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Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet von Gram-negativen bakteriellen
Impfstoffzusammensetzungen und ihre Herstellung. Insbesondere betrifft
sie das Gebiet von nützlichen
Gram-negativen bakteriellen Außenmembranvesikel-(oder
Bläschen-("bleb"))Zusammensetzungen,
die heterolog exprimierte Chlamydia-Antigene umfassen, und vorteilhafte
Verfahren, um diese Zusammensetzungen wirksamer und sicherer als Impfstoff
zu machen.
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Hintergrund der Erfindung
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Chlamydiae
sind obligatorische intrazelluläre
Gram-negative Bakterien, die sich nur in cytoplasmatischen Einschlüssen eukaryontischer
Zellen vermehren. Sie haben einen besonderen Entwicklungszyklus,
der durch zwei Hauptformen dargestellt wird, das sporenartige Elementarkörperchen
(EB), das die von Zelle zu Zelle übertragene infektiöse Form
ist, und das nicht-infektiöse,
stoffwechselaktive Retikularkörperchen
(RB), das sich in der Wirtszelle vermehrt.
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Von
den vier bekannten Chamydia-Arten sind Chlamydia trachomatis und
C. pneumoniae die wichtigen humanen Pathogene. Die kürzlich definierte
Art C. pneumoniae (Grayston 1989) wird jetzt als Hauptursache für Atemwegsinfektionen
anerkannt (Grayson 1993), und Daten nehmen jetzt für eine Verbindung
mit Atherosklerose zu. Die Verbindung wird durch seroepidemiologische
Studien gestützt,
Studien, die die Gegenwart des Bakteriums in den atherosklerotischen
Läsionen
zeigen, Studien, die die Fähigkeit
von C. pneumoniae zur Vermehrung in den unterschiedlichen Zelltypen
zeigen, die in den atherosklerotischen Läsionen vorhanden sind, Eingriffsversuchen
mit Antibiotika bei Patienten mit Herkranzerkrankung und experimentelle
Atemwegsinfektion bei Kaninchen oder Apolipoprotein-E-Mangel-Mäusen, die
zu inflammatorischen Veränderungen
in der Aorta führt
(Danesh 1997, Fong 1997, Laitinen 1997, Moazed 1997). Insgesamt
implizieren diese Daten C. pneumoniae als verursachenden und/oder
verschlimmernden Faktor von Atherosklerose.
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C.
trachomatis ist ein humanes Hauptpathogen; übertragen von Mensch zu Mensch
(es gibt kein bekanntes Tierreservoir) verursacht es okulare und
genitale Infektionen, die zu Langzeitfolgen führen können. Ein Trachom, eine okulare
Chlamydia-Infektion, ist endemisch in mehreren Entwicklungsländern und
ist die führende
Ursache in der Welt für
vermeidbare Erblindung bei Millionen Menschen, die von dieser Krankheit
betroffen sind. Genitale Chlamydia-Infektionen stellen die häufigste
bakterielle, geschlechtlich übertragene Krankheit
("sexually transmitted
disease", STD) weltweit
dar. 1996 erstellte die WHO einen neuen Satz globaler Abschätzungen
für vier
Haupt-STDs, wobei eine umfassende Übersicht über die veröffentlichten und unveröffentlichten
Verbreitungsdaten gezeichnet wurde (Gerbase 1998). Es wurde geschätzt, daß 1995 4
und 5,2 Millionen neue Fälle
von Infektion mit C. trachomatis in Individuen im Alter von 15–49 Jahren
für Nordamerika
bzw. Westeuropa erfolgten; weltweit summierte sich C. trachomatis
auf schätzungsweise
89,1 Millionen neue Fälle.
Kollektiv zeigen die Daten höhere
Infektionsraten bei Frauen im Vergleich mit Männern (Washington 1987, Peeling
1995, Cates 1991); ein höheres
Auftreten wird bei Heranwachsenden und jungen Erwachsenen festgestellt,
wobei ca. 70 % der Chlamydia-Infektionen in der Altersgruppe von
15–24
Jahren angegeben werden (Peeling 1995).
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Es
besteht ein klarer Bedarf an wirksamen Impfstoffen gegen Chlamydia
trachomatis und Chlamydia pneumoniae.
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Außenmembranvesikel
(Bläschen, "blebs")
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Gram-negative
Bakterien sind vom äußeren Medium
durch zwei aufeinanderfolgende Schichten aus Membranstrukturen getrennt.
Diese als die cytoplasmatische Membran und die Außenmembran
(OM) bezeichneten Strukturen unterscheiden sich sowohl strukturell
als auch funktionell. Die Außenmembran
spielt eine wichtige Rolle in der Wechselwirkung von pathogenen
Bakterien mit ihren jeweiligen Wirten. Entsprechend stellen die
oberflächenexponierten
bakteriellen Moleküle
wichtige Ziele für
die Immunreaktion des Wirtes dar, was Außenmembrankomponenten zu attraktiven
Kandidaten bei der Bereitstellung von Impfstoff-, diagnostischen
und therapeutischen Reagenzien macht.
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Bakterielle
Ganzzellimpfstoffe (abgetötet
oder abgeschwächt
(attenuiert)) haben den Vorteil der Bereitstellung mehrfacher Antigene
in ihrer natürlichen
Mikroumgebung. Nachteile um diesen Ansatz sind die durch bakterielle
Komponenten wie Endotoxin- und Peptidoglycan-Fragmente induzierten
Nebenwirkungen. Andererseits können
azelluläre
Spaltimpfstoffe, die gereinigte Komponenten aus der Außenmembran
enthalten, nur begrenzten Schutz liefern und mögen die Antigene nicht angemessen
dem Immunsystem des Wirtes präsentieren.
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Proteine,
Phospholipide und Lipopolysaccharide sind die drei Hauptbestandteile,
die in der Außenmembran
aller Gram-negativen Bakterien gefunden werden. Diese Moleküle sind
asymmetrisch verteilt: Membranphospholipide (hauptsächlich im
inneren Blättchen),
Lipooligosaccharide (ausschließlich
im äußeren Blättchen)
und Proteine (innere und äußere Blättchen-Lipoproteine,
integrale oder polytopische Membranproteine). Für viele bakterielle Pathogene,
die die menschliche Gesundheit beeinflussen, haben sich Lipopolysaccharid
und Außenmembranproteine
als immunogen und zugänglich
zum Verleihen von Schutz gegen die entsprechende Krankheit durch
Immunisierung erwiesen.
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Die
OM von Gram-negativen Bakterien ist dynamisch und kann in Abhängigkeit
von den Umweltbedingungen drastische morphologische Transformationen
erfahren. Unter diesen Erscheinungsformen wurde die Bildung von
Außenmembranvesikeln
oder "Bläschen" in vielen Gram-negativen
Bakterien untersucht und dokumentiert (L. Zhou et al. 1998, FEMS
Microbiol. Lett. 163: 223–228).
Darunter schließt
eine nicht-erschöpfende
Liste von bakteriellen Pathogenen, von denen die Erzeugung von Bläschen berichtet
wurde, ein: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella
melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis,
Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila,
Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa
und Yersinia enterocolitica. Obwohl der für die Produktion von OM-Bläschen verantwortliche
biochemische Mechanismus nicht vollständig verstanden wird, wurden
diese Außenmembranvesikel
umfassend untersucht, da sie eine mächtige Methodik zur Isolierung
von Außenmembranproteinzubereitungen
in ihrer nativen Konformation darstellen.
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Beispiele
für Bakterienarten,
aus denen Bläschenimpfstoffe
hergestellt werden können,
wurden besprochen in WO 01/09350. Zum Beispiel scheidet N. meningitidis
Serogruppe B (menB) Außenmembranbläschen in
ausreichenden Mengen aus, um ihre Herstellung im industriellen Maßstab zu
erlauben. Solche Mehrkomponenten-Außenmembranproteinimpfstoffe
aus natürlich
vorkommenden menB-Stämmen
wurden als wirksam im Schutz von Jugendlichen vor menB-Krankheit
aufgefunden und wurden in Lateinamerika zugelassen. Ein alternatives
Verfahren zur Herstellung von Außenmembran vesikeln erfolgt über das
Verfahren der Detergensextraktion der bakteriellen Zellen (
EP 11243 ).
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfinder haben festgestellt, daß Gram-negative bakterielle
Bläschen
ein idealer Zusammenhang zur Präsentation
von Chlamydia-Außenmembranproteinen
sind. Insbesondere sind Gonokokkenbläschen nützlich im Fall der Präsentation
von C. trachomatis-OMPs, und Meningokokkenbläschen sind nützlich im
Fall der Präsentation
von C. pneumonieae-OMPs. Dies ist so, weil a) diese Außenmembranproteine solche
Bläschen
in einer nativen (oder annähernd
nativen) Konformation integrieren können, wodurch eine nützliche
immunologische Wirkung bewahrt wird; b) Bläschen (insbesondere aus Neisseria-Stämmen) in
industriellen Mengen erzeugt werden können, c) Bläschen mukosal verabreicht werden
können
und d) die Kombination von Chlamydia-Antigenen mit nativen Bläschenantigenen
wichtige Wechselwirkungen für
bestimmte Zustände
wie Salpingitis haben kann.
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Die
vorliegende Erfindung stellt somit vorteilhafte Gram-negative bakterielle
Bläschenzubereitungen (abgeleitet
aus oben aufgeführten
Bläschen-erzeugenden
bakteriellen Stämmemn
und bevorzugt nicht abgeleitet aus Chlamydia) bereit, die auf ihrer
Oberfläche
ein oder mehrere rekombinante (und bevorzugt heterologe) Proteinantigene
aus Chlamydia trachomatis oder Chlamydia pneumoniae präsentieren.
Vorteilhafte Impfstofformulierungen und Verfahren zur Verabreichung
werden ebenfalls bereitgestellt.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Gram-negatives bakterielles Bläschen bereit,
das nicht aus Chlamydia stammt und auf seiner Oberfläche das
PorB-Außenmembranprotein
von Chlamydia traochmatis präsentiert,
worin die Kombination des Chlamydia-Antigens mit den nativen Gram-negativen
bakteriellen Bläschenantigenen
in der Prävention
oder Behandlung von Salpingitis, bei Vorhandensein in einer Impfstofformulierung, wechselwirkt.
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Auch
bereitgestellt wird ein Gram-negatives Bläschen, das nicht aus Chlamydia
stammt und auf seiner Oberfläche
sowohl die PmpG- als auch MOMP-(aus
einem oder mehreren Serovars)Außenmembranproteine von
Chlamydia trachomatis präsentiert,
worin die Kombination der Chlamydia-Antigene mit den nativen Gram-negativen
bakteriellen Bläschenantigenen
in der Prävention
oder Behandlung von Salpingitis, bei Vorhandensein in einer Impfstofformulierung,
wechselwirkt.
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Zusätzlich wird
ein Gram-negatives Bläschen
bereitgestellt, das von Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis
oder Haemophilus influenzae erzeugt wird und auf seiner Oberfläche ein
Schutzantigen von Chlamydia pneumoniae präsentiert.
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Im
Zusammenhang dieser Anmeldung zeigt der Begriff "präsentiert
auf seiner Oberfläche" an, daß das Chlamydia-Protein
auf der äußeren Oberfläche des
Bläschens
exponiert und an die Außenmenbran
gebunden sein sollte (bevorzugt durch Integration in die Außenmembran).
Am meisten bevorzugt sollte es seine native Faltung innerhalb des
heterologen Bläschenzusammenhangs
annehmen.
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Eine
effiziente Stragegie zur Modulation der Zusammensetzung einer Bläschenzubereitung
auf diese Weise besteht in der Übertragung
einer oder mehrerer Kopien eines DNA-Segments, das eine Expressionskassette
enthält,
die ein Gen umfaßt,
das das Chlamydia-Außenmembranprotein
codiert, in das Genom eines Gram-negativen Bakteriums.
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Eine
nicht-erschöpfende
Liste von bevorzugten bakteriellen Arten, die als Empfänger für eine solche Kassette
verwendet werden könnten,
schließt
ein: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis,
Brucella ovis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella
pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas
aeruginosa und Yersinia enterocolitica. Neisseria meningitidis,
Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae
und Pseudomona aeruginos sind besonders bevorzugt für diesen
Zweck, und Neisseria gonorrhoeae und Neisseria meningitidis sind
am meisten bevorzugt zur Herstellung der Bläschen dieser Erfindung. Die
Chlamydia-OMPs werden heterolog exprimiert, und in solchen Situationen
sollten Chlamydia-Stämme
nicht zur Herstellung der Bläschen
der Erfindung verwendet werden.
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Das
Gen (die Gene), das in der Expressionskassette enthalten ist, kann
homolog (oder endogen) (d.h. es existiert natürlich im Genom des manipulierten
Bakteriums) oder bevorzugt heterolog sein (d.h. es existiert nicht
natürlich
im Genom des manipulierten Bakteriums). Die eingeführte Expressionskassette
kann aus unmodifizierten, "natürlichen" Promotor/Gen/Operon-Sequenzen
oder veränderten
Expressionskassetten bestehen, in denen die Promotorregion und/oder
die codierende Region oder beide verändert wurden. Eine nicht-erschöpfende Liste
von bevorzugten Promotoren (bevorzugt stark), die zur Expression
verwendet werden könnten,
schließt
die Promotoren porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB von N. meningitidis
oder N. gonorrhoeae, die Promotoren p2, p5, p4, ompF, p1, ompH,
p6, hin47 von H. influenzae, die Promotoren ompH, ompG, ompCD, ompE,
ompB1, ompB2, ompA von M. catarrhalis, die Promotoren λpL, lac,
tac, araB von Escherichia coli oder die Promotoren ein, die spezifisch
durch Bakteriophagen-RNA-Polymerase,
wie zum Beispiel E. coli Bakteriophage T7, erkannt werden.
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Die
Expressionskassette kann in das bakterielle Chromosom mittels homologer
und/oder ortsspezifischer Rekombination übertragen und integriert werden
(wie in WO 01/09350 erörtert).
Zur Übertragung
solcher Gene und/oder Operons verwendete integrative Vektoren können bedingt
replikative oder Suizidplasmide, Bakteriophagen, Transposonen oder
lineare DNA-Fragmente sein, die durch Restriktionshydrolyse oder PCR-Amplifikation
erhalten werden. Die Integration ist bevorzugt auf chromosomale
Regionen gerichtet, die entbehrlich für das Wachstum in vitro sind.
Eine nicht-erschöpfende
Liste von bevorzugten Loci, die zur Ausrichtung der DNA-Integration
verwendet werden können,
schließt
die porA-, porB-, opa-, opc-, rmp-, omp26-, lecA-, cps-, lgtB-Gene
von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, die P1-, P5-,
hmw1/2-, IgA-Protease-, fimE-Gene von NTHi; die lecA1-, lecA2-,
omp106-, uspA1-, uspA2-Gene von Moraxella catarrhalis ein. Alternativ
kann die zur Modulation der Expression von Bläschenkomponente(n) verwendete
Expressionskassette in ein Bakterium der Wahl mittels episomaler
Vektoren, wie zum Beispiel kreisförmige/lineare replikative Plasmide,
Cosmide, Phasmide, lysogene Bakteriophagen oder bakterielle künstliche
Chromosomen, übertragen
werden. Die Auswahl des Rekombinationsereignisses kann mittels selektierbarer
genetischer Marker ausgewählt
werden, wie zum Beispiel durch Gene, die Resistenz gegen Antibiotika
verleihen (zum Beispiel Kanamycin, Erythromycin, Chloramphenicol
oder Gentamycin), Gene, die Resistenz gegen Schwermetalle und/oder
toxische Verbindungen verleihen, oder Gene, die auotrophe Mutationen
ergänzen
(zum Beispiel pur, leu, met, aro). Bläschen können aus dem resultierenden
modifizierten Stamm hergestellt werden.
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Die
Expression einiger heterologer Proteine in bakteriellen Bläschen kann
die Zugabe von Außenmembran-Zielsignal(en)
erfordern. Das bevorzugte Verfahren zum Lösen dieses Problems besteht
in der Schaffung einer genetischen Fusion zwischen einem heterologen
Gen und einem Gen, das für
ein residentes OMP codiert, als spezifischer Ansatz, um rekombinante
Proteine auf Bläschen
auszurichten. Am meisten bevorzugt wird das heterologe Gen mit den
Signalpeptidsequenzen eines solchen OMP fusioniert.
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Eine
besonders bevorzugte Anwendung dieser Erfindung ist die Einführung von
Chlamydia-(trachomatis oder pneumoniae)Schutzantigenen (bevorzugt
Außenmembranproteine)
in Gram-negative bakterielle Bläschen,
die nicht aus Chlamydia-Stämmen
stammen. Dies hat mehrere Vorteile, die die Tatsache einschließen, daß solche
Bläschen
(und sie umfassende Impfstoffe) äußerst geeignet
zur mukosalen Verabreichung sind, was vorteilhaft ist, da eine mukosale
(IgA-) Immunreaktion gegen die im Bläschen vorhandenen Chlamydia-Antigene
schützender
gegen Chlamydia-Infektion sein wird, die sich selbst in der Schleimhaut
zeigen.
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In ein Gram-negatives bakterielles Bläschen integrierte
Chlamydia trachomatis-Antigene
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Eine
besonders bevorzugte Verwendung liegt auf dem Gebiet der Prophylaxe
oder Behandlung von geschlechtlich übertragenen Krankheiten (STDs).
Es ist häufig
schwierig für Ärzte zu
bestimmen, ob die Hauptursache für
eine STD in einer Gonokokken- oder Chlamydia trachomatis-Infektion
liegt. Die zwei Organismen sind Hauptursachen für Salpingitis – eine Krankheit,
die zu Sterilität
im Wirt führen
kann. Es wäre
nützlich,
falls gegen eine STD geimpft oder sie mit einem kombinierten Impfstoff
behandelt werden könnte,
der wirksam gegen Krankheit ist, die durch beide Organismen verursacht
wird. Das Hauptaußenmembranprotein
(MOMP oder OMP1 oder OMPI) von C. trachomatis hat sich als Ziel
von Schutzantikörpern
erwiesen. Jedoch ist die strukturelle Integrität diese integralen Membranproteins
wichtig zur Induzierung solcher Antikörper. Zusätzlich sind die durch diese
Antikörper
erkannten Epitope variabel und definieren mehr als 10 Serovars.
Der Bläschenzusammenhang
der Erfindung erlaubt die geeignete Faltung eines oder mehrerer
MOMP oder anderer Chalydia-Membranproteine für Impfstoffzwecke. Die Veränderung
von (bevorzugt) einem Gonokokken-Stamm, der ein oder mehrere C.
trachomatis-MOMP-Serovars und/oder ein oder mehrere andere schützende Chlamydia-OMPs
in der Außenmembran
exprimiert, und die Produktion von Bläschen daraus erzeugt eine Einzellösung für die mehrfachen
Probleme von korrekt gefalteten Membranproteinen, die Präsentation
von ausreichenden MOMP-Serovars und/oder anderen Chlamydia-OMPS
zum Schutz gegen ein weites Spektrum von Serovars und die gleichzeitige
Prophylaxe/Behandlung von Gonokokkeninfektion (und entsprechend
das fehlende Erfordernis für
den Arzt, zunächst
zu entscheiden, welcher Organismus besondere klinische Symptome verursacht – gegen
beide Organismen kann gleichzeitig geimpft werden, was somit die
Behandlung der STD in einem sehr frühen Stadium erlaubt). Bevorzugte
Loci für
die Geninsertion im Gonokokkenchromosom sind oben angegeben. Nevorzugte
schützende
C. trachomatis-Gene, die aufgenommen werden könnten, sind HMWP, PmpG und
die in WO 99/28475 offenbarten OMPs.
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Eine
besonders bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung stellt ein Gram-negatives bakterielles Bläschen (bevorzugt
von Gonokokken) bereit, das auf seiner Oberfläche das PorB-Außenmembranprotein (siehe
unten) von Chlamydia trachomatis präsentiert.
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PorB
Chlamydia trachomatis-Serovar D (D/UW-3/Cx) DNA-Sequenz
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Translatierte
Aminosäuresequenz
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Die
Gegenwart von PorB in den Bläschen
bedeutet, daß das
Antigen leichter mukosal verabreicht werden kann, und stellt einen
wirksameren Schutz als bei alleiniger Verabreichung bereit.
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Die
vorliegende Erfindung stellt zusätzlich
ein Gram-negatives bakterielles Bläschen (bevorzugt von Gonokokken)
bereit, das auf seiner Oberfläche
ein oder mehrere der folgenden Proteine von Chlamydia trachomatis
oder C. trachomatis PorB in Kombination mit einem oder mehreren
der folgenden Proteine präsentiert.
Es wird einem Fachmann ersichtlich sein, daß statt der nachfolgenden Sequenzen
(und der obigen PorB-Sequenz) das natürliche Analogon der Sequenzen
von anderen C. trachomatis-Serovars oder -Serotypen verwendet werden
könnte,
ebenso wie Gene verwendet werden könnten, die funktionelle Analoga
der Proteine codieren, die Insertionen, Deletionen oder Substitutionen
aus den genannten Sequenzen umfassen, die die immunologischen Eigenschaften
des codierten Proteins nicht beeinflussen. Bevorzugt sollte eine
Sequenz aus einem Serovar D-Stamm ausgewählt werden. Ein bakterieller
Stamm, der ein solches Bläschen
erzeugen kann ist ein weiterer Aspekt der Erfindung.
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Erneut
können
solche Bläschen,
wenn sie in einer Impfstofformulierung vorhanden sind, schützender gegen
Chlamydia trachomatis-Infektion als die Verwendung des Proteins
in Isolierung sein.
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Besonders
vorteilhafte Paare von Chlamydia trachomatis-Antigenen sind weitere
bevorzugte Ausführungsformen
dieser Erfindung. So wird in einem weiteren Aspekt ein Gram-negatives
Bläschen
(bevorzugt von Gonokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl
die PorB- als auch PmpG-Außenmembranproteine
von Chlamydia trachomatis präsentiert.
Ferner wird ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt von Gonokokken)
bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl die PorB- als auch
MOMP-(aus einem oder mehreren Serovars)Außenmembranproteine von Chlamydia
trachomatis präsentiert.
Schließlich
wird ein Gram-negatives Bläschen
(bevorzugt von Gonokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl
die PmpG- als auch MOMP-(aus
einem oder mehreren Serovars)Außenmembranproteine
von Chlamydia trachomatis präsentiert.
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Durch
MOMP (oder OMP1 oder OMPI) aus einem oder mehreren (1, 2, 3, 4,
5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr) Serovars ist es bevorzugt, daß ein oder
mehrere aus einer Liste von Serovars ausgewählt werden sollten, die aus
B, Ba, D, Da, E, L1, L2, L2a, F, G, K, L3, A, C, H, I, Ia und J
besteht; besonders bevorzugt aus einer Liste, die aus D, E, F, G,
K, H, I und J besteht. Am meisten bevorzugt sollten ein oder mehrere
MOMPs wenigstens MOMP aus Serovar D oder E (am meisten bevorzugt
D) umfassen. Eine weitere bevorzugte Strategie ist die Auswahl eines
oder mehrerer MOMP aus jeder der folgenden drei Serogruppen: B-Serogruppe
(bestehend aus Serovars B, Ba, D, Da, E, L1, L2 und L2a, und bevorzugt
ausgewählt
aus Serovars D, Da und E); F-G-Serogruppe (bestehend aus Serovars
F und G); und C-Serogruppe (bestehend aus Serovars A, C, H, I, Ia,
J, K und L3, und bevorzugt ausgewählt aus Serovars H, I, Ia,
J und K).
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Am
meisten bevorzugt sollten die Gene für die Chlamydia trachomatis-Antigene am PorA-Locus
von Neisseria (bevorzugt von Gonokokken) inseriert werden.
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Eine
solche als Impfstoff formulierte Zubereitung kann erhöhten Schutz
für einen
Wirt gegen Chlamydia trachomatis ergeben, als wenn ein einzelnes
Antigen verabreicht wird.
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Bevorzugt
stammt das Bläschen
aus einem Stamm (bevorzugt von Gonokokken), der zur Aufregulierung
eines oder mehrerer schützender
Außenmembranantigene
modifiziert wurde (wie nachfolgend beschrieben).
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Bevorzugt
stammt das Bläschen
aus einem Stamm (bevorzugt von Gonokokken), der zur Abregulierung
eines oder mehrere immundominanter variabler oder nicht-schützender
Außenmembranantigene
modifiziert wurde (wie nachfolgend beschrieben).
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Bevorzugt
stammen die Bläschen
aus einem Stamm (bevorzugt von Gonokokken), der einen entgifteten
Lipid-A-Teil von bakteriellem LPS aufweist, weil der Stamm verändert wurde,
um die Expression eines oder mehrerer Gene zu reduzieren oder auszuschalten,
die dazu führen,
daß LPS
toxisch ist (bevorzugt ausgewählt aus
den folgenden Genen oder Homologen davon: htrB, msbB und lpxK; siehe
nachfolgender Abschnitt).
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Bevorzugt
stammen die Bläschen
aus einem Stamm (bevorzugt von Gonokokken), der einen entgifteten
Lipid A-Teil von bakteriellem LPS aufweist, weil der Stamm manipuliert
wurde, um eine größere Menge
eines oder mehrerer Gene zu exprimieren, die ein Genprodukt erzeugen,
das LPS entgiften kann (bevorzugt ausgewählt aus den folgenden Genen
oder Homologen davon: pmrA, pmrB, pmrE und pmrF; siehe nachfolgender
Abschnitt).
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Impfstoffzusammensetzungen,
die das Bläschen
der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Exzipienten oder
Träger
umfassen, werden auch erwogen. Bevorzugt umfaßt der Impfstoff zusätzlich einen mukosalen
Hilfsstoff. Mukosale Hilfsstoffe sind allgemein fachbekannt (siehe "Vaccine Design – The subunit and
adjuvant approach" (Hrsg.
M.F. Powell & M.J.
Newman) (1995) Plenum Press, New York). Ein bevorzugter mukosaler
Hilfsstoff ist LT2 (oder LTII, das in LTIIa und LTIIb gespalten
werden kann – siehe
Martin et al., Infection and Immunity, 2000, 68:281–287). Bevorzugt
sollten solche Impfstoffe wie nachfolgend unter "Impfstoffformulierungen" beschrieben formuliert
und verabreicht werden.
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Der
Gehalt an Bläschen
pro Dosis im Impfstoff wird typischerweise im Bereich von 1–100 μg, bevorzugt
5–50 μg und ganz
besonders typisch im Bereich von 5–25 μg sein.
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Optimale
Mengen von Komponenten für
einen besonderen Impfstoff können
durch Standarduntersuchungen sichergestellt werden, die die Beobachtung
geeigneter Immunreaktionen in Probanden beinhalten. Nach einer Erstimpfung können Patienten
eine oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen in angemessenem Abstand
erhalten.
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Ein
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention
von Chlamydia trachomatis-Infektion in einem Wirt wird ebenfalls
bereitgestellt, das die Schritte der Verabreichung einer wirksamen
Menge des obigen Impfstoffs an einen bedürftigen Wirt umfaßt. Bevorzugt
wird der Impfstoff mukosal über
einen entweder intranasalen, oralen, intradermalen oder intravaginalen
Weg verabreicht.
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In ein Gram-negatives bakterielles Bläschen integrierte
Chlamydia pneumoniae-Antigene
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In
einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Gram-negatives Bläschen bereit,
das auf seiner Oberfläche
ein Schutzantigen aus Chlamydia pneumoniae präsentiert. Neisseria meningitidis,
Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae sind die Arten
zur Herstellung des Bläschens.
Solche Schutzantigene sind bevorzugt eines oder mehrere aus den
nachfolgend aufgeführten:
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1)
Zellhülle:
Membranproteine, Lipoproteine und Porine
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2)
Codierende Gene (nicht in C. trachomatis)
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3)
Chlamydia-spezifische Proteine
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(Die
vollständigen
Sequenzangaben wurden auf der Homepage von Chlamydia Genome Project
veröffentlicht:
http://chlamydia-www.berkeley.edu:4231/index.html).
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Zusätzliche
Chlamydia-Gene und codierte Proteine, die zur Expression in einem
Gram-negativen Bakterium zur OMV-Impfstoffherstellung geeignet sind:
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Wenn
solche Bläschen
in einer Impfstofformulierung vorhanden sind, können sie stärker schützend gegen Chlamydia pneumoniae-Infektion
als die Verwendung des Protein/Antigens in Isolation sein.
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Besonders
vorteilhafte Paare von Chlamydia pneumoniae-Antigenen wurden ebenfalls
gefunden. So wird in einem weiteren Aspekt ein Gram-negatives Bläschen (bevorzugt
von Meningokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl
die PorB- als auch MOMP-Außenmembranproteine
von Chlamydia pneumoniae präsentiert.
Außerdem
wird ein Gram-negatives Bläschen
(bevorzugt von Meningokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl
MOMP- als auch ein oder mehrere Pmp-Außenmembranproteine von Chlamydia
pneumoniae präsentiert.
Ein Gram-negatives Bläschen
(bevorzugt von Meningokokken) wird zusätzlich bereitgestellt, das
auf seiner Oberfläche
sowohl die PorB- als auch ein oder mehrere Pmp-Außenmembranproteine
von Chlamydia pneumoniae präsentiert.
Ein Gram-negatives Bläschen
(bevorzugt von Menigokokken) wird ebenfalls bereitgestellt, das
auf seiner Oberfläche
sowohl die PorB- als auch Npt1-Proteine von Chlamydia pneumoniae
präsentiert.
Ein Gram-negatives Bläschen
(bevorzugt von Meningokokken) wird zusätzlich bereitgestellt, das
auf seiner Oberfläche
sowohl die Npt1- als auch ein oder mehrere Pmp-Proteine von Chlamydia
pneumoniae präsentiert.
Schließlich
wird ein Gram-negatives Bläschen
(bevorzugt von Meningokokken) bereitgestellt, das auf seiner Oberfläche sowohl
die Npt1- als auch MOMP-Proteine
von Chlamydia pneumoniae präsentiert.
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Als
Impfstoff formulierte Zubereitungen können gesteigerten Schutz für einen
Wirt gegen Chlamydia ergeben, als wenn ein einzelnes Antigen verabreicht
wird.
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Bevorzugt
stammt das Bläschen
aus einem Stamm, der modifiziert wurde, um ein oder mehrere schützende Außenmembranantigene
aufzuregulieren (siehe unten; für
schützende
Menigokokken-Außenmembranantigene
sie beispielsweise den Abschnitt "Neisseria-Bläschenzubereitungen" für diejenigen
Antigene, die bevorzugt auf reguliert werden sollten).
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Bevorzugt
stammt das Bläschen
aus einem Stamm, der modifiziert wurde, um ein oder mehrere immundominante
variable oder nicht-schützende
Außenmembranantigene
abzuregulieren (wie nachfolgend beschrieben; für variable/nicht-schützende Menigokokken-Außenmenbranantigene
siehe beispielsweise den Abschnitt "Neisseria-Bläschenzubereitungen" für diejenigen
Antigene, die bevorzugt abreguliert werden sollten).
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Bevorzugt
stammen die Bläschen
aus einem Stamm, der einen entgifteten Lipid A-Teil von bakteriellem
LPS aufweist, weil der Stamm manipuliert wurde, um die Expression
eines oder mehrer Gene zu reduzieren oder auszuschalten, die dazu
führen,
daß LPS
toxisch ist (bevorzugt ausgewählt
aus den folgenden Genen oder Homologen davon: htrB, msbB und lpxK;
siehe nachfolgender Abschnitt).
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Bevorzugt
stammen die Bläschen
aus einem Stamm, der einen eintgifteten Lipid A-Teil von bakteriellem
LPS aufweist, weil der Stamm manipuliert wurde, um ein oder mehrere
Gene in einer höheren
Menge zu exprimieren, die ein Genprodukt erzeugen, das LPS entgiften
kann (bevorzugt ausgewählt
aus den folgenden Genen oder Homologen davon: pmrA, pmrB, pmrE und
pmrF; siehe nachfolgender Abschnitt).
-
Impfstoffzusammensetzungen,
die das Bläschen
der Erfindung und einen pharmazeutisch geeigneten Exzipienten oder
Träger
umfassen, werden auch erwogen. Bevorzugt umfaßt der Impfstoff zusätzlich einen mukosalen
Hilfsstoff. Mukosale Hilfsstoffe sind allgemein fachbekannt (siehe "Vaccine Design – The subunit and
adjuvant approach" (Hrsg.
M.F. Powell & M.J.
Newman) (1995) Plenum Press, New York). Ein bevorzugter mukosaler
Hilfsstoff ist LT2 (oder LTII, das in LTIIa und LTIIb gespalten
werden kann – siehe
Martin et al., Infection and Immunity, 2000, 68:281–287). Bevorzugt
sollten solche Impfstoffe wie nachfolgend unter "Impfstoffformulierungen" beschrieben formuliert
und verabreicht werden.
-
Der
Gehalt an Bläschen
pro Dosis im Impfstoff wird typischerweise im Bereich von 1–100 μg, bevorzugt
5–50 μg und ganz
besonders typisch im Bereich von 5–25 μg sein.
-
Optimale
Mengen von Komponenten für
einen besonderen Impfstoff können
durch Standarduntersuchungen sichergestellt werden, die die Beobachtung
geeigneter Immunreaktionen in Probanden beinhalten. Nach einer Erstimpfung
können
Probanden eine oder mehrere Auffrischungsimmunisierungen in angemessenem
Abstand erhalten.
-
Die
Wirksamkeit eines C. pneumoniae-Impfstoffes kann in einem Mäusemodell
der Infektion ausgewertet werden, wie dem von Murdin et al. beschriebenen,
2000, J. Infect. Dis. 181 (Suppl. 3):55444–51. Der durch eine Impfstofformulierung
hervorgerufene Schutz kann durch die Reduzierung der bakteriellen
Last in der Lunge nach einer Kontaktinfektion mit C. pneumoniae
getestet werden.
-
Ein
Verfahren zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention
von Chlamydia pneumoniae-Infektion in einem Wirt wird ebenfalls
bereitgestellt, das die Schritte der Verabreichung einer wirksamen
Menge des obigen Impfstoffs an einen bedürftigen Wirt umfaßt. Bevorzugt
wird der Impfstoff mukosal über
einen entweder intranasalen, oralen, intradermalen oder intravaginalen
Weg verabreicht.
-
Weitere Verbesserungen für die Bakterien
und Bläschen
der Erfindung
-
Das
Gram-negative Bakterium kann ferner durch ein oder mehrere Verfahren
gentechnisch verändert werden,
die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: (a) ein Verfahren
der Abregulation der Expression von immundominanten variablen oder
nicht-schützenden
Antigenen, (b) ein Verfahren der Aufregulation der Expression von
schützenden
OMP-Antigenen, (c) ein Verfahren der Abregulation eines Gens, das
daran beteiligt ist, den Lipid A-Teil von LPS toxisch zu machen,
(d) ein Verfahren der Aufregulation eines Gens, das daran beteiligt
ist, den Lipid A-Teil von LPS weniger toxisch zu machen, und (e)
ein Verfahren der Abregulation der Synthese eines Antigens, das
eine strukturelle Ähnlichkeit
mit einer humanen Struktur teilt und eine Autoimmunreaktion in Menschen
induzieren kann. Diese Verfahren werden im Detail in WO 01/09350
beschrieben.
-
Solche
Bläschenimpfstoffe
der Erfindung werden geschaffen, um die Immunreaktion auf einige
schützende
(bevorzugt konservierte) Antigene oder Epitope zu fokussieren – formuliert
in einem Mehrkomponentenimpfstoff. Wenn solche Antigene integrale
OMPs sind, werden die Außenmembranvesikel
von Bläschenimpfstoffen
ihre geeignete Faltung sicherstellen. Diese Erfindung stellt Verfahren
zur Optimierung der OMP- und LPS-Zusammensetzung von OMV-(Bläschen)-Impfstoffen
durch Deletieren von immundominanten variablen sowie nicht-schützenden
OMPs bereit, indem konservierte OMPs durch Deletion von variablen
Regionen geschaffen werden, indem die Expression von schützenden
OMPs auf reguliert wird, und indem Kontrollmechanismen zur Expression
(wie Eisenrestriktion) von schützenden
OMPs eliminiert werden. Zusätzlich
wird die Reduzierung der Toxizität
von Lipid A durch Modifikation des Lipidteils oder durch Veränderung
der Phosphorylzusammensetzung, während
seine Adjuvansaktivität
bewahrt wird, oder durch Maskieren bereitgestellt. Jedes dieser
neuen Verfahren zur Verbesserung verbessert individuell den Bläschenimpfstoff,
jedoch funktioniert eine Kombination aus einem oder mehreren dieser
Verfahren in Verbindung, um einen optimierten manipulierten Bläschenimpfstoff
zu erzeugen, der immunschützend
und nicht-toxisch ist – insbesondere
geeignet zur pädiatrischen
Verwendung.
-
(a) Ein Verfahren zur Abregulation der
Expression von immundominanten variablen oder nicht-schützenden Antigenen
-
Viele
Oberflächenantigene
sind variabel unter bakteriellen Stämmen und sind als Ergebnis
schützend nur
gegen einen beschränkten
Satz von eng verwandten Stämmen.
Die Reduzierung der Expression oder bevorzugt die Deletion des Gens
(der Gene), das variables Oberflächenprotein
(Proteine) codiert, wird beschrieben, was zu einem bakteriellen
Stamm führt,
der Bläschen
erzeugt, die bei Verabreichung in einem Impfstoff ein stärkeres Potential
für Kreuzreaktivität gegen
verschiedene Stämme
aufgrund eines höheren
Einflusses haben, der durch konservierte Proteine (auf den Außenmembranen
bewahrt) auf das Immunsystem des Impflings ausgeübt wird. Beispiele für solche
variablen Antigene schließen
ein: für
Neisseria – Pili
(PilC), das antigene Variationen erfährt, PorA, Opa, TbpB, FrpB;
für H.
influenzae – P,
P5, Pilin, IgA1-Protease; und für
Moraxella – CopB,
OMP106.
-
Andere
Gentypen, die abreguliert oder ausgeschaltet werden könnten, sind
Gene, die in vivo durch das Bakterium leicht eingeschaltet (exprimiert)
oder ausgeschaltet werden können.
Da durch solche Gene codierte Außenmembranproteine nicht immer
auf den Bakterien vorhanden sind, kann die Gegenwart solcher Proteine
in den Bläschenzubereitungen
auch nachteilig für
die Wirksamkeit des Impfstoffs aus den oben genannten Gründen sein.
Ein bevorzugtes Beispiel zur Abregulation oder Deletion ist Neisseria-Opc-Protein. Durch
einen Opc-haltigen Bläschenimpfstoff
induzierte Anti-Opc-Immunität
würde nur
begrenzte Schutzfähigkeit
besitzen, da der infizierende Organismus leicht Opc- werden
könnte.
H. influenzae HgpA und HgpB sind andere Beispiele für solche
Proteine.
-
In
Verfahren a) werden diese variablen oder nicht-schützenden
Gene in der Expression abreguliert oder endgültig ausgeschaltet. Dies hat
den überraschenden
Vorteil des Konzentrierens des Immunsystems auf bessere Antigene,
die in geringen Mengen auf der Außenoberfläche von Bläschen vorhanden sind.
-
Der
Stamm kann auf diese Weise durch eine Anzahl von Strategien manipuliert
werden, die die Transposoninsertion zur Unterbrechung der codierenden
Region oder Promotorregion des Gens oder Punktmutationen oder Deletionen
zum Erreichen eines ähnlichen
Ergebnisses einschließen.
Eine homologe Rekombination kann auch zur Deletion eines Gens aus
einem Chromosom verwendet werden (wenn Sequenz X einen Teil (bevorzugt
alles) der codierenden Sequenz des Gens von Interesse umfaßt). Sie
kann zusätzlich
zur Veränderung
seines starken Promotors gegen einen schwächeren (oder keinen) Promotor
verwendet werden. All diese Techniken werden in WO 01/09350 beschrieben.
-
(b) Ein Verfahren zur Aufregulation der
Expression von schützenden
OMP-Antigenen
-
Dies
kann durch Inserieren einer Kopie eines solchen schützenden
OMP in das Genom (bevorzugt durch homologe Rekombination) oder durch
Aufregulation der Expression des nativen Gens durch Austauschen
des nativen Promotors gegen einen stärkeren Promotor oder Inserieren
eines starken Promotors stromaufwärts des fraglichen Gens erfolgen
(auch durch homologe Rekombination). Solche Verfahren können unter Verwendung
der in WO 01/09350 beschriebenen Techniken erreicht werden.
-
Solche
Verfahren sind besonders nützlich
zur Steigerung der Produktion von immunologisch relevanten Bläschenkomponenten
wie Außenmembranproteinen
und Lipoproteinen (bevorzugt konservierte OMPs, gewöhnlich vorhanden
in Bläschen
in geringen Konzentrationen).
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(c) Ein Verfahren zur Abregulation eines
Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid-A-Teil von LPS toxisch
zu machen
-
Die
Toxizität
von Bläschenimpfstoffen
stellt eines der größten Probleme
bei der Verwendung von Bläschen
in Impfstoffen dar. Ein Verfahren zum genetischen Entgiften des
in Bläschen
vorhandenen LPS wird offenbart. Lipid A ist die Hauptkomponente
von LPS, die für
die Zellaktivierung verantwortlich ist. Viele Mutationen in Genen,
die an diesem Reaktionsweg beteiligt sind, führen zu wesentlichen Phänotypen.
Jedoch führen Mutationen
in den Genen, die für
die letztlichen Modifikationsschritte verantwortlich sind, zu temperaturempfindlichen
(htrB) oder permissiven (msbB) Phänotypen. Mutationen, die zu
einer verringerten (oder keiner) Expression dieser Gene führen, führen zu
veränderter
toxischer Aktivität
von Lipid A. Tatsächlich
sind das nicht-lauroylierte (htrB-Mutante) [auch definiert durch
das resultierende LPS, dem beide sekundären Acylketten fehlen] oder
nicht-myristoylierte
(msbB-Mutante) [auch definiert durch das resultierende LPS, dem
nur eine einzelene sekundäre
Acylkette fehlt] Lipid A ist weniger toxisch als das Lipid A vom
Wildtyp. Mutationen im Lipid A 4'-Kinase-codierenden Gen (lpxK)
verringern ebenfalls die toxische Aktivität von Lipid A.
-
Verfahren
c) involviert somit die Deletion eines Teils (oder bevorzugt von
allem) eines oder mehrerer der obigen offenen Leseraster oder Promotoren.
Alternativ könnten
die Promotoren durch schwächere
Promotoren ersetzt werden. Bevorzugt werden die homologen Rekombinationstechniken
zur Durchführung
des Verfahrens verwendet. Bevorzugt werden die in WO 01/09350 beschriebenen
Verfahren verwendet. Die Sequenzen der htrB- und msbB-Gene von Neisseria
meningitidis B, Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae werden
für diesen
Zweck in WO 01/09350 bereitgestellt.
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(d) Ein Verfahren zur Aufregulation eines
Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid A-Teil von LPS weniger
toxisch zu machen
-
Toxische
Aktivität
von LPS könnte
auch durch Einführung
von Mutationen in Gene/Loci verändert
werden, die an Polymyxin B-Resistenz beteiligt sind (eine solche
Resistenz wurde mit der Addition von Aminoarabinose an das 4'-Phosphat von Lipid
A korreliert). Diese Gene/Loci könnten
pmrE sein, das eine UDP-Glucosedehydrogenase codiert, oder eine
Region von antimikrobiellen Peptidresistenzgenen, die vielen Enterobacteriaceae
gemein sind, die an der Aminoarabinosesynthese und -übertragung
beteiligt sein könnten.
Das Gen pmrF, das in dieser Region vorhanden ist, codiert eine Dolicol-Phosphatmanosyltransferase
(J.S. Gunn, B.L. Kheng, J. Krueger, K. Kim, L. Guo, M. Hackett,
S.I. Miller 1998, Mol. Microbiol. 27: 1171–1182).
-
Mutationen
im PhoP-PhoQ-Regulationssystem, das ein Phospho-Relais-Zweikomponentenregulationssystem
ist (z.B. PhoP-konstitutiver Phänotyp,
PhoPC), oder Umwelt- oder Kulturbedingungen
mit wenig Mg++ (die das PhoP-PhoQ-Regulationssystem
aktivieren) führen
zur Addition von Aminoarabinose an das 4'-Phosphat und zum Ersatz von Myristat
durch 2-Hydroxymyristat (Hydroxylierung von Myristat). Dieses modifizierte
Lipid A zeigt eine reduzierte Fähigkeit
zur Stimulation der E-Selectinexpression durch humane Endothelzellen
und TNF-α-Sezernierung
aus humanen Monozyten.
-
Verfahren
d) beinhaltet die Aufregulation dieser Gene unter Verwendung einer
Strategie wie in WO 01/09350 beschrieben.
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(e) Ein Verfahren zur Abregulation der
Synthese eines Antigens, das eine strukturelle Ähnlichkeit mit einer humanen
Struktur teilt und eine Autoimmunreaktion in Menschen induzieren
kann
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Die
Isolation von bakteriellen Außenmembranbläschen aus
verkapselten Gram-negativen Bakterien führt häufig zur gleichzeitigen Reinigung
von Kapselpolysaccharid. In manchen Fällen kann sich dieses "verunreinigende" Material als nützlich erweisen,
da Polysaccharid die Immunreaktion steigern kann, die durch andere
Bläschenkomponenten
verliehen wird. In anderen Fällen
kann sich jedoch die Gegenwart von verunreinigendem Polysaccharidmaterial
in bakteriellen Bläschenzubereitungen
als nachteilig für
die Verwendung der Bläschen
in einem Impfstoff erweisen. Zum Beispiel wurde zumindest für den Fall
von N. meningitidis gezeigt, daß Kapselpolysaccharid
der Serogruppe B keine schützende
Immunität
verleiht und dafür
anfällig
ist, eine nachteilige Autoimmunreaktion in Menschen zu induzieren.
Entsprechend ist das Verfahren e) die Manipulation des bakteriellen
Stammes zur Bläschenproduktion,
so daß er
frei von Kapselpolysaccharid ist. Die Bläschen werden dann zur Verwendung
in Menschen geeignet sein. Ein besonders bevorzugtes Beispiel für eine solche Bläschenzubereitung
ist eine aus N. meningitidis Serogruppe B, die frei von Kapselpolysaccharid
ist.
-
Dies
kann unter Verwendung von modifizierten Stämmen zur Bläschenproduktion erreicht werden,
in denen die für
die Kapselbiosynthese und/oder den Kapselexport notwendigen Gene
beeinträchtigt
wurden, wie in WO 01/09350 beschrieben. Ein bevorzugtes Verfahren
ist die Deletion einiger oder aller der Neisseria meningitidis cps-Gene,
die für
die Polysaccharidbiosynthese und den Polysaccharidexport erforderlich
sind. Für diesen
Zweck kann das Austauschplasmid pMF121 (beschrieben in Frosh et
al., 1990, Mol. Microbiol. 4:1215–1218) zur Übertragung einer Mutation verwendet
werden, die den cpsCAD-(+galE)-Gencluster deletiert. Alternativ
könnte
das siaD-Gen deletiert oder dessen Expression abreguliert werden
(das Meningokokken-siaD-Gen
codiert alpha-2,3-Sialyltransferase, ein Enzym, das zur Kapselpolysaccharid-
und LOS-Synthese erforderlich ist). Solche Mutationen können auch
Wirt-ähnliche
Strukturen auf dem Saccharid-Teil des LPS der Bakterien entfernen.
-
Kombinationen der Verfahren a)–e)
-
Man
mag einsehen, daß eines
oder mehrere der obigen Verfahren verwendet werden können, um
einen modifizierten Stamm zu erzeugen, um daraus verbesserte Bläschenzubereitungen
der Erfindung herzustellen. Bevorzugt wird ein solches Verfahren
verwendet, besonders bevorzugt werden zwei oder mehr (2, 3, 4 oder
5) der Verfahren verwendet, um den Bläschenimpfstoff herzustellen.
Da jedes zusätzliche
Verfahren in der Herstellung des Bläschenimpfstoffs verwendet wird,
arbeitet jede Verbesserung in Verbindung mit den anderen verwendeten
Verfahren, um eine optimierte manipulierte Bläschenzubereitung herzustellen.
-
Eine
bevorzugte Bläschenzubereitung
aus Menigokokken (insbesondere N. meningitidis B) umfaßt die Verwendung
der Verfahren b), c) und e) (gegebenenfalls kombiniert mit Verfahren
a)). Solche Bläschenzubereitungen
sind sicher (keine Strukturen ähnlich
den Wirtstrukturen), nicht-toxisch und so strukturiert, daß die Immunreaktion
des Wirtes auf große
Mengen von schützenden
(und bevorzugt konservierten) Antigenen fokussiert werden wird.
-
Alle
obigen Elemente arbeiten zusammen, um einen optimierten Bläschenimpfstoff
bereitzustellen.
-
Ähnlich wie
für M.
catarrhalis, nicht-typisierbares H. influenzae, Gonococcus und Nicht-Serotyp
B-Meningokokkenstämme
(z.B. Serotyp A, C, Y oder W) umfassen bevorzugte Bläschenzubereitungen
die Verwendung der Verfahren b) und c), gegebenenfalls kombiniert
mit Verfahren a).
-
Bevorzugte Neisseria-Bläschenzubereitungen
-
Eines
oder mehrere der folgenden Gene (die schützende Antigene codieren) sind
zur Aufregulation über
Verfahren b) bevorzugt, wenn es an einem Neisseria-Stamm durchgeführt wird,
einschließlich
Gonococcus und Meningococcus (insbesondere N. meningitidis B): NspA
(WO 96/29412), Hsf-artig
(WO 99/31132), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (WO 00/23595),
PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO 96/31618),
TbpA (
US 5,912,336 ),
TbpB, FrpA/FrpC (WO 92/01460), LbpA/LbpB (PCT/EP98/05117), Fhab
(WO 98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), Tbp2
(WO 99/57280), MltA (WO 99/57280) und ctrA (PCT/EP00/00135). Sie
sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative
Bakterien eingeführt
werden können.
-
Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind zur Abregulation über Verfahren
a) bevorzugt: PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa und
Opc (am meisten bevorzugt PorA).
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Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren
c): htrB, msbB und LpxK (am meisten bevorzugt msbB, das nur eine
einzelne sekundäre
Acylkette vom LPS-Molekül entfernt).
-
Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren
d): pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.
-
Eines
oder mehrerer der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren
e): galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC und ctrD (die
Gene werden in WO 01/09350 beschrieben).
-
Viele
der obigen offenen Leseraster und stromaufwärts gelegenen Regionen werden
in WO 01/09350 beschrieben.
-
Bevorzugte
Gonokokken-Gene zur Aufregulation über Verfahren b) schließen eines
oder mehrere der folgenden ein:
-
Bevorzugte
Gonokokkengene zur Abregulation über
Verfahren a) schließen
eines oder mehrere der folgenden ein:
-
Bevorzugte Pseudomonas aeruginosa-Bläschenzubereitungen
-
Eines
oder mehrere der folgenden Gene (die Schutzantigene codieren) sind
bevorzugt zur Aufregulation über
Verfahren b): PcrV, OprF, OprI. Sie sind auch als Gene bevorzugt,
die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden
können.
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Bevorzugte Moraxella catarrhalis-Bläschenzubereitungen
-
Eines
oder mehrerer der folgenden Gene (die Schutzantigene codieren) sind
bevorzugt zur Aufregulation über
Verfahren b): OMP106 (WO 97/41731 & WO 96/34960), HasR (PCT/EP99/03824),
PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85 (PCT/EP00/01468), lipo06 (
GB 9917977.2 ), lipo10 (
GB 9918208.1 ), lipo11 (
GB 9918302.2 ), lipo18 (
GB 9918038.2 ), P6 (PCT/EP99/03038),
ompCD, CopB (M.E. Helminen et al., (1993) Infect. Immun. 61:2003–2010),
D15 (PCT/EP99/03822), OmplA1 (PCT/EP99/06781), Hly3 (PCT/EP99/03257), LbpA
und LbpB (WO 98/55606), TbpA and TbpB (WO 97/13785 & WO 97/32980),
OmpE, UspA1 und UspA2 (WO 93/03761), FhaB (WO 99/58685) und Omp21.
Sie sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative
Bakterien eingeführt
werden können.
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Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren
a): CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA und LbpB.
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Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren
c): htrB, msbB und IpxK (am meisten bevorzugt msbB).
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Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren
d): pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.
-
Viele
der obigen offenen Leseraster und stromaufwärts gelegenen Regionen werden
in WO 01/09350 beschrieben.
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Bevorzugte Haemophilus influenzae-Bläschenzubereitungen
-
Eines
oder mehrerer der folgenden Gene (die schützende Antigene codieren) sind
bevorzugt zur Aufregulation über
Verfahren b): D15 (WO 94/12641), P6 (
EP
281673 ), TbpA, TbpB, P2, P5 (WO 94/26304), OMP26 (WO 97/01638),
HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, Iomp1457 (
GB 0025493.8 ), YtfN (
GB 0025488.8 ), VirG (
GB 0026002.6 ), Iomp1681
(
GB 0025998.6 ), OstA
(
GB 0025486.2 ) und
Hif (alle Gene in diesem Operon sollten aufreguliert werden, um
Pilin aufzuregulieren). Sie sind auch bevorzugt als Gene, die heterolog
in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden können.
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Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren
a): P2, P5, Hif, IgA1-Protease, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA
und TbpB.
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Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Abregulation über Verfahren
c): htrB, msbB und LpxK (am meisten bevorzugt msbB).
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Eines
oder mehrere der folgenden Gene sind bevorzugt zur Aufregulation über Verfahren
d): pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.
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Viele
der obigen offenen Leseraster und stromaufwärts gelegenen Regionen werden
in WO 01/09350 beschrieben.
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Zubereitungen von Membranvesikeln (Bläschen) der
Erfindung
-
Die
Herstellung von Bläschenzubereitungen
aus beliebigen der zuvor genannten modifizierten Stämme kann
durch Ernten von natürlich
durch die Bakterien abgestoßenen
Bläschen
oder durch jedes der einem Fachmann wohlbekannten Verfahren erreicht
werden (z.B. wie in
EP 301992 ,
US 5,597,572 ,
EP 11243 oder
US 4,271,147 offenbart). Für Neisseria
wird bevorzugt das im nachfolgenden Beispiel beschriebene Verfahren verwendet.
-
Bevorzugt
kann die Zubereitung von Membranvesikeln durch eine 0,22 μm-Membran
filtriert werden.
-
Eine
sterile (bevorzugt homogene) Zubereitung von Membranvesikeln, die
durch Leiten der Membranvesikel durch eine 0,22 μm-Membran erhältlich ist,
wird ebenfalls erwogen.
-
Impfstofformulierungen
-
Eine
bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung ist die Formulierung der Bläschenzubereitungen der Erfindung
in einem Impfstoff, der auch einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten
umfassen kann.
-
Die
Impfstoffherstellung wird allgemein beschrieben in "Vaccine Design-The
subunit and adjuvant approach",
Hrsg. M.F. Powell & M.J.
Newman, (1995) Plenum Press, New York).
-
Die
Bläschenzubereitungen
der vorliegenden Erfindung können
in der Impfstofformulierung der Erfindung mit Hilfsstoff versetzt
werden. Geeignete Hilfsstoffe schließen ein Aluminiumsalz wie Aluminiumhydroxidgel
(Alaun) oder Aluminiumphosphat ein, aber können auch ein Salz von Calcium
(insbesondere Calciumcarbonat), Eisen oder Zink sein, oder können eine
unlösliche
Suspension von acyliertem Tyrosin oder acylierten Zuckern, kationisch
oder anionisch derivatisierten Polysacchariden oder Polyphosphazenen
sein.
-
Geeignete
Th1-Hilfsstoffsysteme, die verwendet werden können, schließen Monophosphoryllipid
A, insbesondere 3-des-O-acyliertes Monophosphoryllipid A, und eine
Kombination aus Monophosphoryllipid A, bevorzugt 3-des-O-acyliertem
Monophosphoryllipid A (3D-MPL), zusammen mit einem Aluminiumsalz
ein. Ein gesteigertes System ivolviert die Kombination eines Monophosphoryllipid
A und eines Saponin-Derivats, insbesondere die Kombination aus QS21
und 3D-MPL, wie in WO 94/00153 offenbart, oder eine weniger reaktogene
Zusammensetzung, worin das QS21 mit Cholesterin abgeschreckt ist,
wie in WO96/33739 offenbart. Eine besonders wirksame Hilfsstoffformulierung,
die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in
WO95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.
-
Der
Impfstoff kann ein Saponin umfassen, besonders bevorzugt QS21. Er
kann auch eine Öl-in-Wasser-Emulsion
und Tocopherol umfassen. Unmethylierte CpG-haltige Oligonukleotide
(WO 96/02555) sind auch bevorzugte Induktoren einer TH1-Reaktion
und sind geeignet zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung.
-
Die
Impfstoffzubereitung der vorliegenden Erfindung kann zum Schützen oder
Behandeln eines für eine
Infektion anfälligen
Säugetiers
mittels Verabreichung des Impfstoffs über den systemischen oder mukosalen
Weg verwendet werden. Diese Verabreichungen können die Injektion über die
intramuskulären,
intraperitonealen, intradermalen oder subkutanen Wege; oder über die
mukosale Verabreichung in die oralen/Ernährungs-, respiratorischen oder
urogenitalen Trakte einschließen.
-
Die
Menge an Antigen in jeder Impfstoffdosis wird als eine Menge ausgewählt, die
eine immunprotektive Reaktion ohne signifikante, nachteilige Nebenwirkungen
in typischen Impflingen induziert. Eine solche Menge wird in Abhängigkeit
davon variieren, welches spezifische Immunogen eingesetzt wird und
wie es präsentiert
wird. Allgemein wird erwartet, daß jede Dosis 1–100 μg Proteinantigen,
bevorzugt 5–50 μg und besonders
typisch im Bereich von 5–25 μg umfassen
wird.
-
Eine
optimale Menge für
einen besonderen Impfstoff kann durch Standardstudien sichergestellt
werden, die die Beobachtung von geeigneten Immunreaktionen in Probanden
beinhalten. Nach einer Erstimpfung können Probanden ein oder mehrere
Auffrischungsimpfungen in angemessenem Abstand erhalten.
-
Ghost- oder abgetötete Ganzzellimpfstoffe
-
Die
Erfinder erwägen,
daß die
obigen modifizierten bakteriellen Stämme nicht nur nützlich in
der Erzeugung von Bläschenzubereitungen
sein können,
die nützlich
in Impfstoffen sind – sie
können
auch leicht zur Herstellung von Ghost- oder abgetöteten Ganzzellzubereitungen
und -Impfstoffen (mit identischen Vorteilen) verwendet werden. Verfahren
zur Herstellung von Ghost-Zubereitungen (leere Zellen mit intakten
Hüllen)
aus Gram-negativen Stämmen
sind allgemein fachbekannt (siehe zum Beispiel WO 92/01791). Verfahren
zum Abtöten
von ganzen Zellen zur Herstellung inaktivierter Zellzubereitungen
zur Verwendung in Impfstoffen sind ebenfalls wohlbekannt. Die Begriffe "Bläschenzubereitungen" und "Bläschenimpfstoffe" sowie die in diesem Dokument
beschriebenen Verfahren sind deshalb auf die Begriffe "Ghost-Zubereitung" und "Ghost-Impfstoff" bzw. "abgetötete Ganzzellzubereitung" und "abgetöteter Ganzzellimpfstoff" für die Zwecke
dieser Erfindung anwendbar.
-
Beispiele
-
Die
nachfolgenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken
durchgeführt,
die den Fachleuten wohlbekannt und für sie Routine sind, ausgenommen
wenn im Detail anders beschrieben. Die Beispiele sind illustrativ,
aber beschränken
nicht die Erfindung.
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Beispiel 1: Zuvor angegebene Beispiele
-
Die
Beispiele wurden in WO 01/09350 beschrieben: Konstruktion eines
Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stammes, dem Kapselpolysaccharide
fehlen; Konstruktion von vielseitigen Genübertragungsvektoren (die pCMK-Reihe), die die Integration
in den porA-Locus von Neisseria meningitidis ausrichten; Konstruktion
eines Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stammes, dem sowohl Kapselpolysaccharide
als auch das hauptsächliche
immundominante Antigen PorA fehlen; Aufregulation der NspA-Außenmembranproteinproduktion
in Bläschen,
die aus einem rekombinanten Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm
stammen, dem funktionelle porA- und cps-Gene fehlen; Aufregulation
des D15/Omp85-Außenmembranproteinantigens
in Bläschen,
die aus einem rekombinanten Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm
stammen, dem funktionelle cps-Gene fehlen, der aber PorA exprimiert;
Konstruktion von vielseitigen Promotorübertragungsvektoren; Fermentationsverfahren
zur Erzeugung rekombinanter Bläschen;
Identifizierung von bakteriellen Promotoren, die zur Aufregulation
von Antigen-codierenden Genen geeignet sind; Aufregulation des N.
meningitidis Serogruppe B Omp85-Gens durch Promotoraustausch; Aufregulation
des Hsf-Proteinantigens in einem rekombinanten Neisseria meningitidis
Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, der aber PorA
exprimiert; Expression des grün
fluoreszierenden Proteins in einem rekombinanten Neisseria meningitidis
Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, der aber PorA
exprimiert; Aufregulation des N. meningitidis Serogruppe B NspA-Gens
durch Promotoraustausch; Aufregulation des N. meningitidis Serogruppe
B pldA-(omp1A)-Gens
durch Promotoraustausch; Aufregulation des N. meningitidis Serogruppe
B tbpA-Gens durch Promotoraustausch; Aufregulation des N. meningitidis
Serogruppe B pilQ-Gens durch Promotoraustausch; Konstruktion einer
kanR/sacB-Kassette zur Einführung
von "sauberen", unmarkierten Mutationen
in das N. meningitidis-Chromosom; Verwendung von kleinen rekombinogenen
Sequenzen (43 bp), um die homologe Rekombination im Chromosom von
Neisseria meningitidis zu erlauben; aktiver Schutz von mit WT und rekombinanten
Neisseria meningitidis-Bläschen
immunisierten Mäusen;
und Immunogenität
von rekombinanten Bläschen,
gemessen durch Ganzzell- und spezifische ELISA-Verfahren.
-
Beispiel 2: Gonokokkenbläschen, die
Chlamydia trachomatis-Proteine auf ihrer Oberfläche exprimieren, zur Verwendung
in einer Impfstoffzusammensetzung
-
Sowohl
Chlamydia trachomatis als auch N. gonorrhoeae verursachen geschlechtlich übertragene Krankheiten,
die Urethritis, Cervicitis, Salpingitis und entzündliche Beckenerkrankung einschließen. Eine
gemischte Infektion mit sowohl CT als auch GC tritt auf. Deshalb
schafft in der Entwicklung eines Impfstoffs, der auf eine oder mehrere
dieser Krankheiten abzielt, die Möglichkeit, Schutz gegen beide
Organismen mit einer Einzelformulierung zu liefern, einen technischen
Vorteil.
-
Schutz gegen N. gonorrhoeae
-
N.
gonorrhoeae OMV-Impfstoff kann auch Bläschen-erzeugendem Stamm (Stämmen) erhalten
werden, in dem die Expression eines oder mehrerer Gene auf- oder
abreguliert wurde. Eine Liste von Genen, die N. gonorrhoeae-Proteine codieren,
für die
es besonders nützlich
ist, die Regulation auf/abzuregulieren, ist oben bereitgestellt.
-
Ein
erfolgreicher Impfstoff zur Prävention
von Infektion durch N. gonorrhoeae kann mehr als eines der folgenden
Elemente erfordern: Erzeugung von Serum- und/oder mukosalen Antikörpern zur
Erleichterung der Komplement-vermittelten
Abtötung
des Gonucoccus und/oder zur Steigerung von Phagozytose und mikrobieller
Abtötung
durch Leukozyten wie polymorphkernige Leukozyten und/oder zur Verhinderung
der Anhaftung der Gonokokken an den Wirtsgeweben; Induzierung einer
Zell-vermittelten Immunreaktion kann ebenfalls zum Schutz beitragen.
-
Das
Potential einer Bläschen-Gonokokken-Impfstoffzubereitung
kann durch Analysieren der induzierten Immunreaktion auf Serum-
und/oder mukosale Antikörper
ausgewertet werden, die Antianhaftung und/oder opsonisierende Eigenschaften
und/oder bakterizide Aktivität
besitzen, wie von anderen beschrieben (D. McChesney et al., Infect.
Immun. 36: 1006, 1982; J. Boslego et al.: "Efficacy trial of a purified gonococcal
pilus vaccine",
Programm und Zusammenfassung der 24. Interscience Conference on
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Whashington, Amercian Society
for Microbiology, 1984; M. Siegel et al., J. Infect. Dis. 145:300, 1982;
de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913–20, 1995).
-
Ein
Mäusemodell
von genitaler Infektion durch N. gonorrhoeae wurde kürzlich beschrieben
(M. Plante, J. Infect. Dis., 182: 848–55, 2000). Die Wirksamkeit
eines Bläschen-Gonokokkenimpfstoffs
könnte
auch durch seine Fähigkeit
zur Prävention
oder zur Reduzierung der Besiedelung durch N. gonorrhoeae in diesem
Mäusemodell
der Infektion ausgewertet werden.
-
Schutz gegen CT
-
Ein
GC/CT-Bläschenimpfstoff
kann aus einem Stamm erhalten werden, der ein oder mehrere Chlamydiagene
exprimiert, bevorzugt ausgewählt
aus der obigen Liste von Genen, die vorhergesagte Außenmembranproteine
codieren.
-
Andere
Gene von Interesse zur Überexpression
in Neisseria sind C. trachomatis-Gene, für die kein Homolog in C. pneumoniae
gefunden wurde. Ein solcher Satz von Genen wurde beschrieben in
S. Richard, "Chlamydia:
Intracellular Biology, Pathogenesis and Immunity", S. 9–27, Stephens, Hrsg., ASM Press,
Washington DC, ISBN: 1-55581-155-8, Seiten: 380.
-
Die
am meisten bevorzugten Kombinationen von Chlamydia trachomatis-Genen sind wie folgt: Hauptaußenmembranprotein
MOMP (aus einem oder mehreren unterschiedlichen Serovars) und das
Außenmembranproteinanalogon
(auch als PorB bekannt), MOMP (aus einem oder mehreren unterschiedlichen
Serovars) und das mutmaßliche
Außenmembranprotein
G (pmpG); und PorB und pmpG.
-
Obwohl
die Immunität
gegen CT nicht vollständig
verstanden wird, gibt es Hinweise, daß Antikörper eine Rolle im Schutz spielen.
Antikörper
gegen CT in Genitalflüssigkeiten
wurden mit Immunität
gegen CT in Verbindung gebracht (R.C. Brunham, Infect Immun. März 1983,
39(3): 149-4). Eine schützende
Rolle von Serumantikörper
in der Immunität
gegen genitale Chlamydia-Infektion wurde ebenfalls gezeigt (R.G.
Rank, Infect. Immun., Jan. 1989; 57(1): 299–301). Es wurde ebenfalls gezeigt,
daß Antikörper, z.B.
MOMP-spezifische Antikörper,
eine CT-Infektion in vitro und in vivo neutralisieren können (Caldwell
et al., 1982, Infect. Immun. 38: 745–54, Lucero et al., 1985, Infect.
Immun. 50: 595–97,
Zhang et al., 1987, J. Immunol. 138: 575–581). Es wurde ebenfalls gezeigt,
daß das
MOMP-Oberflächenantigen
von CT nicht-lineare Oberflächenepitope
trägt,
die das Ziel neutralisierender Antikörper sind (J. Fan, J. Infect.
Dis. 1997, 176(3): 713–21).
-
Somit
schließt
ein wichtiges Ziel in der Konstruktion eines schützenden Chlamydia-Impfstoffs
die Identifizierung einer Formulierung (Formulierungen) der CT-Antigene
ein, die die Induzierung einer Chlamydia-spezifischen Antikörperreaktion optimieren können. Die
Optimierung der Antikörperreaktion
schließt
das Abzielen auf die genitale Schleimhaut und/oder die Präsentation
von angemessen gefalteten Chlamydia-Antigenen und/oder die Kombination
mehrerer Antikörperziele
ein.
-
Die
mukosale Ausrichtung der Immunreaktion gegen Chlamydia-Antigen kann
durch mukosale Verabreichung des Impfstoffs erreicht werden. Die intranasale
Verabreichung eines Außenmembranvesikelimpfstoffs
kann andauernde lokale mukosale Antikörper und Serumantikörper mit
starker bakterizider Aktivität
in Menschen induzieren.
-
Für bestimmte
B-Zellepitope wie nicht-lineare Epitope ist die Präsentation
des Antigens für
das Immunsystem in einer geeignet gefalteten Weise kritisch. Ein
aus einem Stamm, der Chlamydia-Antigen e) exprimiert, hergestellter
Bläschenimpfstoff
bietet für
Chlamydia-OMP eine Außenmembranumgebung,
die kritisch zur Aufrechterhaltung dieser Antigene in einer geeignet
gefalteten Struktur sein kann.
-
Die
Kombination mehrerer Antikörperziele
kann eine erhöhte
Wirksamkeit durch Angreifen der Infektion zu unterschiedlichen Schritten
des Lebenszyklus der Bakterien schaffen, wie zum Beispiel bei der
Adhäsion
an die Wirtszelle, Internalisierung durch die Wirtszelle und/oder
Wechselwirkung mit weiteren Schritten der intrazellulären Entwicklung.
-
Die
Induzierung und Rekrutierung von Th1-Zellen in die lokalen genitalen
Schleimhäute
sind wichtig für
die Immunität
gegen Chlamydia. Somit schließt
ein wichtiges Ziel in der Konstruktion eines schützenden Anti-Chlamydia-Impfstoffs
die Identifizierung einer Formulierung (Formulierungen) von CT-Antigen(en)
ein, die die Induzierung von Chlamydia-spezifischen Th1-Zellen und
bevorzugt die Rekrutierung dieser Zellen in die genitalen Schleimhäute optimieren
kann. Ein aus einem Stamm, der Chlamydia-Antigen(e) exprimiert, hergestellter
Bläschenimpfstoff
kann eine Chlamydia-spezifische
CMI-Reaktion induzieren. Antigen-spezifische T-Zellreaktionen können in
Menschen nach intranasaler Immunisierung mit einem Außenmembranvesikelimpfstoff
induziert werden.
-
Ein
besonderer Vorteil eines GC/CT-Bläschenimpfstoffs ist seine Fähigkeit
zur Induzierung von sowohl Antikörper-
als auch CMI-Reaktionen.
-
Die
Wirksamkeit des GC/CT-Bläschenimpfstoffs
kann durch seine Fähigkeit
zur Hervorrufung von Antigen- oder Chlamydia-spezifischen Antikörper- und/oder CMI-Reaktionen
ausgewertet werden. Antikörper-Reaktionen
können
durch klassische Techniken wie ELISA oder Western-Blot ausgewertet
werden. Bevorzugt können
die induzierten Antikörper
die Infektiosität
von Chlamydia in einem in-vitro-Test neutralisieren (G. Byrne et
al., J. Infect. Dis., Aug. 1993; 168(2): 415–20). Bevorzugt ist die CMI-Reaktion
zum Th1-Phänotyp verschoben.
Eine Th1-verschobene Immunreaktion kann durch erhöhte Antigenspezifische
IgG2a/IgG1-Verhältnisse
in Mäusen
beurteilt werden (Snapper et al., 1987, Science 236:944–47). Ein
erhöhtes
Verhältnis
von Th1/Th2-Cytokin,
z.B. ein erhöhtes
IFN-gamma/IL-5-Verhältnis,
nach in-vitro- Restimulation
von Immun-T-Zellen mit dem Antigen (Antigenen) kann auch eine solche
verschobene Th1-Reaktion anzeigen.
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Die
Fähigkeit
der Formulierung, Antigen-spezifische mukosale Antikörper hervorzurufen,
ist von besonderem Interesse und kann durch Detektion von Antikörpern wie
IgG und/oder IgA in mukosalen Flüssigkeiten
wie Sekreten des Genitaltrakts und Vaginalspülungen gezeigt werden. In dieser
Hinsicht kann ein bestimmter Verabreichungsweg des Impfstoffs besonders
erwünscht
sein, wie intranasale, orale, intravaginale und intradermale Übertragungen.
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Die
Wirksamkeit des GC/CT-Bläschenimpfstoffs
kann durch seine Fähigkeit
zur Induzierung von Schutz gegen eine Chlamydia-Exposition in einem
Tiermodell (Tiermodellen) ausgewertet werden. Beispiele für solche
Tiermodelle wurden in der Literatur beschrieben: genitale Infektion
mit MoPn in Mäusen
(Barron et al., J. Infect. Dis. 1143:63–66), genitale Infektion mit
humanen Stämmen
in Mäusen
(Igietseme et al., 2000, Infect. Immun. 68:6798–806, Tuffrey et al. 1992,
J. Gen. Microbiol. 138: 1707–1715),
genitale Infektion mit einem GPIC-Stamm in Meerschweinchen (Rank
et al., 1992, Am. J. Pathol. 140:927–936). Schutz gegen Infektion
kann durch Reduzierung der abgesonderten Chlamydien aus dem infizierten
Ort und/oder eine Reduzierung der histopathologischen Reaktionen
nach einer Kontaktinfektion in immunisierten Tieren getestet werden.
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Der
Vorteil der Kombination von zwei oder mehr Chlamydia-Antigenen (wie
oben beschrieben) kann durch eine oder mehrere der folgenden Techniken
ausgewertet werden:
- – Fähigkeit zur Hervorrufung einer
mehrschichtigen Antikörper- und/oder T-Zell-Schutzreaktion.
- – Fähigkeit
zur Hervorrufung von Antikörpertitern
in einem neutralisierenden Test in vitro und/oder von neutralisierendem
Antikörper
gegen mehrfache Stämme
(antigenisch verschieden)
- – Fähigkeit
zur Hervorrufung einer Schutzimmunreaktion gegen Chlamydia in einem
Mäusemodell
der genitalen Infektion gemäß Test durch
eine reduzierte Absonderung von Bakterien und/oder Pathologie nach Exposition.
-
Beispiel 3: Expression von heterologen
Antigenen (Chlamydia trachomatis MOMP und PorB) in Bläschen, die aus
einem rekombinanten Neisseria meningitidis Serogruppe B-Stamm stammen,
dem funktionale porA- und cps-Gene
fehlen
-
Andere
Gene von Interesse zur Überexpression
in Neisseria sind Chlamydia trachomatis-Gene, für die kein Homolog in Chlamydia
pneumoniae gefunden wurde. Darunter wurde gezeigt, daß das Hauptaußenmembranprotein
(MOMP) und das Außenmembranproteinanalogen
(PorB) eine schützende
Rolle gegen genitale Chlamydia-Infektion spielen. Die Optimierung
der Antikörperreaktion
könnte
durch Präsentation
von geeignet gefalteten Proteinen erreicht werden.
-
MenB-Bläschenvesikel
können
als Übertragungsvektoren
zur Expression heterologer Membranproteinantigene unter der Kontrolle
des veränderten
porA-lacO-Promotors verwendet werden, der in WO 01/09350 beschrieben
wird. Exprimiert im Bläschenzusammenhang
können
rekombinantes MOMP und PorB aus Chlamydia trachomatis Serovar D
und K in der Membran korrekt gefaltet und an der Oberfläche exponiert
werden. Neisseria meningitidis-Stämme, denen funktionelle cps-Gene
fehlen, werden vorteilhaft als Empfängerstämme zur Expression der heterologen
Antigene verwendet (WO 01/09350).
-
PCR-Amplifikationen der Gene, die für MOMP codieren
(Chlamydia trachomatis)
-
Murine
McCoy-Zellen (ATCC), die mit entweder Chlamydia trachomatis Serovar
K (UW31-CX-serK) oder Serovar D (UW31-CX-serD) infiziert waren,
wurden in 400 μl
Lysepuffer lysiert: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45 % Nonidet P40, 0,45 % Tween 20, enthaltend
60 μg/ml
Proteinase K, 3 Stunden bei 56°C.
10 μl des
Lysats wurden als Matrize zur Amplifizierung der entsprechenden
Gene verwendet. Das Gen, das für
MOMP codiert (Serovar K) (SEQ ID NO:1 unten), wurde unter Verwendung
der Oligonukleotidprimer CYK/OMP/5/NDE und CYKD/OMP/3/BG PCR-amplifiziert
(siehe Tabelle 1). Das Gen, das für MOMP codiert (Serovar D)
(SEQ ID NO:2 unten), wurde unter Verwendung der Oligonukleotidprimer CYD/OMP/5/NRU
und CYKD/OMP/3/BG PCR-amplifiziert (siehe Tabelle 1). Die für die PCR-Amplifikation verwendeten
Bedingungen waren die vom Lieferanten beschrieben (HiFi DNA-Polymerase,
Boehringer Mannheim GmbH). Der Thermozyklus war der folgende: 25-mal
(94°C 1
min., 52°C
1 min, 72°C
3 min) und einmal (72°C
10 min, 4°C
bis zur Gewinnung). Die entsprechenden Amplikons (1194 bp) wurden
mit entweder NdeI/BglII- oder NruI/BglI2-Restriktionsenzymen verdaut
und können
in die entsprechenden Restriktionsorte von pCMK(+)-Übertragungsvektor
kloniert werden (wie in WO 01/09350 beschrieben).
-
PCR-Amplifikationen der Gene, die für PorB codieren
(Chlamydia trachomatis)
-
Murine
McCoy-Zellen (ATCC), die mit entweder Chlamydia trachomatis Serovar
K (UW31-CS-serK) oder Serovar D (UW31-CX-serD) infiziert waren,
wurden in 400 μl
Lysepuffer lysiert: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 2,5 mM MgCl2, 0,45 % Nonidet P40, 0,45 % Tween 20, enthaltend
60 μg/ml
Proteinase K, 3 Stunden bei 56°C.
10 μl des
Lysats wurden als Matrize zur Amplifikation der entsprechenden Gene
verwendet.
-
PorB-Sequenzen
sind hoch konserviert unter den Serovars D und K (SEQ ID NO:3 unten).
Die gleichen Primer wurden zur Amplifikation der entsprechenden
Gene in beiden Serovars verwendet: CYD/PORB/5/NRU und CYD/PORB/3/BG
(siehe Tabelle 1). Die für
die PCR-Amplifikation verwendeten Bedingungen waren die vom Lieferanten
beschriebenen (HiFi DNA-Polymerase, Boehringer Mannheim GmbH). Der Thermozyklus
war wie folgt: 25-mal (94°C
1 min, 52°C
1 min, 72°C
3 min) und 1-mal (72°C
10 min, 4°C
bis zur Gewinnung). Die entsprechenden Amplikons (1035 bp) wurden
mit NruI/BglII-Restriktionsenzymen
verdaut und können
in die entsprechenden Restriktionsorte von pCMK(+)-Übertragungsvektor
kloniert werden (wie in WO 01/09350 beschrieben).
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Transformation
-
Linearisierte
rekombinante pCMK-Plasmide können
innerhalb eines Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stammes transformiert
werden, dem funktionelle cps-Gene fehlen (beschrieben in WO 01/09350).
Die aus einem Doppel-Crossing-over zwischen den pCMK-Vektoren und
dem chromosomalen porA-Locus
resultierende Integration kann durch eine Kombination von PCR und
Western-Blot-Durchmusterung wie in WO 01/09350 beschrieben selektiert
werden.
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Tabelle
1: In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide
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SEQ
ID NO:1 Nukleotidsequenz
von DNA, die für
Chlamydia trachomatis MOMP Serovar K-Protein codiert.
-
SEQ
ID NO:2 Nukleotidsequenz
von DNA, die für
Chlamydia trachomatis MOMP Serovar D-Protein codiert.
-
SEQ
ID NO:3 Nukleotidsequenz
von DNA, die für
Chlamydia trachomatis PorB Serovar D-Protein codiert.
-
-
Beispiel 4: Isolierung und Reinigung von
Bläschen
von Menigokokken, denen Kapselpolysaccharid fehlt
-
Rekombinante
Bläschen
können
wie nachfolgend beschrieben gereinigt werden. Die Zellpaste (42
g) wird in 211 ml von 0,1 M Tris-Cl-Puffer, pH 8,6, der 10 mM EDTA
und 0,5 % Natriumdesoxychlolat (DOC) enthält, suspendiert. Das Verhältnis von
Puffer zu Biomasse sollte 5/1 (V/G) sein. Die Biomasse wird durch
Rühren
mit einem Magnetrührer
für 30
Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Der Gesamtextrakt wird dann
mit 20 000 g für
30 Minuten bei 4°C
zentrifugiert (13 000 U/min in einem JA-20-Rotor, Beckman J2-HS-Zentrifuge). Das
Pellet sollte verworfen werden. Der Überstand wird mit 125 000 g
für 2 Stunden
bei 4°C
ultrazentrifugiert (40 000 U/min in einem 50.2 Ti-rotor, Beckman
L8-70M-Ultrazentrifuge), um Vesikel aufzukonzentrieren. Der Überstand
sollte verworfen werden. Das Pellet wird vorsichtig in 25 ml von
50 mM Tris-Cl-Puffer, pH 8,6, der 2 mM EDTA, 1,2 % DOC und 20 %
Saccharose enthält,
suspendiert. Nach einem zweiten Ultrazentrifugenschritt mit 125
000 g für
2 Stunden bei 4°C
werden die Vesikel vorsichtig in 44 ml 3%iger Saccharose suspendiert
und bei 4°C
gelagert. Alle für
die Bläschenextraktion
und Reinigung verwendeten Lösungen
enthielten 0,01 % Thiomersalat. Wie in WO 01/019350 veranschaulicht,
liefert dieses Verfahren Proteinzubereitungen, die stark mit Außenmembranproteinen
angereichtert sind.
-
Beispiel 5: Modelle zur Untersuchung von
Schutz gegen Gonokokken- und C. trachomatis-Infektion
-
Die
kann wie oben in Beispiel 2 beschrieben erfolgen. Zusätzlich ist
Whittum-Hudson et al. (Vaccine 16. Juli 2001; 19(28–29): 4061–71), "The anti-idiotypic
antibody to chlamydial glycolipid exoantigen (GLXA) protects mice
against genital infection with a human biovar of Chlamydia trachomatis", ein vaginales Impfmodell
für C.
trachomatis, das auch zur Untersuchung von Impfstoffwirksamkeit
verwendet werden kann. SEQUENZPROTOKOLL