基配列。 配列番号６： Ｒ１プライマーの塩基配列。 配列番号７： Ｒ２プライマーの塩基配列。 配列番号８： Ｆ２プライマーの塩基配列。

【００１５】 配列番号９： ５３−ｋＤａの蛋白質について、Ｆ２プ
ライマーとＲ１プライマーを用いてＰＣＲ増幅される塩
基配列。 配列番号１０： ５３−ｋＤａの蛋白質について、Ｆ２
プライマーとＲ２プライマーを用いてＰＣＲ増幅される
塩基配列。 配列番号１１： ５３−ｋＤａの蛋白質について、Ｆ１
プライマーとＲ１プライマーを用いてＰＣＲ増幅される
塩基配列。 配列番号１２： ５３−ｋＤａの蛋白質について、Ｆ１
プライマーとＲ２プライマーを用いてＰＣＲ増幅される
塩基配列。

【００１６】 配列番号１３： ６７−ｋＤａの蛋白質について、Ｆ２
プライマーとＲ２プライマーを用いてＰＣＲ増幅される
塩基配列。 配列番号１４： ６７−ｋＤａの蛋白質について、Ｆ２
プライマーとＲ１プライマーを用いてＰＣＲ増幅される
塩基配列。 配列番号１５： ６７−ｋＤａの蛋白質について、Ｆ１
プライマーとＲ２プライマーを用いてＰＣＲ増幅される
塩基配列。 配列番号１６： ６７−ｋＤａの蛋白質について、Ｆ１
プライマーとＲ１プライマーを用いてＰＣＲ増幅される
塩基配列。

【００１７】本発明の蛋白質のクローニング法は、後述
する実施例において詳細に説明するが、通常のクローニ
ング法を適宜組み合わせて行うことができる。例えば、
ギンギバリス菌ＦＤＣ３８１株のゲノムＤＮＡを適当な
制限酵素、例えば、Ｓａｕ３ＡＩなどで切断したＤＮＡ
断片を製造する。このＤＮＡ断片を適当なクローニング
ベクター、例えば、λＧＥＭ−１１などに組み込み、ウ
サギの抗血清を用いて目的の蛋白質の発現をスクリーニ
ングすることにより、目的の蛋白質をコードしているク
ローンを得る。例えば、本発明の５３−ｋＤａ蛋白質に
ついては、組換えクローンλＭＯ１５（約１５ｋｂ）が
得られた（図１参照）。

【００１８】図１は得られたクローンλＭＯ１５（約１
５ｋｂ）の制限酵素地図であり、図中のアルファベット
は制限酵素を示し、ＡはＡｃｃＩを、ＢはＢａｍ ＨＩ
を、ＥはＥｃｏ ＲＩを、ＫはＫｐｎ Ｉを、ＰはＰｓ
ｔ Ｉを、それぞれ示している。図中の網掛け部分は、
本発明の５３−ｋＤａの蛋白質をコードしている部分を
示している。サザンハイブリダイゼーションのプローブ
としては、図中にＰｓｔ ＩからＰｓｔ Ｉまでの約
１．５ｋｂを用いた。

【００１９】サザンハイブリダイゼーションの結果を図
２の（ａ）及び（ｂ）に示す。図２の（ａ）のレーン１
はギンギバリス菌ＦＤＣ３８１株であり、レーン２はＰ
ｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ ＡＴＣＣ３
３１８５であり、レーン３はＰ．ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌ
ｉｓ ＡＴＣＣ３５４０６であり、レーン４はＰｒｅｖ
ｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ ＡＴＣＣ２５６
１１であり、レーン５はＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｌｏｅ
ｓｃｈｅｉｉ ａｔｃｃ１５９３０であり、レーン６は
Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｍｅｌａｎｉｎｏｇｅｎｉｃａ
ａｔｃｃ２５８４５である。

【００２０】図２の（ｂ）はギンギバリス菌ＦＤＣ３８
１株と同じ種についてのものであり、レーン１はＰ．ｇ
ｉｎｇｉｖａｌｉｓＦＤＣ３８１であり、レーン２は
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＳＵ６３であり、レーン３は
Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ ＡＴＣＣ３３２７７であ
り、レーン４はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＳＵＮＹ１０
２１であり、レーン５はＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓＷ８
３である。

【００２１】この結果、本発明の５３−ｋＤａの蛋白質
は、配列番号２の塩基配列の２９８番目のＡＴＧから始
まる４９８個のアミノ酸（シグナルペプチドを含む）で
あった。

【００２２】同様な方法により、ギンギバリス菌ＡＴＣ
Ｃ３３２７７株から、本発明の６７−ｋＤａの蛋白質を
コードするＤＮＡを取得することができた。この蛋白質
は配列番号４の３４１番目のＡＴＧから始まる５６３個
のアミノ酸（シグナルペプチドを含む）であった。

【００２３】本発明の蛋白質はギンギバリス菌の外膜蛋
白質としての特性をそこなわない範囲において、配列番
号１又は３に示されるアミノ酸配列の中の、１個以上の
アミノ酸を欠失させることもできるし、１個以上のアミ
ノ酸を他のアミノ酸に置換することもできるし、また、
１個以上の他のアミノ酸を付加することもできるし、さ
らに、これらの改変を組み合わせて改変することもでき
る。

【００２４】本発明の配列番号２又は４で示される本発
明の蛋白質をコードする塩基配列においても前記した改
変された蛋白質を含む本発明の蛋白質を発現できるもの
であれば、１個以上の塩基が改変されていてもよい。

【００２５】本発明の歯周病細菌ギンギバリス菌を検出
するためのＰＣＲ増幅に使用されるプライマーとして
は、配列番号２又は４に記載された塩基配列の中の連続
した１５塩基以上、好ましくは１５〜４０塩基、より好
ましくは２０塩基〜３０塩基程度を用いることができる
が、より好ましくは前方として配列番号５又は８に示さ
れる塩基配列を有するものを、後方として配列番号６又
は７に示される塩基配列を有するものを使用することが
できる。これらの好ましいプライマーは、本発明の５３
−ｋＤａ蛋白質と６７−ｋＤａ蛋白質をコードする核酸
の両者に共通する塩基配列を有しており、同時に両方の
蛋白質を検出することが可能となるものである。

【００２６】本発明のＰＣＲ増幅法は、通常の方法によ
り行うことができるが、好ましくは、配列番号５に記載
のプライマー（Ｆ１プライマー）又は配列番号８に記載
のプライマー（Ｆ２プライマー）と配列番号６に記載の
プライマー（Ｒ１プライマー）とを組み合わせてしよう
する場合には、９６℃で１分間、５０℃で３０秒、７２
℃で２分間のサイクルを２０〜５０回、好ましくは３０
〜４０回、例えば、３５回繰り返すのが好ましい。ま
た、配列番号５に記載のプライマー（Ｆ１プライマー）
又は配列番号８に記載のプライマー（Ｆ２プライマー）
と配列番号７に記載のプライマー（Ｒ２プライマー）と
を組み合わせてしようする場合には、９６℃で１分間、
５２℃で３０秒、７２℃で２分間のサイクルを２０〜５
０回、好ましくは３０〜４０回、例えば、３５回繰り返
すのが好ましい。

【００２７】本発明のＰＣＲ法で増幅された核酸を検出
するためのプローブとしては、増幅された領域の連続す
る１４塩基以上の核酸を使用することができが、５３−
ｋＤａの蛋白質と６７−ｋＤａの蛋白質の両者を同時に
検出対象とするためには、両者に共通する塩基配列が好
ましい。好ましいプローブとしては、前記のＦ２プライ
マーを用いた場合にはＦ１プライマーの塩基配列を包含
するものが挙げられる。プローブは好ましくは３０塩基
以上、より好ましくは３０塩基〜７０塩基、さらに具体
的には６４塩基程度のものが挙げられる。

【００２８】このＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲ法に
より細菌検査を行えば、歯周ポケット中の歯周病細菌ギ
ンギバリス菌を特異的に高感度かつ簡便に検出できるこ
とが判った。さらに歯周ポケット内にどちらの外膜蛋白
のタイプの歯周病細菌ギンギバリス菌が生息しているの
か、また歯周病はどちらの歯周病細菌ギンギバリス菌に
より発症、進行しているのかが判明し、さらには歯周病
の進行程度、歯周病治療効果、メインテナンスの良否の
判定も行えることが明らかになった。

【００２９】従来、歯周ポケット中の数千種ともいわれ
ている細菌群の中から偏性嫌気性細菌である歯周病細菌
を検出するのは、これまでの一般的な培養法、生化学的
性状試験では困難であった。本発明により、日常の歯科
臨床に応用できる歯周病細菌検査確立の見通しが得られ
た。さらに、より簡便で迅速な歯周病診断薬の開発につ
ながる。この検査法さらには歯周病診断薬により、これ
まで不明であった歯周病細菌の感染様態、伝播経路が解
明でき、歯周病予防も期待できる。

【００３０】検出するための標識としては公知の種々の
標識を使用することができる。プローブの標識化は必要
に応じて当業者が改変することが可能である。

【００３１】本発明の抗体は、本発明の蛋白質の全部又
は一部を用いて通常の方法により製造することができ
る。抗体は必要に応じてモノクローナル抗体にすること
もできるし、キメラ型、ヒト型抗体とすることもでき
る。

【００３２】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明す
るが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００３３】実施例１ ギンギバリス菌ＦＤＣ３８１株のゲノムＤＮＡをミヤモ
トらの方法（MiyamotoM.,et al.,Infect. Immun., 59,1
941 (1991)） により調製し、これを制限酵素Ｓａｕ３
ＡＩを用いて部分的に切断し、ＤＮＡ断片を製造した。
このＤＮＡ断片の１５〜２０ｋｂのものをアガロースゲ
ル電気泳動により選別して、λＧＥＭ−１１（プロメ
ガ、マジソン、ウィスコンシン、ＵＳＡ）に制限酵素Ｂ
ａｍ ＨＩを用いて組み込んだ。これをファージに入
れ、マルトース依存大腸菌Ｑ３５８細胞と共に、３０℃
で２０分間インキュベートし、ソフトＬ寒天を混合して
Ｌ寒天に取り、３７℃で一夜インキュベートした。得ら
れたファージのプラークをアビコらの方法（Abiko Y.,
et al.,Adv. Dent. Res.,2,310 (1988)）により、５３
−ｋＤａ蛋白質を発現するものをスクリーニングした。
組換えクローンλＭＯ１５（約１５ｋｂ）が得られた
（図１参照）。

【００３４】選別されたファージのクローンを、プラス
ミドベクターｐＨＳＧ３９９、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１
９（タカラ酒造）にサブクローンした。宿主細胞として
大腸菌ＸＬ１−ブルー（ストラタジーン、ラホーヤ、カ
リホルニア、ＵＳＡ）を用いた。ＤＮＡの配列を決める
ために、Ｔａｑダイデオキシターミネーターサイクルセ
キュエンシングキット（アプラーイドバイオシステム
ズ、ホスターシティー、カリフォルニア，ＵＳＡ）及び
３７３Ａ自動ＤＮＡシーキュエンサー（アプラーイドバ
イオシステムズ）を用いて、サンガーらのジデオキシチ
ェインターミネーション法を行った。５３−ｋＤａ蛋白
質のアミノ酸配列及び塩基配列を図４に示す。枠で囲わ
れているアミノ酸配列は、以前に報告された（Kokeguch
i S., et al., Microbios.,77,247-252 (1994) ）Ｎ−
末端アミノ酸配列と一致する部分であり、４個の枠で囲
われた塩基配列は可能性のある開始コドンを示してい
る。

【００３５】実施例２ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析及びウ
エスタンブロット） ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、大腸菌細胞と５３−ｋＤａ蛋白を
用いてラエムリらの方法によりおこなった。結果を図３
の（ａ）に示す。レーン１はギンギバリス菌ＦＤＣ３８
１から精製した５３−ｋＤａ蛋白、レーン２はｐＭＯ１
５を含む大腸菌ＸＬ１−ブルー、レーン３はｐＵＣ１９
を含む大腸菌ＸＬ１−ブルーである。ウエスタンブロテ
ィングは、ウサギ抗血清等を用いて苔口らの方法（Koke
guchi S., Dent. Jpn., 27,29-34 (1990) ）によって行
った。結果を図３の（ｂ）及び（ｃ）に示す。（ｂ）は
ウサギ抗血清を使用したものであり、（ｃ）は患者の血
清を使用したものである。

【００３６】実施例３ （サザンブロットハイブリダイ
ゼーション） サザンブロットハイブリダイゼーションは、サザン（１
９７５年）の方法により行った。各種のゲノムｄｎａは
ミヤモトらの方法により調製し、Ｐｓｔ Ｉで消化した
ものを用いた。ＤＮＡプローブは、ｐＭＯ１５の１．５
ｋｂのＰｓｔ Ｉフラグメントから調製し、α−³²Ｐで
標識した。ハイブリダイゼーションは、６×ＳＳＣで行
い、６５℃１６時間のハイブリダイズ後、室温で５分間
２×ＳＳＣ−０．５％ＳＤＳで２度洗浄し、３７℃で１
０分間置いた。６５℃で３０分間０．２×ＳＳＣ−０．
１％ＳＤＳで２度洗浄して、乾燥して、−７０℃で自動
ラジオグラフィーにかけた。結果を図２に示す。

【００３７】実施例４ （検体中のＤＮＡの増幅と検
出） （１）歯周病病巣からのサンプリング 歯周病病巣の歯周ポケット内に３本の滅菌ペーパーポイ
ント（＃４５，ジッペラー社、ドイツ）を挿入し、３０
秒から１分間静置する。歯周ポケット内の歯肉縁下プラ
ークを被験試料として採取する。ペーパーポイントを歯
周ポケットから取り出し、１ｍｌの滅菌ＰＢＳ（−）溶
液の入ったチューブ内に投入した。ボルテックスミキサ
ーで３０秒から１分間よく攪拌し、菌懸濁液とした。

【００３８】（２）ＤＮＡの抽出 菌懸濁液を１０，０００〜１２，０００ｒｐｍで遠心沈
殿し、上清を捨てる。菌沈殿物にインスタジーン（バイ
オラド社）液２００μｌを加え、５６℃、３０秒加熱す
る。１０秒、ボルテックスでよく攪拌後、１００℃（沸
騰水浴中）で８分加熱する。１０秒、ボルテックスでよ
く攪拌後、試料液を１０，０００〜１２，０００ｒｐｍ
で、２、３分遠心沈殿する。

【００３９】（３）上清の２０μｌ（あるいは適量、希
釈液にして）をＤＮＡのテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔ
ｅ）として、５０μｌのＰＣＲ系に加え、ＰＣＲ反応を
行う。

【００４０】（４）ＰＣＲ反応はパーキンエルマー社の
アンプリタック（ＡｍｐｌｉＴａｑ）、ベーリンガーハ
イム社のハイファイタック（ＨｉＦｉＴａｑ）またはタ
カラ社のタカラタック（Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ）で行
う。以下に、５０μｌのＰＣＲ系の反応組成をあげる。

【００４１】 抽出ＤＮＡテンプレート試料 ２０μｌまで ２．５ｍＭ ｄＮＴＰ ４μｌまで タック（Ｔａｑ）酵素 ０．２５〜０．５μｌ ＰＣＲ用バッファー ５μｌ （１０倍濃度、最終濃度１．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂含有） フォワード プライマー（Ｆｏｗａｒｄ Ｐｒｉｍｅｒ） ３μｌ リバース プライマー（Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｐｒｉｍｅｒ） ３μｌ 水で５０μｌの反応溶液とする。

【００４２】 （５）ＰＣＲ反応 変性反応 ９４〜９６℃ ２分 １サイクル アンプリタック（ＡｍｐｌｉＴａｑ）は９分 増幅反応 ９４〜９６℃ １分 ５０℃ ３０秒 ３５サイクル ７２℃ ２分 伸展反応 ７２℃ ７分 １サイクル

【００４３】（６）アガロース電気泳動を行い、臭化エ
チジウム溶液にて染色後増幅バンドを確認した。

【００４４】

【発明の効果】本発明は、歯周病細菌の外膜蛋白質の特
異性に着目し、歯周病細菌の簡便で高感度な最初の実用
的な検出方法を提供するものである。従来、歯周病細菌
についての有力なまた実用可能な簡便で高感度な細菌検
査法さらには診断薬が無かったことなどから、本発明の
歯周病細菌の検出方法は画期的な方法を提供するもので
ある。特に口腔衛生意識が高く、歯周病の研究において
先進国である欧米の国々においても歯周病の細菌検査法
や診断薬の登場が待望されており、本発明の実用的な検
出方法におおきな期待が寄せられている。

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Japan Science And Technology Corporation <120> Recombinaut outer membrane proteins of P.gingivalis,the genes encoding them and a primers for detection them <130> PA907029 <160> 16 <210> 1 <211> 499 <212> PRT <213> Prophyromonas gingivalis <400> 1 Met Lys Leu Asn Lys Met Phe Leu Val Gly Ala Leu Leu Ser Leu 15 Gly Phe Ala Ser Cys Ser Lys Glu Gly Asn Gly Pro Ala Pro Asp 30 Ser Ser Ser Thr Ala Asp Thr His Met Ser Val Ser Met Ser Leu 45 Pro Gln His Asn Arg Ala Gly Asp Asn Asp Tyr Asn Pro Ile Gly 60 Glu Tyr Gly Gly Val Asp Lys Ile Asn Asp Leu Thr Val Tyr Val 75 Val Gly Asp Gly Lys Ile Asp Val Arg Lys Leu Ser Thr Ala Asp 90 Leu Gln Val Asn Gln Gly Ala Ser Thr Thr Ser Ile Val Thr Ala 105 Pro Phe Gln Val Lys Ser Gly Glu Lys Thr Val Tyr Ala Ile Val 120 Asn Ile Thr Pro Lys Val Glu Ala Ala Leu Asn Ala Ala Thr Asn 135 Ala Ala Asp Leu Lys Val Ala Tyr Glu Ala Ala Tyr Ala Ala Phe 150 Ser Asp Ala Gly Ser Glu Ile Ala Thr Leu Val Asn Asn Gln Asp 165 Gln Met Ile Met Ser Gly Lys Pro Val Val Gln Thr Ile Leu Ala 180 Asn Val Ser Ala Ala Asn Ala Ser Val Gln Asn Lys Val Pro Ile 195 Ile Val Lys Arg Ala Ala Ile Arg Ala Ser Met Thr Ile Thr Gln 210 Gln Pro Val Asn Gly Ala Tyr Glu Ile Lys Ala Leu Arg Pro Gly 225 Asn Val Glu Val Gly Ile Ala Thr Val Ser Asp Leu Lys Trp Ala 240 Val Ala Gln Tyr Glu Lys Lys Tyr Tyr Leu Gln Gln Lys Asp Asn 255 Ala Leu Ser Pro Ala Ala Ser Phe Val Pro Ala Ser Thr Asn Asp 270 Tyr Asn Gly Ala Asn Gly Ala Met Lys His Tyr Asp Tyr Ser Gln 285 Leu Ala Asn Arg Ile Thr Val His Gln Leu Asn Ala Pro Tyr Ser 300 Val Thr Asp Val Pro Asn Val Ala Tyr Lys Tyr Val Ser Glu Thr 315 Thr His Ala Asp Asn Asp Tyr Arg Lys Gly Asn Thr Thr Tyr Ile 330 Leu Val Lys Gly Lys Leu Lys Pro Val Ala Ala Met Trp Ala Asp 345 Gly Glu Gln Ala Ala Tyr Gln Glu Gly Gly Asp Leu Phe Leu Gly 360 Leu Val Thr Gly Lys Phe Tyr Ala Asn Glu Ala Asn Ala Asn Ala 375 Ala Asn Pro Ala Ser Gly Gly Ala Gly Asn Pro Arg Val Val Thr 390 Tyr Lys Ala Ala Ala Val Tyr Tyr Tyr Ala Trp Leu Asn Pro Asn 405 Thr Leu Asp Pro Thr Thr Trp Thr Met Ser Pro Ala Arg Arg Asn 420 Asn Ile Tyr Asn Val Asn Ile Ser Lys Phe Arg Asn Ile Gly Leu 435 Ser Gly Asn Pro Phe Val Pro Thr Asp Pro Asp Pro Asn Asn Pro 450 Asp Thr Pro Asp Asn Pro Asp Thr Pro Asp Pro Glu Asp Pro Asp 465 Thr Pro Asn Pro Glu Glu Pro Leu Pro Val Gln Lys Thr Tyr Met 480 Val Val Asp Val Thr Val Thr Pro Trp Thr Leu His Asn Tyr Asp 495 Ile Glu Phe *** 499 <210> 2 <211> 2345 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 2 gtcgagcggg aggtcttatg tcggccatct tgtcgatata ttctgaacac tctatgttgt 60 gtctttgtta agtaagctaa tcaccttata atatcagtac aagctgttca ggtgaagttc 120 atgcagaata gtgtgcaaga gtatagaatt gtagagatta tgggttcgga tatgtgataa 180 cgaggattca tcgttaagtt tatccggttt tatagtcttg agcgttttgt gttttatagt 240 ctttctttcg acgtttttag aatcaattta atattaatcc ttttaaacat ttggcttatg 300 aagttaaaca aaatgttttt ggtcggagca ttgctctcat tgggctttgc ttcttgtagt 360 aaagagggca atgggcctgc tcccgatagc tcttctacag cagacactca catgtctgtt 420 tctatgtcgt taccgcagca caatcgtgct ggcgacaacg actacaatcc cataggtgag 480 tatggtggtg tagacaaaat caacgacttg actgtttatg ttgtcggtga tggcaagatt 540 gatgtgagaa aactttctac agctgatctg caagttaatc agggagcctc tactacttct 600 attgtgacag ctcctttcca ggtaaagagt ggtgaaaaga ctgtctatgc cattgtcaat 660 atcactccta aggtagaggc agctcttaat gcagcgacca atgctgctga cctaaaggtt 720 gcatatgaag cagcttacgc tgccttttct gatgccggca gtgagattgc tacgttggta 780 aataaccagg atcagatgat tatgtctggt aagcctgtgg tgcagactat tttggctaat 840 gtgagtgctg ccaatgcttc tgtgcagaat aaggttccca taatcgttaa acgtgctgca 900 atacgtgcat caatgactat tactcagcaa cccgtgaatg gtgcttatga aatcaaggcg 960 cttcgtccgg gtaatgtaga ggttggcatc gctacggttt ctgatctgaa gtgggctgta 1020 gctcagtacg aaaagaagta ctacctccag cagaaagaca atgctctctc accagctgct 1080 tccttcgtgc ctgcaagtac caacgactac aatggtgcta atggtgctat gaagcactat 1140 gactactccc agttggccaa tagaatcact gttcaccagc tgaatgctcc ttattctgtg 1200 acagatgtcc ctaacgttgc ttataagtat gtttctgaga ccactcacgc tgacaatgat 1260 tacagaaaag gtaatacgac ttatatcctc gtaaagggta agctgaagcc tgtcgctgcc 1320 atgtgggctg atggagagca agctgcatat caagagggtg gcgacctctt cttgggtctt 1380 gtgaccggta agttctatgc aaatgaagcc aatgcaaatg cagctaaccc tgcttctggc 1440 ggtgccggta accctcgagt agtgacgtac aaagctgcag ctgtttatta ctatgcttgg 1500 ttgaatccga acacgttgga tcctacgaca tggactatgt ctcctgcacg tcgtaacaat 1560 atctacaacg tgaatatctc taagttccgc aacatcggtc tttctggtaa tccattcgtt 1620 cctacggatc ctgatccgaa caacccggat actcctgata atcctgatac tccggacccc 1680 gaagatcctg atactcccaa tcctgaagag ccgctgccgg ttcagaagac atacatggtt 1740 gtggacgtga cagtgacacc ttggacgttg cataactatg atatcgaatt ctaagagata 1800 gaggtgtttt ttacagaaaa gggagggatt tcacctgatg gttctcttca aggggggtaa 1860 cccctccctt ttcttttttg ttctaataac tattataata gtaagcatat ggatattcgc 1920 aaactgtttg ttgctttgcc ggtggtgctc gccctgttgg gaagtttagc ttcatgtgat 1980 aagatgattt atgacaatta cgatgattgt cctcgaggag tatatgtcaa attctattct 2040 cagacggaat gtgctcaaaa cccttcttat ccggaagaga taggtcgctt gaatgtctat 2100 gctttcgata agaacgatat tctcccgcag tgctaatctg ttcgaaaacg tccgtttgtc 2160 tgaaacgaac gaatggctcg tcccattaga aaaaaatgac ttgtatacga ttttggcttg 2220 ggggaatatc ggtgatcatt ataatatagg cgagattaaa attggcgaaa cgaccaagca 2280 gcaagttttg ttgcgcttga aacaagaagg aaagtgggcg accaatatag atggggccac 2340 cctcg 2345 <210> 3 <211> 563 <212> PRT <213> Prophyromonas gingivalis <400> 3 Met Lys Leu Asn Lys Met Phe Leu Val Gly Ala Leu Leu Ser Leu 15 Gly Phe Ala Ser Cys Ser Lys Glu Gly Asn Gly Pro Asp Pro Asp 30 Asn Ala Ala Lys Ser Tyr Met Ser Met Thr Leu Ser Met Pro Met 45 Gly Ser Ala Arg Ala Gly Asp Gly Gln Asp Gln Ala Asn Pro Asp 60 Tyr His Tyr Val Gly Glu Trp Ala Gly Lys Asp Lys Ile Glu Lys 75 Val Ser Ile Tyr Met Val Pro Gln Gly Gly Pro Gly Leu Val Glu 90 Ser Ala Glu Asp Leu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Glu Asn Pro Thr 105 Ile Asp Pro Ala Thr His Asn Ala Ile Leu Lys Pro Lys Lys Gly 120 Ile Lys Val Asn Ser Ala Val Gly Lys Thr Val Lys Val Tyr Val 135 Val Leu Asn Asp Ile Ala Gly Lys Ala Lys Ala Leu Leu Ala Asn 150 Val Asn Ala Ala Asp Phe Asp Ala Lys Phe Lys Lys Ile Ile Glu 165 Leu Ser Thr Gln Ala Gln Ala Leu Gly Thr Val Ala Asp Gly Pro 180 Asn Pro Ala Thr Ala Ala Gly Lys Ile Ala Lys Lys Asn Gly Thr 195 Thr Asp Glu Thr Ile Met Met Thr Cys Leu Gln Pro Ser Asp Ala 210 Leu Thr Ile Glu Ala Ala Val Ser Glu Ala Asn Ala Ile Ala Gly 225 Ile Lys Asn Gln Ala Lys Val Thr Val Glu Arg Ser Val Ala Arg 240 Ala Met Val Ser Thr Lys Ala Gln Ser Tyr Glu Ile Lys Ala Thr 255 Thr Gln Ile Gly Glu Ile Ala Ala Gly Ser Val Leu Ala Thr Ile 270 Thr Asp Ile Arg Trp Val Val Ala Gln Gly Glu Arg Arg Gln Tyr 285 Leu Ser Lys Lys Arg Gly Thr Val Pro Glu Asn Thr Trp Val Thr 300 Pro Gly Ser Gly Phe Val Pro Thr Ser Ser Thr Phe Tyr Thr Asn 315 Ala Thr Glu Tyr Tyr Asp Tyr Ala Gly Leu Trp Glu Asp His Asn 330 Thr Asn Glu Ala Val Ile Ser Gly Thr Gln Val Pro Thr Leu Ala 345 Asp Tyr Gln Leu Gln Asp Val Thr Gly Glu Leu Ala Asn Ala Leu 360 Ser Gly Lys Phe Leu Leu Pro Asn Thr His Lys Ser Gly Ala Asn 375 Ala Ala Ser Ser Asp Tyr Lys Arg Gly Asn Thr Ala Tyr Val Leu 390 Val Arg Ala Lys Phe Thr Pro Lys Lys Glu Ala Phe Ile Asp Arg 405 Gly Lys Thr Tyr Ser Asp Asn Thr Ala Val Pro Glu Tyr Val Ala 420 Gly Glu Asp Phe Phe Val Gly Glu Asn Gly Gln Phe Tyr Val Ser 435 Met Lys Ser Val Thr Asp Pro Lys Val Gly Gly Val Ala Gly Met 450 Lys Ala His Lys Tyr Val Lys Gly Lys Val Leu Tyr Tyr Ala Trp 465 Leu Asn Pro Ser Thr Thr Ser Pro Asp Ser Trp Trp Asn Ser Pro 480 Val Val Arg Asn Asn Ile Tyr His Ile His Ile Lys Ser Ile Lys 495 Lys Leu Gly Phe Asn Trp Asn Pro Leu Val Pro Asp Pro Asp Pro 510 Ser Asn Pro Glu Asn Pro Asn Asn Pro Asp Pro Asn Pro Asp Glu 525 Pro Gly Thr Pro Val Pro Thr Asp Pro Glu Asn Pro Leu Pro Asp 540 Gln Asp Thr Phe Met Ser Val Glu Val Thr Val Leu Pro Trp Lys 555 Val His Ser Tyr Glu Val Asp Leu *** 563 <210> 4 <211> 2223 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 4 ttgttagtgc gttgttttag tctcgtgagt cgagcgggag gtcttatgtc gaccatcttg 60 tcgatatatt ctgaacactc tatgtcgtgt ctttgttaag taaactgatc accttataat 120 atcagtacaa gctgttcagg tgaagttcat gcagaatagt gtgcaagagt atagaattgt 180 agagattatg ggttcggata tgtgataacg aggattcatc gttaagttta tccggtttta 240 tagtcttgag cgttttgtgt tttatagtct ttctttcgac gtttttagaa tcaatttaat 300 attaatcctt ttaaacattt ggcttatgaa gttaaacaaa atgtttttgg tcggagcatt 360 gctctcattg ggctttgctt cttgtagtaa agagggcaat ggccccgatc cggacaatgc 420 ggcgaagtcg tatatgtcta tgacgttgtc catgcctatg ggaagtgctc gtgcgggtga 480 cggacaggat caagctaacc ctgactacca ttatgtagga gagtgggcag gaaaagacaa 540 aattgagaaa gtgagcatct acatggtgcc tcagggtggc cctgggcttg tggagagtgc 600 tgaagatctt gattttggca cttattatga aaatcctact atagatcctg caacccacaa 660 tgccattttg aaaccgaaaa aaggtatcaa ggttaattct gctgtcggca agacggttaa 720 agtatatgtg gtgctcaatg acatcgccgg caaggcaaaa gcccttttgg caaatgttaa 780 tgcagcagac tttgatgcta aattcaaaaa gataatcgaa ctgtctactc aggctcaggc 840 tttaggtacg gtagccgatg gcccgaatcc tgctacagcg gctggaaaga ttgccaaaaa 900 gaatggtact actgatgaga caatcatgat gacctgtttg cagccttctg atgctttgac 960 tatcgaagct gctgtatccg aggccaatgc tatcgcaggg attaagaatc aggccaaggt 1020 tacggtggag cgttctgtag cacgtgcgat ggtttcaacg aaagcccaga gttatgaaat 1080 taaagccact actcaaattg gagaaattgc cgcaggttct gttttggcta ccattacgga 1140 tatcagatgg gttgttgctc aaggagaacg tcgccaatac ctaagcaaga aaagaggaac 1200 tgttccagaa aatacttggg ttactccggg ttctggtttc gttcctacca gcagcacttt 1260 ctatacaaat gctaccgagt attatgatta tgccggtctg tgggaagatc ataatacaaa 1320 tgaggccgta atcagtggaa ctcaagtgcc gactttggct gattatcagc ttcaggacgt 1380 gactggcgaa ttggcaaatg ctctttcagg gaaattcctg ctgcctaata cccataagtc 1440 aggtgctaat gctgcctcgt cagactataa gagaggtaat actgcctatg tattggttcg 1500 tgcgaagttt actcccaaga aagaagcctt tatcgataga ggtaaaactt attcagataa 1560 tactgcagtt cctgaatatg tagcaggtga agatttcttc gttggtgaga atggccagtt 1620 ctatgtgtct atgaaatccg ttacagaccc caaggtaggt ggtgtagctg gtatgaaggc 1680 acacaaatat gtgaaaggca aagtactgta ctatgcttgg ttgaatccca gtactacttc 1740 tcccgattca tggtggaatt cccctgttgt gcgcaacaat atctaccata tccacatcaa 1800 gagcatcaag aagttgggct tcaactggaa tcctttggtg ccggatccgg atcctagcaa 1860 cccggaaaat ccgaataacc ctgacccgaa tccggatgag ccgggtactc ccgttcctac 1920 agatccggag aaccccttgc ctgatcagga tacgttcatg tcggttgagg ttacagtttt 1980 gccttggaaa gttcattcct atgaggttga tctctaatta gctattgtaa aattttcttt 2040 ttgagggtgg gatttcggtt cccaccgttc tcccaccctc tatatttttt aaaacaatga 2100 acaaacggaa gcatatggat attcgcagac ttattatttc tttgccggca ataatggccc 2160 tgtggggtgg tttggcttca tgtgataaga tgatttatga caattacgat gattgtcctc 2220 gag 2223 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <221> primer bind <223> PCR primer <400> 5 catttggctt atgaagttaa aca 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <221> primer bind <223> PCR primer <400> 6 ggattcaacc aagcatagta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <221> primer bind <223> PCR primer <400> 7 ctcgaggaca atcatcgtaa 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <221> primer bind <223> PCR primer <400> 8 gtcgagcggg aggtcttatg tc 22 <210> 9 <211> 1508 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 9 gtcgagcggg aggtcttatg tcggccatct tgtcgatata ttctgaacac tctatgttgt 60 gtctttgtta agtaagctaa tcaccttata atatcagtac aagctgttca ggtgaagttc 120 atgcagaata gtgtgcaaga gtatagaatt gtagagatta tgggttcgga tatgtgataa 180 cgaggattca tcgttaagtt tatccggttt tatagtcttg agcgttttgt gttttatagt 240 ctttctttcg acgtttttag aatcaattta atattaatcc ttttaaacat ttggcttatg 300 aagttaaaca aaatgttttt ggtcggagca ttgctctcat tgggctttgc ttcttgtagt 360 aaagagggca atgggcctgc tcccgatagc tcttctacag cagacactca catgtctgtt 420 tctatgtcgt taccgcagca caatcgtgct ggcgacaacg actacaatcc cataggtgag 480 tatggtggtg tagacaaaat caacgacttg actgtttatg ttgtcggtga tggcaagatt 540 gatgtgagaa aactttctac agctgatctg caagttaatc agggagcctc tactacttct 600 attgtgacag ctcctttcca ggtaaagagt ggtgaaaaga ctgtctatgc cattgtcaat 660 atcactccta aggtagaggc agctcttaat gcagcgacca atgctgctga cctaaaggtt 720 gcatatgaag cagcttacgc tgccttttct gatgccggca gtgagattgc tacgttggta 780 aataaccagg atcagatgat tatgtctggt aagcctgtgg tgcagactat tttggctaat 840 gtgagtgctg ccaatgcttc tgtgcagaat aaggttccca taatcgttaa acgtgctgca 900 atacgtgcat caatgactat tactcagcaa cccgtgaatg gtgcttatga aatcaaggcg 960 cttcgtccgg gtaatgtaga ggttggcatc gctacggttt ctgatctgaa gtgggctgta 1020 gctcagtacg aaaagaagta ctacctccag cagaaagaca atgctctctc accagctgct 1080 tccttcgtgc ctgcaagtac caacgactac aatggtgcta atggtgctat gaagcactat 1140 gactactccc agttggccaa tagaatcact gttcaccagc tgaatgctcc ttattctgtg 1200 acagatgtcc ctaacgttgc ttataagtat gtttctgaga ccactcacgc tgacaatgat 1260 tacagaaaag gtaatacgac ttatatcctc gtaaagggta agctgaagcc tgtcgctgcc 1320 atgtgggctg atggagagca agctgcatat caagagggtg gcgacctctt cttgggtctt 1380 gtgaccggta agttctatgc aaatgaagcc aatgcaaatg cagctaaccc tgcttctggc 1440 ggtgccggta accctcgagt agtgacgtac aaagctgcag ctgtttatta ctatgcttgg 1500 ttgaatcc 1508 <210> 10 <211> 2017 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 10 gtcgagcggg aggtcttatg tcggccatct tgtcgatata ttctgaacac tctatgttgt 60 gtctttgtta agtaagctaa tcaccttata atatcagtac aagctgttca ggtgaagttc 120 atgcagaata gtgtgcaaga gtatagaatt gtagagatta tgggttcgga tatgtgataa 180 cgaggattca tcgttaagtt tatccggttt tatagtcttg agcgttttgt gttttatagt 240 ctttctttcg acgtttttag aatcaattta atattaatcc ttttaaacat ttggcttatg 300 aagttaaaca aaatgttttt ggtcggagca ttgctctcat tgggctttgc ttcttgtagt 360 aaagagggca atgggcctgc tcccgatagc tcttctacag cagacactca catgtctgtt 420 tctatgtcgt taccgcagca caatcgtgct ggcgacaacg actacaatcc cataggtgag 480 tatggtggtg tagacaaaat caacgacttg actgtttatg ttgtcggtga tggcaagatt 540 gatgtgagaa aactttctac agctgatctg caagttaatc agggagcctc tactacttct 600 attgtgacag ctcctttcca ggtaaagagt ggtgaaaaga ctgtctatgc cattgtcaat 660 atcactccta aggtagaggc agctcttaat gcagcgacca atgctgctga cctaaaggtt 720 gcatatgaag cagcttacgc tgccttttct gatgccggca gtgagattgc tacgttggta 780 aataaccagg atcagatgat tatgtctggt aagcctgtgg tgcagactat tttggctaat 840 gtgagtgctg ccaatgcttc tgtgcagaat aaggttccca taatcgttaa acgtgctgca 900 atacgtgcat caatgactat tactcagcaa cccgtgaatg gtgcttatga aatcaaggcg 960 cttcgtccgg gtaatgtaga ggttggcatc gctacggttt ctgatctgaa gtgggctgta 1020 gctcagtacg aaaagaagta ctacctccag cagaaagaca atgctctctc accagctgct 1080 tccttcgtgc ctgcaagtac caacgactac aatggtgcta atggtgctat gaagcactat 1140 gactactccc agttggccaa tagaatcact gttcaccagc tgaatgctcc ttattctgtg 1200 acagatgtcc ctaacgttgc ttataagtat gtttctgaga ccactcacgc tgacaatgat 1260 tacagaaaag gtaatacgac ttatatcctc gtaaagggta agctgaagcc tgtcgctgcc 1320 atgtgggctg atggagagca agctgcatat caagagggtg gcgacctctt cttgggtctt 1380 gtgaccggta agttctatgc aaatgaagcc aatgcaaatg cagctaaccc tgcttctggc 1440 ggtgccggta accctcgagt agtgacgtac aaagctgcag ctgtttatta ctatgcttgg 1500 ttgaatccga acacgttgga tcctacgaca tggactatgt ctcctgcacg tcgtaacaat 1560 atctacaacg tgaatatctc taagttccgc aacatcggtc tttctggtaa tccattcgtt 1620 cctacggatc ctgatccgaa caacccggat actcctgata atcctgatac tccggacccc 1680 gaagatcctg atactcccaa tcctgaagag ccgctgccgg ttcagaagac atacatggtt 1740 gtggacgtga cagtgacacc ttggacgttg cataactatg atatcgaatt ctaagagata 1800 gaggtgtttt ttacagaaaa gggagggatt tcacctgatg gttctcttca aggggggtaa 1860 cccctccctt ttcttttttg ttctaataac tattataata gtaagcatat ggatattcgc 1920 aaactgtttg ttgctttgcc ggtggtgctc gccctgttgg gaagtttagc ttcatgtgat 1980 aagatgattt atgacaatta cgatgattgt cctcgag 2017 <210> 11 <211> 1221 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 11 catttggctt atgaagttaa acaaaatgtt tttggtcgga gcattgctct cattgggctt 60 tgcttcttgt agtaaagagg gcaatgggcc tgctcccgat agctcttcta cagcagacac 120 tcacatgtct gtttctatgt cgttaccgca gcacaatcgt gctggcgaca acgactacaa 180 tcccataggt gagtatggtg gtgtagacaa aatcaacgac ttgactgttt atgttgtcgg 240 tgatggcaag attgatgtga gaaaactttc tacagctgat ctgcaagtta atcagggagc 300 ctctactact tctattgtga cagctccttt ccaggtaaag agtggtgaaa agactgtcta 360 tgccattgtc aatatcactc ctaaggtaga ggcagctctt aatgcagcga ccaatgctgc 420 tgacctaaag gttgcatatg aagcagctta cgctgccttt tctgatgccg gcagtgagat 480 tgctacgttg gtaaataacc aggatcagat gattatgtct ggtaagcctg tggtgcagac 540 tattttggct aatgtgagtg ctgccaatgc ttctgtgcag aataaggttc ccataatcgt 600 taaacgtgct gcaatacgtg catcaatgac tattactcag caacccgtga atggtgctta 660 tgaaatcaag gcgcttcgtc cgggtaatgt agaggttggc atcgctacgg tttctgatct 720 gaagtgggct gtagctcagt acgaaaagaa gtactacctc cagcagaaag acaatgctct 780 ctcaccagct gcttccttcg tgcctgcaag taccaacgac tacaatggtg ctaatggtgc 840 tatgaagcac tatgactact cccagttggc caatagaatc actgttcacc agctgaatgc 900 tccttattct gtgacagatg tccctaacgt tgcttataag tatgtttctg agaccactca 960 cgctgacaat gattacagaa aaggtaatac gacttatatc ctcgtaaagg gtaagctgaa 1020 gcctgtcgct gccatgtggg ctgatggaga gcaagctgca tatcaagagg gtggcgacct 1080 cttcttgggt cttgtgaccg gtaagttcta tgcaaatgaa gccaatgcaa atgcagctaa 1140 ccctgcttct ggcggtgccg gtaaccctcg agtagtgacg tacaaagctg cagctgttta 1200 ttactatgct tggttgaatc c 1221 <210> 12 <211> 1730 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 12 catttggctt atgaagttaa acaaaatgtt tttggtcgga gcattgctct cattgggctt 60 tgcttcttgt agtaaagagg gcaatgggcc tgctcccgat agctcttcta cagcagacac 120 tcacatgtct gtttctatgt cgttaccgca gcacaatcgt gctggcgaca acgactacaa 180 tcccataggt gagtatggtg gtgtagacaa aatcaacgac ttgactgttt atgttgtcgg 240 tgatggcaag attgatgtga gaaaactttc tacagctgat ctgcaagtta atcagggagc 300 ctctactact tctattgtga cagctccttt ccaggtaaag agtggtgaaa agactgtcta 360 tgccattgtc aatatcactc ctaaggtaga ggcagctctt aatgcagcga ccaatgctgc 420 tgacctaaag gttgcatatg aagcagctta cgctgccttt tctgatgccg gcagtgagat 480 tgctacgttg gtaaataacc aggatcagat gattatgtct ggtaagcctg tggtgcagac 540 tattttggct aatgtgagtg ctgccaatgc ttctgtgcag aataaggttc ccataatcgt 600 taaacgtgct gcaatacgtg catcaatgac tattactcag caacccgtga atggtgctta 660 tgaaatcaag gcgcttcgtc cgggtaatgt agaggttggc atcgctacgg tttctgatct 720 gaagtgggct gtagctcagt acgaaaagaa gtactacctc cagcagaaag acaatgctct 780 ctcaccagct gcttccttcg tgcctgcaag taccaacgac tacaatggtg ctaatggtgc 840 tatgaagcac tatgactact cccagttggc caatagaatc actgttcacc agctgaatgc 900 tccttattct gtgacagatg tccctaacgt tgcttataag tatgtttctg agaccactca 960 cgctgacaat gattacagaa aaggtaatac gacttatatc ctcgtaaagg gtaagctgaa 1020 gcctgtcgct gccatgtggg ctgatggaga gcaagctgca tatcaagagg gtggcgacct 1080 cttcttgggt cttgtgaccg gtaagttcta tgcaaatgaa gccaatgcaa atgcagctaa 1140 ccctgcttct ggcggtgccg gtaaccctcg agtagtgacg tacaaagctg cagctgttta 1200 ttactatgct tggttgaatc cgaacacgtt ggatcctacg acatggacta tgtctcctgc 1260 acgtcgtaac aatatctaca acgtgaatat ctctaagttc cgcaacatcg gtctttctgg 1320 taatccattc gttcctacgg atcctgatcc gaacaacccg gatactcctg ataatcctga 1380 tactccggac cccgaagatc ctgatactcc caatcctgaa gagccgctgc cggttcagaa 1440 gacatacatg gttgtggacg tgacagtgac accttggacg ttgcataact atgatatcga 1500 attctaagag atagaggtgt tttttacaga aaagggaggg atttcacctg atggttctct 1560 tcaagggggg taacccctcc cttttctttt ttgttctaat aactattata atagtaagca 1620 tatggatatt cgcaaactgt ttgttgcttt gccggtggtg ctcgccctgt tgggaagttt 1680 agcttcatgt gataagatga tttatgacaa ttacgatgat tgtcctcgag 1730 <210> 13 <211> 2195 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 13 gtcgagcggg aggtcttatg tcgaccatct tgtcgatata ttctgaacac tctatgtcgt 60 gtctttgtta agtaaactga tcaccttata atatcagtac aagctgttca ggtgaagttc 120 atgcagaata gtgtgcaaga gtatagaatt gtagagatta tgggttcgga tatgtgataa 180 cgaggattca tcgttaagtt tatccggttt tatagtcttg agcgttttgt gttttatagt 240 ctttctttcg acgtttttag aatcaattta atattaatcc ttttaaacat ttggcttatg 300 aagttaaaca aaatgttttt ggtcggagca ttgctctcat tgggctttgc ttcttgtagt 360 aaagagggca atggccccga tccggacaat gcggcgaagt cgtatatgtc tatgacgttg 420 tccatgccta tgggaagtgc tcgtgcgggt gacggacagg atcaagctaa ccctgactac 480 cattatgtag gagagtgggc aggaaaagac aaaattgaga aagtgagcat ctacatggtg 540 cctcagggtg gccctgggct tgtggagagt gctgaagatc ttgattttgg cacttattat 600 gaaaatccta ctatagatcc tgcaacccac aatgccattt tgaaaccgaa aaaaggtatc 660 aaggttaatt ctgctgtcgg caagacggtt aaagtatatg tggtgctcaa tgacatcgcc 720 ggcaaggcaa aagccctttt ggcaaatgtt aatgcagcag actttgatgc taaattcaaa 780 aagataatcg aactgtctac tcaggctcag gctttaggta cggtagccga tggcccgaat 840 cctgctacag cggctggaaa gattgccaaa aagaatggta ctactgatga gacaatcatg 900 atgacctgtt tgcagccttc tgatgctttg actatcgaag ctgctgtatc cgaggccaat 960 gctatcgcag ggattaagaa tcaggccaag gttacggtgg agcgttctgt agcacgtgcg 1020 atggtttcaa cgaaagccca gagttatgaa attaaagcca ctactcaaat tggagaaatt 1080 gccgcaggtt ctgttttggc taccattacg gatatcagat gggttgttgc tcaaggagaa 1140 cgtcgccaat acctaagcaa gaaaagagga actgttccag aaaatacttg ggttactccg 1200 ggttctggtt tcgttcctac cagcagcact ttctatacaa atgctaccga gtattatgat 1260 tatgccggtc tgtgggaaga tcataataca aatgaggccg taatcagtgg aactcaagtg 1320 ccgactttgg ctgattatca gcttcaggac gtgactggcg aattggcaaa tgctctttca 1380 gggaaattcc tgctgcctaa tacccataag tcaggtgcta atgctgcctc gtcagactat 1440 aagagaggta atactgccta tgtattggtt cgtgcgaagt ttactcccaa gaaagaagcc 1500 tttatcgata gaggtaaaac ttattcagat aatactgcag ttcctgaata tgtagcaggt 1560 gaagatttct tcgttggtga gaatggccag ttctatgtgt ctatgaaatc cgttacagac 1620 cccaaggtag gtggtgtagc tggtatgaag gcacacaaat atgtgaaagg caaagtactg 1680 tactatgctt ggttgaatcc cagtactact tctcccgatt catggtggaa ttcccctgtt 1740 gtgcgcaaca atatctacca tatccacatc aagagcatca agaagttggg cttcaactgg 1800 aatcctttgg tgccggatcc ggatcctagc aacccggaaa atccgaataa ccctgacccg 1860 aatccggatg agccgggtac tcccgttcct acagatccgg agaacccctt gcctgatcag 1920 gatacgttca tgtcggttga ggttacagtt ttgccttgga aagttcattc ctatgaggtt 1980 gatctctaat tagctattgt aaaattttct ttttgagggt gggatttcgg ttcccaccgt 2040 tctcccaccc tctatatttt ttaaaacaat gaacaaacgg aagcatatgg atattcgcag 2100 acttattatt tctttgccgg caataatggc cctgtggggt ggtttggctt catgtgataa 2160 gatgatttat gacaattacg atgattgtcc tcgag 2195 <210> 14 <211> 1700 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 14 gtcgagcggg aggtcttatg tcgaccatct tgtcgatata ttctgaacac tctatgtcgt 60 gtctttgtta agtaaactga tcaccttata atatcagtac aagctgttca ggtgaagttc 120 atgcagaata gtgtgcaaga gtatagaatt gtagagatta tgggttcgga tatgtgataa 180 cgaggattca tcgttaagtt tatccggttt tatagtcttg agcgttttgt gttttatagt 240 ctttctttcg acgtttttag aatcaattta atattaatcc ttttaaacat ttggcttatg 300 aagttaaaca aaatgttttt ggtcggagca ttgctctcat tgggctttgc ttcttgtagt 360 aaagagggca atggccccga tccggacaat gcggcgaagt cgtatatgtc tatgacgttg 420 tccatgccta tgggaagtgc tcgtgcgggt gacggacagg atcaagctaa ccctgactac 480 cattatgtag gagagtgggc aggaaaagac aaaattgaga aagtgagcat ctacatggtg 540 cctcagggtg gccctgggct tgtggagagt gctgaagatc ttgattttgg cacttattat 600 gaaaatccta ctatagatcc tgcaacccac aatgccattt tgaaaccgaa aaaaggtatc 660 aaggttaatt ctgctgtcgg caagacggtt aaagtatatg tggtgctcaa tgacatcgcc 720 ggcaaggcaa aagccctttt ggcaaatgtt aatgcagcag actttgatgc taaattcaaa 780 aagataatcg aactgtctac tcaggctcag gctttaggta cggtagccga tggcccgaat 840 cctgctacag cggctggaaa gattgccaaa aagaatggta ctactgatga gacaatcatg 900 atgacctgtt tgcagccttc tgatgctttg actatcgaag ctgctgtatc cgaggccaat 960 gctatcgcag ggattaagaa tcaggccaag gttacggtgg agcgttctgt agcacgtgcg 1020 atggtttcaa cgaaagccca gagttatgaa attaaagcca ctactcaaat tggagaaatt 1080 gccgcaggtt ctgttttggc taccattacg gatatcagat gggttgttgc tcaaggagaa 1140 cgtcgccaat acctaagcaa gaaaagagga actgttccag aaaatacttg ggttactccg 1200 ggttctggtt tcgttcctac cagcagcact ttctatacaa atgctaccga gtattatgat 1260 tatgccggtc tgtgggaaga tcataataca aatgaggccg taatcagtgg aactcaagtg 1320 ccgactttgg ctgattatca gcttcaggac gtgactggcg aattggcaaa tgctctttca 1380 gggaaattcc tgctgcctaa tacccataag tcaggtgcta atgctgcctc gtcagactat 1440 aagagaggta atactgccta tgtattggtt cgtgcgaagt ttactcccaa gaaagaagcc 1500 tttatcgata gaggtaaaac ttattcagat aatactgcag ttcctgaata tgtagcaggt 1560 gaagatttct tcgttggtga gaatggccag ttctatgtgt ctatgaaatc cgttacagac 1620 cccaaggtag gtggtgtagc tggtatgaag gcacacaaat atgtgaaagg caaagtactg 1680 tactatgctt ggttgaatcc 1700 <210> 15 <211> 1908 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 15 catttggctt atgaagttaa acaaaatgtt tttggtcgga gcattgctct cattgggctt 60 tgcttcttgt agtaaagagg gcaatggccc cgatccggac aatgcggcga agtcgtatat 120 gtctatgacg ttgtccatgc ctatgggaag tgctcgtgcg ggtgacggac aggatcaagc 180 taaccctgac taccattatg taggagagtg ggcaggaaaa gacaaaattg agaaagtgag 240 catctacatg gtgcctcagg gtggccctgg gcttgtggag agtgctgaag atcttgattt 300 tggcacttat tatgaaaatc ctactataga tcctgcaacc cacaatgcca ttttgaaacc 360 gaaaaaaggt atcaaggtta attctgctgt cggcaagacg gttaaagtat atgtggtgct 420 caatgacatc gccggcaagg caaaagccct tttggcaaat gttaatgcag cagactttga 480 tgctaaattc aaaaagataa tcgaactgtc tactcaggct caggctttag gtacggtagc 540 cgatggcccg aatcctgcta cagcggctgg aaagattgcc aaaaagaatg gtactactga 600 tgagacaatc atgatgacct gtttgcagcc ttctgatgct ttgactatcg aagctgctgt 660 atccgaggcc aatgctatcg cagggattaa gaatcaggcc aaggttacgg tggagcgttc 720 tgtagcacgt gcgatggttt caacgaaagc ccagagttat gaaattaaag ccactactca 780 aattggagaa attgccgcag gttctgtttt ggctaccatt acggatatca gatgggttgt 840 tgctcaagga gaacgtcgcc aatacctaag caagaaaaga ggaactgttc cagaaaatac 900 ttgggttact ccgggttctg gtttcgttcc taccagcagc actttctata caaatgctac 960 cgagtattat gattatgccg gtctgtggga agatcataat acaaatgagg ccgtaatcag 1020 tggaactcaa gtgccgactt tggctgatta tcagcttcag gacgtgactg gcgaattggc 1080 aaatgctctt tcagggaaat tcctgctgcc taatacccat aagtcaggtg ctaatgctgc 1140 ctcgtcagac tataagagag gtaatactgc ctatgtattg gttcgtgcga agtttactcc 1200 caagaaagaa gcctttatcg atagaggtaa aacttattca gataatactg cagttcctga 1260 atatgtagca ggtgaagatt tcttcgttgg tgagaatggc cagttctatg tgtctatgaa 1320 atccgttaca gaccccaagg taggtggtgt agctggtatg aaggcacaca aatatgtgaa 1380 aggcaaagta ctgtactatg cttggttgaa tcccagtact acttctcccg attcatggtg 1440 gaattcccct gttgtgcgca acaatatcta ccatatccac atcaagagca tcaagaagtt 1500 gggcttcaac tggaatcctt tggtgccgga tccggatcct agcaacccgg aaaatccgaa 1560 taaccctgac ccgaatccgg atgagccggg tactcccgtt cctacagatc cggagaaccc 1620 cttgcctgat caggatacgt tcatgtcggt tgaggttaca gttttgcctt ggaaagttca 1680 ttcctatgag gttgatctct aattagctat tgtaaaattt tctttttgag ggtgggattt 1740 cggttcccac cgttctccca ccctctatat tttttaaaac aatgaacaaa cggaagcata 1800 tggatattcg cagacttatt atttctttgc cggcaataat ggccctgtgg ggtggtttgg 1860 cttcatgtga taagatgatt tatgacaatt acgatgattg tcctcgag 1908 <210> 16 <211> 1413 <212> DNA <213> Prophyromonas gingivalis <400> 16 catttggctt atgaagttaa acaaaatgtt tttggtcgga gcattgctct cattgggctt 60 tgcttcttgt agtaaagagg gcaatggccc cgatccggac aatgcggcga agtcgtatat 120 gtctatgacg ttgtccatgc ctatgggaag tgctcgtgcg ggtgacggac aggatcaagc 180 taaccctgac taccattatg taggagagtg ggcaggaaaa gacaaaattg agaaagtgag 240 catctacatg gtgcctcagg gtggccctgg gcttgtggag agtgctgaag atcttgattt 300 tggcacttat tatgaaaatc ctactataga tcctgcaacc cacaatgcca ttttgaaacc 360 gaaaaaaggt atcaaggtta attctgctgt cggcaagacg gttaaagtat atgtggtgct 420 caatgacatc gccggcaagg caaaagccct tttggcaaat gttaatgcag cagactttga 480 tgctaaattc aaaaagataa tcgaactgtc tactcaggct caggctttag gtacggtagc 540 cgatggcccg aatcctgcta cagcggctgg aaagattgcc aaaaagaatg gtactactga 600 tgagacaatc atgatgacct gtttgcagcc ttctgatgct ttgactatcg aagctgctgt 660 atccgaggcc aatgctatcg cagggattaa gaatcaggcc aaggttacgg tggagcgttc 720 tgtagcacgt gcgatggttt caacgaaagc ccagagttat gaaattaaag ccactactca 780 aattggagaa attgccgcag gttctgtttt ggctaccatt acggatatca gatgggttgt 840 tgctcaagga gaacgtcgcc aatacctaag caagaaaaga ggaactgttc cagaaaatac 900 ttgggttact ccgggttctg gtttcgttcc taccagcagc actttctata caaatgctac 960 cgagtattat gattatgccg gtctgtggga agatcataat acaaatgagg ccgtaatcag 1020 tggaactcaa gtgccgactt tggctgatta tcagcttcag gacgtgactg gcgaattggc 1080 aaatgctctt tcagggaaat tcctgctgcc taatacccat aagtcaggtg ctaatgctgc 1140 ctcgtcagac tataagagag gtaatactgc ctatgtattg gttcgtgcga agtttactcc 1200 caagaaagaa gcctttatcg atagaggtaa aacttattca gataatactg cagttcctga 1260 atatgtagca ggtgaagatt tcttcgttgg tgagaatggc cagttctatg tgtctatgaa 1320 atccgttaca gaccccaagg taggtggtgt agctggtatg aaggcacaca aatatgtgaa 1380 aggcaaagta ctgtactatg cttggttgaa tcc 1413

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、クローンｐＭＯ１５の制限酵素地図を
示す。

【図２】図２は、サザンブロットハイブリダイゼーショ
ンの結果を示す、図面に代わる写真を図面化したもので
ある。

【図３】図３は、ウエスタンブロティングの結果を示
す、図面に代わる写真を図面化したものである。

【図４】図４は、本発明の５３−ｋＤａの蛋白のアミノ
酸配列と塩基配列を対比したものである。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｂ (72)発明者 栗原 英見 広島県広島市東区牛田早稲田３丁目11−21 −303 (72)発明者 宮本 学 岡山県岡山市福島２丁目19−23 ハイツに のわりＢ101 (72)発明者 高柴 正悟 岡山県岡山市城東台東２−10−16 Ｆターム(参考） 4B024 AA13 BA50 BA80 CA03 DA06 EA04 GA11 HA11 HA12 4B063 QA01 QA19 QQ03 QR08 QR42 QR66 QS10 QS16 QS34 QX02 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA11 DA86 EA50 FA72 FA74

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表の配列番号１又は３に示されるア
   ミノ酸配列、又は、これらのアミノ酸の一部が欠失し、
   他のアミノ酸で置換され、及び／又は他のアミノ酸が付
   加したアミノ酸配列を有する、歯周病細菌ギンギバリス
   菌の組換え外膜蛋白質。
2. 【請求項２】 請求項１に記載された蛋白質をコードす
   る塩基配列を有する核酸。
3. 【請求項３】 塩基配列が配列表の配列番号２又は３で
   示される請求項２に記載の核酸。
4. 【請求項４】 核酸がＤＮＡである請求項２又は３に記
   載の核酸。
5. 【請求項５】 請求項２〜５のいずれかに記載の核酸の
   塩基配列の連続する１５塩基以上からなるＰＣＲ増幅法
   のためのプライマー。
6. 【請求項６】 プライマーの塩基配列が配列表の配列番
   号５、６、７又は８で示される請求項５に記載のプライ
   マー。
7. 【請求項７】 請求項２〜５のいずれかに記載の核酸の
   塩基配列の連続する１４塩基以上からなる歯周病細菌ギ
   ンギバリス菌の外膜蛋白質をコードする核酸を検出する
   ためのプローブ。
8. 【請求項８】 プローブの塩基配列が配列表の配列番号
   ５で示される塩基配列を有する請求項７に記載のプロー
   ブ。
9. 【請求項９】 検体中のＤＮＡを請求項５又は６に記載
   のプライマーを用いて増幅し、増幅されたＤＮＡから歯
   周病細菌ギンギバリス菌の外膜蛋白質をコードするＤＮ
   Ａを検出する方法。
10. 【請求項１０】 検出の請求項７又は８に記載のプロー
    ブを使用する請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 請求項１に記載の蛋白質の全部又は一
    部に対して免疫応答を示す抗体。