PL211017B1 - Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków, jego zastosowanie i zawierająca go szczepionka, zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania szczepionki - Google Patents

Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków, jego zastosowanie i zawierająca go szczepionka, zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania szczepionki

Info

Publication number
PL211017B1
PL211017B1 PL353891A PL35389100A PL211017B1 PL 211017 B1 PL211017 B1 PL 211017B1 PL 353891 A PL353891 A PL 353891A PL 35389100 A PL35389100 A PL 35389100A PL 211017 B1 PL211017 B1 PL 211017B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
strain
gene
vesicle
expression
antigen
Prior art date
Application number
PL353891A
Other languages
English (en)
Other versions
PL353891A1 (pl
Inventor
François-Xavier Jacques Berthet
Wilfried L.J. Dalemans
Philippe Denoel
Guy Dequesne
Christiane Feron
Yves Lobet
Jan Poolman
Georges Thiry
Joelle Thonnard
Pierre Voet
Original Assignee
Smithkline Beecham Biolog
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=10858521&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL211017(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Smithkline Beecham Biolog filed Critical Smithkline Beecham Biolog
Publication of PL353891A1 publication Critical patent/PL353891A1/pl
Publication of PL211017B1 publication Critical patent/PL211017B1/pl

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/095—Neisseria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6905—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion
    • A61K47/6911—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a colloid or an emulsion the form being a liposome
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/22—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Neisseriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55544—Bacterial toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków, jego zastosowanie i zawierająca go szczepionka, zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania szczepionki. Wynalazek dotyczy nowych szczepionek pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych i korzystnych sposobów uzyskiwania tych szczepionek jako skuteczniejszych i bezpieczniejszych.
Tło wynalazku
Bakterie Gram-ujemne są oddzielone od środowiska zewnętrznego dwiema kolejnymi warstwami o strukturze błony. Te struktury, określane jako błona cytoplazmatyczna i błona zewnętrzna (OM, ang. outer membrane), różnią się zarówno strukturalnie, jak i funkcjonalnie. Błona zewnętrzna odgrywa ważną rolę w oddziaływaniu bakterii patogennych z ich odpowiednimi gospodarzami. Wskutek tego, eksponowane na powierzchni cząsteczki bakteryjne stanowią ważne cele dla odpowiedzi immunologicznej gospodarza, co czyni składniki błony zewnętrznej atrakcyjnymi kandydatami do uzyskiwania szczepionek, odczynników diagnostycznych i terapeutycznych.
Szczepionki bakteryjne z całych komórek (zabitych lub atenuowanych) mają tę zaletę, że dostarczają wielu antygenów w ich naturalnym mikrootoczeniu. Wadami tego podejścia są efekty uboczne indukowane przez składniki bakteryjne, takie jak fragmenty endotoksyn i peptydoglikanów. Z drugiej strony, szczepionki z podjednostek nie komórkowych zawierające oczyszczone składniki błony zewnętrznej mogą zapewnić tylko ograniczoną ochronę i nie mogą właściwie prezentować antygenów układowi immunologicznemu gospodarza.
Białka, fosfolipidy i lipopolisacharydy stanowią trzy główne składniki znajdowane w błonie zewnętrznej wszystkich bakterii Gram-ujemnych. Te cząsteczki są rozmieszczone asymetrycznie: fosfolipidy błonowe (głównie w warstwie wewnętrznej), lipooligosacharydy (wyłącznie w warstwie zewnętrznej) i białka (lipoproteiny warstwy wewnętrznej i zewnętrznej, integralne lub politopowe białka błonowe). W przypadku wielu patogenów bakteryjnych, które wpływają na ludzkie zdrowie, wykazano, że lipopolisacharydy i białka błony zewnętrznej są immunogenne i przydatne do nadawania ochrony przed odpowiednią chorobą na drodze immunizacji.
Błona zewnętrzna bakterii Gram-ujemnych jest dynamiczna i, zależnie od warunków otoczenia, może ulegać drastycznym przekształceniom morfologicznym. Wśród tych objawów badano tworzenie pęcherzyków błony zewnętrznej (ang. vesicles lub plebs) i udokumentowano dla wielu bakterii Gram-ujemnych (Zhou, L. i in. 1998. FEMS Microbiol. Lett. 163: 223-228). Wśród patogenów bakteryjnych, które opisano jako wytwarzające pęcherzyki, nie wyczerpująca lista obejmuje: Bordetella pertussis, Borrelia burgdorferi, Brucella melitensis, Brucella ovis, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Esherichia coli, Haemophilus influenzae, Legionella pneumophila, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Pseudomonas aeruginosa i Yersinia enterocolitica. Chociaż mechanizm biochemiczny odpowiedzialny za wytwarzanie pęcherzyków OM nie jest w pełni zrozumiany, to te pęcherzyki błony zewnętrznej były rozlegle badane, ponieważ reprezentują potężną metodologię izolowania preparatów białek błony zewnętrznej w ich konformacji natywnej. W tym kontekście, zastosowanie preparatów błony zewnętrznej ma szczególne znaczenie dla opracowania szczepionek przeciw Neisseria, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa i Chlamydia. Ponadto, pęcherzyki błony zewnętrznej łączą wiele antygenów białkowych i niebiałkowych, które prawdopodobnie nadają rozległą ochronę przeciwko wariantom wewnątrzgatunkowym.
Twórcy wykażą, że w porównaniu z innymi, szerzej stosowanymi typami szczepionki bakteryjnej (szczepionki bakteryjne z całych komórek i z oczyszczonych podjednostek), szczepionki z pęcherzyków błony zewnętrznej (jeżeli są zmodyfikowane w pewien sposób) mogą stanowić idealny kompromis.
Rozpowszechnione zastosowanie szczepionek z podjednostek bakteryjnych nastąpiło dzięki intensywnym badaniom białek powierzchniowych bakterii, które okazały się przydatne w zastosowaniach do szczepionek (na przykład pertaktyny z B. pertussis). Te białka są luźno związane z bakteryjną błoną zewnętrzną i mogą być oczyszczone z supernatantu hodowli albo łatwo ekstrahowane z komórek bakteryjnych. Jednak wykazano takż e, ż e strukturalne, integralne białka błony zewnętrznej także stanowią antygeny ochronne. Przykłady to PorA dla grupy surowiczej B N. meningitidis B; D15 dla H. influenzae; OMP (białko błony zewnętrznej) CD dla M. catarrhalis; OMP F dla P. aeruginosa. Takie białka mają jednak dość specyficzne cechy strukturalne, szczególnie wiele amfipatycznych arkuszy β, co komplikuje ich bezpośrednie zastosowanie jako szczepionek z podjednostek oczyszczonych (rekombinacyjnych).
PL 211 017 B1
Ponadto stało się jasne, że potrzebne są szczepionki wieloskładnikowe (w kategoriach białek powierzchniowych bakterii i integralnych białek błonowych) dla zapewnienia sensownego poziomu ochrony. Na przykład, w przypadku szczepionek z podjednostek B. pertussis szczepionki wieloskładnikowe górują nad produktami jedno- lub dwuskładnikowymi.
W celu włączenia integralnych biał ek bł ony zewnę trznej do takiego produktu podjednostki, w produkcie musi być obecne natywne (lub niemal natywne) fa ł dowanie konformacyjne biał ek, ż eby miał przydatne działanie immunologiczne. Zastosowanie wydzielonych pęcherzyków błony zewnętrznej może być eleganckim rozwiązaniem problemu zawarcia integralnych białek błony ochronnej w szczepionce zawierają cej podjednostkę , przy zapewnieniu, ż e dalej skł adają się wła ś ciwie.
N. meningitidis grupy surowiczej B (menB) wydziela pęcherzyki błony zewnętrznej w ilościach dostatecznych, aby umożliwić wytwarzanie ich na skalę przemysłową. Stwierdzono, że takie wieloskładnikowe szczepionki białek błony zewnętrznej z występujących w przyrodzie szczepów menB są skuteczne do ochrony nastolatków przed chorobą menB i zostały zarejestrowane w Ameryce Łacińskiej. Alternatywny sposób wytwarzania pęcherzyków błony zewnętrznej polega na ekstrakcji detergentowej komórek bakteryjnych (EP nr 11 243).
Przykłady gatunków bakterii, z których można wytworzyć szczepionki pęcherzykowe, są następujące.
Neisseria meningitidis
Neisseria meningitidis (meningokok) to bakteria Gram-ujemna często izolowana z ludzkich górnych dróg oddechowych. Sporadycznie wywołuje inwazyjne choroby bakteryjne, takie jak bakteriemia i zapalenie opon. Zachorowalność na chorobę meningokokową wykazuje róż nice geograficzne, związane z porą roku oraz rokiem (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V.; Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). Większość przypadków choroby w krajach umiarkowanych jest skutkiem szczepów grupy surowiczej B, zaś zachorowalność zmienia się od 1-10/100000/rok populacji całkowitej, czasami osiągając wyższe wartości (Kaczmarski, E. B. (1997), Commun. Dis. Rep. Rev. 7: R55-9, 1995; Scholten, R. J. P. M., Bijlmer, H. A., Poolman, J. T. i in. Clin. Infect. Dis. 16: 237-246, 1993; Cruz, C, Pavez, G., Aguilar, E. i in. Epidemiol. Infect. 105: 119-126, 1990). Zachorowalności swoiste dla wieku w dwóch grupach wysokiego ryzyka, u dzieci młodszych i nastolatków, osiągają wyższe poziomy.
Epidemie zdominowane przez grupę surowiczą A meningokoków występują głównie w Afryce Środkowej, czasami osiągając poziomy do 1000/100000/rok (Schwartz, B., Moore, P. S., Broome, C. V. Clin. Microbiol. Rev. 2 (Supplement), S18-S24, 1989). Niemal wszystkie przypadki choroby meningokokowej w całości są powodowane przez meningokoki grupy surowiczej A, B, C, W-135 i Y. Dostępna jest czterowalentna szczepionka z polisacharydów otoczki A, C, W-135, Y (Armand, J., Arminjon, F., Mynard, M. C., Lafaix, C, J. Biol. Stand. 10: 335-339, 1982).
Szczepionki polisacharydowe są obecnie ulepszane przez chemiczne sprzęganie ich z białkami nośnikowymi (Lieberman, J. M., Chiu, S. S., Wong, V. K. i in. JAMA 275: 1499-1503, 1996). Szczepionka grupy surowiczej B nie jest dostępna, gdyż polisacharyd otoczki B jest nie immunogenny, najprawdopodobniej dlatego, że wykazuje podobieństwo strukturalne ze składnikami gospodarza (Wyle,
F. A., Artenstein, M. S., Brandt, M. L. i in. J. Infect. Dis. 126: 514-522, 1972; Finne, J. M., Leinonen,
M., Makela, P. M. Lancet ii.: 355-357, 1983).
Przez wiele lat skupiano wysiłki na opracowywaniu szczepionek opartych na meningokokowej błonie zewnętrznej (de Moraes, J. C., Perkins, B., Camargo, M. C. i in. Lancet 340: 1074-1078, 1992; Bjune, G., Hoiby, E. A. Gronnesby, J. K. i in. 338: 1093-1096, 1991). Takie szczepionki wykazały skuteczność od 57-85% u dzieci starszych (> 4 lata) i młodzieży. Większość tych prób skuteczności przeprowadzono ze szczepionkami OMV (pęcherzyków błony zewnętrznej, uzyskanymi przez pozbawienie pęcherzyków LPS) pochodzącymi od szczepów N. meningitidis B typu dzikiego.
W tych szczepionkach obecnych jest wiele składników bakteryjnej błony zewnętrznej, takich jak PorA, PorB, Rmp, Opc, Opa, FrpB i wkład tych składników w obserwowaną ochronę wciąż wymaga dalszego określenia. Inne składniki bakteryjnej błony zewnętrznej określono (stosując przeciwciała zwierzęce lub ludzkie) jako potencjalnie nadające się do indukcji odporności ochronnej, takie jak TbpB, NspA (Martin, D., Cadieux, N., Hamel, J., Brodeux, B. R., J. Exp. Med. 185: 1173-1183, 1997; Lissolo, L., Maltre-Wilmotte, C., Dumas, P. i in., Inf. Immun. 63: 884-890, 1995). Mechanizm odporności ochronnej obejmuje aktywność bakteriobójczą za pośrednictwem przeciwciał i opsonofagocytozę.
W minionych kilku dziesięcioleciach częstość infekcji Neisseria meningitidis dramatycznie wzrosła. Przypisuje się to pojawieniu się szczepów opornych na wiele antybiotyków oraz zwiększonej eks4
PL 211 017 B1 pozycji wskutek wzrostu aktywności społecznej (np. baseny lub teatry). Nie jest już niczym nadzwyczajnym wyizolowanie szczepów Neisseria meningitidis opornych na niektóre lub wszystkie ze standardowych antybiotyków. To zjawisko stworzyło niezaspokojone medyczne zapotrzebowanie i popyt na nowe środki mikrobójcze, szczepionki, sposoby badania przesiewowego leków i testy diagnostyczne na ten organizm.
Moraxella catarrhalis
Moraxella catarrhalis (zwana także Branhamella catarrhalis) to bakteria Gram-ujemna często izolowana z ludzkich górnych dróg oddechowych. Jest odpowiedzialna za kilka patologii, przy czym główne to zapalenie ucha środkowego u dzieci młodszych i dzieci oraz zapalenie płuc u starszych. Jest odpowiedzialna także za zapalenie zatok, zakażenia szpitalne i, mniej często, za choroby inwazyjne.
U większoś ci testowanych dorosł ych zidentyfikowano przeciwciał a bakteriobójcze (Chapman, A. J. i in. (1985) J. Infect. Dis. 151:878). Szczepy M. catarrhalis wykazują zmienność swojej oporności na aktywność bakteriobójczą surowicy: w ogólności, izolaty od osób chorych są bardziej oporne niż od tych, które są po prostu skolonizowane (Hol, C. i in. (1993) Lancet 341: 1281, Jordan, K. L. i in. (1990) Am. J. Med. 88 (suppl. 5A): 28S). Oporność na surowicę można przeto uznawać za czynnik zjadliwości bakterii. Aktywność opsonizującą zaobserwowano w surowicach dzieci wracających do zdrowia po zapaleniu ucha środkowego.
U ludzi nie zidentyfikowano antygenów będących celem tych róż nych odpowiedzi immunologicznych, z wyjątkiem OMP B1, białka 84 kDa, którego ekspresję reguluje żelazo i które jest rozpoznawane przez surowice pacjentów z zapaleniem płuc (Sethi, S. i in. (1995) Infect. Immun. 63:1516) z wyją tkiem UspA1 i UspA2 (Chen D. i in. (1999), Infect. Immun. 67: 1310).
Stosując sposoby biochemiczne scharakteryzowano kilka innych białek błonowych obecnych na powierzchni M. catarrhalis ze względu na ich potencjalne znaczenie w indukcji odporności ochronnej (przegląd - patrz Murphy, T. F. (1996) Microbiol. Rev. 60: 267). W modelu myszy zapalenia płuc, obecność przeciwciał powstałych przeciwko niektórym z nich (UspA, CopB) sprzyja szybszej likwidacji infekcji płucnej. Inny polipeptyd (OMP CD) jest wysoce zachowany wśród szczepów M. catarrhalis i wykazuje homologie z poryną Pseudomonas aeruginosa, która, jak wykazano, jest skuteczna przeciwko tej baterii w modelach zwierzęcych.
M. catarrhalis wytwarza pęcherzyki błony zewnętrznej. Te pęcherzyki wydzielono lub ekstrahowano stosując różne sposoby (Murphy T. F., Loeb M. R., 1989. Microb. Pathog. 6: 159-174; Unhanand M., Maciver, I., Ramillo O., Arencibia-Mireles O., Argyle J. C., McCracken G. H. Jr., Hansen E. J., 1992. J. Infect. Dis. 165: 644-650). Zdolność ochronną takich preparatów pęcherzyków przetestowano na modelu mysim badając usuwanie M. catarrhalis z płuc. W tym modelu wykazano, że aktywna immunizacja przy użyciu szczepionki pęcherzykowej lub pasywne przeniesienie przeciwciała antypęcherzykowego indukuje znaczącą ochronę (Maciver I., Unhanand M., McCracken G. H. Jr., Hansen, E. J., 1993. J. Infect. Dis. 168: 469-472).
Haemophilus influenzae
Haemophilus influenzae to nieruchliwa bakteria Gram-ujemna. Człowiek jest jej jedynym naturalnym gospodarzem. Izolaty H. influenzae zazwyczaj klasyfikuje się zgodnie z ich otoczką polisacharydową. Zidentyfikowano sześć różnych typów otoczkowych oznaczanych „a” do „f”. Izolaty, które nie aglutynują z surowicami odpornościowymi uzyskanymi przeciwko jednemu z tych sześciu serotypów są klasyfikowane jako atypowe i nie wyrażają otoczki.
H. influenzae typu b (Hib) odróżnia się wyraźnie od innych typów tym, że stanowi główną przyczynę bakteryjnego zapalenia opon i chorób ogólnoustrojowych. Atypowe szczepy H. influenzae (NTHi) są tylko sporadycznie wydzielane z krwi pacjentów mających chorobę ogólnoustrojową. NTHi stanowi pospolitą przyczynę zapalenia płuc, pogorszenia przewlekłego zapalenia oskrzeli, zapalenia zatok i zapalenia ucha środkowego. Szczepy NTHi wykazują dużą zmienność identyfikowaną metodą analizy klonalnej, podczas gdy szczepy Hib jako całość są bardziej homogenne.
Wykazano, że rozmaite białka H. influenzae są zaangażowane w patogenezę albo nadają ochronę przy szczepieniu w modelach zwierzęcych.
Opisano przylegania NTHi do ludzkich komórek nabłonkowych nosogardzieli (Read RC. i in. 1991. J. Infect. Dis. 163: 549). Oprócz fimbrii i rzęsek (Brinton C. C. i in., 1989. Pediatr. Infect. Dis. J. 8: S54; Kar S. i in. 1990. Infect. Immun. 58: 903; Gildorf J. R. i in., 1992. Infect. Immun. 60: 374; St. Geme J. W. i in., 1991. Infect. Immun. 59: 3366; St. Geme J. W. i in., 1993. Infect. Immun. 61: 2233) w NHTi zidentyfikowano wiele adhezyn. Wykazano, ż e wśród nich dwa eksponowane na powierzchni białka o wysokiej masie cząsteczkowej oznaczane HMW1 i HMW2 pośredniczą w adhezji NTHi do
PL 211 017 B1 komórek nabłonkowych (St. Geme J. W. i in. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2875). Inną rodzinę białek o wysokiej masie cząsteczkowej zidentyfikowano w szczepach NHTi, które nie mają białek należących do rodziny HMW1/HMW2. Hia, białko NTHi 115 kDa (Barenkamp S. J., St. Geme S. W., 1996. Mol. Microbiol., w druku) jest wysoce podobne do adhezyny Hsf wyrażanej przez szczepy H. influenzae typu b (St. Geme J. W. i in., 1996. J. Bact. 178: 6281). Inne białko, Hap, wykazuje podobieństwo do proteaz serynowych IgA1 i wykazano, że jest zaangażowane w adhezję i wnikanie do komórki (St. Geme J. W. i in., 1994. Mol. Microbiol. 14: 217).
Zidentyfikowano i ponumerowano pięć głównych białek błony zewnętrznej (OMP). Pierwotne badania przy użyciu szczepów H. influenzae typu b wykazały, że przeciwciała specyficzne dla P1 i P2 OMP chroniły nowonarodzone szczury przed późniejszą prowokacją (Loeb M. R. i in., 1987. Infect. Immun. 55: 2612; Musson R. S. Jr. i in., 1983. J. Glin. Invest. 72: 677). Stwierdzono, że P2 może indukować przeciwciała bakteriobójcze i opsonizujące, które są skierowane przeciwko zmiennym regionom obecnym w eksponowanych na powierzchni strukturach pętli tego integralnego OMP (Haase E. M. i in., 1994 Infect. Immun. 62: 3712; Troelstra A. i in., 1994 Infect. Immun. 62: 779). Lipoproteina P4 także może indukować przeciwciała bakteriobójcze (Green B. A. i in., 1991. Infect. Immun. 59: 3191).
OMP P6 to konserwatywna lipoproteina związana z peptydoglikanem stanowiąca 1-5% błony zewnętrznej (Nelson M. B. i in., 1991. Infect. Immun. 59: 2658). Później rozpoznano lipoproteinę o w przybliżeniu tej samej masie cząsteczkowej nazywaną POP (P6 cross-reactive protein, białko reaktywne krzyżowo z P6) (Deich R. M. i in., 1990. Infect. Immun. 58: 3388). Mieszanina konserwatywnych lipoprotein P4, P6 i PCP nie zapewniała ochrony, jak wykazano na modelu zapalenia ucha środkowego szynszyli (Green B. A. i in., 1993. Infect. Immun. 61: 1950). Sama P6 wydaje się indukować ochronę w modelu szynszyli (Demaria T. F. i in., 1996. Infect. Immun. 64: 5187).
Opisano także białko fimbrynę (Miyamoto N., Bakaletz, L. O., 1996. Microb. Pathog. 21: 343) mające homologie z OMP P5, która sama ma homologie sekwencji z integralnym OmpA Escherichia coli (Miyamoto N., Bakaletz, L. O., 1996. Microb. Pathog. 21: 343; Munson R. S. Jr. i in., 1993. Infect. Immun. 61: 1017). Wydaje się, że NTHi przywiera do śluzu przy pomocy fimbrii.
Zgodnie z obserwacjami poczynionymi dla gonokoków i meningokoków, NTHi wyraża dwuskładnikowy receptor transferyny ludzkiej złożony z TbpA i TbpB, gdy rośnie w warunkach ograniczenia żelaza. Przeciwciało anty-TbpB chroniło nowonarodzone szczury (Loosmore S. M. i in., 1996. Mol. Microbiol. 19: 575). Dla NTHi opisano także receptor hemoglobiny/haptoglobiny (Maciver I. i in., 1996. Infect. Immun. 64: 3703). Zidentyfikowano także receptor dla Haem:hemopeksyny (Cope L. D. i in., 1994. Mol. Microbiol. 13: 868). Wśród NHTi obecny jest także receptor laktoferryny, ale dotąd nie został scharakteryzowany (Schryvers A. B. i in., 1989. J. Med. Microbiol. 29: 121). Wśród NHTi nie opisano dotąd białka podobnego do dwoinkowego białka FrpB.
OMP 80 kDa, antygen powierzchniowy D15, nadaje ochronę przeciwko NTHi w modelu prowokacji myszy. (Flack F. S. i in., 1995. Gene 156: 97). Lipoproteina błony zewnętrznej 42 kDa, LPD jest konserwatywna wśród Haemophilus influenzae i indukuje przeciwciała bakteriobójcze (Akkoyunlu M. i in., 1996. Infect. Immun. 64: 4586). Stwierdzono, ż e podrz ę dne OMP 98 kDa (Kimura A. i in., 1985. Infect. Immun. 47: 253) jest antygenem ochronnym, przy czym to OMP może być jednym z OMP indukowanych przez ograniczenie Fe lub jedną z adhezyn o wysokiej masie cząsteczkowej, które scharakteryzowano dalej. H. influenzae wytwarza aktywność proteazy IgA1 (Mulks M. H., Shoberg R. J., 1994. Meth. Enzymol. 235: 543). Proteazy IgA1 z NTHi mają wysoki stopień zmienności antygenowej (Lomholt H., van Alphen L., Kilian, M., 1993. Infect. Immun. 61: 4575).
Wykazano, że inne OMP z NTHi, OMP26, białko 26 kDa, wzmaga usuwanie z płuc w modelu szczura (Kyd, J. M., Cripps, A. W., 1998. Infect. Immun. 66: 2272). Wykazano także, że białko HtrA NTHi stanowi antygen ochronny. W istocie, to białko chroniło Chinchilla przed zapaleniem ucha środkowego i chroniło nowonarodzone szczury przeciwko bakteriemii H. influenzae typu b (Loosmore S. M., i in. 1998. Infect. Immun. 66: 899).
Pęcherzyki błony zewnętrznej zostały wydzielone z H. influenzae (Loeb M. R., Zachary A. L., Smith D. H., 1981. J. Bacteriol. 145: 569-604; Stuli T. L., Mack K., Haas J. E., Smit J., Smith A. L., 1985. Anal. Blochem. 150: 471-480). Pęcherzyki skojarzono z indukcją przepuszczalności bariery krew-mózg (Wiwpelwey B., Hansen E. J., Scheld W. M., 1989 Infect. Immun. 57: 2559-2560), indukcją zapalenia opon (Mustafa M. M., Ramilo O., Syrogiannopoulos G. A., Olsen K. D., McCraken G. H. Jr., Hansen, E. J., 1989. J. Infect. Dis. 159: 917-922) i wychwytem DNA (Concino M. F., Goodgal S. H., 1982 J. Bacteriol. 152: 441-450). Te pęcherzyki są zdolne do wiązania się i absorbowania przez nabłonek śluzówki nosa (Harada T., Shimuzu T., Nishimoto K., Sakakura Y., 1989. Acta Otorhinolarygol.
PL 211 017 B1
246: 218-221), co pokazuje, że w pęcherzykach obecne mogą być adhezyny i/lub czynniki kolonizacji. Odpowiedź immunologiczną na białka obecne w pęcherzykach błony zewnętrznej zaobserwowano u pacjentów mających rozmaite choroby związane z H. influenzae (Sakakura Y., Harada T., Hamaguchi Y., Jin C. S., 1988. Acta Otorhinolarygol. Suppl. (Stockh.) 454: 222-226; Harada T., Sakakura Y., Miyoshi Y. 1986. Rhinology 24: 61-66).
Pseudomonas aeruginosa
Rodzaj Pseudomonas składa się z Gram-ujemnych, obdarzonych biegunową wicią pałeczek, prostych oraz nieco zakrzywionych, które rosną aerobowo i nie tworzą przetrwalników. Ze względu na ich ograniczone wymagania metaboliczne, gatunki Pseudomonas są wszechobecne i są szeroko rozpowszechnione w glebie, powietrzu, ściekach i w roślinach. Wykazano także, że liczne gatunki Pseudomonas, takie jak P. aeruginosa, P. pseudomallei, P. mallei, P. maltophilia i P. cepacia są patogenne dla ludzi. Spośród tej listy, P. aeruginosa uważa się za ważny patogen ludzki, gdyż jest związany z infekcją oportunistyczną gospodarza o pogorszonej odpornoś ci i jest odpowiedzialny za wysoką chorobowość u pacjentów hospitalizowanych. Zakażenie szpitalne P. aeruginosa dotyka przede wszystkim pacjentów poddanych długotrwałemu leczeniu i otrzymujących środki tłumiące odporność, kortykosteroidy, antymetabolity, antybiotyki lub naświetlanie.
Pseudomonas, a zwłaszcza P. aeruginosa, wytwarza rozmaite toksyny (takie jak hemolizyny, fibrynolizyny, esterazy, koagulazy, fosfolipazy, endo- i egzotoksyny), które przyczyniają się do patogenności tych bakterii. Ponadto, te organizmy mają wysoką swoistą oporność na antybiotyki wskutek obecności pomp usuwających wiele leków. Ta ostatnia cecha często komplikuje rezultat leczenia choroby.
Wskutek niekontrolowanego stosowania chemioterapeutyków przeciwbakteryjnych częstość zakażenia szpitalnego powodowanego przez P. aeruginosa znacznie wzrosła w ciągu ostatnich 30 lat. Na przykład, w USA obciążenie ekonomiczne wskutek zakażeń szpitalnych P. aeruginosa szacuje się na 4,5 miliarda dolarów USA rocznie. Zatem aktywnie potrzebne jest opracowanie szczepionki do czynnej lub biernej immunizacji przeciwko P. aeruginosa (przegląd - patrz Stanislavsky i in., 1997. FEMS Microbiol. Lett. 21: 243-277).
Rozmaite związane z komórką i wydzielane antygeny P. aeruginosa były przedmiotem opracowywanych szczepionek. Stwierdzono, że wśród antygenów Pseudomonas, śluzowata substancja, która stanowi pozakomórkowy szlam złożony głównie z alginianu, jest heterogenna w kategoriach wielkości i immunogenności. Wydaje się, że składniki alginianowe o wysokiej masie cząsteczkowej (30-300 kDa) zawierają epitopy konserwatywne, zaś składniki alginianowe o niskiej masie cząsteczkowej (10-30 kDa) oprócz epitopów unikalnych posiadają epitopy konserwatywne. Wykazano, że wśród białek związanych z powierzchnią, PcrV, które jest częścią aparatu wydzielania-translokacji typu III, jest interesującym celem dla szczepienia (Sawa i in., 1999. Nature Medicine 5: 392-398).
Antygeny eksponowane na powierzchni, w tym O-antygeny (polisacharyd O-specyficzny LPS) lub H-antygeny (antygeny witki) stosowano do serotypowania dzięki ich wysoce immunogennej naturze. Struktury chemiczne powtarzających się jednostek O-specyficznych polisacharydów zostały wyjaśnione i te dane umożliwiły identyfikację 31 chemotypów P. aeruginosa. Epitopy konserwatywne wśród wszystkich serotypów P. aeruginosa są zlokalizowane w oligosacharydzie rdzenia i regionie lipidu A LPS, a immunogeny zawierające te epitopy indukują u myszy krzyżową odporność ochronną przeciwko różnym immunotypom P. aeruginosa. Wynikało z tego, że zewnętrzny rdzeń LPS jest ligandem do wiązania P. aeruginosa do komórek nabłonkowych dróg oddechowych i oczu. Jednak, w tym zewnętrznym regionie rdzenia istnieje heterogeniczność wśród różnych serotypów. Epitopy w rdzeniu wewnętrznym są wysoce konserwatywne i wykazano, że są dostępne na powierzchni i nie zamaskowane przez polisacharyd O-specyficzny.
W celu sprawdzenia właściwości ochronnych białek OM, szczepionkę zawierającą białka OM z P. aeruginosa z o masach cząsteczkowych w zakresie od 20 do 100 kDa zastosowano w próbach przedklinicznych i klinicznych. Ta szczepionka była skuteczna w modelach zwierzęcych przeciwko prowokacji P. aeruginosa i indukowała wysokie poziomy specyficznych przeciwciał u ochotników. Osocze od ochotników zawierające przeciwciała przeciw P. aeruginosa zapewniło ochronę bierną i pomogł o w wyzdrowieniu 87% pacjentów mają cych ciężkie postaci infekcji P. aeruginosa. Niedawno wykazano, że białko hybrydowe zawierające części białek błony zewnętrznej OprF (aminokwasy 190-342) i OprI (aminokwasy 21-83) z Pseudomonas aeruginosa połączone z S-transferazą glutationową chroni myszy przeciwko 975-krotności 50% dawki letalnej P. aeruginosa (Knapp i in., 1999. Vaccine. 17: 1663-1669).
PL 211 017 B1
Niniejsi twórcy zdawali sobie sprawę z szeregu wad związanych z powyższymi szczepionkami pęcherzykowymi typu dzikiego (albo występującymi w przyrodzie albo wytworzonymi chemicznie).
Przykłady takich problemów są następujące:
- obecność immunodominują cych, lecz zmiennych biał ek na pęcherzyku [(PorA; TbpB, Opa (N. meningitidis B); P2, P5 (atypowe H. influenzae)] - przy czym takie pęcherzyki są skuteczne tylko przeciwko ograniczonemu wyborowi gatunków bakterii. Swoistość odpowiedzi przeciwciała bakteriobójczego względem typu może wykluczyć stosowanie takich szczepionek u małych dzieci;
- obecność niechroniących (nieistotnych) antygenów (Rmp, H8, ...) na pęcherzyku - antygenów, które są dla układu odpornościowego atrapami;
- brak obecnoś ci ważnych cząsteczek, które są wytwarzane warunkowo (na przykład białka błony zewnętrznej regulowane przez żelazo, IROMP, mechanizmy ekspresji regulowane in vivo) - takie warunki trudno regulować przy wytwarzaniu pęcherzyków w celu zoptymalizowania ilości antygenu na powierzchni;
- niski poziom ekspresji antygenów ochronnych, (szczególnie konserwatywnych) (NspA, P6);
- toksyczność LPS pozostałego na powierzchni pęcherzyka potencjalna indukcja odpowiedzi autoimmunologicznej ze względu na struktury identyczne z gospodarzem (na przykład polisacharyd otoczkowy w grupie surowiczej B Neisseria meningitidis, lakto-N-neotetraoza w LPS Neisseria, struktura sacharydowa w LPS ntHi, struktury sacharydowe w rzęskach).
Takie problemy mogą uniemożliwić zastosowanie szczepionek pęcherzykowych jako odczynników szczepiących u ludzi. Jest tak szczególnie w przypadku zastosowań pediatrycznych (< 4 lata), gdzie zdolność wywoływania odczynu przeciwko szczepionkom pęcherzykowym jest szczególnie ważna, i gdzie wykazano, że szczepionki pęcherzykowe (na przykład wspomniana poprzednio sprzedawana szczepionka pęcherzykowa MenB) są nieskuteczne przy ochronie immunologicznej. Odpowiednio, przedmiotem niniejszego wynalazku są sposoby łagodzenia powyższych problemów przy użyciu zmodyfikowanych genetycznie szczepów bakteryjnych, co daje ulepszone szczepionki pęcherzykowe. Takie sposoby będą przydatne zwłaszcza przy wytwarzaniu nowych szczepionek przeciwko patogenom bakteryjnym takim jak Neisseiria meningitidis, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa i innym.
Szczepionki pęcherzykowe według wynalazku są skonstruowane tak, aby skupić odpowiedź immunologiczną na kilku ochronnych antygenach lub epitopach (korzystnie konserwatywnych) - zestawionych w postaci szczepionki wieloskładnikowej. Kiedy takie antygeny stanowią integralne OMP, to pęcherzyki błony zewnętrznej szczepionek pęcherzykowych zapewniają ich właściwe fałdowanie. W niniejszym zgłoszeniu przedstawiono sposoby optymalizowania składu OMP i LPS szczepionek OMV (pęcherzykowych) przez usuwanie immunodominujących zmiennych OMP, jak również nieochronnych OMP, przez tworzenie konserwatywnych OMP metodą delecji regionów zmiennych, przez regulację w górę ekspresji ochronnych OMP i przez eliminowanie mechanizmów kontrolnych (takich jak ograniczenie przez żelazo) ekspresji ochronnych OMP. Rozwiązania według wynalazku wykorzystują zmniejszenie toksyczności lipidu A przez modyfikację porcji lipidowej lub przez zmianę składu fosforylowego przy zachowaniu aktywności adiuwanta lub zamaskowaniu jej. Każdy z tych sposobów ulepszania osobno ulepsza szczepionkę pęcherzykową, jednak kombinacja jednego lub więcej z tych sposobów prowadzi do wytworzenia zoptymalizowanej zmodyfikowanej genetycznie szczepionki pęcherzykowej, która jest immunoochronna i nietoksyczna - szczególnie przydatna do zastosowań pediatrycznych.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Neisseria meningitidis, otrzymywany przy użyciu następującego sposobu:
a) sposobu obniżania poziomu immunodominujących zmiennych lub nieochronnych antygenów w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy konstruowania szczepu bakteryjnego wytwarzającego mniejszą ilość lub nie wytwarzającego antygenu PorA oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu.
Wynalazek dostarcza ponadto preparatu zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Moraxella catarrhalis, otrzymywanego przy użyciu następującego sposobu:
a) sposobu obniżania poziomu immunodominujących zmiennych lub nieochronnych antygenów w preparacie pę cherzyków, obejmują cego etapy okreś lania toż samoś ci takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego wytwarzającego mniejszą ilość lub nie wytwarzającego takich antyge8
PL 211 017 B1 nów oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu, przy czym jeden lub więcej z tych antygenów są wybrane z grupy składającej się z: CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA i LbpB.
Kolejnym aspektem wynalazku jest preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Haemophilus influenzae otrzymywany przy użyciu następującego sposobu:
a) sposobu obniżania poziomu immunodominujących zmiennych lub nieochronnych antygenów w preparacie pę cherzyków, obejmują cego etapy okreś lania toż samości takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego wytwarzającego mniejszą ilość lub niewywarzającego takich antygenów oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu, przy czym jeden lub więcej z tych antygenów są wybrane z grupy składającej się z: P2, P5, Hif, proteazy IgA1, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA i TbpB.
Korzystnie, preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków według wynalazku jest otrzymywany przy użyciu jednego lub więcej dalszych sposobów wybranych z następującej grupy:
b) sposobu zwiększania ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed genem kodującym ten antygen powodując jego ekspresję na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
c) sposobu zwiększania ekspresji wyrażanych warunkowo ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby usunąć represywne mechanizmy kontrolne jego ekspresji oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
d) sposobu modyfikowania części lipidu A bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w nadawaniu toksyczności części lipidu A bakteryjnego LPS, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
e) sposobu modyfikowania części lipidu A bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w zmniejszaniu toksyczności części lipidu A bakteryjnego LPS, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed tym genem powodując jego ekspresję na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
f) sposobu zmniejszania toksyczności lipidu A w preparacie pęcherzyków i zwiększania poziomów antygenów ochronnych, obejmującego etapy konstruowania chromosomu szczepu bakteryjnego tak, aby zawrzeć gen kodujący peptyd polimyksynę A lub jego pochodną, lub analog, połączony z antygenem ochronnym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
g) sposobu wytwarzania konserwatywnych antygenów OMP na preparacie pęcherzyków obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby usunąć zmienne regiony genu kodującego ten antygen oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
h) sposobu zmniejszania w preparacie pęcherzyków ekspresji antygenu, który wykazuje podobieństwo strukturalne do struktury ludzkiej i może być zdolny do indukowania odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w biosyntezie antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu; lub
i) sposobu zwiększania ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić do chromosomu jedną lub więcej dalszych kopii genu kodującego ten antygen kontrolowanych przez heterologiczną, silniejszą sekwencję promotorową oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu.
Korzystnie, preparat pęcherzyków według wynalazku jest otrzymywany sposobem, w którym etapy modyfikowania w sposobach a), b), c), d), e), h) oraz i) są przeprowadzane przez homologiczne zdarzenie rekombinacyjne między sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym, a sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym do szczepu. Ponadto korzystnie etapy konstruowania wykonuje się przez podwójne homologiczne zdarzenie rekombinacyjne typu crossing-over między dwiema sekwencjami o co najmniej 30 nukleotydach na chromosomie bakteryjnym oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową i dwiema sekwencjami o co najmniej 30 nukleotydach na wektorze transformowanym do szczepu oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową „Y”, przy czym podczas zdarzenia rekombinacyjnego X i Y są zamieniane.
PL 211 017 B1
Jeszcze korzystnie wyżej wskazane dwie sekwencje nukleotydowe mają w przybliżeniu tą samą długość, a wektorem jest liniowa cząsteczka DNA.
Ponadto, w korzystnej postaci wykoania zdarzenia rekombinacyj ne w sposobach a), b), c), d), e) i h) przeprowadzane są w regionie chromosomu 1000 bp przed kodonem inicjacji genu będącego przedmiotem zainteresowania, a najkorzystniej w przypadku sposobu a), d) lub h) sekwencja nukleotydową X zawiera część regionu promotorowego genu, zaś sekwencja nukleotydową Y albo zawiera region słabego promotora, albo nie zawiera regionu promotora.
W szczególnie korzystnym aspekcie wynalazku zdarzenia rekombinacyjne w sposobach a), d) i h) są przeprowadzane tak, że sekwencja nukleotydowa X zawiera część sekwencji kodującej genu będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto, korzystnie zdarzenia rekombinacyjne w sposobie i) są przeprowadzane tak, że sekwencja nukleotydowa Y zawiera dalszą kopię genu w kasecie ekspresyjnej.
Korzystnie, preparat pęcherzyków Neisseria meningitidis według wynalazku jest otrzymywany przez wykorzystanie sposobu b) i/lub i), w którym zwiększana jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: NspA, podobny do Hsf, Hap, PorB, OMP85, PilQ, PldA, FrpB, TbpA, TbpB, FrpA, FrpC, LbpA, LbpB, FhaB, HasR, lipo02, Tbp2 (lipo28), MltA (lipo30) i ctrA.
Korzystniej, preparat pęcherzyków Neisseria meningitidis według wynalazku jest otrzymywany przez wykorzystanie co najmniej sposobu h), w którym zmniejszana jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC i ctrD.
Również korzystnie, preparat pęcherzyków Moraxella catarrhalis według wynalazku jest otrzymywany przez wykorzystanie sposobu b) i/lub i), w którym zwiększona jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: OMP106, HasR, PilQ, OMP85, lipo06, lipo10, lipo11, lipo18, P6, ompCD, CopB, D15, OmplA1, Hly3, LbpA, LbpB, TbpA, TbpB, OmpE, UspA1, UspA2 i Omp21.
Ponadto, korzystnie, preparat pęcherzyków Haemophilus influenzae według wynalazku jest otrzymywany przez wykorzystanie sposobu b) i/lub i), w którym zwiększana jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: D15, P6, TbpA, TbpB, P2, P5, OMP26, HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 i Hif.
Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka zawierająca preparat pęcherzyków według wynalazku i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
Przedmiotem wynalazku jest również szczepionka meningokokowa zawierająca preparat pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Neisseria meningitidis według wynalazku i jeden lub więcej zwykłych lub skoniugowanych meningokokowych polisacharydów otoczki wybranych spośród serotypów A, C, Y lub W.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto szczepionka przeciwko zapaleniu opon zawierająca preparat z modyfikowanego szczepu Neisseria meningitidis według wynalazku, skoniugowany polisacharyd otoczki H. influenzae b i jeden lub więcej zwykłych lub skoniugowanych pneumokokowych polisacharydów otoczki.
W kolejym aspekcie wynalazek dostarcza szczepionki przeciwko zapaleniu ucha środkowego zawierającej preparat pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Moraxella catarrhalis według wynalazku i jeden lub więcej zwykłych lub skoniugowanych pneumokokowych polisacharydów otoczki i jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed zakażeniem atypowymi H. influenzae.
Przedmiotem wynalazku jest także szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego, która zawiera preparat pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Haemophilus influenzae według wynalazku i jeden lub więcej zwykłych lub skoniugowanych pneumokokowych polisacharydów otoczki i jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed zakażeniem Moraxella catarrhalis.
Korzystnie, szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego według wynalazku dodatkowo obejmuje jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przeciwko Streptococcus pneumoniae i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV, i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy.
W kolejnej postaci wykonania przedmiotem wynalazku jest modyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny, z którego wytwarzany jest preparat pęcherzyków według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wytwarzania szczepionki obejmujący generowanie szczepionki z modyfikowanego Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego według wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie preparatu pęcherzyków według wynalazku do wytwarzania leku do immunizacji gospodarza będącego człowiekiem przeciwko odpowiednio chorobie
PL 211 017 B1 wywołanej przez zakażenie Neisseria meningitidis, chorobie wywołanej przez Moraxella catarrhalis lub chorobie wywołanej przez Haemophilus influenza.
Preparaty zawierające pęcherzyki według wynalazku są szczególnie przydatne do szczepionek o zasię gu globalnym przeciwko okreś lonym stanom chorobowym.
Niniejszym opisano także wektory do wytwarzania pęcherzyków według wynalazku.
Szczepionka pęcherzykowa według wynalazku jest imraunoochronna i nietoksyczna, gdy jest stosowana u dzieci w wieku poniżej 4 lat.
Zwięzły opis rysunków
Figura 1: reaktywność przeciwciała monoklonalnego 735 mAb na różnych koloniach.
Figura 2: reaktywności specyficznych przeciwciał monoklonalnych zmierzone metodą ELISA dla całych komórek.
Figura 3: schematyczne przedstawienie wektorów pCMK stosowanych do dostarczania genów, operonów i/lub kaset ekspresyjnych w genomie Neisseria meningitidis.
Figura 4: analiza ekspresji PorA w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnego szczepu N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka całkowite uzyskano ze szczepów rekombinacyjnych cps- (ścieżki 3 i 4), cps- porA::pCMK+ (ścieżki 2 i 5) i cps- porA::nspA (ścieżki 116) N. meningitidis grupy surowiczej B i analizowano w warunkach SDS-PAGE w 12% żelu poliakryloamidowym. Żele zabarwiono błękitem Coomassie (ścieżki 1 do 3) lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i zabarwiono immunologicznie, stosując przeciwciało monoklonalne anty-PorA.
Figura 5: analiza ekspresji NspA w ekstraktach białka rekombinacyjnych szczepów N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka ekstrahowano z całych bakterii (ścieżki 1 do 3) lub z preparatów pę cherzyków bł ony zewnę trznej (ś cież ki 4 do 6) oddzielonych metod ą SDS-PAGE w 12% żelu akryloamidowym i analizowano metodą immunoblottingu, stosując surowicę poliklonalną anty-NspA. Analizowano próbki odpowiadające cps- (ścieżki 116), cps- pora::pCMK+ (ścieżki 3 i 4) i cps- porA::nspA (ścież ki 2 i 5). Wykryto dwie postacie NspA: postać dojrzałą (18 kDa) migrującą wspólnie z rekombinacyjnym oczyszczonym NspA i postać krótszą (15 kDa).
Figura 6: analiza ekspresji D15/omp85 w ekstraktach białka rekombinacyjnych szczepów N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka ekstrahowano z preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej i oddzielono metodą SDS-PAGE w 12% żelu akryloamidowym i analizowano metodą immunoblottingu stosując surowicę poliklonalną anty-omp85. Analizowano próbki odpowiadające rekombinacyjnym szczepom cps- (ścieżka 2), i cps- ,PorA+, PCK + Omp85/D15 (ścieżka 1) N. meningitidis grupy surowiczej B.
Figura 7: ogólna strategia modulowania ekspresji genu przez wprowadzanie promotora (RS oznacza miejsce restrykcyjne).
Figura 8: analiza pęcherzyków błony zewnętrznej wytwarzanych przez rekombinacyjne szczepy cps- N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka ekstrahowano z preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej i oddzielono metodą SDS-PAGE w warunkach redukujących na gradiencie 4-20% żelu poliakryloamidowego. Żel barwiono błękitem brylantowym Coomassie R250.
Ścieżki 2, 4, 6 odpowiadały 5 μg białek całkowitych, zaś na ścieżki 3, 5 i 7 wprowadzono 10 μg białek.
Figura 9: konstrukcja plasmidu zastępującego promotor stosowanego do regulacji w górę ekspresji/wytwarzania Omp85/D15 u H44/76 Neisseria meningitldis.
Figura 10: analiza ekspresji OMP85 w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnych szczepów NmB (pochodne H44/76). Żele zabarwiono błękitem Coomassie (A) lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i zabarwiono immunologicznie przy użyciu króliczego przeciwciała monoklonalnego anty-OMP85 (N. gono) (B).
Figura 11: analiza ekspresji OMP85 w preparatach OMV z rekombinacyjnych szczepów NmB (pochodne H44/76). Żele zabarwiono błękitem Coomassie (A) lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i zabarwiono immunologicznie przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-OMP85 (B).
Figura 12: schematyczne przedstawienie rekombinacyjnej strategii PCR stosowanej do usunięcia lacO w chimerycznym promotorze porA/lacO.
Figura 13: analiza ekspresji Hsf w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnych szczepów N. meningitidis grupy surowiczej B (pochodne H44/76). Białka całkowite uzyskano z Cps-PorA+ (ścieżki 1) i Cps-PorA+/Hsf (ścieżki 2) rekombinacyjnych N. meningitidis szczepów grupy surowiczej B i analizowano w warunkach SDS-PAGE w 12% żelu poliakrylo-amidowym. Żele zabarwiono błękitem Coomassie.
PL 211 017 B1
Figura 14: analiza ekspresji GFP w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnych szczepów N. meningitidis (pochodna H44/76). Białka całkowite uzyskano ze szczepów rekombinacyjnych Cps-,PorA+ (ścieżka 1), Cps-,PorA-GFP+ (ścieżka 2 i 3). Białka rozdzielono metodą PAGE-SDS w 12% ż elu poliakryloamidowym, a nastę pnie zabarwiono błękitem Coomassie.
Figura 15: ilustracja wzoru głównych białek na powierzchni rozmaitych preparatów rekombinacyjnych pęcherzyków według analizy metodą SDS-PAGE (barwienie Coomassie).
Figura 16: specyficzna odpowiedź anty-Hsf na rozmaite preparaty pęcherzyków i pęcherzyków rekombinacyjnych przy użyciu oczyszczonego rekombinacyjnego białka Hsf.
Figura 17: analiza ekspresji NspA w ekstraktach białka całkowitego rekombinacyjnych NmB (pochodne grupy surowiczej B). Żele zabarwiono błękitem Coomassie (A) lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i zabarwiono immunologicznie przy użyciu mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-PorA (B) lub mysiego przeciwciała poliklonalnego anty-NspA (C).
Opis wynalazku
W niniejszym zgłoszeniu opisano ogólny zestaw narzędzi i sposobów nadających się do stosowania do wytwarzania ulepszonych, genetycznie zmodyfikowanych pęcherzyków ze szczepów bakteryjnych Gram-ujemnych. Wynalazek obejmuje sposoby stosowane, żeby uzyskiwać pęcherzyki rekombinacyjne bardziej immunogenne, mniej toksyczne i bezpieczniejsze dla ich stosowania w szczepionce dla ludzi i/lub zwierząt. Ponadto, obecny wynalazek opisuje także specyficzne procesy niezbędne do konstruowania, wytwarzania, otrzymywania i stosowania rekombinacyjnych, zmodyfikowanych pęcherzyków z rozmaitych bakterii Gram-ujemnych do celów szczepienia oraz celów terapeutycznych i/lub diagnostycznych. Stosując sposoby według wynalazku, można manipulować składem biochemicznym pęcherzyków bakteryjnych przez działanie na/zmienianie ekspresji genów bakteryjnych kodujących produkty obecne w lub związane z bakteryjnymi pęcherzykami błony zewnętrznej (białka błony zewnętrznej, czyli OMP). W zakresie niniejszego wynalazku leży także wytwarzanie pęcherzyków przy użyciu sposobu modyfikacji genetycznej w celu zwiększania, zmniejszania lub uzyskiwania warunkowej ekspresji jednego lub więcej genów kodujących składniki błony zewnętrznej.
Dla przejrzystości, określenie „kaseta ekspresyjna” będzie odnosić się niniejszym do wszystkich elementów genetycznych niezbędnych do wyrażania genu lub operonu oraz do wytwarzania i kierowania odpowiedniego białka(ek), będącego przedmiotem zainteresowania, do pęcherzyków błony zewnętrznej, pochodzących od danego gospodarza bakteryjnego. Nie wyczerpująca lista tych cech obejmuje elementy kontrolne (transkrypcyjne i/lub translacyjne), regiony kodujące białko i sygnały kierujące, z właściwymi odstępami między nimi. Odniesienie do inserecji sekwencji promotorowych oznacza, dla celów niniejszego wynalazku, insercję sekwencji mającej co najmniej funkcję promotorową i korzystnie jeden lub więcej innych genetycznych elementów regulatorowych zawartych w kasecie ekspresyjnej. Ponadto, określenie „kaseta integracyjna” będzie odnosić się niniejszym do wszystkich elementów genetycznych wymaganych do integracji segmentu DNA w danym gospodarzu bakteryjnym. Nie wyczerpująca lista tych cech obejmuje nośnik wprowadzający (lub wektor), z regionami rekombinogennymi oraz znacznikami wybieralnymi i przeciwwybieralnymi.
Ponownie, dla przejrzystości, określenie „modyfikowanie szczepu bakteryjnego w celu wytwarzania mniej wspomnianego antygenu” odnosi się do dowolnego środka służącego do zmniejszania ekspresji antygenu, będącego przedmiotem zainteresowania, w odniesieniu do ekspresji antygenu z niezmodyfikowanego (tj. występującego w naturze) pęcherzyka tak, ż e ekspresja jest niższa o co najmniej 10% niż dla pęcherzyka niezmodyfikowanego. Korzystnie jest ona niższa o co najmniej 50%. „Silniejsza sekwencja promotorowa” odnosi się do regulatorowego elementu kontrolnego, który zwiększa transkrypcję dla genu kodującego antygen, będący przedmiotem zainteresowania. „Regulacja w górę ekspresji” odnosi się do dowolnego ś rodka służącego do zwiększania ekspresji antygenu, będącego przedmiotem zainteresowania, w odniesieniu do ekspresji antygenu z niezmodyfikowanego (tj. występującego w naturze) pęcherzyka. Należy rozumieć, że stopień „regulacji w górę” będzie zmieniać się zależnie od poszczególnego antygenu, będącego przedmiotem zainteresowania, ale nie przekroczy ilości, która przerwie całość błony pęcherzyka. Regulacja w górę antygenu odnosi się do ekspresji, która jest wyższa o co najmniej 10% niż ekspresja dla pęcherzyka niezmodyfikowanego. Korzystnie, jest ona wyższa o co najmniej 50%. Korzystniej, jest ona wyższa o co najmniej 100% (dwukrotnie).
Aspekty wynalazku odnoszą się do osobnych sposobów wytwarzania ulepszonych zmodyfikowanych pęcherzyków, do kombinacji takich sposobów i do kompozycji pęcherzyków wytworzonych w wyniku tych sposobów. W innym aspekcie przedmiotem wynalazku są narzędzia genetyczne stoso12
PL 211 017 B1 wane w celu genetycznego zmodyfikowania wybranego szczepu bakteryjnego w celu ekstrahowania ze wspomnianego szczepu ulepszonych zmodyfikowanych pęcherzyków.
Etapy modyfikowania w sposobach według wynalazku można prowadzić rozmaitymi sposobami znanymi specjaliście. Na przykład, techniką insercji transpozonu można wstawić sekwencje (np. promotory lub otwarte ramki odczytu), a promotory/geny można przerwać. Na przykład, dla regulacji w górę ekspresji genu, silny promotor można wstawić przez transpozon do 2 kb przed kodonem inicjacji genu [korzystniej 200-600 bp (par zasad, ang. base pairs) przed kodonem, najkorzystniej w przybliżeniu 400 bp przed kodonem]. Można także zastosować mutację lub delecję punktową (szczególnie do regulacji w dół ekspresji genu).
Takie sposoby mogą jednak być dość nietrwałe lub niepewne, a zatem korzystne jest, żeby etap modyfikowania [szczególnie dla sposobów a), b), c), d), e), h) i i), jak opisano poniżej] prowadzić przez rekombinację homologiczną. Korzystnie, rekombinacja ma miejsce między sekwencją (regionem rekombinogennym) o długości co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym i sekwencją (drugim regionem rekombinogennym) o długości co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym w obrębie szczepu. Korzystnie, regiony mają 40-1000 nukleotydów, korzystniej 100-800 nukleotydów, najkorzystniej 500 nukleotydów). Te regiony rekombinogenne powinny być dostatecznie podobne, żeby były one zdolne do hybrydyzowania z innymi w warunkach wysoce ostrych (jak określono później).
Rekombinacje mogą zachodzić przy użyciu pojedynczego regionu rekombinogennego na chromosomie i wektora lub na drodze podwójnego crossing-over (dla 2 regionów na chromosomie i wektora). W celu przeprowadzenia pojedynczej rekombinacji, wektor powinien być kołową cząsteczką DNA. W celu przeprowadzenia podwójnej rekombinacji, wektor może być kołową lub liniową cząsteczką DNA (patrz figura 7). Korzystne jest wykorzystywanie podwójnej rekombinacji i stosowanie wektora liniowego, gdyż tak wytworzona zmodyfikowana bakteria będzie bardziej trwała w kategoriach procesów odwrotnych. Korzystnie, dwa regiony rekombinogenne na chromosomie (i na wektorze) mają podobną (najkorzystniej taką samą) długość, żeby ułatwiać podwójne crossing-over. Podwójne crossing-over działa tak, że dwa regiony rekombinogenne na chromosomie (oddzielone przez sekwencję nukleotydową „X”) i dwa regiony rekombinogenne na wektorze (oddzielone przez sekwencję nukleotydową „Y”) rekombinują pozostawiając niezmieniony chromosom, z tym wyjątkiem, że X i Y zostały zamienione. Położenie regionów rekombinogennych może znajdować się zarówno przed jak i za, albo może oskrzydlać otwartą ramkę odczytu, będącą przedmiotem zainteresowania. Te regiony mogą składać się z sekwencji kodującej, nie kodującej lub mieszaniny sekwencji kodującej i nie kodującej. Tożsamość X i Y będzie zależeć od pożądanego skutku. X może stanowić całość lub część otwartej ramki odczytu, zaś Y wcale nie mieć nukleotydów, co może spowodować usunięcie sekwencji X z chromosomu. Alternatywnie, Y może stanowić region silnego promotora dla insercji przed otwartą ramką odczytu, a zatem X może wcale nie mieć nukleotydów.
Przydatne wektory będą mieć zmieniający się skład, zależnie od tego, jaki typ rekombinacji ma być przeprowadzony i jaki jest ostateczny cel rekombinacji. Wektorami integracyjnymi stosowanymi do wprowadzenia regionu Y mogą być plazmidy warunkowo replikatywne lub samobójcze, bakteriofagi, transpozony lub liniowe fragmenty DNA otrzymane metodą hydrolizy restrykcyjnej lub amplifikacji PCR. Rekombinację wybiera się przy użyciu wybieralnego markera genetycznego takiego jak geny nadające oporność na antybiotyki (na przykład kanamycynę, erytromycynę, chloramfenikol lub gentamycynę), geny nadające oporność na metale ciężkie i/lub związki toksyczne albo geny uzupełniające mutacje auksotrofowe (na przykład pur, leu, met, aro).
Sposób a) i f) - regulacja w dół/usuwanie zmiennych i nie ochronnych antygenów immunodominujących
Wśród szczepów bakteryjnych wiele antygenów powierzchniowych zmienia się i wskutek tego chronią one tylko przed ograniczonym zbiorem blisko spokrewnionych szczepów. Aspekt niniejszego wynalazku obejmuje zmniejszenie ekspresji lub, korzystnie, delecję genu(ów) kodującego zmienne białko(a) powierzchniowe, które daje szczep bakteryjny wytwarzający pęcherzyki, które, gdy są podawane w szczepionce, mają silniejszy potencjał reaktywności krzyżowej przeciwko rozmaitym szczepom dzięki wyższemu wpływowi wywieranemu przez zachowane białka (zatrzymane na błonach zewnętrznych) na układ immunologiczny szczepionego. Przykłady takich antygenów zmiennych obejmują: dla Neisseria - PilC rzęski bakteryjnej, który ulega zmienności antygenowej, PorA, Opa, TbpB, FrpB; dla H. influenzae - P2, P5, pilina, proteaza IgA1; i dla Moraxella - CopB, OMP106.
PL 211 017 B1
Inne typy genów, które można regulować w dół lub wyłączyć, to geny, które in vivo mogą zostać łatwo włączone (wyrażone) lub wyłączone przez bakterię. Skoro białka błony zewnętrznej kodowane przez takie geny nie są zawsze obecne na bakterii, to obecność takich białek w preparatach pęcherzyków może także być szkodliwa dla skuteczności szczepionki z przyczyn podanych wyżej. Korzystny przykład dla regulacji w dół lub usunięcia stanowi białko Opc z Neisseria. Odporność przeciw Opc indukowana przez szczepionkę pęcherzykową zawierającą Opc mogłaby mieć tylko ograniczoną zdolność ochronną, jako że organizm zakażający mógłby łatwo stać się Opc-. HgpA i HgpB z H. influenzae stanowią inne przykłady takich białek.
W sposobie a), ekspresja tych zmiennych lub nie ochronnych genów jest regulowana w dół lub ostatecznie wyłączana. Daje to wspomnianą wyżej nieoczekiwaną korzyść ze skupiania układu odpornościowego na lepszych antygenach, które są obecne w niskich ilościach na powierzchni zewnętrznej pęcherzyków.
Szczep można zmodyfikować w ten sposób stosując szereg strategii obejmujących insercję transpozonu dla przerwania regionu kodującego lub regionu promotora genu, lub mutacje lub delecję punktowe dla osiągnięcia podobnego wyniku. Rekombinację homologiczną można także zastosować do usunięcia genu z chromosomu (gdzie sekwencja X zawiera część (korzystnie całość) sekwencji kodującej genu, będącego przedmiotem zainteresowania). Można ją dodatkowo zastosować do zmiany jego silnego promotora na słabszy (albo żaden) promotor (gdzie sekwencja nukleotydową X obejmuje część (korzystnie całość) regionu promotorowego genu i sekwencja nukleotydowa Y zawiera albo region słabszego promotora [powodujący zmniejszoną ekspresję genu(ów)/operonu(ów), będącego przedmiotem zainteresowania], albo nie zawiera regionu promotora). W tym przypadku korzystne jest, żeby rekombinacja wystąpiła w regionie chromosomu 1000 bp przed genem, będącym przedmiotem zainteresowania.
Alternatywnie, Y może nadawać warunkową aktywność transkrypcyjną, powodującą warunkową ekspresję genu(ów)/operonu(ów), będącego przedmiotem zainteresowania (regulacja w dół). Jest to przydatne w ekspresji cząsteczek, które są toksyczne lub źle znoszone przez gospodarza bakteryjnego.
Większość z białek przedstawionych wyżej stanowią integralne OMP i ich zmienność może być ograniczona tylko do jednej lub paru z ich pętli eksponowanych na powierzchni. Inny aspekt niniejszego wynalazku [sposób g)] obejmuje delecję regionów DNA kodujących te pętle eksponowane na powierzchni, co prowadzi do ekspresji integralnego OMP zawierającego pętle zachowawcze eksponowane na powierzchni. Pętle eksponowane na powierzchni H. influenzae P2 i P5 stanowią korzystne przykłady białek, które można transformować w antygeny reaktywne krzyżowo, stosując taki sposób. Ponownie, rekombinacja homologiczna stanowi korzystny sposób wykonania tego procesu modyfikowania.
Sposób b) - wprowadzanie i modulacja promotorów
W dalszym aspekcie przedmiotem wynalazku jest modyfikowanie skł adu pę cherzyków metodą zmieniania in situ regionu regulatorowego kontrolującego ekspresję genu(ów) i/lub operonu(ów), będącego przedmiotem zainteresowania. Ta zmiana może obejmować częściowe lub całkowite zastąpienie promotora endogennego kontrolującego ekspresję genu, będącego przedmiotem wynalazku, przez gen nadający odmienną aktywność transkrypcyjną. Ta odmienna aktywność transkrypcyjna może być nadawana przez warianty (mutacje punktowe, delecję i/lub insercję) endogennych regionów kontrolnych, przez występujące w naturze lub zmodyfikowane promotory heterologiczne lub przez kombinacje obu z nich. Takie zmiany korzystnie nadadzą aktywność transkrypcyjną silniejszą niż aktywność endogenna (wprowadzenie silnego promotora), powodując zwiększoną ekspresję genu(ów)/operonu(ów), będących przedmiotem zainteresowania (regulację w górę). Taki sposób jest szczególnie przydatny dla wzmagania wytwarzania immunologicznie odpowiednich składników pęcherzyków takich jak białka i lipoproteiny błony zewnętrznej (korzystnie konserwatywnych OMP, zazwyczaj obecnych w pęcherzykach w niskich stężeniach).
Typowe silne promotory, które można wbudować do Neisseria to porA [SEKW. ID. NR: 24], porB [SEKW. ID. NR: 26], IgtF, Opa, p110, 1st i hpuAB. PorA i PorB są korzystne jako konstytutywne, silne promotory. Ustalono (przykład 9), że aktywność promotora PorB jest zawarta we fragmencie odpowiadającym nukleotydom -1 do -250 przed kodonem inicjacji genu porB. W Moraxella korzystne jest stosowanie promotorów ompH, ompG, ompE, OmpBl, ompB2, ompA, OMPCD i Omp106, zaś w H. influenzae korzystne jest wbudowanie promotorów P2, P4, P1, P5 i P6.
Stosując korzystną technologię rekombinacji homologicznej z podwójnym crossing-over do wprowadzenia promotora w regionie 1000 bp przed genem, promotory można umieszczać gdziekol14
PL 211 017 B1 wiek od 30-970 bp przed kodonem inicjacji genu, którego ekspresja ma być regulowana w górę. Chociaż zwyczajowo sądzi się, że dla uzyskania optymalnej ekspresji genu region promotora powinien być względnie blisko otwartej ramki odczytu, twórcy niespodziewanie stwierdzili, że umieszczenie promotora dalej od kodonu inicjacji powoduje duże wzrosty poziomów ekspresji. Tak więc, korzystne jest, jeżeli promotor wstawia się 200-600 bp od kodonu inicjacji genu, korzystniej 300-500 bp, a najkorzystniej w przybliżeniu 400 bp od ATG inicjacji.
Sposób c) - składniki pęcherzyków wytwarzane warunkowo
Ekspresja niektórych genów kodujących pewne składniki pęcherzyków jest starannie regulowana. Wytwarzanie składników jest modulowane warunkowo i zależy od różnych sygnałów metabolicznych i/lub otoczenia. Takie sygnały obejmują, na przykład, ograniczenie przez żelazo, modulację potencjału redox, zmiany pH i temperatury, zmiany substancji odżywczych. Niektóre przykłady składników pęcherzyków, które są wytwarzane warunkowo, obejmują regulowane przez żelazo białka błony zewnętrznej z Neisseiria i Moraxella (na przykład TbpB, LbpB) i indukowalne przez substrat poryny błony zewnętrznej. Obecny wynalazek obejmuje zastosowanie opisanych poprzednio sposobów genetycznych [sposób a) lub b)] do uzyskiwania konstytutywnej ekspresji takich cząsteczek. W ten sposób, wpływ sygnału otoczenia na ekspresję genu(ów), będącego przedmiotem zainteresowania, można przezwyciężyć przez modyfikowanie/zastąpienie odpowiedniego regionu kontrolnego genu, tak że staje się konstytutywnie aktywny (na przykład przez usunięcie części (korzystnie całości) lub represywnej sekwencji kontrolnej - np. regionu operatorowego) lub wstawienie silnego promotora konstytutywnego. Dla genów regulowanych przez żelazo można usunąć operator fur. Alternatywnie, sposób i) można zastosować do wprowadzenia w chromosomie dodatkowej kopii genu/operonu, będącego przedmiotem zainteresowania, który umieszcza się sztucznie pod kontrolą promotora konstytutywnego.
Sposoby d) i e) - detoksykacja LPS
Toksyczność szczepionek pęcherzykowych stanowi jeden z największych problemów przy zastosowaniu pęcherzyków w szczepionkach. W dalszym aspekcie przedmiotem wynalazku są sposoby genetycznej detoksykacji LPS obecnego w pęcherzykach. Lipid A stanowi główny składnik LPS odpowiedzialny za aktywację komórkową. Wiele mutacji w genach uczestniczących w tym szlaku przemian prowadzi do istotnych fenotypów. Jednak, mutacje w genach odpowiedzialnych za końcowe etapy modyfikacji prowadzą do fenotypów wrażliwych na temperaturę (htrB) lub tolerancyjnych (msbB). Mutacje powodujące zmniejszoną (albo brak) ekspresję tych genów powodują zmienioną aktywność toksyczną lipidu A. Zaiste, lipid A nie-lauroilowany (mutant htrB) oraz non-mirystylowany (mutant msbB) są mniej toksyczne niż lipid A typu dzikiego. Mutacje w genie kodującym 4'-kinazę lipidu A (IpxK) także zmniejszają aktywność toksyczną lipidu A.
Zatem, sposób d) obejmuje albo usunięcie części (albo korzystnie całości) jednego lub więcej z powyż szych promotorów lub otwartych ramek odczytu. Alternatywnie, promotory moż na zastą pić słabszymi promotorami. Korzystnie, do wykonania sposobu stosuje się opisane wyżej techniki rekombinacji homologicznej.
W tym celu dodatkowo podano sekwencje htrB i msbB genów z Neisseria meningitidis B, Moraxella catarrhalis i Haemophilus influenzae.
Aktywność toksyczna LPS może także zostać zmieniona przez wprowadzenie mutacji w genach/loci zaangażowanych w oporności na polimyksynę B (taką oporność skorelowano z addycją aminoarabinozy na 4' fosforanie lipidu A). Tymi genami/loci mógłby być pmrE, który koduje dehydrogenazę UDP-glukozową lub region genów odporności na peptydy mikrobójcze wspólny dla wielu pałeczek jelitowych, który może być zaangażowany w syntezę i przenoszenie aminoarabinozy. Gen pmrF, który jest obecny w tym regionie koduje transferazę dolikolo-fosforanowo-mannozylową (Gunn J. S., Kheng, B. L., Krueger J., Kim K., Guo L., Hackett M., Miller S. I., 1998. Mol. Microbiol. 27: 1171-1182).
Mutacje w układzie regulacyjnym PhoP-PhoQ, który stanowi fosfo-przekaźnikowy dwuskładnikowy układ regulacyjny (f. i. fenotyp konstytutywny PhoP, PhoPC) albo warunki niskiej zawartości Mg++ w otoczeniu lub hodowli (które aktywują układ regulacyjny PhoP-PhoQ) prowadzą do addycji aminoarabinozy na 4'-fosforanie i zastąpienia 2-hydroksymirystynianem mirystynianu (hydroksylacji mirystynianu). Ten zmodyfikowany lipid A wykazuje zmniejszoną zdolność stymulowania ekspresji
E-selektyny przez ludzkie endoteliocyty i wydzielania TNF-α z ludzkich monocytów.
Sposób e) obejmuje regulację w górę tych genów przy użyciu strategii jak opisano wyżej (przy czym włącza się silne promotory, do wykonania sposobu korzystnie stosując techniki rekombinacji homologicznej).
PL 211 017 B1
Alternatywnie, zamiast przeprowadzania dowolnej takiej mutacji, jako szczep do wytwarzania szczepionki można zastosować szczep oporny na polimyksynę B (w połączeniu z jednym lub więcej z innych sposobów według wynalazku), gdyż pęcherzyki z takich szczepów także mają zredukowaną toksyczność LPS (na przykład jak pokazano dla meningokoka - van der Ley, P., Hajstra, H. J., Kramer, M., Steeghs, L., Petrov, A. i Poolman, J. T., 1994. W: Proceedings of ninth international pathogenic Neisseria conference. Guildhall, Winchester, Anglia).
Jako dalszą alternatywę (i dalszy aspekt wynalazku) twórcy podają sposób detoksykacji Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego obejmujący etap hodowania szczepu w pożywce wzrostowej zawierającej 0,1 mg - 100 g aminoarabinozy na litr pożywki.
Dla zmniejszenia aktywności toksycznej LPS, w jeszcze dalszej alternatywie, do preparatu pęcherzyków można dodać peptydy syntetyczne, które naśladują aktywność wiązania polimyksyny B (opisaną poniżej) (Rustici, A., Velucchi, M., Faggioni, R., Sironi, M., Ghezzi, P., Quataert, S., Green, B. i Porro M., 1993. Science 259: 361-365; Velucchi, M., Rustici, A., Meazza, C., Villa, P., Ghezzi, P. I Porro, M., 1997. J. Endotox. Res. 4).
Sposób f) - kotwiczenie białek homologicznych lub heterologicznych do pęcherzyków błony zewnętrznej przy zmniejszeniu toksyczności LPS
Dalszy aspekt niniejszego wynalazku obejmuje zastosowanie sekwencji genetycznych kodujących peptydy polimyksyny B (lub ich analogi) jako środka do kierowania białek fuzyjnych do błony zewnętrznej. Polimyksyna B stanowi cykliczny peptyd złożony z aminokwasów nie kodowanych przez tRNA (wytwarzany przez Gram-dodatnie bakterie promieniowate), który wiąże się bardzo mocno do części lipidu A lipopolisacharydu (LPS) obecnego w błonie zewnętrznej. To wiązanie zmniejsza toksyczność własną LPS (aktywność endotoksyny). Opracowano peptydy naśladujące strukturę polimyksyny B i złożone z aminokwasów kanonicznych (kodowanych przez tRNA), które także wiążą lipid A z silnym powinowactwem. Te peptydy zastosowano do detoksykacji LPS. Jeden z tych peptydów znany jako SAEP-2 (N-koniec-Lys-Thr-Lys-Cys-Lys-Phe-Leu-Lys-Lys-Cys-C-koniec) okazał się bardzo obiecujący pod tym względem (Molecular Mapping and detoxifying of the Lipid A binding site by syntetyczn peptides (1993). Rustici, A., Velucchi, M., Faggioni, R., Sironi, M., Ghezzi, P., Quataert, S., Green, B. i M. Porro. Science 259, 361-365).
Obecny sposób f) według wynalazku stanowi ulepszenie tego zastosowania. Stwierdzono, że zastosowanie sekwencji DNA kodującej peptyd SEAP-2 (lub jego pochodne), połączonej genetycznie z genem, będ ącym przedmiotem zainteresowania (kodującym na przykład antygen limfocytu T lub antygen ochronny, który zazwyczaj wydzielany jest jako toksyna albo białko cytosolowe lub okołoplazmatyczne) stanowi środek do kierowania odpowiedniego białka rekombinacyjnego do błony zewnętrznej korzystnego gospodarza bakteryjnego (przy jednoczesnym zmniejszeniu toksyczności LPS).
Ten układ jest przydatny dla białek labilnych, które nie mogłyby być eksponowane bezpośrednio na zewnątrz pęcherzyka. Pęcherzyki mogłyby więc działać jako nośnik do dostarczania, który mógłby wystawiać białko układowi odpornościowemu po otoczeniu pęcherzyków przez limfocyty T. Alternatywnie, fuzja genetyczna powinna także obejmować peptyd sygnałowy lub domenę przezbłonową, tak żeby białko rekombinacyjne mogło przebyć błonę zewnętrzną dla wystawienia układowi odpornościowemu gospodarza.
Ta strategia kierowania mogłaby być szczególnie interesująca w przypadku genów kodujących białka, które normalnie nie są kierowane do błony zewnętrznej. Ta metodologia umożliwia także wyizolowanie pęcherzyków rekombinacyjnych wzbogaconych w białko, będące przedmiotem zainteresowania. Korzystnie, taki peptydowy sygnał kierujący umożliwia wzbogacenie pęcherzyków błony zewnętrznej w jedno lub kilka białek, będących przedmiotem zainteresowania, które w naturze nie są spotykane w takiej danej lokalizacji subkomórkowej. Nie wyczerpująca lista bakterii, które można zastosować jako biorcę takich preparatów pęcherzyków rekombinacyjnych, obejmuje Neisseria meningitidis, Neisseiria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis i Chlamydia pneumoniae.
Chociaż korzystnie, gen dla konstruktu jest zmodyfikowany w chromosomie bakterii [przy użyciu sposobu i)], to w alternatywnym korzystnym wykonaniu białka rekombinacyjne znaczone SAEP-2 wytwarza się niezależnie i przyłącza do preparatu pęcherzyków na etapie późniejszym.
Dalsze wykonanie wynalazku to zastosowanie takich konstruktów w sposobie oczyszczania białka. W ogólności, układ mógłby zostać użyty jako część układu ekspresyjnego do wytwarzania białek rekombinacyjnych. Etykietę peptydową SAEP-2 można zastosować do opartego na powinowac16
PL 211 017 B1 twie oczyszczania białka, do którego jest ona przyłączona, stosując kolumnę zawierającą unieruchomione cząsteczki lipidu A.
Sposób h) - polisacharydy reaktywne krzyżowo
Izolowanie bakteryjnych pęcherzyków błony zewnętrznej z zamkniętych w otoczce bakterii
Gram-ujemnych często powoduje współoczyszczanie polisacharydu otoczki. W niektórych przypadkach ten materiał „zanieczyszczający” może okazać się przydatny, gdyż polisacharyd może zwiększać odpowiedź odpornościową wywoływaną przez inne składniki pęcherzyków.
Jednak, w innych przypadkach obecność zanieczyszczającego materiału polisacharydowego w preparatach pęcherzyków bakteryjnych moż e okazać się szkodliwa dla stosowania pęcherzyków w szczepionce. Na przykład, co najmniej w przypadku N. meningitidis wykazano, że polisacharyd otoczki grupy surowiczej B nie nadaje odporności ochronnej i jest skłonny do indukowania u ludzi szkodliwej odpowiedzi autoimmunologicznej. Wskutek tego, sposób h) według wynalazku stanowi modyfikowanie szczepu bakteryjnego do wytwarzania pęcherzyków taki, żeby był wolny od polisacharydu otoczki. Wtedy pęcherzyki będą przydatne do stosowania u ludzi. Szczególnie korzystny przykład takiego preparatu pęcherzyków stanowi preparat z N. meningitidis grupy surowiczej B pozbawionej polisacharydu otoczki.
Można to osiągnąć stosując zmodyfikowane szczepy wytwarzające pęcherzyki, w których geny niezbędne dla biosyntezy i/lub eksportu otoczki zostały uszkodzone. Inaktywację genu kodującego biosyntezę lub eksport polisacharydów otoczki można osiągnąć przez mutowanie (mutację punktową, delecję lub insercję) regionu kontrolnego, regionu kodującego lub obu z nich (korzystnie stosując opisane wyżej techniki rekombinacji homologicznej). Ponadto, inaktywację genów biosyntezy otoczki można także osiągnąć przez nadekspresję antysensowną lub mutagenezę transpozonową. Korzystny sposób stanowi delecja niektórych lub wszystkich spośród genów cps z Neisseria meningitidis wymaganych dla biosyntezy i eksportu polisacharydu. W tym celu, można zastosować plazmid zastępczy pMF121 (opisany przez Frosha i in., 1990, Mol. Microbiol. 4: 1215-1218) do uzyskania mutacji delecyjnej grupy genów cpsCAD (+galE). Alternatywnie, można usunąć gen siaD lub jego ekspresję regulować w dół (meningokokowy gen siaD koduje alfa-2,3-sialilotransferazę, enzym wymagany do syntezy polisacharydów otoczki i LOS). Takie mutacje mogą także usuwać podobne do gospodarza struktury części sacharydowej LPS bakterii.
Sposób i) - wprowadzanie jednej lub więcej dalszych kopii genu i/lub operonu do chromosomu gospodarza lub wprowadzanie genu, i/lub operonu heterologicznego do chromosomu gospodarza
Skuteczną strategię modulowania składu preparatu pęcherzyków stanowi wprowadzenie jednej lub więcej kopii segmentu DNA zawierającego kasetę ekspresyjną do genomu bakterii Gram-ujemnej. Nie wyczerpująca lista korzystnych gatunków bakteryjnych, które można zastosować jako biorcę dla takiej kasety obejmuje Neisseria meningitidis, Neisseiria gonorrhoeae, Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae. Gen(y) zawarty w kasecie ekspresyjnej może być homologiczny (lub endogenny) (tj. w naturze istnieje w genomie bakterii, którą się manipuluje) lub heterologiczny (tj. w naturze nie istnieje w genomie bakterii, którą się manipuluje). Ponownie wprowadzona kaseta ekspresyjna może składać się z niezmodyfikowanych, „naturalnych” sekwencji promotorów/genów/operonów lub ze zmodyfikowanych kaset ekspresyjnych, w których region promotora i/lub region kodujący lub oba z nich zostały zmienione. Nie wyczerpująca lista korzystnych promotorów, które można stosować do ekspresji, obejmuje promotory porA, porB, IbpB, tbpB, p110, 1st, hpuAB z N. meningitidis lub N. gonorroheae, promotory p2, p5, p4, ompF, pl, ompH, p6, hin47 z H. influenzae, promotory ompH, ompG, ompCD, ompE, ompB1, ompB2, ompA z M. catarrhalis, promotor λpL, lac, tac, araB z Escherichia coli lub promotory rozpoznawane swoiście przez polimerazę RNA bakteriofaga, takiego jak bakteriofag T7 E. coli. Nie wyczerpująca lista korzystnych genów, które mogą być wyrażane w takim układzie, obejmuje NspA, Omp85, PilQ, kompleks TbpA/B, Hsf, PldA, HasR z Neisseria; MOMP, HMWP; Moraxella OMP106, HasR, PilQ, OMP85,
PldA z Chlamydia; FHA, PRN, PT z Bordetella pertussis.
W korzystnym wykonaniu wynalazku kasetę ekspresyjną wprowadza się i wbudowuje w chromosom bakteryjny przy pomocy rekombinacji homologicznej i/lub specyficznej dla miejsca. Wektorami integracyjnymi stosowanymi do wprowadzania takich genów i/lub operonów mogą być warunkowo rekatywne lub samobójcze plazmidy, bakteriofagi, transpozony lub liniowe fragmenty DNA otrzymane metodą hydrolizy restrykcyjnej lub amplifikacji PCR. Integracja jest korzystnie ukierunkowana na regiony chromosomu zbędne dla wzrostu in vitro. Nie wyczerpująca lista korzystnych loci, które można zastosować do ukierunkowania integracji DNA, obejmuje geny porA, porB, opa, opc, rmp, omp26,
PL 211 017 B1 lecA, cps, IgtB z Neisseiria meningitidis i Neisseria gonorrhoeae, geny P1, P5, hmw1/2, IgA-proteaza, fimE z NTHi; geny lecA1, lecA2, omp106, uspA1, uspA2 z Moraxella catarrhalis. Alternatywnie, kasetę ekspresyjną stosowaną do modulowania ekspresji składników pęcherzyków można dostarczyć do wybranej bakterii przy pomocy wektorów episomalnych takich jak kołowe/liniowe plazmidy replikatywne, kosmidy, phasmidy, bakteriofagi lizogeniczne lub sztuczne chromosomy bakteryjne. Rekombinację można wybrać przy pomocy wybieralnego markera genetycznego takiego jak geny nadające oporność na antybiotyki (na przykład kanamycynę, erytromycynę, chloramfenikol lub gentamycynę), geny nadające oporność na metale ciężkie i/lub związki toksyczne lub geny uzupełniające mutacje auksotrofowe (na przykład pur, leu, met, aro).
Geny heterologiczne - ekspresja obcych białek w pęcherzykach błony zewnętrznej
Pęcherzyki bakteryjne błony zewnętrznej stanowią bardzo atrakcyjny układ do wytwarzania, izolowania i dostarczania białek rekombinacyjnych do zastosowań do szczepienia, terapeutycznego i/lub diagnostycznego. Dalszy aspekt niniejszego wynalazku odnosi się do ekspresji, wytwarzania i kierowania obcych białek heterologicznych do błony zewnętrznej, oraz zastosowania bakterii do wytwarzania pęcherzyków rekombinacyjnych.
Korzystny sposób osiągnięcia tego obejmuje etapy: wprowadzenia genu heterologicznego, ewentualnie kontrolowanego przez sekwencję silnego promotora, do chromosomu szczepu Gram-ujemnego metodą rekombinacji homologicznej. Z otrzymanego zmodyfikowanego szczepu mogą być wytworzone pęcherzyki.
Niewyczerpująca lista bakterii, które można zastosować jako biorcę do wytwarzania pęcherzyków rekombinacyjnych, obejmuje Neisseria meningitidis, Neisseiria gonorrhoeae Moraxella catarrhalis, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae. Gen wyrażany w takim układzie może być pochodzenia wirusowego, bakteryjnego, grzybowego, pasożytowego lub wyższego eukariotycznego.
Korzystne zastosowanie wynalazku obejmuje sposób ekspresji białek błony zewnętrznej Moraxella, Haemophilus i/lub Pseudomonas (integralnych, politopowych i/lub lipoprotein) w pęcherzykach rekombinacyjnych Neisseria meningitidis. Korzystne miejsca integracji są podane wyżej, a korzystnie wprowadzane geny to te, które dają ochronę przeciwko bakterii, z której zostały wydzielone. Korzystne geny ochronne dla każdej bakterii są opisane poniżej.
Dalsze korzystne zastosowania to: pęcherzyki wytworzone ze zmodyfikowanego szczepu Haemophilus influenzae, gdzie gen heterologiczny stanowi ochronne OMP z Moraxella catarrhalis; oraz pęcherzyki wytworzone ze zmodyfikowanego szczepu Moraxella catarrhalis, gdzie gen heterologiczny stanowi ochronne OMP z Haemophilus influenzae (korzystne miejsca wstawienia genów są podane wyżej, a korzystne antygeny ochronne są opisane poniżej).
Szczególnie korzystne jest zastosowanie tego aspektu w dziedzinie profilaktyki lub leczenia chorób przenoszonych drogą płciową (STD, sexually-transmitted diseaseses). Lekarzom praktykującym często trudno jest określić, czy główną przyczyną STD jest infekcja gonokokiem, czy Chlamydia trachomatis. Te dwa organizmy stanowią główne przyczyny zapalenia jajowodu - choroby, która może doprowadzić do bezpłodności nosiciela. Byłoby więc przydatne, gdyby można było szczepić przeciwko STD lub leczyć szczepionką kombinacyjną skuteczną przeciwko chorobie powodowanej przez oba organizmy. Wykazano, że główne białko błony zewnętrznej (MOMP, Major Outer Membrane Protein) z C. trachomatis jest celem przeciwciał ochronnych. Jednak, dla indukowania takich przeciwciał ważna jest integralność strukturalna tego integralnego białka błonowego. Ponadto, epitopy rozpoznawane przez te przeciwciała są zmienne i określają ponad 10 odmian serologicznych. Poprzednio opisany aspekt niniejszego wynalazku umożliwia właściwe fałdowanie jednego lub więcej białek błonowych w preparacie pęcherzyków błony zewnętrznej. Zmodyfikowanie szczepu gonokokowego wyrażającego wiele MOMP odmian serologicznych C. trachomatis w błonie zewnętrznej i wytwarzanie z niego pęcherzyków, daje pojedyncze rozwiązanie wielu problemów prawidłowego składania białek błonowych, prezentacji dostatecznej ilości MOMP odmian serologicznych dla ochrony przeciwko szerokiemu spektrum odmian serologicznych i równoczesnej profilaktyki/leczenia infekcji gonokokowej (a dzięki temu na początku brak wymagania od lekarzy prowadzących decyzji, który organizm powoduje poszczególne objawy kliniczne - można szczepić równocześnie przeciwko obu organizmom, umożliwiając tak leczenie STD na bardzo wczesnym etapie). Korzystne miejsca wstawienia genów w chromosomie gonokokowym są podane wyżej. Inne korzystne, ochronne geny C. trachomatis, które można wcielić, to HMWP, PmpG oraz OMP ujawnione w WO 99/28475.
PL 211 017 B1
Kierowanie białek heterologicznych do pęcherzyków błony zewnętrznej
Ekspresja niektórych białek heterologicznych w pęcherzykach bakteryjnych może wymagać dodania sygnału(ów) kierującego do błony zewnętrznej. Korzystny sposób rozwiązania tego problemu polega na stworzeniu połączenia genetycznego między genem heterologicznym i genem kodującym rezydentne OMP, jako specyficznego podejścia do kierowania białek rekombinacyjnych do pęcherzyków. Najkorzystniej, gen heterologiczny jest połączony z sekwencjami peptydów sygnałowych takiego OMP.
Preparaty pęcherzyków dwoinkowych
Zgodnie z wynalazkiem u meningokoków (w szczególności u N. meningitidis B) gen PorA jest regulowany w dół w sposobie a).
Jeden lub więcej z następujących genów (kodujących antygeny ochronne) jest korzystny dla regulacji w górę sposobami b) i/lub i) wykonywanymi na szczepie dwoinkowym, włącznie z gonokokiem i meningokokiem (szczególnie N. meningitidis B): NspA (WO 96/29412), podobny do Hsf (WO 99/31132), Hap (PCT/EP99/02766), PorA, PorB, OMP85 (WO 00/23595), PilQ (PCT/EP99/03603), PldA (PCT/EP99/06718), FrpB (WO 96/31618), TbpA (US 5 912 336), TbpB, FrpA/FrpC (WO 92/01460), LbpA/LbpB (PCT/EP98/05117), FhaB (WO 98/02547), HasR (PCT/EP99/05989), lipo02 (PCT/EP99/08315), Tbp2 (WO 99/57280), MltA (WO 99/57280) i ctrA (PCT/EPOO/00135). Są one także korzystne jako geny, które można wprowadzać heterologicznie do innych bakterii Gram-ujemnych.
Dla regulacji w dół sposobem d) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: htrB, msbB i IpxK.
Dla regulacji w górę sposobem e) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
Korzystne sekwencje kontrolne represyjne dla sposobu c) to: region operatora fur (szczególnie dla jednego lub obu z genów TbpB i LbpB); i region operatora DtxR.
Dla regulacji w dół sposobem h) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, CtrA, ctrB, ctrC, i ctrD.
Preparaty pęcherzyków Pseudomonas aeruginosa
Dla regulacji w górę sposobami b) i/lub i) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów (kodujących antygeny ochronne): PcrV, OprF, OprI. Są one także korzystne jako geny, które można wprowadzać heterologicznie do innych bakterii Gram-ujemnych.
Preparaty pęcherzyków Moraxella catarrhalis
Zgodnie z wynalazkiem jeden lub więcej z następujących genów jest regulowanych w dół w sposobie a): CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA i LbpB.
Dla regulacji w górę sposobami b) i/lub i) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów (kodujących antygeny ochronne): OMP106 (WO 97/41731 i WO 96/34960), HasR (PCT/EP99/03824), PilQ (PCT/EP99/03823), OMP85 (PCT/EPOO/01468), lipo06 (GB 9917977,2), lipo10 (GB 9918208,1), lipo11 (GB 9918302,2), lipo18 (GB 9918038,2), P6 (PCT/EP99/03038), ompCD, CopB (Helminen M. E. i in. (1993) Infect. Immun. 61: 2003-2010), D15 (PCT/EP99/03822), OmplA1 (PCT/EP99/06781), Hly3 (PCT/EP99/03257), LbpA i LbpB (WO 98/55606), TbpA i TbpB (WO 97/13785 i WO 97/32980), OmpE, UspA1 i UspA2 (WO 93/03761) i Omp21. Są one także korzystne jako geny, które można wprowadzać heterologicznie do innych bakterii Gram-ujemnych.
Dla regulacji w dół sposobem d) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: htrB, msbB i IpxK.
Dla regulacji w górę sposobem e) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
Preparaty pęcherzyków Haemophilus influenzae
Zgodnie z wynalazkiem jeden lub więcej z następujących genów jest regulowanych w dół w sposobie a): P2, P5, Hif, proteazy IgA1, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA i TbpB.
Dla regulacji w górę sposobami b) i/lub i) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów (kodujących antygeny ochronne): D15 (WO 94/12641), P6 (EP 281673), TbpA, TbpB, P2, P5 (WO 94/26304), OMP26 (WO 97/01638), HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 i Hif (regulacji w górę powinny zostać poddane wszystkie geny w tym operonie, w celu regulacji w górę piliny). Są one także korzystne jako geny, które można wprowadzać heterologicznie do innych bakterii Gram-ujemnych.
Dla regulacji w dół sposobem d) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: htrB, msbB i IpxK.
PL 211 017 B1
Dla regulacji w górę sposobem e) korzystny jest jeden lub więcej z następujących genów: pmrA, pmrB, pmrE, i pmrF.
Preparaty szczepionek
Korzystne wykonanie wynalazku stanowi przygotowanie preparatów pęcherzyków według wynalazku w szczepionce, która może także zawierać farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę.
Wytwarzanie preparatów pęcherzyków z dowolnych spośród wyżej wymienionych zmodyfikowanych szczepów można osiągnąć dowolnym ze sposobów znanych specjaliście. Korzystnie, stosuje się sposoby ujawnione w EP 301 992, US 5 597 572, EP 11 243 lub US 4 271 147. Najkorzystniej, stosuje się sposób opisany w przykładzie 8.
Wytwarzanie szczepionek jest ogólnie opisane w Vaccine Design („The subunit and adjuvant approach” (red. Powell M. F. i Newman M. J.) (1995) Plenum Press New York).
Preparaty pęcherzyków według niniejszego wynalazku można uzupełnić adiuwantami w preparacie szczepionki według wynalazku. Przydatnym adiuwantem może być sól glinum taka jak żel wodorotlenku glinu (ałun) lub fosforan glinu, ale może także być sól wapnia (szczególnie węglan wapnia), żelaza lub cynku, albo może być nierozpuszczalna zawiesina acylowanej tyrozyny lub acylowanych cukrów, kationowe lub anionowe upochodnionych polisacharydów, lub polifosfazenów.
Przydatne układy adiuwantów Thl, które mogą być stosowane, obejmują monofosforylo-lipid A, szczególnie 3-de-O-acylowany monofosforylo-lipid A oraz kombinację monofosforylo-lipidu A, korzystnie 3-de-O-acylowanego monofosforylo-lipidu A (3D-MPL) razem z solą glinu. Układ ulepszony obejmuje połączenie monofosforylo-lipidu A i pochodnej saponiny, zwłaszcza kombinację QS21 i 3D-MPL, jak ujawniono w WO 94/00153 lub wywołującą mniejszy odczyn kompozycję, gdzie QS21 jest stłumiony cholesterolem, jak ujawniono w WO 96/33739. Szczególnie mocny preparat adiuwantu obejmujący QS21 3D-MPL i tokoferol w emulsji olej-w-wodzie jest opisany w WO95/17210 i stanowi preparat korzystny.
Szczepionka może zawierać saponinę, korzystniej QS21. Może ona także zawierać emulsję olej-w-wodzie i tokoferol. Oligonukleotydy zawierające niezmetylowaną CpG (WO 96/02555) stanowią także preferencyjne induktory odpowiedzi THl i są przydatne do stosowania w niniejszym wynalazku.
Preparat szczepionki według niniejszego wynalazku może być stosowany do ochrony lub leczenia ssaka podatnego na infekcję, przy pomocy podawania wspomnianej szczepionki drogą układową systemową lub śluzową. Podawanie może obejmować wstrzyknięcie drogą domięśniową, dootrzewnową, śródskórną lub podskórną; albo drogą podawania śluzowego do układu pokarmowego, oddechowego, moczowo-płciowego. Zatem, w jednym aspekcie przedmiotem niniejszego wynalazku jest sposób immunizowania człowieka jako gospodarza przeciwko chorobie wywołanej przez infekcję bakteriami Gram-ujemnymi, który obejmuje podawanie gospodarzowi immunoochronnej dawki preparatu pęcherzyków według niniejszego wynalazku.
Ilość antygenu w każdej dawce szczepionki jest wybierana jako ilość, która indukuje odpowiedź immunoochronną bez znaczących, szkodliwych efektów ubocznych u typowych osób szczepionych.
Taka ilość będzie zmieniać się zależnie od tego, który konkretny immunogen jest wykorzystywany i jak jest prezentowany. Ogólnie, oczekuje się, że każda dawka będzie obejmować 1-100 μg antygenu białkowego, korzystnie 5-50 μg, a najbardziej typowo w zakresie 5-25 μg.
Optymalną ilość poszczególnej szczepionki można ustalić przez normalne badania obejmujące obserwację u leczonych właściwych odpowiedzi odpornościowych. Po początkowym szczepieniu, leczeni w odpowiednich odstępach mogą otrzymywać jedną lub kilka immunizacji przyspieszających.
Szczepionki z otoczek bakteryjnych lub z zabitych całych komórek
Twórcy przewidują, że powyższe ulepszenia preparatów i szczepionek pęcherzykowych można łatwo rozciągnąć na preparaty i szczepionki z otoczek bakteryjnych (tzw. komórek duchów) lub z zabitych całych komórek (przy identycznych korzyściach). Zmodyfikowane szczepy Gram-ujemne według wynalazku, z których wytwarza się preparaty pęcherzyków, można także stosować do wytwarzania preparatów z otoczek bakteryjnych i zabitych całych komórek. Sposoby wytwarzania preparatów z otoczek bakteryjnych (pustych komórek z nietkniętymi otoczkami) ze szczepów Gram-ujemnych są znane w stanie techniki (patrz na przykład WO 92/01791). Sposoby zabijania całych komórek dla wytworzenia inaktywowanych preparatów komórkowych do stosowania w szczepionkach są także znane. Określenia „preparaty pęcherzyków” i „szczepionki pęcherzykowe”, jak również sposoby opisane w niniejszym dokumencie można zatem dla celów niniejszego wynalazku odnosić do określeń, odpowiednio, „preparat z otoczek bakteryjnych” i „szczepionka z otoczek bakteryjnych” oraz „preparat z zabitych całych komórek” i „szczepionka z zabitych całych komórek”.
PL 211 017 B1
Kombinacje sposobów a) - i)
Można docenić, że jeden lub więcej z powyższych sposobów można zastosować do wytworzenia szczepu zmodyfikowanego, z którego wytwarza się ulepszone preparaty pęcherzyków według wynalazku. W celu wytworzenia szczepionki pęcherzykowej korzystnie stosuje się jeden taki sposób, a korzystniej stosuje się dwa lub więcej (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 lub 9) sposobów. W miarę, jak do wytwarzania szczepionki pęcherzykowej stosuje się każdy dodatkowy sposób, każde ulepszenie działa w połączeniu z innymi stosowanymi sposobami dla uzyskania zoptymalizowanego zmodyfikowanego preparatu pęcherzyków.
Korzystny sposób wytwarzania pęcherzyków meningokokowych (szczególnie N. meningitidis B) obejmuje zastosowanie sposobów a), b), d) i/lub e) i h). Takie preparaty pęcherzyków są bezpieczne (nie ma struktur podobnych do struktur gospodarza), nietoksyczne i mają taką strukturę, że odpowiedź odpornościowa gospodarza będzie skupiona na wysokich poziomach antygenów ochronnych (i korzystnie konserwatywnych). Wszystkie powyższe elementy działają razem dla wytworzenia zoptymalizowanej szczepionki pęcherzykowej.
Podobnie dla M. catarrhalis i atypowych H. influenzae, korzystne sposoby wytwarzania pęcherzyków obejmują zastosowanie sposobów a), b), id) i/lub e).
Dalszy aspekt wynalazku stanowi więc immunoochronna i nietoksyczna Gram-ujemna szczepionka pęcherzykowa, z otoczek bakteryjnych, lub z zabitych całych komórek, przydatna do zastosowań pediatrycznych.
Przez zastosowanie pediatryczne rozumie się zastosowanie u dzieci młodszych niż czteroletnie.
Przez działanie immunoochronne rozumie się, że co najmniej 40% (a korzystnie 50, 60, 70, 80, 90 i 100%) dzieci młodszych przechodzi serokonwersję (4-krotny wzrost aktywności bakteriobójczej [rozcieńczenia surowic odpornościowych, przy którym 50% bakterii umiera - patrz na przykład PCT/EP98/05117]) przeciwko zbiorowi szczepów heterologicznych do wybrania z głównych znanych grup klonalnych. Dla meningokoka B te szczepy powinny mieć PorA typu różnego od szczepu wytwarzającego pęccherzyki i powinny korzystnie stanowić 2, 3, 4, albo najkorzystniej wszystkie 5 spośród szczepów H44/76, M97/252078, BZ10, NGP165 i CU385. Dla atypowych H. influenzae, szczepami powinny korzystnie być 2, 3, 4 albo najkorzystniej wszystkie 5 spośród szczepów 3224A, 3219C, 3241A, 640645 i A840177. Dla M. catarrhalis, szczepami powinny korzystnie być 2, 3, 4 albo najkorzystniej wszystkie 5 spośród szczepów ATCC 43617, 14, 358, 216 i 2926.
Przez określenie nietoksyczny rozumie się, że istnieje znaczący (2-4 krotny, korzystnie 10 krotny) spadek aktywności endotoksyny zmierzonej znanymi testami LAL i pirogenności.
Kombinacje szczepionek
Dalszy aspekt wynalazku stanowią kombinacje szczepionek zawierające preparaty pęcherzyków według wynalazku z innymi antygenami, które korzystnie stosuje się przeciwko pewnym stanom chorobowym. Stwierdzono, że pęcherzyki są szczególnie przydatne do tworzenia preparatów z innymi antygenami, jako że korzystnie mają działanie adiuwantu na antygeny, z którymi są zmieszane.
W jednej z korzystnych kombinacji, preparaty pęcherzyków meningokoka B według wynalazku przygotowuje się z 1, 2, 3 lub korzystnie wszystkimi 4 z następujących meningokokowych polisacharydów otoczki, które mogą być zwykłe lub sprzężone z nośnikiem białkowym: A, C, Y lub W. Taką szczepionkę można korzystnie zastosować jako globalną szczepionkę meningokokową. Zamiast stosowania preparatów pęcherzyków meningokoka B według wynalazku, przewiduje się także, że preparat powinien alternatywnie zawierać preparaty pęcherzyków meningokoka B typu dzikiego wraz z 2 lub więcej (korzystnie kilkoma) szczepami należącymi do kilku podtypów/serotypów (na przykład wybranymi spośród P1.15, P1.7,16, P1.4 i P1.2).
W dalszym korzystnym wykonaniu, preparaty pęcherzyków meningokoka B według wynalazku [lub wspomnianą wyżej mieszankę 2 lub więcej preparatów pęcherzyków meningokoka B typu dzikiego], korzystnie przygotowanych z 1, 2, 3 lub wszystkimi 4 spośród zwykłych lub sprzężonych polisacharydów otoczki meningokokowej A, C, Y lub W, przygotowuje się ze sprzężonym polisacharydem otoczki H. influenzae b oraz jednym lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki. Ewentualnie, szczepionka może także zawierać jeden lub więcej antygenów białek, które mogą chronić gospodarza przed infekcją Streptococcus pneumoniae. Taką szczepionkę można korzystnie zastosować jako globalną szczepionkę meningokokową.
Pneumokokowe antygeny polisacharydów otoczki są korzystnie wybrane z serotypów 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F i 33F (najkorzystniej z serotypów 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F i 23F).
PL 211 017 B1
Korzystnymi antygenami białek pneumokokowych są te białka pneumokokowe, które są eksponowane na zewnętrznej powierzchni pneumokoka (możliwe do rozpoznania przez układ odpornościowy gospodarza podczas co najmniej części cyklu życiowego pneumokoka), albo białka, które są wydzielane lub uwalniane przez pneumokoka. Najkorzystniej, białko stanowi toksyna, adhezyna, 2-składnikowy przekaźnik sygnału lub lipoproteina Streptococcus pneumoniae albo ich fragmenty. Szczególnie korzystne białka obejmują, ale bez ograniczania do tego: pneumolizynę (korzystnie detoksykowaną przez działanie chemiczne lub mutację) [Mitchell i in. Nucleic Acids Res. 11 lipca 1990; 18 (13): 4010 „Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2”, Mitchell i in. Biochim Biophys Acta, 23 stycznia 1989; 1007 (1): 67-72 „Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli: rapid purification and biological properties”, WO 96/05859 (A. Cyanamid), WO 90/06951 (Paton i in.), WO 99/03884 (NAVA)]; PspA i jego przezbłonowe warianty delecyjne (US nr 5 804 193 - Briles i in.); PspC i jego przezbłonowe warianty delecyjne (WO 97/09994 - Briles i in.); PsaA i jego przezbłonowe warianty delecyjne (Berry & Paton, Infect Iiranun 1996 Dec; 64 (12): 5255-62 „Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae”); białka pneumokokowe wiążące cholinę i ich przezbłonowe warianty delecyjne; CbpA i jego przezbłonowe warianty delecyjne (WO 97/41151; WO 99/51266); dehydrogenazę gliceraldehydo-3-fosforanową (Infect. Immun. 1996 64: 3544); HSP70 (WO 96/40928); PcpA (Sanchez-Beato i in. FEMS Microbiol. Lett. 1998, 164: 207-14); białko podobne do M, zgłoszenie patentowe SB nr EP 0 837 130; oraz adhezynę 18627, zgłoszenie patentowe SB nr EP 0 834 568. Dalsze korzystne białkowe antygeny pneumokokowe to te, które ujawniono w WO 98/18931, zwłaszcza wybrane w WO 98/18930 i PCT/US99/30390.
W dalszym korzystnym wykonaniu, preparaty pęcherzyków Moraxella catarrhalis według wynalazku przygotowuje się z jednego lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki oraz jednego lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed infekcją atypowymi H. influenzae. Ewentualnie, szczepionka może także zawierać jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przed infekcją Streptococcus pneumoniae. Szczepionka może także ewentualnie zawierać jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy. Taką szczepionkę można korzystnie zastosować jako globalną szczepionkę zapalenia ucha środkowego.
Korzystne atypowe antygeny białkowe H. influenzae obejmują białko fimbrynę (US nr 5 766 608) i białka fuzyjne obejmujące ich peptydy (np. LBl Fusion) (US nr 5 843 464 - Ohio State Research Foundation), OMP26, P6, białko D, TbpA, TbpB, Hia, Hmw1, Hmw2, Hap i Di5.
Korzystne antygeny wirusa grypy obejmują całego, żywego lub inaktywowanego wirusa, rozciętego wirusa grypy, hodowanego w jajkach lub komórkach MDCK albo komórkach Vero lub całe wirosomy grypy (jak opisał R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) albo ich białka oczyszczone lub rekombinacyjne, takie jak białka HA, NP, NA lub M, lub ich kombinacje.
Korzystne antygeny RSV (wirusa oskrzelowego, Respiratory Syncytial Virus) obejmują glikoproteinę F, glikoproteinę G, białko HN lub ich pochodne.
W jeszcze dalszym korzystnym wykonaniu, preparaty pęcherzyków atypowych H. influenzae według wynalazku przygotowuje się z jednego lub więcej zwykłych lub sprzężonych pneumokokowych polisacharydów otoczki i jednego lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed infekcją M. catarrhalis. Ewentualnie, szczepionka może także zawierać jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przed infekcją Streptococcus pneumoniae. Szczepionka może także ewentualnie zawierać jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy. Taką szczepionkę można korzystnie zastosować jako globalną szczepionkę zapalenia ucha środkowego.
Sekwencje nukleotydów
Niniejszym opisano sekwencje nukleotydów, które można stosować w sposobach według wynalazku. Podano specyficzne regiony przed rozmaitymi genami z rozmaitych szczepów, które można stosować, na przykład w sposobach a), b), d) i h). Ponadto, podano regiony kodujące dla wykonania sposobu d).
Ogólny sposób analizy niekodującego regionu oskrzydlającego gen bakteryjny i jej wyzyskanie do modulowanej ekspresji genu w pęcherzykach.
Niekodujące regiony oskrzydlające konkretny gen zawierają elementy regulatorowe ważne przy ekspresji genu. Ta regulacja ma miejsce zarówno na poziomie transkrypcyjnym, jak i translacyjnym. Sekwencję tych regionów albo przed, albo za otwartą ramką odczytu genu, można otrzymać przez
PL 211 017 B1 sekwencjonowanie DNA. Te informacje o sekwencji umożliwiają określenie potencjalnych motywów regulatorowych takich jak różne elementy promotorowe, sekwencje terminatorowe, elementy sekwencji indukowalnych, represory, elementy odpowiedzialne za zmianę fazy, sekwencja Shine-Dalgarno, regiony o potencjalnej strukturze drugorzędowej zaangażowanej w regulację, jak również inne typy motywów lub sekwencji regulatorowych.
Te informacje o sekwencji umożliwiają modulację naturalnej ekspresji genu, będącego przedmiotem zainteresowania. Regulację w górę ekspresji genu można zrealizować przez zmianę promotora, sekwencji Shine-Dalgarno, potencjalnych elementów represorowych lub operatorowych, lub dowolnych innych zaangażowanych elementów. Podobnie, regulację w dół ekspresji można osiągnąć przez podobne typy modyfikacji. Alternatywnie, zmieniając sekwencje ze zmianą fazy, ekspresję genu można umieścić pod kontrolą zmiany fazy, albo można odsprzęgnąć od tej regulacji. W innym podejściu, ekspresję genu można umieścić pod kontrolą jednego lub więcej indukowalnych elementów umożliwiających regulowaną ekspresję.
Przykłady takiej regulacji obejmują, ale bez ograniczania do tego, indukcję przez przesunięcie temperaturowe, dodanie substratów induktorowych, jak wybrane węglowodany lub ich pochodne, pierwiastki śladowe, witaminy, kofaktory, jony metali, itp.
Takie modyfikacje, jak opisano wyżej, można wprowadzić kilkoma różnymi sposobami. Modyfikację sekwencji zaangażowanych w ekspresji genów można wykonać in vivo przez mutagenezę losową, a następnie wybór pożądanego fenotypu. Inne podejście polega na izolowaniu regionu, będącego przedmiotem zainteresowania, i modyfikowaniu go przez mutagenezę losową, lub ukierunkowaną na dane miejsce mutagenezę zastąpienia, insercji lub delecji. Zmodyfikowany region można następnie ponownie wprowadzić do genomu bakteryjnego metodą rekombinacji homologicznej i ocenić wpływ na ekspresję genu. W innym podejściu, znajomość sekwencji regionu, będącego przedmiotem zainteresowania, można wykorzystać do zastąpienia lub delecji całości, lub części naturalnych sekwencji regulatorowych. W tym przypadku, docelowy region regulatorowy wydziela się i modyfikuje, żeby zawierał elementy regulatorowe z innego genu, kombinację elementów regulatorowych z różnych genów, syntetyczny region regulatorowy lub dowolny inny region regulatorowy, lub żeby usunąć wybrane części sekwencji regulatorowych typu dzikiego. Te sekwencje zmodyfikowane można następnie wprowadzić ponownie do genomu bakterii na drodze rekombinacji homologicznej.
W sposobie b), na przykład, ekspresję genu można modulować przez wymianę jego promotora na promotor silniejszy (przez wyizolowanie sekwencji poprzedzającej gen, modyfikację in vitro tej sekwencji i ponowne wprowadzenie do genomu metodą rekombinacji homologicznej). Ekspresję regulowaną w górę można otrzymać zarówno w bakterii, jak i w pęcherzykach błony zewnętrznej odrzuconych (lub wytworzonych) z bakterii.
W innych przykładach, opisane podejścia można zastosować do wytwarzania rekombinacyjnych szczepów bakteryjnych o ulepszonej charakterystyce do zastosowań do szczepienia, jak opisano wyżej. Mogą to być, ale bez ograniczania do tego, szczepy atenuowane, szczepy o zwiększonej ekspresji wybranych antygenów, szczepy ze znokautowanymi genami (lub o zmniejszonej ekspresji genów), które zakłócają odpowiedź immunologiczną i szczepy o zmodulowanej ekspresji białek immunodominujących.
SEKW. ID. NR: 2-23, 25, 27-38 to wszystko dwoinkowe sekwencje poprzedzające (przed kodonem inicjacji rozmaitych korzystnych genów) zawierające w przybliżeniu po 1000 bp. SEKW. ID. NR: 39-62 to wszystko sekwencje poprzedzające M. catarrhalis (przed kodonem inicjacji rozmaitych korzystnych genów) zawierające w przybliżeniu po 1000 bp. SEKW. ID. NR: 63-75 to wszystko sekwencje poprzedzające H. influenzae (przed kodonem inicjacji rozmaitych korzystnych genów) zawierające w przybliżeniu po 1000 bp. Wszystkie z nich można zastosować w sposobach genetycznych (szczególnie rekombinacji homologicznej) dla regulacji w górę lub regulacji w dół otwartych ramek odczytu, z którymi są one związane (jak opisano przedtem). SEKW. ID. NR: 76-81 są regiony kodujące dla genów HtrB i MsbB z Neisseria, M. catarrhalis i Haemophilus influenzae. Można je zastosować w sposobach genetycznych (szczególnie rekombinacji homologicznej) dla regulacji w dół (w szczególności usunięcia) części (korzystnie wszystkich) tych genów [sposób d)].
W rozwiązaniach według wynalazku możne znaleźć więc zastosowanie wydzielona sekwencja polinukleotydowa, która hybrydyzuje w warunkach wysoce ostrych z co najmniej 30-nukleotydową porcją nukleotydów w SEKW. ID. NR: 2-23, 25, 27-81 albo nić komplementarna do niej. Wydzielona sekwencja powinna być dostatecznie długa dla przeprowadzenia rekombinacji homologicznej z sekwencją chromosomową, jeżeli stanowi ona część przydatnego wektora - mianowicie co najmniej
PL 211 017 B1 nukleotydów (korzystnie co najmniej 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 lub 500 nukleotydów). Korzystniej, wydzielony polinukleotyd powinien zawierać co najmniej 30 nukleotydów (korzystnie co najmniej 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 lub 500 nukleotydów) z SEKW. ID. NR: 2-23,
25, 27-81 albo nici komplementarnej do niej.
Stosowane niniejszym wysoce ostre warunki hybrydyzacji obejmują, na przykład, 6 x SSC, 5 x
Denhardt, 0,5% SDS, i 100 μg/mL fragmentowanego i zdenaturowanego DNA z nasienia pstrąga hybrydyzowanego przez noc w temperaturze 65°C i przemytego w 2 x SSC, 0,1% SDS jeden raz w temperaturze pokojowej przez około 10 minut, a następnie jeden raz w temperaturze 65°C przez około 15 minut, a następnie przemytego co najmniej raz w 0,2 x SCC, 0,1% SDS w temperaturze pokojowej przez co najmniej 3-5 minut.
Niniejszym opisano zastosowanie wydzielonych sekwencji polinukleotydów do przeprowadzenia modyfikacji genetycznej (takiej jak insercja transpozonu lub specyficzna dla miejsca mutacja lub delecja, ale korzystnie rekombinacja homologiczna) w obrębie 1000 bp przed genem chromosomalnym bakterii Gram-ujemnej w celu albo zwiększenia albo zmniejszenia ekspresji genu. Korzystnie, szczep, w którym ma mieć miejsce rekombinacja, jest taki sam jak szczep, z którego otrzymano sekwencje poprzedzające według wynalazku. Jednak genomy meningokoków A, B, C, Y i W i gonokoka są dostatecznie podobne, żeby sekwencja poprzedzająca z dowolnego z tych szczepów mogła być przydatna do projektowania wektorów do prowadzenia takich operacji w innych szczepach. Może być tak również dla Haemophilus influenzae i atypowego Haemophilus influenzae.
Przykłady
Poniższe przykłady wykonuje się przy użyciu normalnych technik, które są znane i rutynowe dla specjalistów, z wyjątkiem, kiedy opisano szczegółowo inaczej. Przykłady są obrazowe, ale nie ograniczają wynalazku.
P r z y k ł a d 1
Konstruowanie szczepu grupy surowiczej B Neisseiria meningitidis bez polisacharydów otoczki
Plazmid pMF121 (Frosch i in., 1990) zastosowano do skonstruowania szczepu Neisseria meningitidis B bez polisacharydu otoczki. Ten plazmid zawiera regiony oskrzydlające miejsce genu kodującego szlak przemian biosyntetycznych polisacharydu grupy B (B PS) oraz genu oporności na erytromycynę. Delecja B PS spowodowała utratę ekspresji polisacharydu otoczki grupy B, jak również delecję aktywnej kopii galE prowadząc do syntezy LPS z niedoborem galaktozy.
Transformacja szczepu
Do transformacji wybrano szczep H44/76 Neisseria meningitidis B (B:15:P1.7, 16; Los 3,7,9). Po inkubacji CO2 przez noc na płytce MH (bez erytromycyny), komórki zebrano w ciekłej MH zawierającej 10 mM MgCl2 (2 ml stosowano na płytkę MH) i rozcieńczono do gęstości optycznej 0,1 (550 nm). Do tych 2 ml roztworu dodano 4 μl roztworu podstawowego plazmidu pMF121 (0,5 μg/ml) na 6 godzin okresu inkubacji w temperaturze 37°C (z wytrząsaniem). Grupę kontrolną zrobiono z taką samą ilością bakterii Neisseria meningitidis B, ale bez dodatku plazmidu. Po okresie inkubacji 100 μl hodowli jako takiej w rozcieńczeniach 1/10, 1/100 i 1/1000 umieszczono na płytkach MH zawierających 5, 10, 20, 40 lub 80 μg erytromycyny/ml przed inkubacją przez 48 godzin w temperaturze 37°C.
Blotting kolonii
Po inkubacji płytek wyhodowano 20 kolonii i poddano selekcji na płytkach MH zawierających 10 i 20 μg erytromycyny/ml, podczas gdy w grupie kontrolnej bez transformacji plazmidem nie było wzrostu kolonii. Szczep H44/76 typu dzikiego był niezdolny do wzrostu na płytkach selekcyjnych z erytromycyną (10 do 80 μg erytromycyny/ml). Nazajutrz, wszystkie widoczne kolonie umieszczono na nowych płytkach MH bez erytromycyny, żeby umożliwić im wzrost. Następnie, przeniesiono je na arkusze nitrocelulozy (blotting kolonii) w celu testowania obecności polisacharydu B. W skrócie, kolonie odbito na arkuszu nitrocelulozowym i bezpośrednio wypłukano w PBS-0,05% Tween 20 przed inaktywacją komórek przez 1 godzinę w temperaturze 56°C w PBS-0,05% Tween 20 (bufor rozcieńczający). Następnie, błonę pokryto na godzinę buforem rozcieńczającym w temperaturze pokojowej (RT). Następnie ponownie przemyto arkusze trzy razy po 5 minut w buforze rozcieńczającym przed inkubacją przeciwciałem monoklonalnym anty-B PS 735 Mab (Boerhinger) rozcieńczonym 1/3000 w buforze rozcieńczającym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po nowym etapie przemywania (3 razy po 5 minut), przeciwciało monoklonalne wykrywano stosując biotynylowaną 1 g anty-mysią z firmy Amersham (RPN 1001) rozcieńczoną 500 razy w buforze rozcieńczającym (jedna godzina w temperaturze pokojowej) przed następnym etapem przemywania (jak opisano wyżej). Następnie, arkusze inkubowano
PL 211 017 B1 przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej z roztworem kompleksu streptawidyny-peroksydazy rozcieńczonym 1/1000 w buforze rozcieńczającym. Po ostatnich trzech etapach przemywania przy użyciu tego samego sposobu, arkusze nitrocelulozowe inkubowano przez 15 min w ciemności stosując roztwór wywoływacza (roztwór 30 mg 4-chloro-1-naftolu w 10 ml metanolu plus 40 ml PBS i 30 μl H2O2 37% z firmy Merck). Reakcję zatrzymano stosując etap przemywania wodą destylowaną.
Testy ELISA dla całych komórek
Wykonano także testy ELISA dla całych komórek, stosując dwie kolonie transformowane („D” i „R”) i szczep typu dzikiego (H44/76) jako bakterie w otoczkach (20 μg białka/ml) oraz zestaw różnych przeciwciał monoklonalnych (Mabs) stosowanych do scharakteryzowania szczepów Neisseria meningitidis. Testowano następujące Mabs: anty-B PS (735 od dr Froscha) i inne Mabs z NIBSC: anty-B PS (Ref 95/750) anty-Pl.7 (A-PorA, Ref 4025), anty-P1.16 (A-PorA, Ref 95/720), anty-Los 3,7,9 (A-LPS, Ref 4047), anty-Los 8 (A-LPS, Ref 4048) i anty-P1.2 (A-PorA Ref 95/696).
Płytki mikrotitracyjne (Maxisorp, Nunc) powleczono 100 μl roztworu rekombinacyjnych meningokokowych komórek B przez noc (ON) w temperaturze 37°C przy około 20 μg/ml w PBS. Następnie, płytki przemyto trzy razy po 300 μl 150 mM NaCl - 0,05% Tween 20 i pokryto 100 μl PBS - 0,3% kazeiny i inkubowano przez 30 min w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem. Płytki przemyto ponownie stosując samą procedurę przed inkubacją z przeciwciałami. Przeciwciała monoklonalne (100 μl zastosowano przy różnych rozcieńczeniach (jak pokazano na figurze 2) w PBS - 0,3% kazeiny 0,05% Tween 20 i umieszczono na mikropłytkach przed inkubacją w temperaturze pokojowej przez 30 min z wytrząsaniem, przed następnym identycznym etapem przemywania. 100 μl anty-mysiej Ig (z królika, Dakopatts E0413) sprzężonej z biotyną i rozcieńczonej 1/2000 w PBS - 0,3% kazeiny - 0,05% Tween 20 dodano do studzienek w celu wykrycia związanych przeciwciał monoklonalnych. Po etapie przemywania (as before), płytki inkubowano z roztworem kompleksu streptawidyny-peroksydazy (100 μl Amersham RPN 1051) rozcieńczonym 1/4000 w tym samym roztworze roboczym przez 30 min w temperaturze pokojowej w warunkach wytrząsania. Po tej inkubacji i ostatnim etapie przemywania płytki inkubuje się przez 15 min w ciemności z roztworem 100 μl chromogenu (4 mg ortofenylenodiaminy (OPD) w 10 ml 0,1M buforu cytrynianowego o pH 4,5 z 5 μl H2O2). Następnie, płytki odczytuje się przy 490/620 nm stosując spektrofotometer.
Wyniki
Figura 1 pokazuje, że wśród 20 wydzielonych kolonii, które były zdolne do wzrostu na pożywce selekcyjnej z erytromycyną, tylko dwie kolonie („D” i „R”) dały ujemny wynik testu na obecność polisacharydu B. Wśród pozostałych, 16 było wyraźnie dodatnich w teście na B PS i wciąż opornych na erytromycynę. Wskazuje to, że zintegrowały plazmid ze swoim genomem, ale w złej orientacji i zachowały nietknięty gen B PS i LPS (bez podwójnego crossing-over). Na płytkach były testowane także dodatnie i ujemne próby kontrolne i wykazały, że szczep H44/76 typu dzikiego NmB był wyraźnie dodatni w teście na polisacharyd B, zaś szczepy meningokoka A (A1) i meningokoka C (C11) były wyraźnie ujemne przy tym przeciwciele anty-B PS 735 Mab. Te wyniki wskazują, że około 10% poddanych selekcji kolonii prawidłowo zintegrowało plazmid w swoim genomie przez wytworzenie podwójnego crossing-over, zaś inne szczepy/kolonie otrzymano po prostym crossing-over, przy zachowaniu genów B PS i LPS nietkniętych i wyrażanych.
Przy użyciu testów ELISA dla całych komórek, wyniki (figura 2 i tabela poniżej) wyraźnie wskazują, że dwie transformanty „D” i „R” (pochodzące z kolonii D i R) nie mogą być już rozpoznawane przez Mabs anty-B PS (735 i 95/750), ani przez anty-Los 3,7,9 i Mabs anty-Los 8. Jednak, przy użyciu swoistych Mabs anty-PorA istnieje wyraźna reakcja dla Mabs 1 anty-P1.7 i anty-P1.16 w komórkach, jak zaobserwowano także u szczepu typu dzikiego. Nie zaobserwowano reakcji z niespecyficznym anty-PorA Mab (anty-P1.2 mab). Te wyniki potwierdzają, że białko PorA, a konkretnie epitopy P1.7 i P1.16 są wciąż obecne po transformacji, zaś polisacharyd B i epitopy Los 3,7,9 i Los 8 (LPS) nie są.
T a b e l a 1
Specyficzności testowanych przeciwciał monoklonalnych
Testowane przeciwciała monoklonalne Skierowane przeciw Wynik
1 2 3
Anty-B PS 735 Polisacharyd B ++ na szczepie typu dzikiego (') na mutantach „D” i „R”
PL 211 017 B1 cd. tabeli 1
1 2 3
Anty-B PS 95/750 z NIBSC B PS ++ na szczepie typu dzikiego (-) na mutantach „D” i „R”
Anty-P1.7 (NIBSC) ++ na wszystkich szczepach typu dzikiego i mutantach
Anty-P1.16 (NIBSC) Pętla 4 poryny A ++ na wszystkich szczepach typu dzikiego i mutantach
Anty-Los 3,7,9 LPS ++ na szczepie typu dzikiego (-) na mutantach „D” i „R”
Anty-Los 8 (NIBSC) LPS +/- na szczepie typu dzikiego (-) na mutantach „D” i „R”
Anty-P1.2 (NIBSC) Anty-Poryna A Sero-podtyp 1.2 (-) na wszystkich szczepach typu dzikiego i mutantach
P r z y k ł a d 2
Konstrukcja wszechstronnych wektorów dostarczających geny (seria pCMK) kierujących integracją w miejscu porA Neisseiria meningitidis
Skonstruowano plazmid umożliwiający rekombinację homologiczną i trwałą integrację obcego DNA w miejscu porA Neisseiria meningitidis. Ten wektor dostarczający (geny, operony i/lub kasety ekspresyjne) jest przydatny do konstruowania szczepów Neisseiria meningitidis wytwarzających pęcherzyki ulepszone rekombinacyjne. Typowo, taki wektor zawiera co najmniej:
(1) szkielet plazmidu mogący mnożyć się w E. coli, ale nie w Neisseria meningitidis (plazmid samobójczy), (2) co najmniej jeden, ale korzystnie dwa regiony o homologii do kierowania integracją w miejscu chromosomowym takim jak porA, (3) wydajne sygnały transkrypcyjne (promotor, region regulatorowy i terminator) i translacyjne (zoptymalizowane miejsce wiązania rybosomu i kodon inicjacji) funkcjonalne w Neisseria meningitidis, (4) miejsce wielokrotnego klonowania i (5) wybieralny gen(y) umożliwiający utrzymanie plazmidu w E. coli i wybór integrantów w Neisseria meningitidis.
Elementy dodatkowe obejmują, na przykład, sekwencje wychwytu dla ułatwienia wejścia obcego DNA do Neisseiria meningitidis i markery wybierane nawzajem, takie jak sacB, rpsL, gltS dla zwiększenia częstości zdarzeń podwójnego crossing-over.
Schematyczny rysunek wektora skonstruowanego w tym przykładzie i oznaczonego pCMK przedstawiono na figurze 3. Jego odpowiednią zupełną sekwencję nukleotydową pokazano na SEKW. ID. NR: 1. pCMK pochodzi od szkieletu pSL1180 (PharmaciaBiotech, Szwecja), plazmidu o wysokiej liczbie kopii zdolnego do replikacji w E. coli, który zawiera gen bla (i przez to nadaje oporność na ampicylinę). Oprócz tego, pCMK funkcjonalnie zawiera dwa regiony oskrzydlające porA (porA5' i porA3' zawierające terminator transkrypcji) niezbędne dla rekombinacji homologicznej, marker wybieralny nadający oporność na kanamycynę, dwie sekwencje wychwytu, promotor chimeryczny porA/lac0 ulegający represji w gospodarzu E. coli wyrażającym lacl, ale aktywny transkrypcyjnie w Neisseria meningitidis i wielokrotne miejsce klonowania (5 obecnych miejsc: Ndel, Kpnl, Nhel, PinAl i SphI) niezbędne dla insereji obcego DNA do pCMK.
pCMK skonstruowano jak następuje. Regiony rekombinogenne porA5' i porA3', promotor porA/lac0 poddano amplifikacji PCR, stosując oligonukleotydy podane w tabeli poniżej, sklonowane w -pTOPO i zsekwencjonowano. Te fragmenty DNA kolejno wycinano z pTOPO i ponownie sklonowane w pSL1180. Kasetę oporności na kanamycynę wycięto z pUC4K (PharmaciaBiotech, Szwecja) i wprowadzono między region oskrzydlający porA5' i region promotora porA/lac0.
T a b e l a 2
Oligonukleotydy stosowane w tej pracy
Oligonukleotydy Sekwencja Uwaga(i)
1 2 3
PorA5' Fwd 5'-CCC AAG CTT GCC GTC TGA ATA CAT CCC GTC ATT CCT CA-3' miejsce klonowania Hindlll sekwencja wychwytu (-)
PL 211 017 B1 cd. tabeli 2
1 2 3
PorA5' Rev 5'-CGA TGC TCG CGA CTC GAG AGA CCT CGT GCG GGC C-3' miejsce klonowania Nru I
PorAS' Fwd 5'-GGA AGA TCT GAT TAA ATA GGC GAA AAT ACC AGC TAC GA-3' miejsce klonowania Bgl II kodony stop (-)
PorA3' Rev 5'-GCC GAA TTC TTC AGA CGG C GC AGC AGG AAT TTA TCG G-3' miejsce klonowania EcoRl sekwencja wychwytu (-)
PoLa Rev1 5'-GAA TTG TTA TCC GCT GAC AAT TCC GGG GAA ACA CCC GAT AC-3'
PoLa Rev2 5'-GAA TTC CAT ATG ATC GGC TTC CTT TTG TAA ATT TGA TAA AAA CCT AAA AAC ATC GAA TTG TTA TCC GCT C-3' miejsce klonowania Ndel
PorAlacO Fwd 5'-AAG CTC TGC AGG AGG TCT GCG CTT GAA TTG-3' miejsce klonowania Pstl
PorAlacO Rev 5'-CTT AAG GCA TAT GGG CTT CCT TTT GTA A-3' miejsce klonowania Ndel
PPA1 5'-GCG GCC GTT GCC GAT GTC AGC C-3'
PPA2 5'-GGC ATA GCT GAT GCG TGG AAC TGC-3'
N-pełny-01 5'-GGG AAT TCC ATA TGA AAA AAG GAC TTG CCA CAC-3' miejsce klonowania Ndel
Nde-NspA-3 5'-GGA ATT CCA TAT GTC AGA ATT TGA GGC GCA C-3' miejsce klonowania Ndel
PNS1 5'-CCG CGA ATT CGG AAC CGA ACA GGC CGT TCG-3' miejsce klonowania EcoRI
PNS1 5'-CGT CTA GAC GTA GCG GTA TCC GGC TGC-3' miejsce klonowania Xbal
PromDlS-51X 5'-GGG CGA ATT CGC GGC CGC CGT CAA CGG CAC ACC CGT TG-3' miejsca klonowania EcoRI i Notl
PromD15-S2 5'-GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3' miejsce klonowania Xbal
PNS4 5'-AGC TTT ATT TAA ATC CTT AAT TAA CGC GTC CGG AAA ATA TGC TTA TC 34 miejsca klonowania Swal i PacI
PNS5 5'-AGC TTT GTT TAA ACC CTG TTC CGC TGC TTC GGC-3' miejsce klonowania Pmel
D15-S4 5'-GTC CGC ATT TAA ATC CTT AAT TAA GCA GCC GGA GAG GGC GTG G-3' miejsca klonowania Swal i PacI
D15-S5 5'-AGC TTT GTT TAA AGG ATC AGG GTG TGG TCG GGC-3' miejsce klonowania Pmel
P r z y k ł a d 3
Konstruowanie szczepu Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B bez zarówno polisacharydów otoczki, jak i głównego immunodominującego antygenu PorA
Modulowanie zawartości antygenowej pęcherzyków błony zewnętrznej może być korzystne przy polepszaniu ich bezpieczeństwa i skuteczności w ich zastosowaniu w szczepionkach lub zastosowaniach diagnostycznych, lub terapeutycznych. Składniki takie jak polisacharydy otoczki Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B powinny być usunięte dla wykluczenia ryzyka indukowania autoimmunizacji (patrz przykład 1). Podobnie, korzystne jest stłumienie immunodominacji głównych antygenów błony zewnętrznej, takich jak PorA, który indukuje swoiste dla szczepu przeciwciała bakteriobójcze, ale nie może nadać ochrony krzyżowej. Dla zilustrowania takiego podejścia twórcy zastosowali wektor pCMK(+) do skonstruowania szczepu Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B pozbawionego zarówno polisacharydów otoczki, jak i immunodominującego antygenu PorA błony zewnętrznej. W tym
PL 211 017 B1 celu przy pomocy rekombinacji homologicznej wprowadzono delecję genu porA w szczepie H44/76 cps-, opisanym w przykładzie 1.
Wytworzono kompetentny szczep H44/76 cps- i transformowano dwoma μg superzwiniętego plazmidu DNA pCMK(+), jak opisano poprzednio. Porcje mieszaniny transformacyjnej (100 μΐ) naniesiono na płytki Muellera-Hintona uzupełnione kanamycyną (200 μg/ml) i inkubowane w temperaturze 37°C przez 24 do 48 godzin. Poddano selekcji kolonie oporne na kanamycynę, ponownie naniesiono na MH-Kn i hodowano przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37°C. Na tym etapie połowę hodowli bakteryjnej wykorzystano do wytworzenia roztworu podstawowego w glicerynie (15% obj.) i przechowywano w stanie zamrożonym w temperaturze -70°C. Inną frakcję (oszacowaną na 10 bakterii) ponownie zawieszono w 15 μl wody destylowanej, gotowano przez dziesięć minut i użyto jako szablon dla badań przesiewowych PCR. Zsyntetyzowano dwa porA startery wewnętrzne, nazwane PPA1 i PPA2 i zastosowano do przeprowadzenia amplifikacji PCR na gotowanych lizatach bakteryjnych w warunkach opisanych przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Stosowany cykl temperaturowy był następujący: 25 razy (94°C 1 min., 52°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Ponieważ podwójne crossing-over między pCMK DNA i chromosomowym miejscem porA usuwa region wymagany dla przyłączenia # 1 i # 2, to klony bez fragmentu 1170 bp amplifikowanego metodą PCR zostały poddane selekcji jako mutanty z delecją porA. Te wyniki PCR zostały dalej potwierdzone przez równoległą analizę obecności PorA w odpowiednich ekstraktach białka bakteryjnego. W tym celu, inną próbkę bakterii (oszacowaną na 5-108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 μl buforu PAGE-SDS (SDS 5%, gliceryna 30%, beta-merkaptoetanol 15%, błękit bromofenolowy 0,3 mg/ml, Tris-HCl 250 mM pH 6,8), zagotowano (100°C), zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy i oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na żelu 12,5%. Następnie, żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i sondowano przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-PorA, jak opisali Maniatis i in. Jak przedstawiono na figurze 4, zarówno barwienie Coomassie, jak i immunoodbitka potwierdziły, że klony porA PCR negatywne nie wytwarzają wykrywalnych poziomów PorA. Ten wynik potwierdza, że wektor pCMK jest funkcjonalny i może być stosowany pomyślnie do kierowania insereją DNA w genie porA, znosząc równocześnie wytwarzanie antygenu białkowego PorA błony zewnętrznej.
P r z y k ł a d 4
Regulacja w górę wytwarzania białka NspA błony zewnętrznej w pęcherzykach pochodzących z rekombinacyjnego szczepu Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów porA i cps
Wzbogacanie pęcherzyków w antygeny ochronne jest korzystne dla polepszenia skuteczności i zakresu działania szczepionek opartych na białkach błony zewnętrznej. W tym kontekście, rekombinacyjne szczepy Neisseria meningitidis bez funkcjonalnych genów cps i porA zmodyfikowano tak, że regulowano w górę poziom ekspresji białka błony zewnętrznej NspA. W tym celu, gen kodujący NspA amplifikowano metodą PCR, stosując startery oligonukleotydowe N01-pełny-Ndel i A7deI-3' (patrz tabela w przykładzie 2). Warunki stosowane do amplifikacji PCR były takie, jak opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Wykonywano następujący cykl termiczny: 25 razy (94°C 1 min., 52°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Odpowiedni amplikon strawiono Ndel i wstawiono w miejsce restrykcyjne Ndel wektora dostarczającego pCMK(+). Sprawdzono orientację wstawki i rekombinacyjne plazmidy, oznaczone pCMK(+)-NspA, oczyszczono w dużej skali, stosując zestaw QIAGEN maxiprep i 2 μg tego materiału zastosowano do transformowania szczepu Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps (szczepu opisanego w przykładzie 1). Integrację otrzymaną z podwójnego crossing-over między wektorem pCMK(+)-NspA i chromosomalnym miejscem porA poddano selekcji, stosując kombinację procedur przesiewowych PCR i Western blot przedstawioną w przykładzie 3.
Porcję bakterii (odpowiadającą około 5 · 108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 μl buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Następnie, żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i sondowano przy użyciu surowicy poliklonalnej antyNspA. Zarówno barwienie Coomassie (danych nie pokazano), jak i immunoblotting (patrz figura 4) potwierdziły, że klony PCR ujemne wobec porA nie wytwarzają wykrywalnych poziomów PorA. Ekspresję NspA sprawdzono w lizatach bakteryjnych z całych komórek (WCBL) lub w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej pochodzących z NmB [cps-, porA-] lub NmB [cps-, porA-, Nspa+]. Chociaż nie można było zaobserwować różnicy przy barwieniu Coomassie, to immunoblotting przy użyciu su28
PL 211 017 B1 rowicy poliklonalnej anty-NspA wykrył 3-5 krotny wzrost ekspresji NspA (w odniesieniu do poziomu endogennego NspA), zarówno w WCBL, jak i w preparatach pęcherzyków błony zewnętrznej (patrz figura 5). Ten wynik potwierdza, że wektor pCMK(+)-NspA jest funkcjonalny i może być stosowany pomyślnie do regulacji w górę ekspresji białek błony zewnętrznej takich jak NspA, znosząc równocześnie wytwarzanie antygenu białkowego PorA błony zewnętrznej.
P r z y k ł a d 5
Regulacja w górę antygenu białkowego D15/Omp85 błony zewnętrznej w pęcherzykach pochodzących z rekombinacyjnego szczepu Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps, ale wyrażającego PorA
Pewne populacje ludzkie wydzielone geograficznie (takie jak Kuba) są zainfekowane przez ograniczoną liczbę izolatów Neisseiria meningitidis należących w znacznym stopniu do jednego lub paru serotypów białek błony zewnętrznej. Ponieważ PorA stanowi główny antygen białkowy błony zewnętrznej indukujący ochronne i swoiste dla szczepu przeciwciała bakteriobójcze, to możliwe jest nadanie ochrony szczepionką przy użyciu ograniczonej liczby serotypów porA w szczepionce. W takim kontekście obecność PorA w pęcherzykach błony zewnętrznej może być korzystna, wzmacniając skuteczność szczepionki z takich ulepszonych rekombinacyjnie pęcherzyków. Takie szczepionki zawierające PorA, można jednak ulepszyć jeszcze dalej, zwiększając poziom innych reaktywnych krzyżowo OMP, takich jak omp85/D15.
W nastę pują cym przykł adzie, zastosowano wektor pCMK(+) do regulacji w górę ekspresji antygenu białkowego Omp85/D15 błony zewnętrznej w szczepie bez funkcjonalnych genów cps ale wyrażającego porA. W tym celu, gen kodujący Omp85/D15 amplifikowano metodą PCR, stosując startery oligonukleotydowe Dl5-Wdel i D15-NotI. Warunki stosowane do amplifikacji PCR były takie, jak opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Wykonywano następujący cykl termiczny: 25 razy (94°C 1 min., 52°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Odpowiedni amplikon wstawiono do wektora klonującego pTOPO zgodnie z instrukcją producenta i przeprowadzono sekwencjonowanie potwierdzające. Ten fragment DNA Omp85/D15 wycięto z pTOPO metodą hydrolizy restrykcyjnej, stosują c Ndel/Nsil i z kolei sklonowane w odpowiednich miejscach restrykcyjnych wektora dostarczającego pCMK(+). Plazmidy rekombinacyjne, oznaczone pCMK(+)-D15, oczyszczono na dużą skalę, stosując zestaw QIAGEN maxiprep i 2 μg tego materiału zastosowano do transformowania szczepu Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps (szczepu opisanego w przykładzie 1).
W celu zachowania ekspresji porA poddano selekcji integracje otrzymane z pojedynczego crossing-over (albo w Omp85/D15, albo w porA) przez połączenie procedur przesiewowych PCR i Western blot. Klony oporne na kanamycynę o dodatnim wyniku testu PCR specyficznego dla porA i Western blot przechowywano w temperaturze -70°C jako roztwór podstawowy w glicerynie i zastosowano do dalszych badań.
Próbkę bakterii (odpowiadającą około 5 · 108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 μl buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zygoto-wano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Następnie, żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i sondowano przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-porA. Jak przedstawiono na figurze 6, zarówno barwienie Coomassie i immunoblotting potwierdziły, że klony dodatnie w teście PCR porA wytwarzają PorA. Ekspresję D15 sprawdzano przy użyciu preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej pochodzących z NmB [cps-, porA-] lub NmB [cps-, porA+, D15+].
Barwienie Coomassie wykryło znaczący wzrost ekspresji D15 (w odniesieniu do endogennego poziomu D15) preparatów (patrz figura 6). Ten wynik potwierdził, że wektor pCMK(+)-D15 jest funkcjonalny i może być stosowany pomyślnie do regulacji w górę ekspresji białek błony zewnętrznej takich jak D15, bez zniesienia wytwarzania głównego antygenu białkowego PorA błony zewnętrznej.
P r z y k ł a d 6
Konstruowanie wszechstronnych wektorów dostarczających promotory
Uzasadnienie: Uzasadnienie tego podejścia jest przedstawione na figurze 7 i może być streszczone w 7 zasadniczych etapach. Niektóre z tych etapów są zilustrowane poniżej przy konstruowaniu wektora dla regulacji w górę ekspresji NspA i D15/Omp85.
PL 211 017 B1
Wektor dla regulacji w górę ekspresji genu NspA
Etap 1. Region DNA (997 bp) umiejscowiony przed genem kodującym NspA został odkryty (SEKW. ID. NR: 2) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niedokończone sekwencje DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Two startery oligonukleotydowe określane jako PNS1 i PNS2 (patrz tabela w przykładzie 2) zostały zaprojektowane przy użyciu tej sekwencji i zsyntetyzowane. Te startery zastosowano do amplifikacji PCR, stosując genomowy DNA ekstrahowany ze szczepu H44/76.
Etap 2. Odpowiednie amplikony oczyszczono stosując zestaw Wizard PCR (Promega, USA) i poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRl/Kbal przez 24 godziny, stosując warunki opisane przez dostawcę (Boehringer Mannheim, Niemcy). Odpowiednie fragmenty DNA oczyszczono na żelu i wstawiono w odpowiednich miejscach wektora klonującego pUC18.
Etap 3. Plazmidy rekombinacyjne wytworzono w dużej skali i próbkę frakcji zastosowano jako szablon dla odwróconej amplifikacji PCR. Odwróconą PCR przeprowadzono przy użyciu oligonukleotydów PNS4 i PNS5, stosując następujące warunki cykli termicznych: 25 razy (94°C 1 min., 50°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Otrzymano zlinearyzowane wektory pUC18 mające delecję w regionie wstawki przed NspA.
Wektor dla regulacji w górę ekspresji genu D15/com85
Etap 1. Region DNA (1000 bp) umiejscowiony przed genem kodującym D15/omp85 został odkryty (SEKW. ID. NR: 3) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niedokończone sekwencje DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Dwa startery oligonukleotydowe określane jako PromD15-5lX i PromD15-S2 (patrz tabela w przykładzie 2) zostały zaprojektowane przy użyciu tej sekwencji i zsyntetyzowane. Te startery zastosowano do amplifikacji PCR, stosując genomowy DNA ekstrahowany ze szczepu H44/76.
Etap 2. Odpowiednie amplikony oczyszczono stosując zestaw Wizard PCR (Promega, USA) i poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi EcoRl/Xbal przez 24 godziny w warunkach opisanych przez dostawcę (Boehringer Mannheim, Niemcy). Odpowiednie fragmenty DNA oczyszczono na żelu i wstawiono w odpowiednich miejscach wektora klonującego pUC18.
Etap 3. Plazmidy rekombinacyjne wytworzono w dużej skali i próbkę frakcji użyto jako szablon dla odwróconej amplifikacji PCR. Odwróconą PCR przeprowadzono przy użyciu oligonukleotydów D15-S4 i D15-S5, stosując następujące warunki cykli termicznych: 25 razy (94°C 1 min., 50°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Otrzymano zlinearyzowane wektory pUC18 mające delecję w regionie wstawki przed D15/omp85.
P r z y k ł a d 7
Sposoby fermentacji do wytwarzania pęcherzyków rekombinacyjnych
Przykłady podane poniżej opisują sposoby wytwarzania pęcherzyków rekombinacyjnych nie mających albo polisacharydów otoczki albo polisacharydów otoczki i PorA. Taką procedurę można zastosować dla szerokiego zakresu szczepów rekombinacyjnych Neisseiria meningitidis i można dostosować do rozszerzonego zakresu skali.
Pożywki do hodowli: szczepy Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B rozmnażano w stałej (FNE 004 AA, FNE 010 AA) lub ciekłej (FNE 008 AA) pożywce do hodowli. Te nowe pożywki do wzrostu meningokoków są korzystnie wolne od produktów zwierzęcych.
T a b e l a 3
Składniki FNE 004 AA FNE 008 AA FNE 010 AA
1 2 3 4
Agar 18 g/L - 18 g/L
NaCl 6 g/L 6 g/L 6 g/L
Glutaminian Na - 1,52 g/L -
NaH2PO4·2H2O 2,2 g/L 2,2 g/L 2,2 g/L
KCl 0,09 g/L 0,09 g/L 0,09 g/L
NH4CI 1,25 g/L 1,25 g/L 1,25 g/L
Glukoza 5 g/L 20 g/L 5 g/L
PL 211 017 B1 cd. tabeli 3
1 2 3 4
Ekstrakt drożdży UF - 2,5 g/L -
Pepton sojowy 5 g/L 30 g/L 5 g/L
CaCl2 · 2H2O 0,015 g/L - 0,015 g/L
MgSO4 ·7H2O 0,6 g/L 0,6 g/L 0,6 g/L
Erytromycyna 0,015 g/L - -
Kanamycyna - - 0,2 g/L
Hodowla w kolbie pęcherzyków rekombinacyjnych cps-Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B
Przeprowadzono to w dwóch etapach obejmujących hodowlę wstępną na pożywce stałej, a następnie hodowlę ciekłą.
Stała hodowla wstępna
Fiolkę posiewanego materiału wyjęto z zamrażarki (-80°C), rozmrożono do temperatury pokojowej i 0,1 mL rozprowadzono na szalce Petriego zawierającej 15 mL FNE004AA (patrz wyżej). Szalkę Petriego inkubowano w temperaturze 37°C przez 18 ± 2 godziny. Materiał rosnący na powierzchni ponownie zawieszono w 8 mL FNE008AA (patrz wyżej) uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny.
Hodowla w kolbie mL ponownie zawieszonej stałej hodowli wstępnej dodano do 2-litrowej kolby zawierającej 400 mL FNE008AA uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny. Kolbę umieszczono na wytrząsarce (200 obr/min) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 16 ± 2 godziny. Komórki oddzielono od bulionu hodowlanego przez odwirowanie przy 5000 g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
Hodowla okresowa pęcherzyków rekombinacyjnych cps-Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B
Przeprowadzono ją w trzech etapach obejmujących hodowlę wstępną na pożywce stałej, hodowlę ciekłą i hodowlę okresową.
Stała hodowla wstępna
Fiolkę posiewanego materiału wyjęto z zamrażarki (-80°C), rozmrożono do temperatury pokojowej i 0,1 mL rozprowadzono na szalce Petriego zawierającej 15 mL FNE004AA (patrz wyżej). Szalkę Petriego inkubowano w temperaturze 37°C przez 18 ± 2 godzin. Materiał rosnący na powierzchni ponownie zawieszono w 8 mL FNE008AA (patrz wyżej) uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny.
Ciekła hodowla wstępna mL ponownie zawieszonej stałej hodowli wstępnej dodano do jednej 2-litrowej kolby zawierającej 400 mL FNE008AA uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny. Kolbę umieszczono na wytrząsarce (200 obr/min) i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 16 ± 2 godziny. Zawartość kolby zastosowano do inokulacji 20-litrowego fermentera.
Hodowla okresowa w fermentorze
Inokulum (400 mL) dodano do wysterylizowanego 20-litrowego fermentera (objętość całkowita) zawierającego 10 L FNE008AA uzupełnionej 15 mg/L erytromycyny. pH doprowadzono do i utrzymywano przy 7,0 przez automatyczne dodawanie NaOH (25% wag./obj.) i H3PO4 (25% obj.). Temperaturę regulowano przy wartości 37°C. Szybkość napowietrzania utrzymywano przy 20 L powietrza/min i stężenie rozpuszczonego tlenu utrzymywano przy 20% nasycenia przez regulację szybkości mieszania. W fermentorze utrzymywano nadciśnienie 300 g/cm2. Po upływie 9 ± 1 godziny hodowla była w fazie stacjonarnej. Komórki oddzielono od bulionu hodowlanego przez odwirowanie przy 5000 g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
Hodowla w kolbie pęcherzyków rekombinacyjnych cps-, PorA-Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B
Przeprowadzono to w dwóch etapach obejmujących hodowlę wstępną na pożywce stałej, a następnie hodowlę ciekłą.
Stała hodowla wstępna
Fiolkę posiewanego materiału wyjęto z zamrażarki (-80°C), rozmrożono do temperatury pokojowej i 0,1 mL rozprowadzono na szalce Petriego zawierającej 15 mL FNE010AA (patrz wyżej). Szalkę
PL 211 017 B1
Petriego inkubowano w temperaturze 37°C przez 18 ± 2 godzin. Materiał rosnący na powierzchni ponownie zawieszono w 8 mL FNE008AA (patrz wyżej) uzupełnionej dodatkiem 200 mg/L kanamycyny.
Hodowla w kolbie mL ponownie zawieszonej stałej hodowli wstępnej dodano do 2-litrowej kolby zawierającej 400 mL FNE008AA uzupełnionej dodatkiem 200 mg/L kanamycyny. Kolbę umieszczono na wytrząsarce (200 obr/min) i inkubowano w temperaturze 37 °C przez 16 ± 2 godziny. Komórki oddzielono od bulionu hodowlanego przez odwirowanie przy 5000 g w temperaturze 4°C przez 15 minut.
P r z y k ł a d 8
Izolowanie i oczyszczanie pęcherzyków z meningokoków pozbawionych otoczki polisacharydowej
Pęcherzyki rekombinacyjne oczyszczano jak opisano poniżej. Pastę komórek (42 g) zawieszono w 211 ml buforu pH 8,6 0,1M Tris-Cl zawierającego 10 mM EDTA i 0,5% dezoksycholinianu sodu (DOC). Proporcja buforu do biomasy wynosiła 5/1 (wag./obj.). Biomasę ekstrahowano przez mieszanie magnetyczne przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie, ekstrakt całkowity odwirowano przy 20000 g przez 30 minut w temperaturze 4°C (13000 obr/min w rotorze JA-20, wirówka Beckman J2-HS). Pastylkę odrzucono. Supernatant ultrawirowano przy 125000 g przez 2 godziny w temperaturze 4°C (40000 obr/min w rotorze 50.2Ti, ultrawirówka Beckman L8-70M) w celu zatężenia pęcherzyków. Supernatant odrzucono. Pastylkę łagodnie zawieszono w 25 ml 50 mM Tris-Cl buforu pH 8,6 zawierającego 2 mM EDTA, 1,2% DOC i 20% sacharozy. Po drugim etapie ultrawirowania przy 125000 g przez 2 godziny w temperaturze 4°C, pęcherzyki łagodnie zawieszono w 44 ml 3% sacharozy i przechowywano w temperaturze 4°C. Wszystkie roztwory stosowane do ekstrakcji i oczyszczania pęcherzyków zawierały 0,01% tiomersalate. Jak zobrazowano na figurze 8, ta procedura daje preparaty białkowe wysoce wzbogacone w białka błony zewnętrznej takie jak PorA i PorB.
P r z y k ł a d 9
Identyfikacja promotorów bakteryjnych przydatnych do regulacji w górę genów kodujących antygeny
Zastosowanie silnych bakteryjnych promotorowych elementów jest zasadniczo ważne dla uzyskania regulacji w górę genów kodujących białka błony zewnętrznej. W tym kontekście, twórcy wykazali poprzednio, że regulacja w górę genów Neisseria meningitidis nspA, hsf i omp85 przy użyciu promotora porA umożliwiła izolowanie pęcherzyków rekombinacyjnych wzbogaconych w odpowiednie białka NspA, Hsf i Omp85.
Alternatywy dla promotora porA mogą być przydatne dla uzyskania różnych poziomów regulacji w górę, dla przezwyciężenia potencjalnej zmiany faz porA i/lub dla osiągnięcia warunkowej ekspresji genu (promotory regulowane przez żelazo).
Opisany niniejszym sposób umożliwia identyfikację precyzyjnego transkrypcyjnego miejsca startu elementów będących silnymi promotorami prawdopodobnie nadających bakteriom wyższy poziom ekspresji. Skoro promotorowe elementy regulatorowe są klasycznie objęte zakresem 200 bp przed i 50 bp za miejscem +1 (Collado-Vides J., Magasanik B., Gralla J. D., 1991, Microbiol Rev 55 (3): 371-94), to wynik takiego doświadczenia umożliwia zidentyfikowanie fragmentów DNA mających około 250 bp niosących silne aktywności promotorów.
Główne białka błony zewnętrznej takie jak PorA, PorB i Rmp z Neisseria meningitidis, P1, P2, P5 i P6 z Haemophilus influenzae, OmpCD i OmpE z Moraxella catarrhalis, jak również niektóre cytoplazmatyczne i/lub regulowane przez żelazo białka tych bakterii posiadają elementy będące silnymi promotorami. Dla sprawdzenia tej ogólnej metodologii twórcy zmapowali transkrypcyjne miejsce startu silnych promotorów porA i porB z Neisseria meningitidis, stosując szybką amplifikację elementów cDNA (5' RACE).
Zasady 5' RACE są następujące:
1) całkowita ekstrakcja RNA przy użyciu zestawu QIAGEN „RNeasy”. Usunięcie DNA genomowego przez działanie DNazą, a następnie oczyszczanie QIAGEN;
2) odwrotna transkrypcja mRNA przy użyciu specyficznego dla porA startera 3'-końcowego (nazwanego porA3). Oczekiwana wielkość cDNA: 307 nt. Usunięcie RNA metodą hydrolizy alkalicznej;
3) ligacja jednoniciowej kotwicy oligo DNA (nazwanej DT88) do 3' końca cDNA przy użyciu ligazy RNA T4. Oczekiwana wielkość produktu: 335 nt. Amplifikacja cDNA ligowanego z kotwicą stosując a combination of hemi-nested PCR;
PL 211 017 B1
4) amplifikacja PCR cDNA ligowanego z kotwicą przy użyciu startera kotwiczącego o sekwencji komplementarnej jako startera 5' końcowego (nazwanego DT89) i startera 3' końcowego (nazwanego pl-2), który leży wewnątrz 3' końca startera RT porA3. Oczekiwana wielkość produktu: 292 bp;
5) amplifikacja PCR poprzednich produktów PCR przy użyciu DT89 jako startera 5' końcowego i pl-1 jako startera 3' końcowego (wewnątrz pl-2). Oczekiwana wielkość produktu: 211 bp; i
6) sekwencjonowanie ze starterem pl-1 (oczekiwane wielkości produktów można obliczyć, ponieważ miejsce startu transkrypcji porA jest znane: 59 nt przed miejscem startu translacji „ATG”).
Procedura doświadczalna
Całkowity RNA ekstrahowano w przybliżeniu z 109 komórek szczepu cps- porA+ Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Ekstrakcję 1 ml hodowli ciekłej o właściwej gęstości optycznej (OD600 = 1) przeprowadzono stosując zestaw QIAGEN „RNAeasy” zgodnie z instrukcją producenta. DNA chromosomowe usunięto przez dodanie 10 U DNazy wolnej od RNazy (Roche Diagnostics, Mannheim, Niemcy) do 30 μl eluowanego RNA i inkubowano w temperaturze 37°C przez 15 min. RNA wolny od DNA oczyszczono stosując ten sam zestaw QIAGEN zgodnie z instrukcją.
Reakcje odwrotnej transkryptazy przeprowadzono stosując starter porA3 i 200 U odwrotnej transkryptazy SUPERSCRIPT II (Life Technologies). Reakcje RT przeprowadzono w objętości 50 μl zawierającej: 5 μl 2mM dNTP, 20 pmol startera porA3, 5 μl buforu 10 x SUPERSCRIPT II, 9 μl 25 mM MgCl2, 4 μl 0,1M DTT, 40 U rekombinacyjnego inhibitora rybonukleazy i 1 μg całkowitego RNA. Starter PorA3 chłodzono etapami (70°C przez 2 min, 65°C przez 1 min, 60°C przez 1 min, 55°C przez 1 min, 50°C przez 1 min i 45°C przez 1 min) przed dodaniem SUPERSCRIPT II. Reakcję RT przeprowadzono w temperaturze 42°C przez 30 min, a następnie wykonano 5 cykli (50°C przez 1 min, 53°C przez 1 min i 56°C przez 1 min) dla destabilizowania struktury drugorzędowej RNA. Przeprowadzono dwie równoległe reakcje, pomijając odwrotną transkryptazę w jednej z reakcji jako ujemnej próbce kontrolnej.
RNA usunięto przez alkaliczne rozszczepianie hydrolityczne z dodatkiem 1 μl 0,5M EDTA, a następnie 12,5 μl 0,2M NaOH przed inkubacją w temperaturze 68°C przez 5 min. Reakcje zobojętniono dodając 12,5 μl 1M Tris-HCl (pH 7,4) i strącano dodatkiem 20 μg glikogenu (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy), 5 μl 3M octanu sodu i 60 μl izopropanolu. Obie próbki ponownie zawieszono w 20 μl 10:1 TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 1 mM EDTA, pH 8).
Ligazę RNA T4 stosowano do kotwiczenia 5'-fosforylowanego, zablokowanego na 3' końcu przez ddCTP kotwiczącego oligonukleotydu DT88 (patrz tabela poniżej). Dwie równoległe ligacje przeprowadzono przez noc w temperaturze pokojowej, przy czym każda zawierała: 1,3 μl 10 x buforu ligazy RNA (Roche Molecular Biochemicals), 0,4 pM DT88, 10 μl cDNA albo próbki kontrolnej RT i 3 U ligazy RNA T4. Jako ujemne próbki kontrolne, przeprowadzono drugi zestaw reakcji ligacji, pomijając ligazę RNA T4. Otrzymane mieszaniny po reakcji ligacji stosowano wprost bez oczyszczanie w następnej PCR.
cDNA ligowany z kotwicą amplifikowano stosując kombinację podejść pół-zagnieżdżonego i gorącego startu PCR dla zwiększenia specyficzności i wydajności produktu. Cztery osobne PCR pierwszej rundy przeprowadzono na reakcji RT/ligazy i próbach kontrolnych w objętości 30 pl, przy czym każda zawierała: 3 pl bufora 10 x Taq Platinium, 3 pl 25 mM MgCl2, 1 pl 10 mM dNTP, 10 pmol każdego ze starterów i 1 pl odpowiedniej reakcji ligacji RNA. PCR startowano na gorąco przez zastosowanie polimerazy DNA Taq Platinium (Life Technologies) (dodano 2 U). Pierwszą PCR na zakotwiczonej ligacji (LA-PCR) przeprowadzono stosując 10 pmol zarówno starter specyficzny dla kotwicy DT89, jak i starter specyficzny dla transkryptu pl-2 (patrz tabela poniżej), który znajduje się wewnątrz 3' końca startera RT porA3.
PCR przeprowadzono stosując początkowo 95°C przez etap 5 min (dla aktywacji polimerazy DNA), a następnie 10 cykli w temperaturze 95°C przez 10 s i 70°C przez 1 min (zmniejszając jeden stopień na cykl), 15 cykli w temperaturze 95°C przez 10 s i 60°C przez 1 min. Drugą pół-zagnieżdżoną LA-PCR przeprowadzono w tych samych warunkach, stosując starter DT89 i starter wewnętrzny pl-2, razem z 10 pmol pl-1 (patrz tabela poniżej) i 1 pl PCR z pierwszej rundy. Produkty amplifikacji przed poddaniem sekwencjonowaniu oczyszczono stosując zestaw QIAGEN „QIAquick PCR purification” zgodnie z instrukcją producenta.
Do sekwencjonowania produktów RACE PCR użyto zestawu CEQTM Dye Terminator Cycle Sequencing (Beckman, Francja), stosując 10 pmol startera pl-1. Reakcje sekwencjonujące przeprowadzono zgodnie z załączoną instrukcją, a produkty sekwencjonowania analizowano urządzeniem Ceq2000 DNA Analysis System (Beckman-Coulter).
PL 211 017 B1
DT88 5' GAAGAGAAGGTGGAAATGGCGTTTTGGC 3'
DT89 5' CCAAAACGCCATTTCCACCTTCTCTTC 3'
porA3 5' CCAAATCCTCGCTCCCCTTAAAGCC 3'
pl-2 5' CGCTGATTTTCGTCCTGATGCGGC 3'
pl-1 5' GGTCAATTGCGCCTGGATGTTCCTG 3'
Wyniki dla promotora porA Neisseria meningitidis
Start transkrypcji dla porA-mRNA z Neisseria meningitidis grupy surowiczej B (szczep H44/76) zmapowano 59 bp przed kodonem startu ATG, stosując opisaną procedurę 5'-RACE. Ten wynik potwierdza mapowanie przeprowadzone metodą przedłużenia startera i opublikowane przez van der Ende i in. (1995). Ten wynik popiera tezę, że fragment DNA zawierający nukleotydy -9 do -259 w odniesieniu do ATG porA jest przydatny do kierowania silną ekspresją genu w Neisseria meningitidis i ewentualnie w innych gatunkach bakteryjnych, takich jak Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
Wyniki dla promotora porB Neisseria meningitidis
Tę samą strategię doświadczalną zastosowano do mapowania miejsca startu transkrypcji porB z Neisseria meningitidis grupy surowiczej B (szczep H44/76). Startery podane w tabeli poniżej odpowiadają starterowi 3' końcowemu RT (porB3), starterowi specyficznemu dla transkrypcji, który jest wewmątrz porB3 (porB2) oraz wewnątrz porB2 (porB1). porB3, porB2 i porB1 są zlokalizowane odpowiednio 265 bp, 195 bp i 150 bp za kodonem startowym ATG.
porBI 5' GGTAGCGGTTGTAACTTCAGTAACTT 3'
porB2 5' GTCTTGTTGGCCTTTGAAGCCGATT 3'
porB3 5' GGAGTCAGTAGCGGCGATAGATGCT 3'
Stosując startery porB1 i DT89 otrzymano amplikon PCR -200 bp przez wykonanie mapowania 5'-RACE. Ponieważ porB1 znajduje się 150 bp od kodonu startowego ATG porB, ten wynik popiera tezę, że transkrypcyjne miejsce startu porB znajduje się około 50 bp (± 30 bp) przed ATG porB.
Dokładny nukleotyd odpowiadający inicjacji transkrypcji jest obecnie ustalany przez sekwencjonowanie DNA. Powyższy wynik PCR popiera tezę, że fragment DNA zawierający nukleotydy -1 do -250 w odniesieniu do kodonu startowego ATG porB jest przydatny do kierowania silną ekspresją genu w Neisseria meningitidis i ewentualnie w innych gatunkach bakteryjnych, takich jak Haemophilus, Moraxella, Pseudomonas.
P r z y k ł a d 10
Regulacja w górę genu Omp85 z N. meningitidis grupy surowiczej B przez zastąpienie promotora
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu D15/com85 przez silny promotor porA w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu D15/Omp85. W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (1000 bp) umiejscowiony przed genem kodującym D15/omp85 został odkryty (SEKW. ID. NR: 3) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niedokończone sekwencje DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Główne etapy tej procedury są przedstawione na figurze 9.
W skrócie, fragment DNA (1000 bp) obejmujący nukleotydy -48 do -983 w odniesieniu do kodonu startowego (ATG) genu D15/Omp85 amplifikowano metodą PCR, stosując oligonukleotydy ProD15-5lX (5'-GGG CGA ATT CGC GGC CGC CGT CAA CGG GAC ACC GTT G-3') i ProD15-52 (5'-GCT CTA GAG CGG AAT GCG GTT TCA GAC G-3') zawierające odpowiednio miejsca restrykcyjne EcoRl i Kbal (podkreślone). Ten fragment poddano restrykcji i wstawiono do plazmidu pUC18 poddanego restrykcji tymi samymi enzymami.
Otrzymany konstrukt poddano mutagenezie in vitro, stosując układ Genome Priming (przy użyciu plazmidu donorowego pGPS2) sprzedawany przez New England Biolabs (MA, USA). Poddano selekcji klony mające wstawiony mini-transpozon (pochodzący z Tn7 i zawierający gen oporności na chloramfenikol). Wydzielono jeden klon zawierający wstawkę mini-transpozonu zlokalizowanoą w re34
PL 211 017 B1 gionie 5' oskrzydlającym D15/Omp85, 401 bp za miejscem EcoRl i zastosowano do dalszych badań. Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528-534) w celu:
(i) usunięcia powtórzonej sekwencji DNA (Tn7R) wytworzonej w procesie transpozycji, (ii) wstawienia meningokokowych sekwencji wychwytu wymaganych dla transformacji i (iii) wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie obcego materiału DNA takiego jak promotory.
Kołową PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy TnRD15-KpnI/XbaI + US (5'-CGC CGG TAC CTC TAG AGC CGT CTG AAC GAC TCG TGG ACA ACC C-3') i TnR03Cam(KpnI) (5'-CGC CGG TAC CGG CGC TAA CTA TAA CGG TC-3') zawierające sekwencje wychwytu i podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (Kpnl i Xbal).
Otrzymany fragment PCR oczyszczono na żelu, strawiono przy użyciu AspllS (izoschizomeru Kpnl) i ligowano do fragmentu DNA 184 bp zawierającego promotor porA i generowanego metodą PCR przy użyciu oligonukleotydów PorA-01 (5'-CGC CGG TAC CGA GGT CTG CGC TTG AAT TGT G-3') i PorA02 (5'-CGC CGG TAC CTC TAG ACA TCG GGC AAA GAC CCG-3') zawierających miejsca restrykcyjne Kpnl. Poddano selekcji rekombinacyjne klony mające promotor porA wstawiony w prawidłowym położeniu (transkrypcja zachodząca w kierunku EcoRl do Xbal) i zastosowano do transformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez polisacharydu otoczki (cps-) i jednego z głównych białek błony zewnętrznej - PorA (porA-).
Rekombinacyjne klony Neisseria meningitidis otrzymane z podwójnego crossing-over (badanie przesiewowe PCR przy użyciu oligonukleotydów Cam-05 (5'-GTA CTG CGA TGA GTG GCA GG-3') i proD15-52) poddano selekcji na pożywce GC zawierającej 5 μg/ml chloramfenikolu i analizowano ekspresję D15/Omp85.
Jak przedstawiono na figurze 10, w porównaniu ze szczepem macierzystym (cps-), w ekstraktach białka całkowitego ze szczepów Nm otrzymanych przez zastąpienie promotora wytwarzanie D15/Omp85 było znacznie zwiększone. Ten wynik zaobserwowano także, gdy analizowano pęcherzyki błony zewnętrznej wytworzone z tych samych szczepów (patrz figura 17). Te wyniki można przypisać zastąpieniu endogennego promotora D15 przez silny promotor porA.
Ponadto, nieoczekiwanie stwierdzono, że, kiedy promotor porA wprowadzono w przybliżeniu 400 bp przed kodonem inicjatorowym, to ekspresja była w przybliżeniu 50 razy większa, niż gdy promotor umieszczono w przybliżeniu 100 bp przed kodonem inicjatorowym.
Ogółem, te doświadczenia popierają tezę, że strategia zastąpienia promotora działa i umożliwia regulację w górę syntezy integralnych białek błony zewnętrznej w pęcherzykach błony zewnętrznej.
Pewne populacje ludzkie wydzielone geograficznie (takie jak Kuba) są zainfekowane przez ograniczoną liczbę izolatów Neisseiria meningitidis należących w znacznym stopniu do jednego lub kilku serotypów białek błony zewnętrznej. Jako że PorA stanowi główny antygen białkowy błony zewnętrznej, który może indukować ochronne i swoiste dla szczepu przeciwciała bakteriobójcze, to możliwe w takiej populacji może być uzyskanie ochrony szczepionką przy użyciu ograniczonej liczby serotypów porA.
Ponadto, PorA może oddziaływać z, albo stabilizować niektóre inne białka błony zewnętrznej. W tym kontekście, obecność PorA w pęcherzykach błony zewnętrznej może być korzystna, wzmacniając skuteczność szczepionki z takich pęcherzyków ulepszonych rekombinacyjnie.
Z tej przyczyny, pożądane może być regulowanie w górę ekspresji białka D15/Omp85 błony zewnętrznej w szczepie Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps, ale wyrażającym PorA. Genomowy DNA ekstrahowano z rekombinacyjnego szczepu cps-, porA-, D15/Omp85+ Neisseria meningitidis grupy surowiczej B przy użyciu zestawu QIAGEN Genomie Tips 100-G. 10 μg tego materiału zlinearyzowano i zastosowano do transformowania Neisseria meningitidis grupy surowiczej B cps- po klasycznej procedurze transformacji. Rekombinacyjne Neisseria otrzymano na płytkach agaru GC zawierających 5 μg/ml chloramfenikolu.
Integracje otrzymane z podwójnego crossing-over przed genem D15 przesiano metodą PCR, jak opisano poprzednio. Skoro rekombinacje homologiczne mogą wystąpić w chromosomie gdziekolwiek, przeprowadzono drugie badanie przesiewowe PCR dla kontroli integralności miejsca porA w szczepie rekombinacyjnym. W tym celu, w doświadczeniu przesiewowym PCR zastosowano wewnętrzne startery porA PPA1 (5- GCG GCC GTT GCG GAT GTC AGC G -3') i PpA2 (5- GGC ATA GGT GAT GCG TGG AAC TGC-3'). Amplifikacja fragmentu 1170 bp potwierdza obecność genu porA w bakteriach rekombinacyjnych.
PL 211 017 B1
Próbkę bakterii rekombinacyjnych (odpowiadającą około 5 · 108 bakterii) można ponownie zawiesić w 50 μl buforu PAGE-SDS, zamrosić (-20°C)/zagotować (100°C) trzy razy, a następnie oddzielić metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Żele można następnie zabarwić błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przenieść na błonę nitrocelulozową i sondować albo przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-porA albo przy użyciu króliczego przeciwciała poliklonalnego anty-D15/Omp85. Można także przeprowadzić analizę pęcherzyków błony zewnętrznej wytworzonych z tych samych szczepów.
P r z y k ł a d 11
Regulacja w górę antygenu białka Hsf w szczepie rekombinacyjnym Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps, ale wyrażającym PorA
Jak opisano wyżej, w pewnych krajach obecność PorA w pęcherzykach błony zewnętrznej może być korzystna i może wzmocnić skuteczność szczepionki z pęcherzyków ulepszonych rekombinacyjnie. W następującym przykładzie, twórcy zastosowali zmodyfikowany wektor pCMK(+) do regulacji w górę ekspresji antygenu białka Hsf w szczepie bez funkcjonalnych genów cps, ale wyrażającym PorA. Oryginalny wektor pCMK(+) zawiera chimeryczny promotor porA/lacO ulegający represji w gospodarzu E. coli wyrażającym laclq, ale transkrypcyjnie aktywny w Neisseria meningitidis. W zmodyfikowanym pCMK(+), natywny promotor porA zastosowano do kierowania transkrypcją genu hsf. Gen kodujący Hsf amplifikowano metodą PCR, stosując startery oligonukleotydowe HSF 01-WdeI i HSF 02-NheI, przedstawione w tabeli poniżej. Ze względu na sekwencję startera HSF 01-NdeI wyrażane białko Hsf będzie zawierać dwie reszty metioniny na 5' końcu. Warunki stosowane do amplifikacji PCR były takie, jak opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Cykle temperaturowe były następujące: 25 razy (94°C 1 min., 48°C 1 min., 72°C 3 min.) i 1 raz (72°C 10 min., 4°C aż do odzyskania). Odpowiedni amplikon z kolei sklonowane w odpowiednich miejscach restrykcyjnych wektora dostarczającego pCMK(+). W tym plazmidzie rekombinacyjnym, oznaczanym pCMK(+)-Hsf, lacO obecny w chimerycznym promotorze porA/lacO usunięto metodą rekombinacyjnej strategii PCR (patrz figura 12). Plazmid PCMK(+)-Hsf stosowany jako szablon di PCR amplifikuje 2 oddzielne fragmenty DNA:
- fragment 1 zawiera region 5' rekombinogenny porA, gen oporności na kanamycynę i promotor porA. Stosowane startery oligonukleotydowe, RPl (SacII) i RP2, są przedstawione w tabeli poniżej. Starter RPl jest homologiczny z sekwencją tuż przed operatorem lac;
- fragment 2 zawiera sekwencję Shine-Dalgarno z genu porA, gen hsf i region 3' rekombinogenny porA. Stosowane startery oligonukleotydowe, RP3 i RP4 (ApaI) są przedstawione w tabeli poniżej.
Starter RP3 jest homologiczny z sekwencją tuż za operatorem lac. 3' koniec fragmentu 1 i 5' koniec fragmentu 2 mają 48 nakładających się zasad. Po 500 ng każdej PCR (1 i 2) użyto do końcowej reakcji PCR, stosując startery RP1 i RP4. Końcowy otrzymany amplikon subklonowano w wektorze pSL1180 poddanym restrykcji przy użyciu SacII i Apal. Zmodyfikowany plazmid pCMK(+)-Hsf oczyszczono w dużej skali, stosując zestaw QIAGEN maxiprep i 2 μg tego materiału zastosowano do transformowania szczepu Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps (szczep opisany w przykładzie 1). W celu zachowania ekspresji porA, integrację otrzymaną z pojedynczego crossing-over poddano selekcji przez połączenie procedur przesiewowych PCR i Western blot. Klony oporne na kanamycynę o dodatnich wynikach testów dla PCR specyficznej wobec porA i Western blot przechowywano w temperaturze -70°C jako roztwór podstawowy w glicerynie i zastosowano do dalszych badań. Próbkę bakterii (odpowiadającą około 5 · 108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 pi buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Ekspresję Hsf sprawdzono w lizatach bakteryjnych z całych komórek (WCBL) pochodzących z NmB [Cps-, PorA+] lub NmB [Cps-, PorA+, Hsf+]. Barwienie Coomassie wykryło znaczący wzrost ekspresji Hsf (w odniesieniu do poziomu Hsf endogennego) (patrz na figurze 13). Ten wynik potwierdza, że zmodyfikowany wektor pCMK(+)-Hsf jest funkcjonalny i może być stosowany pomyślnie do regulacji w górę ekspresji białek błony zewnętrznej, bez zniesienia wytwarzania głównego antygenu białkowego PorA błony zewnętrznej.
Oligonukleotydy zastosowane w tej pracy
Oligonukleotydy Sekwencja Uwaga(i)
1 2 3
Hsf 01-Nde 5'-GGA ATT CCA TAT GAT GAA ChA AAT ATA CCG C-3' miejsce klonowania Ndel
PL 211 017 B1 cd. tabeli
1 2 3
Hsf 02-Nhe 5'-GTA GCT AGC TAG CTT ACC ACT GAT AAC CGA C-3' miejsce klonowania Nhe I
GFP-mut-Asn 5'-AAC TGC AGA ATT AAT ATG AAA GGA GAA GAA CTT TTC-3' miejsce klonowania Asnl zgodne z Ndel
GFP-Spe 5'-GAG ATA CTA GTT TAT TTG TAG AGC TCA TCC ATG-3' miejsce klonowania Spel zgodne z Whel
RP1 (SacII) 5'-TCC CCG CGG GCC GTG TGA ATA CAT CCG GTC-3' miejsce klonowania SacII
RP2 5'-CAT ATG GGC TTG CTT TTG TAA ATT TGA GGG GAA AGA CCC GAT ACG TCT TCA-3'
RP3 5'-AGA CGT ATC GGG TGT TTG CCC TCA AAT TTA CAA AAG GAA GCC CAT ATG-3'
RP4 (Apal) 5'-GGG TAT TCC GGG CCC TTG AGA CGG CGG AGC AGG-3' miejsce klonowania Apal
P r z y k ł a d 12
Ekspresja białka fluoryzującego na zielono w szczepie rekombinacyjnym Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps, ale wyrażającym PorA
W następującym przykładzie, wektor pCMK zastosowano do testowania ekspresji cytoplazmatycznego białka heterologicznego w Neisseria meningitidis. Białko fluoryzujące na zielono (GFP) amplifikowano z plazmidu pKen-Gfpmut2 ze starterami GFP-Asn-mut2 i GFP-Spe (patrz tabela w przykładzie 11). Asnl daje lepkie końce zgodne z Ndel, Spel daje lepkie końce zgodne z Nhel. Warunki stosowane do amplifikacji PCR były takie, jak opisane przez dostawcę (polimeraza DNA HiFi, Boehringer Mannheim, GmbH). Cykle temperaturowe były następujące: 25 razy (94°C 1 min, 48°C 1 min, 72°C 3 min) i 1 raz (72°C 10 min, 4°C aż do odzyskania). Odpowiedni amplikon sklonowane w wektorze wprowadzającym pCMK(+) strawionym enzymami restrykcyjnymi Ndel i Nhel. W tym plazmidzie rekombinacyjnym, oznaczonym pCMK(+)-GFP, metodą strategii rekombinacyjnej PCR usunięto lacO obecny w chimerycznym promotorze porA/lacO. Plazmid PCMK(+)-GFP stosowano jako szablon do amplifikacji PCR 2 oddzielnych fragmentów DNA:
- fragment 1 zawierał region 5' rekombinogenny porA, gen oporności na kanamycynę i promotor porA. Stosowano startery oligonukleotydowe, RP1 (SacII) i RP2 (patrz tabela w przykładzie 11). Starter RPl jest homologiczny z sekwencją tuż przed operatorem lac;
- fragment 2 zawiera sekwencję Shine-Dalgarno PorA, gen gfp i region 3' rekombinogenny porA. Stosowane startery oligonukleotydowe, RP3 i RP4 (ApaI), są przedstawione w tabeli w przykładzie 11. Starter RP3 jest homologiczny z sekwencją tuż za operatorem lac.
3' koniec fragmentu 1 i 5' koniec fragmentu 2 mają 48 nakładających się zasad. Po 500 ng każdej PCR (1 i 2) użyto do końcowej reakcji PCR, stosując startery RP1 i RP4. Dwadzieścia μg tego fragmentu PCR zastosowano do transformowania szczepu Neisseiria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnych genów cps.
Transformacja liniowym DNA jest mniej skuteczna, niż kołowym plazmidem DNA, ale wsystkie otrzymane rekombinanty uległy podwójnemu crossing-over (co potwierdzono kombinacją procedur przesiewowych PCR i Western blot). Klony oporne na kanamycynę przechowywano w temperaturze -70°C jako roztwór podstawowy w glicerynie i zastosowano do dalszych badań. Próbkę bakterii (odpowiadającą około 5 · 108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 μl buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu.
Ekspresję GFP sprawdzono w lizatach bakteryjnych z całych komórek (WCBL) pochodzących z NmB [Cps-, PorA+] lub NmB [Cps-, PorA-, GFP+]. Barwienie Coomassie wykryło ekspresję GFP nieobecnego w szczepie biorcy Neisseria meningitidis (patrz figura 14).
P r z y k ł a d 13
Regulacja w górę genu NspA z N. meningitidis grupy surowiczej B przez zastąpienie promotora
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu NspA przez silny promotor porA, w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu NspA. W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (924 bp)
PL 211 017 B1 umiejscowiony przed genem kodującym NspA został odkryty (SEKW. ID. NR: 7) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq zawierającej niedokończone sekwencje DNA genomowego szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Fragment DNA (675 bp) obejmujący nukleotydy -115 do -790 w odniesieniu do kodonu startowego (ATG) genu NspA amplifikowano metodą PCR, stosując oligonukleotydy PNS1' (5'-CCG CGA ATT CGA CGA AGC GGC CCT CGA C-3') i PNS2 (5'-CGT CTA GAC GTA GGG GTA TCC GGC TGC-3') zawierające odpowiednio miejsca restrykcyjne EcoRl i Xbal (podkreślone). Fragment PCR poddano restrykcji przy użyciu EcoRl i Xbal i wstawiono do pUC18. Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer (1992), Biotechniques 12: 528-534) w celu wstawienia meningokokowych sekwencji wychwytu wymaganych dla transformacji i odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie kasety promotorowej CmR/PorA.
Kołową PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy BAD01-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GCT TAT CGA TGG AAA ACG CAG C-3') i BAD02-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTT CAG ACG GGG GGC TTA TAT AGT GGA TTA AC-3') zawierające sekwencje wychwytu i podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (Xmal i Xhol). Otrzymany fragment PCR oczyszczono na żelu i strawiono przy użyciu Xhol.
Kasetę promotorową CmR/PorA amplifikowano z poprzednio opisanego plazmidu pUC D15/Omp85, stosując startery oligonukleotydowe BAD 15-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GTG TAG ACA TCG GGC AAA GAC CCG-3') i BAD 03-2 (5'-GGC GCC CGG GCT CGA GCA CTA GTA TTA GCC TGT TAT CCC-3') zawierające podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (Xmal, Xbal, Spel i Xhol). Otrzymany fragment PCR poddano trawieniu i wstawiono do kołowego plazmidu PCR strawionego odpowiednimi enzymami. 10 μq rekombinacyjnego plazmidu zlinearyzowano i użyto do transformowania szczepu Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez polisacharydu otoczki (cps-) i jednego z głównych białek błony zewnętrznej - PorA (porA-).
Rekombinacyjne klony Neisseria meningitidis otrzymane z podwójnego crossing-over (przesiewanie PCR przy użyciu oligonukleotydów BAD 25 (5'-GAG CGA AGC CGT CGA ACG C-3') i BAD08 (5'-CTT AAG CGT CGG ACA TTT CC-3')) poddano selekcji na płytkach agarowych GC zawierających 5 μg/ml chloramfenikolu i analizowano ekspresję NspA. Próbkę bakterii rekombinacyjnych (odpowiadającą około 5 · 108 bakterii) ponownie zawieszono w 50 μl buforu PAGE-SDS, zamrożono (-20°C)/zagotowano (100°C) trzy razy, a następnie oddzielono metodą elektroforezy PAGE-SDS na 12,5% żelu. Następnie żele zabarwiono błękitem brylantowym Coomassie R250 lub przeniesiono na błonę nitrocelulozową i sondowano albo przy użyciu przeciwciała monoklonalnego anty-PorA lub przy użyciu przeciwciała poliklonalnego anty-NspA (figura 17). Podobnie jak dla Omp85, uzyskano niespodziewane wskazanie, że insercja promotora w przybliżeniu 400 bp przed kodonem lnicjatorowym NspA wyraża więcej białka niż w razie umieszczenia w przybliżeniu 100 bp przed kodonem inicjatorowym.
Ten sam rekombinacyjny plazmid pUC można zastosować do regulacji w górę ekspresji NspA w szczepie Neisseria meningitidis grupy surowiczej B bez funkcjonalnego genu cps, ale wciąż wyrażającym PorA.
P r z y k ł a d 14
Regulacja w górę genu pldA (omplA) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B przez zastąpienie promotora
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu pldA (omplA) przez silny promotor porA w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu PldA (OmplA1). W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (373 bp) umiejscowiony przed sekwencją kodującą pldA został odkryty (SEKW. ID. NR: 18) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Ten DNA zawiera sekwencję kodującą próbny gen rpsT. Kodon stop rpsT jest umiejscowiony 169 bp przed ATG pldA. Dla uniknięcia przerwania tego potencjalnie ważnego genu, twórcy zdecydowali, żeby wstawić kasetę promotorową CmR/PorA tuż przed ATG pldA. W tym celu, fragment DNA wielkości 992 bp odpowiadający genowi rpsT, sekwencji międzygenowej 169 bp i pierwszym 499 nukleotydom genu pldA amplifikowano metodą PCR z DNA genomowego Neisseria meningitidis grupy surowiczej B, stosując oligonukleotydy PLA1 Amo5 (5'-GCC GTC TGA ATT TTA AAT TGC GCG TTT ACA G-3') i PLA1 Amo3 (5'-GTA GTC TAG ATT CAG ACG GCG CAA TTT GGT TTC CGG AC-3') zawierające sekwencje wychwytu (podkreślone). PLA1 Amo3 zawiera także miejsce restrykcyjne Xbal. Ten fragment PCR oczyszczono stosując zestaw High Pure Kit (Roche, Mannheim, Niemcy) i sklonowane bezpośrednio do wektora pGemT (Promega, USA). Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR
PL 211 017 B1 (Jones i Winistofer (1992)) w celu wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie kasety promotorowej CmR/PorA.
Kołową PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy CIRC1-Bgl (5'CCT AGA TCT CTC CGG CCC CGA TTG TGG-3 ') i albo CIRC1-XH-RBS/2 (5'-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA ATA TAC GGA ATA TGC G-3'), albo CIRC2-XHO/2 (5'-CCG CTC GAG ATG AAT ATA CGG AAT-3'), zawierające podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (Bglll i Xhol).
Kasetę promotorową CmR/PorA amplifikowano z poprzednio opisanego plazmidu pUC D15/Omp85, stosując startery BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT GAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') i CM-PORA-3 (5'-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GC-3') zawierające podkreślone przydatne miejsca restrykcyjne (Bglll i Xhol). Ten fragment PCR sklonowane w kołowym plazmidzie PCR otrzymanym przy użyciu starterów CIRC1-Bgl i CIRC1-XH-RBS/2. Ten plazmid można zastosować do transformowania szczepów (cps-) i (cps- porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed pldA skieruje wstawkę promotora porA bezpośrednio przed ATG pldA.
Inną kasetę amplifikowano z DNA genomowego rekombinacyjnej Neisseria meningitidis grupy surowiczej B (cps-,porA-, D15/Omp85+) nadmiernie wyrażającej D15/Omp85 przez zastąpienie promotora. Ta kaseta zawiera gen cmR, promotor porA i 400 bp odpowiających sekwencji oskrzydlającej 5' genu D15/Omp85. Ta sekwencja okazała się skuteczna do regulacji w górę ekspresji D15/Omp85 w Neisseria i zostanie przetestowana na możliwość regulacji w górę ekspresji innych antygenów Neisseria. Startery stosowane do amplifikacji to BAD 20 i CM-PORA-D15/3 (5'-CGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3') zawierające miejsca restrykcyjne Xhol (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowano w kołowym plazmidzie PCR otrzymanym przy użyciu starterów CIRCl-Bgl i CIRC2-XHO/2. Ten plazmid zostanie użyty do transformowania szczepów (cps-) i (cps-, porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed pldA skieruje wstawkę promotora porA 400 bp przed ATG pldA.
P r z y k ł a d 15
Regulacja w górę genu tbpA N. meningitidis grupy surowiczej B przez zastąpienie promotora
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu tbpA przez silny promotor porA, w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu TbpA. W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (731 bp) umiejscowiony przed sekwencją kodującą tbpA został odkryty (SEKW. ID. NR: 17) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Ten DNA zawiera sekwencję kodującą antygen TbpB. Geny są zorganizowane w operonie. Gen TbpB zostanie usunięty i zastąpiony przez kasetę promotorową CmR/porA. W tym celu, fragment DNA wielkości 3218 bp odpowiadający 509 bp regionu oskrzydlającego 5' genu tbpB, 2139 bp sekwencji kodującej tbpB, 87 bp sekwencji intergenowej i 483 pierwszym nukleotydom sekwencji kodującej tbpA amplifikowano metodą PCR z DNA genomowego Neisseria meningitidis grupy surowiczej B, stosując oligonukleotydy BAD16 (5'GGG GTA GCT AGC CGT CTG AAG CGA TTA GAG TTT CAA AAT TTA TTC-3') i BAD17 (5'-GGC CAA GCT TCA GAC GGC GTT CGA CCG AGT TTG AGC CTT TGC-3') zawierające sekwencje wychwytu oraz miejsca restrykcyjne Whel i Hindlll (podkreślone). Ten fragment PCR oczyszczono stosując zestaw High Pure Kit (Boerhinger Mannheim, Niemcy) i sklonowane bezpośrednio do wektora w pGemT (Promega, USA). Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer (1992)) w celu (i) wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie kasety promotorowej CmR/PorA i (ii) usunięcia 209 bp sekwencji oskrzydlającej 5' tbpB i sekwencji kodującej tbpB.
Kołową PCR przeprowadzono stosując oligonukleotydy BAD 18 (5'-TCC CCC GGG AAG ATC TGG ACG AAA AAT CTC AAG AAA CCG-3') i BAD 19 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG CAA ATT TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGC AAC AGC AAG ATT TGT TCC G-3') zawierające przydatne miejsca restrykcyjne Xmal, Bglll i Xhol (podkreślone).
Kasetę promotorową CmR/PorA amplifikowano z poprzednio opisanego plazmidu pUC D15/Omp85, stosując startery BAD21 (5'-GGA AGA TCT CCG CTC GAG ACA TCG GGC AAA CAG GCG-3') i BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT GAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') zawierające przydatne miejsca restrykcyjne Xmal, Spel, Bglll i Xhol (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowane w kołowym plazmidzie PCR. Ten plazmid zostanie użyty do transformowania szczepów (cps-)
PL 211 017 B1 i (cps-porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed tbpA skieruje insereję promotora porA bezpośrednio przed ATG tbpA.
P r z y k ł a d 16
Regulacja w górę genu pilQ z Neisseria meningitidis grupy surowiczej B gene przez zastąpienie promotora
Celem doświadczenia było zastąpienie endogennego regionu promotorowego genu pilQ przez silny promotor porA, w celu regulacji w górę wytwarzania antygenu PilQ. W tym celu skonstruowano plazmid promotora zastępczego, stosując metodologie klonowania E. coli. Region DNA (772 bp) umiejscowiony przed genem kodującym pilQ został odkryty (SEKW. ID. NR: 12) w prywatnej bazie danych Incyte PathoSeq szczepu Neisseria meningitidis ATCC 13090. Ten DNA zawiera sekwencję kodującą antygen PilP. Gen PilQ stanowi część operonu, którego twórcy nie chcieli zaburzyć, gdyż piliny są zasadniczo ważnymi elementami bakterii. Kasetę promotorową CmR/porA wprowadzono przed genem pilQ zgodnie z taką samą strategią, jak opisano dla regulacji w górę ekspresji genu pldA. W tym celu, fragment DNA wielkości 8 66 bp odpowiadający części 3' sekwencji kodującej pilP, 18 bp sekwencji intergenowej i 392 pierwszym nukleotydom genu pilQ amplifikowano metodą PCR z DNA genomowego Neisseria grupy surowiczej B, stosując oligonukleotydy PQ-rec5-Nhe (5'-CTA GCT AGC GCC GTC TGA ACG ACG CGA AGC CAA AGC-3') i PQ-rec3-Hin (GCC AAG CTT TTC AGA CGG GAC GGT ATC GTC CGA TTC G-3') zawierające sekwencje wychwytu oraz miejsca restrykcyjne Whel i Hindlll (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowane bezpośrednio w wektorze pGemT (Promega, USA). Ten plazmid poddano kołowej mutagenezie PCR (Jones i Winistofer (1992)) w celu wstawienia odpowiednich miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie kasety promotorowej CmR/PorA.
Kołową PCR przeprowadzono, stosując oligonukleotydy CIRC1-PQ-Bgl (5'-GGA AGA TCT AAT GGA GTA ATC CTC TTC TTA-3') i albo CIRC1-PQ-XHO (5'-CCG CTC GAG TAC AAA AGG AAG CCG ATA TGA TTA CGA AAC TGA CAA AAA TC-3') albo CIRC2-PQ-X (5'-CCG CTC GAG ATG AAT ACC AAA GTG ACA AAA ATC-3') zawierające przydatne miejsca restrykcyjne Bglll i Xhol (podkreślone).
Kasetę promotorową CmR/PorA amplifikowano z poprzednio opisanego plazmidu pUC D15/Omp85, stosując startery BAD20 (5'-TCC CCC GGG AGA TCT CAC TAG TAT TAC CCT GTT ATC CC-3') i CM-PORA-3 (5'-CCG CTC GAG ATA AAA ACC TAA AAA CAT CGG GCA AAC ACC C-3') zawierające przydatne miejsca restrykcyjne Bglll i Xhol (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowane w kołowym plazmidzie PCR otrzymanym przy użyciu starterów CIRC1-PQ-Bgl i CIRC1-PQ-XHO. Ten plazmid można zastosować do transformowania szczepów (cps-) i (cps-, porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed pilQ skieruje wstawkę promotora porA bezpośrednio przed ATG pilQ.
Inną kasetę amplifikowano z genomowego DNA rekombinacyjnej Neisseria meningitidis grupy surowiczej B (cps-, porA-, D15/Omp85+) nadmiernie wyrażającej D15/Omp85, przez zastąpienie promotora. Ta kaseta zawiera gen cmR, promotor porA i 400 bp odpowiadających sekwencji oskrzydlającej 5' gen D15/Omp85. Ta sekwencja okazała się skuteczna do regulacji w górę ekspresji D15/Omp85 w Neisseria meningitidis i zostanie przetestowana na okoliczność regulacji w górę ekspresji innych antygenów Neisseria. Starterami stosowanymi do amplifikacji były BAD 20 i CM-PORA-D153 (5'-GGG CTC GAG TGT CAG TTC CTT GTG GTG C-3') zawierające miejsca restrykcyjne Xhol (podkreślone). Ten fragment PCR sklonowane w kołowym plazmidzie PCR otrzymanym przy użyciu starterów CIRC1-PQ-Bgl i CIRG2-PQ-X. Ten plazmid można zastosować do transformowania szczepów (cps-) i (cps-, porA-) Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Integracja przez podwójne crossing-over w regionie przed pilQ skieruje wstawkę porA 400 bp przed ATG pilQ.
P r z y k ł a d 17
Konstruowanie kasety kanR/sacB do wprowadzania „czystych”, nie znakowanych mutacji w chromosomie N. meningitidis
Celem doświadczenia jest skonstruowanie wszechstronnej kasety DNA zawierającej marker wybieralny do dodatniego przesiania rekombinacji w chromosomie Neisseria meningitidis (tj. gen kanR) i marker przeciwwybieralny do usunięcia kasety z chromosomu po rekombinacji (tj. gen sacB). Tym sposobem, jakikolwiek heterologiczny DNA wprowadzony podczas rekombinacji homologicznej zostanie usunięty z chromosomu Neisseria.
Fragment DNA zawierający gen neoR i gen sacB wyrażany pod kontrolą swojego własnego promotora otrzymano przez restrykcję plazmidu pIB 279 (Blomfield I. G., Vaughn V., Rest R. F., Eisenstein B. I. (1991), Mol. Microbiol. 5: 1447-57) przy użyciu enzymu restrykcyjnego BamHl. Wektor bior40
PL 211 017 B1 ca pochodził z plazmidu pCMK, opisanego poprzednio. Gen kanR został usunięty z pCMK metodą restrykcji enzymami Nrul i EcoRV. Ten plazmid nazwano pCMKs. Kasetę neoR/sacB wstawiono do pCMKs w miejscu restrykcyjnym Bglll zgodnym z końcami BamHl.
E. coli zawierająca plazmid nie jest zdolna do wzrostu w obecności 2% sacharozy w pożywce, co potwierdza funkcjonalność promotora sacB.
Ten plazmid zawiera sekwencje rekombinogenne umożliwiające insercję kasety w miejscu porA w chromosomie Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Rekombinacyjne Neisseria otrzymano na płytkach agarowych GC zawierających 200 μg/ml kanamycyny. Niestety, promotor sacB nie był funkcjonalny w Neisseria meningitidis: nie zaobserwowano różnicy wzrostu na płytkach agarowych GC zawierających 2% sacharozy.
Skonstruowano nową kasetę zawierającą gen sacB pod kontrolą promotora kanR. Kołową PCR przeprowadzono stosując jako szablon plazmid pUC4K ((Amersham Pharmacia Biotech, USA)) oraz oligonukleotydy CIRC-Kan-Nco (5'-CAT GCC ATG GTT AGA AAA ACT CAT CGA GCA TC-3') i CIRC-Kan-Xba (5'-CTA GTC TAG ATC AGA ATT GGT TAA TTG GTT G-3') zawierające Ncol i Xial miejsca restrykcyjne (podkreślone).
Otrzymany fragment PCR oczyszczono na żelu, strawiono przy użyciu Ncol i ligowano do genu sacB wytworzonego przez PCR z plazmidu pIB279 przy użyciu oligonukleotydu SAC/NCO/NEW5 (5' CAT GCC ATG GGA GGA TGA ACG ATG AAC ATC AAA AAG TTT GGA A-3') zawierającego miejsce restrykcyjne Ncol (podkreślone) i RBS (wytłuszczone) i oligonukleotydu SAC/NCO/NEW3 (5'-GAT CCC ATG GTT ATT TGT TAA GTG TTA ATT GTC-3') zawierającego miejsce restrykcyjne Ncol (podkreślone).
Można testować czułość rekombinacyjnych klonów E. coli na płytkach agarowych zawierających 2% sacharozy. Nową kasetę kanR/sacB można subklonować w pCMKs i zastosować do transformowania szczepu cps- Neisseria meningitidis grupy surowiczej B.
Nabyta wrażliwość na sacharozę zostanie potwierdzona u Neisseria. Plazmid PCMKs będzie stosowany do transformowania rekombinacyjnej kanR/SacB Neisseria dla usunięcia całej kasety wprowadzonej w chromosomie w miejscu porA. Czysta rekombinacyjna Neisseria zostanie otrzymana na płytkach agarowych GC zawierających 2% sacharozy.
P r z y k ł a d 18
Zastosowanie małych sekwencji rekombinogennych (43 bp) dla umożliwienia rekombinacji homologicznej w chromosomie Neisseria meningitidis
Celem doświadczenia jest zastosowanie małych sekwencji rekombinogennych (43 bp) do sterowania insercjami, modyfikacjami lub delecjami w chromosomie Neisseria. Osiągnięcie tego doświadczenia ogromnie ułatwi przyszłą pracę, w sensie uniknięcia etapów subklonowania sekwencji homologicznych w E. coli (sekwencje rekombinogenne wielkości 43 bp można łatwo dodać w starterze amplifikacji PCR).
Gen kanR amplifikowano metodą PCR z plazmidu pUC4K z oligonukleotydem Kan-PorA-5 (5'-GCC GTC TGA ACC CGT CAT TCC CGC GCA GGC GGG AAT CCA GTC CGT TCA GTT TCG GGA AAG GCA CGT TGT GTC-3') zawierającym 43 bp homologiczne do sekwencji oskrzydlającej 5' gen porA NmB (wytłuszczone) oraz sekwencję wychwytu (podkreślone) i Kan-PorA-3 (5'-TTC AGA CGG CGC AGC AGG AAT TTA TCG GAA ATA ACT GAA ACC GAA CAG ACT AGG GTG AGG TCT GCC TCG-3') zawierającym 43 bp homologiczne do sekwencji oskrzydlającej 3' gen porA NmB (wytłuszczone) i sekwencję wychwytu (podkreślone).
Otrzymany fragment DNA 1300 bp sklonowane w wektorze pGemT (Promega, USA). Ten plazmid można zastosować do transformowania szczepu cps- Neisseria meningitidis grupy surowiczej B. Rekombinacyjne Neisseria zostaną otrzymane na płytkach GC zawierających 200 μg/ml kanamycyny. Integracje otrzymane z podwójnego crossing-over w miejscu porA będą badane przesiewowe PCR, przy użyciu starterów PPAl i PPA2, jak opisano poprzednio.
P r z y k ł a d 19
Czynna ochrona myszy immunizowanych WT i rekombinacyjnymi pęcherzykami Neisseria meningitidis
Zwierzęta immunizowano trzy razy (drogą śródotrzewnową) przy użyciu 5 μg rozmaitych OMV zaadsorbowanych na Al(OH)3 w dniach 0, 14 i 28. Krew pobierano dnia 28 (dzień 14 po II) i 35 (dzień 7 po III) i zwierzęta poddano prowokacji w dniu 35 (drogą śródotrzewnową). Dawka prowokująca wynosiła 20 x LD50 (~107 jednostek tworzenia kolonii/mysz). Śmiertelność monitorowano przez 7 dni po prowokacji.
PL 211 017 B1
Wstrzykiwanymi OMV były:
Grupa 1: pęcherzyki Cps-, PorA+
Grupa 2: pęcherzyki Cps-, PorAGrupa 3: pęcherzyki Cps -, PorA-, NspA+
Grupa 4: pęcherzyki Cps-, PorA-, Omp85+
Grupa 5: pęcherzyki Cps-, PorA-, Hsf+
Figura 15 ilustruje wzór tych OMV uzyskany metodą SDS-PAGE.
Po 24 godzinach od prowokacji, śmiertelność wynosiła 100% (8/8) w ujemnej grupie kontrolnej (immunizowanej samym Al(OH)3), podczas gdy myszy immunizowane 5 różnymi preparatami OMV były wciąż żywe (przeżywało 7 do 8/8 myszy).
Przez 7 dni monitorowano także chorobę i myszy immunizowane pęcherzykami o nadmiernej ekspresji NspA wydawały się mniej chore niż inne grupy.
PorA obecny w pęcherzykach PorA+ prawdopodobnie nadaje rozległą ochronę przeciwko infekcji przez szczep homologiczny.
Jednak, ochrona indukowana przez pęcherzyki o regulowanej w górę ekspresji PorA jest prawdopodobnie, co najmniej w pewnym stopniu, skutkiem obecności zwiększonej ilości NspA, Omp85 lub Hsf.
P r z y k ł a d 20
Immunogenność pęcherzyków rekombinacyjnych zmierzona testami ELISA dla całych komórek i specyficznymi
W celu zmierzenia zdolności przeciwciał do rozpoznawania antygenów obecnych na powierzchni komórek MenB, zebrane razem surowice myszy (z przykładu 19) testowano metodą ELISA dla całych komórek (stosując komórki inaktywowane tetracykliną) i miana wyrażano jako miana punktów środkowych.
Wszystkie typy przeciwciał pęcherzykowych indukowały wysokie miano przeciwciał, zaś ujemna próba kontrolna była wyraźnie ujemna.
Pęcherzyk WCE (H44/76) miano punktu środkowego
14P2 14P3
CPS(-) Pora (+) 23849 65539
CPS(-) Pora (-) 20130 40150
CPS (-) Pora (-) NSPA (+) 8435 23846
CPS (-) Pora (-) OMP85 (+) 4747 16116
CPS (-) Pora (-) HSF (+) 6964 22504
(-) 51 82
Zbadano specyficzną odpowiedź przeciwciał na dostępne białko rekombinacyjne HSF. Mikropłytki pokryto cząsteczkami HSF o pełnej długości, 1 pg/ml.
Wyniki zobrazowane na figurze 16 pokazują, że następowała dobra swoista odpowiedź HSF, gdy OMV nadmiernie wyrażające HSF zastosowano do immunizowania myszy (stosując oczyszczony rekombinacyjny HSF na płytkach).
Pęcherzyki o nadmiernej ekspresji HSF indukują dobry poziom przeciwciał specyficznych.
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 1
Sekwencja nukleotydowa wektora pCMK(+)
TCTTCCGCITCCTCGCTCACTQACTO3CTGCGCTCWTCGTrCGGCTW3GCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAACGCGCT
AATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTA
AAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTnTGCATAGGCrCCGCCCCCCrGACGAGCATCACAAAAATCGACGCYCAAGTGAGAGG
TGGCGAAACCCGACAGGP.CTATAAAGATACCAGGCGTTrCCCCrimAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCrGTTCCGACCCT
GCCGGTTACXXX^TACCnGTCCOCCTrKYCCCTTCGGGZV\Ga3TGGa3CITrCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATGTCA
GTTCGGTGTAGCTCGITa3CTCCAAGCia3GCTCTGIGCACGAACCCCCCGTrCAGCCCGACCGCTCCGCGrrATCCGGT
AACTATCGTCTIGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTrATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGC
GAGGTATGTAGGCGGIGCrACAGAGTTCITGAAGIGGrGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATriGGTATCT
GCGCTCTGGIGAAGCCAGTTACCTrCGGAAAAAGAGTIGGTAGCTGTrGATCCGGCAAACAAACCAGGGCTGGTAGCGGT
TGACGCTCAGIGGAACGAAAACTCACniTAAGGGATITIGGTCATGAGATrATCAAAAAGGATGrTCACOTAGATCCTrT
TAAATTAAAAATCAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTA7\ACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCrr?ATCAGT
GAGGCACCTATGTCAGCGATCIGTCTATIYCGTTCATCCATAGTTGCCIGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTAGGATACG
GGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTrATCAGCAATAA
ACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCnGCAACnTrATCCGCCTCCATCCAGTCrATrAATTGTTGCCGG
- GAAGCTAGAGrAAGTAGIYCI^CAGITAATAGTTTGCGCAACGITGTTGCCATTGCrACAGGCATCCTGGIGTCACGCrC
GTCOTTTGGTATGGCTTCAIYCAGCIGCGGITCCCAACGATCAAGGCGAGITACATGATCCCCCATCTrGTGCAAAAAAG
0 CGGTTAGCTCCITCGGTCCTCCGATCGTrGTCAGAAGTAAGTrGGCCGGAGTCTrATCACrrCATGGTTATGGCAGCACTG
CATAAITCTCTrACTGTCAIGCCATCCCTAAGAIGCTriYCTGrGACIGGIGAGTACTCAACCAAGTCATTGIOAGAATA
GIGTATGa3GCGACO3AGIYGCYCrrGCCCGGGGTCAATACGGGATAATACO3CGCCACATAGCAGAACTn?AAAAGIGC
TCATCAITGGAAAACGTTGITCC3GGGCGAAAACTCTCAAGGATCTrACCGCTGTraAGA.TCCAGTrcGATGTAACCCAGr
CGTGCACCCAAGIGATGłYCAGCATCTTrrACTTrCACCAGCGTITCrGGGTGAGCAAAAACAGaAAGGCAAAAlGCCGC
5 AAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAAIGITGAATACTCATAOTCTTGCITTITCAATATrATrGAAGCAITTATCAGG
GTTATrGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATrrAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGA
AAAGTGCCACCrGACGrCTAAGAAACCATrATrATGAIGACATrAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCGITrCG
TCTCGCGCGTITCGGTGATGACGGTGA7\AACCTCTGACACATGCAGGrcCCGGAGACGGTCACAGCTrGTCTGTAAGCGG
ATCCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTCTCGGGGCIGGCITAACTAIGCGGCATCA
PL 211 017 B1
Ci.GCTCi.rmTTiACCTiATAGGCCG^JATCGGCAAAATCCCTTATAAATCASAAGMi.TAGCCCGAaATAGGGTTCAGTG
TTCITCCAGITraGAACAAGAGTCCACTAnAAAGAACGlGGACTCCAACSICAAAGGGCGAAAAACGGTCTATCAGGGC
GATGGCCCACTACGTCAACCATCACCCAAiTCAi.CTnnTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAA
AGGGAGCCCCCGATITAGAGCITGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGOGG
GCGCTAGGGCGCIOGCAAGTGTAGCGGTCA.CGCTSCGCGTilACCACCACACCCGCCGCGCITAATGCECCGCTACAGGGC
GCGTACTATGGTIGCrrroACGTATGCGGTGTGAAATACCC-CACAGATGCCTAAGGACffAAATACCOCATCAjSGCGCCAT
TCGCCAITCAGGCIGCGCAACTOTIGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTICGCrATTACGCCAGCIGGCGAAAGGGGG ?JCTCCTCCA?CGCGATTAAGITGGGTAACOCC«3GGTTrTCCCAGTCACGACGTP3TAAiA.CGACGGCCAGTCCCAAi3C
TIGCCGTCIOAATAGATCCCGTCATrCCTCAAAAACAGAAAACCAAAATCAGAAACCTAAAATCCCGTCATTCCCGCGCA
GGCGGGAATCO\GTCCGTTCAGTlTCHGTakITia2GATAAAnGClOCTGCITITOaTICTAGATrCCCACTTTCGTG
TGACGGCTGTAGATGCCCGATGGTCTTTATAGCGGATIAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAAGCaGCAGACACTACAG
ATAGTACGGAACCGATrCAC.TK3GTGCITCAGCACCTTAGAGAATCGTrCTCnmGAGCTAAO3CGa.t3GCTACGCCGTAC
AGCOCATCGGCCCGCACGAGGTCTCIOGAGTCGCGAGCATCAAGGGCOiA.rTCrGCACKKGGGGGGGGaAAAGCCACGTI
GTGTCTCAAAATCrOTGATGTrACATTGCACZ^AGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACrGTCrGCTrACATAAA
CAGTAATACAAGGGGIGTTATGAGCCATAITCAACGGGAAACGTCTTGCrCGAGGCCGCGATTAAATrCCAACATOGAIG
CTGATITATATGGGTATAAATGGGCrCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGATTGTATGGGAAGCCC
0 GATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGrrCAGACIAAACPG
KTGACGCAATTrATCCCTCTrCCGACCATCftAGCATTITATCCGTACrCCTCATCATGCATCGTIACTCACCACTGCGA
TCCCCGGGAAĄACAGCATTCGAGGTATTAGiAGAATATCCTCATICAGGTGAAAATATroTTGATGCECTGGCAGTGTTC
CIGCGCCGGITGCAITCGATTCCIGITrGTAATIOTCCTITTAACAGCGATCGCGIATrrCGTCTCGCTCAGGCGCAATC
ACGAATGAATAACGGTITGGTrGATGCGAGTGATITrGATOACGAGCGTAATGGCTGGCCTGITGAACAAGTCrGGAAAG
5 AAATCCATAAGClTITCCCAITCTCACCKGATTCAGTOGTCACTCAIGCTGAITrCTCACTTCATAACCTrATnTIGAC
GAGGGGAAAITAATAGGITGTATrGATGTrGGACGAGTCGGAATCGCAGACCGATACCAGGATCTIGCCATCCTATGGAA
CK3CCTX?GGlOAGTlTICTCCITCAlTACAGAAACGGCITITrCAA7\AATATGGTATTGATAATCCrGATATGAATAAAT
TCCAGlTTCAITIGATCCTCGATGAGlTnTCTAATCAGAATTGGTTAAITGGTTCTAACACIGGCAGAGCATTAOGCTG
ACTIGACGGGACGGCGGCITIGITGAATAAATCGAACTITIGCTCAGITGAAGGATCAGATCACGCATCTTCCCGACAAC
PL 211 017 B1
GCAGACCGITTCGTGGCAAAGCAAAAGrrCAAAATCAC£AACTGGTCCACCTACAACAAAGCrCTCATCAACayiGGCTC
CCTCACTTK7IGGC1GGATGAIGGGGCGAITCAGGCOT3GTATGAGTCAGCAACACCITCTTCA(^GGCAGACCTCAGC
GCCCCCCCCCCCCTG<^GGAGGTC7IXXGCITGAATTOTOITGTAGAAACACAACGTnTrGAAAAAATAAGCrATIGTIT
TATATCAAAATATAATCAT7TIT7WVkIAAAGGITCCTXX^ITTATCAGATAITIOTTCTOAAAAATGGTrTITrGCGGG
GGGGGGGGTATAATTGAAGACnTATCOGGTGITrGCCCGGAATrGTGAGCGGATAACAATrCGATGTITITAGGTTTTrA
IGAAATITACYVVVY3GAAGCCCATATGCATCCrAGGCCrATrAATATrCCGGAGTATACGTAGCCGGCrAACGITAACAA
CO3GTACCTCTAGAACTATAGCTAGCATGCGCAAATITAAAGCGCTGATATCGATCGCGCGCAGATCTGATrAAATAGGC
GAAAATACCAGCrACX^TCAAATCATCXX:COGCGITGATTATGATTITTCCAAACGCACTrCCGCCATCGTGTCrGGCGC
ITGGCIOAAACGO^TACGGGCATCGGCT^OTACACTCAAATTAATGCCGCCTCaTrO^^TrGCGCCACAAAITCTAAA
TTCAGCCCCAAACAAAAACCCGGATACWAAGAAAAACGGCAATAAAGACAGCAJmACCGTCTYWkAGATTITCAGACG
GTATTia^7TriTGGCITGGTIT?GCACATATAGTCAGACX?rtGGCAAAAATAGTCTGTTAACGAAATITGACGCATAA
AAATGCGCCAAAAAATTTTCAA7TDGOGTAAAACCTTCCT7V\TATTCAGCAAAAAGTAGGAAAAATCAGAAftAG7TITGCA
TITrcAAAATGAGATTGAGGATAAAATITrAGTAACGTATGITArTGCAAAGGTCrCGAATTCTCATTCCCACGCAGGCG
GGAATCTAGTCIGirCGGTTTCAGITATTrcałATAAAITCCTGCTGCGCCGTCIGAAGAATTCGTAATCATGGTCATAG
CIGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATrCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGG
TGCCTAATGAGIGAGCTAACTCACATT7V\TTGCGITGCGCTCACIGCCCGCTrrCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGC
TGCATTAATGAATOGGCCAACGCGCGGGGAGAGGOaGTTTGCGTATTGGGCGC
SEKW. ID. NR: 2
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (997 bp) przed genem NspA w szczepie Z2491 Neisseria meningitidis grupy surowiczej A.
GGAACCGAACACGCCGTrCGGTCATACGCCGCCGAAAGGrnGCCGCAAGAGGAAGCCGCCCTCGACATCGAAGACGCGG
TAG\CGGCGCGCrGGAAAGCGCGGGTmGTCCACTACGA7VLCATCGGCmTGCGAAACCAGCCATGCAGlGCCGCCAC
AATrrGAACTACTGGCAGTTCGGCGATTATrrAGGCATAGGCGCGGGCGCGCACGGCAA7\ATTrCCTATCCCGACCGCAT
5 CGAGCGCACXGTCCGCCGCCGCCACCCCAACGACTACXTCGCCTTAAIGCAAAACCGACCGAGCGAAGCCGTCGAACGCA
AAACCGIGGCCGCCGAAGAITIGCCGIIGGAAITCATGAIGAACGCCCIGCOCCIGACGGACGGCGIACCCACCGCGAIG
TTGCAGGAGCGCACGGGCGTACCGAGTGCCAAAATGATGGCGCAAATCGAAACGGCAAGGCAAAAAGGCCrGCrGGAAAC
CGACCCCnCCGTATTCn^CniACCnAAAT^GGACGCTIOTTriTAAACOATTTGCrGCAGTGTrrTrrATAGTGGATrA
PL 211 017 B1
ACMAAACCAGlACGGCClTGCOTCGCCrTAGCrCAAAGAGAACGf'.TrCTCTAAGGTOCTGAAGCACCAAGlGAATCG3T
TCCX3TACTATCTGTAOT3TCTGCGGCTTCGTCGCCTrGTCCTGftTTnTGTTAATCCi.CTATATAAGCGCAAACZkAATCG
GCBGCCGCCCKCGAAiACCCCCCCGAi.CGCGTCCGGAAAAlATGCITATCGATGGAAiACGCAGCCGCATCCCCOGCCGG
GCGTTTCAGACGGCA.CAGCCGCCGCCGGAAATGTCCGA.CGCTrAAGGCACAGACGCACACAAAAAACCGTATGCCTGCA.C
CCMTTAAAGGCAACGCGCGCCITAACGGCTrrGCCO
SEKW. ID. NR: 3
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem D15/Otnp85 w szczepie ATCC13 090 Neisseria meninc/itidis grupy surowiczej B.
ACCATIGCCGCCCGCGCCGGCTrCCAAAGOGGCGA.CAAAATACAA.TCCGTCAACGGCACACCCGTTGCAGATTGGGGCAG
CGCGCAAACCX3AAATCCTCCTCAACCrCGAAGCCGGCAAAGTCGCCGTCGGGTICA.GACGGCATCAGGCGCGCAAACCCT
CCGCACCATCGA.TGCCGCAGGCACGCC«3AAGCCGGTAAAATa3CAAAAAACCAACGCTACATCGGA.CTGATGCCCITTA
AAATCACAACCGTTGCCGGTGGCGTGGAAAAAGGCAGGCCCGCCGAATiAAGCAGGCCTGAAACCGGGCGACAGGCrGACT
GCCGCCGACGGCAAACCCATTACCTCAIGGCAAGAATGGGCAAACCTSACCCGCCAAAGCCCCGGCAAAAAAATCACCCI
GAAOTACGAACGCGCCGGACAAACCCATACCGCCGACATCCGCCCCGATACIGTCGAACAGCCCGACCACACCCTGATCG
GGCGCCTCGGCCTCCGTCCGCAGCCGGACAGGGCGTGGGACECGCAAATCOTCCGCAGCTACCGTCCGTCTCjrrATCCGC
GCATrCGGCA.TGGGCrGGG.AAAAAACCGTTrCCCACTCOTCGACAACCCTCAAATTnTCGGCAAA.CTAATCACCCGCAA
CGCCTCCGTCAGCCA.TATTTCCGGGCCBCTGACCAlTGCCGACATTGCCGGACAGTCCGCCCAACrCGGGnGCAAAGIT
CTCGTGTITTATACGTGCCGAATGGATACGCGGCAAACCTrrGGGCGAACGCGTCCAAAACATCGGTITGCGCTrCGGGCT
TCCCCTCATCATGCTGATGATCGCGGiraZCTTCTKAACGACCTTACCCHGCTOCimiTTAGATriTACGTTrCGGAA
TGCCGTCTGAAA.CCySCATrCCGCA.CCACAA.GGAACTGACA
SEKW. ID. NR: 4
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem podobnym do Hsf z Neisseria meningitidis
AłTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAAAAACAGAAACCTCACCGCOGTCAlTC
CCGCAAAAGCGGGAATCTAGAAACACAACGCGGCAGGACITIATCAGAAAAAACAGAAACCCCACCGCCGTCATTCCCGC
PL 211 017 B1
AAAAGCGGGAATCCAGACCCnTCGGCACGGAAACTITACCGGATAAAACAGTITCCTrAGATTCCACGTCCTAGATTCCCG
CTTrCO<X3GGAATGACGAGATTI^AGATTATGGGAATTTATCAGGAATGATrGAATCCATAGAAAAACGACAGGAATCTA
TCAGAAATWiCAGAAACCCCCACCGCCTCATrCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCGGCAGGACTTTATCGG
AAAAAACCGAAACCCCACCGACCGTCATrCCCGCAAAAGTTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTTATCGGAAA
AAACAGAAACCCCCACCGCGTCATrCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGGAACAGGAATITATCGGAAAAAAC
AGAAACCCCACCGACCGTCATTCCCGCaAAAGCGGGAATCCAGCAACCX5AAAAACCACAGGAATCTATCAGCAAAAACAG
A7\ACCCCCACa^a^TCa.TTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGAAACACAACGCGGCAGGACTITATCGGAAAAAACAGAA
ACCaACCGACCGTCATrCCCGCAAAAGCTGGAATCCAAAAACGCAACGCAACAGGAATTrATCGGAAAAAACAGAAACC
CCAra5CCGTCATTCCCGaVkAAGCGGGAATCCAGACCCGTCGGCAO3GAAACITACCGGATAAAACAGTITCGITAGAT
TCCaaGrCO^GAITCCCX3CCrrCGCGGGAATCACGAGA7TIT7VVGTTGGGGGAATITATCAGAAAACCCCCAACCCCCA
AAAACCGGGCGGATGCCGCACCATCCGCCCCCAAACCCCGATrTAACCATTCAAACAAACCAAAAGAAAAAACAAA
SEKW. ID. NR: 5
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (772 bp) przed genem PilQ z Neisseria meningitidis
GOłATCrTCGGGAAGCCTrCTCCCGAATCATTACCCCTrGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCX3GAAAACGGCGGCAAT
CATCACGGCAAGAGCAGCATCCTGAACCTCAGTGCCATTGCGACCACCTACCAAGCAAAATCCGTAGAAGAGCITGCCGC
AGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGTTAGGGTkAACCATGAAACACTAIGCCTrACTCATCAGCTrTCr
GGCTCTCTCCGCGTGTrCCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAGCCAAAGCAGAAA
TCATACCITICCAAGCACCTACCCTGCCGGTTGCGCCGGTATACAGCCCGCCGCAGCTrACAGGGCCG7\AO3CATrCGAC
0 TTCO3CCGCA7GGAAACCGACA7\A7W\GGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTATTAAAGAAACGGTGGAAAAAITCAG
TTTGGAAAATAIGOGITATGTCGGCAITITGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCGGGCTrCATCGAGGCIGAAGGTTATGTCT
AC^CIGTCGCTGTC^GCAACTATTTGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATrACCGACGACAGCATCGTCCIGAAC
GAGCIGATAGAAGACAGCACGGGCAACIGGGITTCCCX3TAAAGCAGAACTGCTGI7VWiITC[TCCGACAAAAACACCGA
ACAAGCGGCAGCACCIGCCGCAGAACAAAAITAAGAAGAGGATrACTCCATr
SEKW. ID. NR: 6
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Hap z Neisseria meningitidis
GTGCGGCAA^AAACAGCAAAAGCCCXX^GTCGATIGCCTGACCGTCCGCGTCCGTAAAATCAGCATAGGTrGCCACXXX5C
PL 211 017 B1
GGCTreSOCGTrrrCCCP.CACAAAGCCTCTGCCATCGGCAGCAGCTTITTCCCCaATATGCOTATCACGCCCACGCCCCC
GCGCCCGGGTGCGGTAGCGACIGCCGCiATCGTTGGAA.CGTTATCCGACATAAAACCCCCGAAAATTCAAAACAGCCGCG
ATTATAGCiAATCCCGTCTOAAGTCCGACGGTITGGCITrCAGA.COGCA.TAAAACCnCAAAAATGCTITGATAAATCCGTC
CBCCTOACCTTAATATAACCATATGGAAAAACGAAACACATACGCOTTCOTSCTCGGTATAGGCTCGCTGCTGGGTCTGTr
CCATCCroCAAAAACCGCC?.TCCGCCCCAATCCCGCCGACGATCTC?AAAACATCGCK.lGGCGAlTn’C?'A.CGCGCCATAG
AGPAA.GOTtXAAAA.TGACCGAAAACGCACA.GGACAAO3CGCGGCAGGCTCTCGAAACCC?rCGTCAAATCCCCGGAGCTTG
TCGAGCAAATCCTGTCC^03AGTAa?rGCAAATAATGATAGCCCGGCGITTCCATTCGGGATCGTrGCCGCCGCCGTCC
GACITGGCGCAATACAACGACATIATCAGCAACGGGGCAGACCGCATTATGGCAATGGCGGAAAAAGAACAAGCCGTCCG
GCACGAAACCA.TACGCCAAGACraAACOTICAACAGGCGCGGGCAACTGTACGGCrrCATCAGCGTCATCCrGATACIGC
TITITCCCGTCTmCŁ-TCGTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCTCCCriGCCGGCGGCACAGTCGITGCCrTCGCG
03TGCTTrCGTGA.TTGGAACPAGCCGAGACCAAGGCAAA?ATTAATIGCAAATCC7rAGGGCGTGCTTCATATCCGCCCaA
ACXX2CGAACCGCACATATAGGCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCCCTCCCAAACAAACCCGAATCCCG
TCAGATAAGGAAAAATA
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 8
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem FrpB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
AAGTGGGAATCTAAPAATGAA^GKMCAGGAATTTATCnGAAATGACCGPJiACTOAACGGACTGGATTCCCGCTrrOlC
GGGAATCACGGCGA.CAGGGITGCn3TTATAGTGGATGAAC?AAAACCAGTACGTCGTB3CCICGCCnAGCTC3\AAQ?BA
AO».lTCTCTf.AGGTCCinAAGCACCAAGTQAATCGGTrCCGTCCTATTTC?TACIGTCIGCGGCrrCGTCGCCrB3TCCT aATrrCTGTTCGTITTCGGTrATTCCCGATAAATrACCGCCG'ITTCTCGTCATrTCTrT?ACCCTTCGTCATTCCCGCGC
TGGGAATGACGGlGGAAAAGTTGCCGTGATrrCGGATAAATrTrCGTAACGCATAAlTTCCGriTTACCCGATAAATGCC
CGCAATCTCAAATCrCCTCATTCCCW-AAAACAAAAAATCaAMACfnAM.TATCGTCiiTTCCCGCGCAGGCGGGAATCT
AOACOTIAGAACAACAGCAATAlTCAAAGAITATCTOAAAGTCCGAGAlTCTAGAlTCCCACrrTCGTCGGAATGACGAA
TrTrAC33TITCrGTITITGGITrTCTCTCCTTCCGrXW\TG?.TCAAATITTAAGTTTTAGGAATTTATCEGAAAAAACAG
AAACCGCTCCGCCGTCATTCCCGCACAGGCTTCGTC/iTTCCCGCGCAGGCTTCGTCATTCCCGCAlTroTTAATCCACTA
'IGCAAAAATCCCCCCCCCCTGTTAATA.TAAATAAAAA.TAATTAATTAATTA.ITtTTCTTA.TCCTrGCCAAATCITAACGGT
ITCGATTTACTTCCCITCATACACTCAAGAGGACGATIGA
SEKW. ID. NR: 9
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem FrpA z Neiaseria meningi tidis (grupy surowiczej B)
0 CIATAAAGATGTAAATAAAAATCTOGCTAACGGTAACACTrTGGCTCftGCAAGGCAGCIACACCAAAACAGACGGTACAA
CroOWsAATCGGGGATITACITTrAGCACCCGACAATCTGCACAGCCGCTTCACGAACAAAATGCrATCCATTAGCCAT
GTTCGGGM7\ACaa3AITTCCCCGITroTTTIAGGCIGTCrAAACAAATAACCA.TAAATGTATATCATTATn,AAAATAA
ATAAAAGTATITAACTATTATIOACGAAATrTrAGAGAAAnAGTAGACTGTCGATrAAATGACAAA.CAATAGTCAGAAAG
GAAATAITrACTATCtKAGCACAGAGCATATITTAGGTAGCCTGTAftCIGTrCCTGCIGGCGGAAGAGGATCftAGGTGGA
5 CITACCOGSGAATAAATCTCCronGTGIGATATGGATGCCMOCCGCGAAGCAAlTGAlGCftATCACGGCAGrCCTACr
IGAAlGAAACOTGTCGITGCAGAAlTraMAACGCrATniTTiAGAAAGGATAAAGGGAGAAAGAATrnTGGITITTAA
TATGATIGCTAAAAGTTTATITITTAGATGCCftfiAAAATATAITITATATACTItATAnGTTTATATGTCrTTATriOA
PL 211 017 B1
ATATATCITACOATGGGGiAATA’m’f.,TATArmTATAATAAATnTACICArnOCTAATATCTCATGGAATATTAOTr
GTAITrrGTTIGAAlTTITCCATATGAAAATATTCCATTrACTAITITICTtKACITTAITAGITTATTTTrAATATITrT
ACCICTrATATTTACCATAAGAGAGCT^ATrGATTCATArTATATrGAGTCGAT^ATTAATTTATTCITAATTrrAĄTTC
SEKW. ID. NR: 10
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem FrpC z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GGAAACAGAGAAAAAAGTTTCTCITCTATCITGGATAAATATATTTACCCTCTIGITrAGTTAAGTAITGGAATITATACC
TAAGTAGTAAAAGlTAGTAAAITATITTTAACTAAAGAGrTAGTATCTACCATAATATATTCTTTAACTAATTrCrAGGC
TGTGAACCTCTGAATGAAAAGACAGATCAAAAAGCAGTftACTGCGCAACAGGCrAAAGAACAAACCAGlTTCAACAATCC
CGAGCCAATCACMGATTTCAACATACGGITACAlTTCAlTITCAGGGCACCAAAATGGTrATCCCCTATGGCTATCTTG
CACKGTATACGCAAGACAA7<KCACAAAATGGCTTTCCGACACGCCCGGGCAGGATGCTTACTCCATTAAITIGATAGAG
ATTAGCGTCrATTACAAAAAAACCGACCAAGGCrGGGTrCTTGAGCCATACAACCAGCAAAACAAAGCACAdTTATCCA
ATTTCTACGCGACGGTITOGATAGCGTGGACGATATTGTTATCCGfiAAAGATGCGTGTAGTTTAAGTACGAOTATGGGAG
AAAGATTCCTTACTIACGGGGrTAAAAAAATGCCATCTGCCrATCCTGAATACGAGGCTTATGAAGATAAAAGACATATr
CCIGAAAATCraTAlTITCATCAATTITACTATATrAA2\AAAGGAGAAAATCCGGCGATTATTACTCATCGGAATAATCG
AATAAACCAAAClGAAGAAGATAGTrATAGCACTAGOGTAGGTTCCTGTATTAACGGnTCACGGTACAGTATTACCCGT
ITAITCGGGAAAAGCAGCAGCTCACACAGCAGGAGITOGTAGGITATCACCAACAAGTAGAGCAATIGGTftCAGAGITIT
0 GTAAACAATIGAAATAAAAAATAATTT7W\GGATdTATT
SEKW. ID. NR: 11
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Omp85 z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ACGTCCGAACCGIGATTCGGCAACGCCGCGCCCAAAACCAAAGCCCAAGCCAAAATGCCGATATAGTIGGCATTGGCAAT
5 CGCG.T-rAATCGGGTTGGCGACCAGGTTCATCi-GCAGCGATTTCAACACTrCCACAATGCCGGAAGGCGGCiKGGaSGACA
CATCGCCCGCGCCCGCCAAAACAATCTCO3IU3GGAAAACCATACCX3GCGAIX»CGGCGGTCAGG«nOCGGAAAACGTA
CCAAltaGGTAAAGGAltATTWTCGGCCTGATATCCGCCTICTTGCCTTnTGGIGCIGCGCGATTGIGGCCGCCACCAA
AATAAATACCAAAACCGGCGCGACCGCITIGAGCGCGCCGACAAACAGGCTGCCGAACAAGCCIGCCGCCAAGCCCAGTT
PL 211 017 B1
GCGGGGAAA.CCX»ACCGA'rTACGATGCCCAACnCCAAACCGGCGGCAA.TCIGCCTGA.CCAGGCTGACGCGGCCGATCGCA
TGAAATAAGGATrrGCCGAACGCCA.TAATTCTTCCTTATGTKJIGATATGITAAAAAATGTTOTAITrrAAAACAAAACT
OTłTATCAłTCGGCGCAACGGITTAAlTTAITCAACGAAAATAAAlTIATTTMTCCIHGCTAlTrrCCGGCACIATTCC
GAAACGCAGCCTimTTCCATATGCGGATTGGAAACAAAATACCTTAAAACAAGCAGATACAlTTCCGGCGGGCCGCAAC
CTCCGAAA.TACCGGCGGCAGTATGCCGTOT3AAGTGTCCO3CCCCGTCCGAACAACACAAAAA.CAGCCGTTCCAAACCCT
GTCCGAACA.GTCnAGAATCGAAATGTGCCA.CACOGATGCACGACACCCGTACCATGATGA.TCAAA.CCGACCGCCCTTGCT
CCTGCCGGCITTAITITICTITCCGCACGCATACGCGCCT
SEKW. ID. NR: 12 io Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (772 bp) przed genem PilQ z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) (ATCC13090) GCGATCTCGGGAAGCCrTCTCCCGAATCATTACCCCrrGAGTCGCTGAAAATCGCCCAATCTCCGGAAAAOGGCCGCAAT
CATGACGGCAAGAGCAGCATCCIGAACGTCAGTGCCATroCCACCACCTACCAAGCAAAA.TCCGTAGAAGAGCrrGCCGC
AGAAGCGGCACAAAATGCCGAGCAAAAATAACTTACGITAGGGAAACCATGAAACACTATGCCrrACTCATCAGCnTCT
GGCTCTCrCCGCGTCrrcCCAAGGTTCTGAGGACCTAAACGAATGGATGGCACAAACGCGACGCGAAaCCAAAGCACAAA
TCATACCTnCCAABCACCTACCCroCCGGTTGCGCCGCTATACAGCCaSCCGCA.GCrTACAtBGCCGAACGCATTCGAC
TTCCGCCGCATGGAAACCGACAAAAfAGGGGAAAATGCCCCCGACACCAAGCGTATTAAAGAAACGCroGAAAAAlTCAG
TTTGGAAAATATGCGTTATGTCGGCATnTGAAGTCTGGACAGAAAGTCTCaiGCrTCATCGAGGCTGAAGGTTATGTCT
ACACTGTCGGTGTCGGCiACTAlTIGGGACAAAACTACGGTAGAATCGAAAGCATTACCGACGACAGCATCiGTCCTGAAC
0 GACrnGATAGAAGACAGCACGGGCAACIGGGTITCCCGTAAA.GCAGAACraCTGTTGAA.TrCTTCeGACAAAAACACCGA
ACAAGCGGCAGCTłCCTGCCGCAGAACAAAAITAAGAAGAGGAITACTCCATT
SEKW. ID. NR: 13
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem podobnym do Hsf z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
5 ItlGirilriCiiriGGTTTClTIOAATCGlTAAATCGGGGTTrGGGGGaiGATGGTGCGGCATCCGCCCGGTnTTGGG
GGTTGGGGGITTTCTGATAAATTCCCCCAACTrAAAATCTCGTGATrCCCGCGAAiGGCGGGAATCIGGGACGTGGAATCT
AAGGAAA.CTGTTrTATCCGGTAAGTTTCCGTGCCGACGGGTCTGGATrCCCGCnTrGCGGGAATGA.CGGCGGTGGGGTm
TCTGlTIGGGGCGATAAAITCATCTTCCGTrGCOTrTrTGSŁTTCGAGCrrTKJOGGCAATGACGGTCGGTGGGGTrrGm
PL 211 017 B1
CIITmTCCGATAAftGTCOTGCCGCGTroTGITTCTGGATTCCCGCCTGCGCGGGAATCACGGTCEGTCGGGGTTrCTGT
TITTnCTGATAGATrCCTGTGGITnnCOGITSCTGGAITCCCaCTriTGCKGGAATGACGCTCGGTGGGGTrTOTSTTr nTCCGATAAATTCCTCTtCraTTGTOlTICTaiATTCCCGCCroCGCGGGAATGAOSCGGTCCGGGTrTCTGTrrnTC
'tTCCTGTCGTTTITCrATOGATTCPATCAITCCTGATfAAITCCCATAATCTAAAATCTCGTCATTCCCGCGAAASCGGG
AAICTAGGACGTCGAATCTAAGGAAACTOTnTATCCGCTAAGTTTCCGTaCCGACaGGTCTOGATTCCCGCITnGCGG
SEKW. ID. NR: 14
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Hap z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
AA.TCAGCA.TAGGTIGCCACGCGCGGCTTGGGOCTTrrCCCACACAAAGCCTCTCCCATCBGCAGCAGGTTITICCCCGAT
ATnCfTrATCACGCCCA.CGCCGCCGCGCCCGGCTGCGCTAaO3ACT3CCGCAATCCTT3GAACX3TTATCCGACATAAA?,CC
CCCGAAAAI^CAAAACAGCCGCGATTATAGCAAATGCCGTCrGAACTCCGACGGTTTCGCriTCAGACGGCATAAAACCG
CAAAAAT<X?IT?eATAAATCCGTCCGCCTCACCTAATATAACCATATGGAAAAACGAAACACATACGCCnTO7IGCTCGGT
AT/aGGCTCGCTCCIGGGTCTX3TTCCATCCCGCAAAAACCGCCATCCGCCCCAATCCCCCCGACGATCTCAAAAACATCGG
CGGCGAITTTCAACGCGCCATAGAGAAA£3CGCEAAAATGACCGAAAACGCACAGGACAAGGCGCGGCAGGCrCTCGA7kAC
CCTCGTCAAATCCCCBGA.GCTIOTCGAGCAAATCCTGTCCGA.CGAGTACGTCCAAATAATGATAGCCCGGCGTITCCAIT
0 CCKGAICGTrGCCGCCCCCGTCCGACTTGGCGCAATACAACGACATrATCAnCAACGGGGCA.GACaSCATTATGGCAATC
GCGGAAAAAGAACAAGCCGTCaOGCA.CGAAACCATACGGCAAGACCAAACCriCfiACAGGCGCGGGCAACTGTACOGCn
CATCAGCGTCATCCTGATACTGCTITnGCCnTCTOX7KCTATGGAGCGGCTACCCCGCAACCGCCGCCrCCCrTGCCG
GCGGCACACTGGirGCCTTGGCGGGTCCTrTtBTGATTGGAAGAAGCCnAGACCAACiGCAAAAATrAA.TTSCAMiTCCTA
GGGCGTGCTTCATATCCGCCCGAACGCCGAACCGCACATATAi3GCACATCCCGCGCGCCGCCGGAAGCGGAAGCCGCGCC
5 CTCCCAAACAAACCCGAATCCCGTCAGATAAGGAAAAATA
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 15
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem LbpA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) GAITITGGTtATCCCGACAAGCITCITGTCHAAGGGCGTCAAATTCCTrrGGTTAGCCAAGAGAAAACCATCAAGCriGC
CGATCG<n.GC»J^TGACCGTCCG7OCITniTGCBACrrrtTGACCTATGT3AAACTCGGAa3aB.TAAAAACCn?ACCCC
C?GGCAAGTAAACCAAAGGCGGAAGATAAAAGGGAGGATGAAGAGAGTGCAGGCGTIGCTAACGTCGAAGAAGGCGAAGGC
GAACTTTCCGAAGATGAAGGCGAAGAAGCCGAAGAAATCGTCGAAGAAGAACCCGAAGAAGAAGCTGAAGAGGAAGAA.GC
TCAACCCAAAGAAGTTGAAGAAA.CCGAAGAAAAATCGCCGA.CAGAAGAAA.GCGGCAGCGGTrCAAA.CGCCATCCTGCCTG
CCTCGGAAGCCIOTAAAGGCAGGGACATCGACCTrTTCCTGZ\AAGGTATCCGCACGGOGGAAGCCGACATTCCAAGAACC
CGAAAAGCACACTATACCGGCACTIGGGAAGCGCGTATCGGCACACCCAITCAATGGGACAATCAGGCGGATAAAGŁAAGC GGCAAAAGCAGAATnTACCCOTAATTTCGGCGAGAAAiaSATTrCCGGAACGOTGACGGAGAAAAACGGTCTACAACCIG CkTTCTATATTGAAAACGGCAAGATTGAGGGCAACGGTrrCCACGCAACAGCACGCACrCGTGAGAACGGCATCAATCIT
TCGGGAAATCGTTCGACCAACCCCAGAACCTTCCAAGCTAGTGAICTTCGTGrAGAAGGAGGATTTIACGGCCCGCAGCG
GAGGAATTOGGCGGTATTAITTTTAATAAGGATGGGAAATCTCITGGTATAACTGAAGGTACrGAAAATAAAGITGAAGT 15 ir^AAGCrGAAGITGAAGTrGAAGCrGAAACTGGTGTTGTCGAACAGTrAGAACCTGATGAAGTrAAACCCCAATIOGGCG
TCGTMTCGGTGCGAAGAAAGATAATAAAGAGGTCGAAAA
SEKW. ID. NR: 16
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem LbpB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej A)
0 CGGCGITAGAGITTAGGGCAGTAAGGGCGCGTCCGCCCTTrAGATCTGTAAGTTACfiArrCrGITAAATAACrnTACroA
CTTTCAGTITITroACCTAAGGCTOAAAGCACCCITACIGCiTAAAGTCCAACGACAAAAACCAAAAGACAAAAACACTI TTATTACCCTAAAATOSAACACCCATAAATCAOriTTlTrTCTCnTGGaSAGGCGGCAGTAAGGGCGCSSTCCGCCCTTAG ATCIGTAAGITAT\aiTCCGTTAAATAG(XTITACTCACr[TGAGTrrTTn3ACCTAAGGGCGGACGCGCCCn'ACn3CT
TCACCra^TCGGCnTGAAlTrroiTCGCTITCGOTGCTTCACCTAAGGGIGAAAGCaCCCTrACreCCGCCTCGCC
5 AAAGACHAAMGGGTTATTTACGGGGGTTGGATnTAGGCAGTAAGGGGGCGTCOGCCCTTAGATCTGrAAGTTATCArr
TCAAnTTOTTCGCTTTCGCITCCITCATCTAAGGGTGAAAGCACCCTTACTGCCGTCTCGCCGAAGACAAaSAGGGCTA
TTTACGGCGITAGAGTITAGGGCAGTAAGGGCGirnUCGCCCITAGATCCAGACAGTCACGCCnTIOAATAGTCCATTTT
PL 211 017 B1
GCCAAAGAACItTAAAACGCAGGACCTAAGGGTGAAAGCACCCITACTGCCrTACATCCAAGCACCCITACTGCACCAOG
TCCAalCACCCTTACTCCCOTACGTCCACGCACKCTrAaGCCCTACATCCAAGCACCCITACTGCCTrACATAGACATG
ACAGACGCCGAGCAGO3GAACAGGACTAAAAACAAITAAGTCATA1T[TTGCCCAACTATAATAGACATGTATAATTATA
TTACTATTAATAAT^ATTAGnTTATCCTCCnTTCATCCC
SEKW. ID. NR: 17
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (731 bp) przed genem TbpA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) (ATCC13090) TATGAAGTCGAAGTCTGCTGTTCCACCTTCAATTATCTGAATTACGGAATGTTGACGCGC
AAAAACAGCAAGTCCGCGATGCAGGCAGGAGAAAGCAGTAGTCAAGCTGATGCTAAAACG
GAACAAGTTGGACAAAGTATGTTCCTCCAAGGCGAGCGCACCGATGAAAAAGAGATTCCA
AACGACCAAAACGTCGTTTATCGGGGGTCTTGGTACGGGCATATTGCCAACGGCACAAGC
TGGAGCGGCAATGCTTCCGATAAAGAGGGCGGCAACAGGGCGGACTTTACTGTGAATTTC
GGTACGAAAAAAATTAACGGCACGTTAACCGCTGACAACAGGCAGGCGGCAACCTTTACC
ATTGTGGGCGATATTGAGGGCAACGGTTTTTCCGGTACGGCGAAAACTGCTGACTCAGGT
TTTGATCTCGATCAAAGCAATAACACCCGCACGCCTAAGGCATATATCACAAACGCCAAG
GTGCAGGGCGGTTTTTACGGGCCCAAAGCCGAAGAGTTGGGCGGATGGTTTGCCTATTCG
GACGATAAACAAACGAAAAATGCAACAGATGCATCCGGCAATGGAAATTCAGCAAGCAGT
GCAACTGTCGTATTCGGTGCGAAACGCCAAAAGCCTGTGCAATAAGCACGGTTGCCGAAC
AATCAAGAATAAGGCCTCAGACGGCACCGCTCCTTCCGATACCGTCTGAAAGCGAAGAGT
0 AGGGAAACACT
SEKW. ID. NR: 18
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (373 bp) przed genem OmplA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) (ATCC13090)
CGTACCGCAltCCGCACIGCAGTG.WAAAGTATTGAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTA
5 CCAAGAGTCCGTCAAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTrCCATAAAAACAAAGCGGCrCGCCAC7\AAACCC
GTITGirGICAAAAAGTAAAACGTGGGCTGRATrrETGCAAAACCTGCAA.TCCGGITITCATCGTCGATTCCGAAAACCCC
AATCCGCTATAAAATGCCGTCTGAAAACCAATATGCCGACAATGGGGGTGGAG
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 19
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Plal z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
TTTTGGCTTCCAGCGTTTCATTGTTTTCGTACAAGTCGTAAGTCAGCTTCAGATTGTTGG
CTTTTTTAAAGTCTTCGACCGTACTCTCATCAACATAGTTCGACCAGTTGTAGATGTTCA GAGTATCGGTGGCAGCGGCTTCGGCATTGGCAGCAGACGCAGCGTCTGCTTGAGGTTGCA CGGCGTTTTTTTCGCTGCCGCCGCAGGCTGCCAGAGACAGCGCGGCCAAAACGGCTAATA CGGATTTTTTCATACGGGCAGATTCCTGATGAAAGAGGTTGGAAAAAAAGAAATCCCCGC GCCCCATCGTTACCCCGGCGCAAGGTTTGGGCATTGTAAAGTAAATTTGTGCAAACTCAA
AGCGATATTGGACTGATTTTCCTAAAAAATTATCCTGTTTCCAAAAGGGGAGAAAAACGT CCGCCCGATTTTGCCGTTTTTTTGCGCTGTCAGGGTGTCCGACGGGCGGATAGAGAGAAA AGGCTTGCATATAATGTAAACCCCCTTTAAAATTGCGCGTTTACAGAATTTATTTTTCTT CCAGGAGATTCCAATATGGCAAACAGCGCACAAGCACGCAAACGTGCCCGCCAGTCCGTC
AAACAACGCGCCCACAATGCTAGCCTGCGTACCGCATTCCGCACCGCAGTGAAAAAAGTA
TTGAAAGCAGTCGAAGCAGGCGATAAAGCTGCCGCACAAGCGGTTTACCAAGAGTCCGTC
AAAGTCATCGACCGCATCGCCGACAAGGGCGTGTTCCACAAAAACAAAGCGGCACGCCAC aaaagccgtctgtctgcaaaagtaaaagccttggcttgatttttgcaaaaccgccaaggc
GGTTGATACGCGATAAGCGGAAAACCCTGAAGCCCGACGGTTTCGGGGTTTTCTGTATTG
CGGGGGCAAAATCCCGAAATGGCGGAAAGGGTGCGATTTTTTATCCGAATCCGCTATAAA
0 ATGCCGTTTGAAAACCAATATGCCGACAATGGGGGCGGAG
SEKW. ID. NR: 20
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem FhaB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
TACGGAAACIGCAAGCGGATCCAGA7\GTTACAGCGlGCATrATTCGGTGCCCGTAAAAAAATGGCIGTITrCITrTAATC
5 ACAATGGACATCG1TACCACGAAGCAACCGAAGGCTATTCCGTCAA1TACGA1TACAACGGC7U\ACAATATCAGAGCAGC
CTCGCCGCCGAGTOCATCCITTGGCGTAACAGACTTCATAAAACTrCAGTCGGAATGAAATrATGGACACGCCA^CCrA
TAAATACATCGACGATGCCGAAATO3AAGlGCAACGCCGCCGCTCTGCAGGOTGGGAAGCCGAATTGCGCCACCGrGCIT
A.CCTCAACCGTIGGCACCnOACGGCAAGTrGTCnACAAACGCGGGACCGGCATGCGCCAAAGTATCCCIOCi.CCGGAA
PL 211 017 B1
GAAAACGGCGGCGATAITCTTCCAGGTACATCTCCTAIOAAAATCATrACIOCCGGITrGGACGCAGCCGCCCCATrTAT
TTrAGGCAAACAGCAGITTITCrACGCAACCGCCATItAAGCTCAATGGAACA7WvCGCCGITGGTIGCCCAAGATAAAT
TGTCAATCGGCAGCCGCTACACCGTTO^^^GAITIGAIGGGGAGCAGAGTCITITCGGAGAGCGAGGTrrCTAGTGGCAG
AATACITrAACTIOGTAITTrCATCCGAACCATCAGTTCTATCTCGGTGCGGACTATGGCCGCGTATrrGGCGAAAGTGC
ACAATAIGTATCGGGCAAGCAGClGATGGGTGCAGlGGTCGGCTTCAGAGGAGGGCATAAAGTAGGCGGTATGITrGCTr
AIGATCTGlTIGCCGGCAAGCCGCTrCATAAACCC7VV\GGCriTCAGACGACCAACAC?CGTrrACGGCTTCAACTrGAAT
TACAGTTTCTAACCrCTGAATTTTITACIOATAITrAGAaCTCTrrCCITATCCm^GAGCGTCAAA
ACTTGGCGCGCAGTACGTrCATCITCAAAAIGGAATAGAC
SEKW. ID. NR: 21 io Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Lipo02 z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ITATCTTOGTOCAAAACTITGTCGGGGTCGGACTGGCTACGGCTrTGGGTITGGACCCGCTCATCGGTCTGATrAGCGGT
TCGGIGTCGCTGACGGGCGGACACGGTAraTCAGGTGCGIGGGGACCTAAlTITXWV\CGCAATACGGCriOGTCGGCGC
AACCX3GTITXX3CTAlTGCATCGGCTACTTr2GGGCTGGIGlTOXKGGCCIGATCGGGGGGCCGGTrGCGCGCCGCCTGA
TCAACAAAATGGGCCGCAAACCGGTTGAAAACAAAAAACAGGATCAGGACGACAACGCGGACGACGTGTTCGAGCAGGGA
A7\ACGCACCCX3CCTGAITACGGCGGAATOGCCGTTGAAACXXTrGCCATCTITGCCGCGTGTITGGCGTriGCCGAGAT
TATGGACXjGCITGGACAAAGAATATCTGTT[O3ACCTGCCCAAA1TCGTG1OGIGTCIGTTTGGCGGCGTGGTCATCCGCA
ACAIGCTCA(nGCCGCATrCAAGGTCAATATCITCGACCGCGCCATCGATGTGTTCGGCAATGCIT?CGCT7TCGCTnTC
ITGGCAATGGCGTTCCTGAATTTOAAACTGTOGGAGGTGACramTGGCGGGGCCTOTAACCGTCAłTCITGCCGTACA
0 AACCGIGGTGATGGITITGTACGCGACnTITGITACCTATGTCTITATGGGGCGCGACTATGATGCGGCAGrATrGGCTG
CaaGCCATTGCGGITTa^CTTGGGTGCAACGCCGACGGCGGlGGCAAATATGCAGTCCGTCACGCATACriTCGGCGCG
TO3CATAAGGCGITITTGAITGTGCCTAIGGTCGGCGCGITCITO31GGATITGAITAATGCCGCGATrCTCACCGGTTT
TGTGAAITTCTrTAAAGGClGATTTnrCXXXnTrCCGACAAAGCACXnGCAAGGTTTACCGCCIGCAGGTGCrrrrGerA
IGATAGCCGCTATCGGICTGCACCGITrGGAAGGAACATC
SEKW. ID. NR: 22
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Tbp2 z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
CCTAercCACCGATrCCAATATGCTa3GCGCGACCCACGAAGCGAAAGACrrGGAATmTGAACTCGGGCATCAAAATC
PL 211 017 B1
GTCAAACCCATTAlGK^KZGITjCCTITIGGGACGAAAACGTIOAAGlt^lGCbCCGAAGAAGltAGCGrGCGCTTTGAAGA
AGGCGrTGCCGGTIGCACTGAA.CGGCAAA.GAATACGCCGACCCCGTCGAACTCTrCCTCGAAGCCAACCGCATCGGCGGCC
GCCA.CGGCTTGGCTATGAGCGACCAAATCGAAAACCGCATCATCGAAGCCAAATCGCGCGGCATCTACGAAGCCCCGGGT
ATGGCGTTGITCCACATCGCCrACGAACGCTTGGTGACCGGCATCCACAACGAAGACACCATCGAACAATACCGCATrAA
CGGCCTGCGCCTCGGCCGTTrGCGCTACCAiiGGCCGCTGGTICGACAGCCAAGCCTrGATGTTGCGCGAAACCGCCCAAC
GCTGGGTCGCCAAAGCCGTTA.CCGGCHAAGTTACCCTCGAACIGCGGCGCGGCAACGACTAGrCGATICTCAACACCGAA
TCGCCCAACCTGACCTACCAACCCtSAACGCCTGAGTATGGAAAAAGTCGAA.GGTGCGGCGTTTACCCCGGTCGACCGCAT
CGGACAGCTCACGATGCGCAACCTCGACATCACCGACACCCCCGCCAAACTGGGCATCTACTCGCAAAGCGCTTIGCTGT
CGCIGGGCGAAGGCrCGGTA.TTA.CCGCAijriGGGCAATAAGAAATAAGGTnOCTGITrTGCATCATrAGCAACrrAA.GG
GGKGTCnOAAAAGATGATCCCTTATGTTAAAAGGAATCOTAltKAAGAATACAAAGTCGTtKrrrATCAGGAAAGCCAG
GCIGGCGGGTCGAGACCTTTGCAATAACA.TAGGITACTAA
SEKW. ID. NR: 23
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem PorA 15 z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GAATGACAATTCATAA.GTTTCCCGAAATTCCAACATAACCGAAACCTGACAA.TAACCGTAGCAACTGAACCGTCATTCCC
GCAAAAGCGGGAATCCAGTCtGTItAGITTCGGTCATTrCCIlATAAATGCCTGITGCTrTTGAITTCTAGATrCCCACTr
TCCTGGGAATGACGGCGGAAGGGTnTGGTITnTCCGATAAATTCTrGAGGCATIGAAATrCCAAATTCCCGCCTGCGC
GGGAA.TGACGGCTGCAGATGCCCGACGGTCTTTATAGlGGATTAACAAAAATCAGGACAAGGCGACGAGCTGCAGACAijr
0 ACAGATAGTACGGAACCGATTCACTTAGIGCTTCAGTATCTTAGAGAATCGTTCTCTITGAGCTAAGGCGAGGCAACGTC
GATACCGCCGCITATAITACAATCGCCGCCCCGTCGTTCGAZIAACCTCCCACAOTAAAAAACTAAGGAAACCCrATGTCC
CGCTA.&AACGAAGAGCTGCAA.GGIATCTCGCnTIGGGTAATCAAAAAACCCAATA.TCCGGCCGAATACGCGCCCGAAAT
TTIGGAAGCGTrCGACAACAAACATCCCBACAACGACTATTrCGTCAAATTCGTr-IGCCCAGAGTTCACCAGCCTGrGCC
5 CKMGACCGGGCAGCCCGACTItGCCACCATCGTCATCCECTACATTCCGCACATCAAAATGGTGGAAAGCAAATCCCrG
AAiiCTCTA.CCTCrrCAGCTTCCGCAACCACGGCGATnTCATGAAGACTGCGTCAACAGCATCATGAAAGACCTCATTGC
CCIGATGGATCCGAAATACATCGAA.GTATrCGGCGAGIT&ACACCGCGCGGCGGCATCGCCA.TrCATCCTrTCGCCAATT
AOGGCAAAGCAGGCACCGAGITIGAAGCATGGGCGCGTAA
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 24
Region promotora PorA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ATroAAGArOTATCGGGTGTTrGCCCGATCTTrrrAGGTrTrTATCAAATITACAAAf.GGAAGCCCAT
SEKW. ID. NR: 25
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem PorB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej A) gttttctgtttttgagggaatgacgggatgtaggttcgtaagaatgacgggatataggtttccgtgcggatggattcgtc attcccgcgcaggcgggaatctagaacgtggaatctaagaaaccgttttatccgataagtttccgtgcggacaagtttgg attcccgcctgcgcgggaatgacgggattttaggtttctaattttggttttctgtttttgagggaatgacgggatgtagg ttcgtaggaatgacgggatataggtttccgtgcggatggattcgtcattcccgcgcaggcgggaatctagaccttagaac aacagcaatattcaaagattatctgaaagtccgagattctagattcccgcctgagcgggaatgacgaaaagtggcgggaa tgacggttagcgttgcctcgccttagctcaaagagaacgattctctaaggtgctgaagcaccaagtgaatcggttccgta ctatttgtactgtctgcggcttcgtcgccttgtcctgatttttgttaatccactatctcctgccgcaggggcgggttttg catccgcccgttccgaaagaaaccgcgtgtgcgttttttgccgtctttataacccccggtttgcaatgccctccaatacc ctcccgagtaagtgttgtaaaaatgcaaatcttaaaaaatttaaataaccatatgttataaaacaaaaaatacccataat atctctatccgtccttcaaaatgcacatcgaattccacacaaaaacaggcagaagtttgttttttcagacaggaacatct atagtttcagacatgtaatcgccgagcccctcggcggtaaatgcaaagctaagcggcttggaaagcccggcctgcttaaa tttcttaaccaaaaaaggaatacagcaatgaaaaaatccctgattgccctgactttggcagcccCtcctgttgcagcaat ggctgacgttaccctgtacggcaccatcaaaaccggcgta
SEKW. ID. NR: 26
Region promotora PorB z Neisseria meningitidis (grupy 25 surowiczej B)
GTTITCroTTITmAGOGAATGACGGGATGTAGGTICGTAfŁGAATGACGGGATATAGGTTrCCGTGCGGATGGATICGTC
ATTCKCGCGOlGGCGGGAATCTAGAACGTGGAATCTAAGAAACCGITTTATCCSATAAGTTITCCGTGCGGACAAGTTrG
PL 211 017 B1
GTTCGTAGGAATCACGGGATATAGGITrCCGTGCGGATGGATrCGTCATTCCCGCGCAGGCGGGAATCCAGACCITAGAA
CAACAGCAATATTCAAAGA7TATOT3AAAGTCCKAGATTCTAGATrCCCGCCTGAGCGGGAAIGACGAA7\AGTGGCGGGA
AlGACGGTrAGCGITGCCTCGCCTEftGCTtAAAGAGAACGAITCTCTAAGCTGCIOAAGCACrAAGrGAATCGGITCCGT
ACTATITGTACrGTCTGCGGCrrCGTCGCCrrGTCOTGATITTrGTTAATGCACTAT
S SEKW. ID. NR: 27
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem siaABC z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ATACGGCCAATGGCrrCAGAAAGCGATAAGCCTOT3GCn3AAAAACCGAlTrC7rTCTClTCTCCCCACCGCACCCATAGA
CGTAAAGGTrATAGGGATTGGTAATCATGGTAACCACATCACCGCGACGCAGCAAAATATITIOTCGCGGAITTCCAACTA
AATCTTCCAAGGC AACAGTTCGTACTACATTGCCACGTGTCAGCTGCA.CATTCGTATCCTCCACAlTIGCCCrrrGAACCA
CCTAC'CGCA3CCACCGCATCCAP.CACACGCrCACCXS3CTGCCGTCAGCGGCATACGCACACTATTCCCAGCACGAATCAC
CGACACA1TOKX?GCA1TATICTCCACCAAACGCACCATCACTTOTCGCTGATTCGCCATT7[TITTCAGGCGGCC[TIAA
TAATTTCCTGAACCTGACCAGGCGTITIACCGACCACCGAAATATCGCCAACAAAOGGCACAGAAACOGTACCACGTGCC
GTGACCAACTGCTCrGGCAACTTAGTITGATCCGCACTACCCGAGCCCATCGAAGAAAGGCCACCACCAAACAATAOTSC
CGGCGGCGCTTCCCAAATCATAATATCCAATACATCACCAATAITTAGCGTACCAGCCGAAGCAIAACCATCGCCAAACT
GAGTCAATGACTSATTTATCTGAGCOTTATATAATAACTGAGCAACCGTATGATICACATCAATCAGCTCCACTrCAGGA
ATTrGAAClTCAGAlTCTTGCCCTAAAGAGACAAI7TmTTG<33CTGGGGCCTGATGAAGGAATCGCAGAGCATCCTAC
AWTASACTTCCACACAATAATAATACTGCGTGACGAATATAAAATITCACTTTAAACACAAGCCAAS.TCCTAATATZAT
TAlAAATGGCCTAATTATAGCACTrAATGGAAATAAATITATGAGTACGTAGAGTATAATTAGTATTCTrCrTTCCAACr
0 TCCITATACITATATATATATACrTATAGATTCTAAAATC
SEKW. ID. NR: 28
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lgt z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) GCCAAAGOaTCGGCGCGGATCCCGCCGCTGCCGAACWSCCGCGCGTCTTGCCAAAGCCGACTTGCTAACCGAAATGGT
5 OSGCGSGlTCCCCKAACTCCAAGGCACGATGGGCAAATACTAlOCCTGTnOGACGGCGAiACCGAAGAAATrGCCGAAG
CCGTCGAGCAGCACTATCAGCOSC&TllTr^^GGCGACAAGCTGCrrGAAMCAAAAimGCCGCCGCCGTCGCA.CTGGCC
GACAAACTAGAAACClTGGTCGGCATrTGGGGCATCGGTCTGATTCCGACCGGCGACA7\AGACCCCTACGCCCrGCGCCG
CGCIGCCTTGGGTATTITGCGTATGCTGATGCAGTATCGTITGGACGTGAACGAACTGATTCAGACGGCAITCGACAGCT
PL 211 017 B1
TCCCCAAAG3TTrGCTCAAO3AAAAAACXX:CGTCIOAAACXXX:CX^Cr^ ^ACCAT^ATCf^AAGACATCGTTGCCGCCGTAOTCGCCAAACAGCajCG^CGTTTGGACGATTTGACCGCCAAACrGCA
GGCCGTTGCGGCGlTCAAACAACTGCCCGAAGCCGCCGa3CTCGCCGCOGCC7V\CA7U\(XXXnGGAAAACCTGCTCAWi
AAGCCGATCCCGAGTTG<X3CWGGITAACG^AAGCCTGTTGCĄACAGGACGAAGAAW\GCCCrCTTrC?CCGCCGCGCAA
GGCTIGCAGCCGAAAATCGCCGCCXX:CGTCy3CCGAAGGCAATTrCCAAACaX?OTYGTCCGAACTGGCTrCCGTCAAACC
GCAAGTCGATGCATTCTTTGACG-GCGTGĄIGGTAATGGCGGAAGATGCCGCCGTAA^CTAAACCGCCTGAACCTGCIGA
ACXX3CTTGGCAGAGCAAATG^CGCGGTAGCCGACATCGCGCTTriOGGCGAGTAACCGTrGTACAGTCCAAATGCCX3TC
TGAAGCCTTCAGACGGCATCGTGCCTATCGGGAGĄATAAA
SEKW. ID. NR: 29 io Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem TbpB z Neisseria meningitidis (szczep MC58)
GAACGAACCG3AT7GCCACTITCGTCGGAATGACGAATTXCAGGITACTGTrrTTG(JITITCIGlTITrGTGAAAATAAT
GiffiAirTCAGCTTGTGGGTATTTACCGGAAA.AAACAGAAAGCGCTCCGCCGTCATrCCCGCGCAGGCGGGAATCTAGGTC
TGTCGGlGCGGAAACrTATCGGATAT^CGGTTTCG^GAGATTITrCGTCCTGGATTCCCACTTTCGTGGGAATCACGCG
AACAGAAACCGCTCCGCOGTCATTGCCGCGCAGGCGGGAATCTAGACAłTCAATGCTAAGGCAATrTATCGGGAATGACr
GAAACTCAA^AAACTGGATTCCCACTTTCGTGGGAAIGACniGGIOCAGGTrrcCCTATCGATGGATrCGTCATrcCCGC
GCAGGCGGGAATCTAGACCITCAATACTAAGGCAAITrATCGGAAATGACTGAAACTaiAAAAACIGGAITCCCACTTrr
GTGGGAAIYlACGCGATrAGAGTTTCAAAATITAlTCTAAATAGCrGAAACTCAACACAOTGGATrCCCGCCTGCGCGGGA
ATCAO^AAGTOGAAGTTACCCGAAACTTAAAACAAGCGAAACCGAAroAACrGGAITCGCACTITCGTCGGAATCACGGA
0 ATGTAGGITCGTGGGAATGACGGCGGAGCGGTroTTGCITTTTCCAATAAATGACCCCAACTrAAAATCCCGTCATrCCC
GCGCAGGCGGGAATCTAGGTCTCTCGGTGCGGAAACITATCGGGTAAAACGGITrCTIGAGAITITCCGTCCTGGAITCC
CAGITIGGIGGGAATGACGGAATCTAGGITCGTGGGAAIGACGGGATATAGGTTTCCGTGCGGACGCGTTCGGAITCATG
ACTGCGCGGGAAIGACGGGATTTTGGTGTATTCCCTAAAAAAATAAAAAAGTAITIOCAAATTrGTrAAAAATAAATAAA
ATAATAATCCTTATCATTCITTAATTGAATTGGATTTATr
SEKW. ID. NR: 30
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem opc z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej A)
CAAAGGCTACGACAGIGCGGAAAACCGGCAAiMCTGGAAGAACATCAGTIGITGGACGGCAITATGCGCĄAAGCCTGCG
PL 211 017 B1 <X2AACOnraxrn7TCGGAAACGCAAACrAAACGCAACCGGTA^^
CAGGACAAGGCGACGAAGCCGCAGACAGTACAAATAGTACGGCAAGGCGAGGCAACiJCCGTACIGGTrrAAATrrAATCC
AGI7\TATGTOGTCGAAC^GAGCTTOGSTAC^CTGCACCGT7kAATTCCGCrrATGCGCGGGCAGCCrATTTCGGACrGATrA
AAGTCAGTGCCX2AAAGCCA.TCTGAAGGCXJATGTG,IT?rPGAACCIGTrGAAAGCCGCC^^
GCCTT^^GGAGACCGGATGCCTGATTATCGGGTATCCGGGGAGGGTTAAGGGGGTATTrGGGTAAAATTAGGAGGTATT
TGGGGa3AAAATAGACGAAAACCTGTGTTTCGGT^TCGGCrcTCGGGAGGGAAACXlAAITriGCAAAGATCTCATCCTGT
TATTITCACAAA7VkCAGAA7^CCAAAAACAGCAAOTGAAAITO^CATTCCa3CGCAGGCGGGAATCGAGACCCCCAAC
GCGGCAGGAATCTATCGGAAATAACCGAAACCGGACGAACCTAGATTCCCGCITTCGCGGGAATGACGGCAGAGTGGITr
CAGTTGCTCCCGATAAATGCCGCCATCTCAACTCTCGrCATTCCCrrAAAACAGAAAACCGAAATCAGAAACCT^AAATr
TCGTCATTCa^TAAAAAAOkGAAAACCAAGTCAGAATAACAATTCCTTGTAAACAAATAACTATITGTrAATTTTTATT
AATATATGTAAAATCCCCCCCCCCCCCCCCCGAAAGdTAAGAATATAAirCrAAGCGTAACGATTATrTACGTTATGTr
ACCATATCCGACTACAATCCAAAlTITGGAGAITITAACr
SEKW. ID. NR: 31
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem siaD 15 z Neisseria meningi tidis (grupy surowiczej B)
ATAATGCAGGOJCTGAAGTTGTTAAACATCAAACACACATCGITGAAGACGAAATGTCTGATGAGGCCAAACAAGTCATT
CCTkGGCAAIGCAGATCTCTCTATTTATGAAATrATGGAACGTTGaSCCCTGAATGAAGAAGATGAGATTAAATIAAAAGA
ATACGTAGAGAGTAACX3GTATGAITITrATCAGTACTCCr[TCrCTCGTGCAGCTGCITrACGATTACAACGTATGGATA
ITCCAG(^TATAAAATCGGCrcnGGCGAAIGTAATAACTACCraTrAAITAAACTGGTGGCCTCITrrGGriAGCCTATr
0 ATTCTCTCTACCGGCA.TGAATTCrATTGAAAGCATCAAT^AAGTCOGTAGAAATrATTCGAGAAGCAGGGGTACCTTATGC
TTTCCTrGACrGTACCAACATe?ACCCAACCCCITACX5AAGATGTrCGATrGGGTGGTA,IGAACGAITrATCP3AAGCGT
TrCTTAGAC^CAATCATTGGOTOIOIGACCATACCTTAGATT^CTATGCTIGCI^AGGAGCAGTAGCTTTAGGCGCITCG
AITITAGAGCOTCAmTACIGACCXX^TOGATCGCC(^GGTCCGGATATIGTAlXXn?CTATGAATCCGGATACrnTAA
AGACCTCAAGCAAGGCGCTCATCCrrrAAAAITGGCACGCGGCGGCAAAAAAGACACGATTATCGCGGGAGAAAAGCCAA
5 CTAAAGATTrCGCCTTTGCATCTGTCGTAGCAGATAAAGACATTAAAAAAGGAGAACrGlTGTCCGGAGATAACCrATGS
GTTAAACGCCCACXKAATCmGACTrCAGCGTCAACGAATATGAAACATrATITGGTAAGGTCGCTGCTrGCAATATrCG
CAAAGGTGCTCAAAI^AAAAAACTGATATTGAATAATOCnTATTAACITAGlTACTITAITAACAGAGGATTGGCTATT
ACATATAGCTAAITCTCAI^AATTTITAAGAGATTMZAATA
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 32
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem ctrA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
ATACGIGCAOTGAGTTGCCGACCATAAATTrAGCATGTITCAATAAGACTAAAAAATATrCAAATCGAATGGAAGGAAA
TCCAATAAAlTTATCAGAlTGATATITTAATAATrCTIGCAGAATAGriTCAGTGCCAGTGTCATrAITAGGGTAGATGC
TAAlGATAITITGGCCACTTAACTCTAATGCTnGAAATAITGGGCGGCATATTGTGGCATrAAATGTGCITCrGTAGTC
ACU^GGTGAAACATAGAAATACGATAATTrroJTATGGTTW^CGGTAATATItTriGACTrCTrCTAAGGATGGGAGGGT
TGACAGCTTGTTCATTIGCTACCAAGTGGATATGAGAAAGTITACTAATAGAATGACGAATGGAGTCATCTACIGTACCA
GATAGTTCACCACCTIGGATATGGCZVVkCTAAACGGCnGCTT7VVTGCACCTACAGCTGCGCCIGGTAGTGCITCTAAACG
GTCGCCGTGAATCATGACCATATCAGGTTCAATITCATGAGATAGACGAGAGATAAACGTAATGGTATTGCCTAAAACGG
CACCCATIGGI^CACCnGGATITGATTIGAAAACAGATATGTATGTTGATAGTTITCTCGAGTrACTTCCTTGTAGGrr
GTGCCATATGITITCATCA.TATGCATACCAGITACAATCAAAIGCAAITGAAGGTCTGGGIGATITTCAATATAGGCTAA
TAAAGGTirrAGCrTGCCGAAGTCGGCTCTCGTACCnGTAAIGCĄAAGAATrGrrrrCATGATrrrAGAATCrAIAAGTA
TATATATATAAGTATAAGGAAIHTGGAAAGAAGAATACTAAITATACTCTACGTACrCATAAATrTATTrCGATIAAGTG
CTATAAITAGGCCAITrATAATTATATTAGGATTTGGCTT
SEKW. ID. NR: 33
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem IgtF z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej A)
0 TCTTITrCGGACTGAAAGGACGCAT(^TCGCGACATCOAGCGCGIGTTCGTCCGGCAGCCAAGGCATAGGTTAIGCCTAC
GAAGCCATCAAATACGCTCTGACałATATCAIGCTGGCGGGCGGAGGCGA7\GAAlTrrTCCCGTCCGAAGTGTATGrrnT
CGACTCGCTTTATGCCGCGAGCCGCCGCAACGGCGAACCGGAAAAAACCCCGCGCCCATACGACGGGAACCGCGACGGGC
IGGTCATCGGGGAAGGCGCGGGGATTTTCGTGCTGGAAGAATTGGPACACGCCAAACGGCGCGGTGCGATAATTTACGCC
GAACTGGTCGGCTACGGAGCCAACAGCGATCCCTACCATATTTCCACGCCCCGCCCCGACGCGCAAGGCGCAATCCTIGC
5 GITTCAGACGGCAITGCAACACGCAGACCrrGCGCCCGAAGACATCGGCTGGATrAATCTGCACGGCACCGGGACGCACC
ACAACGACAGTATGGAAAGCCGCGCCGTrGCAGCGGTnTCGGCAAGAATACGCCCrGCACGTCCAGCAAGCGGCiAACC
GGACACACGCrGGGCGCGGCGGGCGCAATCGAAGGCGCGTrCGCGTGGGGCATTGClGACCGGAAAAGCAATCCCGAAGG
GAAAGITCCGCCCCAGCITTGGGACGGGGAGAACGATCCCGACCTrCCCGCCATCAACCTGACCGGCAGCGGCAGCCGCT
PL 211 017 B1
GGGAAACCGAAAAA.CGCAnGCCGCCAGCTCGTCCTTIGCCTrCGGAGGAAGCAA.CTGCGrrrTACTCA.TCGGATGAAAT
AAGITTGrCAATCCCACCGCTATGCTATACAATACGCGCCTACTCTTGATGGGTCTOTAGCTCAGGGGrrAGAGCAGGGG
ACTCATAA.TCCCTIGGTCGTGG01TCGAGCCCCACCGGACCCACCAATrCCGAA.GCCCGGACGTATGTTrGGGCTTmT
GCOKrCroTCKAACCAAAATGOTITCAGIAAACrTrGKra.
SEKW. ID. NR: 34
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lgtB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
TACAAAAATATTTCGCCGAATGATTAGCCGCCGTCGTGAATGAGACrTGGCGCAACTTtSGAGATnTGATTGTCGATGLAC
GGCTCGACAGACGGTACGCTIGCCATTGCCPAGGAinTCAAAAGCGGGA.CAGCCGTATCAAA?vTCCrTGCACAAGCIGA
AAA,TTCCGGCCTGATTCCCTCnTAAACATGGGGCTGGACGAATrGGCAAAGTCAGGAATGGGCX3AATATATTGCACGC;i
CCGATCCtGACGATATPGCCGCCCCCGACTGGATTGAGAAAATCGTGGGCGAGATGGAAAAAGACCGCAGCATCATCGCG
ATGGGOGCGTGGCTGGAAGTrrrGTCGGAAGAAAAGGACGGCAACCOGCTGGCGCGGCATCACAGGCACGGCAAAATnG
GAAAAAGCCGACCCeGCACGAAGATATtGCCGACrnTrCCCTTTCGGCAACCCCATACACAA.CAACACGATGA.TTAIGZŁ
GGCGCAGCGTCATTGACGGCGGTrrGCGTTACfA.CACCGAGCGGGATIGGGCGGAAGATrACCAATITrGGTACGATGTC
AGCAAATTGGGCA.GGCTGGOTTATrATGCCGAjAGCGTI.GGTCAAATACCGCCTTCACGCCAATCAGGTITCATCCAAATA
CAGCATCCGCCAA.CACGAAATCGCGCAAGGCATCCAAAAAACCGCCAGAAACGATrrrnGCAGTCTATGGGTTrTAAAA
CCCGG'r'TCGACAGCCTIGAA.TACCGCCAAATAAAAGCf..CTAGOGrATGAArrGCTGGAGAAA,CATrrrGCCGGAA.GAAGAT
TITCAACGCGCCCGCCGGTTTTTOTACCAATGCTTCA7\ACGGACGGACACGCIOCC(^CGGCGCGIGGCroGAT[TTGC
GCXAGACGGCAGGATGGWaXKTCTriACOTrGAGGCAATACTrCGGCATTrTGCACCGATTGCGGAAAAACCaTTGAA
0 AAACGCO3CITTATCCAACAGACAAAAAACAGGATAAATT
SEKW. ID. NR: 35
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lst z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
GCGCACGGCTnTTCTIGATCGGITrGAGGGTCGCCA.G&ATAiŁTCGGGGA.CGGCAAAGCCTTTAGACTGCAATTCTITAA
5 TCGCGGCGGTCAGTIGAGGTACGGATCCGCTGATGITCGGCAG1TTGATTACGTTK3CATCGGGCTOTTTCACCAGTTCG
CCCAATTGGGCfAGCGCGTCGGGTACGCGCTGCGCnTCGGTCAGATATCGGCGGAATGCCGCCAAAA-TACCKCCGGACAG
GCAAATGTCGCKlAGTrnGAGATCAATATGGOCGTGGCGGGGAAACGCiGrGCArAATCGGCAGCAGCGArroGGIGGCCA
GCGCGGGGGCTTCGTCGGTATGGGTATAAACAA.TGGTGGAtrrnGAGTCATAGGATTATrCTGrTOTAGGTIGGlTrn
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 36
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem msbB z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) 10 ^-CCGACGGCGAACAGACACGTCGrrGZWyTCAACCGCnGGACAGTACGGCGGCGCAATACGACATGCrTGCAGGTTATC TTGAAAGACTTGCCGGAAAAACCGACClSTTGGGCGTGCGCCTACCGCCiAAAIGCOTrCTGAACaCCCGATIATCCrnT
GAAAGCGCGATTATGCCCCATACCCTGCCCGATATTTCCCAATGTATCAGACAAAATTTCGAACAATATTTCAAAGACCT
GAACGGTACCGAACGTIGCGGCGTCTACGATAIGGTCTTGCATCAGGTGGAAAAACCGCIGCTGGTGrrGCGTGATGGAAC
AATGCGGCGGCAACCAGTCCAAAGCGICCGTCATGTTGGGACTGAACGGCAATAGrrrGCGTAAAAAACTGATTCAA.CAC 15 OCmiTCCICTCAATATCTCGGCAACCGTCOGTAItnTGGGTATTGACCCGGGCAGTCGCGTAAOGGGTrTCGGTGTCATC
GATGTCZOJGGGCGCGATCAITrTTAaGTCGCCTCCGGOTGCATCAAAACGCCTGCOGATCCGCCTCTGGCAGACAGGAT
IGCCJTTGA.TIGTGCGGCATATCGGCGAACTCGTTACCGTrTA.CAAGCCTCfACAGGCGGCAGTGGAACAGCTGrrCGTCfi
ACGTCAATCCGGCATCGACGCIGATGCTCGGTCAGGCTAGGGGCGCGGCAlTGGCGGCAnGGTCAGCCATAAGCTGCCC
GITTCGGAATACACGGCCTrGCAGGTCAAACAGGCGGTAGTCGGCAAGGGCAAGGCGGCAAAAGAACAGGIGCAGCATAT
0 OOTCGTGC/iGATCCTGGGGCTrrCGGGAA.CGCCGCACGAmGGCGGCEGACGGTCTIGCCGTCGCGCTGACCCA.CGCCrT
ACGCAACCiiCGGGCTTGCCGCCAi\ACTCAATCCrrCGGGGATGCAGGTCAAGO3CGGCA.GGTrrCAATAGlTrCfiGACGG
CATTTOTAITTTCCaTrCTGAAAAGAAAATGTGTATCGAG
SEKW. ID. NR: 37
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem htrB 25 z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B)
CCGCCAAGCGTTTCCCCCTTIGTCGGGCTTAACATriGCITIGTACGGOiGACTTITTCCCTrCATAiiCGCGGCCITTCC
GAAAAGKCGATGGTAGGCGCGACGTAATIGTCAACCCTGAAGGTACGGTIGGACGAAAAGTITrCCTTrTCATICCACCT
GKCAACnTTCGGOTACACCnAGTGGTCTCGlTAGGlTroGGCriAACTACHCCCITAAAAAAACGGACAlTCnTCCATC
PL 211 017 B1
CCCCTCTCTAAGGITrCACGGrAAGTTrACCCTTATAAiiGAGTTCACTrACCATACITATCCCTriAAAACGA.TATAAAG
GGCGACSGCICTAATACAAGTATGlTCTACGGCAGACITCITCrACCAAACA7«kAAGrTCOTriTAGAGTTACrC(3CTTA
TAGACAAATGAAGGCrTAGCCATAfSGCTTCCGGTAGGCCTATrrCAACCGCTGGTrcACAGGCTACGCrAAAACCTACGG
TAGAACCGCGTTCTGGGGTTrCGCGCACAGCGGCGTCTnGGAACCAGTroTCTCCGAACACGCATAACCGCCCOCTITA
ATGGlOGTGGCGGGl-rCACCTGATGTAGTITCAGCGlGCGCnTGGTAGlTrGCGTAGCCGATGTTGAGGAGGCTCGACC
CGAAACTACOGlTGCrGACGayjCAGCCITZACAlGATCCIGGTCCTTAGAGGCCTGTAGCGGGTrCaiCACrTGCrrCCG
CTTTCCGTAACKaACTTGGITCCGCGACCGCTCGlTCCAAACTACAAGCCGATACGGACWIGCTTrGGGGCIGGGACTA
CaKAAACGGTACSlTAATGTCGGTGGCGGACTACGTCGCAGTrrCGCTTAATGaTrrrCTCCCGGAGGACGGAACCGACG
CAGGGCIGCGTITira3GITCACTCGCA(XAAATCCTAlO3CITAGGCCGITTCATITrGCGTAACTATGGCAGCAGGAG
AG/iTACGlTCTOCTGOGCCTrrAGCCAATACTrCTCAACT
SEKW. ID. NR: 38
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem MltA z Neisseria meningitidis (grupy surowiczej B) CACAAAAACCAAGTTATGACGGGAATAAGGTACAGCAGCCAAACCAAGGCCTCGCCCTGC
GTCGGATGGTCGGTATAGCCGAAAAATCCGCCGAGCAGCACGCCCAACGGGCTGTCTTCG TGCAAATATTTTGATGAGTCGAACACAATGTCCTGAAGCGCGTTCCAAATGCCTGCTTCG TGCAGCGCACGGAGCGAACCGGCA.AGCAGACCAGCGGCAACGATAATCAGAAACGCCCCT
GTCCAACGGAAAAACTTCGCCAGATTCAGGCGCATCCCACCCTGATAAATCAACGCGCCA
ATCACGGCGGCAGCCAAAACCCCCGCTACCGCACCGGCCGGCATCTGCCACGTCGGGCTC
0 TGTTTGAATACGGCAAGCAGGAAAAAAACGCTCTCCAAACCTTCGCGCGCCACGGCAAGA AACGCCATACCGACCAAGGCCCATCCTTGACCGCTGCCACGGTTCAAAGCCGCCTGCACA GAATCCTGAAGCTGCCGCTTCATCGAACGGGCGGCTTTTTTCATCCATAAAATCATATAA GTCAGCATCGCGACAGCAACCAAACCGATAATGCCGACGACGAACTCCTGCTGCTTCTGG CGAATCTCGCCCGTTGCCGAATGGATTCCGTACCCCAGCCCCAAACACATCAAAGAAGCA
5 AGAACAACCCCGAACCAGACCTTAGGCATCAGTTTGGAATGTCCGGACTGTTTCAGAAAA
CCGGCAACGATGCCGACGATGAGCGCGGCTTCGATACCCTCGCGCAACATAATTAAAAAA
GCGACCAGCATAAACGCGAACGAACAAGGATGATGAATAATATATTATCGGAATATTTTC
ATTGCTTGTAAATACAAATGCAAGTTATTTTTATCTGCAGTACCGCGCGGCGGAAAGTTC
PL 211 017 B1
CGCAGCTGCAGCTGCGCCCTGTGTTAAAATCCCCTCTCCACGGCTGCCGCAACGCCGCCC
GAAACCATCTTTCTTATTACTGCCGGCAACATTGTCCATT
SEKW. ID. NR: 39
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem 5 ompCD z Moraxełla catarrhalis
GCTGATTTGTGAGCAAGCGGGCGCATCAGGGATTACCTTGCATTTGCGAGAAGATCGTCG
ACATATTCAAGATGAAGATGTTTATGAATTGATTGGGCAATTGACAACACGCATGAATCT
TGAGATGGCAGTCACTGATGAGATGCTAAATATTGCCCTAAAGGTACGACCAGCATGGGT
GTGTTTAGTACCAGAAAAACGCCAAGAGCTGACTACAGAAGGTGGGCTTGATATCGCCAA
TTTATCAAATATTCAAGCATTTATACACAGTCTTCAGCAGGCGGATATTAAGGTTTCTTT
ATTCATCGATCCAGATCCGCATCAAATTGATGCTGCAATTGCTTTGGGTGCTGATGCGAT
TGAGCTGCATACGGGAGCTTATGCTCAAGCGACTTTACAAAATAATCAAAAGCTTGTTGA
TAAAGAGCTTGACCGTATTCAAAAAGCCGTTGCAATGGCACAAAAAAAATCATCATTATT
GATTAATGCAGGTCATGGTTTGACGCGTGATAATGTTGCAGCGATTGCCCAAATTGATGG
TATTCATGAGCTGAATATCGGGCATGCATTGATTTCAGATGCGATATTTATGGGGCTTGA
TAATGCAGTCAAGGCAATGAAAATGGCTTTTATTCAAGATAAAACGACCAATCATTGATG
CGTTAGAAAGAAAATCGTAAATAATGATGACTATTGTGTAATATTATGTATTTTTGTTCA
AAAAAAGGTTGTAAAAAAATTCATTTACCATTAAGCTAAGCCCACAAGCCACAATGAATA
CCTATTGGTTTGACTCATTAGTCACTAAGAATCTGCAAAATTTTGTAACAGATTATTGGC
0 AGGTCTTGGATCGCTATGCTAAAATAGGTGCGGTAATCTTGAAAAACCAACCATTCCTTG
GAGGAATTTATGAAAAAGGGATATAAACGCTCTTGCGGTCATCGCAGCCGTTGCAGCTCC
AGTTGCAGCTCCAGTTGCTGCTCAAGCTGGTGTGACAGTC
SEKW. ID. NR: 40
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem copB z Moraxella catarrhalis
GATGCTGTTAAAGTGGGTATTGGTCCTGGTTCTATTTGTACAACCCGTATTGTTGCAGGC
ATTGGCGTCCCGCAGATAAGTGCCATTGATAGTGTGGCAAGTGCGTTAAAAGATCGCATT
CCTTTGATTGCCGATGGCGGTATTCGTTTTTCGGGTGATATCGCCAAAGCCATCGCAGCA
PL 211 017 B1
GGCGCTTCATGTATTATGGTGGGTAGCTTGTTGGCAGGTACCGAAGAAGCACCTGGTGAG
GTGGAATTATTCCAAGGTCGTTATTATAAGGCTTATCGTGGTATGGGCAGCTTGGGGGCA
ATGTCTGGTCAAAATGGCTCATCGGATCGTTATTTTCAAGATGCCAAAGATGGTGTTGAA
AAACTGGTTCCAGAGGGTATCGAAGGCCGTGTTCCTTATAAAGGCCCTGTGGCAGGCATC
ATCGGTCAATTGGCAGGTGGTCTAAGATCATCCATGGGTTATACAGGTTGCCAGACCATC
GAACAGATGCGTAAGAATACCAGCTTTGTCAAAGTGACTTCCGCAGGCATGAAGGAATCG
CATGTACACGATGTACAGATTACCAAAGAAGCACCCAATTATCGCCAAAATTAACTCTAT
TAATAGCAAATACAAGCACTCATTAGATAGGGTGGGTGCTTTTTAGAGCATAAAAAATAA
ACTGACACATGACTTATTGTCATATTTTTAAAATGCTTTTAATTTAGATTTTTAATTTAG
ATAATGGCTAAAAATAACAGAATATTAATTTAAAGTTTTCAAAATCAAGCGATTAGATGA aattatgaaaataaataacaataattctgatttattttaaccaataatatcaattatcat TTACAAGAAAAATTTTTTTTGATAAAATTCTTACTTGTACCTTGCTATTTTTTCTTATTT ATCATTTTTGGCGGTATTTTCGTTGATTTTAGTAAGTAGATGAGCAAGGGATAATTTGAC
AAAAACAAATTTGATTTCAAGCCTCATAATCGGAGTTATT
SEKW. ID. NR: 41
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem D15 z Moraxella catarrhalis
AAAACTGGTGATGTCTTCACTGCTATTCATGGTGAACCAATCAATGATTGGCTAAGTGCC
ACCAAGATTATTCAGGCAAATCCAGAAACCATGCTTGATGTGACAGTCATGCGTCAAGGT
0 AAGCAGGTTGATTTAAAATTAATGCCCCGTGGTGTAAAGACACAAAACGGCGTAGTCGGT CAACTGGGTATTCGCCCCCAGATTGATATCGATACGCTCATTCCTGATGAATATCGTATG ACGATTCAATATGATGTCGGTGAGGCATTTACTCAAGCCATCCGACGAACTTATGATTTA TCAATAATGACCTTAGATGCGATGGGTAAGATGATTACAGGATTGATTGGCATTGAAAAT CTATCAGGTCCCATTGCCATTGCCGATGTTTCTAAGACCAGTTTTGAGTTGGGATTTCAA
5 GAAGTGTTATCGACAGCCGCAATCATCAGTTTAAGCTTGGCAGTACTGAATCTTTTACCC ATTCCAGTGTTAGATGGCGGGCATTTGGTATTTTATACTTATGAATGGATTATGGGCAAA TCTATGAATGAAGCGGTGCAGATGGCAGCATTTAAAGCGGGTGCGTTATTGCTTTTTTGT TTCATGTTACTTGCAATCAGTAACGATATCATGCGATTTTTTGGCTAAGTTCTGATTTAT
PL 211 017 B1
CGTACCATTAACAAAATTTTTGGCTTTTTTAAGCTGAAATACTTGCCAAATTTAACTTTT
TGGCTTACCTTTACACAATATAAATTTGGGTGTAGAAAATTTTGGATACATTTTTATACC
TTATTTTTAGAAATTTTAAAAATTAAGTTTGGATAGACTTATGCGTAATTCATATTTTAA
AGGTTTTCAGGTCAGTGCAATGACAATGGCTGTCATGATGGTAATGTCAACTCATGCACA
AGCGGCGGATTTTATGGCAAATGACATTGCCATCACAGGACTACAGCGAGTGACCATTGA
AA.GCTTAC7LAAGCGTGCTGCCGTTTCGCTTGGGTCAAGTG
SEKW. ID. NR: 42
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem omplA z Moraxella catarrhalis
ACTTGGCGAAAATACCATTTATATCGATTGTGATGTTATACAGGCAGATGGCGGTACACG
CACAGCCAGTATCAGTGGTGCTGCGGTGGCACTTATTGATGCTTTAGAACACTTGCAGCG
TCGTAAAAAGCTTACCCAAGATCCGCTTTTGGGCTTGGTGGCAGCGGTTTCTGTGGGTGT
TAATCAAGGCCGTGTATTGCTTGATTTGGATTATGCTGAAGATTCAACTTGTGATACCGA
TTTAAATGTGGTCATGACGCAGGCAGGTGGGTTTATTGAGATTCAAGGCACAGCAGAAGA
AAAGCCATTTACTCGTGCTGAAGCTAATGCGATGCTTGATTTGGCAGAGCTGGGAATTGG
GCAGATTATCGAAGCCCAAAAGCAAGTATTAGGCTGGTGATATGCTAATCGTTGAAGATA
ATGGCGTGATCATCACATTAAATGGACAAGTAAAAGACCCATTATTTTGGTGGTCGATGA
TATTGCTGCTGCTGGGTGTCTTGGTGGCAATCATTTGTTTGATTGCACCCGTTTTTTATG
CAATCGGTGCGTTGGCTTTATTTGCAGTTGTGGTATTTGTGTTTAATATTCAAAGGCAAA
0 AAGCCAAAACTTGTCATATGTTTTCACAAGGTCGCTTGAAGATTACGTCCAAACGCTTTG
AGATTCATAACAAATCACTAACCTTATCAGCATCGGCAACAATATCTGCTAAAGATAACA
AAATGACAATTGTTGATCGGGGCATTGAATATCATTTTACAGGTTTTGCTGATGACCGTG
AAATTAATATAGCCAAACAGGTACTTTTGGGAAAGTCAATCAAAACCAATGCGGTGGCGG
TAACATTGGCTAAGTAGTTGTTGTGATACAGACAGGTTGGATGGTCTTTAACTCCACCCA
5 CCTAACTTTTTCTTTGTTTGGATTTAAGAGTATGTTATGATGGGCAGGATTTTATTTTAA
GTCATCATTTAATGCAATCAGTTGTCCAGAGTAGCCGTTC
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 43
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem hly3 z Moraxella catarrhalis
GTGATCGGCAACACCCCACCATTCAGGAGCAACCAAAATTGCCCGTGCCTTGCCTGTCTT
GGTGGTATCATTTGGCAGGGCAATGTGGCTAAGTAGTGGTGTGCCATCAGGTGCGGTGGT
GGTGAGTGTACGATTCGTTATTGTCATAAAATTATCCTTTTGGGTTGGATGATATCAATG
AAATACCCTACGGTTGTATGGAATTTTATCCATTGTACCACGGTATTGGTCTTTTTAAAT
TAACAAGCAGCTTCTAGCAAGTCAAAGTTTTTATGCCTATTTTTTCAGATTTTAAGGTAC
AATAAAGCCAATTGTTAATAATATGGTATTGTCATGATTTATGATGAATTGCGACCAAAA
TTTTGGGAAAATTATCCCTTAGATGCGTTAACAGATGCTGAATGGGAAGCATTATGTGAC
GGATGTGGCGCGTGTTGTTTGGTGAAATTTCTTGATGATGACAATGTTAAATTGACCGAA
TATACCGATGTTGCCTGCCAGCTATTGGATTGCTCAACAGGATTTTGCCAAAACTATGCC
AAGCGTCAAACGATTGTGCCAGATTGTATTCGCTTAACACCTGATATGCTGCCTGATATG
CTGTGGTTGCCACGCCATTGTGCTTATAAGCGGTTGTATCTTGGGCAAAATCTGCCAGCA
TGGCACAGGCTCATTAAACATAGCCAAAACCATGGTGCAGGATTTGCGAAAGTTTCAACT
GCTGGGCGATGTGTGAGTGAGCTTGGTATGAGTGATGAAGACATAGAAAGGCGAGTGGTG
AAATGGGTTAAACCTTGACATGATTGTTGACATGATTGACAGACAATAAAAATTGGCAAA
TTTGATAAAATTGGTGTATGTGTGTGATTTTATCAAAAGCACTTGAATAAAACCGAGTGA
TACGCTAAATTGTAGCAAACCAATCAATTCATCATAATTTTAATGAACACGAGGTTAAAT
0 TATACTGTCTATGTCTGATGACAATTCAAGCACTTGGTCG
SEKW. ID. NR: 44
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lbpA z Moraxella catarrhalis
TAACAAAGGCAACCCAACACGCAGTTATTTTGTGCAAGGCGGTCAAGCGGATGTCAGTAC
5 TCAGCTGCCCAGTGCAGGTAAATTCACCTATAATGGTCTTTGGGCAGGCTACCTGACCCA
GAAAAAAGACAAAGGTTATAGCAAAGATGAGGATACCATCAAGCAAAAJ1GGTCTTAAAGA
TTATATATTGACCAAAGACTTTATCCCACAAGATGACGATGACGATGACGATGACGATAG
TTTGACCGCATCTGATGATTCACAAGATGATAATACACATGGCGATGATGATTTGATTGC
PL 211 017 B1
ATCTGATGATTCACAAGATGATGACGCAGATGGCGATGACGATTCAGATGATTTGGGTGA
TGGTGCAGATGATGACGCCGCAGGCAAAGTGTATCATGCAGGTAATATTCGCCCTGAATT
TGAAAACAAATACTTGCCCATTAATGAGCCTACTCATGAAAAAACCTTTGCCCTAGATGG
TAAAAATAAGGCTAAGTTTGATGTAAACTTTGACACCAACAGCCTAACTGGTAAATTAAA
CGATGAGAGAGGTGATATCGTCTTTGATATCAAAAATGGCAAAATTGATGGCACAGGATT
TACCGCCAAAGCCGATGTGCCAAACTATCGTGAAGAAGTGGGTAACAACCAAGGTGGCGG
TTTCTTATACAACATCAAAGATATTGATGTTAAGGGGCAATTTTTTGGCACAAATGGCGA
AGAGTTGGCAGGACGGTTACATCATGACAAAGGCGATGGCATCACTGACACCGCCGAAAA
AGCAGGGGCTGTCTTTGGGGCTGTTAAAGATAAATAAAGCCCCCCTCATCATCGTTTAGT
CGCTTGACCGACAGTTGATGACGCCCTTGGCAATGTCTTAAAACAGCACTTTGAAACAGT
GCCTTGGGCGAATTCTTGGATAAATGCACCAGATTTGCCTCGGGCTAATATCTTGATAAA
ACA.TCGCCATAAAATAGAAAATAAAGTTTAGGATTTTTTT
SEKW. ID. NR: 45
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lbpB z Moraxella catarrhalis
CAGCTTGTACCATTTGGTGAATATATACCATTTGGTGGTTTGTTGGATATTTTACCAGGG
CTTGAGGGTGTCGCTAGCCTAAGCCGTGGCGATGATAAGCAACCACCGCTCAAATTGGGC
GGCGGCGTGGGCGATACGATTGGTGCGGCAATTTGTTATGAGGTGGCATATCCTGAGACG
ACGCGTAAAAATGCACTTGGCAGTAATTTTTTATTAACCGTCTCAAACGATGCTTGGTTT
0 GGTACAACAGCAGGTCCTTTGCAGCATTTACAAATGGTGCAAATGCGAAGCTTGGAGACG
GGGCGATGGTTTGTGCGTGCAACAAACAACGGAGTGACTGCATTAATTGACCATCAAGGA
CGGATTATCAAGCAGATACCGCAGTTTCAGCGAGATATTTTGCGAGGTGATGTACCCAGT
TATGTTGGACACACGCCTTATATGGTTTGGGGGCATTATCCCATGTTGGGGTTTTCTTTG
GTGCTGATTTTTCTTAGTATCATGGCAAAGAAAATGAAAAATACCACCGCCAAACGAGAA
5 AAATTTTATACCGCTGATGGTGTGGTAGACCGCTGAATTGTGCCACTTTGGGCGTTAGAG
CATGAGCAAGATTAGGCGTTGGGTGAGCTTTGGTTGTATTACTCATCAGCCTACCCGAAA
CCTGCCAAACATCACCGCCCAAAACCTAAACATACAATGGCTAAAAATATCAGAAAATAA
CTTGCTGTATTGTAAATTCTTATGTTATCATGTGATAATAATTATCATTAGTACCAAGAT
PL 211 017 B1
ATCCATTACTAAACTTCATCCCCCATCTTAACAGTTACCAAGCGGTGAGCGGATTATCCG
ATTGACAGCAAGCTTAGCATGATGGCATCGGCTGATTGTCTTTTTGCCTTGTTGTGTGTT
TGTGGGAGTTGATTGTACTTACCTTAGTGGTGGATGCTTGGGCTGATTTAATTAAATTTG
ATCAAAGCGGTCTTCACAACACACCAAACGAGATATCACC
SEKW. ID. NR: 46
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem tbpB z Moraxella catarrhalis
AGTTTGCCCTGATTTTGAGAGCCACTGCCATCATGAATTTGTTGGCGTAAACACCACTCG
TATTCTTCTTCGGTTTCCCCTTTCCATGCAAACACAGGGATACCAGCGGCCGCCATGGCA
GCGGCGGCGTGGTCTTGGGTGCTAAAAATATTGCATGATGTCCAGCGAACTTCTGCACCC
AAGGCAACCAAAGTCTCAATCAGCACCGCTGTTTGAATGGTCATGTGGATACAGCCTAGG
ATTTTAGCACCCTTAAGTGGTTGCTGGTCTTGATAGCGTTTTCTTAACCCCATCAGGGCT
GGCATCTCAGCTTCTGCCAAGGCAATCTCACGGCGACCATAATCGGCTAAACGGATATCA
GCGACTTTATAATCGGTGAAGTTTTGGGTGGTACTTGGATTGATTGAGGTAGGCATATCT
TTATTCCTAAGCTATTTTAAAGTATTTTTAACAATAATTTTGATGAATTTGAGATAATTG
ATGCTAAAAGGTTGAATGACCAAACCATCGCTAACAATCAAGAAAAGACATTTTAAGCAT
AAAAAGCAAATGTGTCTTGATGGCTTATTATAACAGTTATTATGATAAATTTGGGTAGAA
AGTTAAATGGATCGTTGGGTAAGTTTGTTGGCTATCCTTAATTAATTATAATTTTTTAAT
AATGCTTTTACTTTATTTTAAAAATAGAGTAAAAAATGGTTGGCTTTGGGTTTTTATCTC
0 actatggtagataaaattgatacaaaatggtttgtattatcacttgtatttgtattataa ttttacttatttttacaaactatacactaaaatcaaaaattaatcactttggttgggtgg
TTTTAGCAAGCAAATGGTTATTTTGGTAAACAATTAAGTTCTTAAAAACGATACACGCTC
ATAAACAGATGGTTTTTGGCATCTGCAATTTGATGCCTGCCTTGTGATTGGTTGGGGTGT
ATCGGTGTATCAAAGTGCAAAAGCCAACAGGTGGTCATTG
SEKW. ID. NR: 47
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem tbpA z Moraxella catarrhalis
TTGGGGGCGGATAAAAAGTGGTCTTTGCCCAAAGGGGCATATGTGGGAGCGAACACCCAA
PL 211 017 B1
ATCTATGGCAAACATCATCAAAATCACAAAAAATACAACGACCATTGGGGCAGACTGGGG
GCAAATTTGGGCTTTGCTGATGCCAAAAAAGACCTTAGCATTGAGACCTATGGTGAAAAA
AGATTTTATGGGCATGAGCGTTATACCGACACCATCGGCATACGCATGTCGGTTGATTAT
AGAATCAACCCAAAATTTCAAAGCCTAAACGCCATAGACATATCACGCCTAACCAACCAT
CGGACGCCCAGGGCTGACAGTAATAACACTTTATACAGCACATCATTGATTTATTACCCA
AATGCCACACGCTATTATCTTTTGGGGGCAGACTTTTATGATGAAAAAGTGCCACAAGAC
CCATCTGACAGCTATGAGCGTCGTGGCATACGCACAGCGTGGGGGCAAGAATGGGCGGGT
GGTCTTTCAAGCCGTGCCCAAATCAGCATCAACAAACGCCATTACCAAGGGGCAAACCTA
ACCAGTGGCGGACAAATTCGCCATGATAAACAGATGCAAGCGTCTTTATCGCTTTGGCAC
AGAGACATTCACAAATGGGGCATCACGCCACGGCTGACCATCAGTACAAACATCAATAAA
AGCAATGACATCAAGGCAAATTA.TCACAAAAATCAAATGTTTGTTGAGTTTAGTCGCATT
TTTTGATGGGATAAGCACGCCCTACTTTTGTTTTTGTAAAAAAATGTGCCATCATAGACA
ATATCAAGAAAAAATCAAGAAAAAAAGATTACAAATTTAATGATAATTGTTATTGTTTAT
GTTATTATTTATCAATGTAAATTTGCCGTATTTTGTCCATCACAAACGCATTTATCATCA
ATGCCCAGACAAATACGCCAAATGCACATTGTCAACATGCCAAAATAGGCATTAACAGAC TTTTTTAGATAATACCATCAACCCATCAGAGGATTATTTT
SEKW. ID. NR: 48
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem ompE z Moraxella catarrhalis
0 AAAGACATTACACATCATCATTCAAACGCCCAACCATGTACCTCTGCCCCGTGGTCGCAC
GCCAACGCTTTTTGATGCGGTGCGTTGGGTTCAGATGGCTTGTCAATCATTTGGTTTTAT
TAAAATTCATACCTTTGGTAGTTTGGCTTTACCTGATATGTCATTTGATTATCGAAACAA
TACGCAGTTGACCAAACATCAATTTTTAGCCATTTGCCAAGCACTCAATATTACCGCTCA
TACGACCATGCTTGGTATTAAATCATCACATAAAGATACTTTACATCCATTTGAATTGAC
5 ATTACCCAAATACGGCCATGCCTCAAATTATGATGATGAATTGGTGCAAAACAATCCATT
GGCTTATTTTCATCAACTGTCTGCCGTCTGCCGATATTTTTATACCCAAACGGTTTGTAT
TGTTGGCGGTGAAAGCTCAGGGAAAACTACCTTGGTGCAAAAACTTGCCAATTATTATGG
TGCCAGCATCGCACCTGAAATGGGTCGATTATACACACACTCCCATCTCGGCGGTAGCGA
PL 211 017 B1
ACTTGCCCTTCAATACAGCGACTACGCATCCATTGCCATCAATCACGCCAACGCTATCGA
AACCGCTCGTACCACTGCCAGCTCTGCTGTTACACTGATTGATACTGATTTTGCGACAAC gcaagcattttgtgaaatttatgaagggcgaacgcatccgcttgtcgcagaatttgctaa
ACAAATGCGATTGGATTTTACGATTTATTTAGATAATAATGTTGCTTGGGTCGCTGATGG
CATGCGTAGGCTTGGTGATGATCATCAACGCAGTTTGTTCGCCAATAAATTGCTTGAGAT
TTTGGCACGATATGATATTAGTTATCATATCATTAATGACACCGACTACCACAAACGCTA
TCTACAAGCATTAAGCTTGATAGACAATCATATTTTTAATCATTTTACAAAAATTCATGA
CAATTAATTAGGGAAAATCTGATGAAAATTGATATTTTAG
SEKW. ID. NR: 49 io Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem uspal z Moraxella catarrhalis
GGATGTGGCATATCTGCCCATCGACCCAATACACATCGGTCGAGGCTATCAAGATGTGGT
ACGAATTAATAGCCAGTCAGGTAAGGGCGGTGCTGCGTATATCTTGCAGCGGCATTTTGG
TTTTAATTTACCACGCTGGACACAGATTGATTTTGCTCGTGTGGTACAGGCTTATGCAGA
AAGTATGGCGCGTGAACTAAAAACTGATGAGCTGCTTGAAATTTTTACCCAAGCGTATCT
TAAGCAAGATAAATTCCGCCTAAGTGACTAIACCATCAGCAATAAAGGCGATGCTGTCAG
CTTCCAAGGCCAAGTAGCGACACCCAAAGCGGTGTTTGAGGTGATTGGTCAAGGCAATGG
TGCGTTATCTGCGTTCATTGATGGCTTGGTGAAATCCACAGGCAGACAGATTCATGTCAC
CAATTACGCCGAACACGCCATCGATAACAAAACCCATCAAAAAACCGATACGGATAACCA
AACCGATGCCGCCGTGCCGCTTATATCCAGCTGTCGGTAGAGGGGCAGATTTATTCAGGC
ATCGCCACTTGCCATAGCACCGTATCCGCCATGCTAAAAGGTGCATTATCCGCTTTGGCA
CAGGCGTGGTAATCTGACCCAATCAAAATCCTGCATGATGGCAGGATTTTATTATTTAGT
GGGCTGCCCAACAATGATGATCATCAGCATGTGAGCAAATGACTGGCGTAAATGACTGAT
GAGTGTCTATTTAATGAAAGATATCAATATATAAAAGTTGACTATAGCGATGCAATACAG
TAAAATTTGTTACGGCTAAACATAACGACGGTCCAAGATGGCGGATATCGCCATTTACCA
ACCTGATAATCAGTTTGATAGCCATTAGCGATGGCATCAAGTTGTGTTGTTGTATTGTCA
TATAAACGGTAAATTTGGTTTGGTGGATGCCCCATCTGATTTACCGTCCCCCTAATAAGT
GAGGGGGGGGGAGACCCCAGTCATTTATTAGGAGACTAAG
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 50
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem uspa2 z Moraxella catarrhalis
CCCCAAGCTTTCCGTTTGTGTGCCTGCTGGTGTCGGGCGGTCATACCATGCTGGTGCGTG
CCGATGGTGTGGGCGTGTATCAGATATTGGGCGAGTCTATCGATGATGCGGTGGGTGAAT
GCTTTGATAAAACGGCAAAAATGCTCAAACTGCCCTATCCTGGTGGCCCAAATATCGAAA
AATTAGCCAAAAACGGCAACCCACA.CGCCTATGA.GCTGCCAAGACCCATGCAGCATAAAG
GGCTGGATTTTTCGTTCAGTGGCATGAAAACCGCCATTCATAATCTCATCAAAGACACAC
CAAACGCCCAAAGCGACCCCGCCACACGAGCAGACATCGCCGCAAGCTTTGAGTATGCGG
TGGTGGATACTTTGGTCAAAAAATGCACCAAAGCACTACAGATGACAGGCATTCGCCAGC
TGGTGGTCGCAGGGGGCGTCTCTGCCAATCAGATGCTACGCCGCACCCTGACCGAGACGC
TCCGCCAAATCGATGCGTCGGTGTACTATGCCCCGACCGAGCTATGCACGGATAATGGTG
CGATGATCGCCTATGCTGGCTTTTGTCGGCTCAGCTGTGGACAGTCGGATGACTTGGCGG
TTCGCTGTATTCCCCGATGGGATATGACGACGCTTGGCGTATCGGCTCATAGATAGCCAC
ATCAATCATACCAACCAAATCGTACAAACGGTTGATACATGCCAAAAATACCATATTGAA
AGTAGGGTTTGGGTATTATTTATGTAACTTATATCTAATTTGGTGTTGATACTTTGATAA
AGCCTTGCTATACTGTAACCTAAATGGATATGATAGAGATTTTTCCATTTATGCCAGCAA
AAGAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGAACTCTGTCTTTTATCTGTCCGCTGATGCTT
TCTGCCTGCCACCGATGATATCATTTATCTGCTTTTTAGGCATCAGTTATTTCACCGTGA
0 TGACTGATGTGATGACTTAACCACCAAAAGAGAGTGCTAA
SEKW. ID. NR: 51
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem omp21 z Moraxella catarrhalis
GAGTGAACTTTATTGTAAAATATGATTCATTAAAGTATCAAAATCATCAAACGCAGCATC
5 AGGGTTTGCTAAATCAATTTTTTCACCATAATTATAGCCATAACGCACAGCAAGCGTAGT
TATGCCAGCGGCTTGCCCTGATAAAATATCATTTTTGGAATCACCAACCATAATGGCATC
AGTCGGTGCGATGCCCAGTGATTGACACAGGTATAATAAAGGCGTTGGGTCGGGCTTTTT
GACGCTGAGCGTATCACCGCCAATCACTTGGTCAAACAGTGTCAGCCATCCAAAATGTGA
PL 211 017 B1
TAAAATTTTAGGCAAATAACGCTCAGGCTTATTGGTACAAATTGCCAAATAAAACCCCGC
TGCTTTTAATCGTTCAAGCCCTTGTATAACCCCTGCATAGCTTTGCGTATTTTCAATTGT
TTTATGGGCATATTCTGCCAAAAATAACTCATGGGCATGGTGAATCATAGTCGTATCATA
GATATGATGTGCTTGCATTGCTCGCTCAACCAATTTTAGCGAACCATTGCCCACCCAGCT
TTTGATGATATCAATTGGCATAGGCGGTAAGTTAAGCTTGGCATACATGCCATTGACCGC
CGCCGCCAAATCAGGGGCACTATCGATAAGCGTACCATCCAAATCAAATATAATCAGTTT
TTTGCCAGTCATTGACAGTGTTTGCATGCTTTTTCCTTATTCTTAAAATTGGCGGCTGTT
TGGTATTTTTTAAATCAGTCAATTTTTACCATTTGTCATATAATGACAAAGTACAAATTT
AGCAATATTTTAGTGCATTTTTTGGCGAAGTTTTATGAAAACTGGTCATTGGTTGCAAAA
CTTTACACAGTACCTATAAAACTTGCACAGTTAATAAGAAATATTTTGTTACTATAGGGG
CGTCATTTGGAACAAGACAGTTATTTGTAAATAGTTATTTGCAAAAGACGGCTAAAAGAC
AGAACAGCGTTTGTTTCAGTGATTAACTAGGAGAAAAACA
SEKW. ID. NR: 52
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem 15 ompl06 z Moraxella catarrhalis
TTGATCGGTTTTGCCCCACTGTTTCATGATTTACTCAAAACAGGCGGCTTGATCGTGCTG
GCAGGTCTGACCCAAAACCAAACCCAAGCGGTCATCGATGCCTACTCGCCTTATGTTACG
CTTGATACGCCATTTTGTTATGCAGATGCCCAAGACTGCCATTGGCAACGCCTAAGCGGC
ATCAAACCTACCAACCCATAAGCGATATGCCATGAGCCACAAACCTAAGCCAACACCGCT
0 ATATCAACAAGTTGAGCAGACCGCCAAGCGTTATTTTGAGACATTGGGCGATGCTCATAC
TCATGATGTCTATGCCACTTTTTTGGCCGAATTTGAAAAACCGCTGCTCATCGCCGCACT
CAATCACACGCACGGCAATCAGTCAAAAACCGCCCAAATCCTTGGTATCAATCGTGGCAC
ATTACGCACCAAAATGAAAACCCATCACTTACTTTAGACCGCCAGTTATCGCCATGGATA
TGGGCAGGTGTGCTCGCCTGCCGTATGATGGCGATGACACCCCATTTGCCCCATATCTGC
5 ACGATTTGACATGATTTAACATGTGATATGATTTAACATGTGACATGATTTAACATTGTT
TAATACTGTTGCCATCATTACCATAATTTAGTAACGCATTTGTAAAAATCATTGCCCCCT
TTTTTTATGTGTATCATATGAATAGAATATTATGATTGTATCTGATTATTGTATCAGAAT
GGTGATGCCTACGAGTTGATTTGGGTTAATCACTCTATTATTTGATATGTTTTGAAACTA
PL 211 017 B1
ATCTATTGACTTAAATCACCATATGGTTATAATTTAGCATAATGGTAGGCTTTTTGTAAA
AATCACATCGCAATATTGTTCTACTGTTACCACCATGCTTGAATGACGATCCAAATCACC
AGATTCATTCAAGTGATGTGTTTGTATACGCACCATTTACCCTAATTATTTCAATCAAAT
GCCTATGTCAGCATGTATCATTTTTTTAAGGTAAACCACC
SEKW. ID. NR: 53
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem HtrB z Moraxella catarrhalis
ACTATTCTGCTTTTTGTTTTTCACGAATGCGAATGCCCAACTCACGCAACTGGCGATTAT
CAACTTCAGCAGGTGCTTCGGTCAATGGGCAATCTGCCGTCTTGGTTTTTGGGAAGGCGA o tcacatca.cggattgagctggcaccaaccatcagcataatcaggcgatctagaccaaatg
CCAAPiCCACCGTGCGGCGGTGCACCAAAACGCAATGCATCCATCAAAAACTTAAACTTAA
GCTCTGCTTCTTCTTTAGAAATACCCAAGGCATCAAATACCGCCTCTTGCATGTCAACCG
TATTAATACGCAGCGAACCGCCACCAATTTCTGTGCCATTTAGTACCATGTCATAGGCAA
TGGATAGGGCGGTTTCGGGACTTTGTTTGAGTTCCTCAACCGAGCCTTTTGGGCGTGTAA
AAGGATGATGAACTGATGTCCACTTACCATCATCAGTTTCCTCAAACATTGGAAAATCAA
CGACCCAAAGCGGTGCCCATTCACAGGTAAATAAATTTAAATCAGTACCGATTTTAACAC
GCAATGCACCCATAGCATCATTGACGATTTTGGCTTTATCGGCACCAAAGAAAATGATAT
CGCCAGTTTGGGCATCGGTACGCTCAATCAGCTCAATCAAAACCTCATCGGTCATATTTT
TAATGATGGGTGATTGTAATCCTGATTCTTTTTCAACGCCATTATTGATATTGCTTGCGT
0 CATTGACCTTAATATATGCCAATCCACGAGCGCCATAAATACCAACAAATTTGGTGTACT
CATCAATCTGCTTGCGACTCATGTTACCGCCATTTGGAATGCGTAAGGCAACAACACGGC
CTTTAGGATCTTGGGCGGGCCCTGAAAATACTTTAAATTCAACATGTTGCATGATGTCAG
CAACATCAATAAGTTTTAAGGGAATGCGTAAATCAGGCTTATCTGAGGCATAATCACGCA
TGGCATCTGCGTAAGTCATGCGGGGGAAGGTATCAAACTCA
SEKW. ID. NR: 54
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem MsbB z Moraxella catarrhalis
TGGATCATATTCTTTATTAATGGTACTGTTTAAACCTGTATTTTAAAGTTTATTGGGTCA
PL 211 017 B1
TATTTTCAAGCTCATCCCATCGCTCAAGCTTCATCATCAAAAGCTCATCAATCTCTACCA
ATCGCTCACCAGCCTTCGTTGCTGCCGCCAAATCGGTATTAAACCATGAACCATCTTCAA
TCTTTTTGGCAAGCTGTGCCTGCTCTTGTTCAAGTGCAGCAATTTCATTAGGCAAATCTT
CAAGTTCACGCTGCTCTTTATAGCTGAGTTTGCGTTTTTGGGCAACGCCTGATTGAGGTG
GTTTGATTTGGATGGGTTCAGCGGGTTTTGTCGCCTTAGGTTTATTGTCTGTGGCGTGAT
GAGCAAGCCATCTTTCATGCTGTTGTACATAGTCTTCATAACCGCCAACATATTCCAAAA
CGATACCGTCGCCGTACTTATCAGTATCAAATACCCAAGTTTGGGTAACAACATTATCCA
TAAAAGCACGGTCATGGCTGATGAGTAATACCGTGCCTTTAAAATTGACCACAAAATCTT
CTAAAAGCTCAAGTGTTGCCATATCCAAATCATTGGTAGGCTCATCAAGCACCAAAACAT
TGGCAGGTTTTAGCAATAATTTGGCCAATAAAACGCGTGCTTTTTCACCGCCTGATAGTG
CTTTAACAGGTGTGCGAGCACGATTTGGCGTGAATAAAAAATCTTGCAAATAGCTTAAAA
TGTGCGTAGTTTTTCCACCAACATCGACATGGTCAGAGCCTTCTGAAACATTATCTGCGA
TAGATTTTTCAGGGTCTAGGTCGTCTTTGAGTTGGTCAAAAAAAGCAATATTTAGATTGG
TGCCAAGCTTAACTGAACCTGACTGAATCGCTGAATCATCCAAACCCAAAATGCTTTTAA
TTAAGGTTGTTTTACCAACGCCATTTTTGCCAATGATACCAACTTTATCACCACGAACAA
GCAGCGTTGAAAAATCCTTAACTAAGGTTTTATTGTCGTAT
SEKW. ID. NR: 55
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem PilQ z Moraxella catarrhalis
0 CAACTTGAAAATCAGCTCAATGCTCTGCCACGCACAGCACCGATGAGCGAGATTATCGGA
ATGATAAATACCAAAGCACAAGCGGTTAATGTGCA.GGTGGTGAGTGCATCAGTTCAAGCA
GGTCGTGAACAGGATTATTATACCGAACGCCCTATCGCAGTGAGTGCGACAGGGGATTAT
CATGCTTTGGGTCGATGGTTACTTGAGTTGTCAGAGGCTAACCATTTGCTGACAGTGCAT
GATTTTGATCTGAAGGCTGGTTTGAACCATCAGCTGATGATGATTGTTCAGATGAAAACT
5 TATCAAGCGAACAAACGCCCAAAACCAGTTGCTCAGCAGGTGCCTGATGTTCAATGAATA
TTATCGGTGGGGCATTTTGGGTGCTTGGATTTGGGTTGGGATTGGATGTGCTGATAGCAC
CAGTCAAGTTGTTGATGATAAGCTTGCACATATTACCCATGAAGAGCGTATGGCGATCAG
TGAGCCTGTGCCGATACCCTTATCTGTGCCGATGATATATCAGCAAGGCAAAGATCCTTT
PL 211 017 B1
TATCAATCCTTATAGAAATGTTGAGGTTCTTGATACCAATCATGCCGCTGATCAGCAAGA
TGAGCCAAAAACCGAATCTACCAAAGCTTGGCCTATGGCAGACACTATGCCATCTCAGCC
ATCTGATACTCATCAGTCTGCCAAGGCTCAGGCACAAGTCTTCAAAGGCGATCCGATAGT
CATTGATACCAACCGTGTTCGAGAGCCTTTAGAAAGCTATGAGTTATCAAGCCTACGCTA
TCATGGTCGTATTTTTGATGATGTTAGACTTGTGGCACTCATTATGAGTCCTGATGGCAT
CGTTCATCGTGTGAGTACTGGACAATATCTTGGTAAAAATCACGGAAAAATTACCCATAT
TGACAGTCGTACGATACATCTGATTGAAGCGGTCGCTGATACACAAGGTGGCTATTATCG
CCGTGATGTAAACATTCATTTTATTCATAAGCAATGACAC
SEKW. ID. NR: 55 io Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipol8 z Moraxella catarrhalis
TTCATGCAACAAGCGACCATCTTGGCCGATGATACCATCCTGCTCACCTAAGAAAATCAG
TTTATCAGCTTGCAGGGCAATGGCTGTGGTCAGTGCTACATCTTCTGCCAATAGATTAAA
AATTTCGCCCGTAACCGAAAAACCTGTCGGTCCTAGTAGGACAATATGGTCATTATCCAA
ATTATGGCGAATGGCATCGACATCAATTGAGCGTACCTCACCTGTCATCTGATAATCCAT
ACCATCTCTGATGCCGTAAGGGCGAGCGGTGACAAAATTACCCGAAATGGCATCAATACG
AGATCCGTACATTGGGGAGTTAGCAAGCCCCATCGACAGCCGAGCTTCGATTTGTAGACG
AATTGAGCCGACTGCCTCCAAGATGGCAGGCATAGATTCATACGGTGTTACACGCACATT
CTCATGTAGGTTTGATATCAGCTTGCGATTTTGTAAATTTTTTTCCACTTGTGGGCGTAC
0 ACCATGCACAAGCACCAATTTGATGCCCAAGCTGTGTAGCAGTGCAAAATCATGAATCAG
CGTACTAAAATTGTCACGAGCGACCGCCTCATCACCAAACATAACCACAAAGGTTTTGCC
ACGATGGGTGTTAATGTACGGGGCAGAATTACGAAACCAATGCACAGGTGTGAGTGCAGG
AGTGTTCTGATAGGTGCTGACAGAATTCATGAATGCTCCAAAGAGTCAATGGCTGGTAAA
ATAAGAATGGCGAACAATATATGGCGAGAGCGTCTGATGTTGGTCAAATGTCCCATTAAT
5 AACTATCAAGATACCATCATACCATAGCAAAGTTTTGGGCAGATGCCAAGCGAATTTATC
AGCTTGATAAGGTTGGCATATGATAAAATCTACCATCATCGTCGCCAGTTTTGAGCATGT
GTAAGTAGTTACCATAATTAAACAGTCAAGAAATTCACACCGTCAATCAGCTGTGCTATG
CTTATGGGCACATAAAACTTGACCAACACAGGATAAATTTA
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 57
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipoll z Moraxella catarrhalis ggcatacttttgccatgctttattttggcataactgctataagcccattgctacttttta
TCATTTATCCATATGTCCAATAATGTGCTTTATGTAATTTAGGCACACTATTAACTCGTG CCACTGTTAACATTCAGCATAAAAATCTTAACAATGAATCAAAGCATCGTATTGGCTGTT AAATGATAAGCTTATATTTATTTAAATTCAGACTAAATGATTGTAATATGGACATATCAA GGTTGAAATCAAAAATTTTGGAGAGTTATGTACGATAATGATAAAAAATTGACCACCATC GTAGGGGTGTTGTATACGGTGTCTTATATTGCCATATGGTTGGTCAGTGGCTATATTTTA
TGGGGCTGGATTGGTGTGACAGGATTTACTCGTGCGATACTTTGGCTGATCGCTTGGATG ATTGTGGGTACGATTGCTGATAGAATTCTGATACCGATTATTTTGACCGTCGTGGTTGGG TTATTTTCTATCTTTTTTGAAAAAAGGCGATAATTTGGTTATTTTTTCACAAAAAATCAT GATTTTTTTTGTAAACTATCTAAAATATCAATTATGTTATATTATGTGATAAAAGATGGG CATGCTTAAGTTTTGGATTGCAAAAATCCTAATATCATCACTGACCAAAGCTGTGATGAT
ATCAAAACTTTATCAAAGTTCTTAGGGTATTATCAAGATATCATACCAAATGAATACTTA
CCCAACTTACTATAAAAATCAAATGATATGACTGTGATTTTATTATCATAGATACAAAAA
TCAAAACGCATGAGCCAAAGGTATGATGAATGAATACAAAATTTCGCACACATTATGACA
ATCTAAATGTCGCCAGAAACGCTGACATTGCGGTGATTTGGTGGGATAGGGGTCAAGCCA
GTGCGATTAAGCTAAATTTTTATGTGGGCAATCGCTGACTTTATTTTATTTGTGCCAGTT
0 GGAACAATTCGTGGTCTAATGTATTTATTTTAAGGAGATAA
SEKW. ID. NR: 58
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipolO z Moraxella catarrhalis
TCTGGTCTACATCCCAAACTATTTACACAAGAAACACTAAAGACAGTGGAGCAGATGACG
5 CTCAAAAAGGCATCTTATAGTAATTTGACAGTTAATTTTCGTCAAGTGCTTGTACAAAAA TACACCATCGTGCAAGAAGTTTGTACCAATTTAAGCACAATCATTTTGGCACACACTGTC AAGCAATGCTTCAGGCAAATTAGCTGCTGGTAAAGATACTTGGGTCATCATGCAATCGCA TCAACCCTTCTTGCTGCGTTGAAGCGATAAGTTTGCCATCTTGCCAAAATTGACCATGGT
PL 211 017 B1
TTAGACCCTTGGCGTGGCTTGTGGTATCGCTCCACATGTCGTAGAGTAGATATTCGGTCA
TATCAAAAGGGCGATGGAAATGTATGGAATGGTCAATACTAGCCATTTGTAGACCTTGTG
TCATCAGGCTTAGCCCATGACTCATTAAACCTGTGCTGACCAAATAATAATCAGACACAA
ACGCAAGTAGTGCTTGATGAATGGCAACTGGCTGCTCCCCAATATCAGCGATACGCACCC
AATTGGCTTGGCGTGGACGCTCAGGCTTGGGTGTCACAGGGTCTCGTGGTGTGACGGGGC ggatttcgacatgacgctgacgcataaatcttgctttgagtggttcgggaattttatgta
AATAATCCGCTTTGAGTTCTTGCTCGGTTTTTAGGCTTTCAGGGGGTGGATAATCAGGCA tggtttcttggtaatcaagcccgccttccatgggtgaaaatgaggcaatcatcgaaaaaa
TGACCTGTTCATTGGTCGTATGATTACCGTTTTTGTCGGTGGTTGGCACATATTGCACCG
1O CAATGACTTCTCGAGCTGATAAACTGCGTCCATCACGTAAGCGGCGTACTTGATAGATGA CTGGTAGACGAATATCGCCACCTCGTAAAAAATAACCATGTAGGCTATGACAAGGTTTAT CAATCGTTAATGTGTTAGCACCAGCAAGCAGCGCTTGGGCA
SEKW. ID. NR: 59
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipo2 z Moraxella catarrhalis
TAAAATGACCTTACAAAATAAAATTATATGTTCAAAAATCGCTTAAGTATTGAAAAAAGC tataaaaacttatctattaaagcataaaagatattaaagcataaaagacgagaaaagagc
AAGCGTCAATGATGATATTTCATATAAAAACTTATGAAATTTTTCAATTTTTTATCGATT
GATTCAGCTTGGCTATCGGTGGTCAACTTTGGCTGCCAAGACATCGCCGGCTTTTTGAAA
AATCATCACAATGGCAACAATGATGATGGTTGAAATCCACTTGACATATACCATGTTGCG ATGCTCACCATAGTTAATCGCAAGGCTTCCCAAGCCACCACCGCCAACCACACCTGCCAT TGCAGAATAACCAATCAAAGACACCAAGGTCAATGTGACCGCATTAATCAAAATGGGCAG GCTTTCAGCAAAATAGTATTTGCTGACAACCTGCCAATGCGTTGCACCCATAGATTTGGC AGCTTCGGTCAGTCCTGTGGGTACTTCTAATAAAGCATTGGCACTCAAGCGTGCAAAAAA
5 TGGAATTGCTGCCACACTCAAAGGGACGATGGCGGCTGTTGTGCCAAGGGTTGTTCCCAC caaaaatcgtgtgactggcatgagaataatgagcaaaataataaaaggaacggagcgacc AATATTAATAATAACATCCAAAATTACAAATACACTGCGATTTTCAAGGATACGCCCTTT ATCGGTTAAAAATGCCAAAAACCCTATCGGTAGCCCAACCAAAACAGCGATGGCAGTGGC
PL 211 017 B1
AGCAAGCCCCATATAGATGGTTTCCCAAGTGGATTGGGCAACCATCTCCCACATTCTTGG gtgcatTTcactgacaaattttgtgacgatttcattccacatagccgataatctcaatat
TGACCCGATGGGTGGTTAAAAATTCTATTGCTTGCATGACCGAGGTGCCTTCACCGATAA
GCTCAGCAATGGTAAAGCCAAATTTTATATCACCTGCATAA
SEKW. ID. NR: 60
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipo7 z Moraxella catarrhalis
AGTAAACAATGGTAACAAATACAGCAGTGTCGCACAGTCCTCAGTACGATGATTCTGAAT
TTGAATATGCAGGATTTTGGATACGATTTGTGGCATGTCTTGTCGATAATTTAATTGTTA
TGATTATAATTGCACCGTATTGGTTTTATAATTATCAGCAAATGATGGCCATGCCTGCTG
ACCAAATACCGTTTTATAGTGTTGGGGATGCCATCCTTTATAGTGCTGGGGATGCTATCC
TAAACTTAGTGATGGCGGCGGCGGTTGTTTGGTTTTGGGTAAAAAAAGGTGCAACACCAG
GTAAAATGCTCTTTGGGCTGCAAGTCCGTGATGCCAAAACAGGGCAATTTATCAGTGTGC
CAAGGGCATTATTGCGATATTTTAGTTATCTGATTTCATCCGTGATTCTTTGTTTGGGAC
TTATTTGGGTTGGTTTTGATAAGAAAAAACAAGGCTGGCATGATAAAATTGCCAAAACTG
TTGTGGTAAAACGCATTCGCTGATGGGTCGCCAGTTAAACAATAAAACCATCAAACGCAA
GCAGGGCGATGTGTTTGAGCAGTTGGCGGTAGATAAGCTAAAACAAGCAGGCTATGAAAT
TATTTTAACCAACTTTACCACCCCATTTGTTGGTGAGATTGATATTATCGCCAGACAGCC
TTTGGAGCAATCGCACCGTTTGGTGCAGCCAAGATTTTGTACGGTATTTGTTGAAGTGCG
0 TAGCCGAACAAGTTCTGTGTATGGTACAGCGCTTGAGAGTGTTACCTCAAAAAAGCAGGC
AAAAATCTACCGAACAGCAGAACGATTTTTAATCAATTATCCCAAATATATTGATGATGC
ATACCGTTTTGATGTCATGGTTTTTGATTTGGTTGATGGATTGATTGAACATGAATGGAT
AAAAAATGCGTTTTGATTGGCTCAATGGTCGTGAATTAAAATCAATCAAGCAATCCGTAG
CTTTACTATAAGATATATCCCAGTAATATGGAAACATAGCA
SEKW. ID. NR: 61
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem lipo6 z Moraxella catarrhalis
CGTTTAGCTTCATACGCAGACCTTGTGCACCTTCGGGCAACCGAAGCATCACGCCAGCAT
PL 211 017 B1
CACGCATCCGCACAAAACCCATCATGCCATCAATTTCGCTGCTGATATGATATACCCCCA
CCAAAGTAAACCGGTTAAATCGTGGAATAACGCCTGCTGCTGAGGGTGAGGCTTCAGGCA
AAACCAAGGTAACCTTATCCCCCAACTTAAGTCCCATGTCAGAGACAATGGACTCACCTA
ATATAATACCAAACTCGCCGATATGTAAATCATCCAAATTGCCTGCGGTCATATGCTCAT
CAATGATAGAAACTTGCTTTTCGTAATCAGGCTCAATGCCAGAAACCACGATTCCAGTCA
CCTGACCTTCAGCGGTTAACATACCTTGTAGTTGAATATAAGGGGCAACTGCTTGCACTT
CTGGATTTTGCATTTTGATTTTTTCGGCAAGTTCTTGCCAATTTGTCAAAATTTCTGTTG
AGGTAACTGAAGCTTGAGGCACCATGCCAAGAATGCGTGATTTAATTTCACGGTCAAAGC
CATTCATGACCGACAAAACCGTGATAAGCACTGCAACCCCAAGCGTAAGCCCAATGGTTG
AGATAAAAGAAATAAAGGAAATAAAGCCATTTTTACGCTTAGCTTTGGTATATCTAAGCC
CAATAAATAACGCCAAGGGACGAAACATAAGCTGTGTTCCAAACGACCCAACCGTGCTAG
TTTAGCACTTTTTTGGACAAATACCAAACATCACATAACAAATGAATCATCAGGTTGGTT
TTGTTGCGCTTGTGTATCTGTATGATAAGTTTCTTGCTAAAACAGCTTTTTTATGTCAGA
ATACAGAAAAGGTATATACTTATATTTTTAACTTTAAATAGATCTGCTTTTTTATACCGA
TGATTTGGCATGAAGTTTATCGGTCTGATATGCTGGATATAAGTTTATCGGCTTGATATA
AATTTTAATTAATCATCAAATTTTTAAGGAATTTATCATTA
SEKW. ID. NR: 62
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem P6 z
Moraxella catarrhalis
0 TAAGGATAC CAGATTTTGGCTTGTCAATCGTTGTGTTAATCATTGTAACGGTTTATAGTG
ATTGTCAATTAATAAGGGTAAAAAAGTATTTATCAAGTAATAATCTTTCTTATATGTGAA
TATAATGACAAATTTATCACATTTTTACAAGGATTTTTTATCAAGATTAGGATATGTTCC
AGCTTAATTATTAGTGATGAGCGTGTGATTATTTGGCATCGTTAAATTTATGAGTGCTAA
AATTGCCAAATGATTAAAATTTTGCTAACATGATAGCCCCTTTGGTAGGCTTTATTTGGT
5 ATTGATGAGCAATAATAATATACCGAGTTAAATGGATTAACTTAACATACGCCAAAAACT
TAACAACGAAAAGTAGATGATTATGACAGATACAGTACAAAAAGAIACAGCACAGTCCCC
CAAAAAAGTTTATCTAAAAGACTACACGCCGCCAGTATATGCAGTTAATAAAGTGGATTT
GGATATCCGCTTGTTTGATGATCATGCTGTCGTTGGTGCCAAACTTAAAATGACACGAGC
PL 211 017 B1
ACACGCAGGCGAGCTTCGGCTTCTTGGGCGAGATTTAAAGCTTAAAAGCATTCACCTAAA
TGGTCAGGAATTAGAGTCGCAGGCGTATCATCTTGATAAGGAAGGCTTAACAATTTTAGA
TGCACCAGATGTCGCAGTGATTGAGACATTGGTTGAGATTTCACCACAAACCAACACAAC
ACTTGAAGGGCTATATCAAGCAGGAACAGGTGATGATAAGATGTTTGTGACACAATGCGA
ACCTGAGGGTTTTCGCAAAATCACCTTTTTCCCTGACCGCCCTGATGTTTTGACAGAATA
CACCACACGCCTAGAAGCACCAAAGCATTTTAAAACCTTGCTTGCCAATGGTAATTTGGT
TGAGTCAGGAGATGTGGATGAAAATCGCCATTATACCATTTGGCATGATCCTACCAAAAA
ACCCAGCTATCTATTCGCCGCTGTCATTGCCAATCTAGAAG
SEKW. ID. NR: 63 io Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem MsbB z Haemophilus influenzae (HiRd)
AAATCAAGCGCCTGTGCCTGCTGGTGATGGTTGTGGAGACGAATTATATTCTTGGTTTGA
ACCGCCAAAACCAGGCACTTCAGTGAGCAAACCTAAAGTTACACCGCCTGAGCCGTTTTT
GTGCCAACAGATTTTGAACTCACCGAATCGGAGAGAATGGTTAGAATAGCATTGAGGTAA
ATCAATATGGATATCGGCATTGATCTTTTAGCAATATTGTTTTGTGTTGGTTTTGTCGCA
TCATTTATCGATGCAATTGCTGGCGGTGGTGGATTAATCACCATTCCAGCGTTACTCATG
ACAGGTATGCCACCAGCAATGGCGTTAGGCACCAACAAATTGCAAGCTATGGGCGGTGCA
TTATCCGCAAGCCTTTATTTCTTGCGAAAAAGAGCGGTCAATTTACGCGATATTTGGTTT
ATTTTGATTTGGGTTTTCTTAGGTTCTGCCCTAGGTACATTATTAATTCAATCAATTGAC
0 GTGGCGATTTTCAAAAAAATGCTTCCTTTTTTGATTTTAGCCATTGGTCTATATTTTTTA
TTTACTCCTAAATTAGGTGATGAAGATCGAAAACAACGATTAAGTTATCTGTTATTTGGT
CTTTTAGTTAGCCCATTTTTAGGTTTTTATGATGGCTTCTTTGGGCCAGGGACTGGCTCA
ATCATGAGTTTAGCCTGTGTTACTTTGCTAGGATTTAATCTCCCGAAAGCGGCAGCACAT
GCAAAAGTGATGAACTTCACTTCGAACCTTGCTTCTTTTGCACTTTTCTTATTGGGCGGA
5 CAAATTCTTTGGAAAGTGGGTTTCGTGATGATGGCTGGGAGCATTTTAGGTGCAAATTTA
GGTGCCAAAATGGTGATGACGAAAGGTAAAACCTTGATTCGACCGATGGTTGTTATCATG
TCTTTTATGATGACGGCTAAAATGGTTTACGATCAGGGTTGGTTTCATTTTTAATTCGGA
AAGCGCGCAAAAGTGCGGTTAAAATTAATTACATTTTATTA
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 64
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem HtrB z Haemophilus influenzae (HiRd)
TTGAAGTCCCCAATTTACCCACCACAATTCCTGCGGCAACATTGGCTAGGTAACAAGATT
CTTCGAAAGAACGTCCATCTGCTAATGTGGTTGCTAATACACTAATGACAGTGTCACCGG
CTCCCGTCACATCAAACACTTCTTTTGCAACGGTTGGCAAATGATAAGGCTCTTGATTTG
GGCGTAATAATGTCATGCCTTTTTCAGAACGCGTCACCAAAAGTGCGGTTAATTCAATAT
CAGAAATTAATTTTAAACCTTTCTTAATAATCTCTTCTTCTGTATTACATTTACCTACAA
CGGCTTCAAATTCAGACATATTGGGTGTCAATAATGTAGCCCCACGATAACGTTCAAAAT
1o CAGTTCCCTTTGGATCGATCAACACAGGCACATTCGCTTTGCGTGCAATTTGAATCATTT
TCTGAACATCTTTAAGCGTGCCTTTGCCGTAATCAGAAAGAATCAAAGCACCGTAATTTT
TCACCGCACTTTCTAACTTCGCTAATAAATCCTTGCAATCTACATTATTGAAATCTTCTT
CAAAATCAAGGCGGAGCAGCTGTTGATGACGAGATAAAATACGTAATTTAGTAATGGTTG
GATGGGTTTCTAATGCAACAAAATTACAATCAATCTTTTGTTTTTCTAATAAGTGGGAAA
GTGCAGAACCTGTCTCATCTTGTCCAATCAATCCCATTAACTGAACGGGTACATTGAGTG
AAGCAATATTCATCGCCACATTTGCAGCACCGCCCGCGCGTTCTTCATTTTCTTGTACGC
GAACTACTGGCACTGGTGCTTCTGGTGAAATACGGTTGGTTGCACCGAACCAATAACGAT
CAAGCATCACATCGCCTAATACAAGTACTTTTGCTTGCTTAAATTCTGCTGAATATTGAG
CCATTTTAAAATCTCTCTATTTGAATAACCAAAATTGTGGCGATTTTACCACAACTCAAA
0 TTTACGATAAACTACGCCCCTAACTTACGTGGAAAGAACAA
SEKW. ID. NR: 65
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem białka D z Haemophilus influenzae (HiRd)
AGCAATAATTATAGCTGGAATATTCTTTAAAGATGAAAGAGATCGTATAAGACAAAAAGA
5 ATTTTATATTGGAGAATTATTAGCAATTATTGGTTCGCTAATATTCGTAATAAATAGTTC
AAATAATGATGGAAATACAGACTTTTTTCTTGGGGCAATATTTCTTTTTACAGCTATTTT
TATTCAATCTGTACAGAATTTAATTGTAAAAAAAGTAGCCAAAAAGATAAATGCTGTTGT
AATAAGTGCATCGACAGCAACAATTTCAGGAGTATTATTTTTATGTTTAGCTTTTAATAC
PL 211 017 B1
TAAACAAATATATTTATTACAAGATGTTGGCATTGGAATGTTGATAGGTTTAGTTTGCGC
TGGCTTTTATGGGATGCTAACAGGGATGTTGATGGCTTTTTATATTGTTCAAAAACAGGG
AATCACTGTTTTTAACATTTTGCAATTATTAATTCCTCTTTCAACTGCGATAATAGGTTA
CTTAACATTAGATGAAAGAATAAATATCTATCAGGGAATTAGCGGTATTATTGTAATTAT
TGGTTGTGTATTGGCATTAAAAAGAAAAAACAAGGAGTGTTGATATATAAAGTAGATGAT
GTTGGTGGAATAGGTATAGTTAAATATCTGGTTCAATTGGTTTTATTAAGGGCGTTAGCA
ATTCTCCATTTAAGTTTATGTTTGAATTAGATATTTTGGGAAAAGATGGAAGAATAAAGC
TGTTAAATAATGCTGAAACATATGAACTATACCAATACTCAAATAAAAATAATTCTGCTG
GAAATGATTATAAATCTCTAATTCTAACTTGTAGAGAGGATAATGACTATCAATCAGAAA
GAATGATTAAAGCCATTAAAAATATTATTCATTGTATGACTAATAATCATCAACCTATTT
CAAGTGCTGAAACATCTTTAGAAACTATTAAAATTATTCACGGAATAATTAATTCTGTTA
AAATAGGTAATGATCCTAACAATATATAAGGAGAATAAGT
SEKW. ID. NR: 66
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem 15 Hin47 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TAAATACTCCAAAATAAATTTCAGATAACGTGGTCTGTAAGACAAAAAAATAAAAAAAAT
GTTCAATAAGAGGAGAGCAAATTATCTTGTTTAAAAGGAAATCGGAGCAGTACAAAAACG
GTCTTACAAGTAGCAAATTCTATAAATTTATGTTCTAATACGCGCAATTTTCTAGTCAAT
AAAAAGGTCAAAAAATGAGCTGGATTAACCOAATTTTTAGTAAAAGTCCTTCTTCTTCCA
0 CTCGAAAAGCCAATGTGC CAGAAGGCGTATGGACAAAATGTACTGCTTGTGAACAAGTAC
TTTATAGTGAAGAACTCAAACGTAATCTGTATGTTTGCCCGAAATGTGGTCATCATATGC
GTATTGATGCTCGTGAGCGTTTATTAAATTTATTGGACGAAGATTCAAGCCAAGAAATTG
CGGCAGATTTAGAACCAAAAGATATTTTAAAATTCAAAGATTTAAAGAAATATAAAGATC
GTATCAATGCGGCGCAAAAAGAAACGGGCGAGAAAGATGCGCTAATTACTATGACAGGTA
5 CACTTTATAATATGCCAATCGTTGTGGCTGCATCGAACTTTGCTTTTATGGGCGGTTCAA
TGGGTTCTGTAGTTGGTGCAAAATTTGTTAAAGCGGCTGAAAAAGCGATGGAAATGAATT
GTCCATTTGTGTGTTTCTCTGCGAGTGGTGGTGCTCGTATGCAGGAAGCATTATTCTCTT
TAATGCAAATGGCAAAAACTAGTGCCGTACTTGCTCAAATGCGTGAAAAGGGTGTGCCAT
PL 211 017 B1
TTATTTCAGTATTAACGGATCCGACTTTAGGCGGCGTATCAGCCAGTTTTGCGATGTTAG
GGGATTTAAATATTGCCGAGCCAAAAGCCTTAATTGGTTTTGCAGGGCCACGCGTTATTG
AACAAACTGTGCGTGAAAAATTGCCAGAAGGTTTCCAACGTAGTGAGTTTCTACTTGAGA
AAGGGGCAATTGATATGATCGTGAAACGTTCAGAAATGCGT
SEKW. ID. NR: 67
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem P5 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TCACTTAATTCAAGCGCATCAATGTTTTCTAAAACATCAACAGAATTGACCGCACTTGTA
TCTAAAATTTCGCCATTTATTAAGACTGCGCGTAATGCCAAAACATGATTAGAGGTTTTA o CCATATTGCAATGAGCCTTGCCCAGAGGCATCGGTGTTAATCATTCCACCTAAAGTCGCT
CGATTGCTGGTGGACAGTTCTGGGGCAAAGAACAAACCATGTGGTTTTAAAAATTGATTA
AGTTGATCTTTTACTACGCCTGCTTGTACTCGAACCCAACGTTCTTTTACATTGAGTTCT
AAGATGGCTGTCATATGACGAGAAAGATCCACTATTATATTGTTATTGATGGATTGCCCA
TTTGTGCCAGTGCCTCCACCGCGAGGCGTAAAGCTGATTGATTGATATTCAGGTAAATTT
GCCAATTTTGTTATCCGCACTATATCAGCAACCGTTTTCGGAAAAAGAATTGCTTGTGGA
AGTTGTTGGTAAACGCTGTTATCCGTAGCCAGACTTAATCTATCTGCATAGTTTGTCGCA
ATATCCCCCTCAAAATGTTGGCATTGAAGATCATCAAGATAATCAAGTACATATTGTTCA
ACTTGAGGAATGCGATTTAGATTTGGCAACATAGTATTTGACCCATTTAAACATATCAGA
TGGAGGCTTTGATAATATCCTAAGGCTAGAATAATGTCGATTAGGAAAGAGAGAGGAGAA
0 AGTAAAAAGTCTGTTTAAGAAAGTGTTATTTTGGATAAAAACTAAACAAAAAATTCAAAA
GAATTTGATCTTTTCAATTTTTATAGGATAATAAGCGCACTTTTGAACGTTCCTTTGGGG
TAAACATAAGCAAAGGAATTGAATTTGTCAAAAGGTAATAAAGTAGGGCAAATTCAAAAC
CCTAGTTAAGTGACTGTTTATAATGTAGCTTTAATTAAAAGTTCAGTATAAACAAGGACA
CTTTTTATTACTATTCGATCACTAAATAGAGGACATCAAAA
SEKW. ID. NR: 69
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem D15 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TCGATTGTATCCTATATAAATTATAGACGTAAAAAATCATTAAATAATGCAAACACCGTT
PL 211 017 B1
AAGCTTAATAACAGTGCTGCGCCAATTCGATAACAGATGCTTTGCACCCGCTCAGAAACA
GGTTTTCCTTTAACAGCTTCCATTGTTAAAAAAACTAAATGACCGCCATCTAATACTGGT
AATGGAAATAAATTCATAATCCCTAAATTTACACTAATCAATGCCATAAAACTTAAAAAA
TACACCAATCCAATATTTGCTGATGCGCCAGCACCTTTTGCAATAGAAATTGGCCCACTT
AAATTATTTAATGACAAATCGCCAGTAAGTAATTTCCCTAATATTTTCAAGGTTAAAAGG
GAAAGCTGTCCTGTTTTTTCAATGCCTTTTTGTAAAGATTCAAGAATACCATATTTTAAT
TCAGTACGGTATTCATCCGCTAATTTTGTTAAGGCTGGGCTAACCCCAACAAACCATTTG
CCATTTTGATTACGCACTGGAGTTAGGACTTTGTCAAATGTTTCTCCATTACGTTCAACT
TTAATAGAAAAAGATTCGCCTTGTTCGACCTGTTTTATAAAATCTTGCCAAGGAAGTGCG
GTTAAATTTTCTTTTAAAATTTTATCACCGATTTGTAAACCAGCTTTCTCAGCGGGAGAA
TTTTGAACAACTTTAGAAAGCACCATTTCAATTTTAGGACGCATAGGCATAATCCCTAAT
GCCTCAAAAGCACTTTCTTTTTCAGGATCGAATGTCCAATTTGTAAGATTTAAAGTCCGT
TGTTGTTCAATATTAGAATTGAAAGGAGAAAGGCTAATCTCAACATTAGGCTCCCCCATT
TTTGTGGCAAGTAGCATATTGATGGTTTCCCAATCTTGAGTTTCTTCGCCATCAATTGTA
AGAATTTGCGTATTGGGTTCAATGTGGGCTTGTGCTGCGATTGAGTTTGGTGTTATTGAT
TCAATCACTGGTTTAACCGTTGGCATTCCATAAAGGTAAAT
SEKW. ID. NR: 69
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem Omp26 z Haemophilus influenzae (HiRd)
0 TTTGATAAATATCCTTAATTAAATGATGGGTTTAATATTTTCTCTGCCCAATTAAATTAG
GCAGAGAACGTTGTTTTTGAGTTCTC-ATGAAGAAAAAAGTTCAATTTATTAGAAAGAACC
TCCAATACTAAATTGGAACTGTTCGACATCATCATTTTCATATTTTTTAATTGGTTTGGC
ATAAGAGAATACCAATGGCCCAATAGGAGATTGCCATTGGAATCCGACACCTGTAGAGGC
GCGAATACGGCTTGATTTGCCATAATCGGGTAAGCTTTTTAATACATTGTTATCTAACCC
5 ACTCTTATCCGATTTCCACTTAGTATTCCAAACACTTGCCGCATCAACAAATAGGGAGGT
TCGGACTGTATTTTGGCTTTTATCACTCACAAACGGTGTTGGTACAATAAGTTCTGCACT
CGCAGTTGTGATTGCATTACCACCAATCACATCAGAACTTATCTTCTTAAAAGTACCATT
ACCATTACCATGTTCTGCATAAATTGCGTTAGGTCCAATACTACCATAAGCAAAACCACG
PL 211 017 B1
TAATGAACCGATGCCACCCGCTGTATAAGTTTGATAGAACGGTAAACGCTTGTTTCCAAA
ACCATTTGCATATCCTGCAGATGCTTTTGCAGATACAACCCAGAGGTGATCTCTGTCTAA
TGGGTAGAAACCCTGTACGTCTGCACTTAGTTTGTAGTATTTGTTATCAGAACCTGGAAT
AGTAACTCGTCCACCAAGACTTGCTTTAACCCCTTTAGTTGGGAAATAGCCTCTATTAAG
GCTGTTATAGTTCCAACCAAAAGAAAAATCAAAGTCATTTGTTTTAATGCCATTACCTTT
AAATTTCATTGATTGAATATATAAATTACGGTTATATTCTAGAGCAAAGTTACTAATTTT
ATTATAGGTATGGCCTAATCCTACATAATAGGAGTTATTTTCATTTACAGGGAAACCTAA
AGTAACATTACTTCCATAAGTCGTACGCTTATAGTTAGAGG
SEKW. ID. NR: 70 io Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem P6 przed genem Haemophilus influenzae (HiRd)
TTAGATTTCTCCTAAATGAGTTTTTTATTTAGTTAAGTATGGAGACCAAGCTGGAAATTT
AACTTGACCATCACTTCCTGGAAGGCTCGCCTTAAAGCGACCATCTGCGGAAACCAATTG
TAGCACCTTTCCTAAGCCCTGTGTAGAACTATAAATAATCATAATTCCATTTGGAGAGAG
GCTTGGGCTTTCGCCTAGAAAAGATGTACTAAGTACCTCTGAAACGCCCGTTGTGAGATC
TTGTTTAACTACATTATTGTTACCATTAATCATCACAAGTGTTTTTCCATCTGCACTAAT
TTGTGCGCTACCGCGACCACCCACTGCTGTTGCACTACCACCGCTTGCATCCATTCGATA
AACTTGTGGCGAACCACTTCTATCGGATGTAAATAAAATTGAATTTCCGTCTGGCGACCA
CGCTGGTTCAGTATTATTACCCGCACCACTCGTCAATTGAGTAGGTGTACCGCCATTTGC
0 TCCCATAACGTAAATATTCAGAACACCATCACGAGAAGAAGCAAAAGCTAAACGAGAACC
ATCTGGCGAAAAGGCTGGTGCGCCATTATGCCCTTGAAAAGATGCCACTACTTTACGTGC
GCCAGAATTTAAATCCTGTACAACAAGTTGTGATTTTTTATTTTCAAACGATACATAAGC
CAAACGCTGGCCGTCTGGAGACCAAGCTGGAGACATAATTGGTTGGGCACTACGATTGAC
GATAAATTGATTATAGCCATCATAATCTGCTACACGAACTTCATAAGGTTGCGAACCGCC
5 ATTTTTTTGCACAACATAAGCGATACGAGTTCTAAAGGCACCACGGATCGCAGTTAATTT
TTCAAAAACTTCATCGCTCACAGTATGCGCGCCATAGCGTAACCATTTATTTGTTACTGT
ATAGCTATTTTGCATTAATACAGTCCCTGGCGTACCTGATGCACCAACCGTATCAATTAA
TTGATAAGTAATACTATAACCATTACCCGATGGAACCACTT
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 71
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem TbpA przed genem Haemophilus influenzae (atypowe)
GGCGATAACCGAGTTTTTGGGGTATTTAGTGCCAAAGAAGACCCACAAAACCCAAAATTA
TCCAGAGAAACCTTAATTGATGGCAAGCTAACTACTTTTAAAAGAACTGATGCAAAAACC
AATACAACAGCCGATACAACAACCAATAAAACAACCAATGCAATAACCGATGAAAAAAAC
TTTAAGACGGAAGATATACTAAGTTTTGGTGAAGCTGATTATCTTTTAATTGACAATCAG
CCTGTTCCGCTTTTACCTGAAAAAAATACTGATGATTTCATAAGTAGTAGGCATCATACT
GTAGGAAATAAACGCTATAAAGTGGAAGCATGTTGCAAGAATCTAAGCTATGTAAAATTT
GGTATGTATTATGAAGACCCACTTAAAGAAGAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAAAAAGAC
CAAGAAAAAAAAGAAAAAGAAAAACAAACGACGACAACATCTATCGAGACTTATTATCAA
TTCTTATTA.GGTCACCGTACTGCCAAGGCCGACATACCTGCAACGGGAAACGTGAAATAT
CGCGGTAATTGGTTTGGTTATATTGGTGATGACACGACATCTTACTCCACTACTGGAGAT
AAAAATGCTCTCGCCGAGTTTGATGTAAATTTTGCCGATAAAAAGCTAACAGGCGAATTA
AAACGACACGATAATGGAAATACCGTATTTAAAATTACTGCAGACCTTCAAAGTGGTAAG
AATGACTTCACTGGTACAGCAACCGCAACAAATTTTGTAATAGATGGTAACAATAGTCAA
ACTGGAAATACCCAAATTAATATTAAAACTGAAGTAAATGGGGCATTTTATGGACCTAAG
GCTACAGAATTAGGCGGTTATTTCACCTATAACGGAAATTCTACAGCTAAAAATTCCTCA
ACCGTACCTTCACCACCCAATTCACCAAATGCAAGAGCTGCAGTTGTGTTTGGAGCTAAA
0 AAACAACAAGTAGAAACAACCAAGTAATGGAATACTAAAAA
SEKW. ID. NR: 72
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem TbpB z Haemophilus influenzae (HiRd)
TAGAATTATATTCTTATACAAAATTGATAATTGTTCGCATTATCATTTTTTTTTTGTAAT
5 AATGTCAACTTATAATTTTTTAAGTTCATGGATAAAATATGAAAAATGGCGTAAAACAAC
TTTTTCTCTTATCATTAATAGGCTTATCATTAACGAATGTAGCTTGGGCAGAAGTTGCAC
GTCCTAAAAATGATACATTGACAAATACGATTCAAAGTGCGGAATTAAAAACCTCCTCTT
TTTCCTCTATGCCTAAGAAAGAAATACCAAATAGGCATATTATTTCTCTTTCCAAAAGCC
PL 211 017 B1
AATTAGCGCACCATCCAAGGCTTGTTTTGCGTGGGTTAATTCCTGCTTTATATCAAAATA
ACACTCAGGCAGTTCAACTGTTATTACCACTATATAAACAATTTCCTCAACAAGATAATT tcttactaacttgggcaaaggctattgaagctcgtgaacaaggtgatttaactcaatcta
TTGCTTATTATCGTGAATTATTCGCTCGAGACGCATCTTTACTACCTTTACGTTATTAAT
TAGCTCAAGCTCTATTTTTTAACTATGAAAATGAAGCTGCCAAAATTCAATTTGAAAAAT
TACGTACAGAGGTAGATGATGAAAAATTTTTAGGTGTTATTGATCAGTATCTTTTAACAC taaatcagcggaatcaatgga.tatggcaagtaggattaaattttttaaatgatgataatt
TGAATAACGCTCCAAAAAGTGGCACAAAAATTGGTAGTTGGACCGCTTGGGAAAAAGAAA
GTGGGCAGGGGGTAGGGTATTCTTTATCAGTAGAAAAAAAATGGCCATGGGCAGATCATT o tttttagtaaaactatgtttaatgggaatggaaaatattattgggataataaaaaataca
ATGAGGCTACTGTGCGTATAGGTGGTGGTTTAGGCTATCAAACTGCCTCAGTTGAAGTCT
CGTTGTTTCCTTTTCAAGAAAAACGCTGGTATGCAGGCGGT
SEKW. ID. NR: 73
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem HifA 15 (piliny) z Haemophilus influenzae (genom LKP serotypu 1) taataaattgctccataaagaggtttgtgccttataaataaggcaataaagattaatata
AACCGTTTATTAAAATGCCAAAGGCTTAATAAACAGCAAACTTTGTTTTCCCAAAAA.AAG
TAAAAAACTCTTCCATTATATATATATATATATATAATTAAAGCCCTTTTTGAAAAATTT
CATATTTTTTTGAATTAATTCGCTGTAGGTTGGGTTTTTGCCCACATGGAGACATATAAA
0 AAAGATTTGTAGGGTGGGCGTAAGCCCACGCGGAACATCATCAAACAA.CTGTAATGTTGT
ATTAGGCACGGTGGGCTTATGCCTCGCCTACGGGGAAATGAATAAGGATAAATATGGGCT
TAGCCCAGTTTATGGATTTAATTATGTTGAAATGGGGAAAACAATGTTTAAAAAAACACT
TTTATTTTTTACCGCACTATTTTTTGCCGCACTTTGTGCATTTTCAGCCAATGCAGATGT
GATTATCACTGGCACCAGAGTGATTTATCCCGCTGGGCAAAAAAATGTTATCGTGAAGTT
5 AGAAAACAATGATGATTCGGCAGCATTGGTGCAAGCCTGGATTGATAATGGCAATCCAAA
TGCCGATCCAAAATACACCAAAACCCCTTTTGTGATTACCCCGCCTGTTGCTCGAGTGGA
AGCGAAATCA.GGGGAAAGTTTGCGGATTACGTTCACAGGCAGCGAGCCTTTACCTGATGA
TCGCGAAAGCCTCTTTTATTTTAATTTGTTAGATATTCCGCCGAAACCTGATGCGGCATT
PL 211 017 B1
TCTGGCAAAACACGGCAGCTTTATGCAAATTGCCATTCGCTCACGTTTGAAGTTGTTTTA
TCGCCCTGCGAAACTCTCGATGGATTCTCGTGATGCAATGAAAAAAGTAGTGTTTAAAGC
CACACCTGAAGGGGTGTTGGTGGATAATCAAACCCCTTATTATATGAACTACATTGGTTT
GTTACATCAAAATAAACCTGCGAAAAATGTCAAAATGGTTG
SEKW. ID. NR: 73
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem HifE (piliny) z Haemophilus influenzae (genom LKP serotypu 1)
TAGTAGATTTCCGCACGGGCAAAAATACAATGGTGTTATTTAACCTCACTTTGCCAAATG
GCGAGCCAGTGCCAATGGCATCCACCGCACAAGATAGCGAAGGGGCATTTGTGGGCGATG
TGGTGCAAGGTGGTGTGCTTTTCGCTAATAAACTTACCCAGCCAAAAGGCGAGTTAATCG
TCAAATGGGGTGAGCGAGAAAGCGAACAATGCCGTTTCCAATATCAAGTTGATTTGGATA
ACGCACAAATACAAAGTCACGATATTCAATGCAAAACCGCAAAATAAATAATTGAAGAGG
ATTTATGCAAAAAACACCCAAAAAATTAACCGCGCTTTTCCATCAAAAATCCACTGCTAC
TTGTAGTGGAGCAAATTATAGTGGAGCAAATTATAGTGGCTCAAAATGCTTTAGGTTTCA
TCGTCTGGCTCTGCTTGCTTGCGTGGCTCTGCTTGATTGCATTGTGGCACTGCCTGCTTA
TGCTTACGATGGCAGAGTGACCTTTCAAGGGGAGATTTTAAGTGATGGCACTTGTAAAAT
TGAAACAGACAGCCAAAATCGCACGGTTACCCTGCCAACAGTGGGAAAAGCTAATTTAAG
CCACGCAGGGCAAACCGCCGCCCCTGTGCCTTTTTCCATCACGTTAAAAGAATGCAATGC
AGATGATGCTATGAAAGCTAATCTGCTATTTAAAGGGGGAGACAACACAACAGGGCAATC
0 TTATCTTTCCAATAAGGCAGGCAACGGCAAAGCCACCAACGTGGGCATTCAAATTGTCAA
AGCCGATGGCATAGGCACGCCTATCAAGGTGGACGGCACCGAAGCCAACAGCGAAAAAGC
CCCCGACACAGGTAAAGCGCAAAACGGCACAGTTATTCAACCCCGTTTTGGCTACTTTGG
CTCGTTATTACGCCACAGGTGAAGCCACCGCAGGCGACGTTGAAGCCACTGCAACTTTTG
AAGTGCAGTATAACTAAAATATTTATTATCCAGTGAAAAAA
SEKW. ID. NR: 75
Sekwencja nukleotydowa regionu DNA (1000 bp) przed genem P2 z Haemophilus influenzae (HiRd)
TTATCCGCTA ACATTTCATC AGTAATTCCA TGAACTTTAA TCGCATCAGG
PL 211 017 B1
51 ATCANCGGGG CGATCTGGCT TAATATAAAT ATGAYAATTA TTACCTGTGT
101 AACGACGATT TATTAATTCA ACTGCACCAA TTTCAATAAT GCAGTGTCCT
151 TCATAATGCG CGCCAAGCTG ATTCATACCT GTAGTTTCAG TATCTAATAC
201 AATTTGGCGA TTGGGATTAA TCATTTGTTC AACCTATCTC TTTCCATTAA
251 AATACTTGCC ATTCTACACA ACAACCTTTT TGTTATGCCK AAACAGATTG
301 AAATTTTTAC TGATGGATCT TGCTTAGGTA ATCCAGGGGC GGGCGGAATT
351 GGTGCCGTAT TGCGTTATAA ACAACATGAA AAAACACTCT CCAAAGGCTA
401 TTTCCAAACC ACCAATAATC GAATGGAATT ACGCGCTGTC ATTGAAGCAT
451 TAAATACATT AAAAGAACCT TGCTTGATCA CGCTTTATAG TGATAGCCAA
501 TATATGAAAA ATGGCATAAC CAAATGGATC TTTAACTGGA AAAAAAATAA
551 TTGGAAAGCA agttctggaa AGCCTGTAAA AAACCAAGAT TTATGGATAG
601 CCTTAGATGA ATCCATCCAA CGTCATAAAA TTAATTGGCA ATGGGTAAAA
651 GGCCATGCTG GACACAGAGA AAATGAAATT TGCGATGAAT TAGCAAAAAA
701 AGGGGCAGAA AATCCGACAT TGGAAGATAT GGGGTACATA GAAGAATAAT
751 ACAACTGATA TAACGTCATA TTTTTCGATA CCTAAAAATA TTTAATACTT
801 AAACCTAAAA CAGAATAAAA AATAATCAAA TTCATTTAAA AAATGTGATC
851 TCGATCAGAT TTCAAGAAAA TTAAAATTTT GGAGTATTGA CATCAAAAAT
901 TTTTTTTGTA AAGATGCAGC TCGTCCGTTT TGGCGATTGG ACAATTCTAT
951 TGGAGAAAAG TTCAATCATA GATAGTAAAC AACCATAAGG AATACAAATT
1001 A
SEKW. ID. NR: 76
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA (częściowa)
genu HtrB Morax‘
1 TCAGTGCTTG
25 51 GGCGGCGTGT
101 GCAGCATCCA
151 CAGCGGCAAA
201 AGTCGACAGT
illa catarrhalis
CTTTTTTAAG ATATGTACCG
GCGTCTTATA TTTCCTATCA
AGCCAATTTA ATCTTGGTTC
AACTCGCCAA ACAAATCCTA
CTTAAAACTT GGGCAATGCC
CTGTCAGTCC TGCATGGATT
TTGCAGGCTT AGTATTTATC
ACCCCAAGAT GCCAGACGCA
AAAAATCAGC TCATCAGTGC
ACCAAAATGG TCTATCGCAC
PL 211 017 B1
251 AAATTAAAAC GGTTCATCAT GAAGATATCC TAATCAAAGC ACTTGCCAAT
301 CCAAGTGGTA TGCTTGCCAT TGTGCCTCAT ATCGGCACTT GGGAGATGAT
351 GAATGCTTGG CTCAATACCT TTGGCTCCCC TACTATCATG TATAAGCCCA
401 TCAAAAATGC GGCGGTAGAT CGCTTTGTTT TACAGGGGCG TGAAAGACTA
451 AATGCCAGCC TTGTACCCAC AGATGCTAGT GGTGTTAAGG CAATTTTTAA
501 AACACTCAAA GCAGGTGGAT TTAGTATCAT ACTGCCCGAC CATGTACCTG
551 ATCCATCAGG TGGTGAGATT GCTCCTTTTT TTGGTATTAA AACCCTAACC
601 AGTACGCTGG CGTCAAAGCT TGCTGCAAAA ACTGGTTGTG CTCTTGTTGG
651 CTTAAGCTGT ATTCGGCGTG AAGATGGCGA TGGTTTTGAA ATTTTTTGTT
701 ATGAATTAAA TGATGAACAA CTTTATTCAA AAAATACCAA AATTGCAACC
751 ACTGCTTTAA ATGGTGCGAT GGAACAAATG ATTTATCCAC ATTTTTTGCA
801 TTATATGTGG AGCTATCGTC GGTTCAAGCA TACACCACTA TTAAATAATC
851 CTTATTTACT TAATGAAAAT GAGGTAAAAA AAATAGCCAT AAAGCTTCAA
901 GCCATGTCAA AGGATAGTTA TGAG
Sekwencja białka: 25% tożsamości i 35% podobieństwa do HtrB z E. coli
SVLGFLRYVP LSVLHGLAAC ASYISYHCRL SIYRSIQANL ILVHPKMPDA
51 QRQKLAKQIL KNQLISAVDS LKTWAMPPKW SIAQIKTVHH EDILIKALAN
101 PSGMLAIVPH IGTWEMMNAW LNTFGSPTIM YKPIKNAAVD RFVLQGRERL
151 NASLVPTDAS GVKAIFKTLK AGGFSIILPD HVPDPSGGEI APFFGIKTLT
201 STLASKLAAK TGCALVGLSC IRREDGDGFE IFCYELNDEC LYSKNTKIAT
251 TALNGAMEQN IYPHFLHYMW SYRRFKHTPL LNNPYLLNEN ELKKIAIKLQ
301 AMSKDSYE
SEKW. ID. NR: 77
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu HtrB Neisseria (meningokoka B)
ATGTTTCGTT TACAATTCGG GCTGTTTCCC CCTTTGCGAA CCGCCATGCA
CATCCTGTTG ACCGCCCTGC TCAAATGCCT CTCCCTGCTG CCACTTTCCT
PL 211 017 B1
101 GTCTGCACAC GCTGGGAAAC CGGCTCGGAC ATCTGGCGTT TTACCTTTTA
151 AAGGAAGACC GCGCGCGCAT CGTCGCCAAT ATGCGTCAGG CAGGCATGAA
201 TCCCGACCCC AAAACAGTCA AAGCCGTTTT TGCGGAAACG GCAAAAGGCG
251 GTTTGGAACT TGCCCCCGCG TTTTTCAGAA AACCGGAAGA CATAGAAACA
301 ATGTTCAAAG CGGTACACGG CTGGGAACAT GTGCAGCAGG CTTTGGACAA
351 ACACGAAGGG CTGCTATTCA TCACGCCGCA CATCGGCAGC TACGATTTGG
401 GCGGACGCTA CATCAGCCAG CAGCTTCCGT TCCCGCTGAC CGCCATGTAC
451 AAACCGCCGA AAATCAAAGC GATAGACAAA ATCATGCAGG CGGGCAGGGT
501 TCGCGGCAAA GGAAAAACCG CGCCTACCAG CATACAAGGG GTCAAACAAA
551 TCATCAAAGC CCTGCGTTCG GGCGAAGCAA CCATCGTCCT GCCCGACCAC
601 GTCCCCTCCC CTCAAGAAGG CGGGGAAGGC GTATGGGTGG ATTTCTTCGG
651 CAAACCTGCC TATACCATGA CGCTGGCGGC AAAATTGGCA CACGTCAAAG
701 GCGTGAAAAC CCTGTTTTTC TGCTGCGAAC GCCTGCCTGG CGGACAAGGT
751 TTCGATTTGC ACATCCGCCC CGTCCAAGGG GAATTGAACG GCGACAAAGC
801 CCATGATGCC GCCGTGTTCA ACCGCAATGC CGAATATTGG ATACGCCGTT
851 TTCCGACGCA GTATCTGTTT ATGTACAACC GCTACAAAAT GCCG
Sekwencja białka - 30% tożsamości i 38% podobieństwa do Htrb
E. coli
1 MFRLQFGLFP PLRTAMHILL TALLKCLSLL PLSCLHTLGN RLGHLAFYLL
51 KEDRARIVAN MRQAGMNPDP KTVKAVFAET AKGGLELAPA FFRKPEDIET
101 MFKAVHGWEH VQQALDKHEG LLFITPHIGS YDLGGRYISQ QLPFPLTAMY
151 KPPKIKAIDK IMQAGRVRGK GKTAPTSIQG VKQIIKALRS GEATIVLPDH
201 VPSPQEGGEG VWVDFFGKPA YTMTLAAKLA HVKGVKTLFF CCERLPGGQG
251 FDLHIRPVQG ELNGDKAHDA AVFNRNAEYW IRRFPTQYLF MYNRYKMP
SEKW. ID. NR: 78
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu HtrB z Haemophilus influenzae (atypowe)
ATGAAAAACG AAAAACTCCC TCAATTTCAA CCGCACTTTT TAGCCCCAAA
PL 211 017 B1
51 ATACTGGCTT TTTTGGCTAG GCGTGGCAAT TTGGCGAAGT ATTTTATGTC
101 TTCCCTATCC TATTTTGCGC CATATTGGTC ATGGTTTCGG TTGGCTGTTT
151 TCACATTTAA AAGTGGGTAA ACGTCGAGCT GCCATTGCAC GCCGTAATCT
201 TGAACTTTGT TTCCCTGATA TGCCTGAAAA CGAACGTGAG ACGATTTTGC
251 AAGAAAATCT TCGTTCAGTA GGCATGGCAA TTATCGAAAC TGGCATGGCT
301 TGGTTTTGGT CGGATTCACG TATCAAAAAA TGGTCGAAAG TTGAAGGCTT
351 ACATTATCTA AAAGAAAATC AAAAAGATGG AATTGTTCTC GTCGGTGTTC
401 ATTTCTTAAC GCTAGAACTT GGCGCACGCA TCATTGGTTT ACATCATCCT
451 GGCATTGGTG TTTATCGTCC AAATGATAAT CCTTTGCTTG ATTGGCTACA
501 AACACAAGGC CGTTTACGCT CCAATAAAGA TATGCTTGAT CGTAAAGATT
551 TACGCGGAAT GATCAAAGCT TTACGCCACG AAGAAACCAT TTGGTATGCG
601 CCTGATCACG ATTACGGCAG AAAAAATGCC GTTTTTGTTC CTTTTTTTGC
651 AGTACCTGAC ACTTGCACTA CTACTGGTAG TTATTATTTA TTGAAATCCT
701 CGCAAAACAG CAAAGTGATT CCATTTGCGC CATTACGCAA TAAAGATGGT
751 TCAGGCTATA CCGTGAGTAT TTCAGCGCCT GTTGATTTTA CGGATTTACA
801 AGATGAAACG GCGATTGCTG CGCGAATGAA TCAAATCGTA GAAAAGGAAA
851 TCATGAAGGG CATATCACAA TATATGTGGC TACATCGCCG TTTTAAAACA
901 CGTCCAGATG AAAATACGCC TAGTTTATAC GATTAA
Sekwencja białka - 57% tożsamości i 66% podobieństwa do HtrB
E. coii
1 MKNEKLPQFQ PHFLAPKYWL FWLGVAIWRS ILCLPYPILR HIGHGFGWLF
51 SHLKVGKRRA AIARRNLELC FPDMPENERE TILQENLRSV GMAIIETGMA
101 WFWSDSRIKK WSKVEGLHYL KENQKDGIVL VGVHFLTLEL GARIIGLHHP
151 GIGVYRPNDN PLLDWLQTQG RLRSNKDMLD RKDLRGMIKA LRHEETIWYA
201 PDHDYGRKNA VFVPFFAVPD TCTTTGSYYL LKSSQNSKVI PFAPLRNKDG
251 SGYTVSISAP VDFTDLQDET AIAARMNQIV EKEIMKGISQ YMWLHRRFKT
301 RPDENTPSLY D*
PL 211 017 B1
SEKW. ID. NR: 79
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu MsbB z Haemophilus influenzae (atypowe)
1 ATGTCGGATA ATCAACAAAA TTTACGTTTG ACGGCGAGAG TGGGCTATGA
51 AGCGCACTTT TCATGGTCGT ATTTAAAGCC TCAATATTGG GGGATTTGGC
101 TTGGTATTTT CTTTTTATTG TTGTTAGCAT TTGTGCCTTT TCGTCTGCGC
151 GATAAATTGA CGGGAAAATT AGGTATTTGG ATTGGGCATA AAGCAAAGAA
201 ACAGCGTACG CGTGCACAAA CTAACTTGCA ATATTGTTTC CCTCATTGGA
251 CTGAACAACA ACGTGAGCAA GTGATTGATA AAATGTTTGC GGTTGTCGCT
301 CAGGTTATGT TTGGTATTGG TGAGATTGCC ATCCGTTCAA AGAAACATTT
351 GCAAAAACGC AGCGAATTTA TCGGTCTTGA ACATATCGAA CAGGCAAAAG
401 CTGAAGGAAA GAATATTATT CTTATGGTGC CACATGGCTG GGCGATTGAT
451 GCGTCTGGCA TTATTTTGCA CACTCAAGGC ATGCCAATGA CTTCTATGTA
501 TAATCCACAC CGTAATCCAT TGGTGGATTG GCTTTGGACG ATTACACGCC
551 AACGTTTCGG CGGAAAAATG CATGCACGCC AAAATGGTAT TAAACCTTTT
601 TTAAGTCATG TTCGTAAAGG CGAAATGGGT TATTACTTAC CCGATGAAGA
651 TTTTGGGGCG GAACAAAGCG TATTTGTTGA TTTCTTTGGG ACTTATAAAG
701 CGACATTACC AGGGTTAAAT AAAATGGCAA AACTTTCTAA AGCCGTTGTT
751 ATTCCAATGT TTCCTCGTTA TAACGCTGAA ACGGGCAAAT ATGAAATGGA
801 AATTCATCCT GCAATGAATT TAAGTGATGA TCCTGAACAA TCAGCCCGAG
851 CAATGAACGA AGAAATAGAA TCTTTTGTTA CGCCAGCGCC AGAGCAATAT
901 GTTTGGATTT TGCAATTATT GCGTACAAGG AAAGATGGCG AAGATCTTTA
951 TGATTAA
Sekwencja białka - 45% tożsamości i 56% podobieństwa do genu 25 MsbB z B. coli
MSDNQQNLRL TARVGYEAHF SWSYLKPQYW GIWLGIFFLL LLAFVPFRLR 51 DKLTGKLGIW IGHKAKKQRT RAQTNLQYCF PHWTEQQREQ VIDKMFAWA
101 QVMFGIGEIA IRSKKHLQKR SEFIGLEHIE QAKAEGKNII LMVPHGWAID 151 ASGIILHTQG MPMTSMYNPH RNPLVDWLWT ITRQRFGGKM HARQNGIKPF
PL 211 017 B1
201 LSHVRKGEMG YYLPDEDFGA EQSVFVDFFG TYKATLPGLN KMAKLSKAW
251 IPMFPRYNAE TGKYEMEIHP AMNLSDDPEQ SARAMNEEIE SFVTPAPEQY
301 VWILQLLRTR KDGEDLYD*
SEKW. ID. NR: 80
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu MsbB
Moraxella catarrhalis
1 ATGAGTTGCC ATCATCAGCA TAAGCAGACA CCCAAACACG CCATATCCAT
51 TAAGCATATG CCAAGCTTGA CAGATACTCA TAAACAAAGT AGCCAAGCTG
101 AGCCAAAATG GTTTGAATGG GCGTTTTTAC ATCCCAAATA TTGGGGAGTT
151 TGGCTGGCTT TTGCGTTGAT TTTACCGCTG ATTTTTCTAC CGCTGCGTTG
201 GCAGTTTTGG ATCGGCAAGC GTCTTGGCAT TTTGGTACAT TACTTAGCTA
251 AAAGCCGAGT TCAAGACACT CTAACCAACC TGCAGCTTAC CTTCCCAAAT
301 CAACCAAAAT CAAAACACAA GGCCACCGCA CGGCAAGTAT TTATTAATCA
351 AGGTATTGGT ATTTTTGAAA GTTTATGTGC ATGGTTTCGC CCTAATGTCT
401 TTAAACGCAC TTTTAGCATT TCTGGTTTAC AGCATTTGAT TGATGCCCAA
451 AAACAAAATA AAGCGGTGAT TTTACTTGGT GGACATCGCA CGACGCTTGA
501 TTTGGGCGGT CGGTTATGTA CACAGTTTTT TGCGGCGGAC TGCGTGTATC
551 GCCCACAAAA CAACCCTTTG CTTGAATGGT TTATCTATAA TGCACGCCGC
601 TGTATCTTTG ATGAGCAAAT CTCAAATCGT GATATGAAAA AACTCATCAC
651 TCGGCTCAAA CAAGGTCGGA TAATTTGGTA TTCACCTGAT CAAGATTTTG
701 GTCTTGAGCA TGGCGTGATG GCGACCTTTT TTGGTGTGCC TGCAGCAACG
751 ATTACCGCTC AGCGTCGTCT TATTAAGCTG GGTGATAAAG CCAATCCTCC
801 TGTCATCATC ATGATGGATA TGCTCAGACA AACGCCCGAT TATATCGCAA
851 AAGGTCACCG TCCACATTAT CACATCAGCC TAAGCGCTGT GTTAAAAAAT
901 TATCCCAGCG ATGACGAAAC CGCCGATGCT GAAGGCATCA ATCGACTGAT
951 TGAGCAAAAT ATTCAAAAAG ATTTAACCCA GTGGATGTGG TTTCATCGCC
1001 GCTTTAAAAC TCAAGCCGAT GACACCAATT ACTATCAACA TTAATG
PL 211 017 B1
Sekwencja białka - 28% tożsamości i 37 podobieństwa do genu
MsbB z E. coli
1 MSCHHQHKQT PKHAISIKHM PSLTDTHKQS SQAEPKSFEW AFLHPKYWGV
51 WLAFALILPL IFLPLRWQFW IGKRLGILVH YLAKSRVQDT LTNLQLTFPN
101 QPKSKHKATA RQVFINQGIG IFESLCAWFR PNVFKRTFSI SGLQHLIDAQ
151 KQNKAVILLG GHRTTLDLGG RLCTQFFAAD CVYRPQNNPL LEWFIYNARR
201 CIFDEQISNR DMKKLITRLK QGRIIWYSPD QDFGLEHGVM ATFFGVPAAT
251 ITAQRRLIKL GDKANPPVII MMDMLRQTPD YIAKGHRPHY HISLSAVLKN
301 YPSDDETADA ERINRLIEQN IQKDLTQWMW FHRRFKTQAD DTNYYQH*
SEKW. . ID. NR: 81
Sekwencja nukleotydowa regionu kodującego DNA genu MsbB
Neisseria (meningokoka B)
1 51 ATGAAATTTA GCTGCTGCAC TATTTTTTGT AAACTTGCCG ACTGTATGTT ACCTGACGGG TTGCAGTTTC TTTGCTCGCC TGCCGTTTGC TACCTTTTGG
15 101 TCAAACCCCG CCGCCGTATC GGCGAAATCA ATTTGGCAAA ATGCTTTCCC
151 GAGTGGGACG GAAAAAAGCG CGAAACCGTA TTGAAGCAGC ATTTCAAACA
201 TATGGCGAAA CTGATGCTTG AATACGGCTT ATATTGGTAC GCGCCTGCCG
251 GGCGTTTGAA ATCGCTGGTG CGTTACCGCA ATAAGCATTA TTTGGACGAC
301 GCGCTGGCGG CGGGGGAAAA AGTCATCATT CTGTACCCGC ACTTCACCGC
20 351 GTTCGAGATG GCGGTGTACG CGCTTAATCA GGATGTACCG CTGATCAGTA
401 TGTATTCCCA CCAAAAAAAC AAGATATTGG ACGCACAGAT TTTGAAAGGC
451 CGCAACCGCT ACGACAATGT CTTCCTTATC GGGCGCACCG AAGGCGTGCG
501 CGCCCTCGTC AAACAGTTCC GCAAAAGCAG CGCGCCGTTT CTGTATCTGC
551 CCGATCAGGA TTTCGGACGC AACGATTCGG TTTTTGTGGA TTTTTTCGGT
25 601 ATTCAGACGG CAACGATTAC CGGCTTGAGC CGCATTGCCG CGCTTGCAAA
651 TGCAAAAGTG ATACCCGCCA TCCCCGTCCG CGAGGCGGAC AATACGGTTA
701 CATTGCATTT CTACCCGGCT TGGGAATCCT TTCCGAGTGA AGATGCGCAG
751 GCCGACGCGC AGCGCATGAA CCGTTTTATC GAGGAACCGT GCGCGAACAT
801 CCCGAGCAGT ATTTTTGGCT GCACAAGCGT TTCAAAACCC GTCCGGAAGG
851 CAGCCCCGAT TTTTACTGAT ACGTAA
Sekwencja białka - 25% identyczność i 36% identyczność i
MsbB E. coli
5 1 MKFIFFVLYV LQFLPFALLH KLADLTGLLA YLLVKPRRRI GEINLAKCFP
51 EWDGKKRETV LKQHFKHMAK LMLEYGLYWY APAGRLKSLV RYRNKHYLDD
101 ALAAGEKVII LYPHFTAFEM AVYALNQDVP LISMYSHQKN KILDAQILKG
151 RNRYDNVFLI GRTEGVRALV KQFRKSSAPF LILPDQDFGR NDSVFVDFFG
201 IQTATITGLS RIAALANAKV IPAIPVREAD NTVTLHFYPA WESFPSEDAQ
10 251 ADAORMNRFI EEPCANIPSS IFGCTSVSKP VRKAAPIFTD T*

Claims (43)

1. Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Neisseria meningitidis, znamienny tym, że jest otrzymywany przy użyciu następującego sposobu:
a) sposobu obniżania poziomu immunodominujących zmiennych lub nie-ochronnych antygenów w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy konstruowania szczepu bakteryjnego wytwarzającego mniejszą ilość lub niewytwarzającego antygenu PorA oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu.
2. Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków według zastrz. 1, znamienny tym, że jest otrzymywany przy użyciu jednego lub więcej dalszych sposobów wybranych z następującej grupy:
b) sposobu zwiększania ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed genem kodującym ten antygen powodując jego ekspresję na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
c) sposobu zwiększania ekspresji wyrażanych warunkowo ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby usunąć represywne mechanizmy kontrolne jego ekspresji oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
d) sposobu modyfikowania części lipidu A bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w nadawaniu toksyczności części lipidu A bakteryjnego LPS, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
e) sposobu modyfikowania części lipidu A bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w zmniejszaniu toksyczności części lipidu A bakteryjnego LPS, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed tym genem powodując jego ekspresję na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
f) sposobu zmniejszania toksyczności lipidu A w preparacie pęcherzyków i zwiększania poziomów antygenów ochronnych, obejmującego etapy konstruowania chromosomu szczepu bakteryjnego tak, aby zawrzeć gen kodujący peptyd polimyksynę A, lub jego pochodną lub analog, połączony z antygenem ochronnym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
g) sposobu wytwarzania konserwatywnych antygenów OMP na preparacie pęcherzyków obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby usunąć zmienne regiony genu kodującego ten antygen oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
h) sposobu zmniejszania w preparacie pęcherzyków ekspresji antygenu, który wykazuje podobieństwo strukturalne do struktury ludzkiej i może być zdolny do indukowania odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w biosyntezie antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu; lub
i) sposobu zwiększania ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić do chromosomu jedną lub więcej dalszych kopii genu kodującego ten antygen kontrolowanych przez heterologiczną, silniejszą sekwencję promotorową oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu.
3. Preparat pęcherzyków według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że etapy modyfikowania w sposobach a), b), c), d), e), h) oraz i) są przeprowadzane przez homologiczne zdarzenie rekombinacyjne między sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym, a sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym do szczepu.
4. Preparat pęcherzyków według zastrz. 3, znamienny tym, że etapy konstruowania wykonuje się przez podwójne homologiczne zdarzenie rekombinacyjne typu crossing-over między dwiema sekwencjami o co najmniej 30 nukleotydach na chromosomie bakteryjnym oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową „X” i dwiema sekwencjami o co najmniej 30 nukleotydach na wektorze transformowanym do szczepu oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową „Y”, przy czym podczas zdarzenia rekombinacyjnego X i Y są zamieniane.
PL 211 017 B1
5. Preparat pęcherzyków według zastrz. 4, znamienny tym, że dwie sekwencje nukleotydowe mają w przybliżeniu tą samą długość oraz wektorem jest liniowa cząsteczka DNA.
6. Preparat pęcherzyków według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobach a), b), c), d), e) i h) przeprowadzane są w regionie chromosomu 1000 bp przed kodonem inicjacji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
7. Preparat pęcherzyków według zastrz. 6, znamienny tym, że dla sposobu a), d) lub h) sekwencja nukleotydową X zawiera część regionu promotorowego genu, zaś sekwencja nukleotydowa Y albo zawiera region słabego promotora, albo nie zawiera regionu promotora.
8. Preparat pęcherzyków według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobach a), d), i h) są przeprowadzane tak, że sekwencja nukleotydowa X zawiera część sekwencji kodującej genu będącego przedmiotem zainteresowania.
9. Preparat pęcherzyków według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobie i) są przeprowadzane tak, że sekwencja nukleotydowa Y zawiera dalszą kopię genu w kasecie ekspresyjnej.
10. Preparat pęcherzyków Neisseria meningitidis według zastrz. 2, znamienny tym, że jest otrzymywany przez wykorzystanie sposobu b) i/lub i), w którym zwiększana jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: NspA, podobny do Hsf, Hap, PorB, OMP85, PilQ, PldA, FrpB, TbpA, TbpB, FrpA, FrpC, LbpA, LbpB, FhaB, HasR, lipo02, Tbp2 (lipo28), MltA (lipo30) i ctrA.
11. Preparat pęcherzyków Neisseria meningitidis według zastrz. 2 albo 10, znamienny tym, że jest otrzymywany przez wykorzystanie co najmniej sposobu h), w którym zmniejszana jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: galE, siaA, siaB, siaC, siaD, ctrA, ctrB, ctrC i ctrD.
12. Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Moraxella catarrhalis, znamienny tym, że jest otrzymywany przy użyciu następującego sposobu:
a) sposobu obniżania poziomu immunodominujących zmiennych lub nie ochronnych antygenów w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy określania tożsamości takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego wytwarzającego mniejszą ilość lub niewywarzającego takich antygenów oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu, przy czym jeden lub więcej z tych antygenów są wybrane z grupy składającej się z: CopB, OMP106, OmpB1, TbpA, TbpB, LbpA i LbpB.
13. Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków według zastrz. 12, znamienny tym, że jest otrzymywany przy użyciu jednego lub więcej dalszych sposobów wybranych z następującej grupy:
b) sposobu zwiększania ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed genem kodującym ten antygen powodując jego ekspresję na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
c) sposobu zwiększania ekspresji wyrażanych warunkowo ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby usunąć represywne mechanizmy kontrolne jego ekspresji oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
d) sposobu modyfikowania części lipidu A bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w nadawaniu toksyczności części lipidu A bakteryjnego LPS, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
e) sposobu modyfikowania części lipidu A bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w zmniejszaniu toksyczności części lipidu A bakteryjnego LPS, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed tym genem powodując jego ekspresję na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
f) sposobu zmniejszania toksyczności lipidu A w preparacie pęcherzyków i zwiększania poziomów antygenów ochronnych, obejmującego etapy konstruowania chromosomu szczepu bakteryjnego tak, aby zawrzeć gen kodujący peptyd polimyksynę A lub jego pochodną, lub analog, połączony z antygenem ochronnym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
g) sposobu wytwarzania konserwatywnych antygenów OMP na preparacie pęcherzyków obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby usunąć zmienne regiony genu kodującego ten antygen oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
100
PL 211 017 B1
h) sposobu zmniejszania w preparacie pęcherzyków ekspresji antygenu, który wykazuje podobieństwo strukturalne do struktury ludzkiej i może być zdolny do indukowania odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w biosyntezie antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu; lub
i) sposobu zwię kszania ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pę cherzyków obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić do chromosomu jedną lub więcej dalszych kopii genu kodującego ten antygen kontrolowanych przez heterologiczną, silniejszą sekwencję promotorową oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu.
14. Preparat pęcherzyków według zastrz. 12 albo 13, znamienny tym, że etapy modyfikowania w sposobach a), b), c), d), e), h) oraz i) są przeprowadzane przez homologiczne zdarzenie rekombinacyjne między sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym a sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym do szczepu.
15. Preparat pęcherzyków według zastrz. 14, znamienny tym, że etapy konstruowania wykonuje się przez podwójne homologiczne zdarzenie rekombinacyjne typu crossing-over między dwiema sekwencjami o co najmniej 30 nukleotydach na chromosomie bakteryjnym oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową i dwiema sekwencjami o co najmniej 30 nukleotydach na wektorze transformowanym do szczepu oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową „Y”, przy czym podczas zdarzenia rekombinacyjnego X i Y są zamieniane.
16. Preparat pęcherzyków według zastrz. 15, znamienny tym, że dwie sekwencje nukleotydowe mają w przybliżeniu tą samą długość oraz wektorem jest liniowa cząsteczka DNA.
17. Preparat pęcherzyków według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobach a), b), c), d), e) i h) przeprowadzane są w regionie chromosomu 1000 bp przed kodonem inicjacji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
18. Preparat pęcherzyków według zastrz. 17, znamienny tym, że dla sposobu a), d) lub h) sekwencja nukleotydowa X zawiera część regionu promotorowego genu, zaś sekwencja nukleotydowa Y albo zawiera region słabego promotora, albo nie zawiera regionu promotora.
19. Preparat pęcherzyków według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobach a), d), i h) są przeprowadzane tak, że sekwencja nukleotydowa X zawiera część sekwencji kodującej genu będącego przedmiotem zainteresowania.
20. Preparat pęcherzyków według zastrz. 15 albo 16, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobie i) są przeprowadzane tak, że sekwencja nukleotydowa Y zawiera dalszą kopię genu w kasecie ekspresyjnej.
21. Preparat pęcherzyków Moraxella catarrhalis według zastrz. 13, znamienny tym, że jest otrzymywany przez wykorzystanie sposobu b) i/lub i), w którym zwiększona jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: OMP106, HasR, PilQ, OMP85, lipo06, lipo10, lipo11, lipo18, P6, ompCD, CopB, D15, OmplA1, Hly3, LbpA, LbpB, TbpA, TbpB, OmpE, UspA1, UspA2 i Omp21.
22. Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków z modyfikowanego szczepu Haemophilus influenzae, znamienny tym, że jest otrzymywany przy użyciu następującego sposobu:
a) sposobu obniżania poziomu immunodominujących zmiennych lub nie ochronnych antygenów w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy określania tożsamości takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego wytwarzającego mniejszą ilość lub nie wytwarzającego takich antygenów oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu, przy czym jeden lub więcej z tych antygenów są wybrane z grupy składającej się z: P2, P5, Hif, proteazy IgAl, HgpA, HgpB, HMW1, HMW2, Hxu, TbpA i TbpB.
23. Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków według zastrz. 22, znamienny tym, że jest otrzymywany przy użyciu jednego lub więcej dalszych sposobów wybranych z następującej grupy:
b) sposobu zwię kszania ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pę cherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed genem kodującym ten antygen powodując jego ekspresję na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
c) sposobu zwię kszania ekspresji wyraż anych warunkowo ochronnych antygenów OMP w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu
PL 211 017 B1
101 bakteryjnego tak, aby usunąć represywne mechanizmy kontrolne jego ekspresji oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
d) sposobu modyfikowania części lipidu A bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w nadawaniu toksyczności części lipidu A bakteryjnego LPS, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
e) sposobu modyfikowania części lipidu A bakteryjnego LPS w preparacie pęcherzyków, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w zmniejszaniu toksyczności części lipidu A bakteryjnego LPS, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić sekwencję silniejszego promotora przed tym genem powodując jego ekspresję na poziomie wyższym niż w pęcherzyku niezmodyfikowanym oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
f) sposobu zmniejszania toksyczności lipidu A w preparacie pęcherzyków i zwiększania poziomów antygenów ochronnych, obejmującego etapy konstruowania chromosomu szczepu bakteryjnego tak, aby zawrzeć gen kodujący peptyd polimyksynę A, lub jego pochodną lub analog, połączony z antygenem ochronnym oraz wytwarzania pę cherzyków z tego szczepu;
g) sposobu wytwarzania konserwatywnych antygenów OMP na preparacie pę cherzyków obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby usunąć zmienne regiony genu kodującego ten antygen oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu;
h) sposobu zmniejszania w preparacie pę cherzyków ekspresji antygenu, który wykazuje podobieństwo strukturalne do struktury ludzkiej i może być zdolny do indukowania odpowiedzi autoimmunologicznej u ludzi, obejmującego etapy identyfikowania genu uczestniczącego w biosyntezie antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby zmniejszyć lub wyłączyć ekspresję tego genu oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu; lub
i) sposobu zwię kszania ekspresji ochronnych antygenów OMP w preparacie pę cherzyków obejmującego etapy identyfikowania takiego antygenu, konstruowania szczepu bakteryjnego tak, aby wprowadzić do chromosomu jedną lub więcej dalszych kopii genu kodującego ten antygen kontrolowanych przez heterologiczną, silniejszą sekwencję promotorową oraz wytwarzania pęcherzyków z tego szczepu.
24. Preparat pęcherzyków według zastrz. 22 albo 23, znamienny tym, że etapy modyfikowania w sposobach a), b), c), d), e), h) oraz i) są przeprowadzane przez homologiczne zdarzenie rekombinacyjne między sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na chromosomie bakteryjnym a sekwencją o długości co najmniej 30 nukleotydów na wektorze transformowanym do szczepu.
25. Preparat pęcherzyków według zastrz. 24, znamienny tym, że etapy konstruowania wykonuje się przez podwójne homologiczne zdarzenie rekombinacyjne typu crossing-over między dwiema sekwencjami o co najmniej 30 nukleotydach na chromosomie bakteryjnym oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową „X” i dwiema sekwencjami o co najmniej 30 nukleotydach na wektorze transformowanym do szczepu oddzielonymi przez sekwencję nukleotydową „Y”, przy czym podczas zdarzenia rekombinacyjnego X i Y są zamieniane.
26. Preparat pęcherzyków według zastrz. 25, znamienny tym, że dwie sekwencje nukleotydowe mają w przybliżeniu tą samą długość oraz wektorem jest liniowa cząsteczka DNA.
27. Preparat pęcherzyków według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobach a), b), c), d), e) i h) przeprowadzane są w regionie chromosomu 1000 bp przed kodonem inicjacji genu będącego przedmiotem zainteresowania.
28. Preparat pęcherzyków według zastrz. 27, znamienny tym, że dla sposobu a), d) lub h) sekwencja nukleotydowa X zawiera część regionu promotorowego genu, zaś sekwencja nukleotydowa Y albo zawiera region słabego promotora, albo nie zawiera regionu promotora.
29. Preparat pęcherzyków według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobach a), d), i h) są przeprowadzane tak, że sekwencja nukleotydowa X zawiera część sekwencji kodującej genu będącego przedmiotem zainteresowania.
30. Preparat pęcherzyków według zastrz. 25 albo 26, znamienny tym, że zdarzenia rekombinacyjne w sposobie i) są przeprowadzane tak, że sekwencja nukleotydowa Y zawiera dalszą kopię genu w kasecie ekspresyjnej.
31. Preparat pęcherzyków Haemophilus influenzae według zastrz. 23, znamienny tym, że jest otrzymywany przez wykorzystanie sposobu b) i/lub i), w którym zwiększana jest ekspresja jednego lub więcej genów z listy obejmującej: D15, P6, TbpA, TbpB, P2, P5, OMP26, HMW1, HMW2, HMW3, HMW4, Hia, Hsf, Hap, Hin47 i Hif.
102
PL 211 017 B1
32. Szczepionka, znamienna tym, że zawiera preparat pęcherzyków określony w zastrz. 1-31 i farmaceutycznie dopuszczalną zaróbkę .
33. Szczepionka meningokokowa, znamienna tym, że zawiera preparat pęcherzyków określony w zastrz. 1, 2, 10 lub 11 i jeden lub więcej zwykłych lub skoniugowanych meningokokowych polisacharydów otoczki wybranych spośród serotypów A, C, Y lub W.
34. Szczepionka przeciwko zapaleniu opon, znamienna tym, że zawiera preparat określony w zastrz. 1, 2, 10 lub 11, skoniugowany polisacharyd otoczki H. influenzae b i jeden lub więcej zwykłych lub skoniugowanych pneumokokowych polisacharydów otoczki.
35. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego, znamienna tym, że zawiera preparat pęcherzyków określony w zastrz. 12, 13 lub 21 i jeden lub więcej zwykłych lub skoniugowanych pneumokokowych polisacharydów otoczki i jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed zakażeniem atypowymi H. influenzae.
36. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego według zastrz. 35, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przeciwko Streptococcus pneumoniae i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy.
37. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego, znamienna tym, że zawiera preparat pęcherzyków określony w zastrz. 22, 24 lub 31 i jeden lub więcej zwykłych lub skoniugowanych pneumokokowych polisacharydów otoczki i jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed zakażeniem Moraxella catarrhalis.
38. Szczepionka przeciwko zapaleniu ucha środkowego według zastrz. 37, znamienna tym, że dodatkowo obejmuje jeden lub więcej antygenów białkowych, które mogą chronić gospodarza przeciwko Streptococcus pneumoniae i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed RSV i/lub jeden lub więcej antygenów, które mogą chronić gospodarza przed wirusem grypy.
39. Zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny, z którego wytwarzany jest preparat pęcherzyków określony w zastrz. 1-31.
40. Sposób wytwarzania szczepionki, znamienny tym, że obejmuje generowanie szczepionki z modyfikowanego Gram-ujemnego szczepu bakteryjnego określonego w zastrz. 39.
41. Zastosowanie preparatu pęcherzyków określonego w zastrz. 1, 10 lub 11 do wytwarzania leku do immunizacji gospodarza będącego człowiekiem przeciwko chorobie wywołanej przez zakażenie Neisseria meningitidis.
42. Zastosowanie preparatu pęcherzyków określonego w zastrz. 12 lub 21 do wytwarzania leku do immunizacji gospodarza będącego człowiekiem przeciwko chorobie wywołanej przez Moraxella catarrhalis.
43. Zastosowanie preparatu pęcherzyków określonego w zastrz. 22 lub 31 do wytwarzania leku do immunizacji gospodarza będącego człowiekiem przeciwko chorobie wywołanej przez Haemophilus influenza.
PL353891A 1999-08-03 2000-07-31 Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków, jego zastosowanie i zawierająca go szczepionka, zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania szczepionki PL211017B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9918319.6A GB9918319D0 (en) 1999-08-03 1999-08-03 Vaccine composition

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL353891A1 PL353891A1 (pl) 2003-12-15
PL211017B1 true PL211017B1 (pl) 2012-03-30

Family

ID=10858521

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL353891A PL211017B1 (pl) 1999-08-03 2000-07-31 Preparat zmodyfikowanych genetycznie pęcherzyków, jego zastosowanie i zawierająca go szczepionka, zmodyfikowany Gram-ujemny szczep bakteryjny oraz sposób wytwarzania szczepionki
PL392363A PL211037B1 (pl) 1999-08-03 2000-07-31 Kompozycja szczepionki

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL392363A PL211037B1 (pl) 1999-08-03 2000-07-31 Kompozycja szczepionki

Country Status (31)

Country Link
US (4) US20060216307A1 (pl)
EP (6) EP1797894B1 (pl)
JP (3) JP5524437B2 (pl)
KR (2) KR20130083491A (pl)
CN (1) CN1377415B (pl)
AR (1) AR025218A1 (pl)
AT (2) ATE345392T1 (pl)
AU (1) AU770360C (pl)
BR (1) BR0012974A (pl)
CA (3) CA2820314C (pl)
CO (1) CO5280150A1 (pl)
CY (1) CY1107553T1 (pl)
CZ (1) CZ2002403A3 (pl)
DE (2) DE60031859T2 (pl)
DK (1) DK1208214T3 (pl)
ES (3) ES2355517T3 (pl)
GB (1) GB9918319D0 (pl)
GC (1) GC0000258A (pl)
HK (1) HK1048493B (pl)
HU (1) HUP0203056A3 (pl)
IL (2) IL147647A0 (pl)
MX (1) MXPA02001205A (pl)
MY (1) MY129006A (pl)
NO (1) NO332230B1 (pl)
NZ (3) NZ516802A (pl)
PL (2) PL211017B1 (pl)
PT (1) PT1208214E (pl)
SI (1) SI1208214T1 (pl)
TR (2) TR200202448T2 (pl)
WO (1) WO2001009350A2 (pl)
ZA (1) ZA200200824B (pl)

Families Citing this family (90)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10967045B2 (en) 1998-11-02 2021-04-06 Secretary of State for Health and Social Care Multicomponent meningococcal vaccine
GB9823978D0 (en) 1998-11-02 1998-12-30 Microbiological Res Authority Multicomponent meningococcal vaccine
NO20002828D0 (no) * 2000-06-02 2000-06-02 Statens Inst For Folkehelse Proteinholdig vaksine mot Neisseria meningtidis serogruppe samt fremgangsmÕte ved fremstilling derav
EP1322328B1 (en) 2000-07-27 2014-08-20 Children's Hospital & Research Center at Oakland Vaccines for broad spectrum protection against diseases caused by neisseria meningitidis
GB0103170D0 (en) * 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0025169D0 (en) 2000-10-13 2000-11-29 Smithkline Beecham Biolog Novel compounds
KR100947757B1 (ko) 2001-01-23 2010-03-18 아벤티스 파스퇴르 다가 수막구균 폴리사카라이드―단백질 접합체 백신
GB0103169D0 (en) * 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
GB0103171D0 (en) 2001-02-08 2001-03-28 Smithkline Beecham Biolog Vaccine composition
WO2002101026A2 (en) 2001-06-11 2002-12-19 Applied Nanosystems B.V. Methods for binding acma-type protein anchor fusions to cell-wall material of micro-organisms
GB0115176D0 (en) * 2001-06-20 2001-08-15 Chiron Spa Capular polysaccharide solubilisation and combination vaccines
US7084257B2 (en) 2001-10-05 2006-08-01 Amgen Inc. Fully human antibody Fab fragments with human interferon-gamma neutralizing activity
MX339524B (es) * 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
GB0130123D0 (en) * 2001-12-17 2002-02-06 Microbiological Res Agency Outer membrane vesicle vaccine and its preparation
GB0213622D0 (en) * 2002-06-13 2002-07-24 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine Corporation
RU2359696C2 (ru) * 2002-08-02 2009-06-27 ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. Вакцинная композиция, содержащая трансферрин-связывающий белок и hsf из грамотрицательных бактерий
CN102552895B (zh) * 2002-08-02 2014-07-23 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 疫苗组合物
EP1524992B1 (en) * 2002-08-02 2015-03-04 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Vaccine compositions comprising l2 and/or l3 immunotype lipooligosaccharides from lgtb- neisseria menigitidis
BR0313100A (pt) * 2002-08-02 2005-06-21 Glaxosmithkline Biolog Sa Composição imunogênica, composição imunogênica isolada, vacina, método de tratamento ou prevenção de doença bacteriana gram-negativa, uso da vacina, cepa bacteriana gram-negativa geneticamente manipulada, método para preparar a composição imunogênica, método para preparar a vacina, método de preparar uma imunoglobulina para uso na prevenção ou tratamento de infecção neisserial, preparação de imunoglobulina, preparação farmacêutica, e, uso da preparação farmacêutica
GB0220197D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Univ Utrecht Refolding method
US7438918B2 (en) 2002-08-30 2008-10-21 University Of Iowa Research Foundation Lipid A deficient mutants of Neisseria meningitidis
GB0220194D0 (en) 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
EP1549338B1 (en) 2002-10-11 2010-12-22 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Polypeptide-vaccines for broad protection against hypervirulent meningococcal lineages
DK2279746T3 (da) * 2002-11-15 2013-11-25 Novartis Vaccines & Diagnostic Overfladeproteiner i neisseria meningitidis
GB0227346D0 (en) 2002-11-22 2002-12-31 Chiron Spa 741
CU23313A1 (es) 2002-11-27 2008-09-25 Inst Finlay Ct De Investigacia Mã0/00todo de obtenciã"n de estructuras cocleares. composiciones vacunales y adyuvantes basados en estructuras cocleares y sus intermediarios
ES2383175T3 (es) 2003-01-30 2012-06-18 Novartis Ag Vacunas inyectables contra múltiples serogrupos de meningococos
GB0308691D0 (en) * 2003-04-07 2003-05-21 Xenova Res Ltd Vaccine preparations
GB0323103D0 (en) 2003-10-02 2003-11-05 Chiron Srl De-acetylated saccharides
CU23377A1 (es) * 2003-11-04 2009-05-28 Ct De Ingenieria Genetica Y Biotecnologia Metodo para la incorporacion de antigenos en vesiculas de membrana externa de bacterias y formulaciones resultantes
GB0408977D0 (en) 2004-04-22 2004-05-26 Chiron Srl Immunising against meningococcal serogroup Y using proteins
GB0416120D0 (en) 2004-07-19 2004-08-18 Health Prot Agency Stable compositions containing OMV's
AU2005203202C1 (en) * 2004-07-30 2009-02-19 Intervet International B.V. Novel bacterium and vaccine
GB0419408D0 (en) * 2004-09-01 2004-10-06 Chiron Srl 741 chimeric polypeptides
GB0419627D0 (en) * 2004-09-03 2004-10-06 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
GB0424092D0 (en) 2004-10-29 2004-12-01 Chiron Srl Immunogenic bacterial vesicles with outer membrane proteins
CN101107007B (zh) 2005-01-27 2011-08-17 奥克兰儿童医院及研究中心 对脑膜炎奈瑟球菌所致疾病具有广谱保护作用的gna1870囊泡疫苗
SG160329A1 (en) 2005-02-18 2010-04-29 Novartis Vaccines & Diagnostic Proteins and nucleic acids from meningitis/sepsis-associated escherichia coli
WO2006091517A2 (en) 2005-02-18 2006-08-31 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Immunogens from uropathogenic escherichia coli
BRPI0612655B1 (pt) 2005-06-27 2021-06-15 Pfizer Ireland Pharmaceuticals Composição imunogênica
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
ZA200805602B (en) 2006-01-17 2009-12-30 Arne Forsgren A novel surface exposed haemophilus influenzae protein (protein E; pE)
US20090123499A1 (en) 2006-06-12 2009-05-14 Nathalie Devos Vaccine
CA2659552A1 (en) 2006-08-16 2008-02-21 Novartis Ag Immunogens from uropathogenic escherichia coli
US8956625B2 (en) 2006-09-07 2015-02-17 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Inactivated polio vaccines
GB0700562D0 (en) 2007-01-11 2007-02-21 Novartis Vaccines & Diagnostic Modified Saccharides
WO2008147816A2 (en) * 2007-05-22 2008-12-04 Cornell Research Foundation, Inc. Compositions and methods for the display of proteins on the surface of bacteria and their derived vesicles and uses thereof
EP2185576A4 (en) * 2007-08-02 2011-01-12 Childrens Hosp & Res Ct Oak FHBP- AND LPXL1-BASED VESICIUM VACCINES FOR BROADBAND PROTECTION AGAINST NEISSERIA MENINGITIDIS-RELATED DISEASES
BR122016015627A2 (pt) 2007-10-19 2018-10-30 Novartis Ag kit, composição antigênica liofilizada e método para preparação de uma composição imunogênica
CA2716212A1 (en) 2008-02-21 2009-08-27 Novartis Ag Meningococcal fhbp polypeptides
CA2716706C (en) 2008-03-03 2014-02-18 Irm Llc Compounds and compositions as tlr activity modulators
AU2009262893B2 (en) * 2008-05-30 2015-05-21 The U.S.A., as represented by The Secretary of the Army, on behalf of Walter Reed Army Institute Of Research Meningococcal multivalent native outer membrane vesicle vaccine, methods of making and use thereof
KR101042541B1 (ko) * 2008-07-25 2011-06-17 한국생명공학연구원 외막소체를 생산하는 재조합 ｇ（－） 박테리아 및 이를이용한 다가항원이 실린 외막소체의 제조방법
GB0816447D0 (en) * 2008-09-08 2008-10-15 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
GB0822634D0 (en) 2008-12-11 2009-01-21 Novartis Ag Meningitis vaccines
WO2010070453A2 (en) 2008-12-17 2010-06-24 Novartis Ag Meningococcal vaccines including hemoglobin receptor
TWI548746B (zh) * 2009-08-06 2016-09-11 英特威特國際股份有限公司 防備豬胸膜肺炎之疫苗及製備該疫苗之方法
EP3017828A1 (en) 2009-08-27 2016-05-11 GlaxoSmithKline Biologicals SA Hybrid polypeptides including meningococcal fhbp sequences
EP2470205A1 (en) 2009-08-27 2012-07-04 Novartis AG Adjuvant comprising aluminium, oligonucleotide and polycation
KR101430283B1 (ko) 2009-09-01 2014-08-14 주식회사이언메딕스 장내 공생 세균유래 세포밖 소포체, 및 이를 이용한 질병모델, 백신, 후보 약물 탐색 방법, 및 진단 방법
WO2011027956A2 (ko) 2009-09-04 2011-03-10 주식회사이언메딕스 그람 양성 박테리아에서 유래한 세포밖 소포체 및 이를 이용한 질병 모델
BR112012004806B8 (pt) 2009-09-02 2022-10-04 Novartis Ag composições imunogênicas que incluem moduladores da atividade de tlr, método para aumento da eficácia da referida composição e uso
EP2483390A2 (en) 2009-09-30 2012-08-08 Novartis AG Expression of meningococcal fhbp polypeptides
CN102917730A (zh) 2009-10-27 2013-02-06 诺华有限公司 修饰的脑膜炎球菌fHBP多肽
WO2011057148A1 (en) 2009-11-05 2011-05-12 Irm Llc Compounds and compositions as tlr-7 activity modulators
CN102762206A (zh) 2009-12-15 2012-10-31 诺华有限公司 免疫增强化合物的均匀悬液及其用途
US20130004530A1 (en) 2010-03-10 2013-01-03 Jan Poolman Vaccine composition
WO2012020326A1 (en) 2010-03-18 2012-02-16 Novartis Ag Adjuvanted vaccines for serogroup b meningococcus
KR102157718B1 (ko) * 2010-07-26 2020-09-18 큐 바이올로직스 인코포레이티드 면역원성 소염 조성물
GB201015132D0 (en) 2010-09-10 2010-10-27 Univ Bristol Vaccine composition
AU2011300418B2 (en) 2010-09-10 2016-05-12 Glaxosmithkline Biologicals Sa Meningococcus overexpressing NadA and/or NHBA and outer membrane vesicles derived therefrom
WO2012133119A1 (ja) * 2011-03-28 2012-10-04 長瀬産業株式会社 フェリチンの製造方法
EP2505208A1 (en) 2011-04-01 2012-10-03 University of Graz Vaccine against Pasteurellaceae
WO2012153302A1 (en) 2011-05-12 2012-11-15 Novartis Ag Antipyretics to enhance tolerability of vesicle-based vaccines
GB201110980D0 (en) 2011-06-28 2011-08-10 Health Prot Agency Neisserial compositions and expression constructs
ES2654613T3 (es) 2012-02-02 2018-02-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Promotores para una expresión aumentada de proteínas en meningococos
WO2013151706A2 (en) 2012-04-06 2013-10-10 Cornell University Subunit vaccine delivery platform for robust humoral and cellular immune responses
CA2882619A1 (en) 2012-09-06 2014-03-13 Novartis Ag Combination vaccines with serogroup b meningococcus and d/t/p
CN103656631B (zh) * 2012-09-24 2015-08-19 北京科兴中维生物技术有限公司 多价肺炎球菌荚膜多糖-蛋白缀合物组合物及其制备方法
EP2925355B1 (en) 2012-11-30 2017-11-15 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Pseudomonas antigens and antigen combinations
RS61246B1 (sr) 2014-02-28 2021-01-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modifikovani meningokokni fhbp polipeptidi
CN107531736B (zh) 2015-01-06 2022-04-15 免疫疫苗科技公司 脂质a模拟物、其制备方法和用途
BR112020001255A2 (pt) 2017-07-21 2020-07-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services composições imunogênicas de neisseria meningitidis
EP3607967A1 (en) 2018-08-09 2020-02-12 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Modified meningococcal fhbp polypeptides
WO2020043874A1 (en) * 2018-08-31 2020-03-05 Glaxosmithkline Biologicals Sa Conjugated haemophilus influenzae vaccine using bordetella outer membrane vesicle
WO2021031270A1 (zh) * 2019-08-22 2021-02-25 四川大学 细菌膜囊泡及其分离制备系统和方法
WO2021113433A1 (en) * 2019-12-03 2021-06-10 University Of Connecticut Mycoplasma vaccine composition and methods
AU2021339930B2 (en) 2020-09-11 2024-06-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Outer membrane vesicles
CN114681601B (zh) * 2020-12-31 2025-08-19 基础治疗有限公司 脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗及其应用
CN115976088B (zh) * 2022-07-21 2023-09-19 深圳蓝晶生物科技有限公司 低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用

Family Cites Families (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2848965A1 (de) 1978-11-11 1980-05-22 Behringwerke Ag Verfahren zur herstellung von membranproteinen aus neisseria meningitidis und diese enthaltende vaccine
JPS55161029U (pl) 1979-05-08 1980-11-19
US4271147A (en) * 1980-01-10 1981-06-02 Behringwerke Aktiengesellschaft Process for the isolation of membrane proteins from Neisseria meningitidis and vaccines containing same
US4666836A (en) * 1981-01-02 1987-05-19 The Research Foundation Of State University Of New York Novel cloning vehicles for polypeptide expression in microbial hosts
US5098997A (en) * 1987-12-11 1992-03-24 Praxis Biologics, Inc. Vaccines for Haemophilus influenzae
RU2023448C1 (ru) 1987-07-30 1994-11-30 Сентро Насьональ Де Биопрепарадос Способ получения вакцины против различных патогенных серотипов менингита нейссера группы в
ES2160570T3 (es) 1988-12-16 2001-11-16 Nederlanden Staat Mutantes de neumolisina y vacunas de neumococos fabricadas a partir de los mismos.
ES2070312T5 (es) * 1988-12-19 2003-05-16 American Cyanamid Co Vacuna de proteina de membrana exterior meningococica de clase 1.
FR2646438B1 (fr) * 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
ES2202297T3 (es) 1990-07-16 2004-04-01 University Of North Carolina At Chapel Hill Proteinas antigenicas de n. meningitidis reprimibles con hierro relacionadas con la familia de toxinas hemolisina.
DE4023721A1 (de) 1990-07-26 1992-01-30 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur herstellung von vakzinen und ihre verwendung
US5912336A (en) 1990-08-23 1999-06-15 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated nucleic acid molecules encoding transferrin binding proteins from Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis
US6592876B1 (en) 1993-04-20 2003-07-15 Uab Research Foundation Pneumococcal genes, portions thereof, expression products therefrom, and uses of such genes, portions and products
US5476929A (en) 1991-02-15 1995-12-19 Uab Research Foundation Structural gene of pneumococcal protein
DE69327599T2 (de) 1992-06-25 2000-08-10 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende Impfstoffzusammensetzung
DK0699076T3 (da) 1993-05-18 2003-03-03 Univ Ohio State Res Found Vaccine mod mellemørebetændelse
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
ATE420171T1 (de) 1994-07-15 2009-01-15 Univ Iowa Res Found Immunomodulatorische oligonukleotide
US5565204A (en) 1994-08-24 1996-10-15 American Cyanamid Company Pneumococcal polysaccharide-recombinant pneumolysin conjugate vaccines for immunization against pneumococcal infections
IL117483A (en) 1995-03-17 2008-03-20 Bernard Brodeur MENINGITIDIS NEISSERIA shell protein is resistant to proteinase K.
US6265567B1 (en) 1995-04-07 2001-07-24 University Of North Carolina At Chapel Hill Isolated FrpB nucleic acid molecule
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
US6180111B1 (en) * 1995-05-18 2001-01-30 University Of Maryland Vaccine delivery system
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
HUP0600442A3 (en) 1995-06-07 2007-03-28 Biochem Vaccines Inc Streptococcal heat shock proteins members of the hsp70 family
BR9609882A (pt) * 1995-08-04 1999-07-27 Univ Guelph Vacina processos para preparar a mesma para tratar uma doença infecciosa para inserir uma molécula de ácido nucleico em uma célula de marcaç o para administrar um agente terapêutico a um hospedeiro e para triar um antígeno imunogênico de um patógeno uso de uma vesícula de membrana composição farmacêutica sistema de liberação de drogas e vesícula de membrana
US6887483B2 (en) * 1995-12-01 2005-05-03 University Of Iowa Research Foundation Non-toxic mutants of pathogenic gram-negative bacteria
DE69735715T2 (de) 1996-05-01 2007-03-29 The Rockefeller University Cholin-bindendes Protein, welches als gegen Pneumokokken gerichtetes Vakzin verwendet wird
FR2751000B1 (fr) 1996-07-12 1998-10-30 Inst Nat Sante Rech Med Adn specifiques des bacteries de l'espece neisseria meningitidis, leurs procedes d'obtention et leurs applications biologiques
US5882871A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation Saliva binding protein
US5882896A (en) 1996-09-24 1999-03-16 Smithkline Beecham Corporation M protein
CA2269663A1 (en) 1996-10-31 1998-05-07 Human Genome Sciences, Inc. Streptococcus pneumoniae antigens and vaccines
FR2755446B1 (fr) * 1996-11-04 1999-01-08 Inst Curie Lignees cellulaires stables exprimant la proteine cftr ou un mutant de cette proteine, outil de selection de molecules ayant un effet sur le transport intracellulaire de ces proteines
US6685943B1 (en) * 1997-01-21 2004-02-03 The Texas A&M University System Fibronectin binding protein compositions and methods of use
EP0973911A1 (en) * 1997-01-30 2000-01-26 Imperial College Of Science, Technology & Medicine MUTANT $i(msbB) or $i(htrB) GENES
GB9711964D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Medical Res Council Live attenuated vaccines
US6764686B2 (en) 1997-07-21 2004-07-20 Baxter International Inc. Modified immunogenic pneumolysin compositions as vaccines
WO1999010497A1 (en) * 1997-08-21 1999-03-04 De Staat Der Nederlanden, Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Novel mutants of gram negative mucosal bacteria and application thereof in vaccines
CN1280619A (zh) 1997-11-28 2001-01-17 根瑟特公司 沙眼衣原体的基因组序列和多肽,其片段以及其用途,特别是用于诊断、预防和治疗感染
GB9726398D0 (en) 1997-12-12 1998-02-11 Isis Innovation Polypeptide and coding sequences
KR100794394B1 (ko) 1998-04-07 2008-01-15 메디뮨 인코포레이티드 백신용 폐렴 구균의 콜린 결합성 단백질의 유도체
BR9910089A (pt) 1998-05-01 2004-06-08 Chiron Corp Composições e antìgenos de neisseria meningitidis
CA2347849C (en) 1998-10-22 2013-06-25 The University Of Montana Omp85 proteins of neisseria gonorrhoeae and neisseria meningitidis, compositions containing same and methods of use thereof
NZ511438A (en) * 1998-11-03 2003-03-28 Nederlanden Staat A lipopolysaccharide (LPS) with reduced toxicity from genetically modified gram negative bacteria
EP1524992B1 (en) * 2002-08-02 2015-03-04 GlaxoSmithKline Biologicals s.a. Vaccine compositions comprising l2 and/or l3 immunotype lipooligosaccharides from lgtb- neisseria menigitidis
US9473463B2 (en) 2014-07-29 2016-10-18 Combined Conditional Access Development & Support, LLC Control word and associated entitlement control message caching and reuse

Also Published As

Publication number Publication date
NO20020506D0 (no) 2002-01-31
AU770360C (en) 2005-04-07
CY1107553T1 (el) 2013-03-13
CA2380840A1 (en) 2001-02-08
CO5280150A1 (es) 2003-05-30
EP1774977A3 (en) 2007-07-04
AU770360B2 (en) 2004-02-19
JP2009284914A (ja) 2009-12-10
NZ530336A (en) 2005-08-26
NO20020506L (no) 2002-04-02
PL353891A1 (pl) 2003-12-15
EP1808490A2 (en) 2007-07-18
NO332230B1 (no) 2012-08-06
ES2355517T3 (es) 2011-03-28
CZ2002403A3 (cs) 2002-05-15
HUP0203056A3 (en) 2008-04-28
DK1208214T3 (da) 2007-03-19
HUP0203056A1 (hu) 2002-12-28
HK1048493B (en) 2007-06-22
ES2275539T3 (es) 2007-06-16
EP1797894A3 (en) 2007-11-14
ATE490327T1 (de) 2010-12-15
EP1808490B1 (en) 2012-11-14
JP5744813B2 (ja) 2015-07-08
ES2399057T3 (es) 2013-03-25
NZ516802A (en) 2005-09-30
US20060216307A1 (en) 2006-09-28
ATE345392T1 (de) 2006-12-15
US20080233154A1 (en) 2008-09-25
EP1808490A3 (en) 2007-10-24
KR20130083491A (ko) 2013-07-22
TR200200275T2 (tr) 2002-05-21
BR0012974A (pt) 2002-05-07
TR200202448T2 (tr) 2003-01-21
NZ530335A (en) 2005-07-29
EP1208214B1 (en) 2006-11-15
SI1208214T1 (sl) 2007-04-30
AR025218A1 (es) 2002-11-13
MY129006A (en) 2007-03-30
PL392363A1 (pl) 2010-11-22
EP1787655A3 (en) 2008-02-13
EP1787655A2 (en) 2007-05-23
CN1377415A (zh) 2002-10-30
EP1792994A3 (en) 2007-10-10
PT1208214E (pt) 2007-02-28
HK1048493A1 (en) 2003-04-04
WO2001009350A2 (en) 2001-02-08
EP1208214A2 (en) 2002-05-29
JP2013017487A (ja) 2013-01-31
GC0000258A (en) 2006-11-01
CA2380840C (en) 2014-04-08
CN1377415B (zh) 2011-05-18
HK1105581A1 (en) 2008-02-22
JP2003506049A (ja) 2003-02-18
DE60031859T2 (de) 2007-05-10
US20160175423A1 (en) 2016-06-23
WO2001009350A3 (en) 2001-08-30
AU6833600A (en) 2001-02-19
EP1792994A2 (en) 2007-06-06
CA2820271A1 (en) 2001-02-08
US20140294935A1 (en) 2014-10-02
ZA200200824B (en) 2003-11-26
DE60045324D1 (de) 2011-01-13
CA2820314C (en) 2016-04-26
KR20020027514A (ko) 2002-04-13
EP1774977A2 (en) 2007-04-18
IL147647A (en) 2012-08-30
GB9918319D0 (en) 1999-10-06
JP5524437B2 (ja) 2014-06-18
EP1797894B1 (en) 2010-12-01
PL211037B1 (pl) 2012-04-30
DE60031859D1 (de) 2006-12-28
EP1797894A2 (en) 2007-06-20
IL147647A0 (en) 2002-08-14
CA2820314A1 (en) 2001-02-08
MXPA02001205A (es) 2002-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU770360B2 (en) Vaccine composition
US20090117147A1 (en) Vaccines comprising outer membrane vesicles from gram negative bacteria
AU2003271337B2 (en) Vaccine composition
TWI297731B (en) Bleb preparation from neisseria meningitidis strain
HK1105576A (en) Genetically engineered bleb vaccine
HK1108004A (en) Genetically engineered bleb vaccine
HK1105427A (en) Vaccines of bacterial outer membrane vesicles
HK1105581B (en) Vaccine composition
HK1105575A (en) Meningococcal vaccine composition

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140731