ES2284840T3 - Vacuna contra chlamydia basada en ampollas. - Google Patents

Vacuna contra chlamydia basada en ampollas. Download PDF

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F-X Jacqueline GlaxoSmithKline Bio S.A. BERTHET
Yves GlaxoSmithKline Biologicals S.A. LOBET
Jan GlaxoSmithKline Biologicals S.A. POOLMAN
Vincent GlaxoSmithKline Biological S.A. VERLANT
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Abstract

Una ampolla bacteriana Gram-negativa no derivada de Chlamydia, que presenta en su superficie la proteína de membrana externa PorB de Chlamydia trachomatis, en la que la combinación del antígeno de Chlamydia con los antígenos de ampolla bacteriana Gram-negativa nativa interacciona en la prevención o tratamiento de la salpingitis cuando están presentes en una formulación de vacuna.

Description

Vacuna contra Chlamydia basada en ampollas.
Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de composiciones de vacuna DE bacterias Gram-negativas y su fabricación. Más particularmente se refiere al campo de composiciones de vesículas de membrana externa (o ampollas) de bacterias Gram-negativas que comprende antígenos de Chlamydia expresados de forma heteróloga, y procedimientos ventajosos para hacer a estas composiciones más eficaces y seguras como vacuna.
Antecedentes de la invención
Chlamydia son bacterias Gram-negativas intracelulares obligadas que se replican solamente en inclusiones citoplásmicas de células eucariotas. Tienen un único ciclo de desarrollo que está representado por dos formas principales, el cuerpo elemental (EB) tipo espora que es la forma infecciosa transmitida de una célula a otra, y el cuerpo reticulado (RB) metabólicamente activo que se replica dentro de la célula huésped.
De las cuatro especies clamidiales conocidas, Chlamydia trachomatis y C. pneumoniae son los patógenos humanos importantes. La especie C. pneumoniae definida recientemente (Grayston 1989) se reconoce actualmente como una causa principal de infecciones del tracto respiratorio (Grayston 1993) y cada vez hay más datos para asociarla con aterosclerosis. La asociación está apoyada por estudios seroepidemiológicos, estudios que demuestran la presencia de la bacteria en las lesiones ateroscleróticas, estudios que muestran la capacidad de C. pneumoniae para replicarse en los diferentes tipos celulares presentes en las lesiones ateroscleróticas, ensayos de intervención con antibióticos en pacientes con arteriopatía coronaria e infección experimental del tracto respiratorio en conejos o ratones deficientes en apolipoproteína-E que conduce a cambios inflamatorios en la aorta (Danesh 1997, Fong 1997, Laitinen 1997, Moazed 1997). En conjunto, esos datos implican a C. pneumoniae como un factor causante y/o agravante de
aterosclerosis.
C. trachomatis es un patógeno humano principal; transmitido de una ser humano a otro (no se conoce reserva animal), causa infecciones oculares y genitales que pueden producir secuelas a largo plazo. El tracoma, una infección ocular clamidial, es endémica en varios países en vías de desarrollo y es la principal causa en el mundo de ceguera evitable con millones de personas afectadas por la enfermedad. Las infecciones genitales clamidiales constituyen la enfermedad de transmisión sexual (ETS) bacteriana más común en todo el mundo. En 1996, la OMS generó una nueva serie de estimaciones globales para cuatro ETS principales que motivaron una extensa revisión de los datos de frecuencia publicados y no publicados (Gerbase 1998). Se ha estimado que en 1995, se produjeron 4 y 5,2 millones de nuevos casos de infección por C. trachomatis en individuos de 15-49 años de edad para Norteamérica y Europa Oriental, respectivamente; en todo el mundo C. trachomatis totalizó una estimación de 89,1 millones de nuevos casos. Colectivamente, los datos muestran índices de infección superiores en mujeres en comparación con hombres (Washington 1987, Peeling 1995, Cates 1991); se encuentra mayor incidencia en adolescentes y en adultos jóvenes, presentándose aproximadamente el 70% de las infecciones por clamidiales en el grupo de edad de 15-24 años (Peeling 1995).
Existe una clara necesidad de vacunas eficaces contra Chlamydia trachomatis y Chlamydia pneumoniae.
Vesículas de membrana externa (ampollas)
Las bacterias Gram-negativas están separadas del medio externo por dos capas sucesivas de estructuras de membrana. Estas estructuras, denominadas como membrana citoplásmica y membrana externa (OM), difieren tanto estructural como funcionalmente. La membrana externa juega un papel importante en la interacción de las bacterias patogénicas con sus respectivos huéspedes. Como consecuencia, las moléculas bacterianas expuestas en superficie representan dianas importantes para la respuesta inmune del huésped, lo que hace a los componentes de la membrana externa candidatos atractivos para proporcionar reactivos de vacuna, diagnóstico y terapéuticos.
Las vacunas de bacterias de célula completa (inactivadas o atenuadas) tienen la ventaja de suministrar múltiples antígenos en su microambiente natural. Los inconvenientes relacionados con este enfoque son los efectos secundarios inducidos por componentes bacterianos tales como fragmentos de endotoxina y peptidoglicanos. Por otro lado, las vacunas de subunidad acelulares que contienen componentes purificados de la membrana externa pueden suministrar solamente protección limitada y pueden no presentar los antígenos apropiadamente al sistema inmune del
huésped.
Las proteínas, fosfolípidos y lipopolisacáridos son los tres constituyentes principales que se encuentran en la membrana externa de todas las bacterias Gram-negativas. Estas moléculas se distribuyen de forma asimétrica: los fosfolípidos de membrana (principalmente en la lámina interna), lipopolisacáridos (exclusivamente en la lámina externa) y proteínas (lipoproteínas de la lámina externa e interna, proteínas de membrana integrales o politópicas). Para muchos patógenos bacterianos que afectan a la salud humana, se ha demostrado que los lipopolisacáridos y las proteínas de membrana externa son inmunogénicos y responsables de conferir protección contra la enfermedad correspondiente mediante inmunización.
La OM de las bacterias Gram-negativas es dinámica y, dependiendo de las condiciones ambientales, puede experimentar transformaciones morfológicas drásticas. Entre estas manifestaciones, se ha estudiado y documentado la formación de vesículas de membrana externa o "ampollas" en muchas bacterias Gram-negativas (Zhoy, L. y col. 1998, FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228). Entre estas, una lista no exhaustiva de patógenos bacterianos de los que ha informado que producen ampollas incluyen: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica. Aunque el mecanismo bioquímico responsable de la producción de ampollas de OM no está completamente comprendido, estas vesículas de membrana externa se han estudiado ampliamente ya que representan una metodología potente para aislar preparaciones de proteína de membrana externa en su conformación nativa.
Los ejemplos de especies bacterianas a partir de las que pueden prepararse vacunas de ampolla se han revisado en el documento WO 01/09350. Por ejemplo, el serogrupo B de N. meningitidis (menB) excreta ampollas de membrana externa en cantidades suficientes para permitir su fabricación a escala industrial. Se ha descubierto que dichas vacunas de proteína de membrana externa multicomponentes a partir de cepas menB de origen natural son eficaces para proteger a adolescentes de enfermedad por menB y se ha registrado en Latinoamérica. Un procedimiento alternativo para preparar vesículas de membrana externa es mediante el procedimiento de extracción con detergente de las células bacterianas (documento EP 11243).
Sumario de la invención
Se ha descubierto que las ampollas de bacterias Gram-negativas son un contexto ideal para presentar proteínas de membrana externa de Chlamydia. En particular las ampollas de gonococos son útiles en el caso de presentar OMP de C. trachomatis y ampollas de meningococos son útiles en el caso de que se presenten OMP de C. pneumoniae. Esto es porque a) estas proteínas de membrana externa pueden integrarse en dichas ampollas en una conformación nativa (o casi nativa) reteniendo de este modo un efecto inmunológico útil; b) las ampollas (particularmente a partir de cepas de Neisseria) pueden producirse en cantidades industriales, c) las ampollas pueden administrarse a la mucosa, y d) la combinación de antígenos de Chlamydia con los antígenos de ampollas nativas puede tener interacciones importantes para ciertas afecciones tales como salpingitis.
La presente invención proporciona por tanto preparaciones de ampollas bacterianas Gram-negativas ventajosas (obtenidas de cepas bacterianas que producen ampollas que se enumeran a continuación, y preferiblemente no obtenidas de Chlamydia) que presentan en su superficie uno o más antígenos proteicos recombinantes (y preferiblemente heterólogos) de Chlamydia trachomatis o Chlamydia pneumoniae. También se proporcionan formulaciones de vacuna y procedimientos de administración ventajosos.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona una ampolla de bacterias Gram-negativas no obtenida de Chlamydia, que presenta en su superficie la proteína de membrana externa PorB de Chlamydia trachomatis, en la que la combinación del antígeno de Chlamydia con los antígenos de la ampolla bacteriana Gram-negativa interaccionan en la prevención o tratamiento de salpingitis cuando está presente en una formulación de vacuna.
También se proporciona un ampolla Gram-negativa no obtenida de Chlamydia, que presenta en su superficie las proteínas de membrana externa PmpG y MOMP (de una o más variedades serológicas) de Chlamydia trachomatis, en la que la combinación de los antígenos de Chlamydia con los antígenos de la ampolla bacteriana Gram-negativa nativa interaccionan en la prevención o tratamiento de salpingitis cuando está presente en una formulación de vacuna.
Además, se proporciona una ampolla Gram-negativa producida por Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis o Haemophilus influenzae que presenta en su superficie un antígeno protector de Chlamydia pneumoniae.
En el contexto de esta solicitud, la expresión "que presenta en su superficie" indica que la proteína de Chlamydia debe estar expuesta a la membrana externa de la ampolla y debe estar unida a la membrana externa (preferiblemente estando integrada en la membrana externa). Más preferiblemente debe adoptar su plegamiento nativo en el contexto de ampolla heteróloga.
Una estrategia eficaz para modular la composición de una preparación de ampolla de esta manera es suministrar una o más copias de un segmento de ADN que contiene un casete de expresión que comprende un gen que codifica dicha proteína de membrana externa de Chlamydia en el genoma de una bacteria Gram-negativa.
Una lista no exhaustiva de especies bacterianas preferidas que podrían usarse como receptores para dicho casete incluye: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa y Yersinia enterocolitica. Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, son más preferidas para este propósito, y Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis son más preferidas para preparar las ampollas de esta invención. Las OMP de Chlamydia se expresan de forma heteróloga, y en dichas situaciones no deben usarse cepas de Chlamydia para preparar las ampollas de la invención.
El gen o genes contenidos en el casete de expresión pueden ser homólogos (o endógenos) (es decir, existen de forma natural en el genoma de la bacteria manipulada) o, preferiblemente, heterólogos (es decir, no existen de forma natural en el genoma de la bacteria manipulada). El casete de expresión introducido puede constar de secuencias de promotor/gen/operón "naturales" no modificadas o casetes de expresión manipulados en los que la región promotora y/o la región codificante o ambas se han alterado. Una lista no exhaustiva de promotores preferidos (preferiblemente fuertes) que podrían usarse para la expresión incluyen los promotores porA, porB, IbpB, tbpB, p110, Ist, hpuAB de N. meningitidis o N. gonorrhoeae, los promotores p2, p5, p4, ompf, p1, ompH, p6, hin47 de H. influenzae, los promotores ompH, ompG, ompCD, ompE, ompB1, ompB2, ompA de M. catarrhalis, el promotor \lambdapL, lac, tac, araB de Escherichia coli o promotores reconocidos específicamente por la ARN polimerasa de bacteriófagos tales como el bacteriófago T7 de E. coli.
El casete de expresión puede suministrarse e integrarse en el cromosoma bacteriano mediante recombinación homóloga y/o específica de sitio (como se analiza en el documento WO 01/09350). Los vectores de integración usados para suministrar dichos genes y/u operones pueden ser plásmidos condicionalmente replicativos o suicidas, bacteriófagos, transposones o fragmentos de ADN lineales obtenidos por hidrólisis de restricción o amplificación por PCR. La integración se dirige preferiblemente a regiones cromosómicas dispensables para el crecimiento in vitro. Una lista no exhaustiva de loci preferidos que pueden usarse para dirigir la integración de ADN incluye los genes porA, porB, opa, opc, rmp, omp26, lecA, cps, IgtB de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae, los genes P1, P5, hmw1/2, IgA-proteasa, fimE de NTHi; los genes lecA1, lecA2, omp106, uspA1, uspA2 de Moraxella catarrhalis. Como alternativa, el casete de expresión usado para modular la expresión del componente o componentes de la ampolla puede suministrarse en una bacteria de elección mediante vectores episómicos tales como plásmidos replicativos circulares/lineales, cósmidos, fásmidos, bacteriófagos lisogénicos o cromosomas bacterianos artificiales. La selección del acontecimiento de recombinación puede realizarse mediante marcadores genéticos de selección tales como genes que confieren resistencia a antibióticos (por ejemplo kanamicina, eritromicina, cloranfenicol o gentamicina), genes que confieren resistencia a metales pesados y/o compuestos tóxicos o genes que complementan mutaciones auxotróficas (por ejemplo pur, leu, met, aro). Las ampollas pueden prepararse a partir de la cepa modificada resultante.
La expresión de algunas proteínas heterólogas en ampollas bacterianas puede requerir la adición de una señal o señales que se dirigen a la membrana externa. El procedimiento preferido para resolver este problema es crear una fusión genética entre un gen heterólogo y un gen que codifica una OMP residente como un enfoque específico para dirigir las proteínas recombinantes a las ampollas. Más preferiblemente, el gen heterólogo se fusiona con las secuencias de péptido señal de dicha OMP.
Una aplicación particularmente preferida de esta invención es la introducción de antígenos protectores de Chlamydia (trachomatis o pneumoniae) (preferiblemente proteínas de membrana externa) en ampollas bacterianas Gram-negativas no de cepas de Chlamydia. Esto tiene varias ventajas incluyendo el hecho de que dichas ampollas (y las vacunas que las comprenden) son extremadamente adecuadas para administración a la mucosa, lo que es beneficioso ya que una respuesta inmune de la mucosa (IgA) contra los antígenos de Chlamydia presentes en la ampolla será más protectora contra infecciones por Chlamydia que se manifiestan ellas mismas en la mucosa.
Antígenos de Chlamydia trachomatis integrados en una ampolla bacteriana Gram-negativa
Un uso particularmente preferido es en el campo de la profilaxis o tratamiento de enfermedades de transmisión sexual (ETS). A menudo es difícil para los facultativos determinar si la causa principal de una ETS se debe a gonococos o a infección por Chlamydia trachomatis. Estos dos organismos son las causas principales de salpingitis - una enfermedad que puede conducir a esterilidad en el huésped. Sería útil que pudiera vacunarse contra o tratarse una ETS con una vacuna combinada eficaz contra la enfermedad causada por los dos organismos. La Proteína de Membrana Externa Principal (MOMP u OMP1 u OMPI) de C. trachomatis ha demostrado ser la diana de anticuerpos protectores. Sin embargo, la integridad estructural de esta proteína de membrana integral es importante para inducir dichos anticuerpos. Además, los epítopes reconocidos por estos anticuerpos son variables y definen más de 10 variedades serológicas. El contexto de ampolla de la invención permite el plegamiento adecuado de una o más MOMP u otras proteínas de membrana de Chlamydia para propósitos de vacuna. La manipulación de una cepa (preferiblemente) de gonococos que expresa una o más variedades serológicas de MOMP de C. trachomatis y/o una o más OMP de Chlamydia protectoras en la membrana externa, y la producción de ampollas de la misma, produce una solución única a los múltiples problemas de proteínas de membrana plegadas de forma correcta, la presentación de suficientes variedades serológicas de MOMP y/o otras OMP de Chlamydia para proteger contra un amplio espectro de variedades serológicas, y la profilaxis/tratamiento simultáneos de infección por gonococos (y por consiguiente la falta de necesidad de que el facultativo decida inicialmente qué organismo causa los síntomas clínicos particulares - puede vacunarse contra ambos organismos simultáneamente permitiendo de este modo el tratamiento de la EST en una etapa muy temprana). Los loci preferidos para la inserción génica en el cromosoma de gonococos se han dado anteriormente. Genes de C. trachomatis protectores preferidos que podrían incorporarse son HMWP, PmpG y las OMP descritas en el documento WO 99/28475.
Una realización particularmente preferida de la invención proporciona una ampolla bacteriana Gram-negativa (preferiblemente de gonococos) que presenta en su superficie la proteína de membrana externa PorB (véase a continuación) de Chlamydia trachomatis.
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Secuencia de ADN de PorB de la variedad serológica D de Chlamydia trachomatis (D/UW-3/Cx)
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Secuencia de aminoácidos traducida
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La presencia de PorB en las ampollas significa que el antígeno puede administrarse a la mucosa más fácilmente, y proporciona una protección más eficaz que si se administrara solo.
La presente invención proporciona además una ampolla bacteriana Gram-negativa (preferiblemente de gonococos) que presenta en su superficie una o más de las siguientes proteínas de Chlamydia trachomatis, o PorB de C. trachomatis en combinación con una o más de las siguientes proteínas. Será evidente para una especialista en la técnica que en lugar de las siguientes secuencias (y la secuencia de PorB anterior), podría usarse el análogo natural de las secuencias de otras variedades serológicas o serotipos de C. trachomatis, como también genes que codifican análogos funcionales de las proteínas que comprenden inserciones, deleciones o sustituciones de las secuencias mencionadas que no afectan a las propiedades inmunológicas de la proteína codificada. Debe seleccionarse preferiblemente una secuencia de una cepa de la variedad serológica D. Una cepa bacteriana capaz de producir dicha ampolla es un aspecto adicional de la invención.
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(Secuencia pasa a página siguiente)
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>gi|6578118|gb|AAC68456.2| Proteasa predicha que contiene los dominios IRBP y DHR [Chlamydia trachomatis]
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>gi|6578109|gb|AAC68227.2| Homólogo de CHLPN de 76 kDa [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3329350|gb|AAC68472.1|Proteína de Membrana Externa I Putativa [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3329346|gb|AAC68469.1| Proteína de Membrana Externa G Putatitva [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3329345|gb|AAC68468.1| Proteína de Membrana Externa F Putativa [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3329169|gb|AAC68308.1| Análogo de Proteína de Membrana Externa [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3328843|gb|AAC68011.1| Proteína de Membrana Externa C Putativa [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3328815|gb|AAC67986.1| Proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3328812|gb|AE001312.1.: 2790-4016,
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>gi|3328651|gb|AAC67834.1| Análogo de Omp85 [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3328646|gb|AE001297.1: 4000-6378,
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>gi|3328587|gb|AAC67774.1| CMP-ácido 2-ceto-3-desoxioctulosónico sintetasa [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3329039|gb|AAC68197.1| Proteína de intercambio tio:disulfuro [Chlamydia trachomatis]
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>gi|3329342|gb|AE001360.1: 10808-13858,
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>gi|3328874 |gb|AAC68042.1| OMP rica en cisteína de 60 kDa [Chlamydia trachomatis]
46 
\newpage
>gi|3328863 |gb|AE001371.1: c11039-9378,
47
>gi|3328841|gb|AAC68010.1| Proteína de Membrana Externa B Putativa [Chlamydia trachomatis]
48 
\newpage
>gi|3328833 |gb|AE001314.1: 9601-14856,
49
50
>gi|3328840 |gb|AAC68009.1| Proteína de membrana externa A putativa [Chlamydia trachomatis]
51
>gi|3328833 |gb|AE001314.1: 6535-9462,
52
53
>gi|3328763|gb|AAC67938.1| Familia de O-sialoglicoproteína endopeptidasa [Chlamydia trachomatis]
54
>gi|3328757|gb|AE001307.1: c6730-6098,
55
>gi|6578102|gb|AAC67897.2| Subunidad K de la ATP sintasa [Chlamydia trachomatis]
56
>gi|3328718|gb|AE001303.1: c956-531,
57 
\newpage
>gi|3329252|gb|AAC68382.1| Proteína ribosómica S14 [Chlamydia trachomatis]
58
>gi|3522908|gb|AE001351.1: 2436-2741,
59
>gi|3329133|gb|AAC68276.1| Proteína de Membrana Externa Principal [Chlamydia trachomatis]
60
>gi|3329126|gb|AE001338.1: c6759-5578,
61
>gi| 3328987|gb|AAC68150.1| Proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
62
>gi|3323898|gb|AE001325.1: 10880-11464,
63
>gi|3328972|gb|AAC68136.1| Apoliproteína N-acetiltransferasa [Chlamydia trachomatis]
64 
\vskip1.000000\baselineskip
>gi|3328966|gb|AE001324.1: c6152-4524,
\vskip1.000000\baselineskip
65 
\vskip1.000000\baselineskip
>gi|3328612|gb|AAC67797.1 Fructosa-6-P fosfotransferasa [Chlamydia trachomatis]
\vskip1.000000\baselineskip
66 
\newpage
>gi|3328609|AE001294.1: 2452-4113,
\vskip1.000000\baselineskip
67 
\vskip1.000000\baselineskip
>gi|3328517|gb|AAC67709.1| Proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
\vskip1.000000\baselineskip
68 
\vskip1.000000\baselineskip
>gi|3328516|gb|AE001286.1: 75-578,
\vskip1.000000\baselineskip
69 
\vskip1.000000\baselineskip
>gi|3328482|gb|AAC67677.1| Proteína ribosómica L28 [Chlamydia trachomatis]
\vskip1.000000\baselineskip
70
>gi|3328480|gb|AE001283.1:c2251-1928,
71
>gi|3328436|gb|AAC67635.1| Proteína de unión ADN SS [Chlamydia trachomatis]
\vskip1.000000\baselineskip
72 
\vskip1.000000\baselineskip
<gi|3328434|gb|AE001279.1: 160-1533,
\vskip1.000000\baselineskip
73 
\vskip1.000000\baselineskip
>gi|3328411|gb|AAC67611.1| proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
\vskip1.000000\baselineskip
74 
\vskip1.000000\baselineskip
<gi|3322886|gb|AE001277.1: c6191-5448,
\vskip1.000000\baselineskip
75
crpA, proteína CHLTR rica en cisterna de 15 kD (Chlamydia trachomatis variedad serológica D (D/UW-3/Cx))
Secuencia de ADN
76 
\newpage
Secuencia de aminoácidos traducida
\vskip1.000000\baselineskip
77 
\vskip1.000000\baselineskip
OmcA, lipoproteína compleja de membrana externa CHLTR rica en cisteína de 9 kD (Chlamydia trachomatis variedad serológica D (D(UW-3/Cx)
Secuencia de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
78 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos traducida
\vskip1.000000\baselineskip
79
cutE, apolipoproteína N-aciltransferasa (Chlamydia trachomatis variedad serológica D (D/UV-3-/Cx)
Secuencia de ADN
\vskip1.000000\baselineskip
80 
\newpage
Secuencia de aminoácidos traducida
81
pal, lipoproteína asociada a peptidoglicano (Chlamydia trachomatis variedad serológica D (D/UW-3/Cx)
Secuencia de ADN
82
Secuencia de aminoácidos traducida
83
Las siguientes proteínas de membrana de externa de Chlamydia trachomatis (secuencias completas anteriormente) se describen por primera vez como útiles en una vacuna contra C. trachomatis.
Secuencias de aminoácidos:
>gi|6578118|gb|AAC68456.2| Proteasa predicha que contiene los dominios IRBP y DHR [Chlamydia trachomatis]
>gi|6578109|gb|AAC68227.2| Homólogo de CHLPN de 76 kDa [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328866|gb|AAC68034.1| Sulfito Reductasa [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328815|gb|AAC67986.1| proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328587|gb|AAC67774.1| CMP-ácido 2-ceto-3-desoxioctulosónico sintetasa [Chlamydia trachomatis]
>gi|3329039|gb|AAC68197.1| Proteína de Intercambio tio:disulfuro [Chlamydia trachomatis]
>gi|3329000|gb|AAC68161.1| Lipoproteína J de translocación de proteínas Yop [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328905|gb|AAC68071.1| proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328884|gb|4AAC68051.1| Fosfatidato Citidiltransferasa [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328855|gb|AAC68022.1| proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328772|gb|AAC67946.1| proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328763|gb|AAC67938.1| familia de O-sialoglicoproteína Endopeptidasa [Chlamydia trachomatis]
>gi|657802IjbIAC67897.2| Subunidad K de la ATP Sintasa [Chlamydia trachomatis]
>gi|3329252|gb|AAC68382.1| Proteína Ribosómica S14 [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328987|gb|AAC68150.1| proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328972|gb|AAC68136.1| Apolipoproteína J N-Acetiltransferasa [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328612|gb|AAC67797.1| Fructosa-6-P Fosfotransferasa [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328517|gb|AAC67709.1| proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328482|gb|AAC67677.1| Proteína Ribosómica L28 [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328436|gb|AAC67635.1| Proteína de Unión a ADN SS [Chlamydia trachomatis]
>gi|3328411|gb|AAC67611.1| proteína hipotética [Chlamydia trachomatis]
De nuevo cuando dichas ampollas están presentes en una formulación de vacuna pueden ser más protectoras contra infección por Chlamydia trachomatis que el uso de la proteína aislada.
Pares de antígenos de Chlamydia trachomatis particularmente beneficiosos son un aspecto adicional de la invención. En este aspecto adicional se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de gonococos) que presenta en su superficie las proteínas de membrana externa PorB y PmpG de Chlamydia trachomatis. Además, se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de gonococos) que presenta en su superficie las proteínas de membrana externa PorB y MOMP (de una o más variedades serológicas) de Chlamydia trachomatis. Por último, se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de gonococos) que presenta en su superficie las proteínas de membrana externa PmpG y MOMP (de una o más variedades sexológicas) de Chlamydia trachomatis.
Se prefiere que una o más MOMP (u OMP1 u OMP I) de una o más variedades serológicas (1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) se seleccionen de una lista de variedades serológicas constituida por B, Ba, D, Da, E, L1, L2, L2a, F, G, K, L3, A, C, H, L, Ia y J; más preferiblemente de una lista constituida por D, E, F, G, K, H, I y J. Más preferiblemente una o más de MOMP debe comprender al menos MOMP de la variedad serológica D o E (más preferiblemente D). Una estrategia preferida adicional es la selección de una o más MOMP de cada uno de los tres siguientes grupos serológicos: grupo serológico B (constituido por las variedades serológicas B, Ba, D, Da, E, L1, L2 y L2a, y preferiblemente seleccionado entre las variedades serológicas D, Da y E); grupo serológico F-G (constituido por las variedades serológicas F y G); y grupo serológico C(constituido por las variedades serológicas A, C, H, I, Ia, J, K y L3, y preferiblemente seleccionado entre las variedades serológicas H, I, Ia, J y K).
Más preferiblemente los genes de los antígenos de Chlamydia trachomatis deben insertarse en el locus PorA del Neisseria (preferiblemente gonococos).
Dicha preparación formulada como una vacuna puede proporcionar protección potenciada a un huésped contra Chlamydia trachomatis cuando se administra un único antígeno.
Preferiblemente la ampolla se ha obtenido de una cepa (preferiblemente gonococos) que se ha modificado por regular positivamente uno o más antígenos de membrana externa protectores (como se describe a continuación).
Preferiblemente la ampolla se ha obtenido de una cepa (preferiblemente gonococos) que se ha modificado para regular negativamente uno o más antígenos de membrana externa variables inmunodominante o no protectores (como se describe a continuación).
Preferiblemente las ampollas se obtienen de una cepa (preferiblemente gonococos) que tiene una parte destoxificada de lípido A de LPS bacteriano, debido a que la cepa se ha manipulado genéticamente para reducir o apagar la expresión de uno o más genes que hacen que LPS sea tóxico (preferiblemente seleccionados entre los siguientes genes, u homólogos de los mismos htrB, msbB y IpxK, véase la siguiente sección).
Preferiblemente las ampollas se obtienen de una cepa (preferiblemente gonococos) que tiene una parte destoxificada de lípido A de LPS bacteriano, debido a que la cepa se ha manipulado para expresar a un nivel mayor uno o más genes que producen un producto génico que es capaz de detoxificar LPS (preferiblemente seleccionado entre los siguientes genes u homólogos de los mismos: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF; véase la siguiente sección).
También se prevén composiciones de vacuna que comprenden la ampolla de la invención y un excipiente o vehículo farmacéuticamente adecuado. Preferiblemente la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante de mucosa. Los adyuvantes de mucosa son bien conocidos en la técnica (véase Vaccine Design "The subunit and adyuvant approach" (eds Powell M. F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Un adyuvante de mucosa preferido es LT2 (o LTII, que puede dividirse en LTIIa y LTIIb - véase Martin y col. Infection and Immunity, 2000 68: 281-287). Preferiblemente dichas vacunas deben formularse y administrarse como se describe a continuación en "formulaciones de vacuna".
El contenido de ampollas por dosis en la vacuna estará típicamente en el intervalo de 1-100 \mug, preferiblemente 5-50 \mug, más típicamente en el intervalo de 5-25 \mug.
Las cantidades óptimas de componentes para una vacuna particular pueden determinarse por estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.
También se proporciona un procedimiento para fabricar un medicamento para prevenir la infección por Chlamydia trachomatis en un huésped que comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de la vacuna anterior a un huésped en necesidad de la misma. Preferiblemente, la vacuna se administra a la mucosa por vía intranasal, oral, intradérmica o intravaginal.
Antígenos de Chlamydia pneumoniae integrados en una ampolla bacteriana Gram-negativa
En un aspecto adicional, la invención proporciona una ampolla Gram-negativa que presenta en su superficie un antígeno protector de Chlamydia pneumoniae. Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis y Haemophilus influenzae son las especies para la producción de dicha ampolla. Dichos antígenos protectores son preferiblemente uno o más de los enumerados a continuación:
1) Envuelta celular: Proteínas de Membrana, Lipoproteínas y Porinas
Gen:
Función proteica:
yaeT
homólogo de OMP85
60 IM
proteína de membrana interna de 60 kD
Igt
prolipoproteína diacilgliceril transferasa
crpA
proteína CHLTR rica en cisteína de 15 kD
omcB
proteína compleja de membrana externa rica en cisteína de 60 kD
omcA
lipoproteína compleja de membrana externa rica en cisteína de 9 kD
cutE
apolipoproteína N-acetiltransferasa
ompA
proteína de la membrana externa principal
pal
lipoproteína asociada a peptidoglicano
porB
análogo de proteína de membrana externa
\vskip1.000000\baselineskip
2) Genes codificantes (no en C. trachomatis)
Gen:
Función proteica:
yqff
proteína de membrana interna hipotética conservada
yxjG
proteína hipotética
guaA
GMP sintasa
guaB
inosina 5'-monofosfato deshidrogenasa
argR
similitud con el represor de arginina
CPn0232
similitud con 5'-metiltioadenosina nucleosidasa
CPn0251
proteína hipotética conservada
CPn0278
lipoproteína de membrana externa conservada
CPn0279
posible permeasa transportadora ABC
yxjG
proteína hipotética
yqeV
proteína hipotética
CPn0486
prolina permeasa hipotética
CPn0505
3-metiladenina ADN glicosilasa
CPn0562
proteína CHLPS de 43 kDa
CPn0585
similitud con CHLPS IncA
yvyD
proteína hipotética conservada
CPn0608
uridina 5'-monofosfato sintasa
CPn0735
uridina quinasa
CPn0907
proteína de tolerancia a cationes divalentes periplasmática tipo CutA
CPn0927
proteína CHLPS de 43 kDa
CPn0928
proteína CHLPS de 43 kDa
CPn0929
proteína CHLPS de 43 kDa
CPn0980
similar a la proteína de 52,9 kDa de S. cerevisiae
bioA
adenosilmetionina-8-amino-7-oxononanoato aminotransferasa
bioD
destiobiotina sintetasa
bioB
biotina sintasa
CPn1045
proteína de membrana hipotética conservada
CPn1046
triptófano hidroxilasa
\vskip1.000000\baselineskip
3) Proteínas específicas de Chlamydia
Gen:
Función proteica
pmp_1
proteína de membrana externa polimófica
pmp_2
proteína de membrana externa polimófica
pmp_3
proteína de membrana externa polimófica
pmp_3
proteína de membrana externa polimófica
pmp_4
proteína de membrana externa polimófica
pmp_4
proteína de membrana externa polimófica
pmp_5
proteína de membrana externa polimófica
pmp_5
proteína de membrana externa polimófica
CPn0133
proteína CHLPS hipotética
CPn0186
similitud a IncA
incB
proteína de inclusión de membrana B
incC
proteína de inclusión de membrana C
CPn0332
proteína CHLTR T2
ItuB
proteína LtuB
pmp_6
proteína de membrana externa polimórfica
pmp_7
proteína de membrana externa polimófica
pmp_8
proteína de membrana externa polimófica
pmp_9
proteína de membrana externa polimófica
pmp_10
proteína de membrana externa polimófica
pmp_11
proteína de membrana externa polimófica
pmp_12
proteína de membrana externa polimófica
pmp_13
proteína de membrana externa polimófica
pmp_14
proteína de membrana externa polimófica
pmp_15
proteína de membrana externa polimófica
pmp_16
proteína de membrana externa polimófica
pmp_17
proteína de membrana externa polimófica
pmp_17
proteína de membrana externa polimófica
pmp_18
proteína de membrana externa polimófica
pmp_10
proteína de membrana externa polimófica
pmp_20
proteína de membrana externa polimófica
euo
proteína CHLPS Euo
CPn0562
homólogo de la proteína CHLPS de 43 kDa
CPn0585
similar a la proteína de membrana de inclusión CHLPS A
CPn0728
homólogo de la proteína CHLPN de 76 kDa
CPn0729
homólogo de la proteína CHLPN de 76 kDa
gp6D
proteína plasmídica CHLTR
CPn0927
homólogo de la proteína CHLPS de 43 kDa
CPn0928
homólogo de la proteína CHLPS de 43 kDa
CPn0929
homólogo de la proteína CHLPS de 43 kDa
pmp_21
proteína de membrana externa polimórfica
ItuA
proteína LtuA
(La información de secuencia completa se ha publicado en el sitio web del Chlamydia Genome Project: http://
chlamydia-www.berkeley.edu:4231/index.html).
400
401
402
403
404
405
406
407
408
Cuando dichas ampollas están presentes en una formulación de vacuna pueden ser más protectoras contra infección por Chlamydia pneumoniae que el uso de la proteína/antígeno aislado.
También se han descubierto pares de antígeno de Chlamydia pneumoniae particularmente beneficiosos. Por tanto en un aspecto adicional se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de meningococos) que presenta en su superficie las proteínas de membrana externa PorB y MOMP de Chlamydia pneumoniae. Además, se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de meningococos) que presenta en su superficie MOMP y una o más proteínas externas de la membrana Pmp de Chlamydia pneumoniae. Adicionalmente se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de meningococos) que presenta en su superficie PorB y una o más proteínas de membrana externa PmP de Chlamydia pneumoniae. También se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de meningococos) que presenta en su superficie las proteínas PorB y Npt1 de Chlamydia pneumoniae. Adicionalmente se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de meningococos) que presenta en su superficie las proteínas Npt1 y una o más proteínas Pmp de Chlamydia pneumoniae. Por último se proporciona una ampolla Gram-negativa (preferiblemente de meningococos) que presenta en su superficie las proteínas Npt1 y MOMP de Chlamydia pneumoniae.
Dichas preparaciones formuladas como una vacuna pueden proporcionar protección potenciada para un huésped contra Chlamydia que cuando se administra un único antígeno.
Preferiblemente, la ampolla se ha obtenido de una cepa que se ha modificado para regular positivamente uno o más antígenos de membrana externa protectores (véase a continuación; por ejemplo para antígenos de membrana externa protectores de meningococos véase la sección "preparaciones de ampolla de Neisseria" para aquellos antígenos que preferiblemente deben regularse positivamente).
Preferiblemente, la ampolla se ha obtenido de una cepa que se ha modificado para regular negativamente uno o más antígenos de membrana externa variables o no protectores inmunodominantes (como se describe a continuación; por ejemplo, para antígenos de membrana externa variables/no protectores de meningococos véase la sección "preparaciones de ampolla de Neisseria" para aquellos antígenos que preferiblemente deben regularse negativamente).
Preferiblemente, las ampollas se obtienen de una cepa que tiene una parte destoxificada de lípido A de LPS bacteriano, debido a que la cepa se ha modificado genéticamente para reducir o apagar la expresión de uno o más genes que causan que LPS sea tóxico (preferiblemente seleccionado entre los siguientes genes, u homólogos de los mismos htrB, msbB e IpxK; véase la siguiente sección).
Preferiblemente, las ampollas se obtienen de una cepa que tiene una parte destoxificada de lípido A de LPS bacteriano, debido a que la cepa se ha modificado genéticamente para que exprese un nivel mayor de uno o más genes que producen un producto génico que es capaz de detoxificar LPS (preferiblemente seleccionado entre los siguientes genes, u homólogos de los mismos pmrA, pmrB, pmrE y pmrF; véase la siguiente sección).
También se prevén composiciones de vacuna que comprenden la ampolla de la invención o un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, la vacuna comprende adicionalmente un adyuvante de mucosa. Los adyuvantes de mucosa son bien conocidos en la técnica (véase Vaccine Design "The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). Un adyuvante de mucosa preferido es LT2 (o LTII, que puede dividirse en LTIIa y LTIIb - véase Martin y col. Infection and Immunity, 2000, 68: 281-287). Preferiblemen-
te dichas vacunas deben formularse y administrarse como se describe a continuación en "Formulaciones de vacuna".
El contenido de ampollas por dosis en la vacuna típicamente estará en el intervalo de 1-100 \mug, preferiblemente 5-50 \mug, más típicamente en el intervalo de 5-25 \mug.
Las cantidades óptimas de los componentes para una vacuna particular pueden determinarse por estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo adecuadamente espaciadas.
La eficacia de una vacuna contra C. pneumoniae puede evaluarse en un modelo de ratón de infección tal como el descrito por Murdin y col., 2000, J. Infect. Dis. 181 (supl. 3): S5444-51. La protección provocada por una formulación de vacuna puede evaluarse por reducción de la carga bacteriana en el pulmón después de una infección de exposición con C. pneumoniae.
También se proporciona un procedimiento para fabricar un medicamento para prevenir infección por Chlamydia pneumoniae en un huésped que comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de la vacuna anterior a un huésped que lo necesita. Preferiblemente, la vacuna se administra a la mucosa por vía intranasal, intradérmica u oral.
Mejoras adicionales en las bacterias y ampollas de la invención
La bacteria Gram-negativa puede modificarse genéticamente de forma adicional por uno o más procedimientos seleccionados entre el siguiente grupo: (a) un procedimiento para regular negativamente la expresión de antígenos variables o no protectores inmunodominantes, (b) un procedimiento para regular positivamente la expresión de antígenos OMP protectores, (c) un procedimiento para regular negativamente un gen implicado en la transformación de la parte de lípido A de LPS tóxico, (d) un procedimiento para regular positivamente un gen implicado en la transformación de la parte de lípido A de LPS menos tóxico, y (e) un procedimiento para regular negativamente la síntesis de un antígeno que comparte una similitud estructural con una estructura humana y puede ser capaz de inducir una respuesta autoinmune en seres humanos. Estos procedimientos se describen con detalle en el documento WO 01/09350.
Dichas vacunas de ampolla de la invención están diseñadas para centrarse en la respuesta inmune de unos pocos antígenos o epítopes protectores (preferiblemente conservados) - formulados en una vacuna de múltiples componentes. Cuando dichos antígenos son OMP integrales, las vesículas de membrana externa de vacunas de ampolla asegurarán su elevamiento apropiado. Esta invención proporciona procedimientos para optimizar la composición de OMP y LPS de vacunas contra OMV (ampolla) delecionando OMP variables inmunodominantes así como no protectoras, creando OMP conservadas por deleción de regiones variables, regulando positivamente la expresión de OMP protectoras, y eliminando los mecanismos de control para la expresión (tales como restricción de hierro) de OMP protectoras. Además se proporciona la reducción en la toxicidad de lípido A por modificación de la parte lipídica o cambiando la composición de fosforilo reteniendo su actividad adyuvante o por enmascarado. Cada uno de estos nuevos procedimientos de mejora individualmente mejoran la vacuna de ampolla, sin embargo una combinación de uno o más de estos procedimientos funcionan en conjunto para producir una vacuna de ampolla optimizada genéticamente que es inmunoprotectora y no tóxica - particularmente adecuada para uso pediátrico.
(a) un procedimiento para regular negativamente la expresión de antígenos variables o no protectores inmunodominantes
Muchos antígenos de superficie son variables entre cepas bacterianas y como consecuencia son protectores sólo contra un conjunto limitado de cepas estrechamente relacionadas. Se describe la reducción en la expresión, o preferiblemente, la deleción del gen o genes que codifican la proteína o proteínas superficiales variables que provoca que la cepa bacteriana produzca ampollas que, cuando se administran en una vacuna, tengan un potencial mayor para reactividad cruzada contra diversas cepas debido a la mayor influencia ejercida por las proteínas conservadas (retenida en las membranas externas) en el sistema inmune del vacunado. Los ejemplos de dichos antígenos variables incluyen: para Neisseria - pili (PilC) que experimenta variaciones antigénicas, PorA, Opa, TbpB, FrpB; para H. influenzae - P2, P5, pilina, IgA1-proteasa; y para Moraxella - CopB, OMP106.
Otros tipos de genes que podían regularse negativamente o apagarse son genes que, in vivo, pueden encenderse fácilmente (expresarse) o apagarse por la bacteria. Como las proteínas de membrana externa codificadas por dichos genes no siempre están presentes en las bacterias, la presencia de dicha proteínas en las preparaciones de ampolla también puede ser nociva para la eficacia de la vacuna por las razones indicadas anteriormente. Un ejemplo preferido para regular negativamente o delecionar es la proteína Opc Neisseria. La inmunidad anti-Opc inducida por una vacuna de ampolla que contiene Opc tendría solamente capacidad protectora limitada ya que el organismo de infección podría llegar a ser fácilmente Opc^{-} - HgpA y HgpB de H. influenzae son otros ejemplos de dichas proteínas.
En el procedimiento a), estos genes variables o no protectores se regulan negativamente en la expresión, o se apagan de forma terminal. Esto tiene la sorprendente ventaja de concentrar el sistema inmune en antígenos mejores que están presentes en cantidades bajas en la superficie externa de las ampollas.
La cepa puede modificarse genéticamente de este modo por varias estrategias que incluyen inserción de transposones para alterar la región codificante o región promotora del gen, o mutaciones o deleciones puntuales para conseguir un resultado similar. También puede usarse recombinación homóloga para delecionar un gen de un cromosoma (donde la secuencia X comprende parte (preferiblemente toda) la secuencia codificante del gen de interés). Puede usarse adicionalmente para cambiar su fuerte promotor por un promotor más débil (o no). Todas estas técnicas se describen en el documento WO 01/09350.
(b) un procedimiento para regular positivamente la expresión de antígenos OMP protectores
Esto puede hacerse insertando una copia de dicha OMP protectora en el genoma (preferiblemente por recombinación homóloga), o regulando positivamente la expresión del gen nativo reemplazando el promotor nativo por un promotor más fuerte, o insertando un promotor fuerte cadena arriba del gen en cuestión (también por recombinación homóloga). Dichos procedimientos pueden conseguirse usando las técnicas descritas en el documento WO
01/09350.
\newpage
Dichos procedimientos son particularmente útiles para potenciar la producción de componentes de ampolla inmunológicamente relevantes tales como proteínas de membrana externa y lipoproteínas (preferiblemente OMP conservadas, habitualmente presentes en las ampollas a bajas concentraciones).
(c) un procedimiento para regular negativamente un gen implicado en la transformación de la parte de lípido A de LPS tóxico
La toxicidad de las vacunas de ampolla presenta uno de los mayores problemas en el uso de ampollas en vacunas. Se describe un procedimiento para detoxificar genéticamente el LPS presente en ampollas. El lípido A es el componente principal de LPS responsable de la actividad celular. Muchas mutaciones en genes implicados en esta vía conducen a fenotipos esenciales. Sin embargo, mutaciones en los genes responsables de etapas de modificaciones terminales conducen a fenotipos sensibles a la temperatura (htrB) o permisivos (msbB). Las mutaciones que producen una expresión disminuida (o ausente) de estos genes provocan una actividad tóxica alterada de lípido A. De hecho, en el lípido A no lauroilado (mutante htrB) [también definido por la ausencia resultante de LPS de ambas cadenas secundarias de acilo] o no miristoilado (mutante msbB) [también definido por la ausencia resultante de LPS sólo de una cadena secundaria de acilo] son menos tóxicos que el lípido A de tipo silvestre. Las mutaciones en el gen codificante de la lípido A 4'-quinasa (Ipxk) también disminuye la actividad tóxica de lípido A.
El procedimiento c) implica por tanto la deleción de parte (o preferiblemente toda) de una o más de las fases de lectura abierta o promotores. Como alternativa, los promotores podrían reemplazarse por promotores más débiles. Preferiblemente, las técnicas de recombinación homóloga se usan para realizar el procedimiento. Preferiblemente, se usan los procedimientos descritos en el documento WO 01/09350. Las secuencias de los genes htrB y msbB de Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis, y Haemophilus influenzae se proporcionan en el documento WO 01/09350 para este propósito.
(d) un procedimiento para regular positivamente un gen implicado en la transformación de la parte de lípido A de LPS menos tóxico
La actividad tóxica de LPS también podría alterarse introduciendo mutaciones en genes/loci implicados en la resistencia a polimixina B (dicha resistencia se ha correlacionado con la adición de aminoarabinosa en el fosfato 4' del lípido A). Estos genes/loci podrían ser pmrE que codifica una UDP-glucosa deshidrogenasa, o una región de genes de resistencia a péptido antimicrobiano común a muchas enterobacterias que podrían estar implicados en la síntesis y transferencia de aminoarabinosa. El gen pmrF que está presente en esta región codifica una dolico1-fosfato manosil transferasa (Gunn J.S., Kheng, B.L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S.I. 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182).
Mutaciones en el sistema regulador PhoP-PhoQ, que es un sistema regulador de dos componentes dependientes de fósforo (fenotipo constitutivo f. i. PhoP, PhoP^{c}), o bajo Mg^{++}, en condiciones ambientales o de cultivo (que activan el sistema regulador PhoP-PhoQ) conducen a la adición de aminoarabinosa en el fosfato-4' y reemplazo de 2-hidroximiristato por el miristato (hidroxilación de miristato). Este lípido A modificado presenta capacidad reducida de estimular la expresión de selectina E por las células endoteliales humanas y la secreción de TNF-\alpha de monocitos humanos.
El procedimiento d) implica la regulación positiva de estos genes usando una estrategia descrita en el documento WO 01/09350.
(e) un procedimiento para regular negativamente la síntesis de un antígeno que comprende una similitud estructural con una estructura humana y puede ser capaz de inducir una respuesta autoinmune en seres humanos
El aislamiento de ampollas de membrana externa bacterianas de bacterias Gram-negativas encapsuladas a menudo provoca la co-purificación de polisacárido capsular. En algunos casos, este material "contaminante" puede demostrar ser útil ya que el polisacárido puede potenciar la respuesta inmune conferida por otros componentes de la ampolla. En otros casos, sin embargo, la presencia de material polisacárido contaminante en las preparaciones de ampolla bacteriana puede demostrar ser nociva para el uso de las ampollas en una vacuna. Por ejemplo, se ha demostrado al menos en el caso de N. meningitidis que el polisacárido capsular de serogrupo B no confiere inmunidad protectora y es susceptible a inducir una respuesta autoinmune adversa en seres humanos. Por consiguiente, el procedimiento e) es la modificación genética de la cepa bacteriana para producción de ampollas de modo que esté libre de polisacárido capsular. Las ampollas después serán adecuadas para su uso en seres humanos. Un ejemplo particularmente preferido de dicha preparación de ampolla es uno de N. meningitidis delserogrupo B desprovisto de polisacárido capsular.
Esto puede conseguirse usando cepas que producen ampollas modificadas en las que los genes necesarios para la biosíntesis capsular y/o exportación se han alterado como se describe en el documento WO 01/09350. Un procedimiento preferido es la deleción de algunos o todos los genes cps de Neisseria meningitidis para la biosíntesis y exportación de polisacáridos. Para este propósito, puede usarse el plásmido de reemplazo pMF121 (descrito en Frosh y col. 1990, Mol. Microbiol. 4: 1215-1218) para suministrar una mutación que deleciona el grupo de genes cpsCAD (+gaIE). Como alternativa, podría delecionarse el gen siaD, o regularse negativamente en la expresión (el gen siaD de meningococos codifica la alfa-2,3-sialitransferasa, una enzima necesaria para la síntesis de polisacárido capsular y LPS). Dichas mutaciones también pueden retirar estructuras similares al huésped en la parte de sacárido del LPS de las bacterias.
Combinaciones de los procedimientos a) - e)
Puede apreciarse que uno o más de los procedimientos anteriores pueden usarse para producir una cepa modificada de la que preparar preparaciones de ampolla mejoradas de la invención. Preferiblemente, uno de dichos procedimientos se usa, más preferiblemente dos o más (2, 3, 4 ó 5) de los procesos se usan para fabricar la vacuna de ampolla. Cuando se usa cada procedimiento adicional en la fabricación de la vacuna de ampolla, cada mejora funciona en conjunto con los otros procedimientos usados para preparar una preparación de ampolla optimizada genéticamente.
Una preparación de ampolla de meningococos preferida (particularmente N. meningitidis B) comprende el uso de los procedimientos b), c) y e) (opcionalmente combinados con el procedimiento a)). Dichas preparaciones de ampolla son seguras (sin estructuras similares a las estructuras del huésped), no tóxicas, y estructuradas de modo que la respuesta inmune del huésped se centrará en los elevados niveles de antígenos protectores (y preferiblemente conservados). Todos los elementos anteriores funcionan juntos para proporcionar una vacuna de ampolla optimizada.
De forma similar para M catarrhalis, H. influenzae no tipificable, gonococos, y cepas de meningococos de serotipo no B (por ejemplo, serotipo A, C, Y o W), las preparaciones de ampolla preferidas comprenden el uso de los procedimientos b) y c), opcionalmente combinados con el procedimiento a).
Preparaciones de ampolla de Neisseria preferidas
Se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) para la regulación positiva mediante el procedimiento b) cuando se realiza en una cepa de Neisseria, incluyendo gonococos, y meningococos (particularmente N. meningitidis B): NspA (documento WO 96/29412), tipo Hsf (documento WO 99/31132), Hap (documento PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (documento WO 00/23595), PilQ (documento PCT/EP99/03603), PldA (documento PCTIEP99/06718), FipB (documento WO 96/31618), TbpA (documento US 5.912.336), TbpB, FrpA/FrpC (documento WO 92/01460), LbpA/LbpB (documento PCT/EP98/05117), FhaB (documento WO 98/02547), HasR (documento PCT/EP99/05989), lipo02 (documento PCT/EP99/08315), Tbp2 (documento WO 99/57280), MltA (documento WO 99/57280), y ctrA (documento PCT/EP00/00135). También se prefieren como genes que puedan introducirse de forma heteróloga en otras bacterias Gram-negativas.
Uno o más de los siguientes genes se prefieren para la regulación negativa mediante el procedimiento a): PorA, PorB, PilC, TbpA, TbpB, LbpA, LbpB, Opa, y Opc (más preferiblemente PorA).
Uno o más de los siguientes genes se prefieren para regulación negativa mediante el procedimiento c): htrB, msbB e IpxK (más preferiblemente msbB que retira solamente una única cadena secundaria de acilo de la molécula LPS).
Uno o más de los siguientes genes se prefieren para la regulación positiva mediante el procedimiento d): pmrA, pmrB, pmrE, y pmrF.
Uno o más de los siguientes genes se prefieren para la regulación negativa mediante el procedimiento e): galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC, y ctrD (los genes se describen en el documento WO 01/09350).
Muchas de las fases de lectura abierta anteriores y regiones cadena arriba se describen en el documento WO 01/09350.
Los genes de gonococos preferidos para regular positivamente mediante el procedimiento b) incluyen uno o más de los siguientes:
Gen del precursor del receptor de lactoferrina de Neisseria gonorrhoeae (lbpA), cds completa.
ACCESO U16260
VERSIÓN U16260.1 GI: 915277
Fuente: Neisseria gonorrhoeae/cepa = "FA19"
gen = "lbpA" nucleótidos: 278..3109
proteína_id = "AAC13780.1" / db_xref = "GI: 915278"
84
85
86
Precursor de la proteína B de unión a lactoferrina de Neisseria gonorrhoeae
Fuente: Neisseria gonorrhoeae ''/cepa = "FA19"
ACCESO AAD08809
PID g4106393
VERSIÓN AAD08809.1 GI: 4106393
/gen = "lbpB" secuencia codificante: 1..728, "AF072890.1: 310..2496"
87
Gen de la proteína A de unión a transferrina (tbpA) de Neisseria gonorrhoeae, cds completa
ACCESO AF241227
VERSIÓN AF241227.1 GI: 9719361
Fuente: Neisseria gonorrhoeae/cepa = "Pgh3-2"
gen "tbpA" secuencia codificante: 223..2946
/proteína_id = "AAF97766.1"
/db-xref = "GI: 9719362"
88
89 
\newpage
Gen de la proteína de unión a transferrina 2 (tbpB) de la cepa UU1008 de Neisseria gonorrhoeae, cds completa.
ACCESO U65222
VERSIÓN U65222.1 GI: 2286066
Fuente: Neisseria gonorrhoeae/cepa = "UU1008"
gen = "tbpB" secuencia codificante: 1..2052
/proteína_id = "AAB64243.1"
/db_xref = "GI: 2286067"
91
Genes pilO, pilP y pilQ, grupo de genes de la biogénesis del pilus de Neisseria gonorrhoeae, cds completa.
ACCESO U40596
VERSIÓN U40596.1 GI: 1173872
fuente: Neisseria gonorrhoeae/cepa = "MS11"
gen = "pilO" secuencia codificante 22..669
/proteína_id = "AAC43601.1"
/db_xref = "GI: 1173873"
92
gen = "pilP" secuencia codificante 687..1229
/proteína_id = "AAC43602.1"
/db_xref = "GI: 1173874"
93
gen = "pilQ" secuencia codificante 1248..3410
/proteína_id = "AAC43603.1"
/db_xref = "GI: 1173875"
94
95 
\newpage
NspA
Gen de la proteína de membrana externa de Neisseria gonorrhoeae, cds completa
ACCESO U52069
VERSIÓN U52069.1 GI: 1808968
fuente Neisseria gonorrhoeae/cepa = "B2"
Gen "NspA" secuencia codificante: 141..665
/proteína_id = "AAB41581.1"
/db_xref = "GI: 1808969"
\vskip1.000000\baselineskip
96 
\vskip1.000000\baselineskip
Gen de la proteína de membrana externa de Neisseria gonorrhoeae (omp85), cds completa
ACCESO U81959
VERSIÓN U81959.1 GI: 1766041
Fuente: Neisseria gonorrhoeae/cepa = "FA19"
gen = "omp85" secuencia codificante 1..2379
/proteína_id = "AAC17600.1"
/db_xref = "GI: 1766042"
97
Homólogo de pldA1 en Neisseria gonorrhoeae
Fuente: proyecto de secuenciación U. de Oklahoma
secuencia codificante de tipo PldA1
>GONOCTG01_15 Continuación (15 de 22) de gonoctg01 a partir de la base 1400001
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
98 
\vskip1.000000\baselineskip
Secuencia de aminoácidos de tipo PldA1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
99 
\vskip1.000000\baselineskip
1000 pares de bases cadena arriba de la secuencia de tipo PldA1 (útiles para reemplazar el promotor por una secuencia más fuerte)
\newpage
>GONOPCTG01_15 Continuación (15 de 22) de gonoctg01 a partir de la base 1400001
100
Los genes de gonococos preferidos para regular negativamente por el procedimiento a) incluyen uno o más de los siguientes:
Gen de la proteína de membrana externa regulada por hierro preFrbP (frpB) de Neisseria gonorrhoeae, cds completa
ACCESO U13980
VERSIÓN U13980.1 GI: 833694
Fuente: Neisseria gonorrhoeae/cepa = "FA19"
gen = "frpB" secuencia codificante: 318..2459
/proteína_id = "AAC43332.1"
/db_xref = "GI: 833695"
101
1020
Gen estructural de N. gonorrhoeae para la proteína III de gonococos (PIII).
ACCESO X05105
VERSIÓN X05105.1 GI: 44889
fuente: Neisseria gonorrhoeae/db_xref = "taxón: 485"
secuencia codificante del gen PIII: 103..813
/proteína_id = "CAA28752.1"
/db_xref = "GI: 44890"
/db_xref = "SWISS-PROT: P07050"
103
Preparaciones de ampolla de Pseudomonas aeruginosa preferidas
Se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) para la regulación positiva mediante el procedimiento b): PcrV, OprF, Oprl. También se prefieren como genes que puedan introducirse de forma heteróloga en bacterias Gram-negativas.
Preparaciones de ampolla de Moraxella catarrhalis preferidas
Se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) para la regulación positiva mediante el procedimiento b): OMP106 (documentos WO 97/41731 y WO 96/34960), HasR (documento PCT/
EP99/03824), PilQ (documento PCT/EP99/03823), OMP85 (documento PCT/EP00/01468), lipo06 (documento GB
9917977.2), lipo10 (documento GB 9918208.1), lipo11 (documento GB 9918302.2), lipo18 (documento GB
9918038.2), P6 (documento PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (Helminen ME, y col (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010), D15 (documento PCT/EP99/03822), OmpIA1 (documento PCT/EP99/06781), Hly3 (documento PCT/EP99/
03257), LbpA y LbpB (documento WO 98/55606), TbpA y TbpB (documentos WO 97/13785 y WO 97/32980), OmpE, UspA1 y UspA2 (documento WO 93/03761), FhaB (documento WO 99/58685) y Omp21. También se prefieren como genes que pueden introducirse de forma heteróloga en otras bacterias Gram-negativas.
Se prefieren uno o más de los siguientes genes para la regulación negativa mediante el procedimiento a): CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA y LbpB.
Se prefieren uno o más de los siguientes genes para la regulación negativa mediante el procedimiento c): htrB, msbB e IpxK (más preferiblemente msbB).
Se prefieren uno o más de los siguientes genes para la regulación positiva mediante el procedimiento d): pmrA, pmrB, pmrE y pmrF.
Muchas de las fases de lectura abierta anteriores y regiones cadena arriba se describen en el documento WO 01/09350.
Preparaciones de ampolla de Haemophilus influenzae preferidas
Se prefieren uno o más de los siguientes genes (que codifican antígenos protectores) para la regulación positiva mediante el procedimiento b): D15 (documento WO 94/12641), P6 (documento EP 281673), TbpA, TbpB, P2, P5 (documento WO 94/26304), OMP26 (documento WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47, lomp1457 (documento GB 0025493.8), Ytfn (documento GB 0025488.8), VirG (documento GB 0026002.6), lomp1681 (documento GB 0025998.6), OstA (documento GB 0025486.2) e Hif (todos los genes en este operón deben estar regulados positivamente para regular positivamente la pilina). También se prefieren como genes que pueden introducirse de forma heteróloga en otras bacterias Gram-negativas.
Se prefieren uno o más de los siguientes genes para la regulación negativa mediante el procedimiento a): P2, P5, Hif, IgA1-proteasa, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA, y TbpB.
Se prefiere uno o más de los siguientes genes para la regulación negativa mediante el procedimiento c): htrB, msbB e IpxK (más preferiblemente msbB).
Se prefieren uno o más de los siguientes genes para la regulación positiva mediante el procedimiento d): pmrA, pmrB, pmrE, y pmrF.
Muchas de las fases de lectura abierta anteriores y regiones cadena arriba se describen en el documento WO 01/09350.
Preparaciones de vesículas de membrana (ampollas) de la invención
La fabricación de preparaciones de ampolla a partir de cualquiera de las cepas modificadas mencionadas anteriormente puede conseguirse recogiendo ampollas desprendidas de forma natural por las bacterias, o por cualquier otro de los procedimientos bien conocidos para los especialistas en la técnica (por ejemplo, como se describe en los documentos EP 301992, US 5.597.572, EP 11243 o US 4.271.147). Para Neisseria, se usa preferiblemente el procedimiento descrito en el siguiente Ejemplo.
Preferiblemente, la preparación de vesículas de membrana es capaz de filtrarse a través de una membrana de 0,22 \mum.
También se prevé una preparación estéril (preferiblemente homogénea) de vesículas de membrana que se pueden obtener pasando las vesículas de membrana a través de una membrana de 0,22 \mum.
Formulaciones de Vacuna
Una realización preferida de la invención es la formulación de las preparaciones de ampolla de la invención en una vacuna que también puede comprender un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La preparación de vacunas se describe en líneas generales en Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York).
Las preparaciones de ampolla de la presente invención pueden potenciarse con adyuvante en la formulación de vacuna de la invención. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio (particularmente carbonato cálcico), hierro o cinc, o puede ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, polisacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente, o polifosfazenos.
Los sistemas adyuvantes ThI adecuados que pueden usarse incluyen, monofosforil lípido A, particularmente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado, y una combinación de monofosforil lípido A, preferiblemente monofosforil lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) junto con una sal de aluminio. Un sistema potenciado implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina particularmente la combinación de QS21 y 3D-MPL como se describe en el documento WO 94/00153 o una composición menos reactogénica en la que se inactive QS21 con colesterol como se describe en el documento WO96/33739. Una formulación adyuvante particularmente potente que implica QS21 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y es una formulación preferida.
La vacuna puede comprender una saponina, más preferiblemente QS21. También puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol. Oligonucleótidos que contienen CpG no metilado (documento WO 96/02555) también son inductores preferentes de una respuesta TH1 y son adecuados para su uso en la presente invención.
La preparación de vacuna de la presente invención puede usarse para proteger o tratar a un mamífero susceptible a infección, mediante la administración de dicha vacuna por vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o por administración a la mucosa por el tracto oral/alimentario, respiratorio, genitourinario.
La cantidad de antígeno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que induce una respuesta inmunoprotecora sin efectos secundarios adversos significativos en vacunados típicos. Dicha cantidad variará dependiendo de qué inmunógeno específica se emplea y cómo se presenta. Generalmente, se espera que cada dosis comprenda 1-100 \mug de antígeno proteico, preferiblemente 5-50 \mug, y más típicamente en el intervalo de 5-25 \mug.
Una cantidad óptima para una vacuna particular puede determinarse por estudios convencionales que implican la observación de respuestas inmunes apropiadas en sujetos. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.
Vacunas de células Completas Fantasma o Inactivadas
Se prevé que las cepas bacterianas modificadas anteriores no sólo pueden ser útiles para generar preparaciones de ampolla útiles en vacunas - también pueden usarse fácilmente para preparar preparaciones de células completas fantasma o inactivadas y vacunas (con ventajas idénticas). Los procedimientos para preparar preparaciones fantasma (células vacías con envueltas intactas) a partir de cepas Gram-negativas son bien conocidos en la técnica (véase por ejemplo el documento WO 92/01791). Los procedimientos para inactivar células completas para preparar preparaciones celulares inactivadas para su uso en vacunas son bien conocidos. Las expresiones "preparaciones de ampolla" y "vacunas de ampolla" así como los procedimientos descritos en todo este documento por lo tanto son aplicables a las expresiones "preparación fantasma" y "vacuna fantasma", y "preparación de células completas inactivadas" y "vacuna de células completas inactivadas", respectivamente, para los propósitos de esta invención.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se realizan usando técnicas convencionales, que son bien conocidas y rutinarias para los especialistas en la técnica, excepto donde se describe de otro modo con detalle. Los ejemplos son ilustrativos, y no limitan la invención.
Ejemplo 1
Ejemplos previamente presentados
Ejemplos que describen: Construcción de una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B que carece de polisacáridos capsulares; Construcción de vectores de suministro de genes versátiles (la serie pCMK) que se dirigen a la integración en el locus porA de Neisseria meningitidis; Construcción de una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B que carece tanto de polisacáridos capsulares como del antígeno inmunodominante principal PorA; Regulación positiva de la producción de proteína de membrana externa NspA en ampollas derivadas de una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B recombinante que carece de los genes porA y cps funcionales; Regulación positiva del antígeno de proteína de membrana externa D15/Omp85 en ampollas derivadas de una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B recombinante que carece de los genes cps funcionales pero que expresa PorA; Construcción de vectores de suministro de promotores versátiles; Procedimientos de fermentación para producir ampollas recombinantes; Identificación de promotores bacterianos adecuados para la regulación positiva de genes que codifican antígenos; Regulación positiva del gen Omp85 de N. meningitidis serogrupo B por reemplazo de promotor; Regulación positiva del antígeno proteico Hsf en una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B recombinante que carece de los genes cps funcionales pero que expresa PorA; Expresión de la Proteína Fluorescente Verde en una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B que carece de los genes cps funcionales pero que expresa PorA; Regulación positiva del gen NspA de N. meningitidis serogrupo B por reemplazo de promotor; Regulación positiva del gen pldA (omplA) de N. meningitidis serogrupo B por reemplazo de promotor; Regulación positiva del gen tbpA de N. meningitidis serogrupo B por reemplazo de promotor; Regulación positiva del gen pilQ de N. meningitidis serogrupo B por reemplazo de promotor; Construcción de un casete kanR/sacB para introducir mutaciones no marcadas "limpias" en el cromosoma de N. meningitidis; Uso de pequeñas secuencias recombinogénicas (43 pb) para permitir la recombinación homóloga en el cromosoma de Neisseria meningitidis; Protección activa de ratones inmunizados con ampollas de Neisseria meningitidis WT y recombinantes; e Inmunogenicidad de ampollas recombinantes medida por procedimientos de ELISA de células completas y específicos que se han descrito en el documento WO 01/09350.
Ejemplo 2 Ampollas de gonococos que expresan proteínas de Chlamydia trachomatis en su superficie para su uso en una composición de vacuna
Tanto Chlamydia trachomatis como N. gonorrhoeae causan enfermedades de transmisión sexual, incluyendo uretritis, cervicitis, salpingitis y enfermedad inflamatoria pélvica. La infección mixta tanto con CT como CG no sucede. Por lo tanto, en el diseño de una vacuna que se dirija a una o más de estas enfermedades, la posibilidad de producir protección contra ambos organismos con una única formulación crea una ventaja técnica.
Protección contra N. gono
Puede obtenerse una vacuna OMV contra N. gonorrhoeae a partir de una o más cepas productoras de ampollas en las que la expresión de uno o varios genes se haya regulado positivamente y/o negativamente. Se ha proporcionado anteriormente una lista de genes que codifican proteínas de N. gonorrhoeae para las que es particularmente útil regular su expresión positiva y/o negativamente.
Una vacuna satisfactoria para la prevención de infección por N. gono puede requerir más de uno de los siguientes elementos: generación de anticuerpos séricos y/o en la mucosa para facilitar la eliminación mediada por el complemento de los gonococos, y/o para potenciar la fagocitosis y eliminación microbiana por los leucocitos tales como leucocitos polimorfonucleados, y/o para evitar la unión de los gonococos a los tejidos del huésped; la inducción de una respuesta inmune mediada por células también puede participar en la protección.
El potencial de una preparación de vacuna de ampolla contra gono puede evaluarse analizando la respuestas inmunes inducidas para los anticuerpos séricos y/o de la mucosa que tienen antiadherencia y/o propiedades de opsonización, y/o actividad bactericida, como se ha descrito por otros (McChesney D y col, Infect. Immun. 36: 1006, 1982; Boslego J y col: Efficacy trialof a purified gonococci pilus vaccine, en Program and Abstracts of the 24^{th} Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Whashington, American Society for Microbiology, 1984; Siegel M y col, J. Infect. Dis 145: 300, 1982; de la Pas, Microbiology, 141 (Pt4): 913-20, 1995).
Recientemente se ha descrito un modelo de ratón de infección génica por N. gono (Plante M, J. Infect. Dis., 1982: 848-55, 2000). La eficacia de una vacuna de ampolla contra gono también puede evaluarse por su capacidad de evitar o reducir la colonización por N. gono en este modelo de ratón de infección.
Protección contra CT
Puede obtenerse una vacuna de ampolla de GC/CT a partir de una cepa que expresa uno o varios genes de
Chlamydia, preferiblemente seleccionados entre la lista anterior de genes que codifican proteínas de membrana externa predichas.
Otros genes de interés para la sobreexpresión en Neisseria son genes de C. trachomatis para los que no se ha descubierto homólogo en C. pneumoniae. Dicho conjunto de genes se ha descrito en Richard S.; p: 9-27, Stephens Stephens Ed. ASM Press, Washington DC, Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity ISBN:
1-55581-155-8 páginas: 380.
Las combinaciones más preferidas de los genes de Chlamydia trachomatis son los siguientes: Proteína de membrana externa principal MOMP (de una o varias variedades serológicas diferentes) y el Análogo de Proteína de Membrana Externa (también conocida como PorB), MOMP (de una o varias variedades serológicas diferentes) y la Proteína de Membrana Externa Putativa G (pmpG); y PorB y pmpG.
Aunque la inmunidad contra CT no se entiende completamente, hay evidencias de que los Ab juegan un papel en la protección. Los Ab contra CT en fluidos genitales se han asociado con inmunidad contra CT (Brunham RC, Infect Immun. 1983 Mar; 39(3): 1491-4). También se ha mostrado un papel protector de los anticuerpos séricos en la inmunidad contra infección genital clamidial (Rank RG, Infect Immun. 1989 Jan; 57(1): 299-301.). Los anticuerpos, por ejemplo anticuerpos específicos contra MOMP, han demostrado ser capaces de neutralizar una infección por CT in vitro e in vivo (Caldwell y col. 1982 Infect. Immun. 38: 745-54, Lucero y col, 1985, Infect. Immun. 50: 595-97, Zhang y col. 1987 J. Immunol. 138: 575-581). El antígeno de superficie MOMP de CT ha demostrado tener epítopes superficiales lineales que se dirigen a anticuerpos neutralizantes (Fan J, J. Infect Dis 1997, 176(3): 713-21).
Por tanto, un objetivo importante en el diseño de una vacuna contra chlamydia protectora incluye la identificación de una o más formulaciones de los antígenos CT capaces de optimizar la inducción de respuestas de anticuerpos específicos para chlamydia. La optimización de la respuesta de Ab incluye dirigirse a la mucosa genital, y/o presentación de antígenos de Chlamydia plegados apropiadamente, y/o una combinación de varias dianas de anticuerpo.
La dirección a la mucosa de la respuesta inmune contra antígenos de Chlamydia puede conseguirse por administración a la mucosa de la vacuna. La administración intranasal de una vacuna de vesícula de membrana externa puede inducir anticuerpos locales en la mucosa persistentes y anticuerpos séricos con fuerte actividad bactericida en seres humanos.
Para ciertos epítopes de células B, tales como epítopes no lineales, la presentación del antígeno al sistema inmune de un modo apropiadamente plegado es crítica. Una vacuna de ampolla preparada a partir de una cepa que expresa uno o más antígenos de Chlamydia ofrece a la OMP de chlamydia un entorno de membrana externa que puede ser crítico para mantener estos antígenos en una estructura apropiadamente plegada.
La combinación de varias dianas de anticuerpo puede crear una eficacia aumentada abordando la infección en diferentes etapas del ciclo de vida de las bacterias, tales como adhesión a la célula huésped, internalización por la célula huésped y/o interferencia con etapas adicionales del desarrollo intracelular.
La inducción y reclutamiento de células Th1 en las mucosas genitales locales son importantes para la inmunidad contra Chlamydia. Por tanto, un objetivo principal en el diseño de una vacuna anti-chlamydia protectora incluye la identificación de una o más formulaciones de uno o más antígenos CT capaces de optimizar la inducción de células Th1 específicas para chlamydia, y preferiblemente el reclutamiento de estas células en las mucosas genitales. Una vacuna de ampolla preparada a partir de una cepa que expresa uno o más antígenos de chlamydia puede inducir una respuesta CMI específica de chlamydia. Las respuestas de células T específicas de antígeno pueden inducirse en seres humanos después de inmunización intranasal con una vacuna de vesícula de membrana
externa.
Una ventaja particular de una vacuna de ampolla de GC/CT es su capacidad de inducir respuestas tanto Ab como CMI.
La eficacia de la vacuna de ampolla de GC/CT puede evaluarse por su capacidad de provocar respuestas Ab y/o CMI específicas de Ag o Chlamydia. Las respuestas de Ab pueden evaluarse por técnicas clásicas tales como ELISA o transferencia de western. Preferiblemente, los anticuerpos inducidos pueden neutralizar la efectividad de Chlamydia en un ensayo in vitro (Byrne G. y col. (J Infect Dis. 1993 Aug; 168(2): 415-20). Preferiblemente, la respuesta CMI está desviada al fenotipo Th1. Una respuesta inmune desviada a Th1 puede evaluarse por proporciones IgG2a/IgG1 específicas de antígeno elevadas en ratones (Snapper y col. 1987, Science 236: 944-47). La proporción elevada de citoquinas Th1/Th2, por ejemplo la proporción de IFN-gamma/IL-5 elevada después de la estimulación in vitro de células T inmunes con el antígeno o antígenos también puede indicar dicha respuesta Th1 desviada.
La capacidad de la formulación de provocar Ab en la mucosa específicos de Ag es de particular interés, y puede demostrarse por detección de anticuerpos, tales como IgG o IgA en fluidos de la mucosa, tales como secreción del tracto genital, lavados vaginales. Para este fin, cierta vía de administración de la vacuna puede desearse particularmente tal como suministro intranasal, oral, intravaginal, intradérmico.
La eficacia de la vacuna de ampolla de CG/CT puede evaluarse por su capacidad de inducir protección contra una exposición a Chlamydia en uno o más modelos animales. Los ejemplos de dichos modelos animales se han descrito en la bibliografía: infección genital con MoPn en ratones (Barron y col. J. Infect. Dis. 1143: 63-66), infección genital con cepas humanas en ratones (lgietseme y col. 2000, Infect. Immun. 68: 6798-806, Tuffrey y col. 1992 J. Gen. Microbiol. 138: 1707-1715), Tuffrey), infección genital con la cepa GPIC en cobayas (Rank y col. 1992 Am. J. Pathol. 140: 927-936). La protección contra la infección puede evaluarse por reducción del desprendimiento de Chlamydia del sitio infectado y/o reducción de las reacciones histopatológicas después de una infección de exposición en animales inmunizados.
La ventaja de combinar dos o más antígenos de Chlamydia (como se ha descrito anteriormente) puede evaluarse por una o más de las siguientes técnicas:
\rightarrow Capacidad de provocar una respuesta protectora de Ab y/o células T multi-diana
\rightarrow Capacidad de provocar títulos de Ab en un ensayo de neutralización in vitro, y/o Ab neutralizante contra múltiples cepas (antigénicamente distintas)
\rightarrow Capacidad de provocar una respuesta inmune protectora contra Chlamydia en un modelo de ratón de infección genital como se evalúa por el desprendimiento reducido de bacterias y/o patología después de la exposición.
Ejemplo 3 Expresión de antígenos heterólogos (MOMP y PorB de Chlamydia trachomatis) en ampollas derivadas de una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B recombinante que carece de los genes porA y cps funcionales
Otros genes de interés para la sobre-expresión en Neisseria son los genes de Chlamydia trachomatis para los que no se han encontrado homólogos en Chlamydia pneumoniae. Entre estos, la proteína de membrana externa principal (MOMP) y el análogo de proteína de membrana externa (PorB) han demostrado jugar un papel protector contra infección genital por chlamydia. La optimización de la respuesta Ab podría conseguirse por presentación de proteínas apropiadamente plegadas.
Las vesículas de ampolla MenB pueden usarse como vectores de suministro para expresar antígenos de proteína de membrana heterólogos bajo el control del promotor porA-lacO modificado genéticamente descrito en el documento WO 01/09350. Expresado en el contexto de las ampollas, MOMP y PorB recombinantes de la variedad serológica D y K de Chlamydia trachomatis pueden plegarse correctamente en la membrana y exponerse en la superficie. Las cepas de Neisseria meningitidis que carecen de los genes cps funcionales se usan de forma ventajosa como cepas receptoras para expresar los antígenos heterólogos (documento WO 01/09350).
Amplificaciones por PCR de los genes que codifican MOMP (Chlamydia trachomatis)
Se lisaron células McCoy murinas (ATCC) infectadas con Chlamydia trachomatis variedad serológica K (UW31-CX-serK), o variedad serológica D (UW31-CX-serD) en 400 \mul de tampón de lisis: KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM pH 8,3, MgCl_{2} 2,5 mM, Nonidet P40 al 0,45%, Tween 20 al 0,45% que contenía 60 \mug/ml de proteinasa K, 3 horas a 56ºC. Se usaron diez \mul del lisado como molde para amplificar los genes correspondientes. El gen que codifica MOMP (variedad serológica K) (SEC ID Nº 1 a continuación) se amplificó por PCR usando los cebadores oligonucleotídicos CYK/OMP/5/NDE y CYKD/OMP/3BG (véase tabla 1). El gen que codifica MOMP (variedad serológica D) (SEC ID Nº 2 a continuación) se amplificó por PCR usando los cebadores oligonucleotídicos CYD/OMP/5/NRU y CYKD/OMP/3BG (véase la tabla 1). Las condiciones usadas para la amplificación por PCR son las descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). El ciclo térmico fue el siguiente: 25 veces (94ºC 1 min, 52ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10 min, 4ºC hasta la recuperación). Los amplicones correspondientes (1194 pb) se digirieron con las enzimas de restricción NdeI/Bg/II o NruI/Bg/II y pueden clonarse en los sitios de restricción correspondientes del vector de suministro pCMK(+) (como se describe en el documento
WO 01/09350).
Amplificaciones por PCR de los genes que codifican PorB (Chlamydia trachomatis)
Se lisaron células McCoy murinas (ATCC) infectadas con Chlamydia trachomatis variedad serológica K (UW31-CX-serK), o variedad serológica D (UW31-CX-serD), en 400 \mul de tampón de lisis: KCl 50 mM, Tris HCl 10 mM pH 8,3, MgCl_{2} 2,5 mM, Nonidet P40 al 0,45%, Tween 20 al 0,45% que contenía 60 \mug/ml de proteinasa K, 3 horas a 56ºC. Se usaron diez \mul del lisado como molde para amplificar los genes correspondientes.
Las secuencias PorB están altamente conservadas entre las variedades serológicas D y K (SEC ID Nº 3 a continuación). Se usaron los mismos cebadores para amplificar los genes correspondientes en ambas variedades serológicas: CYD/PORB/5/NRU y CYD/PORB/3/BG (véase la tabla 1). Las condiciones usadas para la amplificación por PCR fueron las descritas por el proveedor (ADN polimerasa HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). El ciclo térmico fue el siguiente: 25 veces (94ºC 1 min, 52ºC 1 min, 72ºC 3 min) y 1 vez (72ºC 10 min, 4ºC hasta la recuperación). Los amplicones correspondientes (1035 pb) se digirieron con las enzimas de restricción NruI/Bg/II y pueden clonarse en los sitios de restricción correspondientes del vector de suministro pCMK(+) (como se describe en el documento WO 01/09350).
Transformación
Plásmidos pCMK recombinantes linealizados pueden transformarse en una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B que carezca de los genes cps funcionales (descrita en el documento WO 01/09350). La integración que produce un cruce doble entre los vectores pCMK y el locus porA cromosómico pueden seleccionarse por una combinación de PCR y exploración por Transferencia de Western como se describe en el documento WO 01/09350.
TABLA 1 Oligonucleótidos usados en este trabajo
104 
\newpage
SEC ID Nº 1:
Secuencia de nucleótidos del ADN que codifica la proteína MOMP de la variedad serológica K de Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
105
SEC ID Nº 2:
Secuencia de nucleótidos del ADN que codifica la proteína MOMP de la variedad serológica D de Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
106 
\newpage
SEC ID Nº 3:
Secuencia de nucleótidos del ADN que codifica la proteína PorB de la variedad serológica D de Chlamydia trachomatis
107
Ejemplo 4 Aislamiento y purificación de ampollas de meningococos desprovistas de polisacárido capsular
Las ampollas recombinantes pueden purificarse como se describe a continuación. Se suspende la pasta celular (42 g) en 211 ml de tampón Tris-Cl 0,1 M pH 8,6 que contiene EDTA 10 mM y Desoxicolato Sódico al 0,5% (DOC). La proporción de tampón a biomasa debe ser 5/1 (V/P). La biomasa se extrae por agitación magnética durante 30 minutos a temperatura ambiente. El extracto total después se centrifuga a 20.000 g durante 30 minutos a 4ºC (13.000 rpm en un rotor JA-20, centrífuga Beckman J2-HS). Debe desecharse el sedimento. El sobrenadante se ultracentrifuga a 125.000 g durante 2 horas a 4ºC (40.000 rpm en un rotor 50.2Ti, ultracentrífuga Beckman L8-70M) para concentrar las vesículas. Debe desecharse el sobrenadante. El sedimento se suspende suavemente en 25 ml de tampón Tris-Cl 50 mM pH 8,6 que contiene EDTA 2 mM, DOC al 1,2% y sacarosa al 20%.
Después de una segunda etapa de ultracentrifugación a 125.000 g durante 2 horas a 4ºC, se suspenden suavemente las vesículas en 44 ml de sacarosa al 3% y se almacenan a 4ºC. Todas las soluciones usadas para la extracción de ampollas y purificación contenían tiomersalato al 0,01%. Como se ilustra en el documento WO 01/019350, este procedimiento produce preparaciones proteicas altamente enriquecidas en proteínas de membrana externa.
Ejemplo 5 Modelos para ensayar la protección contra infección por gonococos y C. trachomatis
Esto puede hacerse como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 2. Además Whittum-Hudson y col. (Vaccine 16 de julio de 2001; 19 (28-29): 4061-71) "The anti-idiotypic antibody to chlamydial glycolipid exoantigen (GLXA) protects mice against genital infection with a human biovar of Chlamydia trachomatis" es un modelo de inoculación vaginal para C. trachomatis que también puede usarse para ensayar la eficacia de la vacuna.
<110> SmithKline Beecham Biologicals s.a.
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\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composición de Vacuna
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\vskip0.400000\baselineskip
<130> B45261
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\vskip0.400000\baselineskip
<160> 108
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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<210> 1
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<211> 1023
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 1
108 
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<210> 2
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<211> 340
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
109
110 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
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<211> 601
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
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111
112
113 
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<210> 4
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<211> 1806
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 4
114
115 
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<210> 5
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<211> 432
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 5
116
117 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 1299
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 6
118
119 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 7
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<211> 878
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
120
121
122
123 
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<210> 8
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<211> 2637
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 8
124
125 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
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<211> 1013
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
126
127
128
129 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3042
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
130
131
132 
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<210> 11
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<211> 1034
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
133
134
135
136 
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<210> 12
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<211> 3105
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 12
137
138 
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<210> 13
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<211> 964
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
139
140
141
142 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2895
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
143
144 
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<210> 15
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<211> 1531
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 15
145
146
147
148
149 
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<210> 16
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<211> 4596
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
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150
151 
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<210> 17
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<211> 340
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 17
152
153 
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<210> 18
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<211> 1023
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 18
154 
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<211> 350
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
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<400> 19
155
156 
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<210> 20
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<211> 1053
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 20
157 
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<210> 21
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<211> 1770
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 21
158
159
160
161
162
163
164 
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<210> 22
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<211> 5313
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 22
165
166
167 
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 23
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<211> 408
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 23
168
169 
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<210> 24
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<211> 1227
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<212> ADN
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 24
170 
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<210> 25
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<211> 792
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<212> PRT
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<213> Chlamydia trachomatis 
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<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
171
172
173
174 
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\vskip0.400000\baselineskip
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<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1650
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\vskip1.000000\baselineskip
264 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 549
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\vskip1.000000\baselineskip
265
266
267 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 645
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
268
269 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 214
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Chlamydia trachomatis 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
270 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 943
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
271
272
273 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3300
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
274
275 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 728
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
276
277
278 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 907
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
279
280
281 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3035
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
282
283
284 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 683
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
285
286
287 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2052
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
288
289 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 86
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 215
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 86
\vskip1.000000\baselineskip
290
291 
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 180
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<212> PRT
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<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 87
292 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 88
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 720
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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293
294
295 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 89
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3829
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 89
296
297
298 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 90
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 174
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 90
\vskip1.000000\baselineskip
299 
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<210> 91
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 710
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 91
\vskip1.000000\baselineskip
300
301 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 92
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 792
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 92
302
303
304 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 93
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Neisseria gonorrhoeae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
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305 
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<212> ADN
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<213> Neisseria gonorrhoeae 
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306 
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\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 95
\vskip1.000000\baselineskip
307
308 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 96
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1000
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Neisseria gonorrhoeae 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 96
309 
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<211> 713
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 97
\vskip1.000000\baselineskip
310
311
312 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 98
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2600
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 98
313
314 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 99
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 236
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 99
315 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 100
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1349
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Neisseria gonorrhoeae 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 100
317 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 101
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 101
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaatccat atgaaaaaac tcttgaaatc gg 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 102
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 102
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggaagatctt tagaagcgga attgtgcat 
\hfill
29 
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\vskip0.400000\baselineskip
<210> 103
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 103
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
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ctgcagaatc gcgaatgaaa aaactcttga aatcgg 
\hfill
36 
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<210> 104
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<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
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<220>
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ctgcagaatc gcgaatgagt agcaagctag tgaac 
\hfill
35 
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<210> 105
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<211> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
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<213> Secuencia Artificial
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<220>
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<223> Cebador
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aggagatctt tagaattgga atcctccgg 
\hfill
29 
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<210> 106
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<211> 1194
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<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
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<400> 106
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318 
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<211> 1182
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<213> Chlamydia trachomatis 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 107
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319 
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<213> Chlamydia trachomatis 
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 108
\vskip1.000000\baselineskip
320
321

Claims (32)

1. Una ampolla bacteriana Gram-negativa no derivada de Chlamydia, que presenta en su superficie la proteína de membrana externa PorB de Chlamydia trachomatis, en la que la combinación del antígeno de Chlamydia con los antígenos de ampolla bacteriana Gram-negativa nativa interacciona en la prevención o tratamiento de la salpingitis cuando están presentes en una formulación de vacuna.
2. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 1 que presenta adicionalmente en su superficie las proteínas de membrana externa PmpG de Chlamydia trachomatis.
3. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 1 que presenta adicionalmente en su superficie MOMP de una o más variedades serológicas de Chlamydia trachomatis.
4. Una ampolla Gram-negativa no derivada de Chlamydia, que presenta en su superficie las proteínas de membrana externa tanto PmpG como MOMP (de una o más variedades serológicas) de Chlamydia trachomatis, en la que la combinación de los antígenos de Chlamydia con los antígenos de la ampolla bacteriana Gram-negativa nativa interacciona en la prevención o tratamiento de salpingitis cuando están presentes en la formulación de vacuna.
5. La ampolla de las reivindicaciones 1-4 que son ampollas de gonococos.
6. La ampolla de la reivindicación 5 que se ha obtenido de una cepa de gonococos que se ha modificado para regular positivamente uno o más antígenos de membrana externa de gonococos protectores.
7. La ampolla de las reivindicaciones 5 y 6 derivadas de una cepa de gonococos que se ha modificado para regular negativamente uno o más antígenos de membrana externa de gonococos variables o no protectores inmunodominantes.
8. La ampolla de la reivindicaciones 5-7 derivada de una cepa que tiene una parte destoxificada de lípido A de LPS bacteriano, debido a que la cepa se ha modificado genéticamente para reducir o apagar la expresión de uno o más genes seleccionados entre el grupo constituido por: htrB, msbB y IpxK.
9. La ampolla de las reivindicaciones 5-8 en la que la preparación de ampolla se obtiene de una cepa que tiene una parte destoxificada de lípido A de LPS bacteriano, debido a que la cepa se ha modificado genéticamente para expresar a un nivel mayor uno o más genes seleccionados entre el grupo constituido por: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF.
10. Una composición de vacuna que comprende la ampolla de las reivindicaciones 1-9, y un excipiente o vehículo farmacéuticamente adecuado.
11. La vacuna de la reivindicación 10, que comprende adicionalmente un adyuvante de mucosa.
12. Uso de las ampollas de las reivindicaciones 1-9 en la fabricación de una vacuna para prevenir la infección por Chlamydia trachomatis en un huésped que comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de la vacuna de la reivindicación 10 u 11 a un huésped que lo necesita.
13. El uso de la reivindicación 12 en el que la vacuna se administra a la mucosa por vía intranasal, oral, o intravaginal.
14. Una ampolla Gram-negativa producida a partir de Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis o Haemophilus influenzae que presentan en su superficie un antígeno protector procedente de Chlamydia pneumoniae.
15. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 14 que presenta en su superficie la proteína de membrana externa PorB de Chlamydia pneumoniae.
16. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 15 que presenta adicionalmente en su superficie la proteína de membrana externa MOMP de Chlamydia pneumoniae.
17. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 15 que presenta adicionalmente en su superficie una o más proteínas de membrana externa Pmp de Chlamydia pneumoniae.
18. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 15 que presenta adicionalmente en su superficie la proteína Npt1 de Chlamydia pneumoniae.
19. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 14 que presenta en su superficie una o más proteínas Pmp de Chlamydia pneumoniae.
20. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 19 que presenta adicionalmente en su superficie la proteína Npt1 de Chlamydia pneumoniae.
21. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 19 que presenta adicionalmente en su superficie la proteína MOMP de Chlamydia pneumoniae.
22. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 14 que presenta en su superficie la proteína MOMP de Chlamydia pneumoniae.
23. La ampolla Gram-negativa de la reivindicación 22 que presenta adicionalmente su superficie la proteína Npt1 de Chlamydia pneumoniae.
24. La ampolla de las reivindicaciones 14-23 que son ampollas de meningococos.
25. La ampolla de la reivindicación 24 derivada de una cepa de meningococos que se ha modificado para regular positivamente uno o más antígenos de membrana externa de meningococos protectores.
26. La ampolla de las reivindicaciones 24 o 25 derivada de una cepa de meningococos que se ha modificado para regular negativamente uno o más antígenos de membrana externa de meningococos variables o no protectores inmunodominantes.
27. La ampolla de las reivindicaciones 24-26 derivada de una cepa que tiene una parte destoxificada de lípido A de LPS bacteriano, debido a que la cepa se ha modificado genéticamente para reducir o apagar la expresión de uno o más genes seleccionados entre el grupo constituido por: htrB, msbB e IpxK.
28. La ampolla de las reivindicaciones 24-27 en la que la preparación de ampolla se obtiene de una cepa que tiene una parte destoxificada de lípido A de LPS bacteriano, debido a que la cepa se ha modificado genéticamente para expresar a un nivel mayor uno o más genes seleccionados entre el grupo constituido por: pmrA, pmrB, pmrE y pmrF.
29. Una composición de vacuna que comprende la ampolla de las reivindicaciones 14-28 y un excipiente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
30. La vacuna de la reivindicación 29, que comprende adicionalmente un adyuvante de mucosa.
31. Uso de las ampollas de las reivindicaciones 14-28 en la fabricación de una vacuna para prevenir infección por Chlamydia pneumoniae en un huésped que comprende las etapas de administrar una cantidad eficaz de la vacuna de la reivindicación 29 ó 30 a un huésped que lo necesite.
32. El uso de la reivindicación 31 en el que la vacuna se administra a la mucosa por vía intranasal u oral.
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