DE60031859T2 - Genetisch manipulierter bleb impfstoff - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet Gram-negativer bakterieller Impfstoff-Zusammensetzungen, deren Herstellung, und die Verwendung derartiger Zusammensetzungen in der Medizin. Ganz besonders betrifft sie das Gebiet neuartiger äußere Membran-Vesikel-(oder Bläschen)-Impfstoffe, und vorteilhafte Verfahren, die diese Impfstoffe wirksamer und sicherer ergeben.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Gram-negative Bakterien werden von dem extrazellulären Medium durch zwei aufeinanderfolgende Schichten von Membranstrukturen getrennt. Diese Strukturen, als cytoplasmatische Membran und als äußere Membran (OM) wiedergegeben, unterscheiden sich beide strukturell und funktionell. Die äußere Membran spielt eine wichtige Rolle bei der Wechselwirkung pathogener Bakterien mit ihren jeweiligen Wirten. Konsequenterweise stellen die der Oberfläche ausgesetzten bakteriellen Moleküle wichtige Ziele für die Wirtsimmunantwort dar, indem sie die äußere Membranbestandteile zu attraktiven Kandidaten machen, vaccinale, diagnostische und therapeutische Reagentien zu liefern.
  • Bakterielle Ganzzellen-Impfstoffe (abgetötet oder abgeschwächt) haben den Vorteil, Mehrfach-Antigene in ihrer natürlichen Mikroumgebung zur Verfügung zu stellen. Nachteile rund um diesen Zugang, sind die durch bakterielle Bestandteile, wie Endotoxin- und Peptidoglycan-Fragmente induzierten Nebenwirkungen. Andererseits können azelluläre Untereinheit-Impfstoffe, die von der äußeren Membran gereinigte Bestandteile enthalten, lediglich begrenzten Schutz bieten, und sie können keine Antigene darstellen, die für das Immunsystems des Wirts passend sind.
  • Proteine, Phospholipide und Lipopolysaccharide sind die drei Hauptbestandteile, die in der äußeren Membran aller Gram-negativer Bakterien gefunden wurden. Diese Moleküle sind asymmetrisch verteilt: Membranphospholipide (meistens im inneren Plättchen), Lipooligosaccharide (ausschließlich im äußeren Plättchen) und Proteine (Lipoproteine des inneren und äußeren Plättchens, integrale oder polytopische Membranproteine). Für viele bakterielle Pathogene, die die menschliche Gesundheit beeinflussen, Lipopolysaccharide und äußere Membran-Proteine, wurde gezeigt, daß sie immunogen und zugänglich sind zum Schutz gegenüber der entsprechenden Krankheit mittels Immunisierung beizutragen.
  • Die OM Gram-negativer Bakterien ist dynamisch und kann sich, in Abhängigkeit von den Umgebungsbedingungen, drastischen morphologischen Umwandlungen unterziehen. Unter diesen Manifestationen wurde die Bildung der äußeren Membranvesikel oder "Bläschen" studiert und in vielen Gram-negativen Bakterien dokumentiert (Zhou, L. et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 163: 223–228). Unter diesen schließt eine nicht-erschöpfende Liste bakterieller Pathogene, die die Herstellung der Bläschen wiedergibt, ein: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa und Yersinia enterocolitica. Obwohl der für die Herstellung der OM-Bläschen verantwortliche biochemische Mechanismus nicht voll verstanden wird, wurden die äußere Membran-Vesikel extensiv studiert, da sie eine kraftvolle Methodologie darstellen, um äußere Membran-Protein-Zubereitungen in ihrer nativen Konformation zu isolieren. In diesem Kontext ist die Verwendung von äußere Membran-Zubereitungen von besonderem Interesse, um Impfstoffe gegen Neisseria, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa und Chlamydia zu entwickeln. Drüber hinaus kombinieren äußere Membran-Bläschen mehrfache eiweißartige und nicht-eiweißartige Antigene, die wahrscheinlich zu einem ausgeweiteten Schutz gegenüber Varianten innerhalb der Spezies beitragen.
  • Im Vergleich mit anderen, weiter verbreitet genutzten Typen eines bakteriellen Impfstoffes (bakterielle Ganzzellen- und gereinigte Untereinheit-Impfstoffe) werden die Erfinder zeigen, daß äußere Membran-Bläschen-Impfstoffe (wenn in bestimmter Weise modifiziert), den idealen Kompromiß darstellen.
  • Die weitverbreitete Verwendung von bakteriellen Untereinheit-Impfstoffen erfolgt wegen des intensiven Studiums bakterieller Oberflächenproteine, die in Impfstoffanwendungen [zum Beispiel B. pertussis-Pertactin] für nützlich befunden wurden. Diese Proteine sind locker mit der bakteriellen äußeren Membran assoziiert und können von einem Kulturüberstand gereinigt werden oder leicht aus den bakteriellen Zellen extrahiert werden. Jedoch wurde auch gezeigt, daß strukturelle, integrale äußere Membran-Proteine auch protektive Antigene sind. Beispiele sind PorA für N. meningitidis Serogruppe B; D15 für H. influenzae; OMP CD für M. catarrhalis; OMP F für P. Aeruginosa. Solche Proteine haben jedoch weniger spezifische strukturelle Merkmale, insbesondere mehrfache amphipathische β-Faltblattstrukturen, die ihre gezielte Verwendung als gereinigte (rekombinante) Untereinheit-Impfstoffe komplizieren.
  • Zusätzlich wurde klar, daß Mehrfachkomponentenimpstoffe benötigt werden (in Begriffen von bakteriellen Oberflächenproteinen und integralen Membranproteinen), um einen vernünftigen Grad an Schutz zu liefern. Beispielsweise sind, im Fall der B. pertussis-Untereinheit-Impfstoffe, Mehrfachkomponenten-Impfstoffe den Einzel- oder Zweikomponenten-Produkten überlegen.
  • Um integrale äußere Membran-Proteine in ein derartiges Untereinheitprodukt einzubringen, muß eine native (oder nahezu native) Konformationsfaltung der Proteine in dem Produkt vorhanden sein, um einen nützlichen immunologischen Effekt zu haben. Die Verwendung abgesonderter äußerer Membran-Vesikel oder -Bläschen kann eine elegante Lösung des Problems sein, protektive Integralmembran-Proteine in einen Untereinheit-Impfstoff einzuführen, während gerade noch sichergestellt ist, daß sie sich passend falten.
  • N. meningitis-Serogruppe B (menB) scheidet in ausreichenden Mengen äußere Membran-Bläschen ab, die ihre Herstellung in industriellem Maßstab erlauben. Solche aus vielen Bestandteilen bestehenden äußere Membran-Protein-Impfstoffe aus natürlich vorkommenden menB-Stämmen wurden zum Schutz von Teenagern gegenüber der menB-Krankheit für wirksam erachtet, und wurden in Lateinamerika registriert. Ein alternatives Verfahren zur Herstellung von äußere Membran-Vesikeln erfolgt über das Verfahren der oberflächenaktiven Extraktion bakterieller Zellen ( EP 11243 ).
  • Beispiele bakterieller Arten, aus denen Bläschen-Impfstoffe hergestellt werden können, sind die folgenden.
  • Neisseria meningitidis:
  • Neisseria meningitidis (Meningococcus) ist ein Gram-negatives Bakterium, das häufig aus den menschlichen oberen Atemwegen isoliert wird. Es verursacht gelegentlich invasive bakterielle Krankheiten, wie Bacteremia und Meningitis. Das Vorkommen einer auf Meningococcen beruhenden Krankheit zeigt geographische, saisonale und jährliche Unterschiede (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S. 18–24, 1989). Am meisten kommt die Krankheit in gemäßigten Ländern vor und beruht auf Stämmen der Serogruppe B und variiert in ihrer Häufigkeit von 1–10/100000/Jahr der Gesamtpopulation und erreicht manchmal höhere Werte (Kaczmarski, E. B. (1997), Common. Dis. Rep. Rev. 7: R55–9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A., Poolman, J. T. et al., Clin. Infect. Dis. 16: 237–246, 1993; Cruz, C., Pavez, G., Aguilar, E. et al., Epidemiol. Infect. 105: 119–126, 1990). Altersspezifisches Auftreten in den beiden hohen Risikogruppen, Kinder und Teenager, erreichen höhere Niveaus.
  • Von den Serogruppe A.-Meningococcen beherrschte Epidemien kommen meistens in Zentralafrika vor und erreichen Niveaus bis zu 1000/100000/Jahr (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V., Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S. 18–24, 1989). Nahezu alle Fälle einer auf Meningococcen basierenden Krankheit insgesamt, werden durch Serogruppe A-, B-, C-, W-135- und Y-Meningococcen verursacht. Ein tetravalenter A-, C-, W-135-, Y-Kapselpolysaccharid-Impfstoff ist verfügbar (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C., J. Biol. Stand. 10: 335–339, 1982).
  • Die Polysaccharid-Impfstoffe werden gegenwärtig durch chemisches Konjugieren mit ihren Trägerproteinen verbessert (Liebermann, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K. et al., JAMA 275: 1499–1503, 1996). Ein Serogruppen-B-Impfstoff ist nicht verfügbar, das das B-Kapselpolysaccharid nicht immunogen ist, weil es wahrscheinlich eine strukturelle Ähnlichkeit mit den Wirtsbestandteilen teilt (Wyle, F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L. et al., J. Infect. Dis. 126: 514–522, 1972; Finne, J. M., Leinonen, M., Mäkelä, P. M., Lancet ii.: 335–357, 1983).
  • Über viele Jahre hinweg waren die Anstrengungen darauf gerichtet, Impfstoffe zu entwickeln, die auf der äußeren Meningococcen-Membran basierten (de Moraes, J. C., Perkins, B., Carmargo, M. C. et al., Lancet 340: 1074–1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E. A. Gronnesby, J. K. et al., 338: 1093–1096, 1991). Solche Impfstoffe zeigten eine Wirksamkeit von 57% bis 85% in älteren Kindern (> 4 Jahre) und bei Heranwachsenden. Die meisten dieser Wirksamkeitsversuche wurden mit OMV-Wirkstoffen (äußere Membranvesikel, abgeleitet von LPS-Verarmung aus Bläschen), die von Wildtypstämmen N. meningitidis abgeleitet waren, durchgeführt.
  • Viele bakterielle äußere Membranbestandteile sind in diesen Impfstoffen vorhanden, wie PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB und der Beitrag dieser Bestandteile zum beobachteten Schutz bedarf noch weiterer Definitionen. Claassen et al. (Vaccine 4: 1001–1008, 1996) und Van der Ley et al. (Vaccine 13: 401–407, 1995) offenbaren rekombinante äußere Membran- Vesikelzubereitungen, die Mehrfachtypen des PorA-Antigens umfassen. Andere bakterielle äußere Membran-Komponenten wurden als möglicherweise relevant zur Induziereung schützender Immunität definiert (unter Verwendung tierischer oder menschlicher Antikörper), wie TbpB, NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B. R., J. Exp. Med. 185: 1173–1183, 1997; Lissolo, L., Maitre-Wilmotte, C., Dumas, P. et al., Inf. Immun. 63: 884–890, 1995). Der Mechanismus protektiver Immunität wird Antikörper-vermittelte bakterizide Aktivität und Opsonophagocytose enthalten.
  • Die Häufigkeit von Neisseria meningitidis-Infektionen stieg in den letzten Dekaden dramatisch an. Dies wurde dem Auftreten gegenüber Merhfachantibiotika-resistenten Stämmen und einer erhöhten Aussetzung aufgrund verstärkter sozialer Aktivitäten (zum Beispiel Swimmingpools oder Theater) zugeschrieben. Es ist nicht länger ungewöhnlich, Neisseria meningitidis-Stämme zu isolieren, die gegenüber einigen oder allen Standardantibiotika resistent sind. Dieses Phänomen hat einen ungelösten medizinischen Bedarf geschaffen und fordert neue antimikrobielle Wirkstoff, Impfstoffe, Drug-Screening-Verfahren und diagnostische Tests für diesen Organismus.
  • Moraxella catarrhalis
  • Moraxella catarrhalis (auch Branhamella catarrhalis genannt) ist ein Gram-negatives Bakterium, das häufig aus den menschlichen oberen Atemwegen isoliert wird. Es ist für verschiedene pathologische Befunde verantwortlich, von denen die Hauptbefunde Mittelohrentzündung bei Säuglingen und Kindern und Lungenentzündung bei den älteren sind. Es ist auch für Nasenhöhlenentzündung, nosokomiale Infekte und weniger häufig für invasive Erkrankungen verantwortlich.
  • Antibakterielle Antikörper wurden bei den meisten getesteten Erwachsenen identifiziert (Chapman, A. J. et al. (1985), J. Infect. Dis. 151: 878). M. catarrhalis-Stämme zeigen Veränderungen in ihrer Kapazität, antibakterieller Serumaktivität zu widerstehen: im allgemeinen sind Isolate von erkrankten Individuen resistenter als solche, die lediglich besiedelt waren (Hol, C. et al. (1993), Lancet 341: 1281, Jordan K. L. et al. (1990), Am. J. Med. 88 (suppl. 5A): 28S). Serumresistenz könnte demzufolge als ein Virulenzfaktor des Bakteriums betrachtet werden. Eine Opsonierungsaktivität wurde in den Seren von Kindern, die aus einer Mittelohrentzündung rückgewonnen wurden, beobachtet.
  • Die durch diese unterschiedlichen Immunantworten im Menschen angepeilten Antigene wurden noch nicht identifiziert, mit Ausnahme von OMP B1, einem 84 kDa-Protein, dessen Expression durch Eisen reguliert wird, und das durch Seren von Patienten mit Lungenentzündung erkannt wird (Sethi, S. et al. (1995), Infect. Immun. 63: 1516) und von UspA1 und UspA2 (Chen D. et al. (1999), Infect. Immun. 67: 1310).
  • Einige andere äußere Membranproteine, die auf der Oberfläche von M. catarrhalis vorhanden sind, wurden unter Verwendung biochemischer Verfahren auf ihre potentielle Verwicklung bei der Induzierung einer protektiven Immunität charakterisiert (zum Überblick siehe: Murphy, T. F. (1996), Microbiol. Rev. 60: 267). In einem Mäuse-Lungenentzündungs-Modell begünstigt die Gegenwart von Antikörpern, die gegenüber einigen von diesen erhöht sind (UspA, CopB), ein schnelleres Abklingen der pulmonaren Infektion. Ein anderes Polypeptid (OMP CD) ist in hohem Maße unter M. catarrhalis-Stämmen bewahrt und zeigt Homologien mit einem Porin von Pseudomonas aeruginosa, für das gezeigt wurde, daß es in Tiermodellen gegenüber diesem Bakterium wirksam ist.
  • M. catarrhalis erzeugt äußere Membran-Vesikel (Bläschen). Diese Bläschen wurden mit verschiedenen Verfahren isoliert oder extrahiert (Murphy, T. F., Loeb, M. R. 1989, Microb. Pathog. 6: 159–174; Unhanand M., Maciver, I., Ramillo, O., Arencibia-Mireles, O., Argyle J. C., McCracken G. H. Jr., Hansen E. J. 1992, J. Infect. Dis. 165: 644–650). Die protektive Kapazität solcher Bläschen-Zubereitungen wurde in einem Mäusemodell auf pulmonares Abklingen von M. catarrhalis getestet. Es wurde gezeigt, daß eine aktive Immunisierung mit einem Bläschenimpfstoff oder ein passiver Transfer eines Anti-Bläschen-Antikörpers einen bemerkenswerten Schutz in diesem Modell induziert (Maciver, I., Unhanand, M., McCracken, G. H. Jr., Hansen, E. J. 1993, J. Infect. Dis. 168: 469-472).
  • Haemophilus influenzae
  • Haemophilus influenzae ist ein nicht-freibewegliches Gram-negatives Bakterium. Der Mensch ist sein einziger natürlicher Wirt. H. influenzae-Isolate werden gewöhnlich entsprechend ihrer Polysaccharid-Kapsel klassifiziert. Sechs unterschiedliche Kapseltypen, von "a" bis "f" benannt, wurden identifiziert. Isolate, die nicht in der Lage sind, mit Antiseren, die gegen einen dieser sechs Serotypen hervorgerufen wurden, zu verkleben, werden als nicht typisch klassifiziert und exprimieren keine Kapsel.
  • H. influenzae, Typ b (Hib) ist deutlich von den anderen Typen unterschiedlich, indem er der Hauptgrund bakterieller Meningitis und systemischer Krankheiten ist. Nicht-typische Stämme des H. influenzae (NTHi) werden nur gelegentlich aus dem Blut von Patienten mit systemischer Krankheit isoliert. NTHi ist ein gewöhnlicher Grund für Lungenentzündung, Verschlimmerung chronischer Bronchitis, Nasennebenhöhlenentzündung und Mittelohrentzündung. NTHi-Stämme zeigen eine weite Variabilität, wie mit Klonierungsanalyse identifiziert wurde, während Hib-Stämme als ganze mehr homogen sind.
  • Verschiedene Proteine des H. influenzae zeigten an der Pathogenese beteiligt zu sein oder zeigten in Tiermodellen, Schutz durch Impfung zu verleihen.
  • Von einer Anhaftung des NTHi an menschliche nasopharyngeale Epithelzellen wurde berichtet (Read R. C., et al. 1991, J. Infect. Dis. 163: 549). Abgesehen von Fimbrien und Pili (Brinton, C. C. et al. 1989, Pediatr. Infect. Dis. J. 8: S54; Kar S. et al. 1990, Infect. Immun. 58: 903, Gildorf J. R. et al. 1992, Infect. Immun. 60: 374, St. Geme J. W. et al. 1991, Infect. Immun. 59: 3366; St. Geme J. W. et al., 1993, Infect. Immun. 61: 2233) wurden viele Anhaftungen in NTHi identifiziert. Unter diesen zeigten zwei an der Oberfläche ausgesetzte Proteine mit hohem Molekulargewicht, und mit HMW1 und HMW2 bezeichnet, daß sie die Anhaftung des NTHi an die Epithelzellen vermitteln (St. Geme J. W. et al. 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2875). In NTHi-Stämmen wurde eine andere Familie von Proteinen mit hohem Molekulargewicht identifiziert, der Proteine fehlen, die der HMW1/HMW2-Familie angehören. Das NTHi-115-kDa-Hia-Protein (Barenkamp S. J., St. Geme S. W. 1996, Mol. Microbiol., im Druck) ist dem Hsf-Adhesin, das durch H. influenzae Typ b-Stämme exprimiert wird (St. Geme J. W. et al., 1996, J. Bact. 178: 6281) in hohem Maße ähnlich. Ein anderes Protein, das Hap-Protein zeigt Ähnlichkeit mit IgA1-Serin-Proteasen und zeigte eine Beteiligung sowohl an der Adhäsion als auch beim Eintritt in die Zelle (St. Geme J. W. et al. 1994, Mol. Microbiol. 14: 217).
  • Fünf größere äußere Membranproteine (OMP) wurden identifiziert und numerische gezählt. Originalstudien mit H. influenzae-Typ b-Stämmen zeigten, daß für P1- und P2-OMPs spezifische Antikörper, Ratten im Säuglingsalter vor der nachfolgenden Anfechtung schützten (Loeb M. R. et al. 1987, Infect. Immun. 55: 2612; Musson R. S. Jr. et al. 1983, J. Clin. Invest. 72: 677). Für P2 wurde gefunden, daß es in der Lage ist, antibakterielle und opsonierte Antikörper zu induzieren, die gegen variable Regionen, die innerhalb der an der Oberfläche ausgesetzten Schleifenstrukturen dieses integralen OMPs vorhanden sind, gerichtet sind (Haase E. M. et al. 1994, Infect. Immun. 62: 3712; Troelstra A. et al., 1994, Infect. Immun. 62: 779). Das Lipoprotein P4 kann auch antibakterielle Antikörper (Green B. A. et al. 1991, Infect. Immun. 59: 3191) induzieren.
  • OMP P6 ist ein konserviertes Peptidglycan, das mit einem Lipoprotein assoziiert ist und bis zu 1–5% der äußeren Membran (Nelson M. B. et al. 1991, Infect. Immun. 59: 2628) ausmacht. Später wurde ein Lipoprotein von etwa dem gleichen Molekulargewicht erkannt, daß PCP (P6-kreuzreaktives Protein) (Deich R. M. et al. 1990, Infect. Immun. 58: 3388) genannt wurde. Eine Mischung der konservierten Lipoproteine P4, P6 und PCP offenbarte keinen Schutz, wie in einem Chinchilla-Mittelohrenzündungs-Modell gemessen wurde (Green B. A. et al. 1993, Infect. immun. 61: 1950). Allein P6 scheint einen Schutz in dem Chincilla-Modell zu induzieren (Demaria T. F. et al. 1996, Infect. Immun. 64: 5187).
  • Ein Fimbrin-Protein (Miyamoto N., Bakaletz, L. O. 1966, Microb. Pathog. 21: 343) wurde auch mit einer Homologie zum OMP P5 beschrieben, das selbst eine Sequenzhomologie zu dem integralen Escherichia coli OmpA besitzt (Miyamoto N., Bakaletz, L. O. 1996, Microb. Pathog. 21: 343; Munson R. S. Jr. et al. 1993. Infect. Immun. 61: 1017). NTHi scheint sich über die Fimbrien an den Schleim anzuheften.
  • In Übereinstimmung mit den mit den Gonococcen und Meningococcen gemachten Beobachtungen, exprimiert NTHi einen dualen menschlichen Transferrin-Rezeptor, der aus TbpA und TbpB zusammengesetzt ist, wenn er unter Limitierung von Eisen gewachsen ist. Der Anti-TbpB-Antikörper schützte Ratten im Säuglingsalter (Loosmore S. M. et al. 1996, Mol. Microbiol. 19: 575). Der Hämoglobin-/Haptoglobin-Rezeptor wurde auch für NTHi (Maciver I. et al. 1996, Infect. Immun. 64: 3703) beschrieben. Ein Rezeptor für Haem:Hämopexin wurde ebenfalls identifiziert (Cope L. D. et al. 1994, Mol. Microbiol. 13: 868). Ein Lactoferrin-Rezeptor ist ebenfalls unter NTHi gegenwärtig, jedoch noch nicht charakterisiert (Schryvers A. B. et al., 1989, J. Med. Microbiol. 29: 121). Ein Protein, das dem neisserialen FrpB-Protein ähnlich ist, wurde noch nicht unter NTHi beschrieben.
  • Ein 80 kDa OMP, das D15-Oberflächenantigen, liefert Schutz gegen NTHi in einem Maus-Herausforderungs-Modell (Flack F. S. et al. 1995, Gene 156: 97). LPD, ein 42 kDa äußeres Membran-Lipoprotein, ist unter Haemophilus influenzae konserviert und induziert antibakterielle Antikörper (Akkoyunlu M. et al. 1996, Infect. Immun. 64: 4586). Für ein kleineres 98 kDa OMP (Kimura A. et al. 1995, Infect. Immun. 47: 253) wurde gefunden, daß es ein protektives Antigen ist; dieses OMP kann sehr gut eines der OMPs sein, die die Eisenbeschränkung induzieren oder eines der Adhäsine mit hohem Molekulargewicht sein, die später charakterisiert wurden. H. influenzae erzeugt eine IgA1-Proteaseaktivität (Mulks M. H., Shoberg R. J. 1994, Meth. Enzymol. 235: 543). IgA1-Proteasen des NTHi haben ein höheren Grad antigener Variabilität (Lomholt H., von Alphen L., Kilian, M. 1993, Infect. Immun. 61: 4575).
  • Ein anderes OMP von NTHi, OMP26, eine 26-kDa-Protein zeigte, daß es die pulmonare Clearance in einem Rattenmodell steigert (Kyd, J. J., Cripps, A. W. 1998, Infect. Immun. 66: 2272). Das NTHi-HtrA-Protein zeigte auch, daß es ein protektives Antigen ist. In der Tat schützte dieses Protein Chinchilla vor einer Mittelohrentzündung und schützte Rattenbabies vor einer Bakteriämie vom H. influenzae-Typ b (Loosmore S. M. et al. 1998, Infect. Immun. 66: 899).
  • Äußere Membranvesikel (oder Bläschen) wurden aus H. influenzae (Loeb M. R., Zachary A. L., Smith D. H. 1981, J. Bacteriol. 145: 569–604; Stull T. L., Mack K., Haas, J. E., Smit, J., Smith, A. L. 1985, Anal. Biochem. 150: 471–480) isoliert. Die Vesikel waren mit der Induktion der Blut-Hirn-Schrankendurchlässigkeit (Wiwpelwey, B., Hansen, E. J., Scheld, W. M. 1989, Infect. Immun. 57: 2559–2560), der Induktion einer auf Meningitis beruhenden Entzündung (Mustafa M. M., Ramilo, O., Syrogiannopoulos, G. A., Olsen, K. D., McCraken G. H. Jr., Hansen, E. J. 1989, J. Infect. Dis. 159: 917–922) und einer DNA-Aufnahme (Concino M. F., Goodgal S. H. 1982, J. Bacteriol. 152: 441–450) assoziiert. Diese Vesikel waren in der Lage, an das nasale mucosale Epithel zu binden und vom nasalen mucosalen Epithel absorbiert zu werden (Harada T., Shimuzu T., Nishimoto K., Sakakura Y. 1989, Acta Otorhinolargygol. 246: 218–221), wobei sie zeigten, daß Adhäsine und/oder Besiedlungsfaktoren in den Bläschen vorhanden sein könnten. Eine Immunantwort gegenüber Proteinen, die in äußere Membranvesikeln gegenwärtig sind, wurde in Patienten mit verschiedenen H. influenzae-Krankheiten beobachtet (Sakakura Y., Harada T., Hamaguchi Y., Jin C. S. 1988, Acta Otorhinoloarygol. Suppl (Stockh.) 454: 222–226; Harada T., Sakakura Y., Miyoshi Y., 1986, Rhinology 24: 61–66).
  • Pseudomonas aeruginosa:
  • Die Gattung Pseudomonas besteht aus Gram-negativen, polar mit Geißeln besetzten, geraden und leicht gebogenen Stäbchenbakterien, die aerob wachsen und keine Sporen bilden. Wegen ihren begrenzten metabolischen Bedürfnissen, sind Pseudomonas spp. ubiquitär und im Boden, der Luft, im Abwasser und in Pflanzen weit verbreitet. Für zahlreiche Spezies von Pseudomonas, wie P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei, P. maltophilia und P. cepacia wurde auch gezeigt, daß sie für Menschen pathogen sind. Innerhalb dieser Liste wird P. aeruginosa für ein wichtiges menschliches Pathogen gehalten, da es mit einer opportunistischen Infektion eines Immunkompromiß-schließenden Wirtes einhergeht und für die hohe Todeszahl hospitalisierter Patienten verantwortlich ist. Eine nosokomiale Infektion mit P. aeruginosa betrifft primär Patienten, die einer Langzeitbehandlung unterworfen sind und immunsuppressive Wirkstoffe, Corticosteroide, antimetabolische Antibiotika oder Bestrahlung erhalten.
  • Das Pseudomonas und insbesondere P. aeruginosa, produziert eine Vielzahl von Toxinen (wie Hämolysine, Fibrinolysine, Esterasen, Koagulasen, Phospholipasen, Endo- und Exotoxine), die zur Pathogenizität dieser Bakterien einen Beitrag leisten. Darüber hinaus besitzen diese Organismen aufgrund der Gegenwart multipler Wirkstoff-Ausflußpumpen eine hohe intrinsische Resistenz gegenüber Antibiotika. Diese letzte Eigenschaft kompliziert häufig den Ausgang der Krankheit.
  • Aufgrund der unkontrollierten Verwendung antibakterieller Chemotherapeutika stieg die durch P. aeruginosa verursachte Häufigkeit einer nosokomialen Infektion bemerkenswert über die letzten 30 Jahre an. Beispielsweise wird die ökonomische Belastung einer P. aeruginosa nosokomialen Infektion in den USA auf 4,5 Millionen US$ geschätzt. Daher ist die Entwicklung eines Impfstoffs zur aktiven oder passiven Immunisierung gegen P. aeruginosa aktuell erforderlich (zum Überblick siehe Stanislavsky et al. 1997, FEMS Microbiol. Lett. 21: 243–277).
  • Verschiedene Zell-assoziierte und abgesonderte Antigene des P. aeruginosa waren Gegenstand einer Impfstoffentwicklung. Unter den Pseudomonas-Antigenen wurde eine schleimige Substanz, die ein extrazellulärer Schleim ist, der überwiegend aus Alginat besteht, befunden, in bezug auf Größe und Immunogenizität heterogen zu sein. Alginat-Bestandteile mit hoher Molekularmasse (30–300 kDa) scheinen konservierte Epitope zu enthalten, während Alginat-Bestandteile niedrigerer Molekularmasse (10–30 kDa) konservierte Epitope zusätzlich zu einzigartigen Epitopen besitzen. Unter den Oberflächen verbundenen Proteinen, konnte für PcrV, das Teil des Typ III-Sekretions-Translokations-Apparates ist, auch gezeigt werden, daß es ein interessantes Ziel für eine Impfung ist (Sawa et al. 1999, Nature medicine 5: 392–398).
  • Oberflächen-exponierte Antigene, einschließlich O-Antigene (O-spezifische Polysaccharide des LPS) oder H-Antigene (Geißelantigene) wurden zur Serotypenbestimmung aufgrund ihrer hohen immunogenen Natur verwendet. Chemische Strukturen wiederholter Einheiten O-spezifischer Polysaccharide wurden aufgeklärt und diese Daten erlaubten die Identifizierung von 31 Chemotypen von P. aeruginosa. Unter allen Serotypen des P. aeruginosa sind konservierte Epitope im Kern-Oligosaccharid gelegen, und die Lipid-A-Region von LPS und die Immunogene, die diese Epitope enthalten, induzieren eine Kreuzprotektiv-Immunität in Mäusen gegenüber unterschiedlichen P. aeruginosa-Immuntypen. Der äußere Kern von LPS war beteiligt, ein Ligand zur Bindung des P. aeruginosa an den Luftweg und an okulare Epithelzellen von Tieren zu sein. Jedoch besteht in dieser äußeren Kernregion unter unterschiedlichen Serotypen Heterogenität. Epitope in dem inneren Kern sind in hohem Maße konserviert und haben gezeigt, daß sie zur Oberfläche Zugang besitzen und nicht durch O-spezifische Polysaccharide maskiert sind.
  • Um die protektiven Eigenschaften von OM-Proteinen zu prüfen, wurden ein Impfstoff, der P. aeruginosa-OM-Proteine mit Molekularmassen, die von 20 bis 100 kDa reichen, in präklinischen und klinischen Versuchen verwendet. Dieser Impfstoff war in Tiermodellen gegen einen P. aeruginosa-Angriff wirksam und induzierte hohe Gehalte spezifischer Antikörper in den menschlichen Versuchspersonen. Plasma von menschlichen Versuchspersonen, die Anti-P. aeruginosa-Antikörper enthalten, lieferten einen passiven Schutz und halfen 87% der Patienten mit schweren Formen einer P. aeruginosea-Infektion zu retten. Vor kürzerer Zeit wurde gezeigt, daß ein Hybridprotein, das Teile der äußeren Membranproteine OprF (Aminosäuren 190–342) und OprI (Aminosäuren 21–83) von mit Glutathion-S-Transferase fusioniertem Pseudomonas aeruginosa enthält, Mäuse gegen eine 975-fache 50% lethale Dosis von P. aeruginosa schützt (Knapp et al. 1999, Vaccine. 17: 1663–1669).
  • Die gegenwärtigen Erfinder haben eine Zahl von Nachteilen, die mit den vorgenannten Wildtypbläschen-Vakzinen einhergehen (entweder natürlich vorkommend oder chemisch hergestellt), realisiert.
  • Beispiele solcher Probleme sind die folgenden:
    • – die Gegenwart immundominanter aber variabler Proteine auf dem Bläschen (PorA; TbpB, Opa [N. meningitidis B]; P2, P5 [nicht-typisierbare H. influenzae]) – solche Bläschen sind nur gegenüber einer beschränkten Auswahl einer bakteriellen Spezies effektiv. Die Typen-Spezifität der antibakteriellen Antikörper-Antwort kann die Verwendung derartiger Impfstoffe in der Kindheit ausschließen;
    • – die Gegenwart ungeschützter Antigene (ohne Bedeutung) (Rmp, H8, ...) bei den Bläschen-Antigenen, die Köder für das Immunsystem sind;
    • – der Mangel an Gegenwart wichtiger Moleküle, die gegebenenfalls produziert werden (z.B. Eisen-regulierte äußere Membranproteine, IROMP's, in vivo-regulierte Expressionsmechanismen) – solche Bedingungen sind schwer in der Bläschenherstellung zu kontrollieren, um die Menge eines Antigens auf der Oberfläche zu optimieren;
    • – der niedrige Expressionsgehalt an protektiven Antigenen (teilweise konserviert) (NspA, P6);
    • – die Toxizität von LPS, das auf der Oberfläche des Bläschens zurückbleibt;
    • – die potentielle Induktion einer Autoimmunantwort wegen wirtsidentischer Strukturen (z.B. das Kapselpolysaccharid in Neisseria meningitidis-Serogruppe B, das Lacto-N-neotetraose in Neisseria LPS, Saccharid-Struktur innerhalb von ntHi-LPS, Saccharid-Strukturen innerhalb von Pili).
  • Solche Probleme können die Verwendung von Bläschen-Impfstoffen als Humanimpfstoffreagentien ausschließen. Dies ist insbesondere so bei pädiatrischer Verwendung (< 4 Jahre), wo das Reaktionsvermögen gegenüber Bläschenimpfstoffen besonders wichtig ist, und wo Bläschenimpfstoffe (z.B. das vorerwähnte vermarktete MenB-Bläschenvakzin) gezeigt haben, daß sie zum Immunschutz ohne Wirkung sind. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Überwindung der obigen Probleme zur Verfügung, indem gentechnisch hergestellte bakterielle Stämme, die verbesserte Bläschenimpfstoffe zum Ergebnis haben, verwendet werden. Solche Verfahren werden insbesondere in der Generation neuer Impfstoffe gegen bakterielle Pathogene, wie Neisseria meningitidis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa und andere nützlich sein.
  • Die erfindungsgemäßen Bläschenimpfstoffe sind dazu bestimmt, die Immunantwort auf wenige protektive Antigene oder Epitope (vorzugsweise konservierte), in einem Mehrfach-Komponenten-Impfstoff formuliert, zu fokussieren. Wo derartige Antigene integrale OMPs sind, werden die äußeren Membranvesikel oder Bläschenimpfstoffe deren geeignete Faltung sicherstellen. Diese Erfindung stellt Verfahren zur Verfügung, die OMP- und LPS-Zusammensetzung der OMV-(Bläschen-)Impfstoffe zu optimieren, indem immundominant variable als auch nicht protektive OMPs entfernt werden, indem konservierte OMPs durch Entfernung veränderlicher Regionen geschaffen werden, durch Aufregulation der Expression protektiver OMPs und durch Eliminierung von Kontrollmechanismen zur Expression protektiver OMPs (wie eine Beschränkung des Eisens). Zusätzlich sorgt die Erfindung für eine Reduzierung der Toxizität eines Lipid A durch Veränderung des Lipidanteils oder durch Veränderung der Phosphoryl-Zusammensetzung, während deren Hilfsstoffseigenschaft beibehalten ist, oder durch dessen Maskierung. Jedes dieser neuen Verfahren zur Verbesserung, verbessert individuell den Bläschenimpfstoff; gleichwohl arbeitet eine Kombination eines oder mehrerer dieser Verfahren zusammen, um einen optimierten gentechnisch hergestellten Bläschenimpfstoff, der immunprotektiv und nicht toxisch ist, insbesondere zur Verwendung in der Pädiatrie geeignet ist, herzustellen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung stellt eine aus einem modifizierten Neisseria meningitidis-Stamm gentechnisch manipulierte Bläschen-Zubereitung zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Zubereitung durch Einsetzen des folgenden Verfahrens erhältlich ist:
    • a) ein Verfahren zur Reduzierung von immundominanten variablen oder nicht-protektiven Antigenen innerhalb der Bläschen-Zubereitung, das die Schritte der Bestimmung der Identität eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stammes zur Erzeugung von weniger oder keinem Antigen des PorA-Antigens umfaßt, und Bläschen von diesem Stamm herstellt;
  • Die Erfindung stellt weiterhin zur Verfügung:
    Eine gentechnisch manipulierte Bläschen-Zubereitung, die aus einem modifizierten Moraxella catarrhalis-Stamm isoliert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung durch Einsetzen des folgenden Verfahrens erhältlich ist:
    • a) ein Verfahren zur Reduzierung von immundominanten variablen oder nicht-protektiven Antigenen innerhalb der Bläschen-Zubereitung, das die Schritte der Bestimmung der Identität eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stammes zur Erzeugung von weniger oder keinem Antigen und der Herstellung von Bläschen aus diesem Stamm umfaßt,
    worin eines oder mehrere dieser Antigene aus einer Liste ausgewählt sind, die aus CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA und LbpB besteht.
  • In einer weiteren Ausführung wird zur Verfügung gestellt:
    Eine gentechnisch manipulierte Bläschen-Zubereitung, die aus einem modifizierten Haemophilus influenzae-Stamm isoliert ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Zubereitung durch Einsetzen des folgenden Verfahrens erhältlich ist:
    • a) ein Verfahren zur Reduzierung von immundominanten variablen oder nicht-protektiven Antigenen innerhalb der Bläschen-Zubereitung, das die Schritte der Bestimmung der Identität eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stammes zur Erzeugung von weniger oder keinem von diesem Antigen und der Herstellung von Bläschen aus diesem Stamm umfaßt, worin eines oder mehrere dieser Antigene aus einer Liste ausgewählt sind, die aus P2, P5, Hif, IgA1-Protease, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA und TbpB besteht.
  • Die erfindungsgemäße gentechnisch manipulierte Bläschen-Zubereitung kann durch Einsetzen eines oder mehrerer weiterer Verfahren, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind, erhalten werden:
    • b) ein Verfahren der Aufregulation der Expression von protektiven, endogenen (und vorzugsweise konservierten) OMP-Antigenen innerhalb der Bläschen-Zubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stammes, um eine stärkere Promotorsequenz stromaufwärts eines Gens einzuführen, das das Antigen codiert, so daß das Gen mit einer höheren Stärke als im nicht-modifizierten Bläschen exprimiert wird, und der Herstellung von Bläschen aus diesem Stamm umfaßt;
    • c) ein Verfahren der Aufregulation der bedingt exprimierten, protektiven (und vorzugsweise konservierten) OMP-Antigene innerhalb der Bläschen-Zubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stammes, um die repressiven Kontrollmechanismen seiner Expression zu entfernen (wie eine Einschränkung des Eisens) und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfaßt;
    • d) ein Verfahren der Modifizierung des Lipid-A-Teils von bakteriellem LPS innerhalb der Bläschen-Zubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid-A-Teil von LPS toxisch zu machen, der Manipulation eines bakteriellen Stammes, um die Expression des Genes zu reduzieren oder auszuschalten, und der Herstellung der Bläschen aus dem Stamm umfaßt;
    • e) ein Verfahren der Modifizierung des Lipid-A-Teils von bakteriellem LPS innerhalb der Bläschen-Zubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid-A-Teil von LPS weniger toxisch zu machen, der Manipulation eines bakteriellen Stammes, um eine stärkere Promotorsequenz stromaufwärts des Gens einzuführen, so daß das Gen mit einer höheren Stärke als im nicht-modifizierten Bläschen exprimiert wird und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfaßt;
    • f) ein Verfahren der Reduzierung der Lipid-A-Toxizität innerhalb der Bläschen-Zubereitung und der Erhöhung der Mengen an protektiven Antigenen, das die Schritte der Manipulation des Chromosoms eines bakteriellen Stammes, um ein Gen einzuführen, das ein Polymyxin-A-Peptid oder ein Derivat oder Analogon davon codiert, fusioniert an ein protektives Antigen, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfaßt;
    • g) ein Verfahren der Erzeugung von konservierten OMP-Antigenen auf der Bläschen-Zubereitung, das die Schritt der Identifizierung eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stammes um variable Regionen eines Gens zu entfernen, das das Antigen codiert, und der Herstellung von Bläschen aus diesem Stamm umfaßt;
    • h) ein Verfahren der Reduzierung der Expression innerhalb der Bläschen-Zubereitung eines Antigens, das eine strukturelle Ähnlichkeit mit einer humanen Struktur teilt und eine Autoimmunreaktion in Menschen induzieren kann (wie das Kapselpolysaccharid von N. meningitidis B), umfassend die Schritte der Identifizierung eines Gens, das an der Biosynthese des Antigens beteiligt ist, der Manipulation eines bakteriellen Stammes, um die Expression des Gens zu reduzieren oder auszuschalten, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm; oder
    • i) ein Verfahren der Aufregulation der Expression von protektiven, endogenen (und vorzugsweise konservierten) OMP-Antigenen innerhalb der Bläschen-Zubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stammes, um in das Chromosom eine oder mehrere weitere Kopien eines Gens einzuführen, das das Antigen codiert, das durch eine heterologe stärkere Promotorsequenz kontrolliert wird, und der Herstellung von Bläschen aus diesem Stamm umfaßt.
  • Weitere Aspekte der Erfindung schließen ein: bevorzugte Verfahren zum Erhalt der oben genannten Bläschen-Zubereitung, einschließlich der optimalen Positionierung starker Promotoren für die Aufregulation der Expression eines Antigens innerhalb der Bläschen, bevorzugte Antigene zur Aufregulation und Abregulation verschiedener bakterieller Stämme, um Bläschen-Zubereitungen zu erhalten, die insbesondere zur Verwendung als Impfstoff geeignet sind. Bevorzugte Formulierungen, die die erfindungsgemäßen Bläschen umfassen, werden auch zur Verfügung gestellt, die insbesondere für global einsetzbare Impfstoffe gegen bestimmte Krankheitszustände geeignet sind. Vektoren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Bläschen und modifizierte bakterielle Stämme, aus denen die erfindungsgemäßen Bläschen hergestellt werden, sind noch weitere Aspekte der Erfindung.
  • Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal eine Bläschen-Zubereitung zur Verfügung, die immunprotektiv und nicht toxisch ist, wenn sie bei Kindern in einem Alter von unter 4 Jahren angewandt wird.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1: Reaktivität des 735 mAb auf unterschiedlichen Kolonien.
  • 2: Reaktivitäten spezifischer monoklonaler Antikörper durch Ganzzellen-ELISA.
  • 3: Schematische Wiedergabe der pCMK-Vektoren, die zur Lieferung von Genen, Operons und/oder Expressionskassetten in dem Genom von Neisseria meningitidis verwendet werden.
  • 4: Analyse der PorA-Expression in Ganzproteinextrakten einer rekombinanten N. meningitidis-Serogruppe B (H44/76-Derivate). Die Gesamtproteine wurden von cps– (Reihen 3 und 4), cps–porA::pCMK+ (Reihen 2 und 5) und cps–porA::nspA (Reihen 1 und 6) rekombinanter N. meningitidis-Serogruppen-B-Stämme geerntet, und wurden unter SDS-PAGE-Bedingungen in einem 12% Polyacrylamidgel analysiert. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau (Linien 1 bis 3) gefärbt oder auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und mit einem Anti-PorA-monoklonalen-Antikörper immungefärbt.
  • 5: Analyse einer NspA-Expression in Protein-Extrakten rekombinanter N. meningitidis-Serogruppe-B-Stämme (H44/76-Derivate). Die Proteine wurden aus ganzen Bakterien (Reihen 1 bis 3) oder äußere Membranbläschenzubereitungen (Reihen 4 bis 6) extrahiert, durch SDS-PAGE auf 12% Acrylamidgel separiert und durch Immun-Blotting unter Verwendung eines Anti-NspA-polyklonalen-Serums analysiert. Die mit cps– (Reihen 1 bis 6), cps–pora::pCMK+ (Reihen 3 und 4) und cps–porA::nspA (Reihen 2 und 5) korrespondierenden Proben wurden analysiert. Zwei Formen von NspA wurden detektiert: eine reife Form (18 kDa), die mit rekombinantem gereinigtem NspA co-migriert ist, und eine kürzere Form (15 kDa).
  • 6: Analyse der D15/omp85-Expression in Protein-Extrakten rekombinanter N. meningitidis-Serogruppe B-Stämme (H44/76-Derivate). Die Proteine wurden aus äußere Membran-Bläschen-Zubereitungen extrahiert, und wurden durch SDS-PAGE auf einem 12% Acrylamidgel separiert und durch Immun-Blotting unter Verwendung eines anti-omp85-polyklonalen Serums analysiert. Die Proben, die mit cps– (Reihe 2 und cps–, PorA+, pCMK+Omp85/D15 (Reihe 1) rekombinanten N. meningitidis-Serogruppen-B-Stämmen korrespondierten, wurden analysiert.
  • 7: Allgemeine Strategie zur Modulierung der Genexpression durch Promotorlieferung (RS steht für Restriktionsort).
  • 8: Analyse der äußeren Membranbläschen, die durch rekombinante N. meningitidis-Serogruppe B cps-Stämme (H44/76-Derivate) hergestellt wurden. Die Proteine wurden aus äußere Membranbläschenzubereitungen extrahiert und mittels SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen auf einem 4–20% Gradient-Polyacrylamidgel separiert. Das Gel war mit Coomassie-Brilliantblau R250 gefärbt. Reihen 2, 4, 6 entsprachen 5 μg der Gesamtproteine, während Reihen 3, 5 und 7 mit 10 μg Proteinen beladen waren.
  • 9: Künstliche Schaffung eines Promotor-Substitutionsplasmides, das zur Aufregulation der Expression/Herstellung von Omp85/D15 in Neisseria meningitidis H44/76 verwendet wurde.
  • 10: Analyse der OMP85-Expression in Gesamtproteinextrakten von rekombinantem NmB (H44/76-Derivate). Die Gele wurden mit Coomassie-Blau (A) gefärbt oder auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und mit Kaninchen-Anti-OMP85 (N. gono) monoklonalem Antikörper (B) immungefärbt.
  • 11: Analyse der OMP85-Expression in OMV-Zubereitungen aus rekombinantem NmB (H44/76-Derivate). Die Gele wurden mit Coomassie-Blau (A) gefärbt, auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und mit Kaninchen-Anti-OMP85-polyklonalem Antikörper (B) immungefärbt.
  • 12: Schematische Wiedergabe der rekombinanten PCR-Strategie, die zur Entfernung des lacO in dem chimären porA/lacO-Promotor verwendet wurde.
  • 13: Analyse der Hsf-Expression in Gesamtprotein-Extrakten der rekombinanten N. meningitidis-Serogruppe B (H44/76-Derivate). Die Gesamtproteine wurden aus Cps–PorA+ (Reihe 1) und Cps–PorA+/Hsf (Reihe 2) rekombinanten N. meningitidis-Serogruppe B-Stämmen geerntet und wurden unter SDS-PAGE-Bedingungen in einem 12% Polyacrylamid-Gel analysiert. Die Gele wurden mit Coomassie-Blau eingefärbt.
  • 14: Analyse der GFP-Expression in Gesamtprotein-Extrakten rekombinanter N. meningitidis (H44/76-Derivat). Die Gesamtproteine wurden aus Cps–, PorA+ (Reihe 1), Cps–, PorA–GFP+ (Reihen 2 und 3) rekombinanter Stämme geerntet. Die Proteine wurden durch PAGE-SDS in einem 12% Polyacrylamidgel separiert und anschließend mit Coomassie-Blau eingefärbt.
  • 15: Erläuterung des Musters größerer Proteine auf der Oberfläche verschiedener rekombinanter Bläschen-Zubereitungen, wie durch SDS-PAGE (Coomassie-Färben) analysiert wurde.
  • 16: Spezifische Anti-Hsf-Antwort auf verschiedene Bläschen- und rekombinante Bläschen-Zubereitungen, unter Verwendung eines gereinigten rekombinanten Hsf-Proteins.
  • 17: Analyse der NspA-Expression in Gesamtprotein-Extrakten eines rekombinanten NmB (Serogruppe B-Derivate). Die Gele wurden mit Coomassie-Blau (A) gefärbt oder auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und mit einem Maus-Anti-PorA-monoklonalen Antikörper (B) oder einem Maus-Anti-N-NspA-polyklonalen Antikörper (C) immungefärbt.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine allgemeine Garnitur von Werkzeugen und Verfahren, die in der Lage sind, zur Herstellung verbesserter, gentechnisch manipulierter Bläschen aus Gram-negativen bakteriellen Stämmen verwendet zu werden. Die Erfindung schließt Verfahren ein, die verwendet werden, um rekombinante Bläschen immunogener, weniger toxisch und sicherer bei ihrer Anwendung in einem menschlichen und/oder tierischen Impfstoff zu machen. Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Erfindung auch spezifische Verfahren, die erforderlich sind, um gentechnisch manipulierte Bläschen aus verschiedenen Gram-negativen Bakterien künstlich herzustellen, herzustellen, zu erhalten und für Impf-therapeutische und/oder diagnostische Zwecke zu benutzen. Durch die erfindungsgemäßen Verfahren kann die biochemische Zusammensetzung bakterieller Bläschen manipuliert werden, indem auf die Expression bakterieller Gene eingewirkt wird oder die Expression bakterieller Gene verändert wird, die Produkte chiffrieren, die mit bakteriellen äußere Membran-Bläschen gegenwärtig sind oder mit diesen verbunden sind (äußere Membran-Proteine oder OMPs). Die Herstellung von Bläschen, die ein Verfahren genetischer Veränderung verwendet, um die Expression eines oder mehrerer Gene, die die äußeren Membran-Bestandteile chiffrieren, zu erhöhen, zu erniedrigen oder vereinbar zu machen, sind auch vom Umfang dieser Erfindung umfaßt.
  • Zur Klarheit wird sich die Bezeichnung "Expressionskassette" hierin auf alle genetischen Elemente beziehen, die notwendig sind, ein Gen oder ein Operon zu exprimieren, und das/die interessierende(n) entsprechende(n) Protein(e) der äußeren Membran-Bläschen, die von einem vorgegebenen bakteriellen Wirt abgeleitet sind, herzustellen und als Ziel zu erkennen. Eine nicht-vollständige Liste dieser Merkmale schließt Kontrollelemente (transkriptionale und/oder translationale) Protein-codierende Regionen und Zielsignale, mit geeigneten Zwischenräumen zwischen ihnen ein. Die Bezugnahme auf den Einbau von Promotorsequenzen meint für die Zwecke dieser Erfindung den Einbau einer Sequenz mit wenigstens einer Promotorfunktion und vorzugsweise einem oder mehrerer anderer genetischer Regulatorelemente, die innerhalb der Expressionskassette umfaßt sind. Darüber hinaus wird die Bezeichnung "integrative Kassette" sich hierin auf alle genetischen Elemente beziehen, um ein DNA-Segment in einen vorgegebenen bakteriellen Wirt zu integrieren. Eine nicht-vollständige Liste dieser Merkmale schließt ein Lieferungsvehikel (oder Vektor) mit rekombinogenen Regionen und selektierbaren Marker und Marker, gegen die selektiert wird, ein.
  • Wiederum zum Zwecke der Klarheit, beziehen sich die Begriffe "gentechnisches Manipulieren eines bakteriellen Stammes, um weniger dieses Antigens herzustellen", auf jedwede Vorrichtung, um die Expression eines interessierenden Antigens zu reduzieren, relativ zu dem nicht-modifizierten (d.h. einem natürlich vorkommenden) Bläschen, dessen Expression wenigstens 10% niedriger als die des nicht-modifizierten Tröpfchens ist. Vorzugsweise ist sie wenigstens 50% geringer. "Stärkere Promotorsequenz" bezieht sich auf ein regulatorisches Kontrollelement, das die Transktiption für ein Gen, das ein interessierendes Antigen codiert, erhöht. "Aufregulations-Expression" bezieht sich auf jedwedes Mittel, das die Expression eines interessierenden Antigens, relativ zu dem nicht-veränderten (d.h. natürlich vorkommenden) Bläschen, verstärkt. Es ist selbstverständlich, daß die Menge der "Aufregulation" von dem besonders interessierenden Antigen abhängen wird, aber nicht einen Wert überschreiten wird, der die Membranunversehrtheit des Bläschens zerreißen wird. Aufregulation eines Antigens bezieht sich auf die Expression, die wenigstens 10% höher als die des nicht veränderten Bläschens ist. Vorzugsweise ist sie wenigstens 50% höher. Bevorzugter ist sie wenigstens 100% (2-fach) höher.
  • Aspekte dieser Erfindung beziehen sich auf individuelle Verfahren zur Herstellung verbesserter Gen-manipulierter Bläschen, auf eine Kombination solcher Verfahren und auf Bläschen-Zubereitungen, die als ein Ergebnis dieser Verfahren hergestellt worden sind. Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die verwendeten genetischen Werkzeuge, um einen ausgewählten bakteriellen Stamm genetisch zu verändern, um die verbesserten Gen-manipulierten Bläschen aus diesem Stamm zu extrahieren.
  • Die Schritte der gentechnischen Manipulation der erfindungsgemäßen Verfahren können auf vielfältige Weise, die dem Fachmann bekannt sind, ausgeführt werden. Beispielsweise können Sequenzen (z.B. Promotoren oder offene Leserahmen) eingebaut werden, und Promotoren/Gene können durch die Technik des Transposon-Einbaus unterbrochen werden. Beispielsweise könnte zur Aufregulation der Expression eines Gens ein starker Promotor mittels eines Transposons bis zu 2 kb stromaufwärts des Startcodons des Gens eingebaut werden (bevorzugter 200–600 bp stromaufwärts, am meisten bevorzugt, annäherungsweise 400 bp stromaufwärts). Punktmutation oder Deletion kann ebenso verwendet werden (insbesondere zur Abregulation der Expression eines Gens).
  • Jedoch können solche Verfahren ziemlich instabil oder unsicher sein, und daher ist es bevorzugt, daß der Gen-Manipulationsschritt [insbesondere für die unten beschriebenen Verfahren a), b), c), d), e), h) und i)] mittels eines homologen Rekombinationsereignisses durchgeführt wird. Vorzugsweise findet das Ereignis zwischen einer Sequenz (eine rekombinogene Region) von wenigstens 30 Nukleotiden auf dem bakteriellen Chromosom statt, und eine Sequenz (eine zweite rekombinogene Region) von wenigstens 30 Nukleotiden auf einem Vektor wurde innerhalb des Stammes transformiert. Vorzugsweise sind die Regionen 40–1000 Nukleotide, bevorzugter 100–800 Nukleotide, am meisten bevorzugt 500 Nukleotide). Die rekombinogenen Regionen sollten ausreichend ähnlich sein, so daß sie in der Lage sind, miteinander unter hohen stringenten Bedingungen (wie später definiert) zu hybridisieren.
  • Rekombinationsereignisse können unter Verwendung einer einzelnen rekombinogenen Region auf dem Chromosom und Vektor oder mittels eines Überkreuzungsereignisses (mit 2 Regionen auf dem Chromosom und Vektor) stattfinden. Um ein einzelnes Rekombinationsereignis ausführen zu können, sollte der Vektor ein ringförmiges DNA-Molekül sein. Um ein Doppel-Rekombinationsereignis ausführen zu können, sollte der Vektor ein ringförmiges oder lineares DNA-Molekül sein (siehe 7). Es ist bevorzugt, daß ein doppeltes Rekombinationsereignis verwendet wird, und daß der verwendete Vektor linear ist, so daß das so hergestellte modifizierte Bakterium stabiler sein wird, was die Rückmutationsereignisse angeht. Vorzugsweise werden die beiden rekombinogenen Regionen auf dem Chromosom (und auf dem Vektor) eine ähnliche Länge aufweisen (am bevorzugtesten dieselbe Länge), um die doppelten Überkreuzungen zu fördern. Die doppelten Überkreuzungsfunktionen, wie die der beiden rekombinogenen Regionen auf dem Chromosom (durch eine Nukleotidsequenz "X" separiert) und die beiden rekombinogenen Regionen auf dem Vektor (durch eine Nukleotidsequenz "Y" separiert) rekombinieren, um ein Chromosom, mit Ausnahme das X und Y ausgewechselt wurden, zu verlassen. Die Position der rekombinogenen Regionen können sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts eines interessierenden offenen Leserahmens sein, oder diesen flankieren. Diese Regionen können aus einer codierenden, nicht-codierenden oder einem Gemisch aus einer codierenden und nicht-codierenden Sequenz bestehen. Die Identität von X und Y wird von dem erwünschten Effekt abhängen. X kann den gesamten oder einen Teil eines offenen Leserahmens ausmachen, und Y kann überhaupt keine Nukleotide sein, welche in einer Sequenz X resultieren würden, die aus dem Chromosom deletiert ist. Alternativ kann Y eine starke Promotorregion zum Einbau stromaufwärts eines offenen Leserahmens sein, und demzufolgen kann X überhaupt keine Nukleotide sein.
  • Geeignete Vektoren werden in ihrer Zusammensetzung in Abhängigkeit, welcher Typ eines Rekombinationsereignisses durchgeführt werden soll, und was letztendlich der Zweck des Rekombinationsereignisses ist, abhängen. Integrative Vektoren, die zur Lieferung der Region Y verwendet wurden, können konditionelle, replikative oder suizide Plasmide, Bakteriophagen, Transposone oder lineare DNA-Fragmente sein, die durch Restriktionshydrolyse oder PCR-Amplifikation erhalten wurden. Eine Selektion eines Rekombinationsereignisses wird mittels selektierbarer Genmarker, wie Genen, die gegenüber Antibiotika Resistenz verleihen (z.B. Kanamycin, Erythromycin, Chloramphenicol oder Gentamycin), Genen, die Resistenz gegenüber Schwermetallen und/oder toxischen Verbindungen verleihen oder Genen, die auxotrophe Mutationen ergänzen (z.B. pur, leu, met, aro), ausgewählt.
  • Verfahren a) und f) – Abregulation/Entfernung variabler und nicht-protektiver immundominanter Antigene
  • Viele Oberflächenantigene sind unter bakteriellen Stämmen veränderlich, und als Konsequenz sind sie nur gegenüber einer begrenzten Reihe eng verwandter Stämme protektiv. Ein Aspekt dieser Erfindung umfaßt die Reduktion der Expression, oder vorzugsweise die Deletion des/der Gens(e), das/die ein variable(s) Oberflächenprotein(e) codiert/codieren, was einen bakteriellen Stamm zum Ergebnis hat, der Bläschen produziert, die, wenn sie in einem Impfstoff verabreicht werden, ein stärkeres Potential zur Kreuzreaktivität gegenüber veränderlichen Stämmen aufgrund eines größeren, durch konservierte Proteine ausgeübten Einflusses, auf das Immunsystem des Geimpften (auf den äußeren Membranen zurückgehalten) haben. Beispiele solcher veränderlichen Antigene schließen ein: für Neisseria – pili (PilC) der antigenen Veränderungen unterliegt, PorA, Opa, TbpB, FrpB; für H. Influenzae – P2, P5, Pilin, IgA1-Protease; und für Moraxella – CopB, OMP106.
  • Andere Gen-Typen, die abreguliert oder ausgeschaltet werden könnten, sind Gene, die – in vivo – leicht eingeschaltet (exprimiert) oder durch das Bakterium ausgeschaltet werden können. Weil solche Gene, die die äußere Membranproteine codieren nicht immer auf dem Bakterium gegenwärtig sind, kann die Gegenwart solcher Proteine in den Bläschen-Zubereitungen auch für die Wirksamkeit des Vakzins aus den oben erwähnten Gründen nachteilig sein. Ein bevorzugtes Beispiel zur Abregulation oder Deletion ist das Neisseria Opc-Protein. Eine Anti-Opc-Immunität, die durch ein Opc enthaltendes Bläschen-Vakzin induziert wurde, würde lediglich eine beschränkte protektive Kapazität haben, da der zu infizierende Organismus leicht Opc– werden könnte. H. influenzae HgpA und HgpB sind andere Beispiele solcher Proteine.
  • Im Verfahren a) sind diese variablen oder nicht-protektiven Gene in der Expression abreguliert oder terminal ausgeschaltet. Dies hat den oben erwähnten überraschenden Vorteil, das Immunsystem auf bessere Antigene, die in geringen Mengen auf der äußeren Oberfläche der Bläschen vorhanden sind, zu konzentrieren.
  • Auf diese Weise kann der Stamm durch eine Anzahl von Strategien Gen-manipuliert werden, die einen Transposoneinbau einschließen, um die codierende Region oder die Promotorregion des Gens zu unterbrechen, oder Punktmutationen oder Deletionen, um ein ähnliches Ergebnis zu erreichen, einschließen. Homologe Rekombination kann auch verwendet werden, um ein Gen aus einem Chromosom (wo die Sequenz X einen Teil der codierenden Sequenz des interessierenden Gens (vorzugsweise alle) umfaßt), zu deletieren. Sie kann zusätzlich verwendet werden, um deren starken Promotor gegen einen schwächeren (oder keinen) Promotor auszutauschen (wo die Nukleotidsequenz X einen Teil der Promotorregion des Gens (vorzugsweise die gesamte) umfaßt, und die Nukleotidsequenz Y entweder eine schwächere Promotorregion [in einer verminderten Expression des/der interessierenden Gens(e)/Operons(e) resultierend] oder keine Promotorregion umfaßt. In diesem Fall ist es für das Rekombinationsereignis vorteilhaft, innerhalb der Region des Chromosoms 1000 bp stromaufwärts des interessierenden Gens stattzufinden.
  • Alternativ kann Y eine konditionelle transkriptionale Aktivität verleihen, die in einer konditionellen Expression des/der interessierenden Gens(e)/Operons(e) (Abregulation) resultiert. Dies ist zur Expression von Molekülen, die toxisch sind, oder durch den bakteriellen Wirt nicht gut unterstützt werden, nützlich.
  • Die meisten der oben beispielhaft erwähnten Proteine sind integrale OMPs und ihre Variabilität kann nur durch eine oder wenige der auf der Oberfläche exponierten Schleifen begrenzt werden. Ein anderer Aspekt dieser Erfindung [Verfahren g)] umfaßt die Deletion von DNA-Regionen, die für diese an der Oberfläche exponierten Schleifen codieren, was zur Expression eines integralen OMP führt, das konservierte Oberflächen-exponierte Schleifen enthält. Oberflächen-exponierte Schleifen von H. influenzae P2 und P5 sind bevorzugte Beispiele für Proteine, die in kreuzreaktive Antigene unter Verwendung eines solchen Verfahrens transformiert werden könnten. Nochmals, eine homologe Rekombination ist ein bevorzugtes Verfahren, dieses gentechnische Verfahren auszuführen.
  • Verfahren b) – Promotorlieferung und Modulation:
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft die Abänderung der Zusammensetzung der Bläschen, indem in situ die regulatorische Region, die die Expression des/der interessierenden Gens(e) und/oder Operons(e) kontrolliert, abgeändert wird. Diese Abänderung kann einen teilweisen oder vollständigen Ersatz des endogenen Promotors, der die Expression eines interessierenden Gens kontrolliert, durch einen, der eine unterschiediche transkriptionale Aktivität verleiht, umfassen. Diese unterschiedliche transkriptionale Aktivität kann durch Varianten der endogenen Kontrollregionen (Punktmutationen, Deletionen und/oder Insertionen), durch natürlich vorkommende oder modifizierte, heterologe Promotoren oder durch eine Kombination aus beiden, verliehen werden. Solche Abänderungen werden vorzugsweise eine transkriptionale Aktivität verleihen, die stärker als die einer endogenen ist (Einführung eines starken Promotors), was in einer verstärkten Expression des/der interessierenden Gens(e)/Operons(e) (Aufregulation), resultiert. Ein derartiges Verfahren ist besonders zur Steigerung der Produktion immunologisch relevanter Bläschenbestandteile, wie äußere Membran-Proteine und Lipoproteine (vorzugsweise konservierte OMPs, gewöhnlicherweise in Bläschen bei niedrigen Konzentrationen gegenwärtig), nützlich.
  • Typische starke Promotoren, die in Neisseria eingebaut werden können, sind porA [SEQ ID NO: 24], porB [SEQ ID NO: 26], IgtF, Opa, p110, Ist und hpuAB. PorA und PorB sind als konstitutive, starke Promotoren bevorzugt. Es wurde etabliert (Beispiel 9), daß die PorB-Promotor-Aktivität in einem Fragment enthalten ist, das den Nukleotiden –1 bis –250 stromaufwärts des Startcodons von porB entspricht. In Moraxella ist die Verwendung von ompH-, ompG-, ompE-, OmpB1-, ompB2-, ompA-, OMPCD- und Omp106-Promotoren bevorzugt, und in H. influenzae ist es bevorzugt, die P2-, P4-, P1-, P5- und P6-Promotoren einzubauen.
  • Unter Verwendung der bevorzugten homologen Doppelüberkreuzungs-Rekombinationstechnologie, zur Einführung des Promotors in die 1000 bp-stromaufwärts-Region, können die Promotoren überall von 30–970 bp stromaufwärts vom Startcodon des Gens plaziert werden, um aufreguliert zu werden. Obwohl herkömmlicherweise gelehrt wird, daß die Promotorregion relativ nahe zum offenen Leserahmen sein sollte, um eine optimale Expression des Gens zu erhalten, haben die gegenwärtigen Erfinder überraschenderweise gefunden, daß die Plazierung des Promotors weiter vom Startcodon entfernt, in einem erheblichen Anstieg der Expressionsstärke resultiert. Daher ist es bevorzugt, wenn der Promotor 200–600 bp vom Startcodon des Gens, bevorzugter 300–500 bp und am meisten bevorzugt, annäherungsweise 400 bp vom Start-ATG eingebaut wird.
  • Verfahren c) – Konditionell erzeugte Bläschenbestandteile
  • Die Expression einiger Gene, die für bestimmte Bläschenbestandteile codieren, wird vorsichtig reguliert. Die Herstellung der Bestandteile wird konditionell moduliert und hängt von verschiedenen metabolischen und/oder Umgebungssignalen ab. Solche Signale schließen beispielsweise ein: Eisen-Begrenzung, Modulation des Redoxpotentials, pH- und Temperaturveränderungen, Ernährungsänderungen. Einige Beispiele der Bläschenbestandteile, von denen man weiß, daß sie konditionell hergestellt werden, schließen eisenregulierte äußere Membranproteine von Neisseria und Moraxella (z.B. TbpB, LbpB), und Substrat-induzierbare äußere Membranpurine ein. Die vorliegende Erfindung umfaßt die Verwendung genetischer Verfahren, die vorstehend beschrieben wurden (Verfahren a) oder b)), um die Expression solcher Moleküle bestandsfest zu machen. Auf diese Weise kann der Einfluß eines Umgebungssignals auf die Expression des/der intresserierenden Gens(e) überwunden werden, indem die mit dem Gen korrespondierende Kontrollregion modifiziert/ersetzt wird, so daß sie konstitutiv aktiv wird (z.B. Entfernung eines Teils [vorzugsweise alles] der repressiven Kontrollsequenz – z.B. die Operatorregion), oder durch Einbau eines konstitutiven starken Promotors. Für Eisen-regulierte Gene kann der fur-Operator entfernt werden. Alternativ kann das Verfahren i) verwendet werden, um eine zusätzliche Kopie des interessierenden Gens/Operons in dem Chromosom zu liefern, das künstlich unter Kontrolle eines konstitutiven Promotors gestellt wurde.
  • Verfahren d) und e) – Entgiftung des LPS
  • Die Toxizität von Bläschen-Impfstoffen stellt eine der größten Probleme bei der Verwendung von Bläschen in Impfstoffen dar. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren genetischer Entgiftung des in Bläschen gegenwärtigen LPS. Lipid A ist der primäre Bestandteil von LPS, der für die Zellaktivierung verantwortlich ist. Viele an diesem Abbauweg beteiligte Mutationen in Genen, führen zu wesentlichen Phänotypen. Jedoch führen die Mutationen in den Genen, die für die endständigen Modifikationsschritte verantwortlich sind, zu temperaturempfindlichen (htrB) oder zulässigen (msbB) Phänotypen. Mutationen, die in einer abgeschwächten (oder keinen) Expression dieser Gene resultieren, ergeben eine veränderte toxische Aktivität des Lipid A. In der Tat ist das nicht-lauroylierte (htrB-Mutante) oder nicht-myristolyierte (msbB-Mutante) Lipid A weniger toxisch, als das Wildtyp-Lipid A. Mutationen in dem die Lipid A-4'-Kinase, codierenden Gen (lpxK), vermindern auch die toxische Aktivität des Lipid A.
  • Verfahren d) umfaßt daher entweder die Deletion eines Teils (oder vorzugsweise alle) eines oder mehrerer der obigen offenen Leserahmen oder Promotoren. Alternativ könnten die Promotoren durch schwächere Promotoren ersetzt werden. Vorzugsweise werden die oben beschriebenen homologen Rekombinationstechniken verwendet, um das Verfahren auszuführen.
  • Die Sequenzen der htrB- und msbB-Gene von Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae werden zusätzlich für diesen Zweck zur Verfügung gestellt.
  • Eine toxische LPS-Aktivität könnte auch durch Einführung von Mutationen in Gene/Orte, die an der Polymyxin-B-Resistenz beteiligt sind, verändert werden (eine solche Resistenz wurde mit der Zugabe von Aminoarabinose zum 4'-Phosphat des Lipid A korreliert). Diese Gene/Orte könnten sein: pmrE, das eine UDP-Glucosedehydrogenase codiert, oder eine Region von antimikrobiellen Peptid-resistenten Genen, die mit vielen Enterobakteriziden gleich ist, könnte an der Synthese der Arabinose und dem Transfer beteiligt sein. Dieses Gen pmrF, das in dieser Region gegenwärtig ist, codiert eine Dolicol-Phosphat-Manosyl-Transferase (Gunn, J. S., Kheng, B. L., Krueger, J., Kim, K., Guo, L., Hackett, M., Miller, S. I. 1988, Mol. Microbiol. 27: 1171–1182).
  • Mutationen im regulatorischen System von PhoP-PhoQ, das ein regulatorisches Zweikomponentensystem zur Phospho-Übertragung ist (z.B. konstitutiver PhoP-Phenotyp, PhoPC), oder niedrige Mg++-Umgebungs- oder Kulturbedingungen (die das regulatorische PhoP-PhoQ-System aktivieren), führen zur Addition von Aminoarabinose an dem das 4'-Phosphat und 2-Hydroxymyristat ersetzende Myristat (Hydroxylierung des Myristats). Dieses modifizierte Lipid A stellt eine verminderte Eignung zur Stimulation der E-Selektin-Expression durch menschliche Endothelialzellen und TNF-α-Sekretion aus humanen Monozyten dar.
  • Verfahren e) ist an der Aufregulation dieser Gene beteiligt, indem die oben beschriebene Strategie verwendet wird (starke Promotoren werden eingebaut, vorzugsweise unter Verwendung homologer Rekombinatiostechniken, um das Verfahren auszuführen).
  • Alternativ könnte, eher als eine dieser Mutationen durchzuführen, ein Polymyxin B-resistenter Stamm als Stamm zur Herstellung eines Vakzins verwendet werden (in Verbindung mit einem oder mehreren anderen erfindungsgemäßen Verfahren), wie auch Bläschen solcher Stämme eine verminderte LPS-Toxizität aufweisen (z.B. wie für Meningococcus gezeigt – van der Ley, P., Hamstra, H. J., Kramer, M., Steeghs, L., Petrov, A. und Poolman, J. T. 1994, In: Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conference. The Guildhall, Winchester, England).
  • Als eine weitere Alternative (und auch als weiterer Aspekt der Erfindung) stellen die Erfinder ein Verfahren zur Entgiftung eines Gram-negativen bakteriellen Stammes zur Verfügung, der den Schritt der Kultivierung des Stammes in einem Wachstumsmedium umfaßt, das 0,1 mg bis 100 g Aminoarabinose per Mediumliter enthält.
  • Als eine noch weitere Alternative können synthetische Peptide, die die Bindungsaktivität von Polymyxin B (unten beschrieben) nachahmen, zur Bläschen-Zubereitung hinzugegeben werden, um die toxische LPS-Aktivität zu vermindern (Rustici, A., Velucchi, M., Faggioni, R., Sironi, M., Ghezzi, P., Quataert, S., Green, B. und Porro, M. 1993, Science 259: 361–365; Velucchi, M., Rustici, A., Meazza, C., Villa, P., Ghezzi, P. und Porro, M. 1997, J. Endotox. Res. 4:).
  • Verfahren f) – Verankerung homologer oder heterologer Proteine an die äußeren Membranbläschen, wobei die Toxizität von LPS reduziert wird
  • Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung umfaßt die Verwendung genetischer Sequenzen, die Polymyxin B-Peptide (oder Analoga davon) codieren, als Mittel um Fusionsproteine in die äußere Membran gezielt einzubauen. Polymyxin B ist ein cyclisches Peptid, das aus nicht-tRNA codierenden Aminosäuren zusammengesetzt ist (aus Gram-positiven actinomycetalen Organismen hergestellt), das sehr stark an den Lipid A-Teil von LPS, das in der äußeren Membran gegenwärtig ist, bindet. Diese Bindung vermindert die intrinsische Toxizität von LPS (Endotoxin-Aktivität). Peptide, die die Struktur des Polymyxin B nachahmen und aus kanonischen Aminosäuren (tRNA codiert) zusammengesetzt sind, wurden entwickelt und binden auch Lipid A mit einer starken Affinität. Diese Peptide wurden zur Entgiftung von LPS verwendet. Eines dieser Peptide, als SAEP-2 (N-Terminus-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys-C-Terminus) bekannt, zeigte, daß es in dieser Hinsicht sehr vielversprechend ist (Molecular Mapping and detoxifying of the Lipid A binding site by synthetic peptides (1993). Rustici, A., Velucchi, M., Faggioni, R., Sironi, M., Ghezzi, P., Quataert, S., Green, B. und M. Porro. Science 259, 361–365).
  • Das vorliegende erfindungsgemäße Verfahren f) stellt eine Verbesserung dieser Anwendung dar. Es wurde gefunden, daß die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für das SEAP-2-Peptid codieren (oder Derivate davon), das an ein interessierendes Gen genetisch fusioniert war (das zum Beispiel ein T-Zellen-Antigen oder ein protektives Antigen codiert, das gewöhnlicherweise als ein Toxin, oder ein cytosolisches oder periplasmischen Protein ausgeschieden wurde) ein Mittel ist, um das entsprechende rekombinante Protein in die äußere Membran eines bevorzugten bakteriellen Wirtes zielgerichtet einzubauen (währenddessen zur selben Zeit die Toxizität des LPS reduziert wird).
  • Dieses System ist für labile Proteine geeignet, die nicht direkt an der Außenseite des Bläschens exponiert sein würden. Das Bläschen würde demzufolge als ein Liefervehikel handeln, das das Protein dem Immunsystem aussetzen würde, sobald die Bläschen durch die T-Zellen verschlungen sein würden. Alternativ sollte die genetische Fusion auch ein Signalpeptid oder eine Transmembran-Domäne umfassen, nämlich eine solche, daß das rekombinante Protein die äußere Membran zur Exposition an das Immunsystem des Wirtes durchqueren kann.
  • Diese Strategie des zielgerichteten Einbaus könnte von besonderem Interesse in dem Fall von Genen sein, die Proteine codieren, die normalerweise nicht zielgerichtet in die äußere Membran eingebaut werden. Diese Methodologie erlaubt auch die Isolierung rekombinanter Bläschen, die im interessierenden Protein angereichert sind. Vorzugsweise erlaubt solch ein auf ein Peptid gerichtetes Signal die Anreicherung der äußeren Membranbläschen in einem oder mehreren interessierenden Proteinen, die in der vorgegebenen subzellulären Lokalisierung natürlicherweise nicht gefunden wurden. Eine nicht-erschöpfende Liste über Bakterien, die als ein Empfängerwirt für eine solche Herstellung rekombinanter Bläschen verwendet werden kann, schließt ein: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxelle catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis und Chlamydia pneumoniae.
  • Obwohl bevorzugterweise das Gen für das Konstrukt in das Chromosom des Bakteriums [unter Verwendung von Verfahren i)] gentechnisch eingebracht wird, ist eine bevorzugte alternative Ausführungsform für SAEP-2-markierte rekombinante Proteine, daß sie unabhängig hergestellt werden und in einer späteren Stufe der Bläschen-Zubereitung beigefügt werden.
  • Eine weitere Ausführungsform ist die Verwendung solcher Konstrukte in einem Verfahren der Proteinreinigung. Das System könnte allgemein als Teil eines Expressionssystems zur Herstellung rekombinanter Proteine verwendet werden. Die SAEP-2-Peptidmarkierung kann zur Affninitätsreinigung des Proteins, an das es angefügt ist, verwendet werden, indem eine Kolonne, die immobilisierte Lipid A-Moleküle enthält, verwendet wird.
  • Verfahren h) – kreuzreaktive Polysaccharide
  • Die Isolierung bakterieller äußere Membranbläschen von verkapselten Gram-negativen Bakterien resultiert oft in der Co-Reinigung eines Kapsel-Polysaccharids. In einigen Fällen kann sich dieses "kontaminierte" Material als nützlich erweisen, da ein Polysaccharid die Immunantwort, die von anderen Bläschenbestandteilen übertragen wird, verstärken kann. Jedoch kann in anderen Fällen die Gegenwart kontaminierenden Polysaccharid-Materials in bakteriellen Bläschen-Zubereitungen sich für eine Verwendung der Bläschen in einem Impfstoff als nachteilig erweisen. Beispielsweise wurde wenigstens im Fall von N. meningitidis gezeigt, daß das Serogruppen B-Kapselpolysaccharid keine schützende Immunität verleiht und für eine Induzierung einer nachteiligen Autoimmunantwort beim Menschen empfänglich ist. Konsequenterweise ist das erfindungsgemäße Verfahren h), die gentechnische Manipulation eines bakteriellen Stammes zur Bläschenherstellung, ein solches, das frei von einem Kapselpolysaccharid ist. Die Bläschen werden dann zur Verwendung am Menschen geeignet sein. Ein besonders bevorzugtes Beispiel einer solchen Bläschen-Zubereitung ist eine aus der N. meningitidis-Serogruppe B, die von einem Kapselpolysaccharid frei ist.
  • Dies kann durch Verwendung modifizierter Bläschenproduktionsstämme erreicht werden, in denen die zur Kapselbiosynthese und/oder -export erforderlichen Gene geschwächt wurden. Eine Inaktivierung des Gens, das für eine Biosynthese eines Kapselpolysaccharids oder einen Export codiert, kann durch Mutieren erreicht werden (Punktmutation, Deletion oder Einbau), entweder der Kontrollregion, der codierenden Region oder beider (vorzugs weise unter Verwendung der oben beschriebenen homologen Rekombinationstechniken). Darüber hinaus kann eine Inaktivierung der Biosynthese der Kapselgene auch durch eine Antisense-Überexpression oder eine Transposon-Mutagenese erreicht werden. Ein bevorzugtes Verfahren ist die Deletion einiger oder aller Neisseria meningitidis-cps-Gene, die für eine Polysaccharid-Biosynthese und den Export erforderlich. Zu diesem Zweck kann das Substitutionsplasmid pMF121 (beschrieben bei Frosh et al. 1990, Mol. Microbiol. 4: 1215–1218) benutzt werden, um eine Mutation beizusteuern, die das cpsCAD (+galE)-Genkluster deletiert. Alternativ könnte das siaD-Gen deletiert oder in der Expression abreguliert werden (das menigococcale siaD-Gen codiert die alpha-2,3-Sialyltransferase, ein Enzym, das zur Kapselpolysaccharid- und LOS-Synthese gefordert wird). Solche Mutationen können auch wirtsähnliche Strukturen am Saccharid-Teil von LPS des Bakteriums entfernen.
  • Verfahren i) – Lieferung eines oder mehrerer weiterer Kopien eines Gens und/oder Operons in einem Wirts-Chromosom, oder Lieferung eines heterologen Gens und/oder Operons in einem Wirts-Chromosom
  • Eine wirksame Strategie, die Zusammensetzung einer Bläschen-Zubereitung zu modulieren, ist, eine oder mehrere Kopien eines DNA-Segments, das eine Expressionskassette enthält, in das Genom eines Gram-negativen Bakteriums zu verbringen. Eine nicht-erschöpfende Liste bevorzugter bakterieller Spezies, die als ein Empfänger für eine solche Kassette benutzt werden könnte, schließt ein: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Hoaemophilus influenzae, Pseudonomas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae. Das/die in der Expressionskassette enthaltene(n) Gen(e) kann/können homolog (oder endogen) (d.h. es existiert auf natüriche Weise in dem Genom des manipulierten Bakteriums) oder heterolog sein (d.h. es kommt nicht natürlich in dem Genom des manipulierten Bakteriums vor). Die wiedereingeführte Expressionskassette kann aus unmodifizierten "natürlichen" Promotor/Gen/Operon-Sequenzen oder Gen-manipulierten Expressionskassetten bestehen, in denen die Promotorregion und/oder die Codierungsregion oder beide verändert wurden. Eine nicht-erschöpfende Liste bevorzugter Promotoren, die zur Expression benutzt werden könnte, schließt die folgenden Promotoren ein: porA, porB, lbpB, tbpB, p110, lst, hpuAB aus N. meningitidis oder N. gonorroheae, die Promotoren p2, p5, p4, ompF, p1, ompH, p6, hin47 aus H. influenzae, die Promotoren ompH, ompG, ompCD, ompF, ompB1, ompB2, ompA von M. catarrhalis, die Promotoren λpl, lac, tac, araB von Escherichia coli oder Promotoren, die spezifisch von Bakteriophagen-RNA-Polymerase, wie der E. coli-Bakteriophage T7 erkannt werden. Eine nicht-erschöpfende Liste bevorzugter Gene, die in einem solchen System exprimiert werden könnten, schließt ein: Neisseria NspA, Omp85, PilQ, TbpA/B-Komplex, Hsf, PldA, HasR; Chlamydia MOMP, HMWP; Moraxella OMP106, HasR, PilQ, OMP85, PldA; Bordetella pertussis FHA, PRN, PT.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Expressionskassette geliefert und in das bakterielle Chromosom mittels einer homologen und/oder ortsspezifischen Rekombination eingebaut. Einbauvektoren, die zur Lieferung solcher Gene und/oder Operons verwendet wurden, können konditionell replikative oder suizide Plasmide, Bakteriophagen, Transposone oder lineare DNA-Fragmente sein, die durch Restriktionshydrolyse oder PCR-Amplifikation erhalten wurden. Der Einbau erfolgt vorzugsweise zielgerichtet in chromosomale Regionen, die für ein Wachstum in vitro entbehrlich sind. Eine nicht-erschöpfende Liste bevorzugter Orte, die benutzt werden können, um zielgerichtet einen DNA-Einbau vorzunehmen, schließt ein: porA-, porB-, opa-, opc-, rmp-, omp26-, lecA-, cps-, lgtB-Gene von Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, die P1-, P5-, hmwl/2-, IgA-Protease, fimE-Gene von NTHi; die lecA1-, lecA2-, omp106-, uspA1-, uspA2-Gene von Moraxella catarrhalis. Alternativ kann die zur Modulation der Expression der Bläschenkomponente(n) verwendete Expressionskassette in ein Bakterium der Wahl mittels episomaler Vektoren, wie ringförmige/lineare replikative Plasmide, Cosmide, Phasmide, lysogene Bakteriophagen oder künstliche bakterielle Chromosomen eingebracht werden. Eine Selektion des Rekombinationsereignisses kann mittels selektierbarer genetischer Marker, wie Genen, die Resistenz gegenüber Antibiotika verleihen (z.B. Kanamycin, Erythromycin, Chloramphenicol oder Gentamycin), Genen, die gegenüber Schwermetallen und/oder toxischen Verbindungen Resistenz verleihen oder Genen, die auxotrophe Mutationen ergänzen (z.B. pur, leu, met, aro), selektiert werden.
  • Heterologe Gene – Expression fremder Proteine in äußere Membranbläschen
  • Bakterielle äußere Membranbläschen stellen ein sehr attraktives System dar, rekombinante Proteine für Impfstoffe, therapeutische und/oder diagnostische Anwendungen herzustellen, zu isolieren und bereitzustellen. Ein weiterer Aspekt diesr Erfindung besteht hinsichtlich der Expression, der Herstellung und dem zielgerichteten Einbau fremder, heterologer Proteine in die äußere Membran und die Verwendung der Bakterien, um rekombinante Bläschen zu erzeugen.
  • Ein bevorzugtes Verfahren dies zu erreichen, besteht in einem Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt: Einführung eines heterologen Gens, das gegebenenfalls durch eine starke Promotorsequenz kontrolliert wird, in das Chromosom eines Gram-negativen Stammes durch homologe Rekombination. Bläschen können von den resultierenden modifizierten Stämmen erzeugt werden.
  • Eine nicht vollständige Liste von Bakterien, die als Empfängerwirt zur Herstellung rekombinanter Bläschen verwendet werden können, schließt ein: Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae. Das in einem derartigen System exprimierte Gen kann von viraler, bakterieller, fungaler, parasitärer oder höherer eukaryotischer Herkunft sein.
  • Eine bevorzugte Anwendung der Erfindung schließt ein Verfahren zur Expression von Moraxella-, Haemophilus- und/oder Pseudomonas-äußere-Membranproteinen (integrale, polytopische und/oder Lipoproteinen) in rekombinanten Neisseria meningitidis-Bläschen ein. Die vorzüglichen Einbauorte sind oben genannt, und die vorzugsweise eingeführten Gene sind die, die einen Schutz gegen das Bakterium zur Verfügung stellen, aus dem sie isoliert wurden. Bevorzugte protektive Gene für jedes Bakterium sind unten beschrieben.
  • Weitere bevorzugte Anwendungen sind: Bläschen, die aus einem modifizierten Haemophilus influenzae-Stamm hergestellt wurden, wo das heterologe Gen ein protektives OMP aus Moraxella catarrhalis ist; und Bläschen, die aus einem modifizierten Moraxella catarrhalis-Stamm hergestellt wurden, wo das heterologe Gen ein protektives OMP aus Haemophilus influenzae ist (bevorzugte Orte für einen Geneinbau sind oben genannt, und bevorzugte protektive Antigene sind unten beschrieben).
  • Eine besonders bevorzugte Anwendung dieses Aspektes ist das Gebiet der Prophylaxe oder der Behandlung sexuell übertragener Krankheiten (STDs). Für Praktiker ist es oft schwierig, zu bestimmen, ob der Hauptgrund einer STD wegen einer Gonococcen- oder Chlamydia trachomatis-Infektion vorliegt. Diese beiden Organismen sind die Hauptgründe für eine Eileiterentzündung – eine Krankheit, die zur Sterilität im Wirt führen kann. Demzufolge würde es nützlich sein, wenn gegen eine STD vakziniert werden könnte, oder mit einem kombiniertem Vakzin, das gegen die Krankheit, die durch beide Organismen verursacht wird, wirksam ist, behandelt werden könnte. Das größere äußere Membran-Protein (MOMP) von C. trachomatis hatte gezeigt, das Ziel protektiver Antikörper zu sein. Jedoch ist die strukturelle Unversehrtheit dieses integralen Membran-Proteins zur Einführung solcher Antikörper wichtig. Zusätzlich sind die durch diese Antikörper erkannten Epitope veränderlich und defnieren mehr als 10 Serotypen. Der vorher beschriebene Gesichtspunkt dieser Erfindung erlaubt die passende Faltung eines oder mehrerer Membran-Proteine innerhalb einer äußere Membranbläschenzubereitung. Die gentechnische Manipulation eines gonococcalen Stammes, der mehrfache C. trachomatis-MOMP-Serotypen in der äußeren Membran exprimiert, und die Herstellung von Bläschen davon, erzeugt eine Einzellösung der mehrfachen Probleme korrekt gefalteter Membranproteine, die Präsentation hinreichender MOMP-Serotypen zur Protektion gegenüber einem weiten Spektrum von Serotypen und die gleichzeitige Prophylaxe/Behandlung einer gonococcalen Infektion (und folglich das fehlende Erfordernis der Praktiker, von Anfang an zu entscheiden, welcher Organismus insbesondere klinische Symptome verursacht – gegen beide Organismen kann gleichzeitig geimpft werden, was daher die Behandlung des STD in einem sehr frühen Stadium erlaubt). Die für einen Geneinbau in das gonococcale Chromosom bevorzugten Orte sind oben angegeben. Andere bevorzugte, protektive C. trachomatis-Gene, die inkorporiert werden könnten, sind HMWP, PmpG und diejenigen OMPs, die in WO 99/28475 offenbart sind.
  • Zielgerichteter Einbau heterologer Protein in äußere Membran-Bläschen
  • Die Expression einiger heterologer Protein in bakterielle Bläschen kann die Zugabe äußerer Membran-Zielsignale erfordern. Das bevorzugte Verfahren, dieses Problem zu lösen, besteht darin, eine genetische Fusion zwischen einem heterologen Gen und einem Gen, das für ein gegenwärtiges OMP codiert, als einen spezifischen Zugang zum zielgerichteten Einbau rekombinanter Proteine in Bläschen, zu schaffen. Ganz besonders bevorzugt wird das heterologe Gen, an die Signalpeptidsequenzen eines solchen OMP fusioniert ist.
  • Neisserien-Bläschen-Zubereitungen
  • Entsprechend der Erfindung ist das PorA-Gen durch das Verfahren a) in Meningococcus (insbesondere N. meningitidis B) abreguliert.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene (chiffrierende protektive Antigene) sind zur Aufregulation mittels der Verfahren b) und/oder i) bevorzugt, wenn sie an einem Neisserien-Stamm ausgeführt werden, einschließlich Gonococcus und Meningococcus (insbesondere N. meningitidis B): NspA (WO 96/29412), Hsf-artig (WO 99/31132), Hap (PCT/EP 99/02766), PorA, PorB, OMP85 (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP 99/03603), PldA (PCT/EP 99/06718), FrpB (WO 96/31618), TbpA ( US 5,912,336 ), TbpB, FrpA/FrpC (WO 92/01460), LbpA/LbpB (PCT/EP 98/05117), FhaB (WO 98/02547), HasR (PCT/EP 99/05989), lipo02 (PCT/EP 99/08315), Tbp2 (WO 99/57280), MltA (WO 99/57280) und ctrA (PCT/EP 00/00135). Sie sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingesetzt werden können.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene sind zur Abregulation durch das Verfahren d) bevorzugt: htrB, msbB und lpxK.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene sind zur Aufregulation durch das Verfahren e) bevorzugt: pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.
  • Bevorzugte unterdrückende Kontrollsequenzen für das Verfahren c) sind: die fur-Operatorregion (besonders für eines oder beider TbpB- oder LbpB-Gene); und die DtxR-Operatorregion.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene sind zur Abregulation durch das Verfahren h) bevorzugt: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC und ctrD.
  • Pseudomonas aeruginosa-Bläschen-Zubereitungen
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene (protektive Antigene chiffrierend) sind zur Aufregulation durch die Verfahren b) und/oder i) bevorzugt: PcrV, OprF, OprI. Sie sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden können.
  • Moraxella catarrhalis-Bläschen-Zubereitungen
  • Gemäß der Erfindung sind eines oder mehrere der folgenden Gene durch das Verfahren a) abreguliert: CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA und LbpB.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene (protektive Antigene chiffrierend) sind zur Aufregulation durch die Verfahren b) und/oder i) bevorzugt: OMP106 (WO 97/41731 & WO 96/34960), HasR (PCT/EP 99/03824), PilQ (PCT/EP 99/03823), OMP85 (PCT/EP 00/01468), lipo06 ( GB 9917977.2 ), lipo10 ( GB 9918208.1 ), lipo11 ( GB 9918302.2 ), lipo18 ( GB 9918038.2 ), P6 (PCT/EP 99/03038), ompCD, CopB (Helminen M. E. et al. (1993) Infect. Immun. 61: 2003–2010), D15 (PCT/EP 99/03822), OmplA1 (PCT/EP 99/06781), Hly3 (PCT/EP 99/03257), LbpA und LbpB (WO 98/55606), TbpA und TbpB (WO 97/13785 & WO 97/32980), OmpE, UspA1 und UspA2 (WO 93/03761) und Omp21. Sie sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden können.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene sind zur Abregulation durch das Verfahren d) bevorzugt: htrB, msbB und lpxK.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene sind zur Aufregulation durch das Verfahren e) bevorzugt: pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.
  • Haemophilus influenzae-Bläschen-Zubereitungen
  • Entsprechend der Erfindung sind eines oder mehrere der folgenden Gene durch das Verfahren a) abreguliert: P2, P5, Hif, IgA1-Protease, HgpA HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA und TbpB.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene (protektive Antigene chiffrierend) sind zur Aufregulation durch die Verfahren b) und/oder i) bevorzugt: D15 (WO 94/12641), P6 ( EP 281673 ), TbpA, TbpB, P2, P5 (WO 94/26304), OMP26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 und Hif (sämtliche Gene in diesem Operon sollten auf reguliert sein, um das Pilusprotein aufzuregulieren). Sie sind auch als Gene bevorzugt, die heterolog in andere Gram-negative Bakterien eingeführt werden können.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene sind zur Abregulation durch das Verfahren d) bevorzugt: htrB, msbB und lpxK.
  • Eines oder mehrere der folgenden Gene sind zur Aufregulation durch das Verfahren e) bevorzugt: pmrA, pmrB, pmrE und pmrF.
  • Impfstofformulierungen
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Formulierung erfindungsgemäßer Bläschen-Zubereitungen in einem Impfstoff, der auch einen pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff umfassen kann.
  • Die Herstellung von Bläschen-Zubereitungen aus einem der vorgenannten modifizierten Stämme kann durch jede der Methoden erreicht werden, die einem Fachmann gut bekannt sind. Vorzugsweise werden die Verfahren, die in EP 301992 , US 5,597,572 , EP 11243 oder US 4,271,147 offenbart sind, verwendet. Am meisten bevorzugt wird das in Beispiel 8 beschriebene Verfahren verwendet.
  • Eine Impfstoffzubereitung wird allgemein in Vaccine-Design beschrieben ("The subunit und adjuvant approach" (Hrsg. Powell M. F. & Newman M. J.) (1995), Plenum Press New York).
  • Die Bläschen-Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können in der erfindungsgemäßen Impfstofformulierung durch Hilfsstoffe unterstützt sein. Geeignete Hilfsstoffe schließen Aluminiumsalz, wie Aluminiumhydroxidgel (Alum) oder Aluminiumphosphat ein, können aber auch ein Salz des Calciums (insbesondere Calciumcarbonat), Eisen oder Zink sein, oder können eine unlösliche Suspension eines acylierten Tyrosins oder eines acylierten Zuckers, kationisch oder anionisch derivatisierter Polysaccharide oder Polyphosphazene sein.
  • Verwendbare, geeignete Th1-Hilfsstoffsysteme schließen ein: Monophosphoryllipid A, insbesondere 3-de-O-acyliertes monophosphoryliertes Lipid A, und eine Kombination aus einem monophosphorylierten Lipid A, vorzugsweise ein 3-de-O-acyliertes monophosphoryliertes Lipid A (3D-MPL) zusammen mit einem Aluminiumsalz. Ein verstärktes System umfaßt die Kombination eines monophosphorylierten Lipids A und eines Saponin-Derivates, insbesondere die Kombination aus QS21 und 3D-MPL, wie in WO 94/00153 offenbart, oder eine weniger reaktionsfähige Zusammensetzung, wo das QS21 mit Cholesterol, wie in WO 96/33739 offenbart, gestoppt wird. Eine besonders starke Hilfsstofformulierung, an der QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beteiligt sind, wird in WO 95/17210 beschrieben und ist eine bevorzugte Formulierung.
  • Der Impfstoff kann ein Saponin umfassen, bevorzugter QS21. Er kann auch eine Öl-in-Wasser-Emulsion und Tocopherol umfassen. Nicht-methyliertes CpG enthaltende Oligonukleotide (WO 96/02555), sind ebenfalls bevorzugte Auslöser einer TH1-Antwort und sind zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
  • Die Impfstoffzubereitung der vorliegenden Erfindung kann zum Schutz oder zur Behandlung eines Säugers, der für eine Infektion empfänglich ist, verwendet werden, indem dieser Impfstoff über eine systemische oder mukosale Route verabreicht wird. Diese Verabreichungen können eine Injektion über intramuskuläre, intraperitoneale, intradermale oder subkutane Routen oder eine mukosale Verabreichung an die oralen/Nahrungsaufnahme-, Atem-, Urogenitaltrakte einschließen. Daher ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Immunisierung eines menschlichen Wirtes gegen eine Krankheit, die durch eine Infektion Gram-negativer Bakterien verursacht wird, wobei das Verfahren die Verabreichung einer immunprotektiven Dosis der erfindungsgemäßen Bläschen-Zubereitung an den Wirt umfaßt.
  • Die Menge eines Antigens in jeder Impfstoffdosis ist als eine Menge ausgewählt, die eine immunprotektive Antwort ohne signifikante nachteilige Nebenwirkungen in typischen Impflingen zu induziert. Eine solche Menge wird in Abhängigkeit davon, welches spezifische Immunogen verwendet wird, und wie es präsentiert wird, abhängen. Im allgemeinen ist zu erwarten, daß jede Dosis 1–100 μg eines Proteinantigens umfassen wird, vorzugsweise 5–50 μg und am typischsten im Bereich von 5–25 μg.
  • Eine optimale Menge für ein besonderes Vakzin kann durch Standardstudien herausgefunden werden, wobei eine Beobachtung geeigneter Immunantworten in Subjekten beteiligt ist. Nach einer anfänglichen Impfung können die Subjekte eine oder mehrere Verstärkungsimmunisierungen erhalten, die adäquat zeitlich auseinanderliegen.
  • Schatten- oder abgetötete Ganzzellen-Impfstoffe
  • Die Erfinder können sich vorstellen, daß die oben genannten Verbesserungen an den Bläschen-Zubereitungen und den Impfstoffen leicht auf Schatten- oder abgetötete Ganzzellen-Zubereitungen und Impfstoffe ausgeweitet werden können (mit identischen Vorteilen). Die erfindungsgemäßen modifizierten Gram-negativen Stämme, aus denen die Bläschen-Zubereitungen hergestellt sind, können auch verwendet werden, um Schatten- oder abgetötete Ganzzell-Zubereitungen herzustellen. Verfahren zur Herstellung von Schatten-Zubereitungen aus Gram-negativen Stämmen (leere Zellen mit intakten Zellhüllen) sind auf diesem Gebiet gut bekannt (siehe z.B. WO 92/01791). Verfahren zur Abtötung ganzer Zellen, um inaktivierte Zellzubereitungen zur Verwendung in Vakzinen herzustellen, sind ebenso wohlbekannt. Die Begriffe "Bläschen-Zubereitungen" und "Bläschen-Impfstoffe", als auch die über das gesamte Dokument beschriebenen Verfahren, sind demzufolge für die Zwecke dieser Erfindung auch jeweils auf die Begriffe "Schatten-Zubereitung" und "Schatten-Impfstoff" und "abgetötete Ganzzellen-Zubereitungen" und "abgetöteter Ganzzellen-Impfstoff" anwendbar.
  • Kombinationen der Verfahren a)–i)
  • Es ist anerkannt, daß eines oder mehrere der oben genannten Verfahren verwendet werden können, um einen modifizierten Stamm herzustellen, aus dem verbesserte erfindungsgemäße Bläschen-Zubereitungen erzeugt werden können. Vorzugsweise wird ein solches Verfahren benutzt, bevorzugter werden zwei oder mehrere (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 oder 9) Verfahren verwendet, um den Bläschenimpfstoff zu erzeugen. Da jedes zusätzliche Verfahren in der Herstellung des Bläschen-Impfstoffes verwendet wird, arbeitet jede Verbesserung in Verbindung mit anderen verwendeten Verfahren, um eine optimierte gentechnisch manipulierte Bläschen-Zubereitung zu erzeugen.
  • Eine bevorzugte meningococcale (insbesondere N. meningitidis B) Bläschen-Zubereitung umfaßt die Verwendung der Verfahren a), b), d) und/oder e) und h). Solche Bläschen-Zubereitungen sind sicher (keine Strukturen sind den Wirtsstrukturen ähnlich), nicht-toxisch, und so strukturiert, daß die Wirts-Immunantwort auf hohe Gehalte protektiver Antigene (und vorzugsweise konservierter) fokussiert sein wird. All die oben genannten Elemente arbeiten zusammen, um einen optimierten Bläschen-Impfstoff zur Verfügung zu stellen.
  • Bevorzugte Bläschen-Zubereitungen umfassen die Verwendung der Verfahren a), b) und d) und/oder e) in ähnlicher Weise für M. catarrhalis und für nicht-typisierbare H. influenzae.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist daher ein immunprotektives und nicht-toxisches Gram-negatives Bläschen-, Schatten-, oder abgetötete Ganzzellvakzin, das zur Verwendung in der Kinderheilkunde geeignet ist.
  • Mit Kinderheilkunde ist die Verwendung bei Kindern mit einem Alter von weniger als 4 Jahren gemeint.
  • Mit immunprotektiv ist gemeint, daß wenigstens 40% (und vorzugsweise 50, 60, 70, 80, 90 und 100%) der Kinder das Serum gegenüber einer Reihe heterologer Stämme umwandeln, die aus größeren klonalen Gruppen bekannt sind, (4-fache Steigerung der antibakteriellen Aktivität [die Verdünnung von Antiseren, bei welcher 50% der Bakterien sterben – siehe z.B. PCT/EP 98/05117]). Für Meningococcus B sollten diese Stämme einen unterschiedlichen PorA-Typ vom Bläschen-Produktionsstamm haben, und sollten vorzugsweise 2, 3, 4 oder, am meisten bevorzugt, alle 5 Stämme H44/76, M97/252078, BZ10, NGP165 und CU385 sein. Für eine untypische H. influenzae sollten die Stämme vorzugsweise 2, 3, 4 oder am meisten bevorzugt sollten alle 5 Stämme 3224A. 3219C, 3241A, 640645 und A840177 sein. Für M. catarrhalis sollten die Stämme vorzugsweise 2, 3, 4 sein, oder, am meisten bevorzugt, sollten alle 5 Stämme ATCC 43617, 14, 358, 216 und 2926 sein.
  • Mit nicht-toxisch ist gemeint, daß eine signifikante Abnahme der Endotoxin-Aktivität (2- bis 4-fach, vorzugsweise 10-fach), gemessen mit den gutbekannten LAL- und Pyrogenizitäts-Assays, vorhanden ist.
  • Impfstoff-Kombinationen
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung sind Impfstoff-Kombinationen, die die erfindungsgemäßen Bläschen-Zubereitungen mit anderen Antigenen umfassen, die vorteilhafter Weise gegen bestimmte Krankheitszustände verwendet werden. Es wurde gefunden, daß die Bläschen vorzugsweise zur Formulierung mit anderen Antigenen geeignet sind, da sie vorteilhafter Weise einen Hilfseffekt bei den Antigenen, mit denen sie gemischt sind, aufweisen.
  • In einer bevorzugten Kombination sind die erfindungsgemäßen Meningococcus B-Bläschen-Zubereitungen mit 1, 2, 3 oder vorzugsweise mit sämtlichen 4 der folgenden meningococcalen Kapselpolysaccharide, die flach sein können oder an einen Proteinträger konjugiert sein können, formuliert: A, C, Y oder W. Solch ein Impfstoff kann vorteilhafter Weise als ein globaler Menigococcus-Impfstoff verwendet werden. Eher als die Verwendung der erfindungsgemäßen Meningococcus B-Bläschen-Zubereitungen ist auch vorgesehen, daß die Formulierung alternativ Wildtyp-Meningococcus B-Bläschen-Zubereitungen aus zwei oder mehr Stämmen (vorzugsweise mehrere) enthalten könnte, die mehrer Subtypen/Serotypen betreffen (z.B. aus P1.15, P1.7,16, P1.4 und P.1.2 ausgewählt).
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen Meningococcus B-Bläschen-Zubereitungen [oder das vorgenannte Gemisch aus 2 oder mehr Wildtyp-Menigococcus B-Bläschen-Zubereitungen], die vorzugsweise mit 1, 2, 3 oder sämtlichen 4 der ebenen oder konjugierten meningococcalen Kapselpolysaccharide A, C, Y oder W formuliert sind, mit einem konjugierten J. influenzae b-Kapselpolysaccharid formuliert und einem oder mehreren der planen oder konjugierten pneumococcalen Polysaccharide. Gegebenenfalls kann der Impfstoff auch ein oder mehrere Protein-Antigene umfassen, die einen Wirt gegen eine Streptococcus pneumoniae-Infektion schützen können. Ein derartiger Wirkstoff kann vorteilhafter Weise als ein globales Meningitis-Vakzin verwendet werden.
  • Die pneumococcalen Polysaccharid-Antigene werden vorzugsweise aus den Serotypen 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F und 33F (am meisten bevorzugt von den Serotypen 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F und 23F) ausgewählt.
  • Bevorzugte pneumococcale Protein-Antigene sind die pneumococcalen Proteine, die an der äußeren Oberfläche von Pneumococcus exponiert sind (die in der Lage sind, durch ein Wirts-Immunsystem von wenigstens einem Teil des Lebenszyklus des Pneumococcus erkannt zu werden) oder es sind Proteine, die vom Pneumococcus ausgeschieden oder freigesetzt werden. Am meisten bevorzugt ist das Protein ein Toxin, ein Adhäsin, ein 2-Komponenten-Signal-Transducer oder ein Lipoprotein des Streptococcus pneumoniae oder Fragmente davon. Besonders bevorzugte Proteine schließen ohne Beschränkung ein: Pneumolysin (vorzugsweise durch chemische Behandlung oder Mutation entgiftet) [Michell et al. Nucleic Acids Res., 11. Juli 1990; 18(13): 4010 "Comparsion of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.", Mitchell et al., Biochim. Biophys. Acta, 23. Jan. 1989; 1007(1): 67–72 "Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties.", WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton et al.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA und Transmembran-Deletionsvarianten davon ( US 5804193 – Briles et al.); PspC und Transmembran-Deletionsvarianten davon (WO 97/09994 – Briles et al.); PsaA und Transmembran-Deletionsvarianten davon (Berry & Paton, Infect Immun. Dez. 1996; 64(12): 5255–62 "Sequenzheterogenität eines PsaA, ein putatives 37-Kilodalton Adhesin, das für die Giftigkeit von Streptococcus pneumoniae essentiell ist"); pneumococcale Cholin-Bindungsproteine und Transmembran-Deletionsvarianten davon; CbpA- und Transmembran-Deletionsvarianten davon (WO 97/41151; WO 99/51266); Glyceroaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (Infect. Immun. 1996, 64: 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato et al., FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164: 207–14); M-artiges Protein, SB Patentanmeldung Nr. EP 0837130 ; und Adhesin 18627, SB-Patentanmeldung Nr. EP 0834568 . Weitere bevorzugte pneumococcale Protein-Antigene sind diejenigen, die in WO 98/18931, offenbart sind, insbesondere diejenigen, die in WO 98/18930 und PCT/US 99/30390 selektiert sind.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die Moraxella catarrhalis-Bläschen-Zubereitungen der Erfindung mit einem oder mehreren der planen oder konjugierten pneumococcalen Kapsel-Polysaccharide und einem oder mehreren Antigenen formuliert, die einen Wirt gegen eine untypische H. influenzae-Infektion schützen können. Gegebenenfalls kann der Impfstoff auch ein oder mehrere Protein-Antigene umfassen, die einen Wirt vor einer Streptococcus pneumonie-Infektion schützen können. Der Impfstoff kann gegebenenfalls auch ein oder mehrere Antigene umfassen, die einen Wirt vor RSV schützen können und/oder ein oder mehrere Antigene, die einen Wirt vor einem Influenza-Virus schützen können. Ein derartiger Impfstoff kann vorteilhafter Weise als ein globales Otitis media-Vakzin (Impfstoff gegen Mittelohrentzündung) verwendet werden.
  • Bevorzugte nicht-typische H. influenzae-Protein-Antigene schließen ein: ein Fimbrin-Protein ( US 5766608 ) und Fusionen, die Peptide davon umfassen, (z.B. LB1-Fusion) ( US 5843464 – Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, Protein D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap, und D15.
  • Bevorzugte Influenza-Virusantigene schließen ein: einen ganzen, lebenden oder inaktivierten Virus, einen Split-Influenza-virus, der in Eiern oder MDCK-Zellen gewachsen ist, oder Vero-Zellen oder ganze flu-Virosomen (wie von R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915–920 beschrieben) oder gereinigte oder rekombinante Proteine davon, wie HA-, NP-, NA- oder M-Proteine oder Kombinationen davon.
  • Bevorzugte RSV-Antigene (syncytialer Atemwegsvirus) schließen das F-Glycoprotein, das G-Glycoprotein, das HN-Protein oder Derivate davon, ein.
  • In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die erfindungsgemäßen untypischen H, influenzae-Bläschen-Zubereitungen mit einem oder mehreren planen oder konjugierten pneumococcalen Polysacchariden und einem oder mehreren Antigenen formuliert, die einen Wirt vor einer M catarrhalis-Infektion schützen können. Gegebenenfalls kann der Impfstoff auch eines oder mehrere Protein-Antigene umfassen, die einen Wirt vor einer Streptococcus pneumoniae-Infektion schützen können. Der Impfstoff kann gegebenenfalls auch eines oder mehrere Antigene umfassen, die einen Wirt vor RSV schützen können und/oder ein oder mehrere Antigene umfassen, die einen Wirt vor einem Influenza-Virus schützen können. Ein derartiger Impfstoff kann vorteilhafterweise als ein globaler Otitis media-Impfstoff verwendet werden.
  • Nukleotidsequenzen der Erfindung
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft das zur Verfügung stellen neuer Nukleotidsequenzen, die in den Verfahren der Erfindung verwendet werden können. Spezifische Stromaufwärtsregionen von verschiedenen Genen von verschiedenen Stämmen werden zur Verfügung gestellt, die zum Beispiel in den Verfahren a), b), d) und h) verwendet werden können. Zusätzlich werden codierende Regionen zur Durchführung des Verfahrens d) zur Verfügung gestellt.
  • Allgemeines Verfahren zur Analyse der nicht-codierenden flankierenden Region eines bakteriellen Gens und dessen Ausnutzung zur modulierten Expression des Gens in Bläschen
  • Die nicht-codierenden flankierenden Regionen eines spezifischen Gens enthalten regulatorische Elemente, die bei der Expression des Gens wichtig sind. Diese Regulation findet sowohl auf der transkriptionalen und translationalen Ebene statt. Die Sequenz dieser Regionen, entweder stromaufwärts oder stromabwärts des offenen Leserahmens des Gens, kann durch DNA-Sequenzierung erhalten werden. Diese Sequenzinformation erlaubt die Bestimmung potentieller regulatorischer Motive, wie unterschiedliche Promotorelemente, Stoppsequenzen, induzierbare Sequenzelemente, Repressoren, Elemente, die für eine Phasenvariation verantwortlich sind, die Shine-Dalgarno-Sequenz, Regionen mit einer potentiellen Sekundärstruktur, die an der Regulation beteiligt sind, als auch andere Typen regulatorischer Motive oder Sequenzen.
  • Diese Sequenzinformation erlaubt die Modulierung der natürlichen Expression des fraglichen Gens. Die Aufregulation der Genexpression kann durch Veränderung des Promotors, der Shine-Dalgano-Sequenz, potentieller Repressor- oder Operatorelemente oder eines jeden anderen beteiligten Elementes durchgeführt werden. Wahrscheinlich kann die Abregulation der Expression durch ähnliche Modifikationstypen erreicht werden. Alterntiv kann durch Veränderung der Phasenvariationssequenzen die Expression des Gens unter Phasenvariationskontrolle gebracht werden oder von dieser Regulation entkoppelt werden. In einem anderen Ansatz kann die Expression des Gens unter die Kontrolle eines oder mehrerer induzierbarer Elemente gebracht werden, die eine regulierte Expression erlauben. Ohne Beschränkung umfassen Beispiele einer solchen Regulation: Induktion durch Temperaturverschiebung, Zugabe von Induktorsubstraten, wie ausgewählte Carbohydrate oder deren Derivate, Spurenelemente, Vitamine, Co-Faktoren, Metallionen usw.
  • Solche vorgenannten Modifikationen können durch verschiedene unterschiedliche Mittel eingeführt werden. Die an der Gen-Expression beteiligte Sequenzmodifikation kann in vivo durch zufallsbedingte Mutagenese, gefolgt von der Selektion des gewünschten Phänotyps, erfolgen. Ein anderer Ansatz besteht darin, die interessierende Region zu isolieren und durch zufallsbedingte Mutagenese zu modifizieren, oder in einer ortsgerichteten Substitution, oder in einer Insertions- oder Deletions-Mutagenese. Durch homologe Rekombination kann anschließend die modifizierte Region in das bakterielle Genom wieder eingeführt werden, und der Effekt der Genexpression kann erfaßt werden. In einem anderen Ansatz kann die Kenntnis über die Sequenz dieser interessierenden Region verwendet werden, um alle oder einen Teil der natürlichen regulatorischen Sequenzen zu ersetzen oder zu entfernen. In diesem Fall wird die angepeilte regulatorische Region isoliert und so modifiziert, daß sie die regulatorischen Elemente eines anderen Gens, eine Kombination regulatorischer Elemente unterschiedlicher Gene, eine synthetische regulatorische Region oder irgendeine andere regulatorische Region enthält, oder sie wird so modifiziert, um ausgewählte Teile der Wildtyp-regulatorischen Sequenzen zu deletieren. Diese modifizierten Sequenzen können anschließend durch homologe Rekombination in das Genom in das Bakterium erneut eingeführt werden.
  • Beispielsweise kann im Verfahren b) die Expression eines Gens durch Austausch seines Promotors mit einem stärkeren Promotor moduliert werden (durch Isolierung der Stromaufwärts-Sequenz des Gens, in vitro-Modifikation dieser Sequenz, und erneute Einführung in das Genom durch homologe Rekombination). Eine aufregulierte Expression kann sowohl in dem Bakterium als in den äußere Membranvesikeln, die von dem Bakterium verbreitet werden (oder erzeugt werden), erhalten werden.
  • In anderen bevorzugten Beispielen, können die beschriebenen Ansätze verwendet werden, um bakterielle rekombinante Stämme mit verbesserten Eigenschaften für Impfstoffanwendungen, wie oben beschrieben, zu generieren. Diese können ohne Beschränkung sein: Abgeschwächte Stämme, Stämme mit gesteigerter Expression ausgewählter Antigene, Stämme mit Null-Mutationen der Gene, die mit der Immunantwort interferieren (oder abgeschwächte Expression) und Stämme mit modulierter Expression immundominanter Proteine.
  • SEQ ID NO: 2–23, 25, 27–38 sind alle Neisseria betreffende Stromaufwärtssequenzen (stromaufwärts vom Startcodon verschiedener bevorzugter Gene), wobei jede Sequenz angenähert 1000 bp umfaßt. SEQ ID NO: 39–62 sind alle M. catarrhalis-Stromaufwärtssequenzen (stromaufwärts vom Startcodon verschiedener bevorzugter Gene), wobei jedes näherungsweise 1000 bp umfaßt. SEQ ID NO: 63–75 sind alle H. influenzae-Stromaufwärtssequenzen (stromaufwärts vom Startcodon verschiedener bevorzugter Gene), wobei jedes näherungsweise 1000 bp umfaßt. Diese können alle in genetischen Verfahren (insbesondere homologe Rekombination) zur Aufregulation oder Abregulation der offenen Leserahmen, mit denen sie verbunden sind (wie zuvor beschrieben), verwendet werden. SEQ ID NO: 76–81 sind die für HtrB- und MsbB-Gene codierenden Regionen von Neisseria, M. catarrhalis und Haemophilus influenzae. Diese können in genetischen Verfahren (insbesondere homologe Rekombination), zur Abregulation (insbesondere zur Deletion), eines Teils (vorzugsweise alle) dieser Gene verwendet werden [Verfahren d)].
  • Ein anderer Aspekt der Erfindung umfaßt daher eine isolierte Polynukleotidsequenz, die unter höchst stringenten Bedingungen zu einem wenigstens 30 Nukleotidteil der Nukleotide in SEQ ID NO: 2–23, 25, 27–81 oder einem Komplementärstrang davon, hybridisiert. Vorzugsweise sollte die isolierte Sequenz lang genug sein, um eine homologe Rekombination mit der chromosomalen Sequenz, soweit sie Teil eines geeigneten Vektor ist – nämlich wenigstens 30 Nukleotide (vorzugsweise wenigstens 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 oder 500 Nukleotide) durchzuführen. Bevorzugter sollte das isolierte Polynukleotid wenigstens 30 Nukleotide (bevorzugt wenigstens 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 oder 500 Nukleotide) von SEQ ID NO: 2–23, 25, 27–81 oder einen Komplementärstrang davon umfassen.
  • Die hierin benutzen höchst stringenten Hybridisationsbedingungen schließen zum Beispiel ein: 6 × SSC, 5 × Denhardt, 0,5% SDS und 100 μg/ml fragmentierter und denaturierter Lachssperm-DNA, die über Nacht bei 65°C hybridisiert wurde und in 2 × SSC, 0,1% SDS einmal bei Raumtemperatur für ungefähr 10 Minuten gewaschen wurde und anschließend einmal bei 65°C für etwa 15 Minuten, gefolgt von wenigstens einem Waschgang in 0,2 × SCC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für wenigstens 3 bis 5 Minuten gewaschen wurde.
  • Ein weiterer Aspekt ist die Verwendung der erfindungsgemäßen isolierten Polynukleotidsequenzen, um ein gentechnisches Manipulationsereignis (wie einen Transposoneinbau, oder eine ortsspezifische Mutation oder Deletion, vorzugsweise jedoch ein homologes Rekombinationsereignis) innerhalb 1000 bp stromaufwärts eines bakteriellen Gram-negativen chromosomalen Gens auszuführen, um entweder die Expression des Gens zu erhöhen oder zu erniedrigen. Vorzugsweise ist der Stamm, in dem das Rekombinationsereignis stattfindet, derselbe Stamm wie der Stamm, von dem die Stromaufwärtssequenzen der Erfindung erhalten wurden. Jedoch sind die Meningococcus A-, B-, C-, Y- und W- und Gonococcus-Genome hinreichend ähnlich, so daß eine Stromaufwärtssequenz von jedem dieser Stämme geeignet sein kann, Vektoren zu entwerfen, die derartige Ereignisse in anderen Stämmen ausführen. Dies ist und kann auch der Fall sein für Haemophilus influenzae und untypischer Haemophilus influenzae.
  • Beispiele
  • Die unten genannten Beispiele wurden unter Verwendung von Standardtechniken, die den Fachleuten auf diesem Gebiet wohlbekannt sind und zu ihrer Routine gehören, ausgeführt, es sei denn, es ist im Detail anders beschrieben. Die Beispiele sind erläuternd, ohne jedoch die Erfindung zu beschränken.
  • Beispiel 1: Konstruktion eines Neisseria meningitidis-Serogruppe-B-Stammes, dem Kapselpolysaccharide fehlen
  • Das Plasmid pMF121 (Frosch et al., 1990) wurde verwendet, um einen Neisseria meningitidis-B-Stamm, dem das Kapselpolysaccharid fehlt, künstlich zu schaffen. Dieses Plasmid enthält die benachbarten Regionen des Genortes, der für den biosynthetischen Stoffwechselweg des Gruppe B-Polysaccharids (B PS) und das Erythromycin-Resistenzgen codiert. Eine Deletion von B PS führte im Ergebnis zu einem Verlust der Expression des Gruppe B-Kapselpolysaccharids als auch zu einem Verlust in der aktiven Kopie des galE, was zur Synthese des LPS ohne Galactose führte.
  • Stammtransformation:
  • Ein Neisseria meningitidis B H44/76-Stamm (B:15:P1.7, 16;Los 3,7,9) wurde zur Transformation ausgewählt. Nach einer CO2-Inkubation über Nacht auf einer MH-Platte (ohne Erythromycin), wurden die Zellen in flüssigem MH, das 10 mM MgCl2 enthielt (2 ml wurden pro MH-Platte verwendet), gesammelt und bis zu einem OD von 0,1 (550 nm) verdünnt. Zu dieser Lösung von 2 ml wurden 4 μl des Plasmids pMF121 Vorratslösung (0,5 μg/ml) über eine Inkubationsperiode von 6 Stunden bei 37°C (unter Schütteln) hinzugegeben. Eine Kontrollgruppe mit derselben Menge der Neisseria Meningitidis-B-bakterien, jedoch ohne Zugabe des Plasmids, war bereitgestellt. Nach der Inkubationsperiode wurden 100 μl der Kultur, unverdünnt und zu 1/10-, 1/100- und 1/1000-Verdünnungen auf die MH-Platten, die 5, 10, 20, 40 oder 80 μg Erythromycin/ml enthielten, gegeben, bevor eine Inkubation über 48 Stunden bei 37°C erfolgte.
  • Kolonieblotten:
  • Nach der Platteninkubation waren 20 Kolonien gewachsen und aus den 10- und 20 μg-Erythromycin/ml HM-Platten ausgewählt, während in der Kontrollgruppe ohne Plasmidtransformation kein Koloniewachstum festzustellen war. Der H44/76-Wildtyp-Stamm war nicht in der Lage, in den ausgewählten Erythromycin-Platten (10 bis 80 μg Erythromacin/ml) zu wachsen. Am folgenden Tag wurden alle sichtbaren Kolonien auf neue MH-Platten ohne Erythromycin plaziert, um sie wachsen zu lassen. Danach wurden sie auf Nitrocellulose-Platten (Kolonie-Blotten) zu vorhandenem B-Polysaccharid übertragen. Kurz, die Kolonien wurden auf eine Nitrocellulose-Platte geplottet und direkt in PBS-0,05% Tween 20 vor der Zellinaktivierung über eine Stunde bei 56°C in PBS-0,05% Tween 20 (Verdünnungspuffer) gespült. Danach wurde die Membran für eine Stunde im Verdünnungspuffer bei Raumtemperatur (RT) überschichtet. Danach wurden die Platten wieder für 3 × 5 Minuten in dem Verdünnungspuffer gewaschen, bevor Inkubutation in dem Verdünnungspuffer mit dem zu 1/3000 verdünnten Anti-B-PS-735 Mab (Boehringer) über 2 Stunden bei RT erfolgte. Nach einem neuen Waschschritt (3-mal 5 Minuten) wurde der monoklonale Antikörper mit einem biotinylierten Antimaus-Ig von Amersham (RPN 1001) detektiert, der 500-mal in dem Verdünnungspuffer (eine Stunde bei RT) verdünnt wurde, bevor der nächste Waschschritt (wie oben beschrieben) erfolgte. Danach wurden die Platten über eine Stunde bei RT mit einer Lösung eines Streptavidin-Peroxidase-Komplexes, der im Verdünnungspuffer 1/1000 verdünnt war, inkubiert. Nach mit derselben Methode erfolgten letzten drei Waschschritten, wurden die Nitrocelluloseplatten für 15 min in der Dunkelheit inkubiert, indem eine Detektionslösung (30 mg 4-Chlor-1-naphthol-Lösung in 10 ml Methanol plus 40 ml PBS und 30 mcl H2O2 37%, von Merck) verwendet wurde. Die Reaktion wurde mit einem Waschschritt mittels destillierten Wassers gestoppt.
  • Ganzzellen-ELISAs:
  • Es wurden auch Ganzzellen-ELISAs unter Verwendung der zwei transformierten Kolonien ("D" und "R") und des Wildtyp-Stammes (H44/76) als umhüllte Bakterien (20 μg Protein/ml) und einer Reihe unterschiedlicher monoklonaler Antikörper, die zur Charakterisierung der Neisseria meningitidis-Stämme verwendet wurden, durchgeführt. Die folgenden Mabs wurden getestet: Anti-B PS (735 von Dr. Frosch) und die anderen Mabs von NIBSC: Anti-B PS (Ref. 95/750), Anti-P1,7 (A-PorA, Ref. 4025), Anti-P1.16 (A-PorA, Ref. 95/720), Anti-Los 3,7,9 (A-LPS, Ref. 4047), Anti-Los 8 (A-LPS, Ref. 4048) und Anti-P1,2 (A-PorA Ref. 95/696).
  • Über Nacht (ON) wurden bei 37°C bei ca. 20 μg/ml in PBS Mikrotiterplatten (Maxisorp, Nunc) mit 100 μl der rekombinanten meningococcalen B-Zell-Lösung beschichtet. Danach wurden die Platten dreimal mit 300 μl aus 150 mM NaCl – 0,05% Tween 20 gewaschen und mit 100 μl PBS-0,3% Casein überschichtet und bei Raumtemperatur unter Schütteln über 30 min inkubiert. Vor der Inkubation mit Antikörpern wurden die Platten unter Anwendung desselben Verfahrens wieder gewaschen. Die monoklonalen Antikörper (100 μl) wurden in unterschiedlichen Verdünnungen (wie in 2 gezeigt) in PBS-0,3% Casein, 0,05% Tween 20 verwendet und vor Inkubation bei Raumtemperatur für 30 min unter Schütteln auf die Mikroplatten verbracht, bevor der nächste identische Waschschritt erfolgte. 100 μl des Anti-Maus Ig (vom Kaninchen, Dakopatts E0413), der mit Biotin verbunden war und zu 1/2000 in PBS-0,3% Casein – 0,05% Tween 20 verdünnt war, wurden in die Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben, um die gebundenen monoklonalen Antikörper zu detektieren. Nach dem Waschschritt (wie vorher) wurden die Platten mit einer Streptavidin-Peroxidase-Komplex-Lösung (100 μl von Amersham RPN 1051) zu 1/4000 in derselben Arbeitslösung verdünnt, bei Raumtemperatur für 30 min unter Schüttelbedingungen inkubiert. Nach dieser Inkubation und dem letzten Waschschritt wurden die Platten mit 100 μl der Chromogen-Lösung (4 mg Orthophenylendiamin (OPD) in 10 ml 0,1 M Citratpuffer, pH 4,5 mit 5 μl H2O2) über 15 min in der Dunkelheit inkubiert. Anschließend wurden die Platten mittels eines Spektrophotometers bei 490/620 nm ausgelesen.
  • Ergebnisse:
  • 1 zeigt, daß von den 20 isolierten Kolonien, die in der Lage waren, auf dem mit Erythromycin ausgewählten Medium zu wachsen, lediglich zwei Kolonien ("D" und "R") die Abwesenheit von B Polysaccharid zeigten. Unter den anderen waren 16 auf B PS klar positiv und gegenüber Erythromycin noch resistent. Dies zeigte, daß sie das Plasmid in ihr Genom einbauten, jedoch in falscher Orientierung, und das B PS und das LPS Gen (keine doppelte Überkreuzungsstelle) intakt halten. Positive und negative Kontrollen wurden auch auf den Platten getestet, und zeigten, daß der H44/76 Wildtyp-NmB-Stamm deutlich positiv für das B-Polysaccharid war, während die Meningococcus-A (A1)- und Meningococcus C (C1l)-Stämme deutlich negativ mit diesem Anti-B PS 735 Mab waren. Diese Ergebnisse zeigen, daß ca. 10% der ausgewählten Kolonien das Plasmid in ihr Genom unter Ausführung einer doppelten Überkreuzungsstelle korrekt integrierten, während die anderen Stämme/Kolonien, die nach einer einfachen Überkreuzungsstelle erhalten wurden, die B PS- und LPS-Gene intakt hielten und exprimierten.
  • Bei Anwendung eines Ganzellen-ELISAs, zeigten die Ergebnisse deutlich (2 und die Tabelle unten), daß die zwei "D"- und "R"-Transformanten (von den D- und R-Kolonien abgeleitet) nicht durch die Anti-B PS-Mabs (735 und 95/750) erkannt werden können, auch nicht durch die Anti-Los 3,7,9 und die Anti-Los 8 Mabs. Wenn jedoch spezifische Anti-PorA Mabs verwendet werden, erfolgt eine deutliche Reaktion mit den Anti-P1.7- und Anti-P1.16 Mabs an den Zellen, wie auch im Wildtyp-Stamm beobachtet wurde. Keine Reaktion wurde mit einem nicht-spezifischen Anti-PorA Mab (Anti-P1.2 mab) beobachtet. Diese Ergebnisse bestätigen, daß das PorA-Protein und spezifisch die P1.7 und P1.16 Epitope doch nach der Transformation vorhanden sind, während das B-Polysaccharid und die Los 3.7,9 und Los 8-Epitope (LPS) nicht vorhanden waren.
  • Tabelle: Spezifitäten der getesteten monoklonalen Antikörper
    Figure 00470001
  • Beispiel 2: Konstruktion vielseitiger Gen-Lieferungsvektoren (pCMK-Serien), gerichtet auf den Einbau in den porA-Genort von Neisseria meningitidis
  • Es wurde ein Plasmid, das die homologe Rekombination und den stabilen Einbau fremder DNA in den porA-Genort von Neisseria meningitidis zuläßt, künstlich geschaffen. Dieser Lieferungsvektor (Gene, Operone und/oder Expressionskassetten) ist zur künstlichen Schaffung von Neisseria meningitidis-Stämmen nützlich, die rekombinante, verbesserte Bläschen produzieren. Typischerweise enthält ein derartiger Vektor wenigstens: (1) ein Plasmidgerüst, das in E. coli, aber nicht in Neisseria meningitidis (ein Suizidplasmid) replikativ ist, (2) wenigstens eine, vorzugsweise jedoch zwei Homologieregionen zum zielgerichteten Einbau in einen chromosomalen Ort, wie porA, (3) effiziente Transkriptions-Signale (Promotor, Regulationsregion und Stoppsequenz) und Translations-Signale (optimierte Ribosom-Bindungsstelle und Startcodon), die in Neisseria meningitidis funktionell sind, (4) eine Mehrfachklonierungsstelle und (5) selektierbare(s) Gen(e), das/die Erhaltung des Plasmids in E. coli und die Auswahl der eingebauten Gegenstände in Neisseria meningitidis zuläßt. Zusätzliche Elemente schließen beispielsweise ein: Transportsequenzen, um den Eintritt einer fremden DNA in Neisseria meningitidis zu erleichtern, und Marker, gegen die selektiert werden kann, wie sacB, rpsL, gltS, um die Häufigkeit des Vorkommens von doppelten Überkreuzungsstellen zu verstärken.
  • Eine schematische Zeichnung des in diesem Beispiel künstlich hergestellten Vektors und des bestimmten pCMK wird in 3 wiedergegeben. Deren entsprechende, vollständige Nukleotidsequenz wird in SEQ ID NO: 1 gezeigt. pCMK leitet sich von einem pSL1180-Gerüst (PharmaciaBiotech, Schweden) ab, einem Plasmid mit hoher Kopiezahl, das in E. coli verdoppelbar ist, das das bla-Gen (und dadurch gegenüber Ampicillin Resistenz verleiht) beherbergt. Hierzu enthält pCMK zusätzlich zwei porA benachbarte Regionen (porA5' und porA3', die eine Transkriptions-Stoppsequenz enthalten), die zur homologen Rekombination notwendig sind, einen selektierbaren Marker, der Resistenz gegenüber Kanamycin verleiht, zwei Transportsequenzen, einen porA/lacO-Hybrididpromotor, der in dem E. coli-Wirt unterdrückt ist, der lacIq exprimiert, jedoch transkriptionell in Neisseria meningitidis aktiv ist und eine Mehrfachklonierungsstelle (5 Orte sind vorhanden: NdeI, KpnI, NheI, PinA1 und SphI), die zur Einfügung fremder DNA in pCMK erforderlich ist.
  • pCMK wurde, wie folgt, künstlich hergestellt. Die porA5' und porA3' rekombinationsfähigen Regionen, der porA/lacO-Promotor wurden mit PCR amplifiziert, indem die in der unten aufgeführten Tabelle aufgelisteten Oligonukleotide verwendet wurden, in pTOPO kloniert und sequenziert. Diese DNA-Fragmente wurden nacheinander aus pTOPO ausgeschnitten und in pSL1180 erneut kloniert. Die Kanamycin-Resistenzkassette wurde aus pUC4K (PharmaciaBiotech, Schweden) ausgeschnitten und wurde zwischen die porA5'-benachbarte Region und die porA/lacO-Promotorregion eingeführt.
  • Tabelle: In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide
    Figure 00490001
  • Tabelle 2 (Fortsetzung)
    Figure 00500001
  • Beispiel 3: Konstruktion eines Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stammes, dem sowohl Kapsel-Polysaccharide als auch das überwiegend immundominante Antigen PorA fehlt
  • Einstellen des antigenen Gehaltes der Bläschen der äußeren Membran kann vorteilhaft sein, deren Sicherheit und Wirksamkeit bei Verwendung in Impfstoffen oder bei diagnostischer oder therapeutischer Anwendung zu verbessern. Bestandteile, wie die Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Kapsel-Polysaccharide sollten entfernt werden, um das Risiko der Induzierung einer Autoimmunität (siehe Beispiel 1) auszuschleißen. In gleicher Weise ist es nützlich, die Immundominanz der Mehrheit der Antigene der äußeren Membran, wie PorA, zu unterdrücken, die stammspezifische bakterizide Antikörper induziert, jedoch keinen Beitrag für einen kreuzvernetzten Schutz leistet. Um einen solchen Zugang zu verdeutlichen, verwendeten wir den pCMK(+)-Vektor, um einen Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stamm künstlich zu schaffen, dem sowohl Kapselpolysaccharide als auch das immundominante äußere Membran-Proteinantigen PorA fehlte. Zu diesem Zweck wurde eine Deletion des porA-Gens in den H44/76 cps-Stamm mittele homologer Rekombination, wie in Beispiel 1 beschrieben, eingeführt.
  • Der H44/76cps-Stamm wurde fachkundig hergestellt und mit 2 μg einer superspiralisierten pCMK(+)-Plasmid-DNA, wie vorher beschrieben, transformiert. Gleiche Fraktionen des Transformationsgemisches (100 μl) wurden auf Mueller-Hinton-Platten, die mit Kanamycin (200 μg/ml) ergänzt waren, aufgestrichen und über 24 bis 48 Stunden bei 37°C inkubiert. Kanamycin-resistente Kolonien wurden selektiert, auf MH-Kn wieder ausgestrichen und für zusätzliche 24 Stunden bei 37°C vermehrt. In diesem Stadium wurde die Hälfte der Bakterienkultur verwendet, um Glycein-Vorräte (15% Vol/Vol) herzustellen und wurde bei –70°C gefroren gehalten. Eine andere Fraktion (auf 108 Bakterien geschätzt) wurde erneut in 15 μl destillierten Wassers suspendiert, 10 Minuten gekocht und als Matrize für ein PCR-Screening verwendet. Zwei innere porA-Primer, PPA1 und PPA2 genannt, wurden synthetisiert und zur Durchführung einer PCR-Amplifizierung gekochter bakterieller Lysate unter den Bedingungen, die vom Hersteller beschrieben wurden (HiFi-DNA-Polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH) verwendet. Die thermische Ringbildung wurde, wie folgt, ausgeführt: 25-mal (94°C, 1 min, 52°C, 1 min, 72°C, 3 min) und 1-mal (72°C, 10 min, 4°C bis zur Ausbeute). Da eine Doppelüberkreuzungsstelle zwischen der pCMK-DNA und dem chromosomalen porA-Genort die Region zerstört, die für die #1- und #2-Doppelstrangbildung gefordert wird, wurden Klone, denen ein 1170 bp PCR-Amplifizierungsfragment fehlt, als porA-Deletionsmutanten selektiert. Diese PCR-Ergebnisse bestätigten ferner durch Parallelanalysen die Gegenwart von PorA in den korrespondierenden bakteriellen Proteinextrakten. Zu diesem Zweck wurde ein anderes Aliquot von Bakterien (auf 5,108 Bakterien geschützt) in 50 μl PAGE-SDS-Puffer (Sensibilisator 5%, Glycerin 30%, beta-Mercaptoethanol 15%, Bromphenolblau 0,3 mg/ml, Tris-HCl 250 mM, pH 6,8) erneut suspendiert, gekocht (100°C), eingefroren (–20°C)/dreimal gekocht (100°C) und durch PAGE-SDS-Elektrophorese auf einen 12,5%-Gel separiert. Die Gele wurden dann mit Coomassie-Brilliantblau R250 eingefärbt oder auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und mit einem Anti-PorA-monoklonalen-Antikörper, wie bei Maniatis et al. beschrieben, untersucht. Wie in 4 wiedergegeben, bestätigen sowohl Coomassie als auch das Einfärben des Immunoblots, daß porA PCR-Negativklone keine detektierbaren Gehalte von PorA erzeugen. Dieses Ergebnis bestätigt, daß der pCMK-Vektor funktionell ist und nachfolgend zur zielgerichteten DNA-Einfügung in das porA-Gen verwendet werden kann, wobei die begleitende Erzeugung des äußeren Membranprotein-Antigens PorA aufgehoben ist.
  • Beispiel 4: Aufregulation der Herstellung des äußeren Membranproteins NspA in Bläschen, von einem rekombinanten Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stamm abgeleitet, dem die funktionellen porA und cps-Gene fehlen
  • Die Anreicherung von Bläschenvesikeln mit protektiven Antigenen ist vorteilhaft zur Verbesserung der Wirksamkeit und des Schutzes der Vakzine, die auf einem Protein der äußeren Membran basieren. In diesem Zusammenhang wurden rekombinante Neisseria meningitidis-Stämme, denen die funktionellen cps- und porA-Gene fehlten, genmanipuliert, so daß der Expressionsgehalt des NspA-Proteins der äußeren Membran aufreguliert wurde. Für diesen Zweck wurde das Gen, das für NspA codiert, mit PCR amplifiziert, indem die N01-voll-NdeI- und -NdeI-3'-Oligonukleotid-Primer (siehe Tabelle in Beispiel 2) verwendet wurden. Die zur PCR-Amplifizierung gewählten Bedingungen sind die beim Hersteller (HiFi-DNA-Polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH) beschriebenen. Die erfolgte thermische Ringbildung wurde, wie folgt, durchgeführt: 25-mal (94°C, 1 min, 52°C, 1 min, 72°C, 3 min) und 1-mal (72°C, 10 min, 4°C bis zur Ausbeute). Die korrespondierende amplifizierte DNA-Sequenz (Amplicon) wurde mit NdeI digeriert und in den NdeI-Restriktionsort des pCMK(+)-Liefer-Vektors eingefügt. Die Orientierung der Einfügung wurde geprüft und rekombinante Plasmide, synthetisches pCMK(+)-NspA, wurden in großem Maßstab unter Verwendung des QIAGEN-Maxiprep-Kits gereinigt und 2 μg dieses Materials wurde verwendet, um einen Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlten (der Stamm wurde in Beispiel 1 beschrieben) zu übertragen. Der Einbau, der aus einer doppelten Überkreuzungsstelle zwischen dem pCMK(+)-NspA-Vektor und dem chromosomalen porA-Genort resultierte, wurde unter Verwendung einer Kombination aus PCR- und Wester-Blot-Screening-Verfahren, die in Beispiel 3 dargelegt sind, selektiert.
  • Bakterien (die mit etwa 5,108 Bakterien korrespondieren) wurden erneut in 50 μl eines PAGE-SDS-Puffers suspendiert, eingefroren (–20°C)/dreimal gekocht (100°C) und wurden anschließend durch eine PAGE-SDS-Elektrophorese auf einem 12,5%-Gel abgetrennt. Die Gele wurden anschließend mit Coomassie-Brilliantblau R250 gefärbt oder auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und mit einem Anti-NspA-polyklonalen Serum untersucht. Sowohl Coomassie (keine Daten) und das Immunoblot-Färben (siehe 4) bestätigten, daß porA-PCR Negativ-Klone keine nachweisbaren Gehalte von PorA erzeugen. Die Expression von NspA wurde in bakteriellen Ganzzellenlysaten (WCBL) oder Bläschen-Zubereitungen der äußeren Membran, die von NmB [cps–, porA–] oder NmB [cps–, porA–, Nspa+] abgeleitet sind, untersucht. Obwohl kein Unterschied beim Coomassie-Färben beobachtbar war, wurde beim Immunoblotting mit dem Anti-NspA-polyklonalen Serum ein 3- bis 5-facher Anstieg in der Expression von NspA (im Hinblick auf den endogenoen NspA-Gehalt) sowohl bei WCBL als auch bei den Bläschen-Zubereitungen der äußeren Membran (siehe 5) detektiert. Dieses Ergebnis bestätigt, daß der pCMK(+)-NspA-Vektor funktionell ist und erfolgreich zur Abregulation der Expression von Proteinen der äußeren Membran, wie NspA, verwendet werden kann, wobei die begleitende Erzeugung des äußeren Membran-Proteinantigens PorA aufgehoben ist.
  • Beispiel 5: Aufregulation des D15/Omp85-Protein-Antigens der äußeren Membran in Bläschen, abgeleitet von einem rekombinanten Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, jedoch PorA exprimiert
  • Bestimmte geographisch isolierte Humanpopulationen (wie Cuba) sind durch eine begrenzte Zahl von Neisseria meningitidis-Isolaten infiziert, die weitgehend einen oder einige Protein-Serotypen der äußeren Membran betreffen. Da PorA ein Hauptprotein-Antigen der äußeren Membran ist, das protektive und stammspezifische bakterizide Antikörper induziert, ist es danach möglich, Impfstoffschutz zu verleihen, indem eine begrenzte Zahl von porA-Serothypen in einem Impfstoff verwendet werden. In einem derartigen Zusammenhang kann die Gegenwart von PorA in Bläschen der äußeren Membran vorteilhaft sein, und die Impfstoff-Wirksamkeit solcher verbesserten rekombinanter Bläschen stärken. Jedoch können solche PorA-enthaltende Vakzine noch weiter verbessert werden, indem der Gehalt anderer kreuzreaktiver OMPs, wie omp85/D15, erhöht wird.
  • Im folgenden Beispiel wurde der pCMK(+)-Vektor verwendet, um die Expression des Omp85/D15 äußeren Membran-Proteinantigens in einem Stamm aufzuregulieren, dem funktionelle cps-Gene fehlen, jedoch porA exprimiert. Zu diesem Zweck wurde das Gen, das für Omp85/D15 codiert, PCR-amplifiziert, indem D15-NdeI- und D15-NotI-Oligonukleotidprimer verwendet wurden. Die zur PCR-Amplifikation verwendeten Bedingungen waren die, die vom Lieferanten (HiFi-DNA-Polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH) beschrieben wurden. Thermische Ringbildung wurde, wie folgt, durchgeführt: 25-mal (94°C, 1 min, 52°C, 1 min, 72°C, 3 min) und 1-mal (72°C, 10 min, 4°C bis zur Ausbeute). Die korrespondierende amplifizierte DNA-Sequenz (Amplicon) wurde in pTOPO-Klonierungsvektor, entsprechend den Spezifikationen des Herstellers, eingefügt, und eine bestätigende Sequenzanalyse wurde durchgeführt. Dieses Omp85/D15-DNA-Fragment wurde aus pTOPO durch Restriktionshydrolyse unter Verwendung von NdeI/NsiI ausgeschnitten und nachfolgend in den korrespondierenden Restriktionsorten des pCMK(+)-Liefervektors kloniert. Rekombinante Plasmide, synthetischer pCMK(+)-D15, wurden in großem Maßstab gereinigt, indem das QIAGEN-Maxiprep-Kit verwendet wurde und 2 μg dieses Materials zur Transformierung eines Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stammes, dem funktionelles cps-Gene fehlen (der in Beispiel 1 beschriebene Stamm) verwendet. Um die Expression von porA zur erhalten, wurde der Einbau, der aus einer einzelnen Überkreuzungsstelle (entweder Omp85/D15 oder porA) resultierte, durch eine Kombination aus PCR- und Western-Blot-Screening-Verfahren selektiert. Kanamycin-resistente Klone wurden zum Positivtesten durch porA-spezifische PCR und Western-Blot bei –70°C als Glycerinvorrat gelagert und für weitere Studien verwendet.
  • Bakterien (entsprechend etwa 5,108 Bakterien) wurden erneut in 50 μl eines PAGE-SDS-Puffers suspendiert, gefroren (–20°C)/dreimal gekocht (100°C) und anschließend durch PAGE-SDS-Elektrophorese auf einem 12,5% Gel getrennt. Anschließend wurden die Gele durch Coomassie-Brilliantblau R250 eingefärbt oder auf eine Nitrocellulose-Membran transferiert und mit einem Anti-porA-monoklonalen-Antikörper untersucht. Wie in 6 wiedergegeben, bestätigten sowohl Coomassie als auch das Immunoblot-Einfärben, daß porA-PCR-Positivklone PorA erzeugen.
  • Die Expression von D15 wurde unter Verwendung von Bläschen-Zubereitungen der äußeren Membran, abgeleitet von NmB [cps–, porA–] oder NmB [cps–, porA+, D15+] untersucht. Coomassie detektierte einen deutlichen Anstieg in der Expression der D15-Zubereitungen (im Hinblick auf den endogenen D15-Gehalt), (siehe 6). Dieses Ergebnis bestätigte, daß der pCMK(+)-D15-Vektor funktionell ist und erfolgreich verwendet werden kann, um die Expression von Proteinen der äußeren Membran, wie D15, aufzuregulieren, ohne die Erzeugung des Haupt-PorA-Protein-Antigens der äußeren Membran aufzuheben.
  • Beispiel 6: Konstruktion eines vielseitigen Promotor-Liefervektors
  • Rationale: Die Rationale für diesen Zugang wird in 7 wiedergegeben und kann in 7 wesentlichen Schritten zusammengefaßt werden. Einige dieser Schritte werden unten mit der Konstruktion eines Vektors zur Aufregulation der Expression von NspA und D15/Omp85 erläutert.
  • Vektor zur Aufregulation der Expression des NspA-Gens.
  • Schritt 1: Eine DNA-Region (997 bp), die stromaufwärts von dem für das NspA-codierende Gen liegt, wurde in der privaten Incyte PathoSeq-Datenbank (SEQ ID NO: 2) entdeckt, die unfertige genomische DNA-Sequenzen des Neisseria meningitidis-Stamms ATCC 13090 enthält. Zwei Oligonukleotid-Primer, als PNS1 und PNS2 (siehe Tabelle in Beispiel 2) wiedergegeben, wurden unter Verwendung dieser Sequenz entworfen und synthetisiert. Diese Primer wurden zur PCR-Amplifikation verwendet, indem aus dem H44/76-Stamm extrahierte genomische DNA verwendet wurde. Schritt 2. Die entsprechenden amplifizierten DNA-Sequenzen (Amplicons) wurden unter Verwendung des Wizard PCR-Kits (Promega, USA) auf gereinigt und der Digerierung mit EcoRI/XbaI-Restriktionsenzymen über 24 Stunden unter Verwendung der Bedingungen, die vom Lieferanten angegeben wurden (Boehringer Mannheim, Deutschland), unterworfen. Die entsprechenden DNA-Fragmente wurden Gel-gereinigt und in die entsprechenden Orte des pUC18-Klonierungsvektors eingebracht. Schritt 3. Rekombinante Plasmide wurden in großem Maßstab hergestellt und ein Aliquot einer Fraktion wurde als Matrize zur inversen PCR-Amplifikation verwendet. Die inverse PCR wurde unter Verwendung von PNS4- und PNS5-Oligonukleotiden durchgeführt, indem die nachfolgend genannten thermischen Ringbildungsbedingungen verwendet wurden: 25-mal (94°C, 1 min; 50°C 1 min, 72°C, 30 min) und 1-mal (72°C, 10 min, 4°C bis zur Ausbeute). Linearisierte pUC18-Vektoren, die einen Verlust in der NspA-Stromaufwärtsregion aufweisen, wurden erhalten.
  • Vektor zur Aufregulation der Expression des D15/omp85-Gens
  • Schritt 1. Eine DNA-Reaion (1000 bp), die stromaufwärts von dem für D15/omp85-codierenden Gen liegt, wurde in der privaten Incyte PathoSeq-Datenbank (SEQ ID NO: 3) entdeckt, die unfertige genomische DNA-Sequenzen des Neisseria meningitidis-Stammes ATCC 13090 enthält. Zwei Oligonukleotidprimer, als PromD15-51X und PromD15-S2 (siehe Tabelle in Beispiel 2) wiedergegeben, wurden unter Verwendung dieser Sequenz entworfen und synthetisiert. Diese Primer wurden zur PCR-Amplifikation unter Verwendung einer aus dem H44/76-Stamm extrahierten genomischen DNA verwendet. Schritt 2. Die korrespondierenden amplifizierten DNA-Sequenzen (Amplicons) wurden unter Verwendung des Wizard-PCR-Kits (Promega, USA) aufgereinigt und der Digerierung mit EcoRI/XbaI-Restriktionsenzymen unter den Bedingungen, die vom Lieferanten (Boehringer Mannheim, Deutschland) beschrieben wurden, über 24 Stunden unterworfen. Die entsprechenden DNA-Fragmente wurden gelgereinigt und in die entsprechenden Orte des pUC18-Klonierungs-Vektors eingefügt. Schritt 3. Rekombinante Plasmide wurden in großem Maßstab hergestellt und ein Aliquot einer Fraktion wurde als Matrize zur inversen PCR-Amplifikation verwendet. Eine inverse PCR wurde unter Verwendung von D15S4- und D15-S5-Oligonukleotiden durchgeführt, indem die nachfolgenden thermischen Ringbildungsbedingungen verwendet wurden: 25-mal (94°C, 1 min, 50°C, 1 min, 72°C, 3 min) und 1-mal (72°C, 10 min, 4°C bis zur Ausbeute). Linearisierte pUC18-Vektoren, die einen Verlust der Einfügung in der D15/omp85-stromaufwärts gelegenen Region aufweisen, wurden erhalten.
  • Beispiel 7: Fermentationsverfahren zur Herstellung rekombinanter Bläschen
  • Die unten aufgeführten Beispiele beschreiben Verfahren zur Herstellung rekombinanter Bläschen, denen entweder Kapsel-Polysaccharide oder Kapsel-Polysaccharid und PorA fehlen. Ein derartiges Verfahren kann in weitem Umfang für rekombinante Stämme von Neisseria meningitidis verwendet werden und kann, über einen ausgedehnten Maßstabsbereich reichend, angeglichen werden.
  • Kulturmedium: Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stämme wurden in festen (FNE 004 AA; FNE 010 AA) oder flüssigen (FNE 008 AA) Kulturmedien vermehrt. Diese neuen Medien zum Wachsen von Meningococcus sind vorteilhafterweise frei von tierischen Produkten und werden als ein weiterer Aspekt der Erfindung betrachtet.
  • Figure 00560001
  • Glaskolbenkultivierung von Neisseria meningitidis-Serogruppe B-cps-rekombinanten Bläschen:
  • Diese wurde in zwei Schritten durchgeführt, die eine Vorkultur auf festem Medium, gefolgt von einer Flüssigkultivierung, umfaßt. Feste Vorkultur: Ein Vial mit Impfgut wurde vom Gefriertrockner (–80°C) entfernt, auf Raumtemperatur aufgetaut und 0,1 ml wurde in eine Petrischale, die 15 ml FNE004AA (siehe oben) enthält, ausgestrichen. Die Petrischale wurde bei 37°C über 18 ± 2 Stunden inkubiert. Das Oberflächen-Wachstum wurde in 8 ml FNE008AA (siehe oben) resuspendiert, mit 15 mg/l Erythromycin ergänzt. Glaskolbenkultur: 2 ml resuspendierter fester Vorkultur wurden in einen 2 l-fassenden Glaskolben gegeben, der 400 ml FNE008AA enthielt und mit 15 mg/l Erythromycin ergänzt wurde. Der Glaskolben wurde auf einen Rütteltisch (200 Upm) gestellt und bei 37°C über 16 ± 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden aus der Kulturnährlösung durch Zentrifugation bei 5000 g bei 4°C über 15 Minuten abgetrennt.
  • Batch-Kultivierung von Neisseria meningitidis-Sergruppe B cps-rekombinanten Tröpfchen:
  • Diese wurde in drei Schritten durchgeführt, die eine Vorkultur auf festem Medium, eine Flüssigkultivierung und eine Kultivierung nach Batch-Art umfaßt. Feste Vorkultur: Ein Vial mit Impfgut wurde vom Gefriertrockner entfernt (–80°C), auf Raumtemperatur aufgetaut und 0,1 ml wurde in einer Petrischale, die 15 ml FNE004AA (siehe oben) enthielt, ausgestrichen. Die Petrischale wurde bei 37°C über 18 ± 2 Stunden inkubiert. Das Oberflächen-Wachstum wurde in 8 ml FNE008AA (siehe oben) erneut suspendiert und mit 15 mg/l Erythromycin ergänzt. Flüssige Vorkultur: 2 ml der erneut suspendierten festen Vorkultur wurden in einen 2 l fassenden Glaskolben, der 400 ml FNE008AA enthielt, zugegeben und mit 15 mg/l Erythromycin ergänzt. Der Glaskolben wurde auf einen Rütteltisch (200 Upm) gestellt und bei 37°C über 16 ± 2 Stunden inkubiert. Der Inhalt des Glaskolbens wurde herangezogen, um einen 20 l-Fermenter zu beimpfen. Batch-Kultur im Fermenter. Das Impfmaterial (400 ml) wurde einem vorsterilisierten, 20 l fassenden Fermenter (Gsamtvolumen), der 10 l FNE008AA enthielt, zugegeben und mit 15 mg/l Erythromycin ergänzt. Der pH-Wert wurde eingestellt und auf 7,0 durch automatische Zugabe von NaOH (25 Gew.-% G/V) und H3PO4 (25% V/V) aufrechterhalten. Die Temperatur wurde auf 37°C eingestellt. Die Belüftungsrate wurde bei 20 l Luft/min aufrechterhalten und die gelöste Sauerstoffkonzentration wurde bei 20% Sättigung durch Kontrolle der Rührgeschwindigkeit aufrechterhalten. Der Überdruck in dem Fermenter wurde bei 300 g/cm2 aufrechterhalten. Nach 9 ± 1 Stunden war die Kultur in einer stationären Phase. Die Zellen wurden von der Kulturnährlösung durch Zentrifigation bei 5000 g bei 4°C über 15 Minuten abgetrennt.
  • Glaskolbenkultivierung von Neisseria meningitidis-Serogruppe B cps-, PorA-rekombinanten Bläschen:
  • Diese wurde in zwei Schritten durchgeführt, die eine Vorkultur in einem festen Medium, gefolgt von einer flüssigen Kultivierung, umfaßte. Feste Vorkultur. Ein Vial mit Impfgut wurde vom Gefriertrockner (–80°C) entfernt, auf Raumtemperatur aufgetaut, und 0,1 ml wurden in einer Petrischale, die 15 ml FNE010AA (siehe oben) enthielt, ausgestrichen. Die Petrischale wurde bei 37°C über 18 ± 2 Stunden inkubiert. Das Oberflächenwachstum wurde erneut in 8 ml FNE008AA (siehe oben) suspendiert und mit 200 mg/l Kanamycin ergänzt. Glaskolbenkultur. 2 ml der resuspendierten festen Vorkultur wurden in einem 2 l fassenden Glaskolben, der 400 ml FNE008AA enthielt, zugegeben und mit 200 mg/l Kanamycin ergänzt. Der Glaskloben wurde auf einen Rütteltisch (200 Upm) gestellt und bei 37°C über 16 ± 2 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden aus der Kulturnährlösung durch Zentrifugation bei 5000 g bei 4°C über 15 Minuten separiert.
  • Beispiel 8: Isolierung und Reinigung der Bläschen von Meningococci ohne Kapselpolysaccharid
  • Rekombinante Bläschen wurden, wie unten beschrieben, gereinigt. Die Zellpaste (42 g) wurde in 211 ml 0,1 M Tris-Cl-Puffer, pH 8,6, der 10 mM EDTA und 0,5% Natriumdesoxycholat (DOC) enthielt, suspendiert. Das Verhältnis von Puffer zur Biomasse betrug 5/1 (V/W). Die Biomasse wurde durch Magnetrühren über 30 Minuten bei Raumtemperatur extrahiert. Der Gesamtextrakt wurde anschließend bei 20000 g über 30 Minuten bei 4°C (13000 Upm in einem JA-20-Rotor, Beckman J2-HS-Zentrifuge) zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen. Der Überstand wurde bei 125000 g über 2 Stunden bei 4°C (40000 Upm in einem 50,2 Ti-rotor, Beckman L8-70 M Ultrazentrifuge) ultrazentrifugiert, um die Bläschen zu konzentrieren. Der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde leicht in 25 ml 5 mM Tris-Cl-Puffer, pH 8,6, 2 mM EDTA, 1,2% DOC und 20% Zucker enthaltend, suspendiert. Nach einem zweiten Schritt der Ultrazentrifugation bei 125000 g über 2 Stunden bei 4°C, wurden die Vesikel sanft in 44 ml 3% Zucker suspendiert und bei 4°C gelagert. Alle Lösungen, die zur Bläschen-Extraktion und -Reinigung verwendet wurden, enthielten 0,01% Thiomersalat. Wie in 8 erläutert, ergab dieses Verfahren Ausbeuten von mit äußeren Membranproteinen hochangereicherten Proteinzubereitungen, wie PorA und PorB.
  • Beispiel 9: Identifizierung bakterieller Promotoren, die zur Aufregulation für Antigene codierende Gene geeignet sind
  • Die Verwendung starker bakterieller Promotorelemente ist wesentlich, um eine Aufregulation von Genen zu erhalten, die für Proteine der äußeren Membran codieren. In diesem Zusammenhang haben wir kürzlich gezeigt, daß die Aufregulation der Neisseria meningitidis nspA-, hsf- und omp85-Gene unter Verwendung des porA-Promotors uns ermöglichte, rekombinante Bläschen zu isolieren, die mit entsprechenden NspA-, Hsf- und Omp85-Proteinen angereichert waren. Alternativen zu dem porA-Promotor können nützlich sein, um unterschiedliche Gehalte der Aufregulation zu erhalten, um eine mögliche porA-Phasenvariation zu überwinden und/oder eine konditionelle Gen-Expression (eisenregulierte Promotoren) zu erreichen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das die Identifizierung eines exakten transkriptionellen Startortes starker Promotorelemente erlaubt, die wahrscheinlich zu einem hohen Expressionsgehalt in Bakterien beitragen. Da Promotor-Regulationselemente von 200 bp stromaufwärts und 50 bp stromabwärts von dem +1-Ort umfaßt werden (Collado-Vides, J., Magasanik, B., Gralla, J. D. 1991, Microbiol. Rev. 55(3): 371–94) erlaubt uns das Ergebnis eines solchen Experimentes, DNA-Fragment von etwa 250 bp, die starke Promotoraktivitäten tragen, zu identifizieren. Größere Proteine der äußeren Membran, wie Neisseria meningitidis PorA, PorB & Rmp, Haemophilus influenzae P1, P2, P5 & P6, Moraxella catarrhalis OmpCD, OmpE, als auch cytoplasmatische und/oder eisenregulierte Proteine dieser Bakterien besitzen starke Promotorelemente. Als Validierung dieser allgemeinen Methode, kartierten wir den transkriptionellen Startort der starken Neisseria meningitidis porA- und porB-Promotoren, indem wir die schnelle Amplifikation von cDNA-Elementen (5'-RACE) nutzten.
  • Die Prinzipien von 5'-RACE sind die folgenden: 1) Gesamt-RNA-Extraktion unter Verwendung eines QIAGEN "RNeasy"-Kits. Entfernen genomischer DNA durch DNase-Behandlung, gefolgt von einer QIAGEN-Reinigung; 2) mRNA-Reverse-Transkription mit einem porA-spezifischen 3'-Endprimer (genannt porA3). Erwartete cDNA-Größe: 307 nt. RNA-Entfernung durch alkalische Hydrolyse; 3) Ligation eines Einzelstrang-DNA-Oligoankers (genannt DT88) an das 3'-Ende der cDNA unter Verwendung einer T4-RNA-Ligase. Erwartete Produktgröße: 335 nt. Amplifikation der Anker-ligierten cDNA unter Verwendung einer Kombination einer hemiverschachtelten PCR; 4) PCR-Amplifikation der Anker-ligierten cDNA, indem ein Ankerprimer für eine komplementäre Sequenz als 5'-Endprimer (genannt dT89) und ein 3'-Endprimer (p1-2 genannt) benutzt wird, welcher innerhalb des 3'-End-RT-Primers porA3 ist. Erwartete Produktgröße: 292 bp; 5) PCR-Amplifikation der vorherigen PCR-Produkte, indem DT89 als 5'-Endprimer und P1-1 als 3'-Endprimer (innerhalb zu p1-2) verwendet werden. Erwartete Produktgröße: 211 bp; und 6) Sequenzbestimmung mit einem p1-1-Primer (erwartete Produktgrößen können kalkuliert werden, weil der porA-Transkriptionsstartort bekannt ist: 59 nt vor dem "ATG"-Translationsstartort).
  • Experimentelles Verfahren
  • Die Gesamt-RNA wurde aus angenähert 109 Zellen des Neisseria meningitidis-Serogruppen B– cps– porA+-Stammes extrahiert. Die Extraktion von 1 ml einer flüssigen Kultur bei geeigneter optischen Dichte (OD600 = 1) wurde entsprechend den Instruktionen des Herstellers mit einem QIAGEN "RNAeasy"-Kits durchgeführt. Durch Zugabe von 10 U RNase-freier DNase (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) zu 30 μl eluierter RNA, wurde chromosomale DNA entfernt und bei 37°C über 15 min inkubiert. Die DNA-freie RNA wurde mit demselben QIAGEN-Kit entsprechend den Anweisungen gereinigt.
  • Umkehrtranskriptionsumsetzungen wurden unter Verwendung eines porA3-Primers und 200 U SUPERSCRIPT II-Umkehrtranskriptase (Life Technologies) durchgeführt. Die RT-Umsetzungen wurden in einem 50 μl-Volumen durchgeführt, das enthielt: 5 μl 2 mM dNTP, 20 pmol porA-Primer, 5 μl 10 × SUPERSCRIPT II-Puffer, 9 μl 25 mM MgCl2, 4 μl 0,1 M DTT, 40 U rekombinanten Ribonuklease-Inhibitor und 1 μg der gesamten RNA. Der porA3-Primer wurde mit nachfolgender Abkühlung erhitzt (70°C über 2 min, 65°C über 1 min, 60°C über 1 min, 55°C über 1 min, 50°C über 1 min und 45°C über 1 min), bevor SUPERSCRIPT II zugegeben wurde. Die RT-Umsetzung wurde bei 42°C über 30 min durchgeführt, gefolgt von 5 Zyklen (50°C über 1 min, 53°C über 1 min und 56°C über 1 min), um die RNA-Sekundärstruktur zu destabilisieren. Zwei Parallelumsetzungen wurden mit der Umkehrtranskriptase durchgeführt, wobei eine Umsetzung als Negativkontrolle ausgelassen wurde.
  • Die RNA wurde durch alkalische Hydrolysespaltung unter Zugabe von 1 μl 0,5 M EDTA, gefolgt von 12,5 μl 0,2 M NaOH, entfernt, bevor Inkubation bei 68°C über 5 min erfolgte. Die Umsetzungen wurden durch Zugabe von 12,5 μl 1 M Tris-HCl (pH 7,4) neutralisiert und durch Zugabe von 20 μg Glycogen (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland), 5 μl 3 M Natriumacetat und 60 μl Isopropanol ausgefällt. Beide Proben wurden erneut in 20 μl 10:1 TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA, pH 8) erneut suspendiert.
  • Die T4-RNA-Ligase wurde verwendet, um ein 5'-phosphoryliertes, 3'-end-ddCTP-blockiertes Anker-Oligonukleotid DT88 (siehe Tabelle unten) zu verankern. Zwei parallel verlaufende Ligationen wurden über Nacht bei Raumtemperatur durchgeführt, wobei jede enthielt: 1,3 μl 10 × RNA-Ligasepuffer (Roche Molecular Biochemicals), 0,4 μM DT88, 10 μl von entweder cDNA oder RT-Kontrollprobe und 3 U einer T4-RNA-Ligase. Als Negativkontrollen wurde eine zweite Serie von Ligationsreaktionen ohne T4-RNA-Ligase durchgeführt. Die erhaltenen Ligations-Reaktionsgemische wurden direkt ohne Reinigung in der nachfolgenden PCR verwendet.
  • Die Anker-ligierte cDNA wurde unter Verwendung einer Kombination aus hemi-verknäuelten und heiß-gestarteten PCR-Näherungen amplifiziert, um die Spezifität und Produktausbeute zu erhöhen. Vier getrennte PCR wurden in einer ersten Runde an der RT/Ligase-Reaktion und Kontrollen in einem 30 μl-Volumen durchgeführt, wobei jede enthielt: 3 μl 10 × Taq-Platinpuffer, 3 μl 25 mM MgCl2, 1 μl 10 mM dNTP, 10 pmol jeden Primers und 1 μl der korrespondierenden RNA-Ligations-Reaktion. Die PCR wurde unter Verwendung von Taq-Platin-DNA-Polymerase (Life Technologies) (2 U zugegeben) heiß gestartet. Die erste Ligations-verankerte PCR (LA-PCR) wurde unter Verwendung von sowohl 10 pmol ankerspezifischen Primers DT89 als auch des Transkript-spezifischen Primers p1-2 (siehe Tabelle unten) durchgeführt, der innerhalb des 3'-End-RT-porA3-Primers ist. Die PCR wurde unter Verwendung eines anfänglichen Schrittes, 95°C über 5 Minuten (zur DNA-Polymerase-Aktivierung) durchgeführt, gefolgt von 10 Zyklen bei 95°C über 10 Sekunden und 70°C über 1 Minute (unter Reduzierung eines Grades per Zyklus), 15 Zyklen bei 95°C über 10 s und 60°C über 1 min. Die zweite hemi-verknäuelte LA-PCR wurde unter denselben Bedingungen durchgeführt, indem ein Primer DT89 und der p1-2 interne Primer zusammen mit 10 pmol von p1-1 (siehe Tabelle unten) und 1 μl der PCR der ersten Runde verwendet wurden. Die Amplifizierungsprodukte wurden unter Verwendung eines QIAGEN "QIAquick PCR-Reinigungs"-Kits, entsprechend den Anweisungen des Herstellers gereinigt, bevor sie der Sequenzbestimmung unterworfen wurden.
  • Das CEQTM Fluorenz-markierte Ketten-Abbruch-Sequenz-Kit der cyclischen Sequenzierung (Beckman, Frankreich) wurde verwendet, um die RACE PCR-Produkte unter Verwendung von 10 pmol des Primers p1-1 zu sequenzieren. Die Sequenzierungsreaktionen wurden entsprechend den zur Verfügung gestellten Anleitungen durchgeführt und die Sequenzierungsprodukte wurden mitteles eine Ceq2000DNA-Analysesystems (Beckman-Coulter) analysiert.
  • Figure 00610001
  • Ergebnisse für den Neisseria meningitidis porA-Promotor
  • Der Start der Transkription für Neisseria meningitidis-Serogruppe B porA-mRNA (Stamm H44/76) wurde bei 59 bp stromaufwärts des ATG-Startcodons kartiert, indem das beschriebene 5'-RACE-Verfahren verwendet wurde. Das Ergebnis bestätigt die durch Primerverlängerung durchgeführte Kartierung und wurde von van der Ende et al. (1995) veröffentlicht. Dieses Ergebnis unterstützt, daß ein DNA-Fragment, das Nukleotide –9 bis –259 enthält, im Hinblick auf porA-ATG geeignet ist, eine starke Genexpression in Neisseria meningitidis zu steuern und möglicherweise in anderen bakteriellen Spezies, wie Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
  • Ergebnisse für den Neisseria meningitidis-porB-Promotor
  • Die gleiche experimentelle Strategie wurde für die Kartierung des Transkriptions-Startortes von Neisseria meningitidis-Serogruppe B (Stamm H44/76)-porB angewandt. Die in der unten gezeigten Tabelle aufgeführten Primer korrespondieren mit dem 3'-End-RT-Primer (porB3), dem Transkript-spezifischen Primer, der innerhalb von porB3 (porB2) und innerhalb von porB2 (porB1) ist. porB3, porB2 und porB1 sind jeweils bei 265 bp, 195 bp und 150 bp stromabwärts vom ATG-Start-Codon gelegen.
  • Figure 00620001
  • Unter Verwendung der porB1- und DT89-Primer wurde unter Durchführung der 5'-RACE-Kartierung eine PCR-amplifizierte DNA-Sequenz (Amplicon) erhalten. Da porB1 bei 150 bp vom porB-ATG-Startcodon gelegen ist, unterstützt dieses Ergebnis, daß der porB-transkriptionale Startort bei etwa 50 bp (+/–30 bp) stromaufwärts vom porB-ATG gelegen ist.
  • Das exakte Nukleotid, das mit dem Transkriptionsstart korrespondiert, wird gegenwärtig durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Das oben genannte PCR-Ergebnis unterstützt, daß ein DNA-Fragment, das Nukleotide –1 bis –250 enthält, im Hinblick auf das porB-ATG-Startcodon zur Steuerung einer starken Genexpression in Neisseria meningitidis geeignet ist und möglicherweise in anderen bakteriellen Spezies, wie Haemophilus, Moracella, Pseudomonas.
  • Beispiel 10: Aufregulation des N. meningitidis-Serogruppe B Omp85-Gens durch Promotorsubstitution
  • Ziel diese Experimentes war es, die endogene Promotorregion des D15/Omp85-Gens durch den starken porA-Promotor zu ersetzen, um die Erzeugung des D15/Omp85-Antigens aufzuregulieren. Für diesen Zweck wurde ein Promotor-Substitutionsplasmid künstlich geschaffen, indem die E. coli-Klonierungsmethodologien verwendet wurden. Eine DNA-Region (1000 bp), stromaufwärts vom für D15/omp85-codierenden Gen gelegen, wurde in der privaten Incyte PathoSeq-Datenbank entdeckt (SEQ ID NO: 3), die unvollendete genomische DNA-Sequenzen des Neisseria meningitidis-Stammes ATCC 13090 enthält. Die Hauptschritte dieses Verfahrens werden in 9 wiedergegeben. In Kürze: ein DNA-Fragment (1000 bp), das im Hinblick auf das Startcodon (ATG) des D15/Omp85-Gens Nukleotide –48 bis –983 umfaßt, wurde unter Verwendung der Oligonukleotide ProD15-51X (5'-GGG CGA ATT CGC GGC CGC CGT CAA CGG CAC ACC GTT G-3') und ProD15-52 (5'-GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3'), das jeweils EcoRI- und XbaI-Restriktionsorte (unterstrichen) enthält, PCR-amplifiziert. Dieses Fragment wurde der Restriktion unterworfen und in das mit denselben Enzymen eingeschränkte pUC18-Plasmid eingefügt. Das erhaltene Konstrukt wurde der in vitro-Mutagenes unterworfen, indem das Genom-Priming-System (das pGPS2-Donor-Plasmid wurde verwendet), das von New England Biolabs (MA, USA) kommerziell vertrieben wird, verwendet wurde. Klone, die ein Mini-Transposon eingefügt haben (abgeleitet von Tn7 und ein Chloramphenicol-Resistenzgen aufweisen), wurden selektiert. Ein Klon, der eine Minitransposon-Einfügung enthält, die in der D15/Omp85-5'-flankierenden Region gelegen ist, 401 bp stromabwärts von dem EcoRI-Ort, wurde isoliert und für weitere Studien verwendet. Dieses Plasmid wurde der Ring-PCR-Mutagenese unterworfen (Jones & Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528–534) um: (i) die wiederholte DNA-Sequenz (Tn7R), die durch den Transpositionsprozeß generiert wurde, zu entfernen, (ii) die Menigococcen-Aufnahmesequenzen, die zur Transformation erforderlich sind, einzufügen und (iii) geeignete Restriktionsorte einzufügen, die die Klonierung fremden DNA-Materials, wie Promotoren, zulassen. Die Ring-PCR wurde unter Verwendung von TnRD15-KpnI/XbaI + US (5'-CGC CGG TAC CTC TAG AGC CGT CTG AAC CAC TCG TGG ACA ACC C-3') & TnR03Cam(KpnI) (5'-CGC CGG TAC CGC CGC TAA CTA TAA CGG TC-3') Oligonukleotiden durchgeführt, die Aufnahmesequenzen und geeignete Restriktionsorte (KpnI und XbaI) (unterstrichen) enthalten. Das erhalten PCR-Fragment wurde Gel-gereinigt, mit Asp718 (Isochizomer von KpnI) digeriert und an ein 184 bp-DNA-Fragment ligiert, das den porA-Promotor enthält und durch PCR generiert wurde, indem PorA-01 (5'-CGC CGG TAC CGA GGT CTG CGC TTG AAT TGT G-3') und PorA02 (5'-CGC CGG TAC CTC TAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3')-Oligonukleotide verwendet wurden, die KpnI-Restriktionsorte enthaltene. Rekombinante Klone, die einen in korrekter Orientierung eingefügten porA-Promotor tragen (Transkriptionsverfahren in EcoRI nach XbaI-Richtung) wurden selektiert und zur Transformation eines Stammes Neisseria meningitidis-Serogruppe B, dem ein Kapsel-Polysaccharid (cps– und eines der Hauptproteine -PorA (porA–) der äußeren Membran fehlen, verwendet. Rekombinante Neisseria meningitidis-Klone, die von dem Ereignis einer doppelten Überkreuzungsstelle erhalten wurden (PCR-Screening jedem Oligonukleotide Cam-o5 (5'-GTA CTG CGA TGA GTG GCA GG-3') & proD15-52 verwendet wurden), wurden in einem GC-Medium, das 5 μg/ml Chloramphenicol enthält, selektiert und auf D15/Omp85-Expression analysiert. Wie in 10 wiedergegeben, war die Produktion von D15/Omp85 deutlich in den Gesamtprotein-Extrakten der Nm-Stämme, die aus dem Promotoraustausch resultierten, im Vergleich mit dem elterlichen Stamm (cps–) deutlich gesteigert. Dieses Ergebnis wurde auch beobachtet, wenn aus denselben Stämmen hergestellte äußere Membranbläschen analysiert wurden (siehe 17). Diese Ergebnisse sind der Substitution des endogenen D15-Promotors durch den starken porA-Promotor zuzuschreiben. Zusätzlich wurde überraschenderweise gefunden, daß eine Expression annäherungsweise 50-mal größer war, wo der porA-Promotor annäherungsweise 400 bp stromaufwärts vom Startcodon eingefügt war, als wenn der Promotor annäherungsweise 100 bp stromaufwärts gelegen war. Insgesamt unterstützen diese Experimente, daß die Promotorsubstitutionsstrategie funktioniert und die Aufregulation der Synthese integraler Proteine der äußeren Membran in Bläschen der äußeren Membran zuläßt.
  • Bestimmte geographisch isolierte menschliche Populationen (wie Cuba) werden durch eine begrenzte Zahl von Neisseria meningitidis-Isolaten infiziert, die weitgehend einen oder einige Protein-Serotypen der äußeren Membran betreffen. Da PorA ein Hauptprotein-Antigen der äußeren Membran ist, das protektive und stammspezifische bakterizide Antikörper induzieren kann, kann es möglich sein, in einer solchen Population einen Impfschutz zu erzeugen, indem eine begrenzte Anzahl von porA-Serotypen verwendet wird. Darüber hinaus kann PorA mit einigen anderen Proteinen der äußeren Membran wechselwirken oder sie stabilisieren. In diesem Zusammenhang kann die Gegenwart von PorA in Bläschen der äußeren Membran vorteilhaft sein, und die Wirksamkeit des Impfstoffes solcher rekombinanter, verbesserter Bläschen verstärken.
  • Aus diesem Grund kann es wünschenswert sein, die Expression des D15/Omp85-Proteins der äußeren Membran im Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, aber PorA exprimiert, aufzuregulieren. Genomische DNA wurde aus dem rekombinanten Neisseria meningitidis-Serogruppe B cps–, porA–, D15/Omp85+-Stamm extrahiert, indem das QIAGEN-Genomic Tips 100-G-Kit verwendet wurde. 10 μg dieses Materials wurde linearisiert und zur Transformation von Neisseria meningitidis-Serogruppe B–cps– verwendet, indem einem klassischen Transformationsprotokoll gefolgt wurde. Rekombinantes Neisseria wurde auf GC-Agarplatten, die 5 μg/ml Chloramphenicol enthielten, erhalten.
  • Einfügungen, die aus einer doppelten Überkreuzungsstelle stromaufwärts vom D15-Gen resultieren, wurden durch die früher beschriebene PCR gescreent. Da homologe Rekombinationen überall im Chromosom vorkommen können, wurde ein zweites PCR-Screening durchgeführt, um die Unversehrtheit des porA-Ortes in dem rekombinanten Stamm zu kontrollieren. Für diesen Zweck wurden interne porA-Primer PPA1 (5-GCG GCC GTT GCC GAT GTC ACG C-3') und PpA2 (5-GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3') in einem PCR-Screeningexperiment verwendet. Die Amplifikation eines 1170 bp-Fragmentes bestätigt die Gegenwart des porA-Gens in den rekombinanten Bakterien.
  • Rekombinante Bakterien (entsprechend etwa 5,108 Bakterien) können erneut in 50 μl eines PAGE-SDS-Puffers suspendiert werden, tiefgekühlt werden (–20°C)/dreimal gekocht werden (100°C) und anschließend durch PAGE-SDS-Elektrophorese auf einem 12,5% Gel separiert werden. Die Gele können anschließend mit Coomassie Brilliantblau R250 eingefärbt werden oder auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen werden und entweder mit einem Anti-porA-monoklonalen-Antikörper oder mit einem Anti-D15/Omp85-Kaninchen-polyklonalen Antikörper analysiert werden. Die Analyse der Bläschen der äußeren Membran, die von denselben Stämmen hergestellt wurden, kann auch durchgeführt werden.
  • Beispiel 11: Aufregulation des Hsf-Proteinantigens in einem rekombinanten Neisseria meningitidis-Serugruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, jedoch PorA exprimiert
  • Wie oben beschrieben kann die Anwesenheit von PorA in Bläschen der äußeren Membran in bestimmten Ländern vorteilhaft sein und kann die Impfstoffwirksamkeit rekombinant verbesserter Bläschen verstärken. Im folgenden Beispiel haben wir einen modifizierten pCMK(+)-Vektor verwendet, um die Expression des Hsf-Protein-Antigens in einem Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlten, aber PorA exprimiert, verwendet. Der Original pCMK(+)-Vektor enthält einen chimären porA/lacO-Promotor, der im E. coli-Wirt unterdrückt ist, der lacIq exprimiert, aber transkriptionell in Neisseria meningitidis aktiv ist. In dem modifizierten pCMK(+) wurde der native porA-Promotor verwendet, um die Transkription des hsf-Gens zu steuern. Das Gen, das für Hsf codiert, wurde PCR-amplifiziert, indem HSF 01-NdeI und HSF 02-NheI-Oligonukleotidprimer verwendet wurden, die in der Tabelle unten wiedergegeben sind. Weil diese Sequenz des HSF 01-NdeI-Primers das Hsf-Protein exprimierte, wird es zwei Methionin-Reste am 5'-Ende enthalten. Die zur PCR-Amplifikation angewandten Bedingungen waren diejenigen, die durch den Lieferanten (HiFi-DNA-Polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH) beschrieben wurden. Thermische Cyclisierung wurde, wie folgt, ausgeführt: 25-mal (94°C 1 min, 48°C 1 min, 72°C, 3 min) und 1-mal (72°C, 10 min, 4°C bis zur Ausbeute). Das korrespondierende Amplikon wurde nachfolgend in den entsprechenden Restriktionsorten des pCMK(+)-Liefer-Vektors kloniert. In diesem rekombinanten Plasmid, synthetisches pCMK(+)-Hsf, entfernten wir lacO, das in dem chimerischen porA/lacO-Promotor durch eine rekombinante PCR-Strategie (siehe 12) gegenwärtig ist. Das pCMK(+)-Hsf-Plasmid wurde für die PCR-Amplifikation zweier separater DNA-Fragmente als Matrize verwendet:
    • – Fragment 1 enthält die porA 5'-rekombinogene Region, das Kanamycin-Resistenzgen und den porA-Promotor. Verwendete Oligonukleotidprimer, RP1 (SacII) und RP2, werden in der unteren Tabelle wiedergegeben. Der RP1-Primer ist zur der Sequenz, die gerade noch stromaufwärts zum lac-Operator ist, homolog.
    • – Fragment 2 enthält die Shine-Dalgarno-Sequenz vom porA-Gen, das hsf-Gen und die porA 3'-rekombinogene Region. Die verwendeten Oligonukleotid-Primer RP3 und RP4 (ApaI) werden in der Tabelle unten wiedergegeben. Der RP3-Primer ist zu der Sequenz, die gerade noch stromabwärts zum lac-Operator ist, homolog. Das 3'-Ende des Fragments 1 und das 5'-Ende des Fragments 2 weisen 48 überlappende Basen auf. 500 ng jeder PCR (1 und 2) wurden für eine endgültige PCR-Reaktion verwendet, indem die Primer RP1 und RP4 verwendet wurden. Das erhaltene Endamplikon wurde in einem mit SacII und ApaI unterdrückten pSL1180-Vektor subkloniert. Das modifizierte Plasmid pCMK(+)-Hsf wurde in großem Maßstab gereinigt, indem das QIAGEN-Maxiprep-Kit verwendet wurde, und 2 μg dieses Materials zur Transformation eines Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stammes, dem funktionelle cps-Gene (der in Beispiel 1 beschriebene Stamm) verwendet. Um die Expression von porA sicherzustellen, wurde der von einer einfachen Überkreuzungsstelle resultierende Einbau durch eine Kombination aus PCR und Western-Blot-Screening-Verfahren selektiert. Kanamycin-resistente Klone auf Positiv-Testung durch porA-spezifische PCR und Western-Blot wurden bei –70°C als Glycerin-Vorrat aufbewahrt und für weitere Studien verwendet. Bakterien (entsprechend etwa 5,108 Bakterien) wurden erneut in 50 μl PAGE-SDS-Puffer suspendiert, gefroren (–20°C)/3-mal gekocht (100°C) und anschließend durch PAGE-SDS-Elektrophorese auf einem 12,5 Gel separiert. Die Expression von Hsf wurde in bakterielleen Ganzzellenlysaten (WCBL), abgeleitet von NmB [Cps–, PorA+] oder NmB [Cps–, PorA+, Hsf+] geprüft. Coomassie-Färbung detektierte ein deutliches Ansteigen in der Expression von Hsf (im Hinblick auf den endogenen Hsf-Gehalt) (siehe in 13). Dieses Ergebnis bestätigt, daß der modifizierte pCMK(+)-Hsf-Vektor funktionell ist und erfolgreich verwendet werden kann, um die Expression der äußeren Membranproteine ohne Aufhebung der Erzeugung des größeren PorA-äußeren Membranprotein-Antigens aufzuregulieren.
  • In dieser Arbeit verwendete Oligonukleotide
    Figure 00670001
  • Beispiel 12: Expression des Grün-Fluoreszenz-Proteins in einem rekombinanten Neisseria meningitis-Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, jedoch PorA exprimiert
  • Im folgenden Beispiel wurde der pCMK-Vektor verwendet, um die Expression eines cytoplasmatischen heterologen Proteins in Neisseria meningitidis zu testen. Das Grün-Fluoreszenz-Protein wurde aus pKen-Gfpmut2-Plasmid mit dem Primern GFP-Asn-mut2 und GFP-Spe (siehe Tabelle in Beispiel 11) amplifiziert. AsnI gibt kohäsive Enden, die mit NdeI vereinbar sind, SpeI gibt kohäsive Enden, die mit NheI vereinbar sind. Die zur PCR-Amplifikation verwendeten Bedingungen waren diejenigen, die vom Hersteller (HiFi-DNA-Polymerase, Boehringer Mannheim, GmbH) beschrieben wurden. Die thermische Cyclisierung wurde, wie folgt, durchgeführt: 25-mal (94°C, 1 min, 48°C 1 min, 72°C 3 min) und 1-mal (72°C 10 min, 4°C bis zur Ausbeute). Das entsprechende Amplikon wurde nachfolgend in dem pCMK(+)-Liefervektor kloniert und mit NdeI und NheI Restriktionsenzymen digeriert. In diesem rekombinanten Plasmid, künstlich pCMK(+)-GFP, entfernten wir mittels rekombinanter PCR-Strategie den lacO, der in dem chimären porA/lacO-Promotor gegenwärtig ist. Das pCMK(+)-GFP-Plasmid wurde als Matrize zur PCR-Amplifikation zweier separater DNA-Fragmente verwendet:
    • – Fragment 1 enthielt die porA-5'-rekombinogene Region, das Kanamycin-Resistenzgen und den porA-Promotor. Die verwendeten Oligonukleotidprimer waren RP1 (SacII) und RP2 (siehe Tabelle in Beispiel 11). Der RP1-Primer ist zu der Sequenz, die gerade noch stromaufwärts zum lac-Operator ist, homolog.
    • – Fragment 2 enthält die PorA-Shine-Dalgarno-Sequenz, das gfp-Gen und die porA3' rekombinogene Region. Die verwendeten Oligonukleotidprimer RP3 und RP4 (ApaI) werden in der Tabelle in Beispiel 11 wiedergegeben. Der RP3-Primer ist zu der Sequenz, die gerade noch stromabwärts zum lac-Operator ist, homolog.
  • Das 3'-Ende des Fragments 1 und das 5'-Ende des Fragments 2 weisen 48 überlappende Basen auf. 500 ng jeder PCR (1 und 2) wurden für eine End-PCR-Reaktion verwendet, indem die RP1- und RP4-Primer verwendet wurden. 20 μg dieses PCR-Fragments wurden verwendet, um einen Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stamm, dem funktionelle cps-Gene fehlen, zu transformieren.
  • Die Transformation mit linearer DNA ist weniger wirksam, als die mit einer ringförmigen Plasmid-DNA, jedoch führten all diese erhaltenden Rekombinanten eine doppelte Überkreuzungsstelle durch (bestätigt durch eine Kombination aus PCR- und Western-Blot-Screening-Verfahren). Kanamycin-resistente Klone wurden bei –70°C als Glycerin-Vorrat gelagert und für weitere Studien verwendet. Bakterien (entsprechend etwa 5,108 Bakterien) wurden erneut in 50 μl PAGE-SDS-Puffer suspendiert, gefroren (–20°C)/3-mal gekocht (100°C) und anschließend durch PAGE-SDS-Elektrophorese auf einem 12,5 Gel separiert.
  • Die Expression von GFP wurde in bakteriellen Ganzzellenlysaten (WCBL), abgeleitet von NmB [Cps–, PorA+] oder NmB [Cps–, PorA–, GFP+], geprüft. Coomassie-Färbung detektierte, daß eine Expression von GFP in dem Empfängerstamm Neisseria meningitidis (siehe 14) nicht vorhanden ist.
  • Beispiel 13: Aufregulation des N. meningitidis-Serogruppe B NspA-Gens durch Promotorsubstitution
  • Ziel diese Experimentes war es, die endogene Promotorregion des NspA-Gens durch einen starken porA-Promotor zu ersetzen, um die Erzeugung des NspA-Antigens aufzuregulieren. Zu diesem Zweck wurde ein Promotor-Substitutionsplasmid künstlich geschaffen, indem die Methodenfolgen der E. coli-Klonierung verwendet wurde. In der privaten Incyte PathoSeq-Datenbank, die unvollendete genomische DNA-Sequenzen des Neisseria meningitidis-Stamms ATCC 13090 enthält, wurde eine DNA-Region (924 bp), die stromaufwärts von dem für NspA codierenden Gen gelegen ist, entdeckt (SEQ ID NO: 7). Ein DNA-Fragment (675 bp), das Nukleotide –115 bis –790 im Hinblick auf das NspA-Gen-Startcodon (ATG) umfaßt, wurde PCR-amplifiziert, indem Oligonukleotide PNS1' (5'-CCG CGA ATT CGA CGA AGC CGC CCT CGA C-3') und PNS2 (5'-CGT CTA GAC GTA GCG GTA TCC GGC TGC-3') verwendet wurden, die jeweils EcoRI- und XbaI-Restriktionsorte (unterstrichen) enthalten. Das PCR-Fragment wurde der Restriktion mit EcoRI und XbaI unterworfen und pUC18 eingefügt. Dieses Plasmid wurde der Ring-PCR-Mutagenese unterworfen (Jones & Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528–534), um meningococcale Aufnahmesequenzen, die zur Transformation erforderlich sind, und geeignete Restriktionsorte, die eine Klonierung einer CmR/PorA-Promotorkassette erlauben, einzufügen. Die Ring-PCR wurde unter Verwendung von BAD01-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GCT TAT CGA TGG AAA ACG CAG C-3') & BAD02-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTT CAG ACG GCG CGC TTA TAT AGT GGA TTA AC-3') Oligonukleotiden durchgeführt, die Aufnahmesequenzen und geeignete Restriktionsorte (XmaI und XhoI) (unterstrichen) enthalten. Das erhaltene PCR-Fragment wurde Gel-gereinigt und mit XhoI digeriert. Die CmR/PorA-Promotorkassette wurde von dem bereits früher beschriebenen pUC D15/Omp85-Plasmid amplifiziert, indem die Primer BAD 15-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTC TAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') & BAD 03-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GCA CTA GTA TTA CCC TGT TAT CCC-3') Oligonukleotide verwendet wurden, die geeignete Restriktionsorte (XmaI, XbaI, SpeI und XhoI) (unterstrichen) verwendet wurden. Das erhaltene PCR-Fragment wurde der Digerierung unterworfen und in das mit entsprechenden Enzymen beschränkte Ring-PCR-Plasmid eingefügt. 10 μg des rekombinanten Plasmids wurden linearisiert und zur Transformation eines Stammes von Neisseria meningitidis-Serogruppe B, dem ein Kapsel-Polysaccharid (cps–) und eines der Hauptproteine der äußeren Membran-PorA (porA–) Proteine fehlt, verwendet. Von einem Ereignis der Doppelüberkreuzungsstelle resultierende rekombinante Neisseria meningitidis-Klone [PCR-Screening unter Verwendung der Oligonukleotide BAD25 (5'-GAG CGA AGC CGT CGA ACG C-3') & BAD08 (5'-CTT AAG CGT CGG ACA TTT CC-3')] wurden auf GC-Agarplatten selektiert, die 5 μg/ml Chloramphenicol enthielten und auf NspA-Expression analysiert. Rekombinante Bakterien (entsprechend etwa 5,108 Bakterien) wurden erneut in 50 μl PAGE-SDS-Puffer suspendiert, gefroren (–20°C)/3-mal gekocht (100°C) und anschließend durch PAGE-SDS-Elektrophorese auf einem 12,5% Gel separiert. Die Gele wurden dann durch Coomassie-Brilliantblau R250 eingefärbt oder auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen und entweder mit einem PorA-monoklonalen Antikörper oder mit einem Anti-NspA-polyklonalen Antikörper (17) analysiert. Wie für Omp85 besteht hier ein überraschender Hinweis, daß die Einfügung des Promotors bei näherungsweise 400 bp stromaufwärts vom NspA-Startcodon, mehr Protein exprimiert, als wenn er näherungsweise bei 100 bp stromaufwärts gelegen ist.
  • Dasselbe rekombinante pUC-Plasmid kann verwendet werden, um die Expression von NspA in einem Neisseria meningitidis-Serogruppe B-Stamm, dem ein funktionelles cps-Gen fehlt, aber gerade noch PorA exprimiert, aufzuregulieren.
  • Beispiel 14: Aufregulation des N. meningitidis-Serogruppe B-pldA (omplA)-Gens durch Promotorsubstitution
  • Ziel dieses Experimentes war es, die endogene Promotorregion des pldA (omplA)-Gens durch einen starken porA-Promotor zu ersetzen, um die Erzeugung des PldA (OmplA1)-Antigens aufzuregulieren. Für diesen Zweck wurde ein Promotor-Substitutionsplasmid künstlich erzeugt, indem die Methodenfolgen der E. coli-Klonierung verwendet wurden. In der privaten Incyte PathoSeq-Datenbank, die den Neisseria meningitidis-Stamm ATCC 13090 enthält, wurde eine DNA-Region (373 bp), die stromaufwärts von der für pldA codierenden Sequenz gelegen ist, entdeckt (SEQ ID NO: 18). Diese DNA enthält die Sequenz, die für ein angenommenes rpsT-Gen codiert. Das Stoppcodon von rpsT ist bei 169 bp stromaufwärts zu pldA ATG gelegen. Um eine Unterbrechung dieses potentiell wichtigen Gens zu vermeiden, entschieden wir, die CmR/PorA-Promotor-Kassette gerade noch stromaufwärts von dem ATG des pldA einzufügen. Zu diesem Zweck wurden ein DNA-Fragment von 992 bp, das dem rpsT-Gen entspricht, die 169 bp-zwischengenische Sequenz und die 499 ersten Nukleotide des pldA-Gens von einer genomischen Neisseria meningitidis-Serogruppe B-DNA PCR-amplifiziert, indem die Oligonukleotide PLA1 Amo5 (5'-GCC GTC TGA ATT TAA AAT TGC GCG TTT ACA G-3') und PLA1 Amo3 (5'-GTA GTC TAG ATT CAG ACG GCG CAA TTT GGT TTC CGC AC-3') verwendet wurden, die Aufnahmesequenzen (unterstrichen) enthalten. PLA1 Amo3 enthält auch einen XbaI Restriktionsort. Diese PCR-Fragment wurde mit einem Hochreinigungskit (Roche, Mannheim, Deutschland) gereinigt und direkt in einem pGemt-Vektor (Promega, USA) kloniert. Dieses Plasmid wurde der Ring-PCR-Mutagenese (Jones & Winistofer (1992)) unterworfen, um geeignete Restriktionsorte einzufügen, die eine Klonierung einer CmR/PorA-Promotorkassette erlauben. Die Ring-PCR wurde unter Verwendung der CIRC1-Bgl-(5'-CCT AGA TCT CTC CGC CCC CCA TTG TCG-3') & entweder CIRC1-XH-RBS/2-(5'-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA ATA TAC GGA ATA TGC G-3') oder CIRC2-XHO/2-(5'-CCG CTC GAG ATG AAT ATA CGG AAT-3') Oligonukleotide durchgeführt, die geeignete Restriktionsorte (BglII und XhoI) (unterstrichen) enthalten. Die CmR/PorA-Promotorkassette wurde von dem vorbeschriebenen pUC D15/Omp85-Plasmid amplifiziert, indem die Primer BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') und CM-PORA-3 (5'-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GC-3'), die geeignete Restriktionsorte (BglII und XhoI) (unterstrichen) enthalten, verwendet wurden. Dieses PCR-Fragment wurde in dem mit den Primern CIRC1-Bgl und CICRC1-XH-RBS/2 erhaltenen Ring-PCR-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid kann verwendet werden, um Neisseria meningitidis-Serogruppe B (cps–) und (cps– porA–)-Stämme zu transformieren. Ein Einbau durch eine doppelte Überkreuzungsstelle in der stromaufwärts gelegenen Region von pldA wird die Einfügung des porA-Promotors unmittelbar stromaufwärts von pldA ATG steuern. Eine andere Kassette wurde aus genominscher DNA der rekombinanten Neisseria meningitidis-Serogruppe B (cps–, porA–, D15/Omp85+), indem durch Promotorsubstitution D15/Omp85 überexprimiert wird, amplifiziert. Diese Kassette enthält das cmR-Gen, den porA-Promotor und 400 bp, entsprechend der 5'-flankierenden Sequenz des D15/Omp85-Gens. Es wurde bewiesen, daß diese Sequenz zur Aufregulation der Expression von D15/Omp85 in Neisseria wirksam ist, und sie wird zur Aufregulation der Expression anderer Neisseria-Antigene getestet werden. Die zur Amplifikation verwendeten Primer waren BAD20 und CM-PORA-D15/3 (5'-CGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3'), die XhoI-Restriktionsorte (unterstrichen) enthielten. Dieses PCR-Fragment wurde in dem mit den Primern CIRC1-Bgl und CIRC2-XHO/2 erhaltenen Ring-PCR-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid wird benutzt werden, um die Neisseria meningitidis-Serogruppe B (cps–) und (cps–, porA–)-Stämme zu transformieren. Einbau durch eine doppelte Überkreuzungsstelle in der stromaufwärts gelegenen Region des pldA wird die Einfügung des porA-Promotors 400 bp stromaufwärts des pldA ATGs steuern.
  • Beispiel 15: Aufregulation des N. meningitidis-Serogruppe B-tbpA-Gens durch Promotorsubstitution
  • Ziel dieses Experimentes war es, die endogene Promotorregion des tbpA-Gens durch einen starken porA-Promotor zu ersetzen, um die Erzeugung des TbpA-Antigens aufzuregulieren. Zu diesem Zweck wurde ein Promotor-Substitutionsplasmid künstlich erzeugt, indem die Methodenfolgen der E. coli-Klonierung verwendet wurden. In der privaten Incyte PathoSeq-Datenbank, die den Neisseria meningitidis-Stamm ATCC 13090 enthält, wurde eine DNA-Region (731 bp), die stromaufwärts von der für tbpA codierenden Sequenz gelegen ist, entdeckt (SEQ ID NO: 17). Diese DNA enthält die Sequenz, die für das TbpB-Antigen codiert. Die Gene waren in einem Operon organisiert. Zu diesem Zweck wurden ein DNA-Fragment von 3218 bp, das der 509 bp-flankierenden Region des tbp-Gens entspricht, die 2139 bp tbpB codierende Sequenz, die 87 bp-zwischengenische Sequenz und die 483 ersten Nukleotide der tbpA-codierenden Sequenz von einer genomischen Neisseria meningitidis-Serogruppe B-DNA PCR-amplifiziert, indem die Oligonukleotide BAD16 (5'-GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3') und BAD17 (5'-GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3') verwendet wurden, die Aufnahmesequenzen und die Restriktionsorte NheI und HindIII (unterstrichen) enthalten. Dieses PCR-Fragment wurde mit einem Hochreinigungskit (Boehringer, Mannheim, Deutschland) gereinigt und direkt in einen pGemt-Vektor (Promega, USA) kloniert. Dieses Plasmid wurde der Ring-PCR-Mutagenese (Jones & Winistofer (1992)) unterworfen, um: (i) geeignete Restriktionsorte einzufügen, die eine Klonierung einer CmR/PorA-Promotorkassette erlauben, und (ii) 209 bp der 5'-flankierenden tbpB-Sequenz und der für tbpB codierenden Sequenz zu streichen. Die Ring-PCR wurde unter Verwendung der BAD 18 (5'-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3') & der BAD 19 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3') Oligonukleotide durchgeführt, die geeignete Restriktionsorte XmaI, BglII und XhoI (unterstrichen) enthalten. Die CmR/PorA-Promotorkassette wurde von dem bereits beschriebenen pUC D15/Omp85-Plasmid amplifiziert, indem die Primer BAD21 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAC CCG-3') und BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') die geeignete Restriktionsorte XmaI, SpeI, BglII und XhoI (unterstrichen) enthalten, verwendet wurden. Dieses PCR-Fragment wurde in dem Ring-PCR-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid wird verwendet werden, um Neisseria meningitidis-Serogruppe B (cps–) und (cps– porA–)-Stämme zu transformieren. Ein Einbau durch eine doppelte Überkreuzungsstelle in der stromaufwärts gelegenen Region von tbpA wird die Einfügung des porA-Promotors unmittelbar stromaufwärts von tbpA ATG steuern.
  • Beispiel 16: Aufregulation des N. meningitidis-Serogruppe 8-pilQ-Gens durch Promotorsubstitution
  • Ziel dieses Experimentes war es, die endogene Promotorregion des pilQ-Gens durch einen starken porA-Promotor zu ersetzen, um die Erzeugung des PilQ-Antigens aufzuregulieren. Zu diesem Zweck wurde ein Promotor-Substitutionsplasmid künstlich erzeugt, indem die Methodenfolgen der E. coli-Klonierung verwendet wurden. In der privaten Incyte PathoSeq-Datenbank, die den Neisseria meningitidis-Stamm ATCC 13090 enthält, wurde eine DNA-Region (772 bp), die stromaufwärts von dem für pilQ codierenden Gen gelegen ist, entdeckt (SEQ ID NO: 12). Diese DNA enthält die Sequenz, die für das PilP-Antigen codiert. Das pilQ-Gen ist Teil eines Operons, das wir nicht beeinträchtigen wollten, weil Pilins wesentliche Elemente der Bakterien sind. Der CmR/porA-Promotor wurde stromaufwärts des PilQ-Gens, derselben für die Aufregulation der Expression des pldA-Gens beschriebenen Strategie folgend, eingeführt. Zu diesem Zweck wurden ein DNA-Fragment von 886 bp, das dem 3'-Teil der Gen-pilP-codierenden Sequenz entspricht, die 18 bp-zwischengenische Sequenz und die 392 ersten Nukleotide des pilQ-Gens von einer genomischen Neisseria meningitidis-Serogruppe B-DNA PCR-amplifiziert, indem die Oligonukleotide PQ-rec5-Nhe (5'-CTA GCT AGC GCC GTC TGA ACG ACG CGA AGC CAA AGC-3') und PQ-rec3-Hin (GCC AAG CTT TTC AGA CGG CAC GGT ATC GTC CGA TTC G-3') verwendet wurden, die Aufnahmesequenzen und NheI- und HindIII-Restriktionsorte (unterstrichen) enthalten. Dieses PCR-Fragment wurde direkt in einen pGemt-Vektor (Promega, USA) kloniert. Dieses Plasmid wurde der Ring-PCR-Mutagenese (Jones & Winistofer (1992)) unterworfen, um geeignete Restriktionsorte einzufügen, die eine Klonierung einer CmR/PorA-Promotorkassette erlauben. Die Ring-PCR wurde unter Verwendung der CIRC1-PQ-Bgl-(5'-GGA AGA TCT AAT GGA GTA ATC CTC TTC TTA-3') und entweder der CIRC1-PQ-XHO-(5'-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA TTA CCA AAC TGA CAA AAA TC-3') oder der CIRC2-PQ-X-(5'-CCG CTC GAG ATG AAT ACC AAA CTG ACA AAA ATC-3') Oligonukleotide durchgeführt, die geeignete Restriktionsorte (BglII und XhoI) (unterstrichen) enthalten. Die CmR/PorA-Promotorkassette wurde von dem bereith beschriebenen pUC D15/Omp85-Plasmid amplifiziert, indem die Primer BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') und CM-PORA-3 (5'-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GCA AAC ACC C-3'), die geeignete Restriktionsorte BglII und XhoI (unterstrichen) enthalten, verwendet wurden. Dieses PCR-Fragment wurde in dem mit den Primern CIRCI-PQ-Bgl und CICRC1-PQ-XHO erhaltenen Ring-PCR-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid kann verwendet werden, um Neisseria meningitidis-Serogruppe B (cps–) und (cps– porA–)-Stämme zu transformieren. Ein Einbau durch eine doppelte Überkreuzungsstelle in der stromaufwärts gelegenen Region von pilQ wird die Einfügung des porA-Promotors unmittelbar stromaufwärts von pilQ ATG steuern. Eine andere Kassette wurde aus genomischer DNA der rekombinanten Neisseria meningitidis-Serogruppe B (cps–, porA–, D15/Omp85+), indem durch Promotorsubstitution D15/Omp85 überexprimiert wird, amplifiziert. Diese Kassette enthält das cmR-Gen, den porA-Promotor und 400 bp, entsprechend der 5'-benachbarten Sequenz des D15/Omp85-Gens. Es wurde bewiesen, daß diese Sequenz zur Aufregulation der Expression von D15/Omp85 in Neisseria meningitidis wirksam ist, und sie wird zur Aufregulation der Expression anderer Neisseria-Antigene getestet werden. Die zur Amplifikation verwendeten Primer waren BAD20 und CM-PORA-D153 (5'GGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3'), die XhoI-Restriktionsorte (unterstrichen) enthalten. Dieses PCR-Fragment wurde in dem mit den Primern CIRC1-PQ-Bgl und CIRC2-PQ-X erhaltenen Ring-PCR-Plasmid kloniert. Dieses Plasmid kann benutzt werden, um die Neisseria meningitidis-Serogruppe B (cps–) und (cps–, porA–)-Stämme zu transformieren. Einbau durch eine doppelte Überkreuzungsstelle in der stromaufwärts gelegenen Region von pilQ wird die Einfügung des porA-Promotors 400 bp stromaufwärts des pilQ ATGs steuern.
  • Beispiel 17: Konstruktion einer kanR/sacB-Kassette zur Einführung "reiner", unmarkierter Veränderungen in dem N. meningitidis-Chromosom
  • Ziel diese Experimentes ist es, eine vielseite DNA-Kassette künstlich zu schaffen, die einen selektierbaren Marker für das Positiv-Screenen der Rekombination in dem Chromosom von Neisseria meningitidis (d.h.: kanR-Gen) und einen Gegenselektionsmarker enthält, um die Kassette von dem Chromosom nach Rekombinaiton (d.h.: sacB-Gen) zu entfernen. Durch dieses Verfahren wird jede heterologe DNA, die während der homologen Rekombination eingeführt wurde, von dem Neisseria-Chromosom entfernt werden.
  • Ein DNA-Fragment, das das neoR-Gen und das sacB-Gen enthält, das unter der Kontrolle ihres eigenen Promotors exprimiert wurde, wurde durch Restriktion des pIB 279-Plasmids (Blomfield, I. C., Vaughn, V., Rest, R. F., Eisenstein, B. I (1991), Mol. Microbiol. 5: 1447–57) mit BamHI-Restriktions enzym erhalten. Der Rezipientenvektor wurde von dem bereits beschriebenen pCMK-Plasmid abgeleitet. Das kanR-Gen des pCMK wurde durch Restriktion mit den Enzymen NruI und EcoRV entfernt. Diese Plasmid wurde pCMKs genannt. Die neoR/sacB-Kassette wurde in das pCMKs bei einem BglII-Restriktionsort, der mit den BamHI-Enden vereinbar ist, eingesetzt.
  • Das E. coli beherbergende Plasmid ist nicht in der Lage, in Gegenwart von 2% Zucker in dem Kulturmedium zu wachsen, wobei es die Funktionalität des sacB-Promotors bestätigt. Dieses Plasmid enthält rekombinogene Sequenzen, die die Einfügung der Kassette bei dem porA-Ort in das Chromosom des Neisseria meningitidis-Serogruppe B erlaubt. Rekombinantes Neisseria wurde auf GC-Agarplatten, die 200 μg/ml Kanamycin enthalten, erhalten. Unglücklicherweise war der sacB-Promotor in Neisseria meningitidis nicht funktionell: kein Wachstumsunterschied auf GC-Agarplatten, die 2% Zucker enthalten, wurde beobachtet.
  • Eine neue Kassette, die das sacB-Gen unter der Kontrolle des kanR-Promotors enthält, wurde künstlich geschaffen. Eine Ring-PCR wurde unter Verwendung des Plasmids pUC4K ((Amersham Pharmacia Biotech, USA)) als Matrize mit CIRC-Kan-Nco-(5'-CAT GCC ATG GTT AGA AAA ACT CAT CGA GCA TC-3') & CIRC-Kan-Xba-(5'-CTA GTC TAG ATC AGA ATT GGT TAA TTG GTT G-3') Oligonukleotiden durchgeführt, die NcoI und XbaI Restriktionsorte (unterstrichen) enthalten. Das erhaltene PCR-Fragment wurde Gel-gereinigt, mit NcoI digeriert und mit dem sacB-Gen verbunden, das durch PCR vom pIB279-Plasmid mit dem SAC/NCO/NEW5-(5'-CAT GCC ATG GGA GGA TGA ACG ATG AAC ATC AAA AAG TTT GCA A-3') Oligonukleotid, das einen NcoI-Restriktionsort (unterstrichen) und ein RBS (fett) und ein SAC/NCO/NEW3 (5'-GAT CCC ATG GTT ATT TGT TAA CTG TTA ATT GTC-3) Oligonukleotid, das einen NcoI-Restriktionsort (unterstrichen) enthält, generiert wurde. Die rekombinanten E. coli-Klone können auf ihre Sensitivität auf Agar-Platten, die 2% Zucker enthalten, getestet werden. Die neue kanR/sacB-Kassette kann in pCMKs subkloniert werden und zur Transformierung eines Neisseria meningitidis-Serogruppe B cps-Stammes verwendet werden. Die erworbene Zuckersensitivität wird in Neisseria bestätigt werden. Das pCMKs-Plasmid wird verwendet werden, um das rekombinante kanR/SacB-Neisseria zu transformieren, um die gesamte Kassette zu entfernen, die am porA-Ort in das Chromosom eingefügt war. Reines rekombinantes Neisseria wird auf GC-Agarplatten, die 2% Zucker enthalten, erhalten werden.
  • Beispiel 18: Verwendung kleiner rekombinogener Sequenzen (43 bp), die die homologe Rekombination in dem Chromosom von Neisseria meningitidis ermöglichen
  • Ziel des Experimentes ist es, kleine rekombinogene Sequenzen (43 bp) zu verwenden, um die Einfügungen, Veränderungen oder Entfernungen im Chromosom von Neisseria zu lenken. Das Erreichen des Ziels dieses Experimentes wird erheblich die zukünftige Arbeit erleichtern, im einzelnen die Vermeidung von Subklonierungsschritten homologer Sequenzen in E. coli (rekombinogene Sequenzen von 43 bp können leicht in PCR-Amplifikationsprimer zugegeben werden). Das kanR-Gen wurde vom Plasmid pUC4K mit Oligonukleotiden Kan-PorA-5 (5'-GCC GTC TGA ACC CGT CAT TCC CGC GCA GGC GGG AAT CCA GTC CGT TCA GTT TCG GGA AAG CCA CGT TGT GTC-3'), das 43 bp, das homolog zur 5'-Nachbarsequenz des NmB porA-Gens (fett) ist und eine Aufnahmesequenz (unterstrichen) enthält, und Kan-PorA-3 (5'-TTC AGA CGG CGC AGC AGG AAT TTA TCG GAA ATA ACT GAA ACC GAA CAG ACT AGG CTG AGG TCT GCC TCG-3'), das 43 bp, das homolog zu der 3'-Nachbarsequenz des NmB porA-Gens (fett) ist, und eine Aufnahmesequenz (unterstrichen) enthält, PCR-amplifiziert. Das erhaltene 1300 bp-DNA-Fragment wurde im pGemT-Vektor (Promega, USA) kloniert. Dieses Plasmid kann zur Transformation eines Neisseria meningitidis-Serogrupp B-cps-Stammes verwendet werden. Rekombinantes Neisseria wird auf GC-Platten, die 200 μg/ml Kanamycin enthalten, erhalten werden. Einbauten, die von einer doppelten Überkreuzungsstelle bei dem porA-Ort herrühren, werden durch PCR mit den bereits früher beschriebenen Primer PPA1 und PPA2 gescreent werden.
  • Beispiel 19: Aktiver Schutz von Mäusen, die mit WT und rekombinanten Neisseria meningitidis-Tröpfchen immunisiert wurden
  • Die Tiere wurden dreimal (IP-Route) mit 5 μg unterschiedlicher OMVs, die an Al(OH)3 adsorbiert waren, an den Tagen 0, 14 und 28 immunisiert. Die Tröpfchen wurden an den Tagen 28 (Tag 14 post II) und 35 (Tag 7 post III) verabreicht, und sie wurden am Tag 35 (IP-Route) abgesetzt. Die geeignete Dosis betrug 20 × LD50 (~107 CFU/Maus). Die Mortalitätsrate wurde für 7 Tage nach dem Absetzen beobachtet.
  • Die injizierten OMVs waren:
    Gruppe 1: Cps–, PorA+-Bläschen
    Gruppe 2: Cps–, PorA– Bläschen
    Gruppe 3: Cps–, PorA–, NspA+-Bläschen
    Gruppe 4: Cps–, PorA–, Omp85+-Bläschen
    Gruppe 5: Cps–, PorA–, Hsf+-Bläschen
  • 15 erläutert das Muster dieser OMVs die durch analysiertes SDS Seite 1 (Coomassie-Färben) analysiert wurden.
  • 24 Stunden nach dem Absetzen lag eine 100%ige Mortalität (8/8) in der negativen Kontrollgruppe vor (nur mit Al(OH)3 immunisiert), während Mäuse, die mit 5 unterschiedlichen OMVs-Zubereitungen immunisiert wurden noch am Leben sind (7 von 8/8 Mäusen überlebten). Krankheit wurde auch während der 7 Tage beobachtet, und die mit NSPA überexprimierten Bläschen immunisierten Mäuse erschienen weniger krank als die der anderen Gruppen. Eine PorA-Gegenwart in PorA+-Bläschen wird wahrscheinlich extensiven Schutz gegenüber einer Infektion eines homologen Stammes verleihen. Jedoch soll ein durch PorA– überregulierte Bläschen induzierter Schutz wahrscheinlich sein, wenigstens bis zu einem gewissen Maß, aufgrund der Gegenwart einer gesteigerten Menge von NspA, Omp85 oder Hsf.
  • Beispiel 20: Immunogenität rekombinanter Bläschen, gemessen durch Ganzzellen und spezifische ELISA-Verfahren
  • Um die Geeignetheit der Antikörper zu messen, die Antigene, die an der MenB-Zelloberfläche gegenwärtig sind, zu erkennen, wurden gepoolte Mäuseseren (aus Beispiel 19) durch Ganzzellen-ELISA (indem mittels Tetracyclin inaktivierte Zellen verwendet wurden) getestet, und die Titer wurden als Mittelpunktstiter exprimiert. Alle Typen der Bläschen-Antikörper induzieren einen hohen Ganzzellen-Ab-Titer, während die negative Kontrollgruppe klar negativ war.
  • Figure 00780001
  • Die spezifische Ab-Antwort auf das vorhandene rekombinante HSF-Protein wurde ausgeführt. Mikroplatten wurden mit 1 μg/ml eines HSF-Moleküls voller Länge beschichtet.
  • Die Ergebnisse, die in 16 erläutert sind, zeigen daß, hier eine gute spezifische HSF-Antwort vorhanden war, wenn HSF überexprimierte OMVs verwendet wurden, um die Mäuse zu immunisieren (indem gereinigtes rekombinantes HSF auf Platten verwendet wird). Die HSF überexprimierten Bläschen induzieren einen guten Gehalt spezifischer Antikörper.
  • SEQ ID NO: 1 Nukleotidsequenz des pCMK(+)-Vektors
    Figure 00790001
  • Figure 00800001
  • SEQ ID NO: 2 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (997 bp) stromaufwärts des NspA-Gens in dem Neisseria-meningitidis-Serogruppe-A-Stamm Z2491
    Figure 00800002
  • SEQ ID NO: 3 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des D15/Omp85-Gens in dem Neisseria-meningitidis-Serogruppe-B-Stamm ATCC13090
    Figure 00810001
  • SEQ ID NO: 4 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Hsf-ähnlichen Gens von Neisseria-meningitidis
    Figure 00810002
  • SEQ ID NO: 5 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (772 bp) stromaufwärts des PilQ-Gens von Neisseria-meningitidis
    Figure 00810003
  • SEQ ID NO: 6 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Hap-Gens von dem Neisseria-meningitidis
    Figure 00820001
  • SEQ ID NO: 7 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (924 bp) stromaufwärts des NspA-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B) (ATCC13090)
    Figure 00820002
  • SEQ ID NO: 8 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des FrpB-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00820003
  • SEQ ID NO: 9 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des FrpA-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00820004
  • SEQ ID NO: 10 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des FrpC-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00830001
  • SEQ ID NO: 11 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Omp85-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00830002
  • SEQ ID NO: 12 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (772 bp) stromaufwärts des PilQ-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B) (ATCC13090)
    Figure 00830003
  • SEQ ID NO: 13 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Hsf-artigen Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00830004
  • SEQ ID NO: 14 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Hap-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00840001
  • SEQ ID NO: 15 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des LbpA-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00840002
  • SEQ ID NO: 16 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des LbpB-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-A)
    Figure 00840003
  • SEQ ID NO: 17 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (731 bp) stromaufwärts des TbpA-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B) (ATCC113090)
    Figure 00840004
  • SEQ ID NO: 18 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (373 bp) stromaufwärts des OmplA-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B) (ATCC13090)
    Figure 00850001
  • SEQ ID NO: 19 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Pla1-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00850002
  • SEQ ID NO: 20 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des FhaB-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00850003
  • SEQ ID NO: 21 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Lipo02-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B) (ATCC 13090)
    Figure 00850004
  • SEQ ID NO: 22 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Tbp2-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00860001
  • SEQ ID NO: 23 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des PorA-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00860002
  • SEQ ID NO: 24 Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B) PorA-Promotor-Region
    Figure 00860003
  • SEQ ID NO: 25 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des PorB-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-A)
    Figure 00860004
  • SEQ ID NO: 26 Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B) PorB-Promotor-Region
    Figure 00870001
  • SEQ ID NO: 27 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des siaABC-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00870002
  • SEQ ID NO: 28 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lgt-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00870003
  • SEQ ID NO: 29 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des TbpB-Gens von Neisseria-meningitidis (Stamm MC58)
    Figure 00870004
  • SEQ ID NO: 30 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des opc-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-A)
    Figure 00880001
  • SEQ ID NO: 31 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des siaD-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00880002
  • SEQ ID NO: 32 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des ctrA-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00880003
  • SEQ ID NO: 33 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lgtF-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-A)
    Figure 00880004
  • SEQ ID NO: 34 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lgtB-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00890001
  • SEQ ID NO: 35 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lst-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00890002
  • SEQ ID NO: 36 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des msbB-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00890003
  • SEQ ID NO: 37 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des htrB-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00900001
  • SEQ ID NO: 38 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des MltA-Gens von Neisseria-meningitidis (Serogruppe-B)
    Figure 00900002
  • SEQ ID NO: 39 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des ompCD-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00900003
  • SEQ ID NO: 40 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des copB-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00900004
  • Figure 00910001
  • SEQ ID NO: 41 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des D15-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00910002
  • SEQ ID NO: 42 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des omplA-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00910003
  • SEQ ID NO: 43 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des hly3-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00920001
  • SEQ ID NO: 44 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lbpA-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00920002
  • SEQ ID NO: 45 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lbpB-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00920003
  • SEQ ID NO: 46 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des tbpB-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00930001
  • SEQ ID NO: 47 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des tbpA-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00930002
  • SEQ ID NO: 48 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des ompE-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00930003
  • SEQ ID NO: 49 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des uspa1-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00940001
  • SEQ ID NO: 50 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des uspa2-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00940002
  • SEQ ID NO: 51 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des omp21-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00940003
  • SEQ ID NO: 52 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des omp106-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00950001
  • SEQ ID NO: 53 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des HtrB-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00950002
  • SEQ ID NO: 54 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des MsbB-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00950003
  • SEQ ID NO: 55 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des PilQ-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00960001
  • SEQ ID NO: 56 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lipo18-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00960002
  • SEQ ID NO: 57 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lipo11-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00960003
  • SEQ ID NO: 58 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lipo10-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00970001
  • SEQ ID NO: 59 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lipo2-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00970002
  • SEQ ID NO: 60 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lipo7-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00970003
  • SEQ ID NO: 61 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des lipo6-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00980001
  • SEQ ID NO: 62 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des P6-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 00980002
  • SEQ ID NO: 63 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des MsbB-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 00980003
  • SEQ ID NO: 64 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des HtrB-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 00990001
  • SEQ ID NO: 65 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Protein D-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 00990002
  • SEQ ID NO: 66 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Hin47-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 00990003
  • SEQ ID NO: 67 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des P5-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 01000001
  • SEQ ID NO: 68 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des D15-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 01000002
  • SEQ ID NO: 69 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des Omp26-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 01000003
  • SEQ ID NO: 70 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des P6-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 01010001
  • SEQ ID NO: 71 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des TbpA-Gens von Haemophilus influenzae (nicht typisierbar)
    Figure 01010002
  • SEQ ID NO: 72 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des TbpB-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 01010003
  • SEQ ID NO: 73 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des HifA(pilin)-Gens von Haemophilus influenzae (LKP Serotyp 1-Genom)
    Figure 01020001
  • SEQ ID NO: 74 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des HifE-Gens Typ pillin) von Haemophilus influenzae (LKP Serotyp 1-Genom)
    Figure 01020002
  • SEQ ID NO: 75 Nukleotidsequenz einer DNA-Region (1000 bp) stromaufwärts des P2-Gens von Haemophilus influenzae (HiRd)
    Figure 01020003
  • SEQ ID NO: 76 Nukleotidsequenz einer codierenden DNA-Region (teilweise), des HtrB-Gens von Moraxella catarrhalis
    Figure 01030001
  • Proteinsequenz: 25% Identität und 35% Ähnlichkeit mit HtrB von E. coli
    Figure 01030002
  • SEQ ID NO: 77 Nukleotidsequenz einer codierenden DNA-Region des Neisseria(meningococcus B)-HtrB-Gens
    Figure 01030003
  • Proteinsequenz – 30% Identität und 38% Ähnlichkeit mit Htrb E. coli.
    Figure 01030004
  • SEQ ID NO: 78 Nukleotidsequenz einer codierenden DNA-Region des Haemophilus influenzae(nicht typisierbar)-HtrB-Gens
    Figure 01040001
  • Proteinsequenz – 57% Identität und 66% Ähnlichkeit mit HtrB E. coli
    Figure 01040002
  • SEQ ID NO: 79 Nukleotidsequenz einer DNA, die für eine Region des Haemophilus influenzae(nicht typisierbar)-MsB-Gens codiert
    Figure 01040003
  • Proteinsequenz – 45% Identität und 56% Ähnlichkeit mit Msb E. coli
    Figure 01040004
  • SEQ ID NO: 80 Nukleotidsequenz einer DNA, die für eine Region des Moraxella catarrhalis MsbB-Gens codiert
    Figure 01050001
  • Proteinsequenz – 28% Identität und 37% Ähnlichkeit mit MsbB von E. coli
    Figure 01050002
  • SEQ ID NO: 81 Nukleotidsequenz einer DNA, die für eine Region des Neisseria (meningococcus B) MsbB-Gens codiert
    Figure 01050003
  • Proteinsequenz – 25% Identität und 36% Identität mit MsbB E. coli
    Figure 01050004
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 01060001
  • Figure 01070001
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
  • Figure 01100001
  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • Figure 01140001
  • Figure 01150001
  • Figure 01160001
  • Figure 01170001
  • Figure 01180001
  • Figure 01190001
  • Figure 01200001
  • Figure 01210001
  • Figure 01220001
  • Figure 01230001
  • Figure 01240001
  • Figure 01250001
  • Figure 01260001
  • Figure 01270001
  • Figure 01280001
  • Figure 01290001
  • Figure 01300001
  • Figure 01310001
  • Figure 01320001
  • Figure 01330001
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  • Figure 01630001

Claims (26)

  1. Gentechnisch manipulierte Bläschenzubereitung, die aus einem modifizierten Neisseria meningitidis-Stamm isoliert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung durch Einsetzen des folgenden Verfahrens erhältlich ist: a) ein Verfahren der Reduzierung von immundominanten variablen oder nicht-protektiven Antigenen innerhalb der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Manipulation eines bakteriellen Stamms zur Erzeugung von weniger oder keinem PorA-Antigen und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst.
  2. Gentechnisch manipulierte Bläschenzubereitung, die aus einem modifizierten Moraxella catarrhalis-Stamm isoliert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung durch Einsetzen des folgenden Verfahrens erhältlich ist: a) ein Verfahren der Reduzierung von immundominanten variablen oder nicht-protektiven Antigenen innerhalb der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Bestimmung der Identität eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stamms zur Erzeugung von weniger oder keinem Antigen und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst, worin eines oder mehrere der Antigene aus einer Liste ausgewählt sind, die aus CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA und LbpB besteht.
  3. Gentechnisch manipulierte Bläschenzubereitung, die aus einem modifizierten Haemophilus influenzae-Stamm isoliert ist, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung durch Einsetzen des folgenden Verfahrens erhältlich ist: a) ein Verfahren der Reduzierung von immundominanten variablen oder nicht-protektiven Antigenen innerhalb der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Bestimmung der Identität eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stamms zur Erzeugung von weniger oder keinem Antigen und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst, worin eines oder mehrere der Antigene aus einer Liste ausgewählt sind, die aus P2, P5, Hif, IgA1-Protease, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA und TbpB besteht.
  4. Gentechnisch manipulierte Bläschenzubereitung gemäß Ansprüchen 1–3, worin die Zubereitung durch Einsetzen eines oder mehrerer weiterer Verfahren erhältlich ist, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: b) ein Verfahren der Aufregulation der Expression von protektiven OMP-Antigenen innerhalb der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stamms, um eine stärkere Promotorsequenz stromaufwärts eines Gens einzuführen, das das Antigen kodiert, so dass das Gen mit einer höheren Stärke als im nicht-modifizierten Bläschen exprimiert wird, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst; c) ein Verfahren der Aufregulation der bedingt-exprimierten, protektiven OMP-Antigene innerhalb der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stamms, um die repressiven Kontrollmechanismen seiner Expression zu entfernen, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst; d) ein Verfahren der Modifizierung des Lipid A-Teils von bakteriellem LPS innerhalb der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid A-Teil von LPS toxisch zu machen, der Manipulation eines bakteriellen Stamms, um die Expression des Gens zu reduzieren oder auszuschalten, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst; e) ein Verfahren der Modifizierung des Lipid A-Teils von bakteriellem LPS innerhalb der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines Gens, das daran beteiligt ist, den Lipid A-Teil von LPS weniger toxisch zu machen, der Manipulation eines bakteriellen Stamms, um eine stärkere Promotersequenz stromaufwärts des Gens einzuführen, so dass das Gen mit einer höheren Stärke als im nicht-modifizierten Bläschen exprimiert wird, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst; f) ein Verfahren der Reduzierung von Lipid A-Toxizität innerhalb der Bläschenzubereitung und der Erhöhung der Mengen an protektiven Antigenen, das die Schritte der Manipulation des Chromosoms eines bakteriellen Stamms, um ein Gen einzuführen, das ein Polymyxin A-Peptid oder ein Derivat oder Analogon davon kodiert, fusioniert an ein protektives Antigen, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst; g) ein Verfahren der Erzeugung von konservierten OMP-Antigenen auf der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stammes, um variable Regionen eines Gens zu deletieren, das das Antigen kodiert, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst; h) ein Verfahren der Reduzierung der Expression innerhalb der Bläschenzubereitung eines Antigens, das eine strukturelle Ähnlichkeit mit einer humanen Struktur teilt und eine Autoimmunreaktion in Menschen induzieren kann, umfassend die Schritte der Identifizierung eines Gens, das an der Biosynthese des Antigens beteiligt ist, der Manipulation eines bakteriellen Stamms, um die Expression des Gens zu reduzieren oder auszuschalten, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm; oder i) ein Verfahren der Aufregulation der Expression von protektiven OMP-Antigenen innerhalb der Bläschenzubereitung, das die Schritte der Identifizierung eines solchen Antigens, der Manipulation eines bakteriellen Stamms, um in das Chromosom ein oder mehrere weitere Kopien eines Gens einzuführen, das das Antigen kodiert, das durch eine heterologe stärkere Promotersequenz kontrolliert wird, und der Herstellung von Bläschen aus dem Stamm umfasst.
  5. Bläschenzubereitung gemäß Ansprüchen 1 bis 4, worin die Manipulationsschritte der Verfahren a), b), c), d), e), h) und i) durch homologe Rekombinationsereignisse zwischen einer Sequenz aus wenigsten 30 Nukleotiden auf dem bakteriellen Chromosom und einer Sequenz aus wenigstens 30 Nukleotiden auf einem innerhalb des Stamms transformierten Vektor durchgeführt wird.
  6. Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 5, worin die Manipulationsschritte durch homologe Doppel-Cross-Over-Rekombinationsereignisse zwischen zwei Sequenzen aus wenigsten 30 Nukleotiden auf dem bakteriellen Chromosom, getrennt durch Nukleotidsequenz „X", und zwei Sequenzen aus wenigstens 30 Nukleotiden auf einem innerhalb des Stamms transformierten Vektor, getrennt durch Nukleotidsequenz „Y", durchgeführt werden, worin während des Rekombinationsereignisses X und Y ausgetauscht werden.
  7. Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 6, worin die zwei Nukleotidsequenzen von etwa gleicher Länge sind und worin der Vektor ein lineares DNA-Molekül ist.
  8. Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 6 oder 7, worin die Rekombinationsereignisse der Verfahren a), b), c), d), e) und h) innerhalb der Region des Chromosoms 1000 bp stromaufwärts des Startkodons des Gens von Interesse durchgeführt werden.
  9. Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 8, worin für Verfahren a), d) oder h) die Nukleotidsequenz X einen Teil der Promoterregion des Gens umfasst und die Nukleotidsequenz Y entweder eine schwache Promoterregion oder keine Promoterregion umfasst.
  10. Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 6 oder 7, worin die Rekombinationsereignisse der Verfahren a), d) und h) so durchgeführt werden, dass die Nukleotidsequenz X einen Teil der kodierenden Sequenz des Gens von Interesse umfasst.
  11. Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 6 oder 7, worin die Rekombinationsereignisse von Verfahren i) so durchgeführt werden, dass die Nukleotidsequenz Y die weitere Kopie des Gens innerhalb einer Expressionskassette umfasst.
  12. Bläschenzubereitung aus Neisseria meningitidis gemäß Anspruch 4, erhältlich durch Einsetzen von Verfahren b) und/oder i), worin ein oder mehrere Gene aus einer Liste aufreguliert sind, die aus NspA, Hsf-ähnlich, Hap, PorB, OMP85, PilQ, PldA, FrpB, TbpA, TbpB, FrpA, FrpC, LbpA, LbpB, FhaB, HasR, lipo02, Tbp2 (lipo28), MltA (lipo30) und ctrA besteht.
  13. Bläschenzubereitung aus Neisseria meningitidis gemäß Anspruch 4 oder 12, erhältlich durch Einsetzen von zumindest Verfahren h), worin ein oder mehrere Gene aus einer Liste abreguliert sind, die aus galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC und ctrD besteht.
  14. Bläschenzubereitung aus Moraxella catarrhalis gemäß Anspruch 4, erhältlich durch Einsetzen von Verfahren b) und/oder i), worin ein oder mehrere Gene aus einer Liste aufreguliert sind, die aus OMP106, HasR, PilQ, OMP85, lipo06, lipo10, lipo11, lipo18, P6, ompCD, CopB, D15, OmplA1, Hly3, LbpA, LbpB, TbpA, TbpB, OmpE, UspA1, UspA2 und Omp21 besteht.
  15. Bläschenzubereitung aus Haemophilus influenzae gemäß Anspruch 4, erhältlich durch Einsetzen von Verfahren b) und/oder i), worin ein oder mehrere Gene aus einer Liste aufreguliert sind, die aus D15, P6, TbpA, TbpB, P2, P5, OMP26, HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 und Hif besteht.
  16. Impfstoff, der die Bläschenzubereitung gemäß Ansprüchen 1–15 und einen pharmazeutisch akzeptablen Exzipienten umfasst.
  17. Meningokokken-Impfstoff, der die Bläschenzubereitung gemäß Ansprüchen 1, 4, 12 oder 13 und ein oder mehrere einfache oder konjugierte Meningokokken-Kapselpolysaccharide, ausgewählt aus den Serotypen A, C, Y oder W, umfasst.
  18. Meningitis-Impfstoff, der die Zubereitung gemäß Ansprüchen 1, 4, 12 oder 13, ein konjugiertes H. influenzae b-Kapselpolysaccharid und ein oder mehrere einfache oder konjugierte Pneumokokken-Kapselpolysaccharide umfasst.
  19. Otitis media-Impfstoff, der die Bläschenzubereitung gemäß Ansprüchen 2, 4 oder 14 und ein oder mehrere einfache oder konjugierte Pneumokokken-Kapselpolysaccharide und ein oder mehrere Antigene, die einen Wirt gegen nicht-typisierbare H. influenzae schützen können, umfasst.
  20. Otitis media-Impfstoff, der die Bläschenzubereitung gemäß Ansprüchen 3, 4 oder 15 und ein oder mehrere einfache oder konjugierte Pneumokokken-Polysaccharide und ein oder mehrere Antigene, die einen Wirt gegen Moraxella catarrhalis-Infektion schützen können, umfasst.
  21. Otitis media-Impfstoff gemäß Anspruch 19 oder 20, worin der Impfstoff zusätzlich ein oder mehrere Proteinantigene, die einen Wirt gegen Streptococcus pneumoniae schützen können, und/oder ein oder mehrere Antigene, die einen Wirt gegen RSV schützen können, und/oder ein oder mehrere Antigene, die einen Wirt gegen Influenzavirus schützen können, umfasst.
  22. Modifizierter Gram-negativer Bakterienstamm, aus dem die Bläschenzubereitung gemäß Ansprüchen 1–15 hergestellt ist.
  23. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs, das die Schritte der Erzeugung des Impfstoffs aus dem modifizierten Gram-negativen Bakterienstamm gemäß Anspruch 22 umfasst.
  24. Verwendung der Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 1, 12 oder 13 in der Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines menschlichen Wirtes gegen eine durch Infektion mit Neisseria meningitidis verursachte Erkrankung.
  25. Verwendung der Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 2 oder 14 in der Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines menschlichen Wirtes gegen eine durch Infektion mit Moraxella catarrhalis verursachte Erkrankung.
  26. Verwendung der Bläschenzubereitung gemäß Anspruch 3 oder 15 in der Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines menschlichen Wirtes gegen eine durch Infektion mit Haemophilus influenzae verursachte Erkrankung.
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