JPH07508649A - マイコバクテリアの膜−関連免疫原 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、マイコバクテリアの膜−関連ポリペプチドに関し、特にかかるポリペ プチドおよびこれらをコードする核酸の、ワクチンおよび診断試薬としての利用 に関するものである。

発明の背景 マイクバクテリアは、抗酸性、グラム−陽性バクテリアの多様な集合であり、そ の幾つかは重大なヒトおよび動物の疾患を引き起こす。ヒトにおける、２つの最 も一般的なマイコバクテリアに起因する疾患は結核症（ＴＢ）および癩病であり 、これらは、それぞれ随チューバークローシス（ＩＬＬ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ）および随しプラ工（！ｔ　Ｉｅｐｒａｅ）による感染に起因する。

結核症は包括的な流行性疾患の主な諸特徴の全てを示す。通常、結核症は世界中 で三千五百万人を越える人々が苦しめられ、毎年５百万人を越える死者を出して いる。インドにおいては、任意の与えられた時点において、はぼへ百万人もの人 々がこの疾病に罹患し、五十万人が死亡していることが報告されている。これら の数値は、この国における該疾病に罹患した人々の全てを包括していない可能性 がある。かくして、結核症はインドばかりか世界中の他の多くの国々において重 大な問題であると考えられる。

結核症は、隨チューバークローシス、隨ボビス（随ｂｏｖｉｓ）、隨アフリカヌ ム（Ｍ。

ａｆｒｉｃａｎｕｍ）およびにミクロッティ（Ｍ、　ｍ１ｃｒｏｔｉ）、即ちマ イコバクテリアセアエ科の抗−酸性、グラム−陽性結核菌によって引き起こされ る。燵チューバークロー’ｙ７の幾つかの地域の病原性菌株も、マドラスおよび インドの他の都市における患者から単離されており、これらは幾つかの点で、ビ ルレント菌株であるにチュー　ハークローンスｔ１３７Ｒｖとは異なっている。

近年、ＡＩＤＳに感染した幾つかの個体群が、Ｔ［ｌの著しく高い罹患率をも示 すことが見出された。集合的にＭＡＩＳ群として知られている、ｋアビウム（Ｉ ｔ　ａｖｉｕｍ）、町散在性の疾患の原因となることが、今や明らかとなってい る（キーン（Ｋｉｅｈｎ）等。

療および鎮制に向けられてきた。しかしながら、延チューｌく一クローシスの緒 特性が、診断法の改良並びにより効果的なワクチンを開発するための研究を妨害 している。更に、この微生物の生化学的な組成が、細胞成分の同定並びに精製を 困難にしており、また多くのこれら物質は一旦精製されると、診断試薬としての 感度および特異性に欠けてしまう。結果として、マイコノくクチリアによる疾患 に対する診断並びに免疫予防手段は、過去半世紀におけるものと殆ど変わって（ １な（１゜ｋチューバークローシスの従来の診断法は、面倒であり、しかも結果 の出るのも遅い。

隨ボビスのアビルレント菌株である、バチルス力ルメソトーゲラン（Ｂａｃｉｌ ｌｕｓＣａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）　（カルメット（Ｃａｌｍ ｅｔｔｅ）、　Ａ、、　Ｍａｓｓｏｎ　ｅｔ　Ｃｉｅ、　Ｐａｒｉ刀B １９３６）が、結核症に対するワクチンとして広範に利用されている。多くの研 究（こより、その結核症に対する予防的有効性が見出されている（ルエルモ（Ｌ ｕｅｌｍｏ）。

ない理由のために、ＢＣＧは結核症に対して予防効果を示さなかった（ファイン （Ｆｉｎｅ）、　Ｐ、、　Ｔｕｂｅｒｃｌｅ、　１９８４．６５．　ｐｐ、１３ ７−１５３；　ファイン等、　Ｌａｎｃｅｔ、　（ｉｉ）、　１X ８６、　ｐｐ、　４９９−５０２）。

ワクチン接種による撲滅、初期診断、および効果的な治療は、マイコＩくクテリ ウム症撲滅運動の重大な目的の一つである。これら病原体、その構成、その自然 発達、その生理、生化学的および免疫学的反応性に関する生物学の現時点の知識 における欠陥は、該病原体の弱化を解明する試みの必要性を際立たせ、結果とし てこの疾病を撲滅するためのより効果的な方法を工夫することが可能となる。こ れら諸疾患の診断並びに予防のためのより効果的な手段を開発するためには、マ イコバクテリア病原体による感染に対する免疫応答を理解することが重要である 。

細胞性免疫応答を引き出す上で重要な該マイコバクテリア成分は、未だ十分には 定義されていない。マイコバクテリアの死菌による感染または接種に対する抗体 およびＴ−細胞の応答が、ヒト並びに動物において研究されている。ＴＢまたは 癩病に罹患したヒトの患者は、マイコバクテリア抗原に対する血清抗体を生成す る。

抗体は抗−マイコバクテリア免疫応答においである機能をもつが、その正確な機 能は依然として明確にされてはいない。というのは、これらの抗体には、何等の 予防的役割も与えられていないからである。マイコバクテリアによる疾患に対す る予防は細胞−媒介免疫を含む。

マイコバクテリアは如何なる直接的な有害物質をも生成せず、結果としてその病 原性は、該感染した宿主との相互作用に関与する多数のファクタによる。細胞内 寄生は、恐らく宿主細胞の栄養ファクタに依存し、その供給不足は静菌作用性で あり、かつマイコバクテリアの潜伏機構においである役割を演する可能性がある ものと理解される。

マイコバクテリア感染における防禦免疫性は、マクロファージを活性化して非− 特異的結核菌活性とする特異的Ｔ細胞によって媒介されることが、一般的に理解 されている。γ−ＩＦＮがＨ２０□−媒介バクテリアのマクロファージによる殺 菌を誘発する証拠があるが、関連するあるいは他のマクロファージ活性化ファク タ（ＭＡＦ）分子も関与している可能性がある。活発なＴ細胞増殖サイトにおけ る不十分な殺菌機能による、これらの原因は未だに説明されていない。遅延−型 過敏症（ＤＴＨ）および防禦免疫性は、別々のサブセットまたは特異性のＴ−細 胞がマイコバクテリア感染に対する後天的耐性の原因であり得るという見方に導 く。また、防禦の妨害は付随する細胞反応、即ちサプレッサーＴ−細胞およびマ クロファージによって、あるいはＴ−細胞のＢ−細胞に対するヘルパー機能への 転位によって生ずる可能性がある。

抗原転位（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ　５ｈｉｆｔ）により、宿主の耐性を回避できる ウィルスおよび幾つかの寄生病原体とは違って、マイコバクテリアは弾性細胞壁 構造をもち、かつその免疫調節細胞壁成分の作用によって宿主の免疫応答を抑制 できる。他の微生物病原体に対する防禦免疫化の成功は、主として免疫性の定量 的パラメータに依存するが、マイコバクテリアの免疫調節刺激が、宿主免疫系の 調節機能障害を引き起こすものと思われる。これは、単に複雑な組成をもつ、例 えば全マイコバクテリアを含むワクチン（例えば、ＢＣＧ）を使用することによ る、より強力な免疫化によって克服し得るものではないと考えられる。多分、マ イコバクテリアは、該宿主の免疫性を高める強力な［アジュバント」構造を発達 させるのではなく、寧ろ宿主の防禦を、該病原体に有利なように作用する効果的 でない細胞反応に逆転させるように発展させた。弱毒化病原体、例えばＢＣＧに よるワクチン接種は免疫応答を更に増幅するが、該宿主の防禦性を制限されたも のとし、規定された抗原による免疫化の潜在的な余地は依然として増大している 。

個々の抗原タンパクの精製および特徴付けは、分子レベルでの該ＤＴＨ反応の基 本的なメカニズムを理解する上で必須である。マイコバクテリアによる疾患の発 病における並びに診断的目的のための規定された構造をもつタンパク質の可能な 機能的役割が、極めて興味深いものとして残されている。多くの研究者グループ が、標準的な生化学的並びに免疫学的技術によって、マイクバクテリア抗原を明 らかにしようと試みており、かつマイコバクテリアにおける共通の並びに種特異 ル（Ｄａｎｉｅｌ）等、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、、　１９７８．４２ ．　ｐｐ、　８４−１１３；スタンフォード（Ｓｔａｎｆｏｒｄ）等、　Ｔｕｂ ｅｒｃｌｅ、　１９７４．５５．　ｐｐ、　１４３−１５２；クワバラ（Ｋｕｗ ａｂａｒａ）、　Ｓ、、　Ｊ、　Ｂｉ盾戟B ＣｈｅｌＬ、　１９７５．２５０．　ｐｐ、　２５５６−２５６２）。

マイコバクテリアゲノムに関連する情報は殆ど入手できない。先ず、該ゲノムの サイズ、Ｇ十〇含有率および種々のマイコバクテリアゲノム間のＤＮＡ相同性の 程度を評価するために、基本的な研究が実施された（グロスキンスキー（Ｇｒｏ ｓｓｋｊｎｓｋｙ）等、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｎｎｕｎ、、　１９Ｂ９．５７． ５：１５３５−１５４１；ガルシア（Ｇａｒｃｉａ）等、　Ｊ、　ＧｅｎB Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　１９８６．１３２．　ｐｐ、　２２６５−２２６１に イマエダ（１ｍａｅｄａ）、　Ｔ、、　Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｓ凾刀B Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１９８５．３５．２：１４７−１５０：　クラークー カーティス（Ｃ１ａｒｋ−Ｃｕｒｔｉｓｓ）。

等、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、　１９８５．１６１３：１０９３−１１０ ２；バエス（Ｂａｅｓｓ）、　１．等、　Ｂ、、　ＡｃｊａB Ｐａｔｈ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、、１９７８．８６．　ｐｐ、 ３０９−３１２；ブラツドリー（Ｂｒａｄｌｅｙ）、　Ｓ、f。

、　Ａｌｌ　Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐｉｒ、Ｄｉｓ、、１９７２．　１０６．　ｐｐ、 １２２−１２４）　。最近、マイコノ＜クチリア遺伝子のクローニングおよび発 現のために組み換えＤＮＡ技術が利用されている。

延チューバークローンス、ｋレブラエおよび幾つかの他のマイコバクテリア種の ゲノムＤＮＡが、λ−ｇｔｌｌファージ（ヤング（Ｙｏｕｎｇ）等、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

Ｕ、Ｓ、Ａ、、　１９８５．８２．　ｐｐ、　２５８３−２５８７．ヤング（Ｙ ｏｕｎｇ）等、　Ｎａｔｕｒｅ　（ｏンドン）、■９８５、３１６．　ｐｐ、　 ４５０−４５２）あるいは他のベクターに基く組み換え遺伝子ライブラリーの構 築に利用された。これらのライブラリーは、二十日鼠のモノクローナル抗ル抗血 清でスクリーニングされ、カリ幾つかの免疫優性の抗原が同定された。こ７１８ −１７２１：　ハッソン＆ヤング（Ｈｕｓｓｏｎ　＆　Ｙｏｕｎｇ）、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、`。

である。幾つかのこれら抗原に対する幾つかの類似抗原も、幾つかの他のマイコ バクテリア種（例えば、ＢＣＧ）中に同定された（ヤマグチ（Ｙａｍａｇｕｃｈ ｉ）等、　ＦＥ８０６しかしながら、これらの抗原は細胞内または分泌分子の何 れかである。

燵ボビスＢＣＧは結核症に対するワクチンとして広範に利用されてきたが、防禦 免疫応答を誘発し得るマイコバクテリアの膜−関連ポリペプチドの決定が強く望 まれている。このような膜−関連ポリペプチドおよびこれをコードするＤＮＡの 使用は、組み換えワクチン、例えばワクシニアウィルス、サルモネラ菌等の生担 体として使用され、ウィルスまたはバクテリア内で発現される、マイコバクテリ ア膜−関連免疫原の発生、または組み換え生ワクチンとして使用できる培養可能 なマイコバクテリア菌株の表面上における、非−マイコバクテリア性免疫原の発 現をもたらす。

従って、本発明の目的は、マイコバクテリアの膜−関連ポリペプチドをコードす る核酸を同定し、かつ単離する方法を提供することにある。

更に、本発明のもう一つの目的は、マイコバクテリアの膜−関連ポリペプチドお よび該ポリペプチドをコードする核酸を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、マイコバクテリアの該膜−関連ポリペプチドまたは該 膜−関連ポリペプチドをコードするＤＮＡの全体または一部を利用したワクチン を提供することにある。

本発明の目的は、更にマイコバクテリア感染に関する診断アッセイにおいて有用 な、マイコバクテリアと共に該膜−関連ポリペプチドを含む、あるいは該ポリペ プチドをコードするＤＮＡを含有する試薬を提供することにある。

更に、本発明の目的は、マイコバクテリア並びにＥ、コリ（［！、　ｃｏｌｉ） 等の他の微生物中で遺伝子発現可能な、該膜−関連ポリペプチドのプロモータを 含むプロモータ配列を提供することにある。

発明の概要 上記目的に従って、本発明は、マイコバクテリアの膜−関連ポリペプチド全体ま たはその一部をコードする核酸および該［）ＮＡによってコードされた該膜−関 連ポリペプチドを含む組成物を包含する。該膜−関連ポリペプチドは、病原性マ イコバクテリア即ち該ポリペプチドまたはその一部を取り出したマイコバクテリ アに対する免疫応答を検出し得ることにより特徴付けられる。かかるマイコバク テロフラシウム（ｔ　ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）および随ボビス（Ｍ、　ｂｏ ｖｉｓ）　ＢＣＧを包含する。

ある特別なマイコバクテリアの膜−関連ポリペプチドは７９ｋＤのイオン−移動 性（ｉｏｎ−ｗ＋ｏｔｉｖｅ）ＡＴＰアーゼである。細胞外、細胞内および経膣 ドメインは、このマイコバクテリア膜−関連ポリペプチドにおいて、そのＤＮＡ およびその推定されたアミノ酸配列に基いて同定される。

本発明は、また膜−関連マイコバクテリアポリペプチドまたはこれをコードする 核酸の表現型の全体または一部を利用したワクチンをも包含する。本発明ｉｔ、 更にマイクバクテリアまたはＬ２某等の他の微生物中で遺伝子発現可能なマイコ バクテリアプロモータ配列をも包含する。このようなプロモータは、膜−関連Ａ ＴＰアーゼをコードするマイコバクテリア遺伝子由来のものである。好ましく１ プロモータは、延ボビス（ｔ　ｂｏｖｉｓ）　ＢＣＧの７９ｋＤの膜−関連ポリ ペプチドをコードする遺伝子のプロモータである。このプロモータ配列は、マイ コノくクチリア中で対象とする遺伝子を発現するのに特に有用である。

図面の簡単な説明 第１図は、ＴＨに罹患した患者由来の血清を使用した、隨ボビスＢＣＧ　ＤＮＡ （／（ネルＡ）およびにチューバークローシスＨ３７ＲＶ　ＤＮＡ（／’ネルＢ ）をもつ、組み換えコロニーの免疫スクリーニングの結果を示した図であり、該 患者における、該抗血清と反応し得る随ボビスＢＣＧ抗原および隨チューバーク ローシスＨ３７Ｒｖ抗原の存在番よ、定性的シグナルによって示される。

第２図は、本明細書に記載した免疫スクリーニングア・ツセイを利用して同定さ れたＢＣＧ　ＤＮＡを担持する、組み換えクローンの制限サイトマ・ツブ（１＜ ネルＢ）と、それぞれ隨チューバークローンスおよび隨ボビスＢＣＧゲノムＤＮ Ａの５種の免疫優性抗原の制限サイトマツプ（）λツソン＆ヤング（Ｈｕｓｓｏ ｎ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

パネルにおける制限マツプは、同一の縮尺で描かれており（上部；こ示されて（ する）、また制限サイトは該制限マツプの上部に示されている。ノくネルＡの点 線（よ非−マイコバクテリアＤＮＡを表す。制限酵素：Ｂ、　ＢａｍＨｌ；　Ｅ 、　ＥｃｏＲＩ；　Ｇ、　Ｂｇｌｌｌ；に、　Ｋｐｎｌ；　Ｐ、　Ｐｖｕｌ；　 Ｘ、　Ｘｈｏｌ；　）Ｉ、　Ｈｉｎｃｌｌ；　Ｕ、　Ｐｖｕｌｌ；　Ｐｓ、　Ｐ ｓｔｌ、　）ｌｉ、@Ｈｉｎｄｌｌ＋。

パネルＡにおいて、Ａは５ａｉｌであり、またＳは５ａｃｌである。

第３図は、組み換えクローンｐＭＢＢ５１Ａの超音波照射した上澄のウェスタン プロット分析の結果を示す図であり、該組み換えクローンは該組み換えコロニー の免疫スクリーニングに従って同定されたＢＣＧ　ＤＮＡインサートをもつ。上 部パネルはＭＢ８５１Ａ　（レーン２）およびＣ，コリ（レーンｌ）と、ＴＢに 罹患した患者由来の血清との反応性を示す。下方のパネル（パートＡ）は、ＭＢ Ｂ５１Ａ　（レーン１および２）およびＥ、コリ（レーン３）と、兎中に発生し た抗−ＦＩ３７Ｒｖ血清との反応性を示す。パートＢはＭＢＢ５１Ａ　（レーン １および２）およびＥ、コリ（レーン３）と、第二抗体のみとの反応性を示す。

矢印は、該組み換えＭＢＢ５１Ａにより発現された９０ｋ［ｌの免疫反応性ＢＣ Ｇタンパクの位置を示し、これは負のコントロールには見られなかった。

第４図は、推定分子量７９ｋＤを有する、イオン−移動性ＡＴＰアーゼをコード する延ボビスＢＣＧ免疫反応性■Ｂ５１Ａｉｌ伝子を含むクローンｐＭＢＢ５１ Ａの、３．２５ｋｂインサートＤＮＡのヌクレオチド配列（Ｓｅｑ、　１０　Ｎ Ｏ，：　ｌ）を示す。その推定アミノ酸配列（Ｓｅｑ、　１０　ＮＯ，：　２） は該ヌクレオチド配列の下方に示されている。上流プロモータエレメントは下線 で示しである。転写終止領域は逆向きの矢印で示しである。５゜および３°フラ ンキング領域も図示しである。

第５図は、ＢＣＧのイオン−移動性ＡＴＰアーゼを表す、ｐＭＢＢ５１Ａによっ てコードされる、７９ｋＤのタンパクについて誘導された模式的なモデルを表す 。このモデルは、該タンパクの経膣ドメインの他のイオン−移動性ＡＴＰアーゼ 類似体中で顕著な、構造上および機能上の特徴のみを考慮したものである。機能 上重要なアミノ酸残基はそれぞれ（Ｐ）９位置４００におけるプロリン；　（Ｄ ）、位置４４３におけるアスパラギン酸；　（Ｇ）、位置５２１におけるグリシ ン；　（Ａ）、位置６４６におけるアラニンを表す。数値は該経膣ドメインの限 界を大まかに画成するアミノ酸残基を示す。

ゲノムＤＮＡのＢａ＋ｎＨＩ消化物のサザンプロットハイブリッド形成の結果を 示す（プローブとして９ＭＭＢ５１＾ＤＮＡを使用した）。パネルＡはエチジウ ムプロミド染色したゲルを示し、パネルＢは該サザンブロットハイブリソド形成 の結果を示すものである。

発明の詳細な説明 本明細書で使用する、マイコバクテリアの［膜−関連ポリペプチド」とは、該膜 −関連ポリペプチドを含有する野性−型のマイコノくクチリアに対する免疫応答 の検出を可能とする、任意のマイコバクテリア膜−関連ポリペプチドとして定義 される。しかしながら、隨ボビスＢＣＧの７９ｋＤ膜−関連ポリペプチドと、結 核に罹患した患者のプールした抗−血清との間の観測された交差−反応性、およ び該７９ｋＤ膜−関連ポリペプチドをコードするＤＮＡと隨チューｌく−クロー シスＨ３７ＲｖのＤＮＡとの間におけるような、交差−ｌゾブリダイゼーション を基にすれば、本発明の該膜−関連ポリペプチドは、本明細書てにボビスＢＣＧ から同定したポリペプチドに限定されるものではない。寧ろ、本発明は、７９ｋ Ｄのイオン−移動性ＡＴＰアーゼのみならず、該膜−関連ポリペプチドが通常見 出される、同一のまたは異なるマイコバクテリアによる免疫応答を検出するのに 利用できるマイコノくクチリアの任意のおよび全ての膜−関連ポリペプチドをも 包含する。

本明細書で使用する用語「核酸」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡ並びに検出可能な標 識が組み込まれた、あるいは安定性を高めるための種々の変性、例えばホスホリ ボース骨格へのホスホロチオエート結合の組み込み等により変性された核酸を包 含する。このような核酸は、また該膜−関連ポリペプチドをコードするＤＮＡの アンチセンス配列を含んでおり、今や周知となっているアンチセンス技術がかか る膜−関連ポリペプチドの発現を変調するのに利用できる。

本発明の幾つかの局面においては、該マイコバクテリアの膜−関連ポリペプチド 全体またはその一部をコードする核酸配列をワクチンとして利用する。

このように使用する場合、該核酸は一般的に「発現可能な核酸」であって、これ は全ての必要な発現調節配列を含んでいて、選択された宿主系内の核酸の転写並 びに翻訳を制御する。幾つかのワクチンの態様において、該ＤＮＡは該膜−関連 ポリペプチドおよび［免疫原性ポリペプチド」の経膣ドメインの少なくとも１つ において、キメラポリペプチドをコードする。この経膣ドメインＣよ、弱毒生ワ クチン等の特定の宿主生物の表面上に、該免疫原性ポリペプチドを発現するの（ こ１１１用される。該膜−関連ポリペプチドが１を越える縁膜領域を含む場合、 該縁膜領域の１以上を免疫原性ポリペプチドと共に使用できる。かくして、例え ば第５図に示したような７９ｋＤイオン−移動性ＡＴＰアーゼは少なくとも３個 の細胞外ドメインを有し、該ドメインには、組み換えＤＮＡ技術を含む周知の方 法によって、免疫原性ポリペプチドを組み込むことができる。■を越える縁膜領 域を、免疫原性ポリペプチドを発現するのに利用することが好ましいが、当業者 は容易にこのような膜−関連ポリペプチドの長さを変えて、免疫応答を最小化し 、あるいはこのような用途に使用する膜−関連ポリペプチドの量を最小化するこ とができる。

本明細書で使用する用語［免疫原性ポリペプチド」とは、ワクチンまたは診断用 途において潜在的に利用可能である任意のポリペプチド全体またはその一部を含 む。かくして、該免疫原性ポリペプチドは、非相同性免疫原、即ち非−マイコバ クテリア源、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ　Ｉａ）またはシゲラ（Ｓｈ ｉｇｅｌ　Ｉａ）由来の免疫原、あるいは該膜−関連ポリペプチドを誘導したも のとは異なるマイコｌくクチかの例においては、相同性免疫原を使用できる。例 えば、本明細書の第５図に示された細胞外ドメインの各々を、通常縁膜ドメイン を含む膜−関連ポリペプチド由来の該ドメインの１以上と組み合わせ、かつ表示 することができる。あるいはまた、該細胞間ドメインを、同一の分子由来の適当 な縁膜領域を利用して、細胞外的に発現することもてきる。

別のワクチンの態様においては、該膜−関連ポリペプチドをコードするＤＮＡで はなく、寧ろマイコバクテリアの該膜−関連ポリペプチドの全体またはその一部 を、ワクチンの一部として使用する。このようなタンパク質性のワクチンは、周 知のアジュバントと共に処方され、かつ当業者には公知の十分に確立されたプロ トコールに従って投与される。

更に他の態様においては、本発明の該膜−関連ポリペプチドをコードする核酸を 、感染性のマイコバクテリアに含まれる野性型の遺伝子とのノゾブリダイゼーノ ヨンに基つく、感染の検出用の診断剤として使用できる。このような検出は、適 当な診断用サンプルから抽出されたＤＮＡの直接的なハイブリダイゼーション、 または本発明の該膜−関連ポリペプチドをコードする該核酸のヌクレオチド配列 を使用して増幅を誘発した、ＰＣＲ増幅を含む。ＰＣＲ増幅を保存領域内で開始 する場合、診断サンプル中のマイコバクテリアの存在を判定できる。この診断ア ッセイに対して特異的な種である、非−保存領域内で該増幅を開始する場合には 、感染を引き起こす特定のマイコバクテリアが決定される。

更に、本発明の膜−関連ポリペプチドは、また潜在的にマイコバクテリアによっ て感染された患者の血清中の抗体の存在を検出するのに利用できる。このような 検出系は、ラジオイムノアッセイおよび当業者には周知のその種々の変法を含む 。更に、本発明の膜−関連ポリペプチドは、生物学的サンプル中の細胞媒介免疫 応答の存在を検出するのに利用することもできる。このようなアッセイ系も、当 業者には周知であり、一般に該膜−関連ポリペプチドの刺激に応答したＴ細胞の 、準−集団のクローン増殖を包含する。このような使用に際して、患者の体液性 および／または細胞−媒介性応答が測定され、かつ該疾患に罹患中ずっと監視に より単離されている。これら４種の組み換えクローンの制限サイトマツプは、マ イコバクテリアの５種の免疫優性抗原のものとは異なっており（ヤング（Ｙｏｕ 口ｌ）、その結果これらのクローン化タンパク抗原が新規であることを示してい る。

この組み換えＤＮＡクローンの一つは、ウェスターンプロット分析によって測定 された見掛けの分子量９０ｋＤを有する免疫反応性タンパク質をコードした。こ のクローンの挿入ＤＮＡの完全なヌクレオチド配列が決定された。このクローン はマイコバクテリアプロモータおよび推定された分子量７９ｋＤを有する７６１ アミノ酸のタンパク質をコードするモノシストロン性ＯＲＦをもっことが分かっ ている。この７９ｋＤのタンパク質はＳ、フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）　（ ゾリオッッ（Ｓｏｌｉｏｚ）等、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ−移動性ＡＴＰア ーゼと高い相同性を有しており、従ってＢＣＧの推定に＋ＡＴＰアーゼまたはイ オン−移動ｍＴＰアーゼを表す。コンピュータアルゴリズムを利用して、このイ オン−移動性ＡＴＰアーゼが膜タンパクであると判定した。これは、ヒトにて、 新規なりＣＧ免疫原を得ることができ、これは結核および他のマイコバクテリに 感染した個体につき、患者をスクリーニングするための、高度に特異的な血清学 的テストの開発、該疾患に対するワクチンの開発、並びに感染した個体の治療の 有効性の評価において利用できる。

更に、ｐＭＢＢ５１Ａ挿入ＤＮＡのヌクレオチド配列に基いて、適当なオリゴヌ クレオチドブライマーを、鋳型としてにボビスＢＣＧまたはにチューバークロー シスＨ３７ＲｖＤＮ＾を使用した、ＰＣＲ増幅のために利用できる。このような ＰＣＲ増幅スキームは、従って与えられたサンプル中のマイコバクテリアＤＮＡ の検出のために有用であり得る。更に、該プライマーの設計の賢明な選択により 、このような増幅手順は、マイコバクテリアのＤＮＡの分類学上の分類に適合さ せることが可能である。

例えば、該ＡＴＰ−結合サイト等の強く保存された領域を側部に配置するプライ マーを使用することにより、ＰＣＲ増幅が全てのマイコバクテリア種に対して一 般的となり、一方で非−保存領域由来のプライマーを使用することにより、増幅 を種物異的なものとすることができる。

ｋボビスＢＣＧのゲノムＤＮＡの組み換えＤＮＡライブラリーを、抗生物質マー カー（アンピンリンおよびテトラサイクリン）および数個の固有クローニングサ イトと共に、高いコピー数のプラスミドベクターであるｐＢＲ３２２を使用して 構築した。

ｋボビスＢＣＧ細胞は対数増殖期後期の培養物から収穫し、かつ高分子量ＤＮＡ を、アイゼンナッハ（Ｅｉｓｅｎａｃｈ）等、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｒｉｏｔ、、 　１９８６．１７９．１）ｐ、　１２５−１４２の方法を幾分改良した方法によ って単離した。ＢＣＧ　ＤＮＡはＢａｍＨｌで完全に消化し、これらフラグメン トの、ｐＢＲ３２２の該ＢａｍＨ＋サイトへのショットガンクローニングを実施 した。このゲノムライブラリーを１三Ｗ菌株Ｄ）ＩＩに形質転換し、組み換え体 をアンピシリン耐性かつテトラサイクリン感受性を基に計数した。この研究の目 的は広いサイズ範囲の制限フラグメントを、該ライブラリーを任意の特定のサイ ズ範囲のＤＮＡフラグメントに制限しないように、発生させることであった。ま たこのクローニング法により、マイコバクテリア抗原の発現につき選択された任 意の組み換え体が、ｐＢＲ３２２のＴｅｔプロモータではなく、寧ろマイコバク テリアプロモータからの発現を誘発するはずであることを、かなりの程度まで確 実にした。

このようにして構築した該ＢＣＧライブラリーはＢＣＧ由来の２０５１クローン を含んでいた。同様な方法で、随チューバークローシスＨ３７Ｒｖ　ＤＮＡのゲ ノムライブラリーを構築し、１１００のクローンが得られた。

このＢＣＧ　ＤＮＡインサートのサイズは０．９〜９．５ｋｂの範囲内であった 。ｐＢＲ３２２内に挿入された該マイコバクテリアＤＮＡフラグメントの平均サ イズは、約４ｋｂであると見積もられた。ＢＣＧの該ゲノムサイズを４．５Ｘ１ ０’ｋｂであるとすると（ブラッートサイズをもつ約ｔｏｏｏのクローンが、該 微生物の全ゲノムを包括的に表している。

マイコバクテリア抗原を発現する組み換え体を同定するために、適当な抗−血清 で組み換えコロニーをスクリーニングするためのコロニー免疫スクリーニングア ッセイ（ＣＩＡ）を確立した。進行中の肺結核であると新たに診断された２０名 の患者から得た血清を、免疫スクリーニングで使用するためにプールした。該患 者の何れも、この研究前に結核治療を受けておらず、カリその痰は全ての場合に おい去し、かくして該免疫スクリーニング中のシグナル／ノイズ比を改善した。

個々の組み換えコロニーをニトロセルロース膜上で一夜成長させ、免疫スクリー ニングを幾分改良を加えた上記の方法に従って実施した。これらのコロニーをク ロロホルム蒸気で溶解して、クローン化マイコバクテリア抗原を放出させ、ニト ロセルロース紙上に固定化した。これらの固定化された抗原は、ＴＢ血清と反応 し、該抗体の結合はホースラディツシュペルオキシダーゼ−プロティンＡを使用 した標準的手順によって顕在化させた。この組み換えクローンを使用して得たシ グナルを、負のコントロールとして機能する、ｐＢＲ３２２ベクターのみを含む Ｅ、コリの場合に得られたシグナルと比較して、該シグナル／ノイズ比を評価し た。更に、該組み換えクローンの免疫反応性が抗−マイコバクテリア抗体による ものか、あるいは正常な血清成分との反応によるものかを確認するために、選択 された組み換え体についてもう一つのＣＩＡを、ＴＢ血清および正常ヒト血清Ｎ １（Ｓ　（ごれらはＴＢ血清について以前に記載したものと類似の方法で、Ｌ三 グに吸収させた）を使用して実施した。選択的にＴＯ血清と反応し、かっＮＨ３ とは反応しないクローンのみが、疑いもなくマイコバクテリア抗原の存在を示唆 するものであると考えた。この免疫スクリーニング法を使用して、マイコバクテ リア抗原を発現することのできる、マイコバクテリアＤＮＡインサートをもつ組 み換えコロニーを同定する方法を以下に記載する。

−ニングの結果を示す図である。これらコロニーは一夜ニトロセルロース紙上で 成長させ、溶解して該クローン化マイコバクテリア抗原を放出させ、該抗体と反 応させた。マイコバクテリア抗原の存在は、該組み換えクローン内の定性的シグ ナルによって示され、該シグナルは、ｐＢＲ３２２ベクターのみを含むコロニー からなる負のコントロール中には存在しない。同様なアッセイを、正常なヒト血 清を使用して繰り返し、該クローン化マイコバクテリア抗原の特異性を確認した 。リスクリーニングされ、ＢＣＧ起源の１４クローン（パネルＡ）およびＨ３７ Ｒｖ起源の２クローン（パネルＢ）が明確な強いシグナルを示し、このことはこ れらのクローンが免疫反応性をもつことを示している（第１図）。これら全ての クローンを、Ｎ１（Ｓとの反応性についてもテストした。しかしながら、ＮＨ３ に対して僅かな反応性を示した３種のクローンを除き、何れのクローンもＮＨ３ に対する反応性を示さなかった。このことは、これらが選択的にＴＯ血清と反応 するマイコバクテリア抗原を発現したことを示している。かくして、この手順は マイコバクテリア抗原をコードする組み換えクローンのゆるぎない同定をもたら した。この方法を、プラスミドまたはコスミドベクター中で調製された、マイコ バクテリア遺伝子バンクに一般的に適用して、少なくともイムノアッセイによる 検出限界まで、ＬＩＩＪ中で発現される遺伝子を同定できる。

Ｃ０免疫反応性のにボビスＢＣＧ　ＤＮＡ組み換え体の制限マツピングＴＢ血清 を使用して単離された免疫反応性のＢＣＧ組み換えＤＮＡクローンの４つのイン サートＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼによりマツピングした。第２図のパネ ルＢは、４つの組み換え体内のクローン化ＢＣＧ　ＤＮＡについて導いた、ゲノ ムＤＮＡ制限サイトマツプを示し、ここでＡはＳａｌ　Ｉ　、ＢはＢａＩＩＩＨ Ｉ　ＥはＥｃｏ　Ｒ１，ＧはＢｇｌ　ＩＩ、ＫはＫｐｎ　Ｉ　、　ＰはＰｖｕ　 ｌ　、　ＳはＳａｃ　Ｉ　、　ＸはＸｈｏ　ｌを表す。次いで、これらの制限サ イトマツプを、隨チューバークローシス／ＩＩＬボビスＢＣＧ（ヤング（Ｙｏｕ ｎｇ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、 　１９８５．８２．　ｐｐ、　２５８３−２５８７；　／”刄\ン （ｌ（ｕｓｓｏｎ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ、 Ｓ、Ａ、、　１９８７．８４．　ｐｐ、　１６７９−１６８R；　シニ ック（Ｓｈｉｎｎｉｃｋ）等、　Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｎｎｕｎ、、　１９８７． ５５．７：１７１８−１７２１）の５つの免疫優性抗原について前に作成したマ ツプと比較した（第２図、パネルＡ）。パネルＡおよびＢに示された制限サイト マツプは同一の縮尺で描かれているので、これら２者の間の差異は明らかである 。免疫反応性ＢＣＧ組み換えクローンの制限サイトマツプと、隨チューバークロ ーシス／！１ボビスＢＣＧの以前に特徴付けされた免疫優性抗原のマツプとの間 には、何等類似性をもつ領域が見られない。従って、これら４つの組み換え体中 の該クローン化ＢＣＧ　ＤＮＡインサートは新規であると結論付けることができ る。

該４つの免疫反応性ＢＣＧクローンの一つであるｐＭＢＢ５１Ａは、ＴＢ血清並 びにウサギ中に生じた抗−Ｈ３７Ｒｖポリクローナル抗血清を使用したウェスタ ンプロット分析において、Ｍｒ９０ｋＤのタンパクの存在を明らかにした（第３ 図）。幾つかの抗−マイコバクテリアモノクローナル抗体（ＴＢ２３、ＴＢ７１ ．　ＴＢ７２、ＴＢ６８、ＴＢ７８．エンゲルス（Ｅｎｇｅｒｓ）、Ｉｎｆｅｃ ｔ、ｌａｍｕｎ、、　１９８５．４Ｂ、　ｐｐ、　６０３−６０５）または正常 なヒト血清を使用したｐＭＢＢ５１Ａの同様なウェスタンプロット分析は、この ９０ｋＤの免疫反応性タンパクの存在を明らかにしなかった。このことは、ｐＭ ＢＢ５１ＡがＢＣＧ抗原をコードし、該抗原が以前にＢＣＧ中で同定されたもの とは異なり、結果として該抗原は新規なものであることを示している。

Ｂ、ｐＭＢＢ５１Ａのヌクレオチド配列の決定この新規なりＣＧ抗原を更に特徴 付けするために、ｐＭＢＢ５１Ａ　ＤＮＡインサートをヌクレオチド配列決定に かけた。ｐＭＢＢ５１Ａ内に含まれるＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩインサートを、付 随的な制限酵素開裂サイトにつきマツピングした。これは、この配列内に少なく とも１個のＰｓｔｌサイトと３個のＳａｌ　ｌサイトが存在することが決定され た。Ｓａｌ　ｌ　、　Ｂａｎｌｌ１１およびＳａｌ　Ｉ　ＳＢａｍＨｌおよびＰ ｓｔｌ、並びにＰｓｔ　Ｉおよび５ａ１１の単一および二重の消化により得られ たオーバーラツプフラグメントを、ＤＮＡ配列分析の準備として、Ｍ１３＋ｎｐ １８およびＭＩ３ｍｐ１９ベクター内でサブクローニングした。次いで、ＤＮＡ 配列決定を、市販品として入手可能なキット、例えばファルマーシア（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）から入手したシーケナーゼ（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ）装置および甘装 置を使用して実施した。決定された配列から導かれたオリゴヌクレオチドを合成 し、これをプライマーとして使用して、より大きなインサートの配列を完成させ た。この配列決定中に幾つかの圧縮領域に遭遇したが、これらは該配列決定反応 においてｄｌＴＰを使用し、かつ反応条件を変更することによって解決された。

該ｐｌＪＢＢ５１ＡインサートＤＮＡの完全なヌクレオチド配列を、両ストラン ドのｄＧＴＰおよびｄｌＴＰを使用した配列決定により決定した。このｐＭＢＢ ５１ＡインサートのＤＮＡ配列は、ＧＣ含有率６７．１％をもち、長さが３．２ ５ｋｂであることが判定され、また第４図に示されている。

クローン化ｐＭＢＢ５１Ａの該３．２５ｋｂのＤＮＡ配列の決定（第４図）は、 該９０ｋ　ＤＢＣＧ抗原のアミノ酸配列の推定を可能とした。第４図において、 ヌクレオチドは該ｐＭＢＢ５１ＡインサートのＤＮＡの左端から番号付けされて いる。

３つの全ての読み取り枠における可能なＯＲＦについてのｐＭＢＢ５１Ａインサ ートＤＮＡ配列の研究は、一方のストランドに７６１個のアミノ酸をもつポリペ プチドをコードする２２８６ｂｐの最長のＯＲＦの存在を明らかにした。他方の ストランドは、３４９個のアミノ酸をもつポリペプチドをコードすることのでき る１０４７ｂｐのより小さなＵＲＦを有することが分かった。７６１個のアミノ 酸をもつ長いタンパクをコードする該最長のＯＲＦは、ウェスタンプロットに見 られる、見掛けの分子量９０ｋＤの該免疫反応性ＢＣＧタンパクに最も近い、７ ９ｋＤの推定された分子量に対応した。このタンパクの推定されたアミノ酸配列 は第４図のヌクレオチド配列の下方に与えられている。

ｐＭＢＢ５１ＡインサートＤＮＡ上のこのＯＲＦの位置は、何れかの側に存在す る、いかなる意味のあるＯＲＦをももたないフランキングＤＮＡ配列の長いスト レッチが存在するようなものである。これは、該ｐＢＲ３２２Ｔｅｔ遺伝子プロ モータからのこのＯＲＦの発現を阻止し、またその代わりに、このＯＲＦはｐＭ ＢＢ５１Ａ内のそれ自体のブロモを示唆した。

該ＯＲＦの直ぐ上流側の、Ｅ、コリの−３５、−１０およびンヤインーダルガル ノ配列と厳密に適合する調節配列（ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）等、 　Ａｎｎ吐Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅは全く十分に保存されている。配列決定された他 のマイコバクテリアプロモータ（ゾール（Ｄａｌｅ）等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ 　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、　Ｃｈａｐ、　 ８．　ｐｐA　１７ ３−１９８　（１９９０））は、上記３つの領域−３５、−１０およびＳＤ全て において該堕三茫のコンセンサス配列とは異なっているが、ｐＭＢＢ５１Ａ　Ｄ ＮＡ調節エレメントは−３５およびＳＤ配列エレメントにおいて１三竺と最大の 配列同一性の程度を示すが、各エレメントにおける単一の不一致およびプリブナ ウ配列における配列同−性約５０％をもつ。上記特徴の全ては、明らかに該領域 がｐＭＢＢ５１Ａ内に含まれるマイコノくクチリア遺伝子のプロモータ領域であ ることを示した。このＢＣＧプロモータ配列と、的な活性を説明している。この ＯＲＦ中の翻訳開始コドンは位置５０８におけるＡＴＧであり、一方で単一の翻 訳終止コドンＴＧ＾は位置２７９０に同定された。ステムおよびループ配座を形 成し得る強力な転写終止構造がこのＯＲＦの３°領域内に同定された。かくして 、このｐＭＢＢ５１Ａ　ＯＲＦは、オペロンではなく寧ろモノシストロン性遺伝 子を表した。ＭＢＢ５１Ａｉ貴伝子の該プロモータ領域は、Ｅ、　）　ＩＪ並び にマイコノくクチリア中での遺伝子発現を可能とする。このプロモータ配列は堕 三迭内でのマイコバクテリア遺伝子を発現させるのに有用である。更に、このプ ロモータ配列はマイコバクテリア中での相同性および／または非相同性遺伝子を 発現させるのに利用することも可能であり、従ってマイコバクテリア中に遺伝子 発現系を発生させるためのキーエレメントを与える。

該ＭＢＢ５１Ａタンパクの可能な生物学的機能に関する情報を導き出すために、 円Ｒプロティンデータベースリリース（ＰＩＲＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄａｔａｂａｓ ｅ　Ｒｅ１ｅａｓｅ）　２０（第１表）およびジーヌバンクヌクレイックアシッ ドデータベース（Ｇｅｎｅｂａｎｋ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＤａｔａｂａｓ ｅ）　（第１Ｉ表）中の入手可能な配列に対する相同性につき、す・ツブマン＆ ビアーソン（Ｌｉｐｍａｎ　ａｎｄ　Ｐｅａｒｓｏｎ）、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ、１９８８．８５．@ｐ。

２に記載のファストＡ（Ｆａｓｔ　Ａ）プログラム一式を利用して探究するのに 、このタンパクのアミノ酸配列を使用した。このＭ８Ｂ５１Ａタンパクの配列は 、ノくクチリアから哺乳動物に至る異なる生物由来の一群のイオン−移動性ＡＴ Ｐアーゼに対して相同性を示した。クツプル（ｋｔｕｐｌｅ）　２による研究か らの最良のスコア１３が、第１表の上部パネル内に示され、またクツプルｌによ る研究から得た最良のスコア１０が下方のパネルに示されている。各場合におい て、ＭＢＢ５１Ａタンパクは、Ｓ、フェカリス（ｆａｅｃａｌｉｓ）　（ソリオ ッツ（Ｓｏｌｉｏｚ）等、　１９８７）に対して、Ｋ゛輸送ＡＴＰアーゼに対し て３１．９％の同一性をもつ５９３アミノ酸の重なりにおいて最大の相同性（７ ５，９％について観測された（同一性２４．２％をもつ３９７アミノ酸の重なり における相同性６８．８％）。より低い程度の相同性も、異なる生物由来のＨ＋ 　、Ｃａ＋４およびＮａ”　−ＡＴＰアーゼについて観測された。かくして、相 同性研究の結果は、ＭＢＢ５１Ａタンパクが隨ボビスＢＣＧのイオン−移動性Ａ ＴＰアーゼであり、かつ他のバクテリア性イオン−移動性ＡＴＰアーゼと密接に 関連していることを示した。これが、マイコバクテリア中のかかるＡＴＰアーゼ のクローニングおよび同定に関する最初の報告である。

このＢＣＧのイオン−移動性ＡＴＰアーゼは、他のイオン−移動性ＡＴＰアーゼ との相同性を示し、その重なり領域はＳ、フェカリスの場合の５９３アミノ酸か ら、屋上４パ＝　（Ｌ、ｄｏｎｏｖａｎｉ）　（メアド（Ｍｅａｄｅ）等、　Ｍ ｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　１９８７．７．　ｐｐ、　３９３７−３９４ ６）の場合の８２アミノ酸までのサイズ範囲に渡るが、配列同一性または保存領 域の殆どは該ＭＢＢ５１ＡタンパクのＣ−末端側半分に局在していた。更に、Ｍ ＢＢ５１ＡタンパクのＣ−末端側半分におけるアミノ酸３０個をもつ領域が、こ れらＡＴＰアーゼの殆どを与えられており、結果としてこのことは該領域の機能 的な重要性を示唆している。Ｓ、フェカリスおよびＥ、コリのに’　ＡＴＰアー ゼとＭＢＢ５１Ａタンパクとの細部に渡る整合性も、数個の残基がこれら３種の ＡＴＰアーゼ間で保存されており、バクテリアからヒトまでの全てのＡＴＰアー ゼにおいて不変であるものを含む。

座　簡単な定義　初期スコア　最適値 ＞Ａ２９５７６　カリウム輸送ＡＴＰアーゼ、ストレプトコッカス　５４７　７ ９２＞ＰＷＥＣＢＫ　カリウム輸送ＡＴＰ　７−ゼ、β−鎖−Ｅ、コリ　３１４ 　２７０＞Ａ２５９３９　プロトン輸送ＡＴＰアーゼーアカパンカビ　１６８　 １８６＞Ａ２５８２３　プロトン輸送ＡＴＰアーゼー酵母　１６６　１８４＞Ｐ ＷＲＢＦＣカルシウム輸送ＡＴＰアーゼーファストトウィッチ１５２　１５８骨 格（ｆａｓｔ　ｔｗｉｔｃｈ　５ｋｅｌｅ）＞ＰＷＲＢＳＣカルシウム輸送ＡＴ Ｐアーゼースロートウィッチ　１３５　１５７骨格（ｓｌｏｗ　ｔｗｉｔｃｈ　 ５ｋｅｌｅ）＞Ａ２５３４４　カリウム輸送ＡＴＰアーゼ、ラット　７８　１５ ５＞ＲＤＥＢＨＡ　水銀リダクターゼ、フレキスナー赤痢菌　９９　１４２＞Ｒ ＤＰＳＨＡ　水銀リダクターゼ（トランスポゾンＴｎ５０１）　７４　１２４＞ ＲＧＰＳＨＡ　水銀リダクターゼ、オペロン調節Ｐ　７９　１０９＞Ａ２４６３ ９　ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ　α　９２８２＞Ａ２４４１４　ナ トリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ　α　９２８２＞Ｂ２４８６２　ナトリウ ム／カリウム輸送ＡＴＰ７−ゼ　β　８３８２該円Ｒプロティンデータベース（ ９１２４配列中に２３７８６１１残基）をファスタ（ＦＡＳＴＡ）プログラムに 従って走査した。元の初期スコアの平均は２７．２であり、標準偏差は６．９で あった。７５．６を越える初期スコアの平均を越える標準偏差は、通常の生物学 的な相関性を示す有意なレベルである６である。最適値は、一般的に該配列内に ギャップを導入することにより、関連タンパクの該初期スコアを改善するであろ う。相関をもたない配列は、通常最適化によってそのスコアは改善されない。

＞Ａ２９５７６　カリウム輸送ＡＴＰアーゼ、ストレプトコッカス　７４４　７ ９２＞ＰｆｉｃＢＫ　カリウム輸ＵＴＰ　７−ゼ、β−鎖−Ｅ、コリ　３８６　 ２７０＞Ａ２５９３９　プロトン輸辺計アーゼーアカパンカビ　３１０　１８６ ＞Ａ２５８２３　プロトン輸送＾πアーゼー酵母（サツカロミセス’）　３１７ 　１８４＞８２４６３９　＋トリウム／カリウム輸送ＡＴＰ　７−ゼ　（ｌｃ＋ 　１５８　１６３＞Ａ２４６３９　ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ　ａ ｃｈ　１７５　１６０＞Ｃ２４６３９ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ　 α（Ｉ＋　１９２　１５９＞ＰＩＩＲＢＦＣカル’、ｙ　ラム輸送ＡＴＰ　７− ゼー７７７、トドウィッチ２４ｏ１５８骨格（ｆａｓｔ　ｔｗｉｔｃｈ　５ｋｅ ｌｅ）＞ＰＷＳＨＮＡ　ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰ　７−ゼ　α骨格　２ １４　１５８＞Ａ２４４１４　ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼ　α鎖　 ２１４　１５８第１Ｉ表：ジーヌバンク核酸配列データベースに対するＭＢＢ５ １＾アミノ酸配列の相同性研究の結果 クツプル：２ 座　簡単な定義　初期スコア　最適値 ＞５ＴＲＡＴＰＫ　ｓ、　７　ｘカリＸ、　Ｋ　”　ＡＴＰ　７−ゼ９完全ｃｄ ｓ、　５３７　８００＞ＥＣ０ＫＤＰＡＢＣＥ、コリｋｄｐＡＢＣオペｏ　ン（ Ｋｄｐ−ＡＴＰ７−ゼをコード＞　３１４　２７０＞ＹＳＰＰＩＭＩＡ　Ｓ、ポ ンプ（ｐｏｍｂｅ）　Ｈ”　ＡＴＰアーゼ、完全ｃｄｓ、１３５　１８８＞ＮＥ ＵＡＴＰＡＳＥ　アカパンカビ原形質膜ＡＴＰアーゼ、完全　１３３　１８６＞ ＮＥＵＡＴＰＰＭ　アカパンカビ原形質膜Ｈ”　ＡＴＰアーゼ　１３１　１８６ ＞ＹＳＣＰＭＡＩ　原形質膜ＡＴＰ７−ゼに対する酵母ＰＭＡＩ　１６６　１８ ４＞Ａ１７８８９　第２図、Ｌ、ドノバ：ＡＴＰ　７−ゼ（７）Ｎおよび　１６ ６　１７０＞ＭＩ２８９８　兎ファストトウィッチ骨格筋Ｃａ′＋ＡＴＰａｓｅ 　１４０　１５８＞ＲＡＢＡＴＰＡＣ兎Ｃａ十Ｍｇ依存性Ｃａ”ＡＴＰａｓｅ　 ｍＲＮＡ、　ｃｏ　１４２　１５７＞ＮＲＩＭＥＲプラスミドＮＲＩ水銀リダク ターゼ（ｍｅｒ）オペｏン１００　１４３、＞５ＴＲＡＴＰＫ　Ｓ、フェカリス 、　Ｋ　’　ＡＴＰアーゼ、完全ｃｄｓ、　７４４　８００＞５ＹＮＣＡＴＰＳ Ｂ　ンアノバクテリウムシネココッカス（Ｃｙａｎｏ−３７９４２２ｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ　５ｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ）６３０１　ＤＮＡ　ｆｏｒ　ＡＴ＞［ ＩＣ０ＫＤＰＡＢＣＥ、コリｋｄｐＡＢｃオペロン（Ｋｄｐ−ＡＴＰアーゼをコ ード）　３７９　２７０＞ＹＳｒ’ＰＭＡＩＡ　Ｓ、ポンプ１ビＡＴＰアーゼ遺 伝子、完全ｃｄｓ、　２７５　１８８＞ＮＥＵＡＴＰＡＳＥ　Ｔ　力／　＜　： ／　７’Ｊビ原形質膜ＡＴＰ　７−ゼ遺伝子、完全　３１１　１８６＞ＮＥＵＡ ＴＰＰＭ　アカパンカビ原形質膜１１　’　ＡＴＰアーゼ　３０２　１８６＞Ｙ ＳＣＰＭＡＩ　原形質膜ＡＴＰアーゼに対する酵母ＰＭＡＩ遺伝子　３１７　１ ８４＞ＪＯ４００４Ｌ、ドノバニカチオン輸但ＴＰ３２２　１７０＞Ａ１７８８ ９　第２図、Ｌ、ドノバニのヌクレオチド配列　３０６　１７０＞ＲＡＴＡＴＰ Ａ２　ラットＮａ＋、に＋＾Ｗアーゼα（＋）イソ型　１５８　１６３接触型 町ヨｙ−のＫｄｐＢタンパクおよび多分Ｓ、フェカリスＫ（＾πアーゼは、ホス ホリル化およびデホスホリル化種間の酵素の環式転位を伴う、アスパルチルホス フェート中間体を形成することが知られているＥＩＥ２−ＡＴＰアーゼの構成員 である。他のＡＴＰアーゼとの類推から、該ホスホリル化Ａｓｐ残基（Ｄ）（フ ァースト（Ｆｕｒｓｔ）　、　Ｊ、　Ｂｉ。

＋、　ＣｈｅＩＬ、　１９Ｂ５．２６０．　ｐｐ、　５Ｏ−５２）は、ＭＢＢ５ １Ａ　ＡＴＰアーゼに内の位置４４３において同定された。この残基は、バクテ リア乃至ヒト由来のＡＴＰアーゼに内に保存されているペンタペプチド配列ＤＫ ＴＧＴの第一の残基であり、かつ触媒サイトの必須のエレメントを形成するはず である。同様に、ＭＢＢ５１Ａ　ＡＴＰアーゼの位置４００におけるプロリン（ Ｐ）は他のＡＴＰアーゼ中の不変のアミノ酸であることが分かつており、膜の覆 うドメイン内に位置しているものと予想される。このような膜埋設プロリン残基 は、輸送チャンネルの調節のために必要とされる、可逆的配座変化のために要求 されるものと推定されている（ブランドル（Ｂｒａｎｄｌ）等、　Ｐｒｏｃ、　 ＮＡＴＬ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、Ｓ、ん、　１９Ｂ６．８３．　ｐｐ、　９１７−９ ２１）。更に、他のイオン−移動性庸アーゼにおいて機能的に重要であると考え られている他の配列モチーフも、繭８Ｂ５１Ａ　ＡＴＰアーゼ内に保存されてい ることが分かった。これらは位置５２１におけるＧ１１（Ｇ）　（ファーレイ＆ ファーラー（Ｆａｒｌｅｙ　ａｎｄ　Ｆａｌｔｅｒ）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、、１９８５゜該ＭＢＢ５１Ａ　ＡＴＰアーゼは膜−関連ＡＴＰアーゼに 対して相同性であるので、ＭＢ８５１Ａタンパク中の該膜関連へリックスの特徴 付けはコンピュータアルゴリズムによつて実施した。ハイドロパン−プロフィー ル（ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ　ｐｒｏｆｉｌｅ）　（ラオ（Ｒａｏ）等。

ＢｉｏｃｈｅＩＬＢｉｏｐｈｙ、　Ａｃｔａ、、　１９８６．８６９．　ｐｐ、 　１９７−２１４）を利用して、該ＭＢＢ５１Ａタンパク内の７つの軽層ドメイ ンを同定し、以下の第１ＩＩ表および第５図に示した。

軽層ドメインの平均サイズは約２１残基である。というのは、２１残基がほぼ脂 質二重層（３２人）の非−極性位置の厚みに等しいα−へリックスに巻かれるか らである。しかしながら、軽層ドメインのこのサイズは、与えられた膜−関連タ ンパクの機能性によって決定した場合には、数個のアミノ酸の範囲内で幅をもつ 。ＭＢＢ５ＩＡタンパク中に同定された該軽層ドメインのサイズは２０〜３７残 基の範囲にある。

最初の６個の軽層ドメインは、バイトロバジ−プロフィールおよび疎水性モーメ ントのプロット両者によって示されるように、−回だけ該層に架かる。７番目の 軽層ドメインは該層を２度横切る。これらの特徴は、位置４００における膜埋設 プロリン（ｐ）と共に、イオン−移動性ＡＴＰアーゼのチャンネル輸送機能に一 致し、これらタンパクの配座における可逆的変化を包含する。このような軽層ド メインは、更にこの分子の細胞内および細胞外ドメインをも画成する。第５図参 照。

第１１１表 第５図の軽層ドメイン　アイゼンバーブ法　ラオ＆アーゴス法ＭＢＢ５１Ａ　Ａ ＴＰアーゼはそのＮ−末端に１５４個の余分のアミノ酸を有する（Ｓ、フエ力は 、これら２つのタンパク間の、広いドメイン構造の強い発展的な保存の明確な証 拠となり、これら２つのタンパクが同様な三次元構造の構成をもつ可能性を高め る。

バイトロバジ−プロフィールおよび二次構造予測に基づき、該ＭＢＢ５１Ａ　Ａ ＴＰアーゼの模式的モデルを第５図に示した。このモデルは、膜を一回横切る少 なくとも７つの軽層ドメインを含み、これらは第５図に、各アミノ酸の位置と共 に示されている。このモデルは、更に該ＭＢＢ５１Ａタンパクの細胞外および細 胞内ドメインを画成する。他のイオン−移動性ＡＴＰアーゼにおいて機能的に重 要であることが示されており、かつ該ＭＢＢ５１Ａタンパク中にも保存されてい る残基の多くも、図示されている。勿論、位置４００におけるプロリン（Ｐ）は 膜埋設性であり、一方で位置４４３におけるアスパラギン酸（Ｄ）、位置５２１ におけるグリシン（Ｇ）および位置６４６におけるアラニン（Ａ）は細胞質に面 している。

ＭＢＢ５１Ａイオン−移動性ＡＴＰアーゼをコードする遺伝子が、ビルレント菌 株１４％性、非−病原性のマイコバクテリアにおいても存在するか否かを判定す るために、上記種由来のゲノムＤＮＡとのサザーンブロットハイプリダイゼーシ ョンを、プローブとしてｐＭＢＢ５１Ａ由来のＢＣＧインサートＤＮＡを使用し て実施した。第６図に示した如く、このｐＭＢＢ５１ＡインサートＤＮＡとハイ ブリッド形成可能なりＮＡも、（そ’／　ＸＨ３７Ｒｖ同族体が、ｋボビスＢＣ Ｇ　ＤＮＡに見られるように、類似の遺伝子的構成をもち、３．２５ｋｂのＢａ ５ＩＩ（＋フラグメント上に存在することを示した。

化学的、免疫学的、診断学上および治療上の問題を処理することを可能とする。

このような血清学的テストは高度に特異的である。というのは、上に記載し、か 法によって決定される抗原決定基を使用するからである。このような血清学的テ ストは、結核の初期の診断に対して有用であり、かくして初期治療並びに該疾患 の感染者から他の人々への伝播を制限することが可能となる。

結核に対する耐性は、細胞媒介免疫によって与えられる。本明細書で同定した該 抗原は、更に該抗原のどのセグメントカ曳チューバークローシス特異的Ｔ−細胞 によって認識されるかを決定するのに利用することができる。ヘルｔ　（−７− 細胞によって認識されるペプチド混合物は、患者並びにその接触者の免疫学的状 態を評価するのに使用する特異的皮膚テスト抗原を与える。このようなペプチド の混合物は、また候補ワクチンの免疫学的有効性を迅速に評価するのに有用であ る。その上、隨チューバークローシス特異的Ｔ−細胞によって認識されたペプチ ドは、該疾患に対するワクチンの成分となり得る。

ｐＭＢＢ５１Ａ　ＤＮＡインサートの完全なヌクレオチド配列の知見は、マイコ ノくクチリアゲノムＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅用の適当なプライマーを設 計するのに利用できる、配列情報の豊富な源を与える。ＢＣＧの該イオンー移動 性ＡＴＰアーゼは、全てのマイコバクテリア種について同一であると予想される （例えば、ＡＴＰ結合サイトに関して）、シっかりと保存された配列の領域およ び異なるマイコノ（クチリア種においては異なっている、（例えば、Ｎ−末端領 域に関する）配列多様化領域をもつ。この知見によれば、プライマーを該保存領 域または該多様化領域の何れかに基いて設計して、与えられたサンプル中で、該 タープ・ットＤＮＡがマイコノくクチリア由来であるか、非−マイコバクテリア 由来であるかを同定することができ、またマイコバクテリアＤＮＡの場合には、 該ＤＮＡがどのマイコバクテリア種に属するかを同定できる。

このような増幅スキームは、高感度カリ高度に特異的なＰＣＲ増幅に基く、マイ コバクテリアの診断法を開発するのに有用である。該３．２５ｋｂのｐＭＢＢ５ ］Ａ　ＤＮＡインサートかにチューバークローシスＨ３７Ｒｖおよび間、ボビス ＢＣＧ中に存在し、かつ無毒性のにバラカニおよび隨スメグマチス（これら種間 の生物学的差異の他の局面に関連をもつ）中には存在しないという観測は、ビル レンス、成長特性および代謝に現れる。

組み換えワクチンも、本発明の膜−関連ポリペプチド全体またはその一部をコー ドするＤＮＡを、適当なワクチンビークルに組み込むことにより構成し得る。例 えば、７９ｋＤＫボビスＢＣＧタンパクまたは該タンパクの一部をコードするＤ ＮＡ全体または、その一部を、該ＤＮＡを発現し慢るワクチンビークルに組み込 むことが！きる。このようなワクチンビークルはワクシニアウィルス等のウィル ス、またはマイコバクテリア、サルモネラ、ビブリオ、バチル灸、エルシニア、 ボルデテラ等のバクテリアであり得、これらを投与した個体に対して長時間に渡 、り免疫性を付与することのできるワクチンを生成する。

該７９ｋＤＢＣＧイオンー移動性ＡＴＰアーゼの特別な特徴は、このものが膜− 結合抗原である点にある。従って、対象とする抗原エピトープ（Ｂ−細胞エピト ープまたはＴ−細胞エピトープ）をコードする外来ＤＮＡと、該遺伝子またはそ の一部とを、免疫原として使用される該外来エピトープを発生するように、結合 するのに該ＡＴＰアーゼを使用できる。このような結合は、ＭＢＢ５１Ａタンパ クの細胞外または細胞内ドメインに、あるいはこれら両型のドメインの組み合わ せに組み込むことができる。ＭＢＢ５１Ａ　ＤＮＡへの免疫原性外来エピトープ の組み込みは、当業者には公知の櫟準的組み換えＤＮＡ法によって達成される。

これら方法の幾つかは、固有の制限サイト、インビトロ変移誘発および／または ＰＣＲ−関連法の利用を含む。このような便利な方法の一つは外来遺伝子が挿入 された該ＭＢ８５１Ａ　ＤＮＡ中の位置１０９０における固有のＮｄｅｌサイト の使用を包含する。細胞表面上でのエピトープのグラフト化は該バクテリア細胞 上に十分に露出した該エピトープによる迅速な抗体応答を誘発し、これは順にＢ 細胞の直接的活性化に導く。更に、エピトープの細胞内局在化はＢ細胞記憶およ び有利なＴ細胞応答を誘発する。種々の病原体に対する免疫応答に関与すること が知られている興味あるエピトープの例は、Ｅ、コ曝几Ｔトキシン、脚および口 腔疾患ウィルス、ＨＩＶ　、コレラトキシン等由来のエピトープを包含する。

かくして、該７９ｋＤ抗原は種々の病原体に対する組み換えワクチンを設計する 上で有用である。かかるワクチンは、マイコバクテリアの該７９ｋＤ膜一関連タ ンパク全体またはその一部を発現し得る組み換えワクチンビークルを含み、該バ クテリア中には細胞膜の外表面および／またはその内側に外来エピトープが発現 されるように、該外来エピトープが組み込まれており、かくして該外来エピトー プは免疫原性とされる。この目的で使用する該ワクチンビークルは、例えばＢＣ Ｇに対しては培養可能なマイコバクテリアであり得る。これら用途において、該 ＢＣＧイオンー移動ＩＴＰアーゼは、マイコバクテリアのシャトルベクター上に 生じ、あるいはまた該免疫原性ポリペプチドの抗原性エピトープをコードする外 来ＤＮＡは、該イオンー移動’ｅｂＴＰアーゼ遺伝子中への相同組み込みまたは ランダム組み込みを介して、該マイコバクテリアゲノムに挿入することができる 。このような方法は、対象とする細胞質の表面上および／またはその内部に抗原 性配列を発現できる安定な組み換えマイコバクテリア菌株を生成し、これは例え ば種々の感染性病原体に対する予防を可能とする。組み換え抗原の該細胞壁への 攻撃は、マイコバクテリア細胞壁の高い免疫原性のためばかりが、Ｈｆｆ血清反 応陽性の高い罹患率をもつ集団への生ワクチンの導入との関連から魅力あるもの である。また、該ＭＢ８５１Ａタンパクに基いて、生ではない、免疫原性組み換 え細胞表面サブユニットワクチンも、該生ワクチンの有用な代替品を開発するこ とを可能とする。更に、他のバクテリア、ウィルスまたは原生動物ワクチンビー クルを、かがる組み換えワクチンを生成するように形質転換できた。強力なワク チンビークルの例はワクシニアウィルス、ポックスウィルス、サルモネラ、エル シニア、ビブリオ、ボルデテラ、バチルス等を包含する。

更に、このような方法を利用して、異なる病原体の多数の予防性エピトープ／抗 原の同時の発現を可能とする多価組み換えワクチンも設計できた。

笠年惣 当業者は、日常的な実験程度のものを利用して、本明細書に具体的に記載された 特定の物質並びに成分に対する多くの等価物を認識し、もしくは確認できるであ ろう。かかる等価物は以下の請求の範囲内に含まれることを意図している。

配列表 （１）一般的情報 （Ｄ　出願人：マンシ、アニル（Ｍｕｎｓｈｉ、　Ａｎｉｌ）；カブール、アル カーナ（Ｋａｐｏｏｒ、　Ａｒｃｈａｎａ）（ｉｉ）　発明の名称：マイコバク テリアの膜−関連免疫原（ｉｉｉ）配列数：２ （ｉｖ）　通信用住所 （Ａ）宛名人：リチャードＦ、）レカルチン（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｆ、　Ｔｒｅｃ ａｒｔｉｎ）（Ｂ）通り名＝４エンパルカプロセンター、スート３４００（Ｃ） 車名：サンフランシスコ （Ｄ）州名：カリフォルニア ＜Ｂ）国名：米国 （Ｆ）郵便番号：　９４１１１ （Ｖ）コンピュータ読み取り形式 （Ａ）媒体型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピュータ：　ＩＢＮ　ＰＣコンバーチプル（Ｃ）演算装置：　ＰＣ− ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯＳ（Ｄ）ソフトウエア：バテンチンリリース＃１．Ｏ，バー ジョン＃１．２５（ｖｉ）　一般的出願データ （Ａ）出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ／９３／（Ｂ）出願口＋　１９９３年、６月２ ８日（Ｃ）分類： （ｖｉｉｉ）代理人情報 （＾）名前：トレカルチンリチャードＦ。

（Ｂ）登録番号：　３１．８０１ （Ｃ）照会事件番号：　ＦＰ−５７００４／ＲＦＴ（ｉｘ）　電信情報 （Ａ）電話番号：　（４１５）　７８１−１９８９（Ｂ）ファックス番号：　（ ４１５）　３９Ｂ−３２４９（２）　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　ｌに関する情報＝ （ｉ）配列の諸特徴 （Ａ）長さ：　３２５０　ｂｐ （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）ストランド性ニー重鎮 （Ｄ）トポロジー：線形 （ｉｉ）　分子型：ＤＮＡ（ゲノム） （ｉｘ）　特徴 （Ａ）名称／キー：　ＣＤ５ （Ｂ）位置：５０８・・・−・２７９０（ｘｉ）　配列の記載：　ＳＥＱ　１０ 　ＮＯ：　ＩＧＧＡＴＣＣＣＧＣＧ　ＧＴＣＡＴＣＧＡＴＣＧＧＧＴＣＡＡＡＣ Ａ　ＣＣＧＣＣＴＣＧＡＣＧＧＧＴｒＣＡＣＧＣＴＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＴＣＣ ＡＣＣＧＣＣＧＣＧＧＧＡＧＧＴＧ　ＧＴＧＧＣＣＧＧＣＡ　ＧＣＣＡＣＧＣＡ ＴＣＴＡＣＴＡＣＧＧＣＡ　ＣＣＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＧＴＧＡＣＣＡＡ　ＴＡ ＣＣＴｒＣＡＣＴ　ＧＣＧＡＧＣＧＣＡＣＣＣＧＣＡＡＣＣＧＧ　ＣＴＧＣＡＣ ＣＡＣＧ　ＡＡＣＴＣＧＧＣＧf ＴＡＴＧＧＣＣＧＴＣＧＡＡＡＴＧＧＡＡＧ　ＧＣＧＧＴＧＣＧＧＴ　ＧＧＣＧ ＣＡＡＡＴＣＴＧ印ＣＧＴＣＣＴ　ＴＣＧＡＴＡπＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＣＡ ＴＴＣＧＣＧＣＧＣＴＣＴＣＣＧＡＴＣＴ　ＣＧＣＣＧＧＡＧＣＣＧＡＴＴＣＧ ＧＧＧＧπ石ＡＣ宵ＣＡＭＴＣＧＧｍＧＴＣＧＧＣＧＡＧＧＴＧＧ　ＣＧＧＣＣ ＡＧＴＴＣＧＧＣＣＣＧＣＧＴＴ　ＣＴＧＣＴＧＣＧＣＴ　ＴＧＣＴＧＣαＩＴ ＧＴＴＧＡＣＧＧＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＣＴＡＴＣＣＧＣＣＧＧＴＧＣ ＧＴｒＣＡＣＣＧＣＧＴＣＡＧ　ＧＣＧＧＣＴｒＣＧＧＴＧＡＧＧＴＧＡＧＴ　 ＡＡｍＧＧＴＣＡ　ＴｒＡＡＣＴＴＧＧＴ　ＣＡＴＧＣＣＧＣＣＧ　ＣＣＧＡＴ ＧＴｒＧＡ　Ｇα；ＧＡＧＧＣＣＡＣＡＧＧＴＣＧＧＣＣＧＧＡＡＧＴＧＡ圓Ａ ＧＣＣＡＣＧ　ＡπＡＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＴＧ　ＡＣＣＧＧＴ　Ｇ品Ｍｅｔ 　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＣＡＣＣＡＣＧＣ Ｇ　ＡＧＴ　ＧＴＧ　ＣＡＧ　ＣＧＧ　ＡＴＡ　ＣＡＡ　ＣＴＣＡＧＡ　ＡＴＣ ＡＧＣＧＧＧ　ＡＴＧ　ＴＣＧＨｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｉ ｎ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅ ｔ　５ｅｒＴＧＣＴＣＴ　ＧＣＧ　ＴＧＣＧＣＣＣＡＣＣＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＡ 　ＴＣＧ　ＡＣＣＣＴＣＡＡＣＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＣＧＣｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ 　Ｃｙｓ　Ａｌａ　１（ｉｓ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅ ｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ＰｒB ＧＧＧ　ＧＴＴ　ＣＧＧ　ＧＣＡ　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＭＣＴＴＣＧＧＣＡＣＣＣ ＧＧ　ＧＴＧ　ＧＣＡ　ＡＣＣＡＴＣＧＡＣＧｌｙ　Ｖａｔ　Ａｒｇ　Ａｌａ　 Ａｌａ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　ｌｉｅ　ＡｓｐＡＣＣＡＧＣＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＴＣＧＡＣＧＣＴ　Ｇ ＣＣＧＣＧ　ＣＴＧ　ＴＧＣＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＴＣＣＧＣＣＧＣＴｈｒ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙ ｓ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　ＡｒｇＧＣＧ　ＧＧＣＴＡＴ　ＣＡＧ　 ＧＣＣＧＡＴ　ＣＴＧ　ＴＧＣＡＣＧ　ＧＡＴ　ＧＡＣＧＧＴ　ＣＧＧ　ＡＧＣ ＧＣＧ　ＡＧＴＡｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ＾ｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｃｙ ｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　５ｅｒＧＡＴ 　ＣＣＧ　ＧＡＣＧＣＣＧＡＣＣＡＣ［；ＣＴ　ＣＧＡ　ＣＡＧ　ＣＴＧ　ＣＴ Ｇ　ＡＴＣＣＧＧ　ＣＴＡ　ＧＣＧ　ＡＴＣＡｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　 Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　 Ｌｅｕ　Ａｌａ　１ｌｅＧＣＣＧＣＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ｍ　ＧＴＧ　ＣＣＣＧＴ Ｇ　ＧＣＣＧＡＴ　ＣＴＧ　ＴＣＧ　ＧＴＧ　ＡＴＧ　ｍ　ＧＧＧＡｌａ　Ａｌ ａ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｌｅ ｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｐｈｅ　ＧｌｙＧＴＣＧＴＧ　ＣＣＴ　ＧＣＣＡ ＣＧ　ＣＧＣＴＴＣＡＣＣＧＧＣＴＧＧ　ＣＡＧ　ＴＧＧ　ＧＴＧ　ＣＴＡ　Ａ ＧＣＧＣＧＶａｌ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ 　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｉｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＡｌａＣＴＧ　 ＧＣＡ　ＣＴＧ　ＣＣＧ　ＧＴＣＧＴＧ　ＡＣＣＴＧＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＴＧ Ｇ　ＣＣＧ　ｍ　ＣＡＣＣＧＣＧＴＴ１、ｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｖａ ｌ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｈｉ ｓ　Ａｒｇ　ＶａP ＧＣＧ　ＡＴＧ　ＣＧＣＭＣＧＣＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＣＡＴ Ｇ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＣＴＡ　ＡＴＣＡｌａ　Ｍｅｔ＾ｒｇ　Ａｓｎ　Ａｌａ　 Ａｒｇ　）ｌｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ 　Ｌｅｕ　１ｉｅＴＣＧ　ＧＴＣＧＧＴ　ＡＴＣＡＣＧ　ＧＣＣＧＣＣＡＣＧ　 ＡＴＣＴＧＧ　ＴＣＧ　ＣＴＧ　ＴＡＣＡＣＣＧＴＣＴＴＣＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｇ ａｙ　ｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ｌｌｅ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ｌ ｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＰｈｅＧＧＣＡＡＴ　ＣＡＣＴＣＧ　ＣＣＣＡ ＴＣＧＡＧ　ＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＴＡ　ＴＧＧ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　Ｃ ＴＧＧｌｙ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓｅ ｒ　Ｇｌｙ　ｌｌｅ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＧＧＡ　ＡＧＣ ＧＡＴ　ＧＣＴ　ＡＴｒ　ＴＡＴ　ＴｒＣＧＡＧ　ＧＴＣＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＧ Ｔ　ＧＴＣＡＣＧ　ＧＴ（宵ＣＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｔｙ ｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａ ｌ　ＰｈｅＧＴＧ　ＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＣＧＧ　ＴＡＴ　ＴＴＣＧＡＧ　 ＧＣＧ　ＣＧＣＧＣＣＭＧ　ＴＣＧ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＶａｔ　Ｌｅｕ　 Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　 Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ＧｌｙＡＧＴ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＡＧＡ　Ｇ ＣＣＴｒＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＣＴＧ　ＡＧＣＧＣＣＭＧ　ＧＭ　ＧＴＡ　ＧＣ ＣＧＴＣＳｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｖａ１ＣＴＧ　Ｃ ＴＡ　ＣＣＧ　ＧＡＴ　ＧＧＧ　ＴＣＧ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＧＴＣＡＴＣＣＣＧ 　ＧＣＣＧＡＣＧＡＡ　ＣＴＣＡＡＡＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ 　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　ｖａｌ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ 　Ｌｅｕ　ＬｙｓＧＭ　ＣＡＧ　ＣＡＧ　ＣＧＣＴＴＣＧＴＧ　ＧＴＧ　ＣＧＴ 　ＣＣＡ　ＧＧＧ　ＣＡＧ　ＡＴＡ　ＧＴｒ　ＧＣＣＧＣＣＧＡＣＧｌｕ　Ｇｌ ｎ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｉ ｎ　ｌｌｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　ＡｓｐＧＧＣＣＴＣＧＣＣＧＴＣＧＡＣ ＧＧＧ　ＴＣＣＧＣＴ　ＧＣＧ　ＧＴＣＧＡＣＡＴＧ　ＡＧＣＧＣＧ　ＡＴＧ　 ＡＣＣＧｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａ ｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　ＴｈｒＧＧＣＧＡＧ 　ＧＣＣＡＡＡ　ＣＣＧ　ＡＣＣＣＧＧ　ＧＴＧ　ＣＧＴ　ＣＣＧ　ＧＧＧ　Ｇ ＧＧ　ＣＡＧ　ＧＴＣＡＴＣＧＧＣＧｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　 Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　 ｌｉｅ　ＧｌｙＧＧＣＡＣＣＡＣＡ　ＧＴＧ　ＣＴＴ　ＧＡＣＧＧＣＣＧＧ　Ｃ ＴＧ　ＡＴＣＧＴＧ　ＧＡＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＣＧ　ＧＴＧＧｌｙ　Ｔｈｒ　 Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ｖａｌ　 Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａ１ＧＧＣＧＣＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧ　′ ＴＴＣＧＣＣＧＧＡ　ＡＴＧ　ＧＴＣＣＧＣＣＴＣＧＴｒ　ＧＡＧ　ＣＡＡ　Ｇ ＣＧＧｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｍｅ ｔ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　ＡｌａＣＡＧ　ＧＣＧ 　ＣＡＡ　ＡＡＧ　ＧＣＣＧＡＣＧＣＡ　ＣＡＧ　ＣＧＡ　ＣＴＡ　ＧＣＣＧＡ ＣＣＧＧ　ＡＴＣＴＣＣＴＣＧＧｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｓ ｐ　Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ｌｌｅ　Ｓｅ ｒ　５ｅｒＧＴＧ　ｍ　ＧＴＴ　ＣＣＣＧＣＴ　ＧＴＧ　ＴＴＧ　ＧＴｒ　ＡＴ ＣＧＣＧ　ＧＣＡ　ＣＴＡ　ＡＣＣＧＣＡ　ＧＣＣＧＧＡＶａｌ　Ｐｈｅ　Ｖａ ｌ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅ ｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ３６５　３７０　’　３７５ ＴＧＧ　ＣＴＡ　ＡＴＣＧＣＣＧＧＧ　ＧＧＡ　ＣＡＡ　ＣＣＣＧＡＣＣＧＴ　 ＧＣＣＧＴＣＴＣＧ　ＧＣＣＧＣＡ　ＣＴＣＴｒｐ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　Ａｌａ　 Ｇａｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　 Ａｌａ　Ａｌａ　ＬｅｕＧＣＣＧＴＧ　ＣＴＴ　ＧＴＣＡＴＣＧＣＣＴＧＣＣＣ Ｇ　ＴＧＴ　ＧＣＣＣＴＧ　ＧＧＧ　ＣＴＧ　ＧＣＧ　ＡＣＴ　ＣＣＧＡｌａ　 Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｔ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。

ＡＣＣＧＣＧ　ＡＴＧ　ＡＴＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣＴＣＴ　ＧＧＴ　ＣＧＣＧＧＴ 　ＧＣＣＣＡＧ　ＣＴＣＧＧＡ　ＡＴＡ　ｍＴｈｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｙ　ｌｉｅ　ＰｈｅＣＴＧ　ＡＡＧ　ＧＧＣＴＡＣＡＡＡ　ＴＣＧ　ＴｒＧ 　ＧＡＧ　ＧＣＣＡＣＣＣＧＣＧＣＧ　ＧＴＧ　ＧＡＣＡＣＣＧＴＣＬｅｕ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａ ｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｖａ１ＧＴＣＴＴＣＧＡＣＡＡＧ　Ａ ＣＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧ　ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＧＧＣＣＧＧ　ＣＴＧ　ＣＡＧ　Ｇ ＴＣＡＧＴＶａｌ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ 　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　５ｅｒＧＣＧ　 ＧＴＧ　ＡＣＣＧＣＧ　ＧＣＡ　ＣＣＧ　ＧＧＣＴＧＧ　ＧＡＧ　ＧＣＣＧＡＣ ＣＡＧ　ＧＴＧ　ＣＴＣＧＣＣＴＴＧＡｌａ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ 　Ａｌａ　ＬｅｕＧＣＣＧＣＧ　ＡＣＣＧＴＧ　ＧＭ　ＧＣＣＧＣＧ　ＴＣＣＧ ＡＧ　ＣＡＣＴＣＧ　ＧＴＧ　ＧＣＧ　ＣＴＣＧＣＧ　ＡＴＣＡｌａ　Ａｌａ　 Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　 Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ｌ１ｅＧＣＣＧＣＧ　ＧＣＡ　ＡＣＧ　ＡＣ Ｔ　ＣＧＧ　ＣＧＡ　ＧＡＣＧＣＧ　ＧＴＣＡＣＣＧＡＣｍ　ＣＧＣＧＣＣＡＴ Ａ０Ｉ９ Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｌａ　 Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　１ｌｅＣＣＣＧＧＣＣＧＣ ＧＧＣＧＴＣＡＧＣＧＧＣＡＣＣＧＴＧ　ＴＣＣＧＧＧ　ＣＧＧ　ＧＣＧ　ＧＴ Ａ　ＣＧＧ　ＧＴＧＰｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ 　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｖａ１ ＧＧＣＡＡＡ　ＣＣＧ　ＴＣＡ　ＴＧＧ　ＡＴＣＧＧＧ　ＴＣＣＴＣＧ　ＴＣＧ 　ＴＧＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＴＧ　ＣＧＣＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　 Ｔｒｐ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　 Ａｓｎ　Ｍｅｔ　ＡｒｇＧＣＧ　ＧＣＣＣＧＧ　ＣＧＣＣＡＣＧＣＣＧＡＡ　Ｔ ＣＧ　ＣＴＧ　ＧＧＴ　ＧＡＧ　ＡＣＧ　ＧＣＣＧＴＡ　ＴＴＣＧＴＣＡｌａ　 Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｖａ１ＧＡＧ　ＧＴＣＧＡＣＧＧＣ ＧＡＡ　ＣＣＡ　ＴＧＣＧＧＧ　ＧＴＣＡＴＣＧＣＧ　ＧＴＣＧＣＣＧＡＣＧＣ ＣＧＴＣ２１Ｉ Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　 Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｖａ１ＭＧ　ＧＡＣＴＣＧ 　ＧＣＧ　ＣＧＡ　ＧＡＣＧＣＣＧＴＧ　ＧＣＣＧＣＣＣＴＧ　ＧＣＣＧＡＴ　 ＣＧＴ　ＧＧＴ　ＣＴＧＬｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａ ｌａ　Ｖａｔ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌ ｅｕＣＧＣＡＣＣＡＴＧ　ＣＴＧ　ＴＴＧ　ＡＣＣＧＧＴ　ＧＡＣＡＡＴ　ＣＣ ＣＧＡＡ　ＴＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＣＣＧＴＧＡｒｇ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｌ ｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｖａ１ＧＣＴ　ＡＣＴ　ＣＧＣＧＴＣＧＧＣＡＴＣＧＡ ＣＧＡＧ　ＧＴＧ　ＡＴＣＧＣＣＧＡＣＡＴＣＣＴＧ　ＣＣＧ　ＧＭＡｌａ　Ｔ ｈｒ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｖａｔ　Ｉｌｅ　Ａ ｌａ　Ａｓｐ　ｌｌｅ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　ＧｌｕＧＧＣＡＡＣＧＴＣＧＡＴ　Ｇ ＴＣＡＴＣＧＡＧ　ＣＡＧ　ＣＴＡ　ＣＧＣＧＡＣＣＧＣＧＧＡ　ＣＡＴ　ＧＴ ＣＧＴＣＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　 Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ｖａ１ＧＣＣＡＴ Ｇ　ＧＴＣＧＧＴ　ＧＡＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＧＡＣＧＧＡ　ＣＣＣＧＣＡ　Ｃ ＴＧ　ＧＣＣＣＧＴ　ＧＣＣＡｌａ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ 　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ＾Ｉａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　 ＡｌａＧＡＴ　ＣＴＡ　ＧＧＣＡＴＧ　ＧＣＣＡＴＣＧＧＧ　ＣＧＣＧＧＣＡＣ Ｇ　ＧＡＣＧＴＣＧＣＧ　ＡＴＣＧＧＴ　ＧＣＣＡｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅ ｔ　Ａｌａ　ｌｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｌ ａ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　ＡｌａＧＣＣＧＡＣＡＴＣＡＴＣＴｒＧ　ＧＴＣＣＧＣＧ ＡＣＣＡＣＣＴＣＧＡＣＧＴＴ　ＧＴＡ　ＣＣＣＣＡＴ　ＧＣＧＡｌａ　Ａｓｐ 　ｒｌｅ　ｌｌｅ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ 　Ｖａｔ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　ＡｌａＣＴｒ　ＧＡＣＣＴＧ　ＧＣＡ　Ａ ＧＧ　ＧＣＣＡＣＧ　ＡＴＧ　ＣＧＣＡＣＣＧＴＣＡＡＡ　ＣＴＣＭＣＡＴＧ　 ＧＴＣＬｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ａ ｒｇ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｖａ１ＴＧＧ　ＧＣ Ａ　ＴＴＣＧＧＡ　ＴＡＣＡＡＣＡＴＣＧＣＣＧＣＧ　ＡＴＴ　ＣＣＣＧＴＣＧ ＣＣＧＣＴ　ＧＣＣＧＧＡＴｒｐ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　 ｌｉｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｌａ　 ＧｌｙＣＴＧ　ＣＴＣＭＣＣＣＣＣＴＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣＧＧＴ　ＧＣＧ　ＧＣ ＣＡＴＧ　ＧＣＧ　ＴＴＣＴＣＡ　ＴＣＧ　ＴＴＣＬｅｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐ ｒｏ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｐ ｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＴＴＣＧＴＧ　ＧＴＣＴＣＡ　ＡＡＣＡＧＣＴＴ Ｇ　ＣＧＧ　ＴＴＧ　ＣＧＣＡＡＡ　ｍ　ＧＧＧ　ＣＧＡ　ＴＡＣＣＣＧＰｈｅ 　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ 　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒ。

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Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．マイコバクテリアの膜−関連ポリペプチド全体またはその一部をコードする 組み換え核酸を含む組成物であって、該マイコバクテリアが、該膜−関達ポリペ プチド全体またはその一部によって検出可能な免疫応答を誘起し得ることを特徴 とする上記組成物。
2. ２．該マイコバクテリアがＭ．ボビス、Ｍ．チューバークローシス、Ｍ．レプラ エ、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．ミクロッティ、Ｍ．アビウム、Ｍ．イントラセルラ ーおよびＭ．スクロフラセウムからなる群から選ばれる、請求の範囲第１項に記 載の組成物。
3. ３．該マイコバクテリアがＭ．ボビスＢＣＧである、請求の範囲第１項に記載の 組成物。
4. ４．該膜−関達ポリペプチドがイオン−移動性ＡＴＰアーゼを含む、請求の範囲 第３項に記載の組成物。
5. ５．該ＡＴＰアーゼが約７９ｋＤの推定分子量をもつ、請求の範囲第４項に記載 の組成物。
6. ６．該膜−関連ポリペプチドが、ＤＮＡ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＩＤ　ＮＯ．：１ 全体または一部を含む核酸とハイブリッド化し得るＤＮＡ配列によってコードさ れる、請求の範囲第１項に記載の組成物。
7. ７．該核酸が、該膜−関連ポリペプチドの少なくとも細胞外ドメインをコードす る、請求の範囲第６項に記載の組成物。
8. ８．該核酸が、該膜−関達ポリペプチドの少なくとも細胞内ドメインをコードす る、請求の範囲第６項に記載の組成物。
9. ９．該核酸が、該膜−関連ポリペプチドの少なくとも１つの経膜ドメインをコー ドする、請求の範囲第６項に記載の組成物。
10. １０．該核酸が、該少なくとも一つの経膜ドメインおよび免疫原性ポリペプチド を含むキメラポリペプチドをコードする、請求の範囲第９項に記載の組成物。
11. １１．マイコバクテリアの膜−関連ポリペプチド全体またはその一部を含む組成 物であって、該マイコバクテリアが、該膜−関連ポリペプチド全体またはその一 部によって検出可能な免疫応答を誘起し得ることを特徴とする上記組成物。
12. １２．該マイコバクテリアがＭ．ボビス、Ｍ．チューバークローシス、Ｍ．レプ ラエ、Ｍ．アフリカヌム、Ｍ．ミクロッティ、Ｍ．アリウム、Ｍ．イントラセル ラーおよびＭ．スクロフラセウムからなる群から選ばれる、請求の範囲第１１項 に記載の組成物。
13. １３．該マイコバクテリアが、Ｍ．ボビスＢＣＧである請求の範囲第１１項に記 載の組成物。
14. １４．該膜−関達ポリペプチドがイオン−移動性ＡＴＰアーゼを含む、請求の範 囲第１３項に記載の組成物。
15. １５．該ＡＴＰアーゼが約７９ｋＤの推定分子量をもつ、請求の範囲第１４項に 記載の組成物。
16. １６．該膜−関連ポリペプチドが、ＤＮＡ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＩＤ　ＮＯ．： １全体またはその一部をコードする核酸とハイブリッド化し得る核酸によってコ ードされる、請求の範囲第１１項に記載の組成物。
17. １７．該ポリペプチドが、該膜−関連ポリペプチドの少なくとも細胞外ドメイン を含む、請求の範囲第１６項に記載の組成物。
18. １８．該ポリペプチドが、該膜−関連ポリペプチドの少なくとも細胞内ドメイン を含む、請求の範囲第１６項に記載の組成物。
19. １９．該ポリペプチドが、該膜−関連ポリペプチドの少なくとも１つの経膜ドメ インを含む、請求の範囲第１６項に記載の組成物。
20. ２０．該ポリペプチドが、該少なくとも一つの経膜ドメインおよび免疫原性ポリ ペプチドを含む、キメラポリペプチドを含有する、請求の範囲第１９項に記載の 組成物。
21. ２１．マイコバクテリアの膜−関連ポリペプチド全体またはその一部、あるいは 該ポリペプチド全体またはその一部をコードする発現可能な核酸を、該ＤＮＡを 発現し得る組み換えワクチンビークル中に含むワクチンにおいて、該ワクチンビ ークルがウイルスまたはバクテリアであることを特徴とする上記ワクチン。
22. ２２．該膜−関達ポリペプチドが、マイコバクテリアのイオン−移動性ＡＴＰア ーゼである請求の範囲第２１項に記載のワクチン。
23. ２３．マイコバクテリアのイオン−移動性ＡＴＰアーゼ由来のプロモータ配列を 含む核酸。