CN1377415A - 疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种适于儿科使用的免疫保护性且无毒的革兰氏阴性囊泡疫苗。产生此囊泡的革兰氏阴性菌的例子是脑膜炎奈瑟氏菌,粘膜炎莫拉氏菌和流感嗜血杆菌。本发明的囊泡通过一或多个细菌染色体的遗传改变被改进,包括保护性抗原的上调,免疫显性非保护性抗原的下调,以及LPS的类脂A部分的脱毒。

Description

疫苗组合物
发明领域
本发明涉及革兰氏阴性细菌疫苗组合物，其制备以及此组合物在药物中的应用。更具体的，本发明涉及新的外膜小泡(或囊泡)疫苗领域，以及赋予这些疫苗更有效和安全的有益方法。
发明背景
革兰氏阴性细菌通过两个连续的膜结构层与外部介质分隔。这些结构是指细胞质膜和外膜(OM)，二者的结构和功能均有区别。外膜在病原菌和其宿主的相互作用中起到重要的作用。所以，表面暴露的细菌的分子是宿主免疫应答的重要靶点，使得外膜组分有望用来提供疫苗、诊断和治疗剂。
全细胞细菌疫苗(灭活或减毒的)具有在其自然微环境中提供多重抗原的优点。此方法的缺点为由细菌组分例如内毒素和肽聚糖片段诱导产生的副作用。另一方面，含有纯化的来自外膜的组分的无细胞亚单位疫苗仅提供有限的保护且不提供对宿主免疫系统的适当的抗原。
蛋白，磷脂和脂多糖为所有革兰氏阴性菌的外膜中的发现的三种主要的成分。这三种成分不对称分布：膜磷脂(大部分在内部小叶)，脂肪寡糖(只存在于外部小叶)以及蛋白(内部和外部小叶脂蛋白，整合或多中心膜蛋白)。对于很多种影响人类健康的细菌病原体而言，脂多糖以及外层膜蛋白表现免疫原性并且能够通过免疫预防相应的疾病。
革兰氏阴性细菌OM是动态可变的且，根据环境条件的不同进行剧烈的形态变化。在这些变化中，外层膜泡或称作″囊泡″的形成已被深入研究并且很多革兰氏阴性细菌都有这样的记载(Zhou，L et al.1998.FEMS Microbiol.Lett.163：223-228)。在这些记载中，据报道产生囊泡的细菌病原体的不完全记载包括：百日咳博德特氏杆菌(Bordetella pertussis)，布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)，袋鼠疏螺旋体(Borrelia melitensis)，绵羊布鲁氏菌(Brucella ovis)，鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)，砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，大肠杆菌(Escherichia coli)，流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)，淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)。虽然产生OM膜泡的生化机制尚不完全明了，但是这些外层膜泡已被广泛的研究因为它们提供了一种有力的方法从其天然生物体中提取外层膜蛋白制备物。在上下文中，外层膜蛋白制备物的应用的目标在于开发疫苗抗奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌和衣原体。此外，外层膜囊泡结合复合蛋白以及其可能赋予抗种内变种的延展保护性的非蛋白抗原。
与其它更广泛的被应用的细菌疫苗的类型(完整的细胞细菌和纯化的亚单位疫苗)相比较，发明人表明了外层膜囊泡疫苗(如以特定的方式修饰)可以为理想的方式。
细菌亚单位疫苗的广泛应用使得研究集中在已被发现对疫苗应用有用的细菌表面蛋白上[例如百日咳博德特氏杆菌pertactin]。这些蛋白与细菌外膜松散结合且可被纯化自培养基上清液或很容易的提取自细菌细胞。然而，也显示结构的，整合的外膜蛋白也是保护性的抗原。脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的例子为PorA；流感嗜血杆菌的例子为D15；粘膜炎莫拉氏菌的例子为OMP CD；铜绿假单胞菌的例子为OMP F。然而这些蛋白具有显著的特异性结构特征，特定的复合两亲β-折叠，使得其直接被用作纯化的(重组的)亚单位疫苗复杂化。
此外，很显然需要复合成分的疫苗(依据细菌表面蛋白和整合的膜蛋白)以提供适当的的保护水平。例如，如为百日咳博德特氏杆菌亚单位疫苗，复合疫苗优于单成分或二成分疫苗。
为了将整合的外层膜蛋白结合到此种亚单位产物中，蛋白的天然(或接近天然的)构象折叠必须存在于产物中来产生有用的免疫学作用。分泌的外层膜小泡或囊泡的用途可为较好的解决包括保护性的整合膜蛋白到亚单位疫苗同时确保其适当地折叠问题的方法。
脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(menB)分泌足够量的外层膜疱来满足其工业化规模的生产。这种来自自然产生的menB菌株的多成分外膜蛋白疫苗已被发现有效的保护患menB疾病的十几岁的少年且已在拉丁美洲注册。可选择的制备外膜蛋白小泡的方法是通过细菌细胞的表面活性剂提取法(EP 11243)。
可由其制备囊泡疫苗的细菌的种类如下。
脑膜炎奈瑟氏菌
脑膜炎奈瑟氏菌是一种革兰氏阴性菌，经常分离自人上呼吸道。其通常引起侵染性细菌病例如菌血症和脑膜炎。脑膜炎球菌疾病的发生率显示地域季节性以及每年之间的差异(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.；Clin.Microbiol.Rev.2(增刊)，S18-S24，1989).。大多数温带国家的疾病取决于血清型B菌株且发生率在1-10/100,000/年总人口之间变化，有时达到较高的值(Kaczmarski，E.B.(1997)，Commun.Dis.Rep.Rev.7：R55-9，1995；Scholten，R.J.P.M.，Bijlmer，H.A.，Poolman，J.T.et al.Clin.Infect.Dis.16：237-246，1993；Cruz，C.，Pavez，G.，Aguilar，E.，et al.Epidemiol.Infect.105：119-126，1990)。婴儿和十几岁的少年两个高危人群的年龄特异性的发生率达到较高的水平。
血清型A脑膜炎球菌引起的传染病主要发生在中非，有时高达1000/100,000/年(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.Clin.Microbiol.Rev.2(增刊)，S18-S24，1989)。几乎所有的脑膜炎球菌性疾病由血清型A，B，C，W-135和Y粘膜炎球菌引起。一种四价的A，C，W-135，Y荚膜多糖疫苗可以被获得(Armand，J.，Arminjon，F.，Mynard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand.10：335-339，1982)。
目前，多糖疫苗通常通过化学结合其到载体蛋白上的方式被改进(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.，et al.JAMA 275：1499-1503，1996)。一种血清型B疫苗没有被采用，因为B荚膜多糖是非免疫原性的，最可能是因为其与宿主成分具有结构相似性(Wyle，F.A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.et al.J.Infect.Dis.126：514-522，1972；Finne，J.M.，Leinonen，M.，Makela，
P.M.Lancet ii.：355-357，1983)。
很多年来，努力开发基于脑膜炎球菌外膜的疫苗已成为人们的焦点(de Moraes，J.C.，Perkins，B.，Camargo，M.C.et al.Lancet 340：1074-1078，1992；Bjune，G.，Hoiby，E.A.Gronnesby，J.K.et al.338：1093-1096，1991)。此种疫苗在年龄较大的小孩(＞4岁)和青少年中具有57％-85％的效果。大多数的这些效果试验用获自野生型的脑膜炎奈瑟氏菌B菌株的OMV(外膜小泡，通过从囊泡缺失LPS来获得)来进行。
很多细菌外膜成分存在于这些疫苗中，例如PorA，PorB，Rmp，Opc，Opa，FrpB且这些所观察到的保护性的成分的作用仍需要进一步的明确。其他的细菌外膜成分已被明确(通过动物或人抗体)为可能与诱导保护性免疫有关，例如TbpB，NspA(Martin，D.，Cadieux，N.，Hamel，J.，Brodeux，B.R.，J.Exp.Med.185：1173-1183，1997；Lissolo，L.，Maitre-Wilmotte，C.，Dumas，p.et al.，Inf.Immun.63：884890，1995)。保护性免疫的机制包括抗体介导的杀菌活性和调理吞噬。
脑膜炎奈瑟氏菌感染的频率在过去的几十年间突然地增加。此取决于复合抗生素抗性菌株的出现，和增加的取决于增加的社会活动的暴露(例如游泳池或电影院)。因为分离对一些或所有的标准抗生素有抗性的脑膜炎奈瑟氏菌菌株已不再罕见。这种现象产生对新的抗微生物药物，疫苗，药物筛选方法，以及此种微生物的诊断方法的尚待满足的需求。
粘膜炎莫拉氏菌
粘膜炎莫拉氏菌(也称为粘膜炎布兰汉氏菌)是一种革兰氏阴性菌，通常分离自人上呼吸道。其是引起一些病症的原因，主要的一种是婴儿和小孩的中耳炎，以及成年人的肺炎。其也引起鼻窦炎，医院内感染以及，偶尔引起侵入性疾病。
杀菌抗体已在大多数检验无病的成人中被鉴定(Chapman，AJ et al.(1985)J.Infect.Dis.151：878)。粘膜炎莫拉氏菌菌株抗血清杀菌活性的能力各异：通常，分离自患病个体的比单纯定居的更具抗性(Hol，C et al.(1993)Lancet 341：1281，Jordan，KL et al.(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A)：28S)。血清抗性因此被认为是细菌的毒性因子。调理活性已在患过中耳炎恢复的小孩的血清中被观察到。
这些作为人体中不同的免疫应答的靶的抗原除了84kDa蛋白OMPB1尚未被鉴定，OMP B1的表达被铁调控，且被肺炎患者(Sethi，S，et al.(1995)Infect.Immun.63：1516)，UspA1和UspA2患者(Chen D.et al.(1999)，Infect.Immun.67：1310)的血清识别。
其它的一些存在于粘膜炎莫拉氏菌表面的膜蛋白已被通过生化方法检测其在诱导保护性免疫中的可能性(参见Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60：267)。在一个小鼠肺炎模型中，产生抵抗肺炎(UspA，CopB)的抗体的存在使得肺感染的恢复加。另一种多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中大量存在，且与铜绿假单胞菌的孔蛋白具有同源性，其中的孔蛋白已被验证在动物模型中有效的抵抗细菌。
粘膜炎莫拉氏菌产生外膜小泡(囊泡)。这些囊泡已被通过不同的方法分离或提取(Murphy T.F.，Loeb M.R.1989.Microb.Pathog.6：159-174；Unhanand M.，Maciver，I.，Ramillo O.，Arencibia-Mireles O.，Argyle J.C.，McCracken G.H.Jr.，Hansen E.J.1992.J.Infect.Dis.165：644-650)。这种囊泡制剂的保护能力已在消除粘膜炎莫拉氏菌肺炎的小鼠模型试验中测试。在此模型中显示了囊泡疫苗的主动免疫或抗囊泡抗体的被动转移诱导显著的保护(Maciver I.，Unhanand M.，McCracken G.H.Jr，Hansen，E.J.1993.J.Infect.Dis.168：469-472)。
流感嗜血杆菌
流感嗜血杆菌是一种不能游动的革兰氏阴性菌。人类是其唯一的天然宿主。流感嗜血杆菌通常依据其多糖荚膜被分类。六种从“a”到“f”的不同的荚膜类型已被鉴定。不能与抗六种血清型之一的抗血清结合的分离物被归类于非典型的，且不表达荚膜。
流感嗜血杆菌b(Hib)与其它的类型明显的不同，其主要引起细菌脑膜炎和全身性疾病。流感嗜血杆菌的非典型菌株(NTHi)仅仅偶尔分离于患全身性疾病患者的血液中。NTHi通常引起肺炎，慢性支气管炎的恶化，鼻窦炎和中耳炎。NTHi菌株通过克隆分析鉴定证明具有很大的变异性，而Hib菌株则具有更多的同源性。
流感嗜血杆菌的各种蛋白已显示与致病有关或已显示在动物模型中接种疫苗时具有保护性。
NTHi对人鼻咽上皮细胞的粘附已被报道(Read RC.et al.1991.J.Infect.Dis.163：549)。除了菌毛和F菌毛(Brinton CC.et al.1989.Pediatr.Infect.Dis.J.8：S54；Kar S.et al.1990.Infect.Immun.58：903；Gildorf JR.etal.1992.Infect.Immun.60：374；St.Geme JW et al.1991.Infect.Immun.59：3366；St.Geme JW et al.1993.Infect.Immun.61：2233)，很多的粘附已在NTHi中被鉴定。其中两种表面暴露的被称为HMW1和HMW2的大分子量蛋白被显示调节NTHi粘附到上皮细胞上(St.Geme JW.et al.1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2875)。另一家族的大分子量蛋白被鉴定在缺乏属于HMW1/HMW2家族的蛋白的NTHi菌株中。NTHi 115-kDa Hia蛋白(Barenkamp SJ.，St Geme S.W.1996.Mol.Microbiol.In press)高度相似于由流感嗜血杆菌b型菌株表达的Hsf粘附素(St.Geme JW.et al.1996.J.Bact.178：6281)。另一种蛋白，Hap蛋白与IgA1丝氨酸蛋白酶显示出相似性并且被表明与粘附和细胞侵入有关(St.Geme JW.et al.1994.Mol.Microbiol.14：217)。
五种主要的外膜蛋白(OMP)已被鉴定和用数字编号。最初使用流感嗜血杆菌b型菌株的研究显示对P1和P2 OMPs特异的抗体保护随后受攻击的幼鼠(Loeb MR.et al.1987.Infect.Immun.55：2612；Musson RS.Jr.et al.1983.J.Clin.Invest.72：677)。P2被发现能够诱导杀菌和调理抗体，其针对存在于暴露此完整OMP的环结构的表面上的可变区域(HaaseEM.et al.1994 Infect.Immun.62：3712；Troelstra A.et al.1994 Infect.Immun.62：779).。脂蛋白P4也可诱导杀菌抗体(Green BA.et al.1991.Infect.Immun.59：3191)。
OMP P6是一种保守的糖脂相关脂蛋白其组成1-5％的外膜(Nelson MB.et al.1991.Infect.Immun.59：2658)。随后大约相同分子重的脂蛋白被识别称为PCP(P6交叉反应蛋白)(Deich RM.et al.1990.Infect.Immun.58：3388)。保守的脂蛋白P4，P6和PCP的混合物没有显示在灰鼠中耳炎模型鉴定到的保护(Green BA.et al.1993.Infect.immun.61：1950)。P6单独显示出在灰鼠模型中诱导保护(Demaria TF.et al.1996.Infect.Immun.64：5187)。
一种丝束蛋白(Miyamoto N.，Bakaletz，LO.1996.Microb.Pathog.21：343)也被描述与OMP P5有同源性，其本身与完整的大肠杆菌OmpA有序列同源性(Miyamoto N.，Bakaletz，LO.1996.Microb.Pathog.21：343；Munson RS.Jr.et al.1993.Infect.Immun.61：1017)。NTHi好像通过菌毛的方式粘附到粘液上。
与用淋病双球菌和脑膜炎球菌性观察的相符，当在限制铁的情况下生长时NTHi表达一种由TbpA和TbpB组成的二价人转铁蛋白受体。抗-TbpB抗体保护幼鼠(Loosmore SM.et al.1996.Mol.Microbiol.19：575)。血红蛋白/亲血色球蛋白受体也被描述于NTHi(Maciver I.et al.1996.Infect.Immun.64：3703)。一种血红素：血红素结合蛋白受体也已被鉴定(Cope LD.et al.1994.Mol.Microbiol.13：868)。乳铁蛋白受体也存在于NTHi中，但仍未被鉴定(Schryvers AB.et al.1989.J.Med.Microbiol.29：121)。一种奈瑟氏菌FrpB-蛋白未被描述在NTHi中。
一种80kDa OMP，D15表面抗原，在小鼠受攻击模型中提供抗NTHi保护。(Flack FS.et al.1995.Gene 156：97).一种42kDa外膜脂蛋白，LPD在流感嗜血杆菌中保守且诱导杀菌的抗体(Akkoyunlu M.et al.1996.Infect.Immun.64：4586)。一种次要的98kDa OMP(Kimura A.et al.1985.Infect.Immun.47：253)，被发现是一个保护性抗原，此OMP可能是一个非常好的Fe-限制性诱导OMPs或高分子量粘附素，其在后面已被鉴定。流感嗜血杆菌产生IgAl-蛋白酶活性(Mulks MH.，Shoberg RJ.1994.Meth.Enzymol.235：543)。NTHi的IgAl-蛋白酶具有高度的抗原变异性(Lomholt H.，van Alphen L.，Kilian，M.1993.Infect.Immun.61：4575)。
NTHI的另一种OMP，OMP26，一种26-kDa蛋白已显示在小鼠模型中增强肺清除率(Kyd，J.M.，Cripps，A.W.1998.Infect.Immun.66：2272)。NTHi HtrA蛋白已显示是一个保护性抗原。的确，这种蛋白保护灰鼠抵抗中耳炎并且保护幼鼠抵抗流感嗜血杆菌b型菌血症(LoosmoreS.M.et al.1998.Infect.Immun.66：899)。
外膜小泡(或囊泡)已从流感嗜血杆菌中分离(Loeb M.R.，Zachary A.L.，Smith D.H.1981.J.Bacteriol.145：569-604；Stull T.L.，Mack K.，Haas J.E.，Smit J.，Smith A.L.1985.Anal.Biochem.150：471-480)。小泡与诱导血-脑屏障渗透性(Wiwpelwey B.，Hansen E.J.，Scheld W.M.1989 Infect.Immun.57：2559-2560)，脑膜炎的诱导(Mustafa M.M.，Ramilo O.，Syrogiannopoulos G.A.，Olsen K.D.，McCraken G.H.Jr.，Hansen，E.J.1989.J.Infect.Dis.159：917-922)以及DNA吸收(Concino M.F.，Goodgal S.H.1982 J.Bacteriol.152：441-450)相关联。这些小泡能够结合和被鼻粘膜上皮吸收(Harada T.，Shimuzu T.，Nishimoto K.，Sakakura Y.1989.ActaOtorhinolarygol.246：218-221)表明粘附素和/或定居因子能够存在于囊泡中。对外膜小泡中存在的蛋白的免疫应答已被在患有不同的流感嗜血杆菌疾病的患者中发现到(Sakakura Y.，Harada T.，Hamaguchi Y.，Jin C.S.1988.Acta Otorhinolarygol.Suppl.(Stockh.)454：222-226；HaradaT.，Sakakura Y.，Miyoshi Y.1986.Rhinology 24：61-66)。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)：
假单胞菌属包括革兰氏阴性的，极性鞭毛的，直或微弯曲杆状好氧生长且不形成孢子。因为其有限的代谢需求，假单胞菌亚种是普遍存在的且广泛分布在土壤，空气，污水和植物中。大多数的假单胞菌例铜绿假单胞菌，假鼻疽假单胞菌(P.pseudomallei)，鼻疽假单胞菌(P.mallei)，嗜麦芽假单胞菌(P.maltophilia)和葱头假单胞菌(P.cepacia)已显示对人类致病。在上述列表中，铜绿假单胞菌被认为是重要的人类病原因为其与无免疫应答的宿主的机会感染相关联且导致住院病人的高发病率。医院感染铜绿假单胞菌使得患者延长治疗并接受免疫抑制剂，皮质类固醇，抗代谢物，抗生素或放疗。
假单胞菌，特别是铜绿假单胞菌，产生多种毒素(溶血素，纤维蛋白溶酶，酯酶，促凝酶，磷脂酶内-和外毒素)赋予这些细菌致病性。然而，这些微生物对抗生素具有高度的固有的抗性使得出现了复合的药物排出泵。后一特性通常使得疾病恶化。
由于抗菌剂化学疗法的不受控制的使用，由铜绿假单胞菌引起的医院传染的频率在过去30年中急剧地增加。在美国，例如铜绿假单胞菌医院感染的经济负担据估计每年为45亿US$。因此，用于主动或被动免疫抵抗铜绿假单胞菌的疫苗被强烈的需求(参见Stanislavsky et al.1997.FEMS Microbiol.Lett.21：243-277)。
铜绿假单胞菌的不同的细胞结合和分泌的抗原已成为疫苗开发的主体。在假单胞抗原中，类粘蛋白物质，其是细胞外主要由藻酸盐组成的粘液，依据大小和免疫原性被发现是异源的。高分子量藻酸盐组分(30-300kDa)显示出含有保守的表面决定簇而低分子量组分(10-30kDa)除了特有的表面决定簇之外含有保守的表面决定簇。在表面相关蛋白中，PcrV，其是III型分泌-易位元件的一部分，也已被表明是一个用于接种的目的靶(Sawa et al.1999.Nature Medicine 5：392-398)。
表面暴露抗原包括O-抗原(LP S的O-特异性多糖)或H-抗原(鞭毛抗原)已被用作血清型来决定其高度的免疫原性特性。O-特异性多糖的重复单位的嵌合结构已被阐明并且这些数据使得鉴定了铜绿假单胞菌的31种化学型。在所有铜绿假单胞菌血清型中的保守表面决定簇位于核心低聚糖和LPS的类脂A区域中，且含有这些表面决定簇的免疫原在小鼠中诱导交叉保护性免疫抵抗不同的铜绿假单胞菌免疫类型。LPS的外核被推断是一个配体用于结合铜绿假单胞菌到动物气管和眼上皮细胞上。然而，在不同血清型的外核区域中存在不均匀性。内核中的表面决定簇是高度保守的并且已被证明是表面可进入的，且不被O-特异性多糖掩蔽。
为了检测OM蛋白的保护性特性，一种含有铜绿假单胞菌的分子量从20到100kD的OM蛋白的疫苗被用于临床前和临床试验。此种疫苗在动物模型中有效的抵抗铜绿假单胞菌的攻击且在人志愿者体内诱导高水平的特异性抗体。来自含有抗铜绿假单胞菌抗体的人自愿者的血浆提供被动的保护并有助于87％的患有严重铜绿假单胞菌感染的患者恢复。最近，一种含有来自铜绿假单胞菌的部分外膜蛋白OprF(氨基酸190-342)和OprI(氨基酸21-83)融合到谷胱甘肽-S-转移酶上的杂交蛋白被证实保护小鼠抵抗铜绿假单胞菌的975-倍的50％致死剂量(Knapp et al.1999.Vaccine.17：1663-1669)。
发明人已意识到上述的野生型囊泡疫苗(天然产生的或化学产生的)具有多种缺点。
这些问题的例子如下：
-在囊泡(PorA；TbpB，Opa[脑膜炎奈瑟氏菌B]；P2，P5[非典型性流感嗜血杆菌])上存在免疫显势但可变的蛋白，此种囊泡仅仅有效的抵抗有限的细菌种类。类型特异的杀菌抗体应答阻碍此种疫苗在婴儿期的应用。
-非保护性(非相关的)抗原(Rmp，H8，…)在囊泡-抗原上的存在诱骗了免疫系统。
-缺乏重要的条件化产生的分子(例如铁-调控的外膜蛋白，IROMP′s，体内调节表达机制)-此种情况很难控制囊泡产量来达到表面上抗原的最佳量
-保护性(特别是保守的)抗原(NspA，P6)的低水平表达
-LPS在囊泡的表面仍保留毒力
-因为宿主完全相同的结构产生的潜在的自身免疫应答的诱导(例如脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的荚膜，奈瑟氏菌LPS的乳-N-新丁糖，ntHiLPS的糖结构，Pili的糖结构)。
这些问题阻碍了囊泡疫苗作为人疫苗药物的应用。特别是儿科(＜4岁)的应用，其中抵抗囊泡的反应尤其重要，且其中的囊泡疫苗(例如前面所述的市售的MenB囊泡疫苗)已显示对于免疫保护无效。因此，本发明利用遗传工程改造的细菌菌株提供了减少上述问题的方法，结果得到了改进的囊泡疫苗。此方法将被特别用于生产新的抵抗细菌病原体的方法，例如脑膜炎奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌，和其它细菌。
本发明的囊泡疫苗依据对配制在复合成分疫苗中的一些保护性(优选保守的)抗原或表面决定簇的免疫应答来设计。其中的抗原为完整的OMPs，囊泡疫苗的外膜小泡将确保它们的适当折叠。本发明提供了优化OMV(囊泡)疫苗的OMP和LPS组分的方法，是通过以下方法实现的：删除免疫显势可变的以及非保护性OMPs，增加保守的OMPs，以及删除可变区，保护性OMPs表达的上调，以及除去保护性OMPs表达(例如铁限制性)的调控机制。另外，本发明提供了减少类脂A的毒性的方法，是通过修饰脂部分或通过改变磷酰基组成且保留其辅助活性或通过掩蔽实现的。每一种这样的新方法分别改进了囊泡疫苗，然而一或更多这些方法的组合使得产生优化的工程囊泡疫苗，其为免疫保护性的且无毒性，特别适于儿科使用。
发明概述
本发明提供一种来自革兰氏阴性细菌菌株的基因工程囊泡制剂，其特征在于所述的制剂通过采用一或多个选自以下的方法被获得：
a)一种减少囊泡制剂中的免疫显性可变的或非保护性抗原的方法，包括以下步骤：确定此抗原的身份，工程改造一种细菌菌株来产生较少的或不产生所述的抗原，并且从所述菌株生产囊泡；
b)一种上调囊泡制剂中的保护性，内源(且优选保守的)OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来导入强启动子序列到编码所述抗原的基因的上游使得所述基因以比在非修饰的囊泡中更高的水平表达，且从所述的菌株制备囊泡；
c)一种上调囊泡制剂中的条件化表达的保护性(且优选保守的)OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来去除其表达的抑制调控机制(例如铁限制性)，且从所述的菌株制备囊泡；
d)一种修饰囊泡制剂中的细菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步骤：鉴定与LPS类脂A部分的毒性有关的基因，工程改造一种细菌菌株来减少或关闭所述基因的表达，并从所述的菌株制备囊泡；
e)一种修饰囊泡制剂中的细菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步骤：鉴定与使得LPS的类脂A部分毒性降低有关的基因，工程改造一种细菌菌株来导入强启动子序列到编码所述抗原的基因的上游使得所述基因以比在非修饰的囊泡中更高的水平表达，且从所述的菌株制备囊泡；
f)一种减少囊泡制剂中脂类A毒性和增加保护性抗原的水平的方法，包括以下步骤：工程改造细菌菌株的染色体来结合一个编码融合到保护性抗原上的多粘菌素A肽，或其衍生物或类似物的基因，并从所述的菌株制备囊泡；
g)一种在囊泡制剂中生成保守的OMP抗原的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，改造细菌菌株来缺失编码所述抗原的基因的可变区，并从所述的菌株制备囊泡；
h)一种减少抗原在囊泡制剂中表达的方法，其中的抗原结构与人的结构类似且可以在人体中诱导自身免疫应答(例如脑膜炎奈瑟氏菌B的荚膜多糖)，包括以下步骤：鉴定涉及抗原的生物合成的基因，改造细菌菌株来减少或关闭所述基因的表达，并从所述的菌株制备囊泡；
i)一种上调囊泡制剂中保护性，内源(且优选保守的)OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来导入编码所述由异源强启动子序列调控的抗原的基因的一或多个拷贝至染色体，并从所述的菌株制备囊泡。
本发明的其它方面包括，优选的用于获得上述囊泡制剂的方法，包括优化强启动子的位置来上调囊泡中抗原的表达，优选的用于不同的细菌菌株的上调和下调的抗原来获得特别适用于疫苗的囊泡制剂。优选的含有本发明囊泡的制剂也被提供，其特别适用于抵抗特定的疾病状态的全球性疫苗。生产本发明囊泡的载体，以及用来制备本发明囊泡的修饰细菌菌株也是本发明的的进一步的一个方面。
本发明第一次提供了一种囊泡疫苗当其用于4岁以下的儿童时是免疫保护性的且无毒。
附图简述
附图1：735mAb在不同克隆上的反应性。
附图2：通过全细胞酶联免疫吸附测定(ELISA)的特异性单克隆抗体的反应性。
附图3：用于传递脑膜炎奈瑟氏菌基因组的基因，操纵子和/或表达盒的pCMK载体的图解描述。
附图4：重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(H44/76衍生物)的总蛋白中PorA表达的分析。总蛋白回收自cps-(泳道3和4)，cps-porA：：pCMK+(泳道2和5)以及cps-porA：：nspA(泳道1和6)重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株并且在SDS-PAGE条件下在12％聚丙烯酰胺凝胶上分析。凝胶用考马斯蓝染色(泳道1到3)或转到硝化纤维膜上用抗-PorA单克隆抗体免疫染色。
附图5：分析重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株(H44/76衍生物)的蛋白提取物的NspA表达。蛋白提取自整个细菌(泳道1到3)或外膜囊泡制剂(泳道4到6)，在12％丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离并且通过免疫印迹反应利用抗-NspA多克隆血清分析。对应于cps-(泳道1和6)，cps-pora：：pCMK+(泳道3和4)以及cps-porA：：nspA(泳道2和5)的样品被分析。两种形式的NspA被检测：一种与重组纯化的NspA共迁移的成熟形式(18kDa)，一种较短的形式(15kDa)。
附图6：在重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株(H44/76衍生物)的蛋白提取物中D15/omp85的表达分析。蛋白提取自外膜囊泡制剂，在12％丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离并且通过利用抗-omp85多克隆血清进行免疫印迹反应分析。对应于cps-(泳道2)和cps-，PorA+，pCMK+Omp85/D15(泳道1)重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的样品被分析。
附图7：通过启动子传递调控基因表达的常规方法(RS代表限制性位点)。
附图8：分析由重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型Bcps-菌株(H44/76衍生物)产生的外膜囊泡。蛋白被提取自外膜囊泡制剂并在还原条件在4-20％梯度聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离，凝胶用考马斯亮蓝R250染色。泳道2，4，6对应于5ug的总蛋白，而泳道3，5和7为10μg蛋白。
附图9：用于在脑膜炎奈瑟氏菌H44/76中上调Omp85/D15的表达/产生的启动子替换质粒的构建。
附图10：重组NmB(H44/76衍生物)的总蛋白提取物中的OMP85表达的分析。凝胶用考马斯亮蓝染色(A)或转到硝化纤维膜上并用鼠抗-OMP85(N.gono)单克隆抗体免疫染色(B)。
附图11：来自重组NmB(H44/76衍生物)的OMV制剂中的OMP85表达的分析。凝胶用考马斯亮蓝染色(A)或转到硝化纤维膜上并用鼠抗-OMP85多克隆抗体免疫染色(B)。
附图12：用于删除嵌合porA/lacO启动子的重组PCR方法的图示。
附图13：重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(H44/76衍生物)总蛋白提取物的Hsf表达的分析。总蛋白获自Cps-PorA+(泳道1)，和Cps-PorA+/Hsf(泳道2)重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株并在12％聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯亮蓝染色。
附图14：重组脑膜炎奈瑟氏菌(H44/76衍生物)总蛋白提取物的GFP表达的分析。总蛋白获自Cps-，PorA+(泳道1)，Cps-，PorA-GFP+(泳道2和3)重组菌株。蛋白在12％聚丙烯酰胺凝胶上通过SDS-PAGE分离然后用考马斯蓝染色。
附图15：在通过SDS-PAGE分析(考马斯蓝染色)的不同重组囊泡制剂表面上的主要蛋白的模式的图解。
附图16：纯化的重组Hsf蛋白对不同的囊泡和重组囊泡制剂的特异性抗Hsf应答。
附图17：重组NmB(血清型B衍生物)的总蛋白提取物中的NspA表达的分析。凝胶用考马斯蓝染色(A)或转到硝化纤维膜上并用鼠抗-PorA单克隆抗体(B)或抗-NspA多克隆抗体(C)免疫染色。
发明内容
本发明涉及一系列常规的能被用于生产改进的基因改造的来自革兰氏阴性细菌菌株的囊泡的工具和方法。本发明包括用于生产具有更多免疫原性，更少毒性安全地用于人和/或动物疫苗的重组囊泡的方法。此外，本发明也描述了特异性的方法用于构建，生产，获得和使用来自不同革兰氏阴性菌的重组，工程改造的囊泡，用于疫苗，治疗和/或诊断目的。通过本发明的方法，细菌囊泡的生化组分可通过调控/改变编码存在于或与细菌外膜囊泡(外膜蛋白或OMPs)结合的产物的细菌基因被操纵。通过遗传修饰来增加，减少或有条件的表现一或多个编码外膜组分的基因表达的方法的囊泡生产也包含在本发明的范围之中。
为了清楚地阐述，术语“表达盒”在此将指所有的表达基因或操纵子以及产生和靶向相应的目的蛋白到得自所给的细菌宿主的外膜囊泡所必需的元件。这些特征的非穷尽列举包括调控元件(转录和/或翻译)，蛋白编码区和靶信号，其之间的适当的间隔。启动子序列的插入是指，为达到本发明的目的，插入带有至少一个启动子功能的序列且优选一或多个其它包含在表达盒中的遗传调控元件。此外，术语″整合盒″在此是指所有的在所给细菌宿主中整合DNA片段必需的遗传元件。。这些特征的非穷尽列举包括传递载体(或载体)，带有重组遗传区域，以及可选择的和反向可选择的标记。
术语“改造细菌菌株产生较少量的所述抗原”是指任意减少目的抗原表达的方式，相对应非修饰(例如，天然产生的)囊泡其表达至少低于10％的非修饰囊泡的表达。优选的至少低于50％。“强启动子序列”是指增加编码目的抗原的基因转录的调控元件。“上调表达”是指任意的增强目的抗原相对于非修饰(例如，天然产生的)囊泡的表达。可以理解“上调”的量依据特定的目的抗原而变化但不会超出破坏囊泡的膜完整性的量。抗原的上调是指表达至少10％高于非修饰囊泡的的表达。优选至少高于50％。更优选至少高于100％(2倍)
本发明的一个方面涉及生产改进的工程囊泡的独特方法，这些方法的组合，以及涉及这些方法产生的囊泡组合物。本发明的另一个方面涉及遗传学工具用于遗传修饰所选的细菌菌株来从所述菌株提取改进的工程改造囊泡。
本发明方法的工程改造步骤可以以技术人员公知的方式来进行。例如，序列(例如，启动子或开放阅读框架)可以被插入，启动子/基因可被通过转座子插入技术分裂。例如，为了上调基因的表达，一个强启动子可通过插入转座子到基因起始密码子的2kb上游(更优选200-600bp上游，最优选大约400bp上游)。点突变或缺失也可以被使用(特别用于基因的下调表达)。
此种方法，然而，可能是非常不稳定的或不确定的，因此优选通过同源重组处理进行工程改造步骤[尤其是下面所述的方法a)，b)，c)，d)，e)，h)和i)]。优选的，此种处理发生在细菌染色体的至少30个核苷酸的序列(重组遗传区域)以及转化菌株的载体的至少30个核苷酸的序列之间。优选区域为40-1000个核苷酸，更优选的100-800个核苷酸，最优选为500个核苷酸。这些重组遗传区域与能够和另一个在高度严紧条件下杂交的重组遗传区域足够的相似(如后面所定义的)。
重组可以通过利用染色体和载体上的单个重组遗传区域，或通过双重交换染色体来进行(在染色体和载体上带有两个区域)。为了进行单一重组处理，载体应为环状的DNA分子(参见附图7)。优选进行双重重组处理且使用线性的载体，当如此产生的修饰的细菌在回复时更加稳定。优选染色体上(以及在载体上的)的重组遗传区域具有相似(更优选为相同)的长度使得促进了双重染色体的交换。双重的染色体交换功能使得在染色体上的两个重组遗传区域(用核苷酸序列‘X’表示)和载体上的两个重组遗传区域(用核苷酸序列‘Y’表示)结合除了X和Y交换外余下未被改变的染色体。重组遗传区域可位于目的阅读框架的上游或下游或侧面。这些区域可包括编码，非编码，或编码和非编码序列的混合物。X和Y的特性依据目的效果。X可以为全部或部分的开放阅读框架，Y根本没有核苷酸，其将产生从染色体删除的序列X。可选择的，Y可以时一个强启动子用于开放阅读框架的上游的插入，且X可能根本没有核苷酸。
合适的载体在组合物种将依据将被进行的重组处理的类型和重组的最终目的而变化。用于传递区域Y的正和载体可以是有条件复制型或自杀性质粒，噬菌体，转座子或通过限制性水解或PCR扩增的线性DNA片段。重组事件的选择通过选择性遗传标记的方式例如赋予基因抗生素(例如卡那霉素，红霉素，氯霉素或庆大霉素)抗性，赋予基因对重金属和/或有毒化合物的抗性或营养缺陷互补型突变的基因(例如，pur，leu，met，aro)。
方法a)和f)-可变和非保护性免疫显性抗原的下调/去除
很多表面抗原在细菌菌株中是可变异的并且结果是仅仅抵抗有限的亲密相关的菌株。本发明的一个方面包括减少表达，或优选的，删除编码产生囊泡的细菌菌株的可变表面蛋白的基因，其中的囊泡当配制成疫苗时，具有强烈的抵抗不同的通过疫苗免疫系统的保守蛋白(保留在外膜上)发挥较高影响的菌株交叉反应的可能性。这种可变抗原的例子包括：发生抗原变异的奈瑟氏菌-pili(PilC)，PorA，Opa，TbpB，FrpB；流感嗜血杆菌-P2，P5，pilin，IgAl-蛋白酶；以及Moraxella-CopB，OMP106。
其它类型的能被下调或关闭的基因是在体内能够很容易被细菌开放(表达)或关闭的基因。由于此种基因编码的外膜蛋白并不经常存在于细菌上，此种蛋白在囊泡制剂中的存在因为上述原因对疫苗的有效性也是有害的。优选的下调或删除的例子是奈瑟氏菌Opc蛋白。由含有囊泡疫苗的Opc诱导的抗-Opc免疫仅具有有限的保护能力，因为感染的生物很容易地变成Opc-。流感嗜血杆菌HgpA和HgpB是另外的此种蛋白的例子。
在方法a)中，这些可变的或非保护性基因在表达上被下调，或最终被关闭。此具有上述令人吃惊的优点即将免疫系统的研究集中于存在于囊泡外表面上低量的最好的抗原上。
菌株可通过大量的策略被工程改造包括转座子插入来干扰基因的编码区或启动子区，或点突变或点缺失来获得相似的结果。同源重组也可被用来从染色体删除基因(其中的序列X包括部分(优选全部的)目的基因的编码序列)。此外可以改变基因启动子区弱(或无)启动子为强启动子(其中的核苷酸序列X包括部分(优选全部的)目的基因的编码序列，且核苷酸序列Y包含弱启动子[结果减少了目的基因/操纵子的表达]，或无启动子区域)。在此情况下，优选重组事件发生在目的基因的染色体1000bp上游的区域。
可选择的，Y可能赋予有条件的转录活性，导致目的基因/操纵子有条件的表达(下调)。此有助于有毒的或不被细菌宿主很好地支持的分子的表达。
大多数的上述例证的蛋白为完整的OMPs并且其变异性可能被限制于一或一些其表面暴露的环。本发明的另一个方面[方法g)]包括删除编码这些表面暴露的环的DNA导致含有保守的表面暴露的环的整合OMP的表达。流感嗜血杆菌P2和P5的表面暴露环的优选的例子是能够被通过此方法转化到交叉反应抗原中的蛋白。
方法b)-启动子传递和调节
本发明的另一个方面涉及通过原位改变调控目的基因/操纵子表达的调控区来修饰囊泡组合物。此种改变可包括用一个具有显著转录活性的启动子替换部分或全部的调控目的基因表达的内源启动子。此显著转录活性可能是内源调控区的变体，天然产生的或修饰的异源启动子或二者组合(点突变，缺失和/或插入)。此种改变优选赋予比内源的更强的转录活性(导入强启动子)，产生增强的目的基因/操纵子的表达(上调)。此方法尤其有助于增强免疫学相关的Bleb组分例如外膜蛋白和脂蛋白(优选保守的OMPs，通常低浓度的存在于囊泡中)的生产。
可被整合在奈瑟氏菌中的代表性的强启动子是porA[SEQ ID NO：24]，porB[SEQ ID NO：26]，lgtF，Opa，p110，lst和hpuAB。PorA和PorB是优选的组成型的强启动子。PorB启动子的活性已被确定(实施例9)包含在与porB的起始密码子的核苷酸-1到-250上游对应的片段中。在摩拉克氏菌中，优选使用ompH，ompG，ompE，OmpB1，ompB2，ompA，OMPCD以及Omp106启动子，且在流感嗜血杆菌，优选整合P2，P4，P1，P5和P6启动子。
利用优选的交叉互换同源重组技术来在1000bp上游区域中导入启动子，启动子可在将被上调的基因的距离起始密码子的30-970bp上游区域的任意处被替换。尽管依据常规启动子区域应当相对地靠近开放阅读框架来获得基因的最佳表达，但本发明令人吃惊的发现启动子更远离启动密码子的替换导致表达水平的大大地增加。因此优选启动子被插入到距离基因的起始密码子的200-600bp，更优选的为300-500bp，最优选距离起始ATG大约400bp处。
方法c)-条件化产生的囊泡组分
一些编码特定囊泡组分的基因的表达被较好的调控。组分的生产被不同的新陈代谢和/或环境信号条件化调控。此信号包括，例如，铁-限制性，氧化还原电位的调节，pH和温度差异，营养改变。一些已知被有条件产生的囊泡组分的例子包括来自奈瑟氏菌和莫拉氏菌(例如TbpB，LbpB)的铁-调节的外膜蛋白，以及底物诱导型外膜蛋白。本发明包括前面所述的遗传方法的应用(方法a)或b))来提供此种分子的组成型表达。这样，环境信号对目的基因表达的影响可被克服通过修饰/取代基因的相应调控区使其变成组成型活性的(例如通过删除部分[优选全部]或阻遏性调控序列-例如操纵基因区)，或插入一个组成型的强启动子。为了铁调控基因，fur操纵基因可被去除。可选择的，方法i)可被用于传递在组成型启动子调节下被人工替代的染色体中的基因/操纵子的另外的拷贝。
方法d)和e)-LPS的脱毒作用
囊泡疫苗的毒性是囊泡在疫苗中应用的一个最大的问题。本发明的另一个方面涉及囊泡中LPS的遗传学脱毒的方法。脂A是LPS的主要成分其起到细胞激活的作用。很多在此途径涉及的基因的突变引起基本的表现型。然而，负责末端修饰步骤的基因中的突变产生温度敏感型(htrB)或允许(msbB)表现型。导致这些基因的表达减少(或没有)的突变产生脂A的改变的毒性。事实上，非月桂酰化(htrB突变体)或非肉豆蔻酰化(msbB突变体)脂A比野生型脂A具有更少的毒性。脂A4`-激酶编码基因(lpxK)的突变也减少了脂A的毒性。
方法d)因此涉及一或多个上述开放阅读框架或启动子部分(或优选全部)的删除。可选择的，启动子可被弱启动子取代。优选上述的同源重组技术被用于实施上面的方法。
来自脑膜炎奈瑟氏菌B，粘膜炎莫拉氏菌，和流感嗜血杆菌的htrB和msbB基因的序列被提供用于此目的。
LPS毒性可以通过在涉及多粘菌素B抗性的基因/位点导入突变来改变(此抗性与脂A的4`磷酸盐的氨基阿拉伯糖有关)。这些基因/位点可能是编码UDP-葡萄糖脱氢酶的pmrE，或与很多与氨基阿拉伯糖合成和传递相关的肠道细菌共有的抗菌肽抗性基因的区域。存在于此区域的基因pmrF编码dolicol-磷酸盐manosyl转移酶(Gunn J.S.，Kheng，B.L.，Krueger J.，Kim K.，Guo L.，Hackett M.，Miller S.I.1998.Mol.Microbiol.27：1171-1182)。
PhoP-PhoQ调控系统的突变，导致氨基阿拉伯糖在4`-磷酸盐和2-羟基豆蔻酸盐取代肉豆蔻酸盐(肉豆蔻酸盐的羟基化)中的增加，其中的系统是二氧磷基-交换的二成分调控系统(f.i.PhoP组成行表现型，PhoP)，或低Mg′环境的或培养条件(其激活PhoP-PhoQ调控系统)。此种修饰的脂A显示出减少的对人内皮细胞E-selectin表达和人单核细胞的TNF-a分泌的刺激能力。
方法e)涉及这些基因通过上述的方法的上调(强启动子被插入，优选使用同源重组技术实施上面的方法)。
可选择的，进行任意的这种突变，多粘菌素B抗性菌株可被用作疫苗生产菌株(与一或多个本发明的其他方法结合)，因为来自此菌株的囊泡具有减少的LPS毒性(for instance as shown for meningococcus-van der Ley，P，Hamstra，HJ，Kramer，M，Steeghs，L，Petrov，A and Poolman，JT.1994.In.Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseria conferenceThe Guildhall，Winchester，England)。
可选择的(本发明的另一个方面)本发明提供了一种革兰氏阴性菌的脱毒的方法包括以下步骤：在含有0.1mg-100g的氨基阿拉伯糖/升培养基的培养基中培养菌株。
另外的可选择的方面，其模拟多粘菌素B的结合活性(描述在下)合成的肽可被加入到Bleb制剂中来降低LPS的毒性(Rustici，A，Velucchi，M，Faggioni，R，Sironi，M，Ghezzi，P，Quataert，S，Green，B and Porro M 1993.Science 259：361-365；Velucchi，M，Rustici，A，Meazza，C，Villa，P，Ghezzi，P and Porro，M.1997.J.Endotox.Res.4：)。
方法f)-结合同源或异源蛋白到外膜囊泡上同时降低了LPS的毒性
本发明的另一个方面包括利用编码多粘菌素B肽(或其类似物)的遗传序列来靶向融合蛋白到外膜上。多粘菌素B是由非tRNA编码的氨基酸(革兰氏阳性放线菌产生的)组成的环形肽其紧密的结合于外膜LPS的脂A部分。此种结合较少了LPS(内毒素活性)的内在毒性。模拟多粘菌素B的结构且由正则(tRNA编码的)氨基酸组成的肽已被改进且结合带有亲和力的脂A。这些多肽被用于LPS脱毒。其中的一个肽SAEP-2(N末端-Lys-Thr-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys-C末端)在此方面显示出较大的潜力(Molecular Mapping and detoxifying of the Lipid A binding site bysynthetic peptides(1993).Rustici，A.，Velucchi，M.，Faggioni，R.，Sironi，M.，Ghezzi，P.，Quataert，S.，Green，B.and M.Porro.Science 259，361-365)。
本发明的方法f)提供了应用的改进。人们发现利用编码SEAP-2肽(或其衍生物)的DNA融合到目的基因(编码例如例如通常被分泌的T细胞抗原或保护性抗原，例如毒素，或胞质或周质蛋白)上是一种靶向相关的重组蛋白到优选的细菌宿主的外膜上的方法(且同时减少了LPS的毒性)。
本系统适用于不稳定的不能够直接暴露在囊泡外面的蛋白。囊泡因此充当传递载体其当囊泡被T细胞吞没时暴露蛋白于免疫系统。可选择的遗传融合应包含一个信号肽或转膜区使得重组蛋白可能通过外膜暴露于宿主免疫系统。
靶向策略特别的适应于编码通常不靶向外膜的蛋白的基因。此方法也允许重组目的蛋白中的丰富囊泡的分离。优选的，此肽靶向信号允许外膜囊泡在一种或一些目的蛋白中较为富集，其并为天然的发现在所给的亚细胞位置。可被用作受体宿主用来生产重组囊泡的细菌的非穷尽列举包括脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌，砂眼衣原体和肺炎衣原体。
尽管用于构建的基因优选被工程改造到细菌的染色体中[通过方法i)]，可选的优选的实施方案是SAEP-2-标记的重组蛋白被单独地制备，并吸附于囊泡制剂。
另一个实施方案是此种构建物在蛋白纯化方法中的应用。系统通常可被用作生产重组蛋白的表达系统的一部分。SAEP-2肽标记物可被用于通过含有固定的脂A分子的柱吸附的蛋白的纯化。
方法h)-交叉反应的多糖
分离有荚膜的革兰氏阴性菌的细菌外膜囊泡通常导致荚膜多糖的共纯化。在一些情况下，这种“污染物”可能证明是有效的因为多糖可增强由其它囊泡组分引起的免疫应答。在其他的情况下，然而，污染的多糖物质在细菌囊泡制剂中的存在被证实在疫苗囊泡的应用是有害的。例如，已经显示至少在为脑膜炎奈瑟氏菌的情况下血清型B荚膜多糖没有保护性的免疫且在人体中容易引起抵抗自动免疫的应答。所以，本发明的方法h)为用于生产不具有荚膜多糖的囊泡制剂的细菌菌株的改造。此囊泡适于人体使用。一个特定优选的此种囊泡制剂的例子来自脑膜炎奈瑟氏菌血清型B且没有荚膜多糖的。
通过利用修饰其荚膜合成和运输所必需的基因已被削弱的囊泡生产菌株可以实现上述的目的。编码荚膜合成和运输的基因的失活可以通过突变(点突变，缺失或删除)调控区，编码区或二者(优选利用上述的同源重组技术)来获得。此外，荚膜合成基因的失活可通过反义超表达或转座子诱变来实现。优选的方法是缺失一些多糖合成和运输所需要的一些或所有的脑膜炎奈瑟氏菌cps基因。为到达此目的，可替换质粒pMF121(described in Frosh et al.1990，Mol.Microbiol.4：1215-1218)实现缺失cpsCAD(+galE)基因簇的突变。可选择的，siaD基因可被缺失，或下调其表达(编码荚膜多糖和LOS合成必需的α-2，3-唾液酸转移酶的脑膜炎球菌siaD基因)。此突变也可以去除细菌LPS的糖部分的宿主相似结构。
方法i)-宿主染色体中一或多个基因和/或操纵子的传递，或宿主染色体中异源基因和/或操纵子的传递
有效的调制囊泡制剂的组分的方法是传递一或多个含有表达盒的DNA片段的拷贝到革兰氏阴性细菌的染色体组中。优选的可被用此盒的受体的细菌中的非穷尽列举包括脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌，砂眼衣原体，肺炎衣原体。含在表达盒中的基因可以是同源的(或内源的)(例如，自然存在于被处理细菌的染色体中)或异源的(例如不自然存在于被处理细菌的染色体中)。再次描述的表达盒可包括未修饰的，″天然的″启动子/基因/操纵子序列或其启动子区和/或编码区或二者已被改变的工程改造的表达盒。优选的可被用于表达的启动子的非穷尽列举包括来自脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌的启动子porA，porB，lbpB，tbpB，p110，Ist，hpuAB，来自流感嗜血杆菌的启动子p2，p5，p4，ompF，pl，ompH，p6，hin47，粘膜炎莫拉氏菌的启动子ompH，ompG，ompCD，ompE，ompB1，ompB2，ompA，大肠杆菌的启动子RpL，lac，tac，araB或被噬菌体RNA聚合酶特例如大肠杆菌噬菌体T7异性识别的的启动子。能在此系统中表达的优选基因的非穷尽列举包括奈瑟氏菌NspA，Omp85，PilQ，TbpA/B复合物，Hsf，PldA，HasR；衣原体MOMP，HMWP；Moraxella OMP106，HasR，PilQ，OMP85，PIDA；百日咳博德特氏杆菌FHA，PRN，PT。
在本发明的一个优选的实施方案中，表达盒通过同源的和/或位点特异性重组的方式被传递和整合在细菌染色体中。用于传递此基因和/或操纵子的整合载体可以是条件复制型或自杀质粒，噬菌体，转座子或通过限制性水解PCR扩增得到的线性DNA片段。整合通常优选在对体外生长非必要的染色体区域。优选用于靶向DNA整合的位置的非穷尽列举包括脑膜炎奈瑟氏菌和淋病奈瑟氏菌的porA，porB，opa，opc，rmp，omp26，lecA，cps，IgtB基因，NTHi的PI，P5，hmw1/2，IgA蛋白酶，fimE基因，粘膜炎莫拉氏菌的lecA1，lecA2，omplO6，uspAI，uspA2基因。可选择的，用于调节囊泡成分的表达的表达盒可被传递到所选的细菌中通过游离型载体例如环状的/线性复制载体，粘粒，噬菌粒，溶解型噬菌体或细菌的人工染色体等方式来进行。重组结果的筛选可通过选择性遗传标记例如赋予抗生素(例如卡那霉素，红霉素，氯霉素，或庆大霉素)抗性的基因，赋予对重金属和/或对有毒化合物抗性的基因或营养缺陷互补突变的基因(例如pur，leu，met，aro)。
异源基因-外来蛋白在外膜囊泡中的表达
外膜细菌囊泡表现为生产，分离和传递重组蛋白的非常吸引人的系统用于疫苗，治疗和/或诊断。本发明的另一个方面为表达，产生以及靶向外来的，异源蛋白到外膜上，以及利用细菌生产重组囊泡。
达到上述目的优选的方法包括以下步骤：通过同源重组导入由强启动子调控的异源基因到革兰氏阴性菌株的染色体中。可由产生修饰的菌株生产囊泡。
被用于受体宿主生产重组囊泡的细菌的非穷尽列举包括脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，流感嗜血杆菌，铜绿假单胞菌，砂眼衣原体，肺炎衣原体。在此系统中表达的基因可以是病毒，细菌，真菌，寄生或高等真核来源的。
本发明的优选的应用包括摩拉克氏菌，嗜血杆菌属和/或假单胞菌外膜蛋白(整合的，广泛存在的和/或脂蛋白)在脑膜炎奈瑟氏菌重组囊泡中表达的方法。优选的整合位点如上所述，优选被导入的基因是那些提供抵抗分离这些基因的细菌的保护性的基因。优选的来自每一细菌的保护性基因被描述在下面。
另外的优选的应用包括：产生自修饰的流感嗜血杆菌菌株的囊泡，其中菌株的异源基因是来自粘膜炎莫拉氏菌的保护性OMP；以及产生自修饰的粘膜炎莫拉氏菌菌株的囊泡，其中菌株的异源基因是来自流感嗜血杆菌的保护性OMP(优选的基因插入的位点如上面所示的，且优选的保护性抗原如下面所描述)。
此方面的特别优选的应用是用在性传播疾病(STDs)的预防或治疗领域。通常很困难来检测STD的主要原因是淋病球菌或砂眼衣原体感染。这两种微生物是输卵管炎疾病的主要原因其可以导致宿主不育。因此，如果STD能够被预防接种抵抗或用联合疫苗治疗有效抵抗由此两种微生物引起的疾病将是有用的。砂眼衣原体的主要的外膜蛋白(MOMP)已被证实是保护性抗体的靶。然而此整合膜蛋白的结构整体性对于诱导此种抗体是重要的。此外，被抗体识别的表面决定簇是可变且超过10个血清型变种。本发明前面所述的部分允许囊泡外膜制剂中一个或多个膜蛋白正确的折叠。在外膜中表达复合砂眼衣原体MOMP血清型变种的淋病双球菌菌株的工程改造，以及由此的囊泡的生产，提供了简单的解决正确折叠膜蛋白，提供足够的MOMP血清型变种来保护抵抗广谱的血清型变种，以及淋病双球菌的感染的同时预防/治疗(所以不必在最初判断哪一种微生物是引起临床症状的原因-两种微生物可被预防接同时抵抗，因此使得在非常早的阶段进行STD治疗)等多种问题。优选的淋病球菌染色体中基因插入的位点如上所示。其它优选的可以被合并的保护性砂眼衣原体基因为HMWP，PmpG且这些OMPs公开在WO 99/28475中。
异源蛋白到外膜囊泡上的靶向
一些异源蛋白在细菌囊泡中的表达可能需要外膜靶向信号的加入。优选的解决此问题的方法是通过在异源基因和编码自己OMP的基因间产生一个遗传融合作为一个特异性途径来靶向重组蛋白到囊泡上。更优选的，异源基因被融合到此OMP的信号肽序列上。
奈瑟氏菌囊泡制剂
一或多个下述的基因(编码保护性抗原)优选通过方法b)和/或i)被上调当处理奈瑟氏菌菌株，包括淋病球菌，和脑膜炎球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏菌B)时：NspA(WO 96/29412)，Hsf-样(WO 99/31132)，Hap(PCT/EP99/02766)，PorA，PorB，OMP85(WO 00/23595)，Pil Q(PCT/EP99/03603)，PldA(PCT/EP99/06718)，FrpB(WO 96/31618)，TbPA(US 5,912,336)，TbpB，FrpA/FrpC(WO 92/01460)，LbpA/LbpB(PCT/EP98/05117)，FhaB(WO 98/02547)，HasR(PCT/EP99/05989)，lipo02(PCT/EP99/08315)，Tbp2(WO 99/57280)，MltA(WO 99/57280)，以及ctrA(PCT/EP00/00135)。其也优选为被异源导入到其它革兰氏阴性细菌的基因。
一个或多个下述的基因优选通过方法a)被下调：PorA，PorB，PilC，TbpA，TbpB，LbpA，LbpB，Opa和Opc。
一个或多个下述的基因优选通过方法d)被下调：htrB，msbB和lpxK。
一个或多个下述的基因优选通过方法e)被上调：pmrA，pmrB，pmrE和pmrF。
优选的用于c)的抑制调控序为：fur操纵基因区(特特别是TbpB或LbpB基因或二者)；以及DtxR操纵基因区。
一个或多个下述的基因优选通过方法h)被下调：galE，siaA，siaB，siaC，siaD，ctrA，ctrB，ctrC和ctrD。
铜绿假单胞菌囊泡制剂
一个或多个下述的基因(编码保护性抗原)优选通过方法b和/或i)被上调：PcrV，OprF，OprI。其也优选为被异源导入到其它革兰氏阴性细菌的基因。
粘膜炎莫拉氏菌囊泡制剂
一个或多个下述的基因(编码保护性抗原)优选通过方法b和/或i)被上调：OMP106(WO 97/41731 & WO 96/34960)，HasR(PCT/EP99/03824)，PilQ(PCT/EP99/03823)，OMP85(PCT/EP00/01468)，lipoO6(GB9917977.2)，lipo10(GB 9918208.1)，lipo11(GB 9918302.2)，lipo18(GB9918038.2)，P6(PCT/EP99/03038)，ompCD，CopB(Helminen ME，et al(1993)Infect.Immun.61：2003-2010)，D15(PCT/EP99/03822)，OmplA1(PCT/EP99/06781)，Hly3(PCT/EP99/03257)，LbpA和LbpB(WO 98/55606)，TbpA和TbpB(WO 97/13785 & WO 97/32980)，OmpE，UspA1和UspA2(WO 93/03761)，和Omp21。其也优选为被异源导入到其它革兰氏阴性细菌的基因。
一个或多个下述的基因优选通过方法a)用于下调：CopB，OMP106，OmpB1，TbpA，TbpB，LbpA和LbpB。
一个或多个下述的基因优选通过方法d)用于下调：htrB，msbB和lpxK。
一个或多个下述的基因优选通过方法e)用于上调：pmrA，pmrB，pmrE和pmrF。
流感嗜血杆菌囊泡制剂
一个或多个下述的基因(编码保护性抗原)优选通过方法b和/或i)被上调：D15(WO 94/12641)，P6(EP 281673)，TbpA，TbpB，P2，P5(WO94/26304)，OMP26(WO 97/01638)，HMW1，HMW2，HMW3，HMW4，Hia，Hsf，Hap，Hin47和Hif(此操纵子中的所有基因应被上调来上调菌毛蛋白)。其也优选为被异源导入到其它革兰氏阴性细菌的基因。
一个或多个下述的基因优选通过方法a)用于下调：P2，P5，Hif，IgAI-蛋白酶，HgpA，HgpB，HMW1，HMW2，Hxu，TbpA，和TbpB。
一个或多个下述的基因优选通过方法d)用于下调：htrB，msbB和lpxK。
一个或多个下述的基因优选通过方法e)用于上调：pmrA，pmrB，pmrE和pmrF。
疫苗配剂
本发明的一个优选的实施方案是本发明疫苗中囊泡制剂的配剂也可含有药理上可接受的赋形剂。
可通过技术人员公知的任意方法来从任意上述被修饰的菌株制备囊泡制剂。优选的使用公开在EP 301992，US 5,597,572，EP 11243或US4,271,147上的方法。更优选的，利用公开在实施例8中的方法。
疫苗制剂通常被描述在Vaccine Design(″The subunit and adjuvantapproach″(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)Plenum Press NewYork)上。
本发明疫苗配剂中的囊泡制剂可被加入佐剂。合适的佐剂包括铝盐例如氢氧化铝凝胶(明矾)磷酸铝，但也可以是钙盐(特别是碳酸钙)，铁盐或锌盐，或为酰基化酪氨酸，或酰基化糖，阳离子或阴离子衍生多糖或含磷氮链聚合物的不溶解的悬浮液。
可被使用的合适的Th1佐剂系统包括，单磷酰基脂A，尤其是3-脱-O-酰基化单磷酰基脂A，单磷酰基脂A，优选3-脱-O-酰基化单磷酰基脂A(3DMPL)与铝盐的组合物。增强的系统包括单磷酰基脂A和皂草苷衍生物的组合物，尤其是公开在WO 94/00153中的QS21和3D-MPL的组合物，或较小反应遗传因子的成分其中的QS21如WO96/33739所述的被用胆固醇淬火。一种尤其有效的佐剂配剂包括在水包油乳浊液中的QS213D-MPL以及维生素E被描述在WO95/17210中并且是一种优选的配剂。
疫苗可含有皂草苷，更优选的含有QS21。其也可含有水包油乳浊液和维生素E。含有寡核苷酸的未甲基化CpG(WO 96/02555)也是优选的TH1应答的诱导物且适合用于本发明中。
本发明的疫苗制剂可被用于保护或治疗哺乳动物易感的的感染，通过全身或粘膜的途径给药所述的疫苗。这些给药可包括通过肌内，腹膜内，真皮内或皮下途径的注射；或通过口服/饮食，呼吸道，泌尿生殖器道给药。因此本发明的一个方面是一种免疫人宿主抵抗由革兰氏阴性细菌感染引起的疾病，其中的方法包括给药于宿主有效量的本发明的囊泡宿主。
每一种疫苗剂量中的抗原的量被选择依据其诱导在典型的疫苗中无显著副作用的免疫保护性应答的量。此量将依据被采用的特异性免疫原以及其如何呈递而变化。通常，人们期望每一剂量含有1-100Lg的蛋白抗原，优选5-5011g，更典型的在5-2511g的范围内。
特定疫苗的最佳的量可通过标准的研究包括受试者的适当免疫应答的观察来确定。在首次接种疫苗后，受验者可间隔地接受一或几次加强免疫。
空胞(ghots)或灭活全细胞疫苗
发明人设想上述的囊泡制剂和疫苗的改进可被扩展到空胞或灭活全细胞制剂和疫苗(带有相同的优点)。本发明修饰的用于制备囊泡制剂的革兰氏阴性菌菌株也可被用于制备空胞或灭活全细胞制剂。从革兰氏阴性菌制备空胞制剂(带有完整外壳的空细胞)的方法是本领域公知的(参见例如WO 92/01791)。灭活全细胞来生产失活细胞制剂用于疫苗的方法也是已知的。为了本发明的目的，术语′囊泡制剂′和和′囊泡疫苗′贯穿此文献的方法因此分别地适用于术语′空胞制剂′和‘空胞疫苗’，和′灭活全细胞制剂′和′灭活全细胞疫苗′。
方法a)-i)的组合
可以理解一个或多个上述的方法可被用于产生修饰的菌株由其来制备本发明的改进的囊泡制剂。优选的一个此种方法被使用，更优选两种或多种(2，3，4，5，6，7，8或9)方法被使用来制造囊泡疫苗。如同每一另外的方法被用在囊泡疫苗的生产中一样，每一种改进的工作与其它的所使用的方法结合来制备最佳的工程改造囊泡制剂。
优选的脑膜炎球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏菌B)囊泡制备包括使用方法a)，b)，d)和/或e)，和h)。此囊泡制剂是安全的(没有与宿主结构相似的结构)，无毒，且有结构的使得宿主免疫应答将集中在高水平的保护性(且优选保守的)抗原上。所有上述原理共同作用提供最佳的囊泡疫苗。
类似于粘膜炎莫拉氏菌和非-典型的流感嗜血杆菌，优选的囊泡制备包括方法a)，b)和d)和/或e)的应用。
本发明的另一个方面因此是适用于儿科使用的免疫保护性和无毒的革兰氏阴性囊泡，空胞，或灭活全细胞疫苗。
儿科使用是指用于小于4岁的婴幼儿。
免疫保护性是指至少40％(且优选50，60，70，80，90和100％)的婴幼儿血清转化(在杀菌活性上增加4倍[在50％细菌死亡时的抗血清的滴度-参见例如PCT/EP98/05117])抵抗选自主要已知克隆组的一系列异源菌株。对于脑膜炎球菌B而言这些菌株应当具有不同于囊泡生产菌株的PorA型，并且应当优选是2，3，4或，最优选，所有的5种菌株H44/76，M97/252078，BZ10，NGP165和CU385。对于非典型的流感嗜血杆菌而言，菌株应优选为2，3，4或最优选所有的5种菌株3224A，3219C，3241A，640645和A840177。对于粘膜炎莫拉氏菌而言，菌株应优选是2，3，4或，最优选，为所有的5种菌株ATCC 43617，14，358，216和2926。
无毒是指内毒素活性通过公知的LAL和热源性试验测定有显著的减少(2-4倍，优选10倍)。
疫苗组合物
本发明的另一个方面为含有本发明囊泡制剂和其它被用于抵抗特定疾病状态的抗原的疫苗组合物。人们已发现囊泡特别适用于与其它抗原配剂，因为对其被混合的抗原有有益的佐剂作用。
在本发明优选的组合的，meningoccocus B囊泡制剂与1，2，3或优选所有的4种下列简单的或结合于蛋白载体的脑膜炎球菌荚膜多糖一起配剂：A，C，Y或W。此疫苗可被有益的用作通用的脑膜炎球菌疫苗。使用本发明的脑膜炎球菌B囊泡制剂，也可想象配剂可选择的含有来自2或更多(优选几个)属于一些亚型/血清型(例如选自P1.15，P1.7，16，P1.4，和P1.2)的菌株的野生型脑膜炎球菌B囊泡制剂。
在另外一个优选的实施方案中，本发明脑膜炎球菌B囊泡制剂[或上述的2或多个野生型脑膜炎球菌B囊泡制剂的混合物]优选的与，1，2，3或优选所有的4种下列简单的或结合于蛋白载体的脑膜炎球菌荚膜多糖一起配剂：A，C，Y或W，与结合的流感嗜血杆菌b荚膜多糖，以及一或多个结合肺炎球菌荚膜多糖配剂。可选择的，疫苗也可含有一或多个可保护宿主抵抗肺炎链球菌感染的蛋白抗原。此疫苗可被有益地用作通用的脑膜炎疫苗。
肺炎球菌荚膜多糖抗原优选的选自血清型1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F(最优选的来自1，3，4，5，6B，7F，9V，14，18C，19F和23F)。
优选的肺炎球菌蛋白抗原为这些肺炎球菌的蛋白其暴露在肺炎球菌的外表面(在至少肺炎球菌的部分生活周期能够被宿主的免疫系统识别的)，或为肺炎球菌分泌或释放的蛋。最优选的，蛋白为毒素，粘附素，2-组分信号转导蛋白，或肺炎链球菌的脂蛋白，或其片段。特别优选的蛋白包括，但不限于：肺炎球菌自溶酶(优选通过嵌合处理或突变减毒)[Mitchell et al.Nucleic Acids Res.1990 Jul 11；18(13)：4010″来自肺炎链球菌基因和蛋白1和2型的比较″，Mitchell et al.Biochim Biophys Acta 1989Jan 23；1007(1)：67-72″肺炎球菌自溶酶基因在Escherichia coli中的表达：快速纯化和生物学特性″，WO 96/05859(A.Cyanamid)，WO 90/06951(Paton et al)，WO 99/03884(NAVA)]；PspA及其转膜缺失变体(US5804193-Briles et al.)；PspC及其转膜缺失变体(WO 97/09994-Briles et al)；PsaA及其转膜缺失变体(Berry & Paton，Infect Immun 1996 Dec；64(12)：5255-62″PsaA的序列异质性，推定的37-千道尔顿的肺炎链球菌的毒力所必需的粘附素″)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其转膜缺失变体；CbpA及其转膜缺失变体(WO 97/41151；WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Infect.Immun.1996 64：3544)；HSP70(WO 96/40928)；PcpA(Sanchez-Beato et al.FEMS Microbiol Lett 1998，164：207-14)；M类蛋白，SB专利申请EP 0837130；以及粘附素18627，SB专利申请EP0834568。其它优选的肺炎球菌蛋白抗原为公开在WO98/18931，尤其在WO 98/18930和PCT/US99/30390筛选的。
在另一个优选的实施方案中，本发明的粘膜炎莫拉氏菌囊泡制剂与与一或多种简单的或结合肺炎球菌荚膜多糖以及一或多个可以保护宿主抵抗非典型的流感嗜血杆菌感染的抗原配剂。可选择的，疫苗也可含有一或多个可保护宿主抵抗肺炎链球菌感染的蛋白抗原。疫苗也可可选择的含有能保护宿主抵抗RSV和/或一或多个可保护抗原抵抗流感病毒的抗原。此疫苗可被有益的用作通用的中耳炎疫苗。
优选的非典型的流感嗜血杆菌蛋白抗原包括Fimbrin蛋白(US5766608)及其含有来自(例如LB1融合物)(US 5843464-俄亥俄州研究基金会)，OMP26，P6，蛋白D，TbpA，TbpB，Hia，Hmw1，Hmw2，Hap，和D15的肽的融合物。
优选的流感病毒抗原包括完整的，活的或灭活的病毒，分裂的流感病毒，生长未成熟的或MDCK细胞，或Vero细胞或全流感病毒体(如R.Gluck，Vaccine，1992，10，915-920所描述的)或其纯化的或重组蛋白，例如HA，NP，NA，或M蛋白，或其重组物。
优选的RSV(呼吸道合胞病毒)抗原包括F糖蛋白，G糖蛋白，HN蛋白，或其衍生物。
在另一个实施方案中，本发明非典型的流感嗜血杆菌囊泡制剂与一或多个简单的或结合的肺炎球菌荚膜多糖，以及一或多个可保护宿主抵抗粘膜炎莫拉氏菌感染的抗原配剂。可选择的，疫苗可包含一或多个保护宿主抵抗Streptococcus pneumoni感染的蛋白抗原。疫苗也可选择的含有一或多个保护宿主抵抗RSV的抗原和/或一或多个保护宿主抵抗流感病毒的抗原。此疫苗可被有益的用作通用的中耳炎疫苗。
本发明的核苷酸序列
本发明的另一个方面涉及可被用于本发明方法中的新核苷酸序列。来自不同菌株的不同基因的特异性上游区域被提供其可被用于例如方法a)，b)，d)和h)。此外，编码序列被提供用于实施方法d)。
用于细菌基因的非编码侧接区分析的常规方法，且其用于囊泡中的基因的调控表达
特异性基因的非编码侧接区含有在基因的表达中重要的调控序列。此调控发生在转录和翻译的水平上。这些区域的序列，基因开放阅读框架的上游或下游序列，可被通过DNA测序来获得。此序列信息允许可能的调控元件的测定例如不同的启动子元件，终止子序列，诱导型序列元件，阻抑物，对位相变易起作用的元件，Shine-Dalgamo序列，带有与调控有关的潜在次级结构的的区域，以及其他类型的调控元件或序列。
此序列信息允许被研究的基因的天然表达的调节。基因表达额上题可被完成通过改变启动子，Shine-Dalgarno序列，潜在的阻抑物或操纵子元件，或任意其它有关的元件。同样地，表达的下调可通过类似类型的调控来获得。可选择的，通过改变位相变易序列，基因的表达可被置于位相变易的调控下，或脱离此种调控。在另一种方法中，基因的表达可被置于一或多种允许调控表达的诱导元件的调节下。此种调节的例子包括，但不限于，通过温度转换的诱导，诱导底物象所选的碳水化合物或其衍生物，痕量元素，维生素，辅因子，金属离子等的加入。
此修饰如上所述可被通过一些不同的方式被导入。与基因表达有关的序列的修饰可被体内通过随机的突变进行然后筛选所需的表型。另一种方法包括目的区域的分离和通过随机突变修饰，或位点直接替换，插入或缺失突变。修饰区然后被重新导入到细菌染色体组通过同源重组，对基因表达的影响可被评定。在另一个方法中，目的区域的序列信息可被用于替换或缺失所有或部分的天然调控序列。在此情况下，调控序列靶被分离和修饰来含有来自另一个基因的调控元件，来自不同基因的调控元件的组合物，合成的调控区，或任意其它的调控区，或删除野生型调控序列的所选部分。这些修饰的序列可然后被导入细菌中通过同源重组到染色体组中。
在方法b)中，例如，基因的表达可通过用强启动子交换其启动子被调节(通过基因上游序列的分离，体外修饰此序列，并通过同源重组重新导入到染色体组中)。上调表达可被获得在细菌中和在细菌脱落(或产生的)外膜载体中。
在另一个有选的实施例中，所描述的方法可被用于产生带有改进特性的重组细菌菌株中用于疫苗的应用。这些可以是，但不限于，减毒菌株，增加所选抗原表达的菌株，带有干扰免疫应答的基因的敲除(或降低表达)的菌株，以及带有免疫显性蛋白的调节表达的菌株。
SEQ ID NO：2-23，25，27-38为所有奈瑟氏菌上游序列(各种优选基因的起始密码子的上游)每一个含有大约1000bp。SEQ ID NO：39-62为所有粘膜炎莫拉氏菌上游序列(各种优选基因的起始密码子的上游)每一个含有大约1000bp。SEQ ID NO：63-75为所有流感嗜血杆菌上游序列(各种优选基因的起始密码子的上游)每一个含有大约1000bp。所有这些序列可被用于遗传学方法中(特别是同源重组)用于上调或下调其结合的开放阅读框架(如上所述)。SEQ ID NO：76-81为来自奈瑟氏菌，粘膜炎莫拉氏菌，和流感嗜血杆菌的HtrB和MsbB基因的编码区。这些序列可被用于遗传学方法中(特别是同源重组)用于下调(特别是删除)这些基因的一部分(优选全部)[方法d]。
本发明的另一个方面是分离多核苷酸序列其在高度严紧条件下与SEQ ID NO：2-23，25，27-81或其互补链的至少30个核苷酸部分的核苷酸杂交。优选的，分离的序列应足够长来与染色体序列进行同源重组，如果染色体序列是合适的杂体的一部分-也即至少30个核苷酸(优选至少40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，或500个核苷酸)。更优选的，分离的核苷酸应含有SEQ ID NO：2-23，25，27-81或其互补链的至少30个核苷酸(优选至少40，50，60，70，80，90，100，200，300，400，或500个核苷酸)。
此处所用的高度严谨杂交条件包括，例如6X SSC，5X Denhardt，0.5％SDS和100g/mL断裂和退火的鲑精DNA杂交，65℃过夜并用2X SSC洗涤，室温0.1％SDS一次大约10分钟然后65℃一次大约15分钟然后至少0.2X SCC洗涤一次，0.1％SDS室温下至少3-5分钟。
另一个方面是本发明分离的多核苷酸序列的应用在遗传学改造(例如转座子插入，或位点特异性突变或缺失，但优选同源重组事件)革兰氏阴性菌染色体基因的1000bp上游来增加或较少基因的表达。优选的，将进行重组的菌株与获得本发明上游序列的菌株相同。然而，脑膜炎球菌A，B，C，Ya和W以及淋病球菌染色体组足够的相似使得来自这些菌株的上游序列可适用于设计用于在其它菌株中进行此事件的载体。此也适用于流感嗜血杆菌和非典型的流感嗜血杆菌的情况。
实施例
下面的实施例通过标准方法来进行，其是本领域技术人员公知的和常规的，除非其另有具体描述。实施例是用来说明但并非限制本发明。
实施例1：没有荚膜多糖的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的构建
质粒pMF121(Frosch et al.，1990)被用于构建没有荚膜多糖的脑膜炎奈瑟氏菌B菌株。此质粒含有用于编码B组多糖(B PS)的生物合成途径的基因位点的侧接区，以及红霉素抗性基因。B PS的删除导致B型荚膜多糖表达的减少同样galE的活性拷贝的缺失导致半乳糖缺陷的LPS的合成。
菌株转化：
脑膜炎奈瑟氏菌B H44/76菌株(B：15：P1.7，16；Los3，7，9)被选择用于转化。MH平皿(不含红霉素)上CO2温育过夜，用含10mM MgCl2(2ml were used per MH plate)的液态MH收集细胞并稀释到OD为0.1(550nm)。加入4gl的质粒pMF121母液(0.5μg/ml)到2ml溶液中，37℃温育6小时(振荡)。对照组为相同量的脑膜炎奈瑟氏菌B细菌，单不加入质粒。在培养一段时间后，100μl培养物，本身，1/10，1/100和1/1000稀释度，在37℃培养48小时前，被置于含有5，10，20，40或80μ红霉素/的MH平皿中。
菌落印迹：
平皿培养后，20个菌落生长和选自10和20μg红霉素/ml MH平皿，而在没有质粒转化的对照组中没有菌落生长。H44/76野生型菌株不能够在选择性红霉素平皿上生长(10到80μg红霉素/ml)。然后，将所有的明显的菌落置于新的不含红霉素的MH平皿上来使其生长。后来，被转到硝化纤维纸上(菌落印迹杂交)来检验B多糖的存在。扼要地，菌落被印迹到硝化纤维纸用PBS-0.05％Tween 20直接漂净然后56℃在PBS-0.05％Tween 20(稀释的缓冲液)细胞失活1小时。然后，膜室温(RT)下在稀释的缓冲液中覆盖1小时。然后，纸被再次洗涤3次5分钟在稀释的缓冲液中然后用抗-B PS 735 Mab(Boerhinger)在稀释度为1/3000的稀释的缓冲液中RT下温育2小时。在新的洗涤步骤后(3次5分钟)，单克隆抗体被用来自Amersham(RPN 1001)在稀释缓冲液中稀释500倍的生物素酰化的抗-鼠Ig筛选(RT下1小时)然后进行下一次的洗涤步骤(如上所述)。然后，纸被在RT下用被在稀释缓冲液稀释1/1000的链霉抗生素-过氧化物酶复合物的溶液温育1个小时。在最后的3次利用相同方法的洗涤后，硝酸纤维素纸在黑暗中利用revelation溶液温育15分钟(10ml甲醇中加入30mg的4氯-1-萘酚溶液，40ml PBS和30mcl的来自Merck的H202 37％)。反应用蒸馏水洗涤步骤终止。
全细胞酶联免疫吸附测定(Elisas)：
利用两种转化的菌落(″D″和″R″)以及野生型菌株(H44/76)作为包被细菌(20μg蛋白/ml)，且一系列用于鉴定脑膜炎奈瑟氏菌菌株的不同单克隆抗体进行全细胞Elisas。下面的Mabs被测定：抗-B PS(735来自Dr Frosch)，以及其他的来自NIBSC的Mabs：抗-B PS(Ref95/750)抗-Pl.7(A-PorA，Ref4025)，抗-Pl.16(A-PorA，Ref95/720)，抗-Los3，7，9(A-LPS，Ref4047)，抗-Los8(A-LPS，Ref4048)，以及抗-P1.2(A-PorA Ref95/696)。
100gl的重组脑膜炎球菌B细胞溶液覆盖的微量滴定板(Maxisorp，Nunc)37℃在大约2μg/ml的PBS中过夜(ON)。然后，滴定板用300μl的150mM NaCI-0.05％Tween20洗涤3次，用100μl的PBS-0.3％Casein覆盖并在室温下振荡温育30分钟。然后与抗体温育前再次用相同的方法洗涤滴定板单克隆抗体。在下一次关键的洗涤步骤之前，单克隆抗体(100μl)以在PBS-0.3％Casein 0.05％Tween 20的不同稀释度(如附图2所示)被使用且在室温振荡温育30分钟前被置于微量培养板上。结合生物素且在PBS-0.3％Casein-0.05％Tween20中稀释到1/2000的100μl的抗鼠Ig(来自小兔，Dakopatts E0413)被加到小孔中检测结合的单克隆抗体。在洗涤步骤后(如上)，滴定板被与在相同溶液中稀释到1/4000的链霉抗生素-过氧化物酶复合物的溶液(100μl的AmershamRPN 1051)室温下振荡温育30分钟。在此温育和最后的洗涤步骤之后，滴定板与100μl的色原溶液(含有4mg正亚苯基二胺(OPD)的10ml 0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH4.5含有5μl H2O2)黑暗中温育15分钟。滴定板然后用分光光度计在490/620nm处进行读数。
结果：
附图1显示了在能够在带有红霉素的选择培养基上生长的20个分离的菌落中，仅有2个(“D”和“R”)菌落的不存在B多糖。在其他的菌落中，有16个显著的P BS阳性的且仍具有红霉素抗性。此表明整合了质粒到其染色体组中，但在错误的方向，且仍保留完整的B PS和LPS基因(没有双重的交叉互换)。阳性和阴性的对照也被在滴定板上测定。且显示了H44/76野生型NmB菌株显著的多对B多糖阳性，而脑膜炎球菌A(A1)和脑膜炎球菌C(C11)菌株显著的抗-B PS 735 Mab呈阴性。这些结果表明大约10％的所选的菌落被正确的整合质粒在其染色体组中通过产生双重的交叉互换，而其它的菌株/菌落在简单的交叉互换后被获得，保留了B PS和LPS基因的完整和表达。
利用全细胞Elisa，结果(附图2和下表2)清楚地表明了两个″D″和″R″转化(获自D和R菌落)不能被抗-B PS Mabs(735和95/750)识别，也不能被抗-Los3，7，9和抗-Los8 Mabs识别。然而，当利用特异性抗-PorAMabs时，在细胞上，与抗-P1.7和抗-P1.16 Mabs有明显的反应，同时也被在野生型菌株中观察到。与非特异性抗-PorA Mab(抗-P1.2mab)没有观察到反应。这些结果证明PorA蛋白，和特异性PI.7和PI.16表面决定簇在转化后仍然存在，而B多肽Los3.7，9和Los8表面决定簇(LPS不存在不存在。
表：被检验的单克隆抗体的特异性
试验Mabs 直接抵抗 结果
抗-B PS 735 B多糖 ++在野生型菌株上(-)在“D”和“R”变体上
来自NIBSC的抗B PS 95/750 B PS ++在野生型菌株上(-)在“D”和“R”变体上
抗-P1.7(NIBSC) 孔蛋白A的环1 ++在野生型和变体菌株上
抗-P1.6(NIBSC) 孔蛋白A的环4 ++在野生型和变体菌株上
抗-Los3，7，9 LPS ++在野生型菌株上(-)在“D”和“R”变体上
抗-Los8(NIBSC) LPS ++在野生型菌株上(-)在“D”和“R”变体上
抗-P1.2(NIBSC) 抗-孔蛋白A血清-亚型1.2 (-)在野生型和变体菌株上
实施例2：靶向脑膜炎奈瑟氏菌的porA位点的整合的多用途基因传递载体(pCMK系列)的构建
使得外源DNA在脑膜炎奈瑟氏菌的porA位点同源重组和稳定插入的质粒被构建。此传递载体(基因，操纵子和/或表达盒)有用于构建脑膜炎奈瑟氏菌菌株生产重组改进的囊泡。典型的，此种载体至少包括：(1)在大肠杆菌中能复制但不在脑膜炎奈瑟氏菌中复制的质粒骨架(一个自杀质粒)，(2)在至少一个，优选两个靶向染色体组位点例如porA的整合的同源区，(3)在脑膜炎奈瑟氏菌中行使功能的有效的转录(启动子，调控区和终止子)和翻译(最佳的核糖体结合位点和起始密码子)信号，(4)多克隆位点和(5)允许质粒维持在大肠杆菌中以及脑膜炎奈瑟氏菌中整合子的选择的可选择的基因。其它的元件包括，例如，促进外源DNA进入脑膜炎奈瑟氏菌的摄取序列，以及反向选择的标记例如增强双重交叉互换频率的sacB，rpsL，gltS。
此实施例中的载体构建和指定的的图表说明被描述在附图3中。其相应的完整核苷酸序列被显示于SEQ.ID NO：1。获自pSL 1180骨架的pCMK(PharmaciaBiotech，Sweeden)，在大肠杆菌中的高拷贝数质粒，携带bla基因(因此赋予氨苄青霉素抗性)。此外，pCMK功能地含有两个同源重组必需的porA侧接区(porA5′和porA3′含有一个转录终止子)，一个带有卡那霉素抗性的选择性标记，两个摄取序列，一个被阻抑在表达lacIq的大肠杆菌宿主中但在脑膜炎奈瑟氏菌中有转录活性的porA/lacO嵌合启动子，以及一个外源DNA在pCMK的插入所必需的复合克隆位点(5个位点为：NdeI，XpnI，NheI，PinAl，和SphI)。
pCMK被构建如下：porA5′和porA3′重组区，porA/lacO启动子被利用下表所列举的寡核苷酸PCR扩增，在pTOPO中克隆和测序。这些DNA片段被从pTOPO连续地切除并在pSL1180中再次克隆。卡那霉素抗性盒被从pUC4K切除(PharmaciaBiotech，Sweeden)病导入到porA5′侧接区和porA/lacO启动子区之间。
表：此操作中所用的寡核苷酸
Figure A0081384200431
实施例3：缺乏荚膜多糖和主要免疫显性抗原PorA的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的构建
外膜囊泡的抗原内含物的调节可有利于改进其在疫苗，或诊断或治疗应用中的安全性和有效性。内容物例如脑膜炎奈瑟氏菌血清型B荚膜多糖应被去除来排除诱导自身免疫的危险(参见实施例1)。类似地，有益于抑制主要免疫抗原例如诱导菌株特异性杀菌抗体但不赋予其交叉保护的免疫显性。为了阐明此种方法我们使用哦尼能够我们使用pCMK(+)载体来构建缺乏荚膜多糖和主要免疫显性PorA外膜蛋白抗原的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株。为实现此目的，porA基因的一个缺失被导入到H44/76cps-菌株中，通过实施例1中所描述的同源重组的方式。
H44/76cps-菌株被有效地的制备并用两个2μg的超螺旋pCMK(+)质粒DNA转化。等分试样的转化混合物(100μl)被置于带有卡那霉素(200μg/ml)的Mueller-Hinton平皿上病37℃培养24到48小时。卡那霉素-抗性菌落被选择，在MH-Kn上37℃重新划线培养24个小时。在细菌培养的一半阶段时，被用于制备甘油原液(15％vol./vol.)被-70℃保存。另一部分试样(估计108个细菌)被重悬浮在15μl蒸馏水中，煮沸10分钟用作PCR筛选的模板。两个porA内引物，PPA1和PPA2，被合成并用于在制造商提供的条件下PCR扩增煮沸的细菌溶解产物(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。所用热循环如下：25次(94℃1min.，52℃1min.，72℃3min.)以及1次1(72℃10min.，4℃适于恢复)。pCMK DNA和和染色体porA位点之间的双重交叉互换删除#1和#2退火所需的区域，缺少1170bp PCR扩增片段的克隆被筛选作为porA缺失突变体。这些PCR结果被进一步的证实通过相应的细菌蛋白提取物的PorA存在的并列分析。为实现此目的，另一细菌的等分试样(估计5.108细菌)被重悬浮在50μl的PAGE-SDS缓冲液中(SDS 5％，甘油30％，β-氢硫基乙醇15％，溴酚蓝0.3mg/ml，Tris-HCI 250mM pH6.8)，煮沸(100℃)冰冻(-20℃)/煮沸(100℃)3次并通过在12.5％凝胶上PAGE-SDS电泳分离，凝胶然后被考马斯亮蓝R250染色或转到硝化纤维膜上并用Maniatis等人所描述的抗-PorA单克隆抗体探测。如附图4所述，考马斯和免疫染色证明porA PCR阴性克隆不产生可检测的PorA的水平。此结果证明pCMK载体是有功能的且可以成功的靶向DNA在porA基因中的插入，终止了PorA外膜蛋白抗原的同时的产生。
实施例4：来自重组的缺少功能性PorA和cps基因的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的囊泡产生NspA外膜蛋白的上调
带有保护性抗原的囊泡水疱有益于提高基于外膜蛋白的疫苗的效率和范围。在上下文中，重组的缺少功能性PorA和cps基因的脑膜炎奈瑟氏菌被工程改造使得外膜蛋白NspA的表达水平被上调。为实现此目的，编码Nspa的基因被使用N01-full-NdeI和NdeI-3`寡核苷酸引物进行PCR扩增(参见实施例2的表)。PCR所用的条件如生产商所述(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。所用热循环如下：25次(94℃1min.，52℃1min.，72℃3min.)以及1次1(72℃10min.，4℃适于恢复)。相应的扩增子用NdeI降解并插入到pCMK(+)传递载体的NdeI限制性位点。插入的方向被检查且重组质粒，设计的pCMK(+)-NspA，被通过QIAGEN maxiprep试剂盒被大规模纯化且2μg的此种物质被用于转化缺少缺少功能性cps基因的脑膜炎奈瑟氏菌B型菌株(菌株被描述在实施例1中)。pCMK(+)-NspA载体和染色体porA位点之间的双重交叉互换产生的整合通过PCR和实施例3中所述的Western印迹杂交筛选方法的结合被筛选。
细菌(相应的大约5.108个细菌)被重悬浮在50μl的PAGE-SDS缓冲液中，冰冻(-20℃)/煮沸(100℃)3次且然后在12.5％凝胶上通过PAGE-SDS电泳分离。凝胶然后被考马斯亮蓝R250染色或转到硝化纤维膜上并用抗-NspA多克隆血清探测。考马斯(无数据显示)和免疫染色(见附图4)证明porA PCR阴性克隆不产生可检测的PorA的水平。检测全细胞溶解产物(WCBL)或来自NmB[cps-，porA-]or NmB[cps-，porA-，Nspa+]的外膜囊泡制剂的NspA的表达。尽管考马斯染色没有观察到差别，用抗-NspA多克隆血清进行的免疫印迹检测到3-5倍的NspA在WCBL和外膜囊泡制剂(见附图5)中表达的增加(与内源NspA水平相比)。此结果证明pCMK(+)-NspA载体是有功能的且可被用于成功的上调外膜蛋白例如NspA的的表达，去除PorA外膜蛋白抗原的同时生产。
实施例5：来自重组的缺少功能性cps基因但表达PorA的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株的囊泡的D15/Omp85外膜蛋白抗原的上调
特定的独立的人群(例如古巴)被属于一或一些外膜蛋白的有限数目的脑膜炎奈瑟氏菌分离物感染。由于PorA是主要的诱导保护性和菌株特异性杀菌抗体的外膜蛋白抗原，其有可能通过有限量的疫苗中的porA血清型赋予疫苗保护性。在此上下文中，PorA在外膜水疱中的存在可能是有益于加强此种重组改进囊泡的疫苗效力。此含有疫苗的PorA，然而可通过增加其它的交叉反应OMPs例如omp85/D 15的水平被进一步的提高。
在下面的实施例中，pCMK(+)载体被用于上调Omp85/D15外膜蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表达porAde de菌株中的表达。为实现此目的，编码Omp85/D15的基因通过利用D15-NdeI和D15-NotI寡核苷酸引物进行PCR扩增。PCR所用的条件如生产商所述(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。进行如下热循环：25次(94℃1min.，52℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃适于恢复)。相应的扩增子依据生产商的说明被插入到pTOPO克隆载体中并进行测序证实。此Omp85/D 15 DNA片段被利用NdeI/NsiI限制性水解从pTOPO上切除随后在pCMK(+)传递载体的相应限制性位点处克隆。重组质粒，试验用pCMK(+)-D15通过QIAGEN maxiprep试剂盒被大规模纯化且2μg的此种物质被用于转化缺少缺少功能性cps基因的脑膜炎奈瑟氏菌B型菌株(菌株被描述在实施例1中)。为了保持porA的表达，单交叉互换(在Omp85/D15或在porA)产生的整合被通过PCR和Western印迹筛选方法的结合来筛选。PorA-特异性PCR和western印迹阳性的卡那霉素抗性克隆被-70℃保存作为甘油原种用于进一步的研究。
细菌(相应的大约5.108个细菌)被重悬浮在50μl的PAGE-SDS缓冲液中，冰冻(-20℃)/煮沸(100℃)3次且然后在12.5％凝胶上通过PAGE-SDS电泳分离。凝胶然后被考马斯亮蓝R250染色或转到硝化纤维膜上并用抗-PorA单克隆血清探针检测。如附图6所示，考马斯和免疫染色证明porA PCR阳性克隆产生PorA。
D15的表达被通过来自NmB[cps-，porA-]或NmB[cps-，porA+，D15+]的外膜囊泡制剂检测。考马斯检测到D15制剂，(附图6)表达的显著的增加(与内源D15的水平相比)。此结果证明pCMK(+)-D15载体载体是有功能的且可被用于成功的上调外膜蛋白例如D15的表达，没有去除主要PorA外膜蛋白抗原的同时的产生。
实施例6：多用途启动子传递载体的构建
合理的：此方法的合理性表示在附图7中且可被概述在7个必要的步骤中。这些步骤中的一些在下面用于上调NspA和D15/Omp85表达的载体的构建来阐述。
上调NspA基因表达的载体
步骤1.一个位于NspA编码基因的上游的DNA区(997bp)被发现(SEQ.ID NO：2)在含有脑膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的未成熟染色体组DNA序列的个人Incyte PathoSeq数据库中。两个寡核苷酸PNS1和PNS2(见实施例2的表)被使用此序列设计和合成。这些引物被通过利用获自H44/76菌株的染色体组进行PCR扩增。步骤2.相应的扩增子通过Wizard PCR试剂盒(Promega，USA)被清除并且用EcoRI/XaI限制性酶降解24小时，使用的条件如供应商所述(BoehringerMannheim，Germany)。相应的DNA片段被凝胶纯化并插入到pUC18克隆载体的相应位点。步骤3：重组质粒被大规模制备且等分试样被用作模板用于反向PCR扩增。反向PCR利用PNS4和PNS5进行，采用下述的热循环条件：25次(94℃1min.，50℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃恢复)。在NspA上游区插入携带缺失的线性化pUC 18载体被获得。
上调D15/omp85基因表达的载体
步骤1.一个位于D15/omp85编码基因的上游的DNA区(1000bp)被发现(SEQ.ID NO：3)在含有脑膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的未成熟染色体组DNA序列的个人Incyte PathoSeq数据库中。两个寡核苷酸PromD15-51X和PromD15-S2(见实施例2的表)被使用此序列设计和合成。这些引物被通过利用获自H44/76菌株的染色体组进行PCR扩增。步骤2.相应的扩增子通过Wizard PCR试剂盒(Promega，USA)被清除并且用EcoRI/XaI限制性酶降解24小时，使用的条件如供应商所述(Boehringer Mannheim，Germany)。相应的DNA片段被凝胶纯化并插入到pUC18克隆载体的相应位点。步骤3：重组质粒被大规模制备且等分试样被用作模板用于反向PCR扩增。反向PCR利用PromD15-51X和PromD15-S2进行，采用下述的热循环条件：25次(94℃1min，50℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃恢复)。在NspA上流区插入携带缺失的线性化pUC 18载体被获得。
实施例7：生产重组囊泡的发酵方法。
本实施例列举了下述的生产缺少荚膜多糖或荚膜多糖和PorA的重组囊泡的方法。此方法可被用于广泛的脑膜炎奈瑟氏菌重组菌株并且可在延展的范围上被修改。
培养基：脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株在固体(FNE 004 AA，FNE010 AA)或液体(FNE 008 AA)培养基上繁殖。这些新的用于脑膜炎球菌生长的培养基不含动物产物是有利的，且可被认为是本发明的一个方面。
    组分   FNE 004 AA  FNE 008 AA  FNE 010 AA
    琼脂     18g/L      -     18g/L
    NaCl     6g/L     6g/L     6g/L
  Na-谷氨酸盐       -     1.52g/L      -
 NaH2PO4-2H2O     2.2g/L     2.2g/L     .2g/L
    KCl     0.09g/L     0.09g/L     0.09g/L
    NH4Cl     1.25g/L     1.25g/L     1.25g/L
    葡萄糖     5g/L     20g/L     5g/L
 酵母提取物UF       -     2.5g/L      -
   大豆蛋白胨     5g/L     30g/L     5g/L
   CaCl2.2H2O     0.015g/L      -     0.015g/L
   MgSO2.7H2O     0.6g/L     0.6g/L     0.6g/L
    红霉素     0.015g/L      -      -
   卡那霉素       -      -     0.2g/L
脑膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-重组囊泡的摇瓶培养：进行两步法培养包括在固体培养基上进行预培养然后进行液体培养。固体预培养。从冰库(-80℃)取出一小瓶种子，室温下解冻且0.1mL被划线培养在含有15mL的FNE004AA(参见上述的)的陪替氏培养皿上。陪替氏培养皿37℃下培养18±2小时。表面生长物被重悬浮在8mL的添加15mg/L红霉素的FNE008AA(参见上述的)中。摇瓶培养.2mL的悬浮的固体预培养物被加到2升的含有400mL添加了15mg/L红霉素的FNE008AA的摇瓶中。摇瓶被置于摇床(200rpm)上且37℃培养16±2个小时。通过4℃下5000g离心15分钟从培养基中分离细胞。
脑膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-重组囊泡的分批培养：培养包括在固体培养基上进行预培养，液体培养和分批培养。固体预培养。从冰库(-80℃)取出一小瓶种子，室温下解冻且0.1mL被划线培养在含有15mL的FNE004AA(参见上述的)的陪替氏培养皿上。陪替氏培养皿37℃下培养18±2小时。表面生长物被重悬浮在8mL的添加15mg/L红霉素的FNE008AA(参见上述的)中。液体预培养培养.2mL的悬浮的固体预培养物被加到2升的含有400mL添加了15mg/L红霉素的FNE008AA的摇瓶中。摇瓶被置于摇床(200rpm)上且37℃培养16±2个小时。摇瓶的内容物被用于20升发酵罐的接种。在发酵罐中的分批培养。接种物(400mL)被加到预先消毒的20升(总体积)含有10L的添加了15mg/L红霉素的FNE008AA的发酵罐中。通过自动装置加入NaOH(25％w/v)和H3PO4(25％v/v)调pH且维持在7.0。温度被控制在37℃。通风速率维持在20L空气/分钟且可溶氧通过控制搅拌速度被维持在20％的饱和度。发酵的超压被维持在300g/cm2。在培养9±1小时后，培养物处于不变的状态。通过4℃下5000g离心15分钟从培养基中分离细胞。
脑膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-，PorA-，重组囊泡的摇瓶培养：进行两步法培养包括在固体培养基上进行预培养然后进行液体培养。固体预培养。从冰库(-80℃)取出一小瓶种子，室温下解冻且0.1mL被划线培养在含有15mL的FNE004AA(参见上述的)的陪替氏培养皿上。陪替氏培养皿37℃下培养18±2小时。表面生长物被重悬浮在8mL的添加200mg/L红霉素的FNE008AA(参见上述的)中。摇瓶培养.2mL的悬浮固体预培养物被加到2升的含有400mL添加了200mg/L红霉素的FNE008AA的摇瓶中。摇瓶被置于摇床(200rpm)上且37℃培养16±2个小时。通过4℃下5000g离心15分钟从培养基中分离细胞。
实施例8：来自缺乏荚膜多糖的脑膜炎球菌的囊泡的分离和纯化
重组囊泡被纯化如下所述。细胞团(42gr)被悬浮在211ml的pH8.6含有10mM EDTA和0.5％脱氧胆酸钠(DOC)的0.1M Tris-Cl缓冲液中。缓冲液与生物质的比例为5/1(V/W)。通过在室温下磁搅拌30分钟提取生物质。总的提取物然后4℃20,000g离心30分钟(A-20转子13,000rpm，Beckman J2-HS离心机)。颗粒状物被丢弃。上清液4℃，125,000g超离心2两小时(50.2Ti转子40,000rpm，Beckman L8-70M超速离心机)来收集水疱。上清液被丢弃。颗粒状物然后悬浮在25ml的pH8.6含有2mM EDTA，1.2％DOC和20％蔗糖的50mM Tris-CI缓冲液中。在4℃，125,000g的第二次超离心两小时步骤后，水疱被温和地悬浮在44ml的3％蔗糖中且4℃下储存。用于囊泡提取和纯化的所有溶液含有0.01％硫柳汞钠。如附图8所阐明的，此方法产生高度富含于外膜蛋白例如PorA和PorB中的蛋白制剂。
实施例9：适于抗原编码基因的细菌启动子的鉴定
强细菌启动子元件的应用对于获得编码外膜蛋白基因的上调是必需的。在上下文中，我们在前面显示脑膜炎奈瑟氏菌nspA，hsf，和omp85基因利用porA启动子的上调允许我们分离富含在相应的NspA，Hsf和Omp85蛋白中的重组囊泡。可选择的，porA启动子可被用于获得上调的不同水平，来克服可能的porA相变和/或来获得有条件的基因表达(铁调控的启动子)。在此我们描述了一种方法允许可能在细菌中赋予高水平表达的强启动子元件的正确转录起始位点的鉴定。由于启动子调控元件典型的包含在+1位点的200bp上游和50bp下游之间(Collado Vides J，Magasanik B，Gralla JD，1991，Microbiol Rev55(3)：371-94)，此实验的结果允许我们来鉴定大约250bp的携带强启动子活性的DNA片段。主要的外膜蛋白例如脑膜炎奈瑟氏菌PorA，PorB & Rmp，流感嗜血杆菌PI，P2，P5 & P6，粘膜炎莫拉氏菌OmpCD，OmpE，以及这些细菌的胞质和/或铁调控的蛋白具有强启动子元件。作为此基本方法的验证，我们通过cDNA元件的快速扩增图绘了强脑膜炎奈瑟氏菌porA和porB启动子的转录位点(5′RACE)。
5′RACE的原理如下：1)利用QIAGEN″RNeasy″试剂盒的总RNA提取。染色体组DNA通过Dnase处理去除然后QIAGEN纯化；2)用porA特异性3`末端引物(porA 3)进行mRNA逆转录。期望的cDNA大小：307nt。通过碱水解去除RNA；3)通过T4 RNA连接酶结合单链DNA寡锚钩(称为DT88)到cDNA的3`末端。理想的产物大小：335nt。A利用hemi-巢式PCR的组合扩增锚钩结合的cDNA；4)利用互补序列锚定引物作为5`末端引物(称为DT89)和其在3`末端RT引物porA 3中的3`末端引物(称为p1-2)PCR扩增锚钩结合的cDNA。理想的产物大小：292bp；5)PCR扩增前面的PCR产物通过使用DT89作为5′末端引物以及pl-1(pl-2内)作为3′末端引物。理想的产物大小：21lbp；以及6)用pl-1引物进行测序(期望的产物大小可被计算因为在“ATG”翻译起始位点的porA转录起始位点是已知的：59)。
实验步骤
总RNA从脑膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-porA+菌株的大约109个细胞提取。通过QIAGEN″RNAeasy″试剂盒按照生产商的说明书进行提取1ml的适当的光学密度(OD600＝1)的液体培养物。染色体DNA被除去通过加入10U的不含RNase的Dnase(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)到30μl的洗脱RNA中且37℃培养15分钟。不含DNA的RNA被用相同的QIAGEN试剂盒按照说明书纯化。
通过使用引物porA3和200U的SUPERSCRIPT II逆转录酶(LifeTechnologies)进行逆转录反应。RT反应在含有5gl的2mM dNTP，20pmol的porA3引物，5μl的10X SUPERSCRIPT II缓冲液，9μl的25mM MgCl2，4μl的0.1M DTT，40U的重组核糖核酸酶抑制剂和1μg的总RNA的50μl体积溶液中反应。在加入SUPERSCRIP II之前porA3引物被逐步退火(70℃2min，65℃1min，60℃1min，55℃1min，50℃1min和45℃1min)。RT反应被进行42℃30min，然后5个循环(50℃1min，53℃1min以及56℃1min)来改变RNA次级结构。进行两个平行的反应，其中的一个反应不加逆转录酶作为阴性对照。
在68℃温育5分钟前通过加入1μl的0.5MEDTA然后加入12.5μl的0.2MNaOH的碱性水解来除去RNA。反应通过加入12.5μl的1MTris-HCI(pH7.4)中和。并通过加入20μg的糖原(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)，5μl的3M醋酸钠以及60μ的异丙醇被沉淀。两个样品均被重悬浮在20μl的10∶1 TE(10mM Tris-HCI，pH7.4；1mM EDTA，pH8)中。
T4 RNA连接酶被用于锚定5′-磷酰化的，3′末端ddCTP阻抑的锚定寡核苷酸DT88(见下表)。两个平行的实验在室温下进行且每一含有：1.3μl的10X RNA连接酶缓冲液(Roche Molecular Biochemicals)，0.4μM DT88，10μl的cDNA或RT对照试样以及3U的T4 RNA连接酶。作为阴性对照，进行第二组的结合试验，省略T4 RNA连接酶，产生的未直接纯化的连接反应混合物被用在随后的PCR中。
锚钩连接的cDNA通过使用hemi-巢式和热启动的PCR方法的联合被扩增来增加特异性和产物产量。RT/连接酶反应液和对照被进行四个独立的第一循环PCR且在30μl的体积中进行，每一含有：3μl的10X TaqPlatinium缓冲液，3μl的25mM MgCl2，1μl的10mM dNTP，10pmol的每种引物以及1μl的RNA结合反应液。PCR通过使用Taq Platinium(Life Technologies)DNA聚合酶(加入2U)被热启动。第一次连接锚定的PCR(LA-PCR)通过使用10pmol的锚钩特异性引物DT89和3`末端RT引物porA 3内的转录特异性引物pl-2(见下表)来进行。PCR被进行通过采用起始95℃5min步骤(用于DNA聚合酶激活)然后10个循环95℃10s和70℃1min(每个循环减少1度)，15循环的95℃10s和60℃1min。第二组hemi-巢式LA-PCR在相同条件下进行使用引物DT89和pl-2内部的引物，加之10pmol的p1-1(见下表)和1μl的第一循环的PCR。在送至测序前，扩增的产物通过使用QIAGEN″QIAquickPCR purification″试剂盒按照生产商的说明书进行纯化。
CEQTMDye Terminator Cycle测序试剂盒(Beckman，France)被用于RACE PCR产物的测序采用10pmol引物pl-1。测序反应被通过按照说明书进行且测序产物被通过Ceq2000 DNA分析系统(Beckman-Coulter)分析。
DT88  5′GAAGAGAAGGTGGAAATGGCGTTTTGGC3′
DT89  5′CCAAAACGCCATTTCCACCTTCTCTTC3′
porA3  5′CCAAATCCTCGCTCCCCTTAAAGCC3′
pl-2  5′CGCTGATTTTCGTCCTGATGCGGC3′
pl-1  5′GGTCAATTGCGCCTGGATGTTCCTG3′
脑膜炎奈瑟氏菌porA启动子的结果
采用所述的通过5′RACE操作图绘了脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(菌株H44/76)porA-mRNA的转录起始的ATG起始密码子的59bp上游。此结果证实了通过引物延伸进行且被van der Ende等人(1995)公开的绘图。此结果支持含有porA ATG的-9到-259核苷酸的DNA片段适于推动脑膜炎奈瑟氏菌和可能的在其它细菌例如嗜血杆菌属，摩拉克氏菌属，假单胞菌属中的强基因表达。
脑膜炎奈瑟氏菌porB启动子的结果
相同的试验策略被用于脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(菌株H44/76)porB转录起始位点的图绘。下列表中的与3′末端RT引物(porB3)，转录特异性引物对应的对应的引物在porB2(porB1)内。porB3，porB2和porB1分别位于ATG起始密码子的265bp，195bp和150bp下游。
porBI  5′GGTAGCGGTTGTAACTTCAGTAACTT3′
porB2  5′GTCTTCTTGGCCTTTGAAGCCGATT3′
porB3  5′GGAGTCAGTACCGGCGATAGATGCT3′
利用porB1和DT89引物进行5′-RACE绘图获得了一个～200bp的PCR扩增子。由于porBlis位于距离porB ATG起始密码子150bp处，此结果支持porB t转录起始位点位于porB ATG的大约50bp(+/-30bp)上游处。
对应于转录起始的准确的核苷酸目前通过DNA测序被测定。上述的PCR结果支持含有相对于porBATG起始密码子的-1到-250处核苷酸的DNA片段适于推动脑膜炎奈瑟氏菌和可能的在其它细菌例如嗜血杆菌属，摩拉克氏菌属，假单胞菌属中的强基因表达。
实施例10：通过启动子替换上调脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的Omp85基因
实验的目的是要用强porA启动子替换D15/Omp85基因的内源启动子区来上调D15/Omp85抗原的产生。为实现此目的，利用大肠杆菌克隆方法构建启动子替换质粒。位于D15/omp85编码基因的上游的DNA区(1000bp)被发现(SEQ ID NO：3)在含有脑膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC13090的未成熟染色体组DNA序列的private Incyte PathoSeq数据库中。此方法的主要步骤被阐述在附图9中。简要的，包含相对于D15/Omp85基因起始密码子(ATG)为核苷酸-48到-983的DNA片段(1000bp)被利用分别含有EcoRI和XbaI限制性位点(加下划线)的寡核苷酸ProD15-51X和Pro15-52(
Figure A0081384200552
)进行PCR扩增。此片段被限制并被插入到用相同酶限制的pUC18质粒中。获得的构建物被使用由New England Biolabs(MA，USA)商业生产的Genome Priming系统(使用pGPS供体质粒)在体外进行突变。已被插入微转座子(来自Tn7且携带氯霉素抗性基因)的克隆被筛选。一个含有在距离EcoRI位点下游的401bp处的D15/Omp85 5`侧接区插入微转座子的克隆被分离并用于进一步的研究。此质粒被递交循环PCR突变(Jones & Winistofer(1992)，Biotechniques12：528-534)来(i)来删除转座过程产生的重复DNA序列(Tn7R)，(ii)插入用于转化的脑膜炎球菌吸收序列，以及(iii)插入合适的允许外源DNA物质例如启动子克隆的限制性位点。循环的PCR被进行利用含有吸收序列和合适的加下划线的限制性位点(KpnI和XbaI)TnRDlS-KpnI/Xbal+US( AGC CGT CTG AAC CAC TCG TGG ACA ACC C-3′)& TnR03Cam(KpnI)的寡核苷酸。产生的PCR片段被凝胶纯化，用Asp718(KpnI的同切点酶)降解并连接到含有porA启动子的184bp DNA片段上并通过利含有KpnI限制性位点的PorA-01(
Figure A0081384200555
和PorA02(
Figure A0081384200556
3′)寡核苷酸进行PCR获得的。携带在正确方向(转录从EcoRI到XbaI的方向进行)插入porA启动子的重组克隆被选择并用于转化缺少荚膜多糖和一种主要的外膜蛋白PorA(porA-)的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的菌株。产生于双重交叉互换事件的重组的脑膜炎奈瑟氏菌克隆(利用寡核苷酸Cam-05(5′-GTA CTG CGA TGA GTG GCA GG-3′)& proD15-52的PCR筛选)被置于含有5μl/ml氯霉素的GC培养基上筛选并分析D15/Omp85的表达。如附图10所描述的，与亲本菌株(cps-)相比，D15/Omp85的产生显著的增加了由启动子替换产生的Nm菌株的总蛋白提取物。当分析由相同菌株制备的外膜囊泡时也观察到此结果(参见附图17)。这些结果得益于内源D15启动子被强porA启动子的替换。此外，令人吃惊地发现当porA启动子被导入到起始密码子上游的大约400bp处时，表达是启动子被替换在大约100bp的上游时的50倍。总而言之，这些实验支持了启动子替换策略并允许整合的外膜蛋白在外膜囊泡中合成的上调。
特定的独立人群(例如古巴)被属于一或一些外膜蛋白的有限数目的脑膜炎奈瑟氏菌分离物感染。由于PorA是主要的诱导保护性和菌株特异性杀菌抗体的外膜蛋白抗原，其可能通过有限量的porA血清型赋予疫苗保护性。此外，PorA与其他的外膜蛋白相互作用或使其更加稳定。在此上下文中，PorA在外膜水疱中的存在可能是有益于加强此种重组改进囊泡的疫苗效力。
因为此原因，D15/Omp85外膜蛋白蛋白在缺少功能性cps基因但表达PorA染色体组DNA的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株中的表达的上调是人们所期望的。染色体组DNA从重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-，porA-，D15/Omp85+菌株中通过使用QIAGEN Genomic Tips 100-G试剂盒提取。10μg此物质被线性化并通过典型的转化方法用于转化脑膜炎奈瑟氏菌血清组B cps-。在含有5μgr/ml氯霉素的GC琼脂平皿上获得重组奈瑟氏菌。
D15基因的上游的双重交叉互换产生的整合被通过前面所述的PCR筛选。因为同源重组克在染色体的任意处发生，第二种PCR筛选方法被进行来控制重组菌株中的porA部位的整合。为实现此目的，内部的porA引物PPA1(5-GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C-3′)和PpA2(5-GGCATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3′)被用在PCR筛选试验中。1170bp片段的扩增证明了porA基因在重组细菌中的存在。
重组细菌(相应的大约5.108个细菌)可被重悬浮在50μl的PAGE-SDS缓冲液中，冰冻(-20℃)/煮沸(100℃)3次然后通过PAGE-SDS电泳在12.5％凝胶上分离。凝胶用考马斯亮蓝R250染色或转到硝化纤维膜上用抗-porA单克隆抗体或抗-D15/Omp85兔多克隆抗体探针检测。由相同菌株制备的外膜囊泡的分析也被进行。
实施例11：缺少功能性cps基因但表达PorA的重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型组B菌株的Hsf蛋白抗原的上调
如上所述，在特定的国家中，PorA在外膜囊泡中的存在可能是有益的，且可加强重组改进囊泡的疫苗效力。在下面的实施例中，我们使用修饰的pCMK(+)载体来上调Hsf蛋白抗原在缺少功能性cps基因但表达PorA的菌株中的表达。原始的pCMK(+)载体含有一个嵌合的在表达lacIq的大肠杆菌宿主中被抑制但在脑膜炎奈瑟氏菌有转录活性的porA/lacO启动子。在修饰的pCMK(+)，天然的porA启动子被用于推动hsf基因的转录。编码Hsf的基因被利用列在下表中的HSF 01-NdeI和HSF 02-NheI寡核苷酸引物PCR扩增。因为用HSF 01-NdeI作为引物，表达的Hsf蛋白将在5`末端含有两个甲硫氨酸残基。PCR扩增的条件是供应商所描述的(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。采用下述的热循：25次(94℃1min.，50℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃恢复)。相应的扩增子然后被被克隆到相应的pCMK(+)传递载体的限制性位点中。在此重组质粒，设计的pCMK(+)-Hsf中，我们删除了存在于嵌合porA/lacO中的lacO通过一个重组PCR策略(见附图12)。pCMK(+)-Hsf质粒被用作模板来PCR扩增2个独立的DNA片段。
-片段1含有porA5′重组区，卡那霉素抗性基因和porA启动子。所用的寡核苷酸引物，RP1(SacII)和RP2，被列在下列的表中。RP1引物刚好与lac操纵子的上游序列同源。
-片段2含有来自porA基因的Shine-Dalgarno序列，hsf基因和porA3′重组遗传区。所用的寡核苷酸，RP3和RP4(ApaI)，被显示于下表中。RP3引物与lac启动子的下游序列同源。片段1的3`末端和片段2的5`末端具有48个核苷酸的重叠。500ng的每一PCR(1和2)被用作使用引物RP1和RP4的最后的PCR。最后获得的扩增子被亚克隆到用SacII和ApaI限制的pSL 1180载体中。修饰的质粒pCMK(+)-Hsf被大规模的纯化利用QIAGEN maxiprep试剂盒和2μg的此种物质被用于转化缺少功能性cps基因的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株(在实施例1中描述的菌株)。为了维持porA的表达，单交叉互换产生的整合通过PCR和Western印迹筛选法的联合被筛选。porA-特异性PCR和western印迹的联合测试阳性的卡那霉素抗性克隆在-70℃保存作为甘油原种并用于进一步的研究。细菌(相应的大约5.108个细菌)被重悬浮在50μl的PAGE-SDS缓冲液中，冰冻(-20℃)/煮沸(100℃)3次且然后被通过PAGE-SDS电泳在12.5％的凝胶上分离。Hsf的表达被检测在来自NmB[Cps-，PorA+]或NmB[Cps-，PorA+，Hsf+]的全细胞细菌溶解产物(WCBL)中。考马斯染色检测Hsf表达的显著增加(与内源Hsf的水平相比)(参见附图13)。此结果证明修饰的pCMK(+)-Hsf载体是功能性的且可被用于成功的上调外膜蛋白的表达，没有去除主要的PorA外膜蛋白抗原的产生。
此操作中所用的寡核苷酸
寡核苷酸 序列 注释
Hsf 01-Nde  5’-GGA ATT CCA TAT GAT GAACAA AAT ATA CCG C-3’ NdeI克隆位点
Hsf 02-Nhe  5’-GTA GCT AGC TAG CTT ACC ACTGAT AAC CGA C-3’ NheI克隆位点
GFP-mut-Asn  5’-AAC TGC AGA ATT AAT ATG AAAGGA GAA GAA CTT TTC-3’ AsnI克隆位点与NdeI相容
GFP-Spe  5’-GAC ATA CTA GTT TAT TTG TAGAGC TCA TCC ATG-3’ SpeI克隆位点与NheI相容
RP1(SacII)  5’-TCC CCG CGG GCC GTC TGAATA CAT CCC GTC-3’ SacII克隆位点
RP2  5’-CAT ATG GGC TTC CTT TTG TAAATT TGA GGG CAA ACA CCC GATACG TCT TCA-3’
RP3  5’-AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCCTCA AAT TTA CAA AAG GAA GCCCAT ATG-3’
RP4(ApaI) 5’-GGG TAT TCC GGG CCC TTC AGACGG CGC AGC AGG-3’ ApaI克隆位点
实施例12：绿色荧光蛋白蛋白在重组的缺乏功能性cps基因但表达PorA的重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株中的表达。
在下述实施例中，pCMK载体被用于测定胞质异源蛋白在脑膜炎奈瑟氏菌中的表达。从pKen-Gfpmut2质粒用引物GFP-Asnmut2和GFP-Spe扩增绿色荧光蛋白(参见实施例11的表)。AsnI提供了与NdeI相容的粘性末端，SpeI提供了与NheI相容的粘性末端。PCR扩增的条件是供应商所描述的(HiFi DNA聚合酶，Boehringer Mannheim，GmbH)。采用下述的热循：25次(94℃1min.，50℃1min.，72℃3min.)以及1次(72℃10min.，4℃恢复)。相应的扩增子然后被被克隆到相应的用NdeI和NheI限制性酶降解的pCMK(+)传递载体中。在此重组质粒，设计的pCMK(+)-GFP中，我们通过重组PCR策略删除了存在于嵌合porA/lacO中的lacO。pCMK(+)-GFP质粒被用作模板来PCR扩增2个独立的DNA片段。
-片段1含有porA5′重组区，卡那霉素抗性基因和porA启动子。所用的寡核苷酸引物，RP1(SacII)和RP2(参见实施例11的表)。RP1引物刚好与lac操纵子的上游序列同源。
-片段2含有来自porA Shine-Dalgarno序列，gfp基因和porA3′重组遗传区。所用的寡核苷酸，RP3和RP4(ApaI)，被显示于实施例11的表中。RP3引物与lac启动子的下游序列同源。片段1的3`末端和片段2的5`末端具有48个核苷酸的重叠。500ng的每一PCR(1和2)被用作使用引物RP1和RP4的最后的PCR。20μg的此种PCR片段被用于转化缺少功能性cps基因的脑膜炎奈瑟氏菌血清组B菌株。
用线性DNA进行的转化的效率低于用环状质粒DNA进行的转化，但所有的重组子通过双重交叉互换被获得(通过PCR和Western印迹筛选法的联合被证实)。卡那霉素抗性克隆在-70℃保存作为甘油原种并用于进一步的研究。细菌(相应的大约5.108个细菌)被重悬浮在50μl的PAGE-SDS缓冲液中，冰冻(-20℃)/煮沸(100℃)3次且然后被通过PAGE-SDS电泳在12.5％的凝胶上分离。
GFP的表达被检测在来自NmB[Cps-，PorA+]或NmB[Cps-，PorA+，GFP+]的全细胞细菌溶解产物(WCBL)中。考马斯染色检测GFP表达的缺失在受体脑膜炎奈瑟氏菌菌株中(参见附图14)。
实施例13：通过启动子替换上调脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的NspA基因
本实验的目的是通过强porA启动子替换NspA基因的内源启动子区来上调NspA抗原的产生。为实现此目的，利用大肠杆菌克隆方法构建启动子替换质粒。位于NspA编码基因的上游的DNA区(924bp)被发现(SEQ ID NO：7)在含有脑膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的未成熟染色体组DNA序列的private Incyte PathoSeq数据库中。一个包含相对于NspA基因起始密码子(ATG)为核苷酸-115到-790的DNA片段(675bp)被利用分别含有EcoRI和XbaI限制性位点(加下划线)的寡核苷酸PNS1′(
Figure A0081384200601
)和PNS2(
Figure A0081384200602
)进行PCR扩增。此片段被限制并被插入pUC18质粒中。此质粒被进行循环PCR突变(Jones & Winistofer(1992)，Biotechniques12：528-534)来插入用于转化的脑膜炎球菌吸收序列，以及合适的允许CmR/PorA启动子盒的克隆的限制性位点。循环的PCR被进行利用含有吸收序列和合适的加下划线的限制性位点(XmaI和XhoI)BAD01-2(
Figure A0081384200603
CGA TGG AAA ACG CAG C-3′)&BAD02-2(
Figure A0081384200604
GTT CAG ACG GCG CGC TTA TAT AGT GGA TTA AC-3′)的寡核苷酸。产生的PCR片段被凝胶纯化he用XhoI降解。CmR/PorA启动子盒被从前面所述的pUC D15/Omp85质粒扩增，使用含有合适的限制性位点(XmaI，XbaI，SpeI和XhoI)加下划线的引物BAD15-2( )& BAD03-2(5′-获得的PCR片段被降解并插入到用相应的酶限制的环状PCR质粒中。10μg的重组质粒被线性化并用于转化缺少荚膜多糖(cps-)和一种主要的外膜蛋白PorA(porA-)的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的菌株。产生于双重交叉互换事件的重组的脑膜炎奈瑟氏菌克隆(利用寡核苷酸BAD25(5′-GAG CGA AGC CGT CGA ACG C-3′)& BAD08(5′-CTT AAG CGT CGGACA TTT CC-3′)的PCR筛选)被置于含有5μl/ml氯霉素的GC培养基上筛选并分析NspA的表达。重组细菌(相应的大约5.108个细菌)可被重悬浮在50μl的PAGE-SDS缓冲液中，冰冻(-20℃)/煮沸(100℃)3次然后通过PAGE-SDS电泳在12.5％凝胶上分离。凝胶用考马斯亮蓝R250染色或转到硝化纤维膜上用抗-porA单克隆抗体或抗-NspA多克隆抗体探针检测(参见附图17)。如同Omp85，令人吃惊的发现了启动子在NspA起始密码子的大约400bp上游的插入比在大约100bp上游处插入表达更多的蛋白。
相同重组质粒pUC质粒可被用于上调NspA在缺乏功能性cps基因但仍表达NspA的脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株中的表达。
实施例14：通过启动子替换上调脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的pldA4(OmplA)基因
本实验的目的是通过强porA启动子替换pldA4(OmplA)基因的内源启动子区来上调pldA4(OmplA)抗原的产生。为实现此目的，利用大肠杆菌克隆方法构建启动子替换质粒。位于pldA编码基因的上游的DNA区(373bp)被发现(SEQ ID NO：18)在脑膜炎奈瑟氏菌菌株的privateIncyte PathoSeq数据库中。此DNA含有编码推定的rpsT基因的序列。RpsT的终止密码子位于plda ATG的上游169bp处。为避免此可能地重要基因的干扰，我们决定在pldA ATG的上游插入CmR/PorA启动子盒。为实现此目的，对应于rpsT基因的992bp的DNA片段，169bp基因间序列以及pldA基因的499个最初的核苷酸被从脑膜炎奈瑟氏菌血清型B染色体组DNA使用含有吸收序列(加下划线)的寡核苷酸PLA1 Amo5
Figure A0081384200611
和PLA1Amo3(
Figure A0081384200612
AC-3′)进行PCR扩增。PLA1 Amo3也含有XbaI限制性位点。此PCR片段被用High Pure试剂盒(Roche，Mannheim，Germany)纯化并直接在克隆在pGemT vector(Promega，USA)中。此质粒被进行循环PCR突变(Jones & Winistofer(1992))来插入合适的允许CmR/PorA启动子盒的克隆的限制性位点。此循环PCR被进行利用含有合适的限制性位点(BgIII和XhoI)加下划线的CIRC1-Bgl(
Figure A0081384200613
TTG TCG-3′)& CIRC1-XH-RBS/2(
Figure A0081384200614
AAG CCG ATA TGA ATA TAC GGA ATA TGC G-3′)或CIRC2-XHO/2
Figure A0081384200615
寡核苷酸。CmR/PorA启动子盒被扩增自先前描述的pUC D15/Omp85质粒，利用含有合适的限制性位点(BgIII用和XhoI)加下划线的引物BAD20(5′-TCC CCC GGG AGATCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3′)和CM-PORA-3(5′-CCG。此PCR片段被克隆在用引物CIRCI-Bgl和CIRC1-XH-RBS/2获得的循环PCR质粒中。此质粒可被用于转化脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-porA-)菌株。通过pldA的上游区域双重交叉互换的整合将直接插入porA启动子到pldA ATG的上游。另一个盒被从通过启动子替换超表达D15/Omp85的重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-，porA-，D15/Omp85+)的染色体组DNA扩增。此盒含有cmR基因，porA启动子和400bp的D15/Omp85基因的5`侧接序列。此序列已被证明有效的上调D15/Omp85在奈瑟氏菌中的表达并且将被试验其它奈瑟氏菌抗原的上调。用于扩增的引物是含有AhoI限制性位点(加下划线)的BAD 20和CM-PORA-D15/3(5′-CGGCTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3′)。此PCR片段被克隆在用引物CIRCI-Bgl和CIRC2-XHO/2获得的循环PCR质粒中。此质粒被用于转化脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-，porA-1菌株。通过pldA上游区域的双重交叉互换产生的整合将直接插入porA启动子到pldAATG的400bp上游。
实施例15：通过启动子替换上调脑膜炎奈瑟氏菌血清型B的tbpA基因
本实验的目的是通过强porA启动子替换tbpA基因的内源启动子区来上调TbpA抗原的产生。为实现此目的，利用大肠杆菌克隆方法构建启动子替换质粒。位于tbpA编码基因的上游的DNA区(731bp)被发现(SEQ ID NO：17)在含有脑膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的private Incyte PathoSeq数据库中。此DNA含有编码TbpB抗原的序列。基因在操纵子中是有组织的。TbpB基因将被删除或通过CmR/porA启动子盒取代。为达到此目的，对应于tbpB的509bp5`侧接区的3218bp的DNA片段，2139bp tbpB编码序列，87bp基因间序列以及tbpA编码序列的483个最初核苷酸被从脑膜炎奈瑟氏菌血清型B染色体组DNA扩增利用含有吸收序列和NheI和HindIII限制性位点(加下划线)的寡核苷酸BAD16(5′GGC CTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTTCAA AAT TTA TTC3′)和BAD17(5′-GGC CAA GCT TCA GAC GGCGTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3′)。此PCR片段用High Pure试剂盒(Boerhinger Mannheim，Germany)纯化并直接克隆在pGemT载体(Promega，USA)。此质粒被进行循环PCR突变(Jones & Winistofer(1992))来(i)插入合适的允许CmR/PorA启动子盒克隆的限制性位点和(ii)删除tbpB和tbpB编码序列的5`侧接序列的209bp。循环PCR被进行利用含有合适的限制位点XmaI，BglII和XhoI(加下划线)的BAD 18(5′-TCC&BAD 19( AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAC ATT TGT TCC G-3′)寡核苷酸。CmR/PorA启动子盒被从前面所述的pUC D 5/Omp85质粒扩增，利用含有合适的限制性位点XmaI，SpeI，BglII和SoI(加下划线)的引物BAD21
Figure A0081384200633
&BAD20( CC-3′)。此PCR片段被克隆在循环PCR质粒中。此质粒将被用于转化脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-porA-)菌株。通过tbpA上游区域的双重交叉互换产生的整合将直接插入porA启动子到tbpA ATG的400bp上游。
实施例16：通过启动子取代上调脑膜炎奈瑟氏菌血清型B pilQ的基因
本实验的目的是通过强porA启动子替换pilQ基因的内源启动子区来上调pilQ抗原的产生。为实现此目的，利用大肠杆菌克隆方法构建启动子替换质粒。位于pilQ编码基因的上游的DNA区(772bp)被发现(SEQ ID NO：12)在含有脑膜炎奈瑟氏菌菌株ATCC 13090的privateIncyte PathoSeq数据库中。此DNA含有编码PilP抗原的序列。PilQ基因是我们不期望干扰的操纵子的一部分，菌毛蛋白是细菌的必要元件。CmR/porA启动子盒被按照pldA基因表达的上调所述的相同的策略导入到pilQ基因的上游。为达到此目的。对应于菌毛蛋白编码序列的3`部分的866bp的DNA片段，18bp基因间序列以及392个pilQ基因的最初核苷酸从奈瑟氏菌血清型B染色体组DNA利用含有吸收序列和NheI和HindIII限制性位点(加下划线)的PQ-rec5-Nhe(5′-CTA GCT AGC GCCGTC TGA ACG ACG CGA AGC CAA AGC-3′)和PQ-rec3-Hin(GCC AAGCTT TTC AGA CGG CAC GGT ATC GTC CGA TTC G-3′)寡核苷酸扩增而来。此PCR片段被直接克隆在pGemT载体(Promega，USA)中。此质粒被进行循环PCR突变(Jones & Winistofer(1992))来插入合适的允许CmR/PorA启动子盒克隆的限制性位点。循环PCR被进行利用含有合适的限制位点BglII和XhoI(加下划线)的PCR CIRC1-PQ-Bgl(5′-GGA
Figure A0081384200641
& CIRC1-PQ-XHO(5′-
Figure A0081384200642
TGA CAA AAA TC-3′)或CIRC2-PQ-X( ACC AAA CTG ACA AAA ATC-3′)寡核苷酸。CmR/PorA启动子盒被从上述的pUC D15/Omp85质粒扩增，使用含有合适的限制性位点BgIII和XhoI(加下划线)的引物BAD20(
Figure A0081384200644
TAT TAC CCT GTT ATC CC-3′)和CM-PORA-3( AAA ACC TAA AAA CAT CGG GCA AAC ACC C-3′)。此PCR片段被克隆在用引物CIRC1-PQ-Bgl和CIRC1-PQ-XHO获得的循环PCR质粒中。此质粒将被用于转化脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-porA-)菌株。通过pilQ上游区域的双重交叉互换产生的整合将直接插入porA启动子到pilQ ATG的上游。
另一个盒被从通过启动子替换超表达D15/Omp85的重组脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-，porA-，D15/Omp85+)的染色体组DNA扩增。此盒含有cmR基因，porA启动子和400bp的D15/Omp85基因的5`侧接序列。此序列已被证明有效的上调D15/Omp85在奈瑟氏菌中的表达并且将被试验其它奈瑟氏菌抗原的上调。用于扩增的引物是含有XhoI限制性位点(加下划线)的BAD 20和CM-PORA-D15/3(5′-CGG CTC GAG TGTCAG TTC CTT GTG GTG C-3′)。此PCR片段被克隆在用引物CIRCI-Bgl和CIRC2-PQ-X获得的循环PCR质粒中。此质粒被用于转化脑膜炎奈瑟氏菌血清型B(cps-)和(cps-，porA-l)菌株。通过pilQ上游区域的双重交叉互换产生的整合将直接插入porA启动子到pilQ ATG的400bp上游。
实施例17：用于在脑膜炎奈瑟氏菌的染色体中导入“干净的”，未标记的突变的kanR/sacB盒。
本实验的目的是构建含有用于脑膜炎奈瑟氏菌(例如kanR基因)的染色体重组的阳性筛选的选择性标记以及从重组后的染色体(例如sacB基因)删除盒的反向选择性标记的多用途DNA盒。通过此方法，任意在同源重组中被导入的异源DNA将从奈瑟氏菌染色体上去除。
一个含有在其自身启动子调控下表达的neoR基因和sacB基因的DNA片段通过pIB 279质粒(Blomfield IC，Vaughn V，Rest RF，EisensteinBI(1991)，Mol Microbiol 5：1447-57)用BamHI限制性酶限制来获得。受体载体来自质粒pCMK，前面所描述的。pCMK的kanR基因通过酶NruI和EcoRV限制被删除。质粒被称为pCMKs。NeoRlsacB盒被插入到pCMKs中在与BamHI末端相容的BglII的限制性位点。
携带质粒的大肠杆菌不能在含有2％蔗糖的培养基上生长，证实了sacB启动子的功能。此质粒含有允许盒在脑膜炎奈瑟氏菌血清型B染色体的porA处插入的重组遗传序列。重组的奈瑟氏菌在含有200μg/ml卡那霉素的GC琼脂平皿上获得。不幸的是，sacB启动子在脑膜炎奈瑟氏菌中没有功能：在含有2％蔗糖的GC琼脂平皿上无生长差异。
一个新的和被构建含有在kanR启动子调控下的sacB基因。利用带有包含NcoI和XbaI限制性位点(加下划线)的CtRC-Kan-Nco(5′-CAT
Figure A0081384200651
&CIRC-Kan-Xba (5′寡核苷酸的质粒pUC4K((Amersham Pharmacia Biotech，USA))作为模板进行循环PCRA。产生PCR片段被凝胶纯化，用NcoI降解并连接到通过从带有含有NcoI限制性位点(加下划线)的SAC/NCO/NEW5(
Figure A0081384200653
GGA GGA TGA ACG ATG AAC ATC AAA AAG TTT GCA A-3′)寡核苷酸以及含有NcoI限制性位点(加下划线)的RBS(粗体)&SAC/NCO/NEW3( GTC-3′)寡核苷酸的pIB279质粒的PCR产生的sacB基因上。重组的大肠杆菌克隆可被在含有2％蔗糖的琼脂平皿上测定其敏感性。新的kanR/sacB盒可被亚克隆在pCMKs中并用于转化脑膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-菌株。获得的蔗糖敏感性在奈瑟氏菌中被证实。pCMKs质粒被用于转化重组的kanR/SacB奈瑟氏菌来删除被插入到染色体的porA位点处的全部的盒。干净的重组奈瑟氏菌将在含有2％蔗糖的GC琼脂平皿上被获得。
实施例18：小重组遗传库列(43bp)的应用允许脑膜炎奈瑟氏菌染色体中的同源重组
本实验的目的是利用小重组遗传序列(43bp)推动奈瑟氏菌染色体的插入，修饰或删除。本实验的完成将大大推动将来的工作，在避免大肠杆菌的；同源序列的亚克隆步骤(43bp的重组遗传序列可很容易地被添加在PCR扩增引物中)。KanR基因被从带有含有与NmB porA基因(黑体)的5`侧接序列同源的43bp和吸收序列(加下划线)的寡核苷酸Kan-PorA-5(
Figure A0081384200661
AAT CCA GTC CGT TCA GTT TCG GGA AAG CCA CGT TGT GTC-3′)和含有与NmB porA基因(黑体)的5`侧接序列同源的43bp和吸收序列(加下划线)的寡核苷酸Kan-PorA-3( AAT TTA TCG GAA ATA ACT GAA ACC GAA CAG ACT AGG CTGAGG TCT GCC TCG-3′)的质粒pUC4K进行PCR扩增而来。获得1300bpDNA片段被克隆在pGemT载体(Promega，USA)中。此质粒可被用于转化脑膜炎奈瑟氏菌血清型B cps-菌株。在含有200μg/ml卡那霉素的GC平皿上获得重组奈瑟氏菌。porA位点的双重交叉互换产生的整合将通过采用引物PPA1 & PPA2的PCR来筛选如前面所述。
实施例19：小鼠用WT和重组脑膜炎奈瑟氏菌囊泡免疫的主动保护
动物在0，14和28天用5μg不同的被吸附在Al(OH)3上的OMVs免疫3次(IP途径)。在第28(II后14天)和35(III后7天)天进行取血，在第35(IP途径)被攻击。攻击的剂量为20xLD50(-10′CFU/鼠)。在共计7天后监测致死率。
被注射的OMVs：
组1：Cps-，PorA+囊泡
组2：Cps-，PorA-囊泡
组3：Cps-，PorA-，NspA+囊泡
组4：Cps-，PorA-，Omp85+囊泡
组5：Cps-，PorA-，Hsf+囊泡
附图15阐明这些OMVs的模式通过分析的SDS Page(考马斯染色)。
在攻击24小时后，在阴性对组中(仅用Al(OH)3免疫的)的致死率为100％(8/8)而用5中不同的OMVs制剂免疫的小鼠仍然活着(7到8/8各小鼠存活)。在7天中病情也被控制且用NSPA超表达囊泡免疫的小鼠比其它的组表现出较少的疾病。存在PorA+囊泡中的PorA可能赋予延伸的抗同源菌株感染的保护。然而，PorA-上调囊泡诱导的保护至少在某些程度上取决于NspA，Omp85或Hsf的增加量的存在。
实施例20：通过全细胞和特异性ELISA测定重组囊泡的免疫原性
为了测定抗体识别存在于MenB细胞表面的抗原的能力，采集的小鼠血清(来自实施例19)被通过全细胞ELISA(使用四环素灭活细胞)检测，且滴度表示为中间。所有类型的囊泡抗体诱导高度的全细胞Ab滴度而阴性对照组为明显的阴性。
囊泡     WCE(H44/76)中间滴度
14P2  14P3
CPS(-)PorA(+) 23849  65539
CPS(-)PorA(-) 20130  40150
CPS(-)PorA(-)NSPA(+) 8435  23846
CPS(-)PorA(-)OMP85(+) 4747  16116
CPS(-)PorA(-)HSF(+) 6964  22504
(-) 51  82
对可获得的重组HSF蛋白的特异性Ab反应被进行。微滴定板用1μg/ml的全长HSF分子覆盖。
附图16中的结果表明当HSF超表达的OMVs被用于免疫小鼠时(使用平皿上的纯化的重组HSF)产生好的特异性HSF应答。HSF超表达的囊泡诱导理想水平的特异性抗体。
SEQ.ID NO：1pCMK(+)载体核苷酸序列TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATAAAATTGTAAACGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCAAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTACTATGGTTGCTTTGACGTATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCCGTCTGAATACATCCCGTCATTCCTCAAAAACAGAAAACCAAAATCAGAAACCTAAAATCCCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGTCCGTTCAGTTTCGGTCATTTCCGATAAATTCCTGCTGCTTTTCATTTCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGCGGAAGGGTTTTGGTTTTTTCCGATAAATTCTTGAGGCATTGAAATTCTAGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGCTGTAGATGCCCGATGGTCTTTATAGCGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAGATAGTACGGAACCGATTCACTTGGTGCTTCAGCACCTTAGAGAATCGTTCTCTTTGAGCTAAGGCGAGGCAACGCCGTACTTGTTTTTGTTAATCCACTATAAAGTGCCGCGTGTGTTTTTTTATGGCGTTTTAAAAAGCCGAGACTGCATCCGGGCAGCAGCGCATCGGCCCGCACGAGGTCTCTGGAGTCGCGAGCATCAAGGGCGAATTCTGCAGGGGGGGGGGGGAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCTTGCTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAGAAGAATATCCTGATTCAGGTGAAAATATTGTTGATGCGCTGGCAGTGTTCCTGCGCCGGTTGCATTCGATTCCTGTTTGTAATTGTCCTTTTAACAGCGATCGCGTATTTCGTCTCGCTCAGGCGCAATCACGAATGAATAACGGTTTGGTTGATGCGAGTGATTTTGATGACGAGCGTAATGGCTGGCCTGTTGAACAAGTCTGGAAAGAAATGCATAAGCTTTTGCCATTCTCACCGGATTCAGTCGTCACTCATGGTGATTTCTCACTTGATAACCTTATTTTTGACGAGGGGAAATTAATAGGTTGTATTGATGTTGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTTGCCATCCTATGGAACTGCCTCGGTGAGTTTTCTCCTTCATTACAGAAACGGCTTTTTCAAAAATATGGTATTGATAATCCTGATATGAATAAATTGCAGTTTCATTTGATGCTCGATGAGTTTTTCTAATCAGAATTGGTTAATTGGTTGTAACACTGGCAGAGCATTACGCTGACTTGACGGGACGGCGGCTTTGTTGAATAAATCGAACTTTTGCTGAGTTGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAACGCAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAAAAGTTCAAAATCACCAACTGGTCCACCTACAACAAAGCTCTCATCAACCGTGGCTCCCTCACTTTCTGGCTGGATGATGGGGCGATTCAGGCCTGGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCCCCCCCCCCCCTGCAGGAGGTCTGCGCTTGAATTGTGTTGTAGAAACACAACGTTTTTGAAAAAATAAGCTATTGTTTTATATCAAAATATAATCATTTTTAAAATAAAGGTTGCGGCATTTATCAGATATTTGTTCTGAAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGACGTATCGGGTGTTTGCCCGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCCCATATGCATCCTAGGCCTATTAATATTCCGGAGTATACGTAGCCGGCTAACGTTAACAACCGGTACCTCTAGAACTATAGCTAGCATGCGCAAATTTAAAGCGCTGATATCGATCGCGCGCAGATCTGATTAAATAGGCGAAAATACCAGCTACGATCAAATCATCGCCGGCGTTGATTATGATTTTTCCAAACGCACTTCCGCCATCGTGTCTGGCGCTTGGCTGAAACGCAATACCGGCATCGGCAACTACACTCAAATTAATGCCGCCTCCGTCGGTTTGCGCCACAAATTCTAAATATCGGGGCGGTGAAGCGGATAGCTTTGTTTTTGACGGCTTCGCCTTCATTCTTTGATTGCAATCTGACTGCCAATCTGCTTCAGCCCCAAACAAAAACCCGGATACGGAAGAAAAACGGCAATAAAGACAGCAAATACCGTCTGAAAGATTTTCAGACGGTATTTCGCATTTTTGGCTTGGTTTGCACATATAGTGAGACCTTGGCAAAAATAGTCTGTTAACGAAATTTGACGCATAAAAATGCGCCAAAAAATTTTCAATTGCCTAAAACCTTCCTAATATTGAGCAAAAAGTAGGAAAAATCAGAAAAGTTTTGCATTTTGAAAATGAGATTGAGCATAAAATTTTAGTAACCTATGTTATTGCAAAGGTCTCGAATTGTCATTCCCACGCAGGCGGGAATCTAGTCTGTTCGGTTTCAGTTATTTCCGATAAATTCCTGCTGCGCCGTCTGAAGAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCSEQ.ID NO：2脑膜炎奈瑟氏菌血清型A菌株Z2491种NspA基因上游(997bp)DNA区核苷酸序列GGAACCGAACACGCCGTTCGGTCATACGCCGCCGAAAGGTTTGCCGCAAGACGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGGTACACGGCGCGCTGGAAAGCGCGGGTTTTGTCCACTACGAAACATCGGCTTTTGCGAAACCAGCCATGCAGTGCCGCCACAATTTGAACTACTGGCAGTTCGGCGATTATTTAGGCATAGGCGCGGGCGCGCACGGCAAAATTTCCTATCCCGACCGCATCGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACTACCTCGCCTTAATGCAAAACCGACCGAGCGAAGCCGTCGAACGCAAAACCGTCGCCGCCGAAGATTTGCCGTTCGAATTCATGATGAACGCCCTGCGCCTGACCGACGGCGTACCCACCGCGATGTTGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATCATGGCGCAAATCGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCTGCTGGAAACCGACCCCGCCGTATTCCGCCCGACCGAAAAAGGACGCTTGTTTTTAAACGATTTGCTGCAGTGTTTTTTATAGTGGATTAACAAAAACCAGTACGGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTTCCGTACTATCTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATATAAGCGCAAACAAATCGGCGGCCGCCCGGGAAAACCCCCCCGAACGCGTCCGGAAAATATGCTTATCGATGGAAAACGCAGCCGCATCCCCCGCCGGGCGTTTCAGACGGCACAGCCGCCGCCGGAAATGTCCGACGCTTAAGGCACAGACGCACACAAAAAACCGTATGCCTGCACCTGCAACAATCCGACAGATACCGCTGTTTTTTCCAAACCGTTTGCAAGTTTCACCCATCCGCCGCGTGATGCCGCCACCACCATTTAAAGGCAACGCGCGGGTTAACGGCTTTGCCGSEQ.ID NO：3脑膜炎奈瑟氏菌血清型B菌株ATCC13090 D15/Omp85上游(1000bp)DNA区核苷酸序列ACCATTGCCGCCCGCGCCGGCTTCCAAAGCGGCGACAAAATACAATCCGTCAACGGCACACCCGTTGCAGATTGGGGCAGCGCGCAAACCGAAATCGTCCTCAACCTCGAAGCCGGCAAAGTCGCCGTCGGGTTCAGACGGCATCAGGCGCGCAAACCGTCCGCACCATCGATGCCGCAGGCACGCCGGAAGCCGGTAAAATCGCAAAAAACCAAGGCTACATCGGACTGATGCCCTTTAAAATCACAACCGTTGCCGGTGGCGTGGAAAAAGGCAGCCCCGCCGAAAAAGCAGGCCTGAAACCGGGCGACAGGCTGACTGCCGCCGACGGCAAACCCATTACCTCATGGCAAGAATGGGCAAACCTGACCCGCCAAAGCCCCGGCAAAAAAATCACCCTGAACTACGAACGCGCCGGACAAACCCATACCGCCGACATCCGCCCCGATACTGTCGAACAGCCCGACCACACCCTGATCGGGCGCGTCGGCCTCCGTCCGCAGCCGGACAGGGCGTGGGACGCGCAAATCCGCCGCAGCTACCGTCCGTCTGTTATCCGCGCATTCGGCATGGGCTGGGAAAAAACCGTTTCCCACTCGTGGACAACCCTCAAATTTTTCGGCAAACTAATCAGCGGCAACGCCTCCGTCAGCCATATTTCCGGGCCGCTGACCATTGCCGACATTGCCGGACAGTCCGCCGAACTCGGCTTGCAAAGTTATTTGGAATTTTTGGCACTGGTCAGCATCAGCCTCGGCGTGCTGAACCTGCTGCCCGTCCCCGTTTTGGACGGCGGCCACCTCGTGTTTTATACTGCCGAATGGATACGCGGCAAACCTTTGGGCGAACGCGTCCAAAACATCGGTTTGCGCTTCGGGCTTGCCCTCATGATGCTGATGATGGCGGTCGCCTTCTTCAACGACGTTACCCGGCTGCTCGGTTAGATTTTACGTTTCGGAATGCCGTCTGAAACCGCATTCCGCACCACAAGGAACTGACASEQ.ID NO：4脑膜炎奈瑟氏菌Hsf样基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列ATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCTCACCGCCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCTAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCAGAAAAAACAGAAACCCCACCGCCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGACCCGTCGGCACGGAAACTTACCGGATAAAACAGTTTCCTTAGATTCCACGTCCTAGATTCCCGCTTTCGCGGGAATGACGAGATTTTAGATTATGGGAATTTATCAGGAATGATTGAATCCATAGAAAAACCACAGGAATCTATCAGAAAAAACAGAAACCCCCACCGCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCGGAAAAAACCGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGTTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCCCCACCGCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGCAACCGAAAAACCACAGGAATCTATCAGCAAAAACAGAAACCCCCACCGACCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCGGAAAAAACAGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCAAAAGCTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCCCACCGCCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGACCCGTCGGCACGGAAACTTACCGGATAAAACAGTTTCCTTAGATTCCACGTCCCAGATTCCCGCCTTCGCGGGAATGACGAGATTTTAAGTTGGGGGAATTTATCAGAAAACCCCCAACCCCCAAAAACCGGGCGGATGCCGCACCATCCGCCCCCAAACCCCGATTTAACCATTCAAACAAACCAAAAGAAAAAACAAASEQ.ID NO：5脑膜炎奈瑟氏菌PilQ基因上游(772bp)DNA区核苷酸序列GCGATGTCGGGAAGCCTTCTCCCGAATCATTACCCCTTGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAACGGCGGCAATCATGACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCCACCACCTACCAAGCAAAATCCGTAGAAGAGCTTGCCGCAGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGTTAGGGAAACCATGAAACACTATGCCTTACTCATCAGCTTTCTGGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAATCATACCTTTCCAAGCACCTACCCTGCCGGTTGCGCCGGTATACAGCCCGCCGCAGCTTACAGGGCCGAACGCATTCGACTTCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTATTAAAGAAACGCTGGAAAAATTCAGTTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTTTGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCCGGCTTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCTACACTGTCGGTGTCGGCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCGTCCTGAACGAGCTGATAGAAGACAGCACGGGCAACTGGGTTTCCCGTAAAGCAGAACTGCTGTTGAATTCTTCCGACAAAAACACCGAACAAGCGGCAGCACCTGCCGCAGAACAAAATTAAGAAGAGGATTACTCCATTSEQ.ID NO：6脑膜炎奈瑟氏菌Hap上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GTGCGGCAAAAAACAGCAAAAGCCCGCTGTCGATTGCCTGACCGTCCGCGTCCGTAAAATCAGCATAGGTTGCCACGCGCGGCTTGGGCGTTTTCCCACACAAAGCCTCTGCCATCGGCAGCAGGTTTTTCCCCGATATGCGTATCACGCCCACGCCGCCGCGCCCGGGTGCGGTAGCGACTGCCGCAATCGTTGGAACGTTATCCGACATAAAACCCCCGAAAATTCAAAACAGCCGCGATTATAGCAAATGCCGTCTGAAGTCCGACGGTTTGGCTTTCAGACGGCATAAAACCGCAAAAATGCTTGATAAATCCGTCCGCCTGACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAAACACATACGCCTTCCTGCTCGGTATAGGCTCGCTGCTGGGTCTGTTCCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTCAAAAACATCGGCGGCGATTTTCAACGCGCCATAGAGAAAGCGCGAAAATGACCGAAAACGCACAGGACAAGGCGCGGCAGGCTGTCGAAACCGTCGTCAAATCCCCGGAGCTTGTCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGTGCAAATAATGATAGCCCGGCGTTTCCATTCGGGATCGTTGCCGCCGCCGTCCGACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAACGGGGCAGACCGCATTATGGCAATGGCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCGGCACGAAACCATACGGCAAGACCAAACCTTCAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCTTCATCAGCGTCATCCTGATACTGCTTTTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCTTGCCGGCGGCACAGTGGTTGCCTTGGCGGGTGCTTTCGTGATTGGAAGAAGCCGAGACCAAGGCAAAAATTAATTGCAAATCCTAGGGCGTGCTTCATATCCGCCCGAACGCCGAACCGCACATATAGGCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCCCTCCCAAACAAACCCGAATCCCGTCAGATAAGGAAAAATASEQ.ID NO：7脑膜炎奈瑟氏菌NspA基因(血清型B)(ATCC13090)上游(924bp)DNA区核苷酸序列GGAACCGAACACGCCGTTCGGTCATACGCCGCCGAAAGGTTTGCCGCAAGACGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGGTACACGGCGCGCTGGAAGGCGCGGGTTTTGTCCACTACGAAACATCGGCTTTTGCGAAACCAGCCATGCAGTGCCGCCACAATTTGAACTACTGGCAGTTCGGCGATTATTTAGGCATAGGCGCGGGCGCTCACGGCAAAATTTCCTATCCCGACCGCATCGAGCGCACCGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACTACCTCGCCTTAATGCAAAGCCAACCGAGTGAAGCCGTCGAACGCAAAACCGTTGCCGCCGAAGATTTGCCGTTTGAGTTCATGATGAACGCCCTGCGCCTGACCGACGCGTACCCGCCGCGATGTTGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATCATGGCGCAAATCGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCTGCTGGAAACCGACCCCGCCGTATTCCGCCCGACCGAAAAAGGACGCTTGTTTTTAAACGATTTGCTGCAGTGTTTTTTATAGTGGATTAACAAAAACCAGTACGGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTTCCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATATAAGCGCAAACAAATCGGCGGCCGCCCGGGAAAACCCGCCCCGAACGCGTCCGGAAAATATGCTTATCGATGGAAAACGCAGCCGCATCCCCCGCCGGGCGTTTCAGACGGCACAGCCGCCGCCGGAAATGTCCGACGCTTAAGGCACAGACGCACACAAAACCGTATGCCTGCACCTGCAACAATCCGACAGATACCGCTGTTTTTTCCAAACCGTTTGCASEQ.ID NO：8脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)FrpB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列AAGTGGGAATCTAAAAATGAAAAGCAACAGGAATTTATCGGAAATGACCGAAACTGAACGGACTGGATTCCCGCTTTCGCGGGAATGACGGCGACAGGGTTGCTGTTATAGTGGATGAACAAAAACCAGTACGTCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACCAAGTGAATCGGTTCCGTCCTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTCTGTTCGTTTTCGGTTATTCCCGATAAATTACCGCCGTTTCTCGTCATTTCTTTAACCCTTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGTTTTTTTGAGTTCCAGTTGTTTCTGATAAATTCTTGCAGCTTTGAGTTCCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGTGGAAAAGTTGCCGTGATTTCGGATAAATTTTCGTAACGCATAATTTCCGTTTTACCCGATAAATGCCCGCAATCTCAAATCCCGTCATTCCCCAAAAACAAAAAATCAAAAACAGAAATATCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGACCTTAGAACAACAGCAATATTCAAAGATTATCTGAAAGTCCGAGATTCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGAATTTTAGGTTTCTGTTTTTGGTTTTCTGTCCTTGCGGGAATGATGAAATTTTAAGTTTTAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCACAGGCTTCGTCATTCCCGCGCAGGCTTCGTCATTCCCGCATTTGTTAATCCACTATATTCCCGCCGTTTTTTACATTTCCGACAAAACCTGTCAACAAAAAACAACACTTCGCAAATAAAAACGATAATCAGCTTTGCAAAAATCCCCCCCCCCTGTTAATATAAATAAAAATAATTAATTAATTATTTTTCTTATCCTGCCAAATCTTAACGGTTTGGATTTACTTCCCTTCATACACTCAAGAGGACGATTGASEQ.ID NO：9脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)FrpA基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列CTATAAAGATGTAAATAAAAATCTCGGTAACGGTAACACTTTGGCTCAGCAAGGCAGCTACACCAAAACAGACGGTACAACCGCAAAAATGGGGGATTTACTTTTAGCAGCCGACAATCTGCACAGCCGCTTCACGAACAAAATGCTATCCATTAGCCATGTTCGGGAAAACACGATTTCCCCGTTTGTTTTAGGCTGTCTAAACAAATAACCATAAATGTATATCATTATTTAAAATAAATAAAAGTATTTAACTATTATTGACGAAATTTTAGAGAAAGAGTAGACTGTCGATTAAATGACAAACAATAGTGAGAAAGGAAATATTTACTATCCGAGCACAGAGCATATTTTAGGTAGCCTGTAACTGTTCCTGCTGGCGGAAGAGGATGAAGGTGGACTTACCCGAGAATAAATGTCCTGTTGTGTGATATGGATGCCATGCCGCGAAGCAATTGATGCAATCACGGCAGTCCTACTTGAATGAAACCTGTCGTTGCAGAATTTGAAAACGCTATTTTTAAGAAAGGATAAAGGGAGAAAGAATTTTTGGTTTTTAAGCTGCATGAAACCGTGTTGGAATAAATGCACACCTACGATAATTAATAATTTTCGTTTTTTATTCTACAAGCTATTTATATATGATTGCTAAAAGTTTATTTTTTAGATGCCAAAAAATATATTTTATATACTTCATATTGTTTATATGTCTTTATTTGAATATATCTTACGATGGGGAAATATTTATATATTTTATAATAAATTTTACTCATTTGCTAATATGTCATGGAATATTACTTGTATTTTGTAGAATTTTTCCATATGAAAATATTCCATTTACTATTTTTCTGAACTTTATTAGTTTATTTTTAATATTTTTACCTCTTATATTTACCATAAGAGAGCTAATTGATTCATATTATATTGAGTCGATAATTAATTTATTCTTAATTTTAATTCCTCACGTTATTTTTTTAATTTACTTGAAAGGAAAGCAGATSEQ.ID NO：10脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)FrpC基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GGAAACAGAGAAAAAAGTTTCTCTTCTATCTTGGATAAATATATTTACCCTCAGTTTAGTTAAGTATTGGAATTTATACCTAAGTAGTAAAAGTTAGTAAATTATTTTTAACTAAAGAGTTAGTATCTACCATAATATATTCTTTAACTAATTTCTAGGCTTGAAATTATGAGACCATATGCTACTACCATTTATCAACTTTTTATTTTGTTTATTGGGAGTGTTTTTACTATGACCTCATGTGAACCTGTGAATGAAAAGACAGATCAAAAAGCAGTAAGTGCGCAACAGGCTAAAGAACAAACCAGTTTCAACAATCCCGAGCCAATGACAGGATTTGAACATACGGTTACATTTGATTTTCAGGGCACCAAAATGGTTATCCCCTATGGCTATCTTGCACGGTATACGCAAGACAATGCCACAAAATGGCTTTCCGACACGCCCGGGCAGGATGCTTACTCCATTAATTTGATAGAGATTAGCGTCTATTACAAAAAAACCGACCAAGGCTGGGTTCTTGAGCCATACAACCAGCAAAACAAAGCACACTTTATCCAATTTCTACGCGACGGTTTGGATAGCGTGGACGATATTGTTATCCGAAAAGATGCGTGTAGTTTAAGTACGACTATGGGAGAAAGATTGCTTACTTACGGGGTTAAAAAAATGCCATCTGCCTATCCTGAATACGAGGCTTATGAAGATAAAAGACATATTCCTGAAAATCCATATTTTCATGAATTTTACTATATTAAAAAAGGAGAAAATCCGGCGATTATTACTCATCGGAATAATCGAATAAACCAAACTGAAGAAGATAGTTATAGCACTAGCGTAGGTTCCTGTATTAACGGTTTCACGGTACAGTATTACCCGTTTATTCGGGAAAAGCAGCAGCTCACACAGCAGGAGTTGGTAGGTTATCACCAACAAGTAGAGCAATTGGTACAGAGTTTTGTAAACAATTCAAATAAAAAATAATTTAAAGGATCTTATTSEQ.ID NO：11脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Omp85基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列ACGTCCGAACCGTGATTCCGCAACGCCGCGCCCAAAACCAAAGCCCAAGCCAAAATGCCGATATAGTTGGCATTGGCAATCGCGTTAATCGGGTTGGCGACCAGGTTCATCAGCAGCGATTTCAACACTTCCACAATGCCGGAAGGCGGCGCGGCGGACACATCGCCCGCGCCCGCCAAAACAATGTGCGTCGGGAAAACCATACCGGCGATGACGGCGGTCAGGGCTGCGGAAAACGTACCAATGAGGTAAAGGATGATAATCGGCCTGATATGCGCCTTGTTGCCTTTTTGGTGCTGCGCGATTGTGGCCGCCACCAAAATAAATACCAAAACCGGCGCGACCGCTTTGAGCGCGCCGACAAACAGGCTGCCGAACAAGCCTGCCGCCAAGCCCAGTTGCGGGGAAACCGAACCGATTACGATGCCCAACGCCAAACCGGCGGCAATCTGCCTGACCAGGCTGACGCGGCCGATCGCATGAAATAAGGATTTGCCGAACGCCATAATTCTTCCTTATGTTGTGATATGTTAAAAAATGTTGTATTTTAAAAGAAAACTCATTCTCTGTGTTTTTTTTATTTTTCGGCTGTGTTTTAAGGTTGCGTTGATTTGCCCTATGCAGTGCCGGACAGGCTTTGCTTTATCATTCGGCGCAACGGTTTAATTTATTGAACGAAAATAAATTTATTTAATCCTGCCTATTTTCCGGCACTATTCCGAAACGCAGCCTGTTTTCCATATGCGGATTGGAAACAAAATACCTTAAAACAAGCAGATACATTTCCGGCGGGCCGCAACCTCCGAAATACCGGCGGCAGTATGCCGTCTGAAGTGTCCCGCCCCGTCCGAACAACACAAAAACAGCCGTTCGAAACCCTGTCCGAACAGTGTTAGAATCGAAATCTGCCACACCGATGCACGACACCCGTACCATGATGATCAAACCGACCGCCCTGCTCCTGCCGGCTTTATTTTTCTTTCCGCACGCATACGCGCCTSEQ.ID NO：12脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)(ATCC13090)PilQ基因(772bp)上游DNA区核苷酸序列GCGATGTCGGGAAGCCTTCTCCCGAATCATTACCCCTTGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAACGGCGGCAATCATGACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCCACCACCTACCAAGCAAAATCCGTAGAAGAGCTTGCCGCAGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGTTAGGGAAACCATGAAACACTATGCCTTACTCATCAGCTTTCTGGCTCTCTCCGCGTGTTCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAATCATACCTTTCCAAGCACCTACCCTGCCGGTTGCGCCGGTATACAGCCCGCCGCAGCTTACAGGGCCGAACGCATTCGACTTCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAAAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTATTAAAGAAACGCTGGAAAAATTCAGTTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATTTTGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCCGGCTTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCTACACTGTCGGTGTCGGCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCGTCCTGAACGAGCTGATAGAAGACAGCACGGGCAACTGGGTTTCCCGTAAAGCAGAACTGCTGTTGAATTCTTCCGACAAAAACACCGAACAAGCGGCAGCACCTGCCGCAGAACAAAATTAAGAAGAGGATTACTCCATTSEQ.ID NO：13脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Hsf-like基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列TTTGTTTTTTCTTTTGGTTTGTTTGAATGGTTAAATCGGGGTTTGGGGGCGGATGGTGCGGCATCCGCCCGGTTTTTGGGGGTTGGGGGTTTTCTGATAAATTCCCCCAACTTAAAATCTCGTCATTCCCGCGAAGGCGGGAATCTGGGACGTGGAATCTAAGGAAACTGTTTTATCCGGTAAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGCGTTTTTGGATTCCAGCTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGGTTTCTGTTTTTGCTGATAGATTCCTGTGGTTTTTCGGTTGCTGGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTTGCGTTGCGTTTTTGGATTCCAACTTTTGCGGGAATGACGGTCGGTGGGGTTTCGGTTTTTTCCGATAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGCGGTGGGGGTTTCTGTTTTTTCTGATAGATTCCTGTGGTTTTTCTATGGATTCAATCATTCCTGATAAATTCCCATAATCTAAAATCTCGTCATTCCCGCGAAAGCGGGAATCTAGGACGTGGAATCTAAGGAAACTGTTTTATCCGGTAAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGCGGTGGGGTTTCTGTTTTTTCTGATAAAGTCCTGCCGCGTTGTGTTTCTAGATTCCCGCTTTTGCGGGAATGACGGCGGTGAGGTTTCTGTTTTTTCCGATAAATTCCTGTSEQ.ID NO：14脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Hap基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列AATCAGCATAGGTTGCCACGCGCGGCTTGGGCGTTTTCCCACACAAAGCCTCTGCCATCGGCAGCAGGTTTTTCCCCGATATGCGTATCACGCCCACGCCGCCGCGCCCGGGTGCGGTAGCGACTGCCGCAATCGTTGGAACGTTATCCGACATAAAACCCCCGAAAATTCAAAACAGCCGCGATTATAGCAAATGCCGTCTGAAGTCCGACGGTTTGGCTTTCAGACGGCATAAAACCGCAAAAATGCTTGATAAATCCGTCCGCCTGACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAAACACATACGCCTTCCTGCTCGGTATAGGCTCGCTGCTGGGTCTGTTCCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTCAAAAACATCGGCGGCGATTTTCAACGCGCCATAGAGAAAGCGCGAAAATGACCGAAAACGCACAGGACAAGGCGCGGCAGGCTGTCGAAACCGTCGTCAAATCCCCGGAGCTTGTCGAGCAAATCCTGTCCGACGAGTACGTGCAAATAATGATAGCCCGGCGTTTCCATTCGGGATCGTTGCCGCCGCCGTCCGACTTGGCGCAATACAACGACATTATCAGCAACGGGGCAGACCGCATTATGGCAATGGCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCGGCACGAAACCATACGGCAAGACCAAACCTTCAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCTTCATCAGCGTCATCCTGATACTGCTTTTTGCCGTCTTCCTCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCTTGCCGGCGGCACAGTGGTTGCCTTGGCGGGTGCTTTCGTGATTGGAAGAAGCCGAGACCAAGGCAAAAATTAATTGCAAATCCTAGGGCGTGCTTCATATCCGCCCGAACGCCGAACCGCACATATAGGCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCCCTCCCAAACAAACCCGAATCCCGTCAGATAAGGAAAAATASEQ.ID NO：15脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)LbpA基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GATTTTGGTCATCCCGACAAGCTTCTTGTCGAAGGGCGTGAAATTCCTTTGGTTAGCCAAGAGAAAACCATCAAGCTTGCCGATGGCAGGGAAATGACCGTCCGTGCTTGTTGCGACTTTTTGACCTATGTGAAACTCGGACGGATAAAAACCGAACGCCCGGCAAGTAAACCAAAGGCGGAAGATAAAAGGGAGGATGAAGAGAGTGCAGGCGTTGGTAACGTCGAAGAAGGCGAAGGCGAAGTTTCCGAAGATGAAGGCGAAGAAGCCGAAGAAATCGTCGAAGAAGAACCCGAAGAAGAAGCTGAAGAGGAAGAAGCTGAACCCAAAGAAGTTGAAGAAACCGAAGAAAAATCGCCGACAGAAGAAAGCGGCAGCGGTTCAAACGCCATCCTGCCTGCCTCGGAAGCCTCTAAAGGCAGGGACATCGACCTTTTCCTGAAAGGTATCCGCACGGCGGAAGCCGACATTCCAAGAACCGGAAAAGCACACTATACCGGCACTTGGGAAGCGCGTATCGGCACACCCATTCAATGGGACAATCAGGCGGATAAAGAAGCGGCAAAAGCAGAATTTACCGTTAATTTCGGCGAGAAATCGATTTCCGGAACGCTGACGGAGAAAAACGGTGTACAACCTGCTTTCTATATTGAAAACGGCAAGATTGAGGGCAACGGTTTCCACGCAACAGCACGCACTCGTGAGAACGGCATCAATCTTTCGGGAAATGGTTCGACCAACCCCAGAACCTTCCAAGCTAGTGATCTTCGTGTAGAAGGAGGATTTTACGGCCCGCAGCGGAGGAATTGGGC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GGCGTTTGCCGAGATTATGGACGGCTTCGACAAAGAATATCTGTTCGACCTGCCCAAATTCGTGTGGTGTCTGTTTGGCGGCGTGGTCATCCGCAACATCCTCACTGCCGCATTCAAGGTCAATATGTTCGACCGCGCCATCGATGTGTTCGGCAATGCTTCGCTTTCGCTTTTCTTGGCAATGGCGTTGCTGAATTTGAAACTGTGGGAGCTGACCGGTTTGGCGGGGCCTGTAACCGTGATTCTTGCCGTACAAACCGTGGTGATGGTTTTGTACGCGACTTTTGTTACCTATGTCTTTATGGGGCGCGACTATGATGCGGCAGTATTGGCTGCCGGCCATTGCGGTTTCGGCTTGGGTGCAACGCCGACGGCGGTGGCAAATATGCAGTCCGTCACGCATACTTTCGGCGCGTCGCATAAGGCGTTTTTGATTGTGCCTATGGTCGGCGCGTTCTTCGTCGATTTGATTAATGCCGCGATTCTCACCGGTTTTGTGAATTTCTTTAAAGGCTGATTTTCCGCCTTTCCGACAAAGCACCTGCAAGGTTTACCGCCTGCAGGTGCTTTTGCTATGATAGCCGCTATCGGTCTGCACCGTTTGGAAGGAACATCSEQ.ID NO：22脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)Tbp2基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列CCTACTCCACCGATTCCAATATGCTCGGCGCGACCCACGAAGCCAAAGACTTGGAATTTTTGAACTCGGGCATCAAAATCGTCAAACCCATTATGGGCGTTGCCTTTTGGGACGAAAACGTTGAAGTCAGCCCCGAAGAAGTCAGCGTGCGCTTTGAAGAAGGCGTGCCGGTTGCACTGAACGGCAAAGAATACGCCGACCCCGTCGAACTCTTCCTCGAAGCCAACCGCATCGGCGGCCGCCACGGCTTGGGTATGAGCGACCAAATCGAAAACCGCATCATCGAAGCCAAATCGCGCGGCATCTACGAAGCCCCGGGTATGGCGTTGTTCCACATCGCCTACGAACGCTTGGTGACCGGCATCCACAACGAAGACACCATCGAACAATACCGCATCAACGGCCTGCGCCTCGGCCGTTTGCTCTACCAAGGCCGCTGGTTCGACAGCCAAGCCTTGATGTTGCGCGAAACCGCCCAACGCTGGGTCGCCAAAGCCGTTACCGGCGAAGTTACCCTCGAACTGCGGCGCGGCAACGACTACTCGATTCTGAACACCGAATCGCCCAACCTGACCTACCAACCCGAACGCCTGAGTATGGAAAAAGTCGAAGGTGCGGCGTTTACCCCGCTCGACCGCATCGGACAGCTCACGATGCGCAACCTCGACATCACCGACACCCGCGCCAAACTGGGCATCTACTCGCAAAGCGGTTTGCTGTCGCTGGGCGAAGGCTCGGTATTACCGCAGTTGGGCAATAAGAAATAAGGTTTGCTGTTTTGCATCATTAGCAACTTAAGGGGTCGTCTGAAAAGATGATCCCTTATGTTAAAAGGAATCCTATGAAAGAATACAAAGTCGTCATTTATCAGGAAAGCCAGTTGTCCAGCCTGTTTTTCGGCGCGGCAAAGGTCAACCCCGTCAATTTCAGCGCGTTCCTCAACAAACAAACCCCCCGAAGGCTGGCGGGTCGAGACCTTTGCAATAACATAGGTTACTAASEQ.ID NO：23脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)PorA基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GAATGACAATTCATAAGTTTCCCGAAATTCCAACATAACCGAAACCTGACAATAACCGTAGCAACTGAACCGTCATTCCCGCAAAAGCGGGAATCCAGTCCGTTCAGTTTCGGTCATTTCCGATAAATGCCTGTTGCTTTTCATTTCTAGATTCCCACTTTCGTGGGAATGACGGCGGAAGGGTTTTGGTTTTTTCCGATAAATTCTTGAGGCATTGAAATTCCAAATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGCTGCAGATGCCCGACGGTCTTTATAGTGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAGCTGCAGACAGTACAGATAGTACGGAACCGATTCACTTAGTGCTTCAGTATCTTAGAGAATCGTTCTCTTTGAGCTAAGGCGAGGCAACGTCGTACTGGTTTTTGTTCATCCACTATATATGACACGGAAAACGCCGCCGTCCAAACCATGCCGTCTGAAGAAAACTACACAGATACCGCCGCTTATATTACAATCGCCGCCCCGTGGTTCGAAAACCTCCCACACTAAAAAACTAAGGAAACCCTATGTCCCGCAACAACGAAGAGCTGCAAGGTATCTCGCTTTTGGGTAATCAAAAAACCCAATATCCGGCCGAATACGCGCCCGAAATTTTGGAAGCGTTCGACAACAAACATCCCGACAACGACTATTTCGTCAAATTCGTCTGCCCAGAGTTCACCAGCCTCTGCCCCATGACCGGGCAGCCCGACTTCGCCACCATCGTCATCCGCTACATTCCGCACATCAAAATGGTGGAAAGCAAATCCCTGAAACTCTACCTCTTCAGCTTCCGCAACCACGGCGATTTTCATGAAGACTGCGTCAACATCATCATGAAAGACCTCATTGCCCTGATGGATCCGAAATACATCGAAGTATTCGGCGAGTTCACACCGCGCGGCGGCATCGCCATTCATCCTTTCGCCAATTACGGCAAAGCAGGCACCGAGTTTGAAGCATTGGCGCGTAASEQ.ID NO：24脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)PorA启动子区GATATCGAGGTCTGCGCTTGAATTGTGTTGTAGAAACACAACGTTTTTGAAAAAATAAGCTATTGTTTTATATCAAAATATAATCATTTTTAAAATAAAGGTTGCGGCATTTATCAGATATTTGTTCTGAAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGACGTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCCCATSEQ.ID NO：25脑膜炎奈瑟氏菌(血清型A)PorB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列gttttctgtttttgagggaatgacgggatgtaggttcgtaagaatgacgggatataggtttccgtgcggatggattcgtcattcccgcgcaggcgggaatctagaacgtggaatctaagaaaccgttttatccgataagtttccgtgcggacaagtttggattcccgcctgcgcgggaatgacgggattttaggtttctaattttggttttctgtttttgagggaatgacgggatgtaggttcgtaggaatgacgggatataggtttccgtgcggatggattcgtcattcccgcgcaggcgggaatctagaccttagaacaacagcaatattcaaagattatctgaaagtccgagattctagattcccgcctgagcgggaatgacgaaaagtggcgggaatgacggttagcgttgcctcgccttagctcaaagagaacgattctctaaggtgctgaagcaccaagtgaatcggttccgtactatttgtactgtctgcggcttcgtcgccttgtcctgatttttgttaatccactatctcctgccgcaggggcgggttttgcatccgcccgttccgaaagaaaccgcgtgtgcgttttttgccgtctttataacccccggtttgcaatgccctccaataccctcccgagtaagtgttgtaaaaatgcaaatcttaaaaaatttaaataaccatatgttataaaacaaaaaatacccataatatctctatccgtccttcaaaatgcacatcgaattccacacaaaaacaggcagaagtttgttttttcagacaggaacatctatagtttcagacatgtaatcgccgagcccctcggcggtaaatgcaaagctaagcggcttggaaagcccggcctgcttaaatttcttaaccaaaaaaggaatacagcaatgaaaaaatccctgattgccctgactttggcagcccttcctgttgcagcaatggctgacgttaccctgtacggcaccatcaaaaccggcgtaSEQ.ID NO：26脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)PorB启动子区GTTTTCTGTTTTTGAGGGAATGACGGGATGTAGGTTCGTAAGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGATGGATTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGAACGTGGAATCTAAGAAACCGTTTTATCCGATAAGTTTTCCGTGCGGACAAGTTTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATGACGGGATTTTAGGTTTCTAATTTTGGTTTTCTGTTTTTGAGGGAATGACGGGATGTAGGTTCGTAGGAATGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGATGGATTCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGACCTTAGAACAACAGCAATATTCAAAGATTATCTGAAAGTCCGAGATTCTAGATTCCCGCCTGAGCGGGAATGACGAAAAGTGGCGGGAATGACGGTTAGCGTTGCCTCGCCTTAGCTCAAAGAGAACGATTCTCTAAGGTGCTGAAGCACTAAGTGAATCGGTTCCGTACTATTTGTACTGTCTGCGGCTTCGTCGCCTTGTCCTGATTTTTGTTAATCCACTATSEQ.ID NO：27脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)siaABC基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列ATACGGCCAATGGCTTCAGAAAGCGATAAGCCTCTGGCTGAAAAACCGATTTCTTGTGTTCTCCCCACCGCACCCATAGACGTAAAGGTATAGGGATTGGTAATCATGGTAACCACATCACCGCGACGCAGCAAAATATTTTGTCGCGGATTTGCAACTAAATCTTCCAAGGCAACAGTTCGTACTACATTGCCACGTGTCAGCTGCACATTCGTATCCTGCACATTTGCCGTTGAACCACCTACCGCAGCCACCGCATCCAACACACGCTCACCGGCTGCCGTCAGCGGCATACGCACACTATTCCCAGCACGAATCACCGACACATTCGCCGCATTATTCTGCACCAAAC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TTATCAGATTGATATTTTAATAATTCTTGCAGAATACTTTCAGTGCCAGTGTCATTATTAGGGTAGATGCTAATGATATTTTGGCCACTTAATTCTAATGCTTTGAAATATTGGGCCGCATATTGTGGCATTAAATGTGCTTCTGTAGTCACGGGGTGAAACATAGAAATACCATAATTTTCGTATGGTAAACCGTAATATTCTTTGACTTCTTCTAAGGATGGGAGGGTGGAAGAGGCCATAACATCTAAATCGGGGGAGCCGATGATGTGAATATGCTTTCTTTTTTCTCCCATTTGCACTAGGCGAGTGACAGCTTGTTCATTTGCTACCAAGTGGATATGAGAAAGTTTACTAATAGAATGACGAATGGAGTCATCTACTGTACCAGATAGTTCACCACCTTCGATATGGCAAACTAAACGGCTGCTTAATGCACCTACAGCTGCGCCTGCTAGTGCTTCTAAACGGTCGCCGTGAATCATGACCATATCAGGTTCAATTTCATCAGATAGACGAGAGATAAACGTAATGGTATTGCCTAAAACGGCACCCATTGGTTCACCTTGGATTTGATTTGAAAACAGATATGTATGTTGATAGTTTTCTCGAGTTACTTCCTTGTAGGTTCTGCCATATGTTTTCATCATATGCATACCAGTTACAATCAAATGCAATTCAAGGTCTGGGTGATTTTCAATATAGGCTAATAAAGGTTTTAGCTTGCCGAAGTCGGCTCTGGTACCTGTAATGCAAAGAATTCTTTTCATGATTTTAGAATCTATAAGTATATATATATAAGTATAAGGAAGTTGGAAAGAAGAATACTAATTATACTCTACGTACTCATAAATTTATTTCGATTAAGTGCTATAATTAGGCCATTTATAATTATATTAGGATTTGGCTTSEQ.ID NO：33脑膜炎奈瑟氏菌(血清型A)lgtF基因上游(1000 bp)DNA区核苷酸序列from thefromTCTTTTTCGGACTGAAAGGACGCATCATCCCGACATCGAGCGCGTGTTCGTCCGGCAGCCAAGGCATAGGTTATGCCTACGAAGCCATCAAATACGGTCTGACCGATATGATGCTGGCGGGCGGAGGCGAAGAATTTTTCCCGTCCGAAGTGTATGTTTTCGACTCGCTTTATGCCGCCAGCCGCCGCAACGGCGAACCGGAAAAAACCCCGCGCCCATACGACGCGAACCGCGACGGGCTGGTCATCGGCGAAGGCGCGGGGATTTTCGTGCTGGAAGAATTGGAACACGCCAAACGGCGCGGTGCGATAATTTACGCCGAACTCGTCGGCTACGGAGCCAACAGCGATGCCTACCATATTTCCACGCCCCGCCCCGACGCGCAAGGCGCAATCCTTGCCTTTCAGACGGCATTGCAACACGCAGACCTTGCGCCCGAAGACATCGGCTGGATTAATCTGCACGGCACCGGGACGCACCACAACGACAGTATGGAAAGCCGCGCCGTTGCAGCGGTTTTCGGCAACAATACGCCCTGCACGTCCACCAAGCCGCAAACCGGACACACGCTGGGCGCGGCGGGCGCAATCGAAGCCGCGTTCGCGTGGGGCATTGCTGACCGGAAAAGCAATCCCGAAGGGAAACTTCCGCCCCAGCTTTGGGACGGGCAGAACGATCCCGACCTTCCCGCCATCAACCTGACCGGCAGCGGCAGCCGCTGGGAAACCGAAAAACGCATTGCCGCCAGCTCGTCGTTTGCCTTCGGAGGAAGCAACTGCGTTTTACTCATCGGATGAAATAAGTTTGTCAATCCCACCGCTATGCTATACAATACGCGCCTACTCTTGATGGGTCTGTAGCTCAGGGGTTAGAGCAGGGGACTCATAATCCCTTGGTCGTGGGTTCGAGCCCCACCGGACCCACCAATTCCCAAGCCCGGACGTATGTTTGGGCTTTTTTGCCGCCCTGTGAAACCAAAATGCTTTGAGAAACCTTGATASEQ.ID NO：34脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)lgtB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列TAGAAAAATATTTCGCCCAATCATTAGCCGCCGTCGTGAATCAGACTTGGCGCAACTTGGAGATTTTGATTGTCGATGACGGCTCGACAGACGGTACGCTTGCCATTGCCAAGGATTTTCAAAAGCGGGACAGCCGTATCAAAATCCTTGCACAAGCTCAAAATTCCGGCCTGATTCCCTCTTTAAACATCGGGCTGGACGAATTGGCAAAGTCAGGAATGGGGGAATATATTGCACGCACCGATGCCGACGATATTGCCGCCCCCGACTGGATTGAGAAAATCGTGGGCGAGATGGAAAAAGACCGCAGCATCATCGCGATGGGCGCGTGGCTGGAAGTTTTGTCGGAAGAAAAGGACGGCAACCGGCTGGCGCGGCATCACAGGCACGGCAAAATTTGGAAAAAGCCGACCCGGCACGAAGATATTGCCGACTTTTTCCCTTTCGGCAACCCCATACACAACAACACGATGATTATGAGGCGCAGCGTCATTGACGGCGGTTTGCGTTACAACACCGAGCGGGATTGGGCGGAAGATTACCAATTTTGGTACGATGTCAGCAAATTGGGCAGGCTGGCTTATTATCCCGAAGCCTTGGTCAAATACCGCCTTCACGCCAATCAGGTTTCATCCAAATACAGCATCCGCCAACACGAAATCGCGCAAGGCATCCAAAAAACCGCCAGAAACGATTTTTTGCAGTCTATGGGTTTTAAAACCCGGTTCGACAGCCTTGAATACCGCCAAATAAAAGCAGTAGCGTATGAATTGCTGGAGAAACATTTGCCGGAAGAAGATTTTGAACGCGCCCGCCGGTTTTTGTACCAATGCTTCAAACGGACGGACACGCTGCCCGCCGGCGCGTGGCTGGATTTTGCGGCAGACGGCAGGATGCGGCGGCTGTTTACCTTGAGGCAATACTTCGGCATTTTGCACCGATTGCTGAAAAACCGTTGAAAAACGCCGCTTTATCCAACAGACAAAAAACAGGATAAATTSEQ.ID NO：35脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)lst基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GCGCACGGCTTTTTCTTCATCGGTTTGAGGGTCGGCAGGATAATCGGGGACGGCAAAGCCTTTAGACTGCAATTCTTTAATCGCGGCGGTCAGTTGAGGTACGGATGCGCTGATGTTCGGCAGTTTGATTACGTTTGCATCGGGCTGTTTCACCAGTTCGCCCAATTCGGCAAGCGCGTCGGGTACGCGCTGCGCTTCGGTCAGATATTCGGGGAATGCCGCCAAAATACGGCCGGACAGGGAAATGTCGGCAGTTTTGACATCAATATCGGCGTGGCGGGCAAACGCCTGCACAATCGGCAGCAGCGATTGGGTCGCCAGCGCGGGGGCTTCGTCGGTATGGGTATAAACAATGGTGGATTTTTGAGTCATAGGATTATTCTCTTGTAGGTTGGTTTTTTCTTTTGGAACACATTGCGCGGGGAATGTGCGCGGCTATTATGGCATATTTTGGCGGCTTTGTTCGCGCTTTGTTCGATCTTGGCGTGTTTGAACGCGGCAGCGTGAAAGGAAGGGGGAAATGGTTTTCCCGCGTTTGGCGGCGGTGTCGGAGGTGCTGTGCCTGATGTGCGGCGGCATATTTTCGGTGAAATTGATTTTATAGTGGTTTAAATTTAAACCAGTACAGCGTTGCCTCGCCTTGTCGTACTATCTGTACTGTCTGCGGCTTCGTTGCCTTGTCCTGATTTAAATTTAAACCACTATAATATTCGGTAACTGTCGGAATATCTGCTAAAATTCCGCATTTTTCCGCCTCGGGACACTCGGGGCGTATGTTTAATTTGTCGGAATGGAGTTTTAGGGATSEQ.ID NO：36脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)msbB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GCCCGACGGCGAACAGACACGTCGTGAAATCAACCGCTTGGACAGTACGGCGGCGCAATACGACATGCTTGCAGGTTATCTTGAAAGACTTGCCGGAAAAACCGACCGTTGGGCGTGCGCCTACCGCCAAAATGCCGTCTGAACACCCGATTATCCTTTTGAAAGCGCGATTATGCCCCATACCCTTCCCGATATTTCCCAATGTATCAGACAAAATTTGGAACAATATTTCAAAGACCTGAACGGTACCGAACCTTGCGGCGTGTACGATATGGTCTTGCATCAGGTGGAAAAACCGCTGCTGGTGTGCGTGATGGAACAATGCGGCGGCAACCAGTCCAAAGCCTCCGTCATGTTGGGACTGAACCGCAATACTTTGCGTAAAAAACTGATTCAACACGGTTTGCTGTGAATATGTCGGCAACCGTCCGTATCTTGGGTATTGACCCGGGCAGTCGCGTAACGGGTTTCGGTGTCATCGATGTCAGGGGGCGCGATCATTTTTACGTCGCCTCCGGCTGCATCAAAACGCCTGCCGATGCGCCTCTGGCAGACAGGATTGCCGTGATTGTGCGGCATATCGGCGAAGTCGTTACCGTTTACAAGCCTCAACAGGCGGCAGTGGAACAGGTGTTCGTCAACGTCAATCCGGCATCGACGCTGATGCTCGGTCAGGCTAGGGGCGCGGCATTGGCGGCATTGGTCAGCCATAAGCTGCCCGTTTCGGAATACACGGCCTTGCAGGTCAAACAGGCGGTAGTCGGCAAGGGCAAGGCGGCAAAAGAACAGGTGCAGCATATGGTGGTGCAGATGCTGGGGCTTTCGGGAACGCCGCAGGANTGGCGGCGGACGGTCTTGCCGTCGCGCTGACCCACGCCTTACGCAACCACGGGCTTGCCGCCAAACTCAATCCTTCGGGGATGCAGGTCAAGCGCGGCAGGTTTCAATAGTTTCAGACGGCATTTGTATTTTGCCGTCTGAAAAGAAAATGTGTATCGAGSEQ.ID NO：37脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)htrB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列CCGCCAAGCGTTTCCCCCTTTGTCGGGCTTAACATTTGCTTTGTACGGCAGACTTTTTCCCTTCATAACGCCGCCTTTCCGAAAAGACGATGGTAGGCGCGACGTAATTCTCAACCCTTAAGGTACGGTTGGACGAAAAGTTTTCCTTTTCATTCCACCTGCCAACTTTTCGGCTACACCGAGTGGTCTCGTTAGGTTTGGGCGAACTACGCCCTTAAAAAAACGGACATTCTTTGCATGCCCGTCTCTAAGGTTTCACGGTAAGTTTACCCTTATAAAGAGTTGACTTACCATACTTATCCCTTTAAAACGATATAAAGGGCGACAGCTGTAATACAAGTATGTTGTACGGCAGACTTCTTCTACCAAACAAAAAGTTCCTTTTAGAGTTACTCGCTTATAGACAAATGAAGGCTTAGCCATAGGCTTCCGGTAGGCCTATTTCAACGGCTGGTTCACAGGCTACGCTAAAACCTACGGTAGAACCGCGTTCTGGGGTTTCGCGCACAGCGGCGTCTTTGGAACCAGTTGTGTCCGAACACGCATAACCGCCCGCTTTAATGGTGGTGGCGGGTTCACCTGATGTAGTTTCAGCGTGCGCTTTGGTAGTTTGCGTAGCCGATGTTGAGGAGGCTCGACCCGAAACTACGGTTGCCGACGCGCCAGCCGCACATGATGCTGGTCGTTAGAGGCCTGTAGCGGGTTCCGCACTTGCTTCCGCTTCCGTAACTGAACTTGGTTCCGCGACCGCTGGTTCCAAACTACAAGCCGATACGGACGCTGCTTTGGGGCTGGGACTACGGCAAACGGTAGATAATGTCGGTGGCGGACTACGTCGCAGTTTCGCTTAATGCGTTTCTGCCGGAGGACGGAACCGACGCAGGGCTGCGTTTTCGGGTTGACTGGCACCAAATGCTATCGCTTAGGCCGTTTCATTTTGCGTAACTATGGCAGCAGGAGAGATACGTTGTGCTGGGCCTTTAGCCAATACTTCTCAACTSEQ.ID NO：38脑膜炎奈瑟氏菌(血清型B)MltA基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列CACAAAAACCAAGTTATGACGGGAATAAGGTACAGCAGCCAAACCAAGGCCTCGCCCTGCGTCGGATGGTCGGTATAGCCGAAAAATCCGCCGAGCAGCACGCCCAACGGGCTGTCTTCGTGCAAATATTTTGATGAGTCGAACACAATGTCCTGAAGCGCGTTCCAAATGCCTGCTTCGTGCAGCGCACGCAGCGAACCGGCAAGCAGACCAGCGGCAACGATAATCAGAAACGCCCCTGTCCAACGGAAAAACTTCGCCAGATTCAGGCGCATCCCACCCTGATAAATCAACGCGCCAATCACGGCGGCAGCCAAAACCCCCGCTACCGCACCGGCCGGCATCTGCCACGTCGGGCTCTGTTTGAATACGGCAAGCAGGAAAAAAACGCTCTCCAAACCTTCGCGCGCCACGGCAAGAAACGCCATACCGACCAAGGCCCATCCTTGACCGCTGCCACGGTTCAAAGCCGCCTGCACAGAATCCTGAAGCTGCCGCTTCATCGAACGGGCGGCTTTTTTCATCCATAAAATCATATAAGTCAGCATCGCGACAGCAACCAAACCGATAATGCCGACGACGAACTCCTGCTGCTTCTGGGGAATCTCGCCCGTTGCCGAATGGATTCCGTACCCCAGCCCCAAACACATCAAAGAAGCAAGAACAACCCCGAACCAGACCTTAGGCATCAGTTTGGAATGTCCGGACTGTTTCAGAAAACCGGCAACGATGCCGACGATGAGCGCGGCTTCGATACCCTCGCGCAACATAATTAAAAAAGCGACCAGCATAAACGCGAACGAACAAGGATGATGAATAATATATTATCGGAATATTTTCATTGCTTGTAAATACAAATGCAAGTTATTTTTATCTGCAGTACCGCGCGGCGGAAAGTTCCGCAGCTGCAGCTGCGCCCTGTGTTAAAATCCCCTCTCCACGGCTGCCGCAACGCCGCCCGAAACCATCTTTCTTATTACTGCCGGCAACATTGTCCATTSEQ.ID NO：39粘膜炎莫拉氏菌ompCD基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GCTGATTTGTGAGCAAGCGGGCGCATCAGGGATTACCTTGCATTTGCGAGAAGATCGTCGACATATTCAAGATGAAGATGTTTATGAATTGATTGGGCAATTGACAACACGCATGAATCTTGAGATGGCAGTCACTGATGAGATGCTAAATATTGCCCTAAAGGTACGACCAGCATGGGTGTGTTTAGTACCAGAAAAACGCCAAGAGCTGACTACAGAAGGTGGGCTTGATATCGCCAATTTATCAAATATTCAAGCATTTATACACAGTCTTCAGCAGGCGGATATTAAGGTTTCTTTATTCATCGATCCAGATCCGCATCAAATTGATGCTGCAATTGCTTTGGGTGCTGATGCGATTGAGCTGCATACGGGAGCTTATGCTCAAGCGACTTTACAAAATAATCAAAAGCTTGTTGATAAAGAGCTTGACCGTATTCAAAAAGCCGTTGCAATGGCACAAAAAAAATCATCATTATTGATTAATGCAGGTCATGGTTTGACGCGTGATAATGTTGCAGCGATTGCCCAAATTGATGGTATTCATGAGCTGAATATCGGGCATGCATTGATTTCAGATGCGATATTTATGGGGCTTGATAATGCAGTCAAGGCAATGAAAATGGCTTTTATTCAAGATAAAACGACCAATCATTGATGCGTTAGAAAGAAAATCGTAAATAATGATGACTATTGTGTAATATTATGTATTTTTGTTCAAAAAAAGGTTGTAAAAAAATTCATTTACCATTAAGCTAAGCCCACAAGCCACAATGAATACCTATTGGTTTGACTCATTAGTCACTAAGAATCTGCAAAATTTTGTAACAGATTATTGGCAGGTCTTGGATCGCTATGCTAAAATAGGTGCGGTAATCTTGAAAAACCAACCATTCCTTGGAGGAATTTATGAAAAAGGGATATAAACGCTCTTGCGGTCATCGCAGCCGTTGCAGCTCCAGTTGCAGCTCCAGTTGCTGCTCAAGCTGGTGTGACAGTCSEQ.ID NO：40粘膜炎莫拉氏菌copB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GATGCTGTTAAAGTGGGTATTGGTCCTGGTTCTATTTGTACAACCCGTATTGTTGCAGGCATTGGCGTCCCGCAGATAAGTGCCATTGATAGTGTGGCAAGTGCGTTAAAAGATCGCATTCCTTTGATTGCCGATGGCGGTATTCGTTTTTCGGGTGATATCGCCAAAGCCATCGCAGCAGGCGCTTCATGTATTATGGTGGGTAGCTTGTTGGCAGGTACCGAAGAAGCACCTGGTGAGGTGGAATTATTCCAAGGTCGTTATTATAAGGCTTATCGTGGTATGGGCAGCTTGGGGGCAATGTCTGGTCAAAATGGCTCATCGGATCGTTATTTTCAAGATGCCAAAGATGGTGTTGAAAAACTGGTTCCAGAGGGTATCGAAGGCCGTGTTCCTTATAAAGGCCCTGTGGCAGGCATCATCGGTCAATTGGCAGGTGGTCTAAGATCATCCATGGGTTATACAGGTTGCCAGACCATCGAACAGATGCGTAAGAATACCAGCTTTGTCAAAGTGACTTCCGCAGGCATGAAGGAATCGCATGTACACGATGTACAGATTACCAAAGAAGCACCCAATTATCGCCAAAATTAACTCTATTAATAGCAAATACAAGCACTCATTAGATAGGGTGGGTGCTTTTTAGAGCATAAAAAATAAACTGACACATGACTTATTGTCATATTTTTAAAATGCTTTTAATTTAGATTTTTAATTTAGATAATGGCTAAAAATAACAGAATATTAATTTAAAGTTTTCAAAATCAAGCGATTAGATGAAATTATGAAAATAAATAACAATAATTCTGATTTATTTTAACCAATAATATCAATTATCATTTACAAGAAAAATTTTTTTTGATAAAATTCTTACTTGTACCTTGCTATTTTTTCTTATTTATCATTTTTGGCGGTATTTTCGTTGATTTTAGTAAGTAGATGAGCAAGGGATAATTTGACAAAAACAAATTTGATTTCAAGCCTCATAATCGGAGTTATTSEQ.ID NO：41粘膜炎莫拉氏菌D15基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列AAAACTGGTGATGTCTTCACTGCTATTCATGGTGAACCAATCAATGATTGGCTAAGTGCCACCAAGATTATTCAGGCAAATCCAGAAACCATGCTTGATGTGACAGTCATGCGTCAAGGTAAGCAGGTTGATTTAAAATTAATGCCCCGTGGTGTAAAGACACAAAACGGCGTAGTCGGTCAACTGGGTATTCGCCCCCAGATTGATATCGATACGCTCATTCCTGATGAATATCGTATGACGATTCAATATGATGTCGGTGAGGCATTTACTCAAGCCATCCGACGAACTTATGATTTATCAATAATGACCTTAGATGCGATGGGTAAGATGATTACAGGATTGATTGGCATTGAAAATCTATCAGGTCCCATTGCCATTGCCGATGTTTCTAAGACCAGTTTTGAGTTGGGATTTCAAGAAGTGTTATCGACAGCCGCAATCATCAGTTTAAGCTTGGCAGTACTGAATCTTTTACCCATTCCAGTGTTAGATGGCGGGCATTTGGTATTTTATACTTATGAATGGATTATGGGCAAATCTATGAATGAAGCGGTGCAGATGGCAGCATTTAAAGCGGGTGCGTTATTGCTTTTTTGTTTCATGTTACTTGCAATCAGTAACGATATCATGCGATTTTTTGGCTAAGTTCTGATTTATCGTACCATTAACAAAATTTTTGGCTTTTTTAAGCTGAAATACTTGCCAAATTTAACTTTTTGGCTTACCTTTACACAATATAAATTTGGGTGTAGAAAATTTTGGATACATTTTTATACCTTATTTTTAGAAATTTTAAAAATTAAGTTTGGATAGACTTATGCGTAATTCATATTTTAA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ATATATCCCAGTAATATGGAAACATAGCASEQ.ID NO：61粘膜炎莫拉氏菌lipo6基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列CGTTTAGCTTCATACGCAGACCTTGTGCACCTTCGGGCAACCGAAGCATCACGCCAGCATCACGCATCCGCACAAAACCCATCATGCCATCAATTTCGCTGCTGATATGATATACCCCCACCAAAGTAAACCGCTTAAATCGTGGAATAACGCCTGCTGCTGAGGGTGAGGCTTCAGGCAAAACCAAGGTAACCTTATCCCCCAACTTAAGTCCCATGTCAGAGACAATGGACTCACCTAATATAATACCAAACTCGCCGATATGTAAATCATCCAAATTGCCTGCGGTCATATGCTCATCAATGATAGAAACTTGCTTTTCGTAATCAGGCTCAATGCCAGAAACCACGATTCCAGTCACCTGACCTTCAGCGGTTAACATACCTTGTAGTTGAATATAAGGGGCAACTGCTTGCACTTCTGGATTTTGCATTTTGATTTTTTCGGCAAGTTCTTGCCAATTTGTCAAAATTTCTGTTGAGGTAACTGAAGCTTGAGGCACCATGCCAAGAATGCGTGATTTAATTTCACGGTCAAAGCCATTCATGACCGACAAAACCGTGATAAGCACTGCAACCCCAAGCGTAAGCCCAATGGTTGAGATAAAAGAAATAAAGGAAATAAAGCCATTTTTACGCTTAGCTTTGGTATATCTAAGCCCAATAAATAACGCCAAGGGACGAAACATAAGCTGTGTTCCAAACGACCCAACCGTGCTAGTTTAGCACTTTTTTGGACAAATACCAAACATCACATAACAAATGAATCATCAGGTTGGTTTTGTTGCGCTTGTGTATCTGTATGATAAGTTTCTTGCTAAAACAGCTTTTTTATGTCAGAATACAGAAAAGGTATATACTTATATTTTTAACTTTAAATAGATCTGCTTTTTTATACCGATGATTTGGCATGAAGTTTATCGGTCTGATATGCTGGATATAAGTTTATCGGCTTGATATAAATTTTAATTAATCATCAAATTTTTAAGGAATTTATCATTASEQ.ID NO：62粘膜炎莫拉氏菌P6基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列TAAGGATACCAGATTTTGGCTTGTCAATCGTTGTGTTAATCATTGTAACGGTTTATAGTGATTGTCAATTAATAAGGGTAAAAAAGTATTTATCAAGTAATAATCTTTCTTATATGTGAATATAATGACAAATTTATCACATTTTTACAAGGATTTTTTATCAAGATTAGGATATGTTCCAGCTTAATTATTAGTGATGAGCGTGTGATTATTTGGCATCGTTAAATTTATGAGTGCTAAAATTGCCAAATGATTAAAATTTTGCTAACATGATAGCCCCTTTGGTAGGCTTTATTTGGTATTGATGAGCAATAATAATATACCGAGTTAAATGGATTAACTTAACATACGCCAAAAACTTAACAACGAAAAGTAGATGATTATGACAGATACAGTACAAAAAGATACAGCACAGTCCCCCAAAAAAGTTTATCTAAAAGACTACACGCCGCCAGTATATGCAGTTAATAAAGTGGATTTGGATATCCGCTTGTTTGATGATCATGCTGTCGTTGGTGCCAAACTTAAAATGACACGAGCACACGCAGGCGAGCTTCGGCTTCTTGGGCGAGATTTAAAGCTTAAAAGCATTCACCTAAATGGTCAGGAATTAGAGTCGCAGGCGTATCATCTTGATAAGGAAGGCTTAACAATTTTAGATGCACCAGATGTCGCAGTGATTGAGACATTGGTTGAGATTTCACCACAAACCAACACAACACTTGAAGGGCTATATCAAGCAGGAACAGGTGATGATAAGATGTTTGTGACACAATGCGAACCTGAGGGTTTTCGCAAAATCACCTTTTTCCCTGACCGCCCTGATGTTTTGACAGAATACACCACACGCCTAGAAGCACCAAAGCATTTTAAAACCTTGCTTGCCAATGGTAATTTGGTTGAGTCAGGAGATGTGGATGAAAATCGCCATTATACCATTTGGCATGATCCTACCAAAAAACCCAGCTATCTATTCGCCGCTGTCATTGCCAATCTAGAAGSEQ.ID NO：63流感嗜血杆菌(HiRd)MsbB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列AAATCAAGCGCCTGTGCCTGCTGGTGATGGTTGTGGAGACGAATTATATTCTTGGTTTGAACCGCCAAAACCAGGCACTTCAGTGAGCAAACCTAAAGTTACACCGCCTGAGCCGTTTTTGTGCCAACAGATTTTGAACTCACCGAATCGGAGAGAATGGTTAGAATAGCATTGAGGTAAATCAATATGGATATCGGCATTGATCTTTTAGCAATATTGTTTTGTGTTGGTTTTGTCGCATCATTTATCGATGCAATTGCTGGCGGTGGTGGATTAATCACCATTCCAGCGTTACTCATGACAGGTATGCCACCAGCAATGGCGTTAGGCACCAACAAATTGCAAGCTATGGGCGGTGCATTATCCGCAAGCCTTTATTTCTTGCGAAAAAGAGCGGTCAATTTACGCGATATTTGGTTTATTTTGATTTGGGTTTTCTTAGGTTCTGCCCTAGGTACATTATTAATTCAATCAATTGACGTGGCGATTTTCAAAAAAATGCTTCCTTTTTTGATTTTAGCCATTGGTCTATATTTTTTATTTACTCCTAAATTAGGTGATGAAGATCGAAAACAACGATTAAGTTATCTGTTATTTGGTCTTTTAGTTAGCCCATTTTTAGGTTTTTATGATGGCTTCTTTGGGCCAGGGACTGGCTCAATCATGAGTTTAGCCTGTGTTACTTTGCTAGGATTTAATCTCCCGAAAGCGGCAGCACATGCAAAAGTGATGAACTTCACTTCGAACCTTGCTTCTTTTGCACTTTTCTTATTGGGCGGACAAATTCTTTGGAAAGTGGGTTTCGTGATGATGGCTGGGAGCATTTTAGGTGCAAATTTAGGTGCCAAAATGGTGATGACGAAAGGTAAAACCTTGATTCGACCGATGGTTGTTATCATGTCTTTTATGATGACGGCTAAAATGGTTTACGATCAGGGTTGGTTTCATTTTTAATTCGGAAAGCGCGCAAAAGTGCGGTTAAAATTAATTACATTTTATTASEQ.ID NO：64流感嗜血杆菌(HiRd)HtrB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列TTGAAGTCCCCAATTTACCCACCACAATTCCTGCGGCAACATTGGCTAGGTAACAAGATTCTTCGAAAGAACGTCCATCTGCTAATGTGGTTGCTAATACACTAATGACAGTGTCACCGGCTCCCGTCACATCAAACACTTCTTTTGCAACGGTTGGCAAATGATAAGGCTCTTGATTTGGGCGTAATAATGTCATGCCTTTTTCAGAACGCGTCACCAAAAGTGCGGTTAATTCAATATCAGAAATTAATTTTAAACCTTTCTTAATAATCTCTTCTTCTGTATTACATTTACCTACAACGGCTTCAAATTCAGACATATTGGGTGTCAATAATGTAGCCCCACGATAACGTTCAAAATCAGTTCCCTTTGGATCGATCAACACAGGCACATTCGCTTTGCGTGCAATTTGAATCATTTTCTGAACATCTTTAAGCGTGCCTTTGCCGTAATCAGAAAGAATCAAAGCACCGTAATTTTTCACCGCACTTTCTAACTTCGCTAATAAATCCTTGCAATCTACATTATTGAAATCTTCTTCAAAATCAAGGCGGAGCAGCTGTTGATGACGAGATAAAATACGTAATTTAGTAATGGTTGGATGGGTTTCTAATGCAACAAAATTACAATCAATCTTTTGTTTTTCTAATAAGTGGGAAAGTGCAGAACCTGTCTCATCTTGTCCAATCAATCCCATTAACTGAACGGGTACATTGAGTGAAGCAATATTCATCGCCACATTTGCAGCACCGCCCGCGCGTTCTTCATTTTCTTGTACGCGAACTACTGGCACTGGTGCTTCTGGTGAAATACGGTTGGTTGCACCGAACCAATAACGATCAAGCATCACATCGCCTAATACAAGTACTTTTGCTTGCTTAAATTCTGCTGAATATTGAGCCATTTTAAAATCTCTCTATTTGAATAACCAAAATTGTGGCGATTTTACCACAACTCAAATTTACGATAAACTACGCCCCTAACTTACGTGGAAAGAACAASEQ.ID NO：65流感嗜血杆菌(HiRd)蛋白D基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列AGCAATAATTATAGCTGGAATATTCTTTAAAGATGAAAGAGATCGTATAAGACAAAAAGAATTTTATATTGGAGAATTATTAGCAATTATTGGTTCGCTAATATTCGTAATAAATAGTTCAAATAATGATGGAAATACAGACTTTTTTCTTGGGGCAATATTTCTTTTTACAGCTATTTTTATTCAATCTGTACAGAATTTAATTGTAAAAAAAGTAGCCAAAAAGATAAATGCTGTTGTAATAAGTGCATCGACAGCAACAATTTCAGGAGTATTATTTTTATGTTTAGCTTTTAATACTAAACAAATATATTTATTACAAGATGTTGGCATTGGAATGTTGATAGGTTTAGTTTGCGCTGGCTTTTATGGGATGCTAACAGGGATGTTGATGGCTTTTTATATTGTTCAAAAACAGGGAATCACTGTTTTTAACATTTTGCAATTATTAATTCCTCTTTCAACTGCGATAATAGGTTACTTAACATTAGATGAAAGAATAAATATCTATCAGGGAATTAGCGGTATTATTGTAATTATTGGTTGTGTATTGGCATTAAAAAGAAAAAACAAGGAGTGTTGATATATAAAGTAGATGATGTTGGTGGAATAGGTATAGTTAAATATCTGGTTCAATTGGTTTTATTAAGGGCGTTAGCAATTCTCCATTTAAGTTTATGTTTGAATTAGATATTTTGGGAAAAGATGGAAGAATAAAGCTGTTAAATAATGCT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CGTAAATATTCAGAACACCATCACGAGAAGAAGCAAAAGCTAAACGAGAACCATCTGGCGAAAAGGCTGGTGCGCCATTATGCCCTTGAAAAGATGCCACTACTTTACGTGCGCCAGAATTTAAATCCTGTACAACAAGTTGTGATTTTTTATTTTCAAACGATACATAAGCCAAACGCTGGCCGTCTGGAGACCAAGCTGGAGACATAATTGGTTGGGCACTACGATTGACGATAAATTGATTATAGCCATCATAATCTGCTACACGAACTTCATAAGGTTGCGAACCGCCATTTTTTTGCACAACATAAGCGATACGAGTTCTAAAGGCACCACGGATCGCAGTTAATTTTTCAAAAACTTCATCGCTCACAGTATGCGCGCCATAGCGTAACCATTTATTTGTTACTGTATAGCTATTTTGCATTAATACAGTCCCTGGCGTACCTGATGCACCAACCGTATCAATTAATTGATAAGTAATACTATAACCATTACCCGATGGAACCACTTSEQ.ID NO：71流感嗜血杆菌(非典型性)TbpA基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列GGCGATAACCGAGTTTTTGGGGTATTTAGTGCCAAAGAAGACCCACAAAACCCAAAATTATCCAGAGAAACCTTAATTGATGGCAAGCTAACTACTTTTAAAAGAACTGATGCAAAAACCAATACAACAGCCGATACAACAACCAATAAAACAACCAATGCAATAACCGATGAAAAAAACTTTAAGACGGAAGATATACTAAGTTTTGGTGAAGCTGATTATCTTTTAATTGACAATCAGCCTGTTCCGCTTTTACCTGAAAAAAATACTGATGATTTCATAAGTAGTAGGCATCATACTGTAGGAAATAAACGCTATAAAGTGGAAGCATGTTGCAAGAATCTAAGCTATGTAAAATTTGGTATGTATTATGAAGACCCACTTAAAGAAGAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGACCAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAAAACAAACGACGACAACATCTATCGAGACTTATTATCAATTCTTATTAGGTCACCGTACTGCCAAGGCCGACATACCTGCAACGGGAAACGTGAAATATCGCGGTAATTGGTTTGGTTATATTGGTGATGACACGACATCTTACTCCACTACTGGAGATAAAAATGCTCTCGCCGAGTTTGATGTAAATTTTGCCGATAAAAAGCTAACAGGCGAATTAAAACGACACGATAATGGAAATACCGTATTTAAAATTACTGCAGACCTTCAAAGTGGTAAGAATGACTTCACTGGTACAGCAACCGCAACAAATTTTGTAATAGATGGTAACAATAGTCAAACTGGAAATACCCAAATTAATATTAAAACTGAAGTAAATGGGGCATTTTATGGACCTAAGGCTACAGAATTAGGCGGTTATTTCACCTATAACGGAAATTCTACAGCTAAAAATTCCTCAACCGTACCTTCACCACCCAATTCACCAAATGCAAGAGCTGCAGTTGTGTTTGGAGCTAAAAAACAACAAGTAGAAACAACCAAGTAATGGAATACTAAAAASEQ.ID NO：72流感嗜血杆菌(HiRd)TbpB基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列TAGAATTATATTCTTATACAAAATTGATAATTGTTCGCATTATCATTTTTTTTTTGTAATAATGTCAACTTATAATTTTTTAAGTTCATGGATAAAATATGAAAAATGGCGTAAAACAACTTTTTCTCTTATCATTAATAGGCTTATCATTAACGAATGTAGCTTGGGCAGAAGTTGCACGTCCTAAAAATGATACATTGACAAATACGATTCAAAGTGCGGAATTAAAAACCTCCTCTTTTTCCTCTATGCCTAAGAAAGAAATACCAAATAGGCATATTATTTCTCTTTCCAAAAGCCAATTAGCGCACCATCCAAGGCTTGTTTTGCGTGGGTTAATTCCTGCTTTATATCAAAATAACACTCAGGCAGTTCAACTGTTATTACCACTATATAAACAATTTCCTCAACAAGATAATTTCTTACTAACTTGGGCAAAGGCTATTGAAGCTCGTGAACAAGGTGATTTAACTCAATCTATTGCTTATTATCGTGAATTATTCGCTCGAGACGCATCTTTACTACCTTTACGTTATTAATTAGCTCAAGCTCTATTTTTTAACTATGAAAATGAAGCTGCCAAAATTCAATTTGAAAAATTACGTACAGAGGTAGATGATGAAAAATTTTTAGGTGTTATTGATCAGTATCTTTTAACACTAAATCAGCGGAATCAATGGATATGGCAAGTAGGATTAAATTTTTTAAATGATGATAATTTGAATAACGCTCCAAAAAGTGGCACAAAAATTGGTAGTTGGACCGCTTGGGAAAAAGAAAGTGGGCAGGGGGTAGGGTATTCTTTATCAGTAGAAAAAAAATGGCCATGGGCAGATCATTTTTTTAGTAAAACTATGTTTAATGGGAATGGAAAATATTATTGGGATAATAAAAAATACAATGAGGCTACTGTGCGTATAGGTGGTGGTTTAGGCTATCAAACTGCCTCAGTTGAAGTCTCGTTGTTTCCTTTTCAAGAAAAACGCTGGTATGCAGGCGGTSEQ.ID NO：73流感嗜血杆菌(LKP血清型1基因组)HifA(pilin)基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列TAATAAATTGCTCCATAAAGAGGTTTGTGCCTTATAAATAAGGCAATAAAGATTAATATAAACCGTTTATTAAAATGCCAAAGGCTTAATAAACAGCAAACTTTGTTTTCCCAAAAAAAGTAAAAAACTCTTCCATTATATATATATATATATATAATTAAAGCCCTTTTTGAAAAATTTCATATTTTTTTGAATTAATTCGCTGTAGGTTGGGTTTTTGCCCACATGGAGACATATAAAAAAGATTTGTAGGGTGGGCGTAAGCCCACGCGGAACATCATCAAACAACTGTAATGTTGTATTAGGCACGGTGGGCTTATGCCTCGCCTACGGGGAAATGAATAAGGATAAATATGGGCTTAGCCCAGTTTATGGATTTAATTATGTTGAAATGGGGAAAACAATGTTTAAAAAAACACTTTTATTTTTTACCGCACTATTTTTTGCCGCACTTTGTGCATTTTCAGCCAATGCAGATGTGATTATCACTGGCACCAGAGTGATTTATCCCGCTGGGCAAAAAAATGTTATCGTGAAGTTAGAAAACAATGATGATTCGGCAGCATTGGTGCAAGCCTGGATTGATAATGGCAATCCAAATGCCGATCCAAAATACACCAAAACCCCTTTTGTGATTACCCCGCCTGTTGCTCGAGTGGAAGCGAAATCAGGGCAAAGTTTGCGGATTACGTTCACAGGCAGCGAGCCTTTACCTGATGATCGCGAAAGCCTCTTTTATTTTAATTTGTTAGATATTCCGCCGAAACCTGATGCGGCATTTCTGGCAAAACACGGCAGCTTTATGCAAATTGCCATTCGCTCACGTTTGAAGTTGTTTTATCGCCCTGCGAAACTCTCGATGGATTCTCGTGATGCAATGAAAAAAGTAGTGTTTAAAGCCACACCTGAAGGGGTGTTGGTGGATAATCAAACCCCTTATTATATGAACTACATTGGTTTGTTACATCAAAATAAACCTGCGAAAAATGTCAAAATGGTTGSEQ.ID NO：73流感嗜血杆菌(LKP血清型1基因组)HifE(tip pilin)基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列TAGTAGATTTCCGCACGGGCAAAAATACAATGGTGTTATTTAACCTCACTTTGCCAAATGGCGAGCCAGTGCCAATGGCATCCACCGCACAAGATAGCGAAGGGGCATTTGTGGGCGATGTGGTGCAAGGTGGTGTGCTTTTCGCTAATAAACTTACCCAGCCAAAAGGCGAGTTAATCGTCAAATGGGGTGAGCGAGAAAGCGAACAATGCCGTTTCCAATATCAAGTTGATTTGGATAACGCACAAATACAAAGTCACGATATTCAATGCAAAACCGCAAAATAAATAATTGAAGAGGATTTATGCAAAAAACACCCAAAAAATTAACCGCGCTTTTCCATCAAAAATCCACTGCTACTTGTAGTGGAGCAAATTATAGTGGAGCAAATTATAGTGGCTCAAAATGCTTTAGGTTTCATCGTCTGGCTCTGCTTGCTTGCGTGGCTCTGCTTGATTGCATTGTGGCACTGCCTGCTTATGCTTACGATGGCAGAGTGACCTTTCAAGGGGAGATTTTAAGTGATGGCACTTGTAAAATTGAAACAGACAGCCAAAATCGCACGGTTACCCTGCCAACAGTGGGAAAAGCTAATTTAAGCCACGCAGGGCAAACCGCCGCCCCTGTGCCTTTTTCCATCACGTTAAAAGAATGCAATGCAGATGATGCTATGAAAGCTAATCTGCTATTTAAAGGGGGAGACAACACAACAGGGCAATCTTATCTTTCCAATAAGGCAGGCAACGGCAAAGCCACCAACGTGGGCATTCAAATTGTCAAAGCCGATGGCATAGGCACGCCTATCAAGGTGGACGGCACCGAAGCCAACAGCGAAAAAGCCCCCGACACAGGTAAAGCGCAAAACGGCACAGTTATTCAACCCCGTTTTGGCTACTTTGGCTCGTTATTACGCCACAGGTGAAGCCACCGCAGGCGACGTTGAAGCCACTGCAACTTTTGAAGTGCAGTATAACTAAAATATTTATTATCCAGTGAAAAAASEQ.ID NO：75流感嗜血杆菌(HiRd)P2基因上游(1000bp)DNA区核苷酸序列1 TTATCCGCTA ACATTTCATC AGTAATTCCA TGAACTTTAA TCGCATCAGG51 ATCANCGGGG CGATCTGGCT TAATATAAAT ATGAYAATTA TTACCTGTGT101 AACGACGATT TATTAATTCA ACTGCACCAA TTTCAATAAT GCAGTGTCCT151 TCATAATGCG CGCCAAGCTG ATTCATACCT GTAGTTTCAG TATCTAATAC201 AATTTGGCGA TTGGGATTAA TCATTTGTTC AACCTATCTC TTTCCATTAA251 AATACTTGCC ATTCTACACA ACAACCTTTT TGTTATGCCK AAACAGATTG301 AAATTTTTAC TGATGGATCT TGCTTAGGTA ATCCAGGGGC GGGCGGAATT351 GGTGCCGTAT TGCGTTATAA ACAACATGAA AAAACACTCT CCAAAGGCTA401 TTTCCAAACC ACCAATAATC GAATGGAATT ACGCGCTGTC ATTGAAGCAT451 TAAATACATT AAAAGAACCT TGCTTGATCA CGCTTTATAG TGATAGCCAA501 TATATGAAAA ATGGCATAAC CAAATGGATC TTTAACTGGA AAAAAAATAA551 TTGGAAAGCA AGTTCTGGAA AGCCTGTAAA AAACCAAGAT TTATGGATAG601 CCTTAGATGA ATCCATCCAA CGTCATAAAA TTAATTGGCA ATGGGTAAAA651 GGCCATGCTG GACACAGAGA AAATGAAATT TGCGATGAAT TAGCAAAAAA701 AGGGGCAGAA AATCCGACAT TGGAAGATAT GGGGTACATA GAAGAATAAT751 ACAACTGATA TAACGTCATA TTTTTCGATA CCTAAAAATA TTTAATACTT801 AAACCTAAAA CAGAATAAAA AATAATCAAA TTCATTTAAA AAATGTGATC851 TCGATCAGAT TTCAAGAAAA TTAAAATTTT GGAGTATTGA CATCAAAAAT901 TTTTTTTGTA AAGATGCAGC TCGTCCGTTT TGGCGATTGG ACAATTCTAT 951 TGGAGAAAAG TTCAATCATA GATAGTAAAC AACCATAAGG AATACAAATT1001 ASEQ.ID NO：76粘膜炎莫拉氏菌HtrB基因DNA编码区(部分)核苷酸序列1 TCAGTGCTTG GTTTTTTAAG ATATGTACCG CTGTCAGTCC TGCATGGATT51 GGCGGCGTGT GCGTCTTATA TTTCCTATCA TTGCAGGCTT AGTATTTATC101 GCAGCATCCA AGCCAATTTA ATCTTGGTTC ACCCCAAGAT GCCAGACGCA151 CAGCGGCAAA AACTCGCCAA ACAAATCCTA AAAAATCAGC TCATCAGTGC201 AGTCGACAGT CTTAAAACTT GGGCAATGCC ACCAAAATGG TCTATCGCAC251 AAATTAAAAC GGTTCATCAT GAAGATATCC TAATCAAAGC ACTTGCCAAT301 CCAAGTGGTA TGCTTGCCAT TGTGCCTCAT ATCGGCACTT GGGAGATGAT351 GAATGCTTGG CTCAATACCT TTGGCTCCCC TACTATCATG TATAAGCCCA401 TCAAAAATGC GGCGGTAGAT CGCTTTGTTT TACAGGGGCG TGAAAGACTA451 AATGCCAGCC TTGTACCCAC AGATGCTAGT GGTGTTAAGG CAATTTTTAA501 AACACTCAAA GCAGGTGGAT TTAGTATCAT ACTGCCCGAC CATGTACCTG551 ATCCATCAGG TGGTGAGATT GCTCCTTTTT TTGGTATTAA AACCCTAACC601 AGTACGCTGG CGTCAAAGCT TGCTGCAAAA ACTGGTTGTG CTCTTGTTGG651 CTTAAGCTGT ATTCGGCGTG AAGATGGCGA TGGTTTTGAA ATTTTTTGTT701 ATGAATTAAA TGATGAACAA CTTTATTCAA AAAATACCAA AATTGCAACC751 ACTGCTTTAA ATGGTGCGAT GGAACAAATG ATTTATCCAC ATTTTTTGCA801 TTATATGTGG AGCTATCGTC GGTTCAAGCA TACACCACTA TTAAATAATC851 CTTATTTACT TAATGAAAAT GAGCTAAAAA AAATAGCCAT AAAGCTTCAA901 GCCATGTCAA AGGATAGTTA TGAG蛋白序列：与大肠杆菌HtrB的同一性为25％相似性为35％1 SVLGFLRYVP LSVLHGLAAC ASYISYHCRL SIYRSIQANL ILVHPKMPDA51 QRQKLAKQIL KNQLISAVDS LKTWAMPPKW SIAQIKTVHH EDILIKALAN101 PSGMLAIVPH IGTWEMMNAW LNTFGSPTIM YKPIKNAAVD RFVLQGRERL151 MASLVPTDAS GVKAIFKTLK AGGFSIILPD HVPDPSGGEI APFFGIKTLT201 STLASKLAAK TGCALVGLSC IRREDGDGFE IFCYELNDEQ LYSKNTKIAT251 TALNGAMEQM IYPHFLHYMW SYRRFKHTPL LNNPYLLNEN ELKKIAIKLQ301 AMSKDSYESEQ.ID NO：77奈瑟氏菌(脑膜炎球菌B)HtrB基因DNA编码区核苷酸序列1 ATGTTTCGTT TACAATTCGG GCTGTTTCCC CCTTTGCGAA CCGCCATGCA51 CATCCTGTTG ACCGCCCTGC TCAAATGCCT CTCCCTGCTG CCACTTTCCT101 GTCTGCACAC GCTGGGAAAC CGGCTCGGAC ATCTGGCGTT TTACCTTTTA151 AAGGAAGACC GCGCGCGCAT CGTCGCCAAT ATGCGTCAGG CAGGCATGAA201 TCCCGACCCC AAAACAGTCA AAGCCGTTTT TGCGGAAACG GCAAAAGGCG251 GTTTGGAACT TGCCCCCGCG TTTTTCAGAA AACCGGAAGA CATAGAAACA301 ATGTTCAAAG CGGTACACGG CTGGGAACAT GTGCAGCAGG CTTTGGACAA351 ACACGAAGGG CTGCTATTCA TCACGCCGCA CATCGGCAGC TACGATTTGG401 GCGGACGCTA CATCAGCCAG CAGCTTCCGT TCCCGCTGAC CGCCATGTAC451 AAACCGCCGA AAATCAAAGC GATAGACAAA ATCATGCAGG CGGGCAGGGT501 TCGCGGCAAA GGAAAAACCG CGCCTACCAG CATACAAGGG GTCAAACAAA551 TCATCAAAGC CCTGCGTTCG GGCGAAGCAA CCATCGTCCT GCCCGACCAC601 GTCCCCTCCC CTCAAGAAGG CGGGGAAGGC GTATGGGTGG ATTTCTTCGG651 CAAACCTGCC TATACCATGA CGCTGGCGGC AAAATTGGCA CACGTCAAAG701 GCGTGAAAAC CCTGTTTTTC TGCTGCGAAC GCCTGCCTGG CGGACAAGGT751 TTCGATTTGC ACATCCGCCC CGTCCAAGGG GAATTGAACG GCGACAAAGC801 CCATGATGCC GCCGTGTTCA ACCGCAATGC CGAATATTGG ATACGCCGTT851 TTCCGACGCA GTATCTGTTT ATGTACAACC GCTACAAAAT GCCG蛋白序列-与大肠杆菌Htrb的同一性为30％相似性为38％1 MFRLQFGLFP PLRTAMHILL TALLKCLSLL PLSCLHTLGN RLGHLAFYLL51 KEDRARIVAN MRQAGMNPDP KTVKAVFAET AKGGLELAPA FFRKPEDIET101 MFKAVHGWEH VQQALDKHEG LLFITPHIGS YDLGGRYISQ QLPFPLTAMY151 KPPKIKAIDK IMQAGRVRGK GKTAPTSIQG VKQIIKALRS GEATIVLPDH201 VPSPQEGGEG VWVDFFGKPA YTMTLAAKLA HVKGVKTLFF CCERLPGGQG251 FDLHIRPVQG ELNGDKAHDA AVFNRNAEYW IRRFPTQYLF MYNRYKMPSEQ.ID NO：78流感嗜血杆菌(非典型性)HtrB基因DNA编码区核苷酸序列1 ATGAAAAACG AAAAACTCCC TCAATTTCAA CCGCACTTTT TAGCCCCAAA51 ATACTGGCTT TTTTGGCTAG GCGTGGCAAT TTGGCGAAGT ATTTTATGTC101 TTCCCTATCC TATTTTGCGC CATATTGGTC ATGGTTTCGG TTGGCTGTTT151 TCACATTTAA AAGTGGGTAA ACGTCGAGCT GCCATTGCAC GCCGTAATCT201 TGAACTTTGT TTCCCTGATA TGCCTGAAAA CGAACGTGAG ACGATTTTGC251 AAGAAAATCT TCGTTCAGTA GGCATGGCAA TTATCGAAAC TGGCATGGCT301 TGGTTTTGGT CGGATTCACG TATCAAAAAA TGGTCGAAAG TTGAAGGCTT351 ACATTATCTA AAAGAAAATC AAAAAGATGG AATTGTTCTC GTCGGTGTTC401 ATTTCTTAAC GCTAGAACTT GGCGCACGCA TCATTGGTTT ACATCATCCT451 GGCATTGGTG TTTATCGTCC AAATGATAAT CCTTTGCTTG ATTGGCTACA501 AACACAAGGC CGTTTACGCT CCAATAAAGA TATGCTTGAT CGTAAAGATT551 TACGCGGAAT GATCAAAGCT TTACGCCACG AAGAAACCAT TTGGTATGCG601 CCTGATCACG ATTACGGCAG AAAAAATGCC GTTTTTGTTC CTTTTTTTGC651 AGTACCTGAC ACTTGCACTA CTACTGGTAG TTATTATTTA TTGAAATCCT701 CGCAAAACAG CAAAGTGATT CCATTTGCGC CATTACGCAA TAAAGATGGT751 TCAGGCTATA CCGTGAGTAT TTCAGCGCCT GTTGATTTTA CGGATTTACA801 AGATGAAACG GCGATTGCTG CGCGAATGAA TCAAATCGTA GAAAAGGAAA851 TCATGAAGGG CATATCACAA TATATGTGGC TACATCGCCG TTTTAAAACA901 CGTCCAGATG AAAATACGCC TAGTTTATAC GATTAA蛋白序列-与大肠杆菌HtrB同一性为57％相似性为66％1 MKNEKLPQFQ PHFLAPKYWL FWLGVAIWRS ILCLPYPILR HIGHGFGWLF51 SHLKVGKRRA AIARRNLELC FPDMPENERE TILQENLRSV GMAIIETGMA101 WFWSDSRIKK WSKVEGLHYL KENQKDGIVL VGVHFLTLEL GARIIGLHHP151 GIGVYRPNDN PLLDWLQTQG RLRSNKDMLD RKDLRGMIKA LRHEETIWYA201 PDHDYGRKNA VFVPFFAVPD TCTTTGSYYL LKSSQNSKVI PFAPLRNKDG251 SGYTVSISAP VDFTDLQDET AIAARMNQIV EKEIMKGISQ YMWLHRRFKT301 RPDENTPSLY D*SEQ.ID NO：79流感嗜血杆菌(非典型性)MsbB基因DNA编码区核苷酸序列  1 ATGTCGGATA ATCAACAAAA TTTACGTTTG ACGGCGAGAG TGGGCTATGA51 AGCGCACTTT TCATGGTCGT ATTTAAAGCC TCAATATTGG GGGATTTGGC101 TTGGTATTTT CTTTTTATTG TTGTTAGCAT TTGTGCCTTT TCGTCTGCGC151 GATAAATTGA CGGGAAAATT AGGTATTTGG ATTGGGCATA AAGCAAAGAA201 ACAGCGTACG CGTGCACAAA CTAACTTGCA ATATTGTTTC CCTCATTGGA251 CTGAACAACA ACGTGAGCAA GTGATTGATA AAATGTTTGC GGTTGTCGCT301 CAGGTTATGT TTGGTATTGG TGAGATTGCC ATCCGTTCAA AGAAACATTT351 GCAAAAACGC AGCGAATTTA TCGGTCTTGA ACATATCGAA CAGGCAAAAG401 CTGAAGGAAA GAATATTATT CTTATGGTGC CACATGGCTG GGCGATTGAT451 GCGTCTGGCA TTATTTTGCA CACTCAAGGC ATGCCAATGA CTTCTATGTA501 TAATCCACAC CGTAATCCAT TGGTGGATTG GCTTTGGACG ATTACACGCC551 AACGTTTCGG CGGAAAAATG CATGCACGCC AAAATGGTAT TAAACCTTTT601 TTAAGTCATG TTCGTAAAGG CGAAATGGGT TATTACTTAC CCGATGAAGA651 TTTTGGGGCG GAACAAAGCG TATTTGTTGA TTTCTTTGGG ACTTATAAAG701 CGACATTACC AGGGTTAAAT AAAATGGCAA AACTTTCTAA AGCCGTTGTT751 ATTCCAATGT TTCCTCGTTA TAACGCTGAA ACGGGCAAAT ATGAAATGGA801 AATTCATCCT GCAATGAATT TAAGTGATGA TCCTGAACAA TCAGCCCGAG851 CAATGAACGA AGAAATAGAA TCTTTTGTTA CGCCAGCGCC AGAGCAATAT901 GTTTGGATTT TGCAATTATT GCGTACAAGG AAAGATGGCG AAGATCTTTA951 TGATTAA蛋白序列-与大肠杆菌MsbB的同一性为45％相似性为56％1 MSDNQQNLRL TARVGYEAHF SWSYLKPQYW GIWLGIFFLL LLAFVPFRLR51 DKLTGKLGIW IGHKAKKQRT RAQTNLQYCF PHWTEQQREQ VIDKMFAVVA101 QVMFGIGEIA IRSKKHLQKR SEFIGLEHIE QAKAEGKNII LMVPHGWAID151 ASGIILHTQG MPMTSMYNPH RNPLVDWLWT ITRQRFGGKM HARQNGIKPF201 LSHVRKGEMG YYLPDEDFGA EQSVFVDFFG TYKATLPGLN KMAKLSKAVV251 IPMFPRYNAE TGKYEMEIHP AMNLSDDPEQ SARAMNEEIE SFVTPAPEQY301 VWILQLLRTR KDGEDLYD*SEQ.ID NO：80粘膜炎莫拉氏菌MsbB基因DNA编码区核苷酸序列1 ATGAGTTGCC ATCATCAGCA TAAGCAGACA CCCAAACACG CCATATCCAT51 TAAGCATATG CCAAGCTTGA CAGATACTCA TAAACAAAGT AGCCAAGCTG101 AGCCAAAATC GTTTGAATGG GCGTTTTTAC ATCCCAAATA TTGGGGAGTT151 TGGCTGGCTT TTGCGTTGAT TTTACCGCTG ATTTTTCTAC CGCTGCGTTG 201 GCAGTTTTGG ATCGGCAAGC GTCTTGGCAT TTTGGTACAT TACTTAGCTA251 AAAGCCGAGT TCAAGACACT CTAACCAACC TGCAGCTTAC CTTCCCAAAT301 CAACCAAAAT CAAAACACAA GGCCACCGCA CGGCAAGTAT TTATTAATCA351 AGGTATTGGT ATTTTTGAAA GTTTATGTGC ATGGTTTCGC CCTAATGTCT401 TTAAACGCAC TTTTAGCATT TCTGGTTTAC AGCATTTGAT TGATGCCCAA451 AAACAAAATA AAGCGGTGAT TTTACTTGGT GGACATCGCA CGACGCTTGA501 TTTGGGCGGT CGGTTATGTA CACAGTTTTT TGCGGCGGAC TGCGTGTATC551 GCCCACAAAA CAACCCTTTG CTTGAATGGT TTATCTATAA TGCACGCCGC601 TGTATCTTTG ATGAGCAAAT CTCAAATCGT GATATGAAAA AACTCATCAC651 TCGGCTCAAA CAAGGTCGGA TAATTTGGTA TTCACCTGAT CAAGATTTTG701 GTCTTGAGCA TGGCGTGATG GCGACCTTTT TTGGTGTGCC TGCAGCAACG751 ATTACCGCTC AGCGTCGTCT TATTAAGCTG GGTGATAAAG CCAATCCTCC801 TGTCATCATC ATGATGGATA TGCTCAGACA AACGCCCGAT TATATCGCAA851 AAGGTCACCG TCCACATTAT CACATCAGCC TAAGCGCTGT GTTAAAAAAT901 TATCCCAGCG ATGACGAAAC CGCCGATGCT GAACGCATCA ATCGACTGAT951 TGAGCAAAAT ATTCAAAAAG ATTTAACCCA GTGGATGTGG TTTCATCGCC1001 GCTTTAAAAC TCAAGCCGAT GACACCAATT ACTATCAACA TTAATG蛋白序列-与大肠杆菌MsbB的同一性为28％相似性为37％1 MSCHHQHKQT PKHAISIKHM PSLTDTHKQS SQAEPKSFEW AFLHPKYWGV51 WLAFALILPL IFLPLRWQFW IGKRLGILVH YLAKSRVQDT LTNLQLTFPN101 QPKSKHKATA RQVFINQGIG IFESLCAWFR PNVFKRTFSI SGLQHLIDAQ151 KQNKAVILLG GHRTTLDLGG RLCTQFFAAD CVYRPQNNPL LEWFIYNARR201 CIFDEQISNR DMKKLITRLK QGRIIWYSPD QDFGLEHGVM ATFFGVPAAT251 ITAQRRLIKL GDKANPPVII MMDMLRQTPD YIAKGHRPHY HISLSAVLKN301 YPSDDETADA ERINRLIEQN IQKDLTQWMW FHRRFKTQAD DTNYYQH*SEQ.ID NO：81奈瑟氏菌(脑膜炎球菌B)MsbB基因DNA编码区核苷酸序列1 ATGAAATTTA TATTTTTTGT ACTGTATGTT TTGCAGTTTC TGCCGTTTGC51 GCTGCTGCAC AAACTTGCCG ACCTGACGGG TTTGCTCGCC TACCTTTTGG101 TCAAACCCCG CCGCCGTATC GGCGAAATCA ATTTGGCAAA ATGCTTTCCC151 GAGTGGGACG GAAAAAAGCG CGAAACCGTA TTGAAGCAGC ATTTCAAACA201 TATGGCGAAA CTGATGCTTG AATACGGCTT ATATTGGTAC GCGCCTGCCG251 GGCGTTTGAA ATCGCTGGTG CGTTACCGCA ATAAGCATTA TTTGGACGAC301 GCGCTGGCGG CGGGGGAAAA AGTCATCATT CTGTACCCGC ACTTCACCGC351 GTTCGAGATG GCGGTGTACG CGCTTAATCA GGATGTACCG CTGATCAGTA401 TGTATTCCCA CCAAAAAAAC AAGATATTGG ACGCACAGAT TTTGAAAGGC451 CGCAACCGCT ACGACAATGT CTTCCTTATC GGGCGCACCG AAGGCGTGCG501 CGCCCTCGTC AAACAGTTCC GCAAAAGCAG CGCGCCGTTT CTGTATCTGC551 CCGATCAGGA TTTCGGACGC AACGATTCGG TTTTTGTGGA TTTTTTCGGT601 ATTCAGACGG CAACGATTAC CGGCTTGAGC CGCATTGCCG CGCTTGCAAA651 TGCAAAAGTG ATACCCGCCA TCCCCGTCCG CGAGGCGGAC AATACGGTTA701 CATTGCATTT CTACCCGGCT TGGGAATCCT TTCCGAGTGA AGATGCGCAG751 GCCGACGCGC AGCGCATGAA CCGTTTTATC GAGGAACCGT GCGCGAACAT801 CCCGAGCAGT ATTTTTGGCT GCACAAGCGT TTCAAAACCC GTCCGGAAGG851 CAGCCCCGAT TTTTACTGAT ACGTAA蛋白序列-与大肠杆菌MsbB的同一性为25％相似性为36％1 MKFIFFVLYV LQFLPFALLH KLADLTGLLA YLLVKPRRRI GEINLAKCFP51 EWDGKKRETV LKQHFKHMAK LMLEYGLYWY APAGRLKSLV RYRNKHYLDD101 ALAAGEKVII LYPHFTAFEM AVYALNQDVP LISMYSHQKN KILDAQILKG151 RNRYDNVFLI GRTEGVRALV KQFRKSSAPF LYLPDQDFGR NDSVFVDFFG201 IQTATITGLS RIAALANAKV IPAIPVREAD NTVTLHFYPA WESFPSEDAQ251 ADAQRMNRFI EEPCANIPSS IFGCTSVSKP VRKAAPIFTD T*

Claims (56)

1.来自革兰氏阴性细菌的基因工程改造的囊泡制剂，其特征在于所述的制剂通过利用选自一下的方法获得：
a)一种减少囊泡制剂中的免疫显性可变的或非保护性抗原的方法，包括以下步骤：确定此抗原的身份，工程改造一种细菌菌株来产生较少的或不产生所述的抗原，并且从所述菌株生产囊泡；
b)一种上调囊泡制剂中的保护性OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来导入强启动子序列到编码所述抗原的基因的上游使得所述基因以比在非修饰的囊泡中更高的水平表达，且从所述的菌株制备囊泡；
c)一种上调囊泡制剂中的条件化表达的保护性OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来去除其表达的抑制调控机制，且从所述的菌株制备囊泡；
d)一种修饰囊泡制剂中的细菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步骤：鉴定与LPS类脂A部分的毒性有关的基因，工程改造一种细菌菌株来减少或关闭所述基因的表达，并从所述的菌株制备囊泡；
e)一种修饰囊泡制剂中的细菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步骤：鉴定与使得LPS的类脂A部分毒性降低有关的基因，工程改造一种细菌菌株来导入强启动子序列到编码所述抗原的基因的上游使得所述基因以比在非修饰的囊泡中更高的水平表达，且从所述的菌株制备囊泡；
f)一种减少囊泡制剂中脂类A毒性和增加保护性抗原的水平的方法，包括以下步骤：工程改造细菌菌株的染色体来结合一个编码融合到保护性抗原上的多粘菌素A肽，或其衍生物或类似物的基因，并从所述的菌株制备囊泡；
g)一种在囊泡制剂中生成保守的OMP抗原的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，改造细菌菌株来缺失编码所述抗原的基因的可变区，并从所述的菌株制备囊泡；
2.权利要求1的基因工程改造的囊泡制剂，其中所述的制剂通过采用选自以下的一种或多种进一步的方法获得：
h)一种减少抗原在囊泡制剂中表达的方法，其中的抗原结构与人的结构类似且可以在人体中诱导自身免疫应答，包括以下步骤：鉴定涉及抗原的生物合成的基因，改造细菌菌株来减少或关闭所述基因的表达，并从所述的菌株制备囊泡；
i)一种上调囊泡制剂中保护性OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来导入编码所述由异源强启动子序列调控的抗原的基因的一或多个拷贝至染色体，并从所述的菌株制备囊泡。
3.权利要求1或2中的囊泡制剂，其中方法a)，b)，c)，d)，e)，h)和i)的工程改造步骤通过在细菌染色体的至少30个核苷酸的序列和转化菌株的载体上的至少30个核苷酸序列之间的同源重组事件来进行。
4.如权利要求3所述的囊泡制剂，其中的工程改造步骤通过细菌染色体上两个由核苷酸序列“X”分隔的至少30个核苷酸的序列和转化菌株的载体上两个由核苷酸序列“Y”分隔的至少30个核苷酸的序列之间的双重交叉互换同源重组事件来进行，其中在重组事件中，X和Y是相互交换的。
5.如权利要求4所述的囊泡制剂，其中的两个核苷酸序列为大约相同的长度，且其中的载体是线性的DNA分子。
6.如权利要求4或5所述的囊泡制剂，其中方法a)，b)，c)，d)，e)和h)的重组事件是在目的基因的起始密码子上游1000bp的染色体区进行。
7.如权利要求6所述的囊泡制剂，其中方法a)，d)或h)的核苷酸序列X含有基因的部分启动子区，且核苷酸序列Y含有弱启动子区，或无启动子区。
8.如权利要求6所述的囊泡制剂，其中方法b)或e)中的核苷酸序列Y含有细菌的强启动子区。
9.如权利要求8所述的囊泡制剂，其中的核苷酸序列Y插入在目的基因的起始密码子上游大约200-600bp。
10.如权利要求9所述的囊泡制剂，其中的核苷酸序列Y插入在目的基因的起始密码子上游大约400bp。
11.如权利要求6所述的囊泡制剂，其中方法c)中核苷酸序列X含有启动子的部分抑制调控区，且核苷酸序列Y不含这种序列。
12.如权利要求4或5所述的囊泡制剂，其中方法a)，d)和h)的重组事件被进行使得核苷酸序列X含有目的基因的部分编码序列。
13.如权利要求4或5所述的囊泡制剂，其中方法i)被进行使得核苷酸序列Y含有表达盒中基因的更多拷贝。
14.权利要求1-13中的囊泡制剂，分离自修饰的脑膜炎奈瑟氏菌B菌株。
15.如权利要求14所述的囊泡制剂，通过采用至少方法b)和/或i)获得，其中以下一或多个基因被上调：NspA，Hsf-样，Hap，PorA，PorB，OMP85，PilQ，PldA，FrpB，TbpA，TbpB，FrpA，FrpC，LbpA，LbpB，FhaB，HasR，lipo02，Tbp2(lipo28)，MltA(lipo30)和ctrA。
16.如权利要求14和15所述的囊泡制剂，通过采用至少方法a)获得，其中以下一或多个基因被下调：PorA，PorB，PilC，TbpA，TbpB，LbpA，LbpB，Opa和Opc。
17.如权利要求14-16所述的囊泡制剂，通过采用至少方法d)获得，其中以下一或多个基因被上调：htrB，msbB和lpxK。
18.如权利要求14-17所述的囊泡制剂，通过采用至少方法e)获得，其中以下一或多个基因被上调：pmrA，pmrB，pmrE和pmrF。
19.如权利要求14-18所述的囊泡制剂，通过采用至少方法c)获得，其中启动子的抑制调控序列是TbpB或LbpB基因或二者的fur操纵基因区。
20.如权利要求14-19所述的囊泡制剂，通过采用至少方法h)获得，其中以下一或多个基因被下调：galE，siaA，siaB，siaC，siaD，ctrA，ctrB，ctrC，和ctrD。
21.权利要求1-13的囊泡制剂，分离自修饰的粘膜炎莫拉氏菌菌株。
22.如权利要求21所述的囊泡制剂，通过采用至少方法b)获得，其中以下一或多个基因被上调：OMP106，HasR，PilQ，OMP85，lipo06，lipo10，lipo11，lipo18，P6，ompCD，CopB，D15，OmplA1，Hly3，LbpA，LbpB，TbpA，TbpB，OmpE，UspA1，UspA2，和Omp21。
23.如权利要求21或22所述的囊泡制剂，通过采用至少方法a)获得，其中以下一或多个基因被下调：CopB，OMP106，OmpB1，TbpA，TbpB，LbpA和LbpB。
24.如权利要求21-23所述的囊泡制剂，通过采用至少方法d)获得，其中以下一或多个基因被下调：htrB，msbB和lpxK。
25.如权利要求21-24所述的囊泡制剂，通过采用至少方法e)获得，其中以下一或多个基因被上调：pmrA，pmrB，pmrE，和pmrF。
26.权利要求1-13的囊泡制剂，分离自修饰的流感嗜血杆菌菌株。
27.如权利要求26所述的囊泡制剂，通过采用至少方法b)和/或i)获得，其中以下一或多个基因被上调：D15，P6，TbpA，TbpB，P2，P5，OMP26，HMW1，HMW2，HMW3，HMW4，Hia，Hsf，Hap，Hin47，和Hif。
28.如权利要求26或27所述的囊泡制剂，通过采用至少方法a)获得，其中以下一或多个基因被下调：P2，P5，Hif，IgAI-protease，HgpA，HgpB，HMW1，HMW2，Hxu，TbpA，和TbpB。
29.如权利要求26-28所述的囊泡制剂，通过采用至少方法d)获得，其中以下一或多个基因被下调：htrB，msbB和lpxK。
30.如权利要求26-29所述的囊泡制剂，通过采用至少方法e)获得，其中以下一或多个基因被上调：pmrA，pmrB，pmrE，和pmrF。
31.来自革兰氏阴性细菌的基因工程改造的囊泡制剂，其特征在于所述制剂通过包括以下步骤的方法获得：通过同源重组，导入一个外源基因到染色体中，该基因可选地被强启动子序列调控，并从所述的菌株制备囊泡。
32.权利要求31的囊泡制剂，其中的革兰氏阴性菌株是淋病奈瑟氏菌，且异源基因是来自砂眼衣原体的保护性OMP。
33.权利要求31的囊泡制剂，其中的革兰氏阴性菌株是流感嗜血杆菌，且异源基因是来自粘膜炎莫拉氏菌的保护性OMP。
34.权利要求31的囊泡制剂，其中的革兰氏阴性菌株是粘膜炎莫拉氏菌，且异源基因是来自流感嗜血杆菌的保护性OMP。
35.一种疫苗，包含权利要求1-34中的囊泡制剂和一种药学上可接受的赋形剂。
36.一种脑膜炎球菌疫苗，包含权利要求14-20的囊泡制剂和一或多种普通的或结合的选自血清型A，C，Y或W的脑膜炎球菌荚膜多糖。
37.一种脑膜炎疫苗，含有权利要求14-20的制剂或权利要求32的囊泡制剂，结合的流感嗜血杆菌b荚膜多糖，以及一或多个普通或结合的肺炎球菌荚膜多糖。
38.一种中耳炎疫苗，含有权利要求21-25的囊泡制剂以及一或多个普通或结合的肺炎球菌荚膜多糖，和一或多个能保护宿主抵抗非典型性流感嗜血杆菌感染的抗原。
39.一种中耳炎疫苗，含有权利要求26-30的囊泡制剂或以及一或多个普通或结合的肺炎球菌荚膜多糖，和一或多个能保护宿主抵抗粘膜炎莫拉氏菌感染的抗原。
40.权利要求38或39的中耳炎疫苗，其中疫苗另外含有一或多种可保护宿主抵抗肺炎链球菌的蛋白抗原和/或一或多种可保护宿主抵抗RSV的抗原和/或一或多种可保护宿主抵抗流感病毒的抗原。
41.一种适于进行权利要求3-34所述的重组事件的载体。
42.一种修饰的用来制备权利要求1-34的囊泡制剂的革兰氏阴性菌菌株。
43.一种适于儿科使用的免疫保护性和无毒的革兰氏阴性囊泡，空胞或灭活全细胞疫苗。
44.一种分离的多核苷酸序列，其在高度严紧条件下与SEQ ID NO：2-23，25，27-81或其互补链的至少30个核苷酸部分杂交。
45.权利要求44的分离的多核苷酸序列，含有至少30个核苷酸。
46.权利要求45的分离的多核苷酸序列，含有SEQ ID NO：2-23，25，27-81或其互补链的至少30个核苷酸。
47.权利要求44-46的分离的多核苷酸序列在革兰氏阴性菌染色体基因上游1000bp内进行同源重组来增加或减少所述基因表达的同源重组事件中的应用。
48.在革兰氏阴性菌株内遗传上调基因表达的方法，包括以下步骤：制备含有强启动子序列的载体和能与基因上游1000bp至少30个核苷酸的序列重组的至少30个核苷酸的序列，用载体转化细菌菌株，在染色体和载体之间进行同源重组来在基因的起始密码子的上游1000bp内导入启动子。
49.权利要求48的方法，其中的启动子被导入在基因的起始密码子上游200-600bp内。
50.权利要求49的方法，其中的启动子被导入在基因的起始密码子上游约400bp处。
51.如权利要求48-50所述的方法，其中的同源重组事件通过在细菌染色体上两个由核苷酸序列“X”分隔的至少30个核苷酸的序列和转化菌株的载体上两个由含有强启动子序列的核苷酸序列“Y”分隔的至少30个核苷酸的序列之间的双重交叉互换同源重组事件来进行，其中的载体是线性的核苷酸序列，且在重组事件中X和Y是相互交换的。
52.权利要求51的方法，其中的两个核苷酸序列具有大约相同的长度。
53.一种通过权利要求48-52的方法获得的修饰的细菌菌株。
54.一种从革兰氏阴性菌菌株通过采用选自下组的一或多种方法来生产遗传工程改造的囊泡制剂的方法：
a)一种减少囊泡制剂中的免疫显性可变的或非保护性抗原的方法，包括以下步骤：检测此抗原的特性，工程改造一种细菌菌株来产生较少的或不产生所述的抗原，并且从所述菌株生产囊泡；
b)一种上调囊泡制剂中的保护性OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来导入强启动子序列到编码所述抗原的基因的上游使得所述基因比在非修饰的囊泡中较高水平的表达，且从所述的菌株制备囊泡；
c)一种上调囊泡制剂中的条件化表达的保护性OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来去除其表达的抑制调控机制，并从所述的菌株制备囊泡；
d)一种修饰囊泡制剂中的细菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步骤：鉴定与表现LPS毒物的类脂A部分有关的基因，工程改造一种细菌菌株来减少或关闭所述基因的表达，并从所述的菌株制备囊泡；
e)一种修饰囊泡制剂中的细菌LPS的脂A部分的方法，包括以下步骤：鉴定与表现LPS的脂A部分较少毒性有关的基因，工程改造一种细菌菌株来导入强启动子序列到编码所述抗原的基因的上游使得所述基因比在非修饰的囊泡中较高水平的表达，且从所述的菌株制备囊泡；
f)一种减少囊泡制剂中脂类A毒性和增加保护性抗原的水平的方法，包括以下步骤：工程改造细菌菌株的染色体来结合一个编码融合到保护性抗原上的多粘菌素A肽，或其衍生物或类似物的基因，并从所述的菌株制备囊泡；或
g)一种在囊泡制剂中生成保守的OMP抗原的方法包括以下步骤：鉴定所述的抗原，改造细菌菌株来缺失编码所述抗原的基因的可变区，并从所述的菌株制备囊泡；
h)一种减少抗原在囊泡制剂中表达的方法，其中的抗原与人的结构具有结构相似性且可能能够在人体中诱导自身免疫应答，包括以下步骤：鉴定涉及抗原的生物合成的基因，改造细菌菌株来减少或关闭所述基因的表达，并从所述的菌株制备囊泡；或
i)一种上调囊泡制剂中保护性OMP抗原的表达的方法，包括以下步骤：鉴定所述的抗原，工程改造一种细菌菌株来导入编码所述由异源强启动子序列调控的抗原的基因的一或多个染色体拷贝，并从所述的菌株制备囊泡。
55.一种免疫人宿主抵抗下列一或多种细菌感染引起的疾病的方法：脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血杆菌，粘膜炎莫拉氏菌，铜绿假单胞菌，砂眼衣原体，肺炎衣原体，该方法包括向宿主给药免疫保护剂量的权利要求1-34的囊泡制剂。
56.权利要求1-34的囊泡制剂在用于免疫人宿主抵抗以下一或多种细菌感染引起的疾病的药物生产中的应用：脑膜炎奈瑟氏菌，淋病奈瑟氏菌，流感嗜血杆菌，粘膜炎莫拉氏菌，铜绿假单胞菌，砂眼衣原体，肺炎衣原体。
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