CN104114706A - 用于脑膜炎球菌中增加的蛋白表达的启动子 - Google Patents

用于脑膜炎球菌中增加的蛋白表达的启动子 Download PDF

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Abstract

描述了新启动子来驱动脑膜炎球菌中的转录，例如用于过表达蛋白抗原以保持在膜囊泡中。经修饰的porA启动子缺少可以造成相转变的野生型聚-G序列。可以使用脑膜炎球菌rRNA编码基因(例如，编码16S rRNA)来驱动蛋白编码基因的转录。这些方法可以组合使用。

Description

用于脑膜炎球菌中增加的蛋白表达的启动子
本申请要求2012年2月2日提交的美国临时专利申请61/594,159的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。
技术领域
本发明属于用于在脑膜炎球菌中控制转录的启动子的领域。
背景技术
脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是细菌性脑膜炎的病因。脑膜炎球菌疫苗接种的一个方法依赖于外膜囊泡(OMV)，如在诺华(Novartis)MENZBTM产品和挪威公共卫生研究院(Norwegian Institute of Public Health)MENBVACTM产品中所使用，两者都通过脑膜炎球菌的去污剂处理产生。
已知改变脑膜炎球菌外膜的蛋白组成，并且因此改变OMV的组成。已经描述了敲除不需要的基因并且过表达需要的基因。参考文献1-2，3报道了OMV疫苗的临床前研究，其中fHbp(也称为GNA1870)过表达(并且这种过表达可以与LpxL1[4]的敲除结合)。参考文献5报道了5种配方的OMV疫苗的临床研究，其中敲除了PorA和FrpB并且过表达Hsf和TbpA。参考文献6报道了由具有灭活的synX和lpxL1基因、过表达的fHbp、两种不同的PorA蛋白和稳定化的OpcA表达的细菌制备的天然外膜囊泡疫苗的I期临床研究。参考文献7报道了由具有灭活的synX和lpxL1基因(和，在两个情况中，灭活的lgtA)、两种不同的PorA蛋白和过表达的NadA或fHbp的细菌制备的三价天然外膜囊泡疫苗。如果通过不去除LPS的方法产生囊泡，诸如lpxL1的基因的灭活是重要的。
蛋白组成中的这些变化可以多种方式实现。例如，细菌可以在铁限制条件下生长以促进与铁代谢相关的某些蛋白的表达。其他技术可以包括对细菌的工程改造。例如，参考文献8提出可以使用强启动子(诸如porA、porB、lgtF或hpuAB启动子)来上调保护性外膜蛋白的表达，或可以去除抑制性转录控制机制。参考文献9提出可以对基因进行工程改造以去除它们的相可变性。在参考文献7中使用porA启动子来过表达NadA，而使用tac启动子过表达fHbp。
本发明的目标是进一步提供并且改善在脑膜炎球菌中改变蛋白表达的方式，并且尤其是提供用于驱动感兴趣基因的表达的启动子。可以使用上调来增加在OMV中有用蛋白的水平。
发明内容
本发明的第一方面使用经修饰的porA启动子来驱动转录。如参考文献8的实施例10-16中使用的天然porA启动子在其-35到-10区域之间含有聚-G序列，但是该序列可能造成相转变并且因此来自天然porA启动子的表达可能不稳定。本发明的经修饰porA启动子有改善，因为它们缺少野生型聚-G序列。
因此，本发明提供了包含启动子的核酸，其包括：
(i)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域和/或
(ii)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域，
其中-10区域和-35区域通过12-20个核苷酸的间插(或间隔子)序列隔开，并且其中间插序列不含聚-鸟嘌呤(guanidine)序列或者包括具有不超过8个连续鸟嘌呤核苷酸的聚-鸟嘌呤序列。
本发明的第二方面使用来自脑膜炎球菌rRNA编码基因(诸如16S rRNA基因)的启动子来驱动蛋白编码基因的转录。因此本发明也提供包含与下游的蛋白编码基因可操作连接的启动子的核酸，其中该启动子包括(i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域和/或(ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。
本发明也提供包含来自与具有5′UTR的蛋白编码基因可操作连接的rRNA基因启动子的启动子区域的核酸，所述5′UTR含有蛋白表达的翻译调节元件。启动子区域可以包括(i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域，(ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域，和(iii)来自基因如porA基因的5′UTR。
本发明也提供了包含启动子的核酸，其包括SEQ ID NO：18，或SEQ IDNO：18的变体，所述变体与SEQ ID NO：18之间存在最多4个(例如，1、2、3或4个)单核甘酸插入、删除或取代的差异。
可以杂合形式使用porA和rRNA启动子，例如具有来自porA启动子的-10区域和来自rRNA启动子的-35区域(其可以是共有的-35区域)。因此，本发明也提供了包含启动子的核酸，其包括：
(i)来自脑膜炎球菌rRNA基因的-10区域和来自脑膜炎球菌porA基因的-35区域，或
(ii)来自脑膜炎球菌porA基因的-10区域和来自脑膜炎球菌rRNA基因的-35区域。
本发明的核酸可以在细菌中存在，并且尤其是在脑膜炎球菌中。启动子可以驱动与之可操作连接的下游蛋白编码基因的表达(尤其是编码外膜蛋白的基因)，并且可以使用该细菌来制备疫苗(尤其是基于囊泡的疫苗)。本发明也提供了这些细菌、这些囊泡和这些疫苗。
本发明的启动子
细菌启动子中的两个基本序列是-10区域(也称为Pribnow盒)和-35区域。通过间插序列分隔这些区域，并且在-10区域和转录起始位点(+1)之间是短非转录上游序列。
已经详细研究了PorA启动子。参考文献10报道了6聚体的-35区域，之后是16聚体或17聚体的间插序列，然后是7聚体Pribnow盒，然后是7-聚体非转录上游序列，之后是转录核苷酸+1。在野生型porA基因中的起始密码子在转录体的核苷酸+59，并且在参考文献8中证明了这个59聚体间隔。
在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域的情况中，这通常是6聚体TATAAT，即典型的-10区域6聚体。
在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域的情况中，这通常是6聚体TGGTTT或ATGGTT。
在-35区域和-10区域之间的间插序列可以是12-20个核苷酸，例如12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸。16、17或18个核苷酸的间插序列是典型的。
短非转录上游序列通常是5-10个核苷酸，例如6、7或8个核苷酸。其可以是富G：C的，例如在序列中至少1/2的核苷酸是G或C，例如在6聚体非转录上游序列中至少3个G/C残基。
因此，启动子可以包括6聚体-35区域、16聚体或17聚体间插序列、6聚体-10区域和6聚体或7聚体非转录上游序列，得到总共34、35或36个核苷酸的核心启动子。
启动子当然可以在-35区域上游连续。-35区域上游的序列对于来自该启动子的高水平表达、来自该启动子的表达调节可能是重要的。例如，在rRNA启动子中核心启动子上游称为UP-元件的序列能够解释它们提高转录高达300倍的突出力度[11，12]。这些可以由RNA聚合酶核心的α-亚基所识别。因此本发明的启动子可以包括上游UP-元件，其通常是富A：T的。相似地，本发明的启动子可以包括上游的CREN(奈瑟球菌的接触调控元件)[13]。
在本发明的启动子包括来自porA基因启动子的-35区域和/或-10区域的情况中，短非转录上游序列可以是TGAAGAC。
在本发明的启动子包括来自porA基因启动子的-35区域和/或-10区域的情况中，如实施例中所示，间插序列可以变化。例如，可以是TTTGCGGGGGGGGGGG(野生型16聚体；SEQ ID NO：26)或TTTGCGGGGGGGGGGGGG(野生型18聚体；SEQ ID NO：17)，但是并不优选这些野生型序列。相反，在这16聚体或18聚体中的11聚体或13聚体聚-G序列可以由非-G核苷酸间断。两个优选的间插序列是TTTGCGAGGGAGGTGG(16聚体；SEQ ID NO：27)和TTTTGCGAGGGAGGTGG(17聚体；SEQ ID NO：28)。
在一些实施方式中，间插序列不含聚鸟嘌呤序列，即在间插序列中没有GG二核苷酸。在其他实施方式中，间插序列可以含有聚鸟嘌呤序列，但是其含有不超过8个连续的鸟嘌呤核苷酸，即其不包括序列GGGGGGGG。理想地，间插序列不包括序列GGGGGGG。理想地，间插序列不包括序列GGGGGG。理想地，间插序列不包括序列GGGGG。理想地，间插序列不包括序列GGGG。间插序列可以包括GGG三核苷酸或GG二核苷酸。因此，在间插序列内的聚G序列可以总共延伸不超过8个核苷酸，并且理想地具有不超过3个连续的鸟嘌呤残基。
在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域的情况中，这通常是6聚体TATAAT，即典型的-10区域6聚体。
在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域的情况中，这通常是6聚体TTGACA(其为共有的-35区域)。
在本发明的启动子包括来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域和/或-10区域的情况中，间插序列可以是GGCGGAAGGAATACTT(SEQ ID NO：29)。
在本发明的启动子包括来自rRNA基因启动子的-35区域和/或-10区域的情况中，短非转录上游序列可以是TCGCAAC。
可以杂合形式使用porA和rRNA启动子，并且可用的启动子包括来自rRNA基因的-35区域(例如，TTGACA)、来自porA基因的经修饰的间插序列(例如，TTTGCGAGGGAGGTGG；SEQ ID NO：27)、典型的Pribnow盒(TATAAT)和来自porA基因的短非转录上游序列(例如，TGAAGAC)。因此，启动子可以包括SEQ ID NO：30(TTGACATTTGCGAGGGAGGTGGTATAATTGAAGAC)。
在一些实施方式中，启动子包括SEQ ID NO：18(在野生型脑膜炎球菌16S rRNA启动子的转录起始位点之前的35聚体片段)。如本文所示，该序列可改变有1、2、3或4个单核苷酸序列插入、删除或取代。
当在细菌中以功能DNA形式存在时，这些启动子可操作地连接到编码感兴趣蛋白的序列，后者的转录受到该启动子的控制。可以使用本发明来表达任意感兴趣的蛋白，但是该蛋白优选是可以保留在囊泡中的外膜蛋白。下面提供了外膜蛋白的合适示例，但是并不优选使用本发明来驱动编码PorA外膜蛋白的转录体的表达。
在编码DNA序列中，本发明的启动子的下游DNA包括转录起始位点，之后是5′未翻译区域(通常包括Shine-Dalgarno序列)然后是编码的感兴趣蛋白的起始密码子。
在启动子来自rRNA基因的情况中，所转录序列的起始理想上源自编码蛋白的基因而不是rRNA基因。因此，rRNA启动子(例如，SEQ ID NO：18或变体)可以与来自脑膜炎球菌蛋白编码基因的5′UTR融合。在一些实施方式中，rRNA启动子与来自porA基因的5′UTR(58聚体)融合，并且该5′UTR然后与感兴趣基因的编码序列融合。5′UTR应该包括翻译调节元件，其允许从蛋白编码基因翻译蛋白。因此，该实施方式使用rRNA启动子来产生可以被翻译的蛋白编码转录体。启动子下游在5′UTR以内的序列对于下游基因的表达的转录或转录后影响的调节是重要的。
也可以使用porA基因的5′UTR与本发明的经修饰porA启动子联用，使得经修饰的porA启动子与来自porA基因的5′UTR连接，后者再与感兴趣蛋白的编码序列融合。
有用的porA 5′UTR可以包括SEQ ID NO：39的核苷酸序列，即GTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCC，或与SEQ ID NO：39存在最多5个(例如，1、2、3、4或5个)单核苷酸插入、删除或取代的差异的序列。
可以理解本文的启动子序列的讨论是指正义链。在发生转录的双链DNA中，启动子具有互补链。在表述两个启动子元件由“n”个核苷酸隔开的情况中，这仍指正义链的核苷酸的数目；在双链DNA中，由“n”个碱基对隔开元件。如果启动子表述为缺少鸟嘌呤残基，这仍指正义链；在双链DNA中，例如无鸟嘌呤的启动子可以包括鸟嘌呤残基，但是仅在反义链上作为正义链上胞嘧啶残基的互补碱基。虽然参照正义链描述了本发明，本发明的范围包括包含这类正义链的双链核酸，以及包括这类正义链或包括这些正义链的反义形式的单链核酸(这些反义链当然可以用于通过标准技术制备正义链)。
囊泡
当制备脑膜炎球菌囊泡，即通过从脑膜炎球菌外膜的破坏或出泡得到的任意蛋白脂质体囊泡时，本发明是特别用于由此形成保留来自外膜的抗原的囊泡。因此该术语包括，例如OMV(有时称为“小泡”)、微囊泡(MV[14])和“天然OMV”(“NOMV”[15]))。
MV和NOMV是天然产生的膜囊泡，在细菌生长期间自发形成并释放到培养基中。MV可以通过以下方法获得：在肉汤培养基中培养奈瑟球菌，将全细胞与肉汤培养基中较小的MV分离(例如，通过过滤或低速离心，只沉淀细胞而不沉淀较小囊泡)，然后从细胞耗尽的培养基中收集MV(例如，通过过滤、示差沉淀或MV聚集，通过高速离心沉淀MV)。一般可以根据培养基中产生的MV的量来选择用于生产MV的菌株，例如，参考文献16和17描述了具有高MV产量的奈瑟球菌。
另一个用于自发外膜囊泡产生的技术是灭活脑膜炎球菌中的mltA基因，如参考文献18所公开。这些突变细菌在生长中向其培养基释放囊泡。
从细菌人工制备OMV，可以利用去污剂处理(例如用脱氧胆酸盐)或通过非去污剂方式(例如参见参考文献19)进行制备。形成OMV的技术包括：用胆酸盐去污剂(例如，石胆酸、鹅脱氧胆酸、乌索脱氧胆酸、脱氧胆酸、胆酸、乌索胆酸等的盐，优选用脱氧胆酸钠[20和21]处理奈瑟球菌)在不会沉淀去污剂的充分高的pH下[22]处理细菌。其它技术可以在基本没有去污剂存在的情况下[19]利用如超声、均化、微流化、空化、渗透压冲击、研磨、法式压制、混合等技术进行。不使用或使用低去污剂的方法可以保留有用的抗原，如NspA[19]。因此一种方法可以使用含有脱氧胆酸盐浓度约0.5％或更低如约0.2％、约0.1％、＜0.05％或0的OMV提取缓冲液。参考文献23描述了一种制备OMV的有用过程，涉及对粗OMV进行超滤，代替高速离心。该过程可以涉及在超滤后进行超离心的步骤。
一个纯化囊泡的便捷方法是在参考文献24中公开的双过滤方法。
优选的囊泡是在细菌培养中自发形成的那些囊泡，而不是仅在细菌的物理或化学处理之后释放的那些囊泡。具有灭活的MltA的脑膜炎球菌的生长是以这种方式产生囊泡的优选方式。参考文献47公开了产生高出泡菌株的方式。对于自发释放的囊泡，优选使用不产生完整LOS的细菌(去污剂-提取的囊泡具有降低水平的潜在反应原性LOS)。
如果脂寡糖(LOS)存在于囊泡中，可以对囊泡进行处理，以将其LOS与蛋白质组分连接起来(“泡内”偶联[48])。
囊泡可能完全缺少LOS，或它们可能缺少六酰化LOS，例如，在囊泡中的LOS可能每个LOS分子的二级酰基链数有减少[25]。例如，囊泡可以来自具有lpxL1删除或突变的菌株，其导致产生五酰化的LOS[2，43]。在一个菌株中的LOS可能缺少乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以是lst和/或lgtB敲除的菌株[5]。LOS可以缺少至少一种野生型一级O-连接的脂肪酸[26]。所述LOS可以没有α链。LOS可以包含GlcNAc-Hep2磷脂酰乙醇胺-KDO2-脂质A[27]。
囊泡可以包括一个、超过一个或(优选)零个PorA血清亚型。从例如参考文献28(其公开了从经修饰表达6种不同的PorA亚型的菌株构建囊泡)和参考文献29中获知提供了多重-PorA OMV的脑膜炎球菌的修饰。相反，也从参考文献5中获知去除PorA的修饰。
囊泡可能不含PorA和FrpB两者中的一种或两种。优选的囊泡是不含PorA的。
囊泡可缺少荚膜糖。例如，它们可能衍生自具有一个或多个用于荚膜生物合成和/或输出的基因(例如，synX)被灭活的菌株。
本发明可与不同菌株的囊泡混合物一起使用。例如，参考文献30公开了含多价脑膜炎球菌囊泡组合物的疫苗，含有第一囊泡和第二囊泡，衍生第一囊泡的脑膜炎球菌菌株具有在使用国有普遍性的血清亚型，衍生第二囊泡的菌株无需具有在使用国有普遍性的血清亚型。参考文献31也公开了不同囊泡的有用组合。在一些实施方式中，可使用各来自L2和L3免疫型菌株的囊泡组合。
过表达
可以使用本发明的启动子来在脑膜炎球菌中过表达感兴趣的基因。在基因编码外膜蛋白抗原的情况下，可以用这种过表达来提供有利地保留该抗原的囊泡。下面更详细地讨论这类囊泡。作为过表达的结果，与相应的野生型脑膜炎球菌中所看到的相比，从经修饰的脑膜炎球菌制备的囊泡含有较高水平的过表达的抗原。以每单位质量的囊泡中相关抗原的质量测量，囊泡中的表达增加在至少10％时有益，并且在增加至少20％、30％、40％、50％、75％、100％或更多时更有益。
通过使用本发明的启动子可以用于过表达抗原的合适的重组修饰包括，但不限于：(i)启动子取代；(ii)基因添加；和/或(iii)基因取代。如果需要，这三个技术可以与(iv)抑制子敲除联用。
在启动子取代中，用本发明的启动子取代细菌中控制抗原基因表达的启动子以提供较高水平的表达。
在基因添加中，已经表达抗原的细菌接受相关基因的第二拷贝。第二拷贝可以整合进细菌染色体中或可以在诸如质粒的附加元件上。可以使用本发明的启动子表达第二拷贝。基因添加的效果是增加抗原的表达量。在使用质粒的情况中，理想地是具有高拷贝数的质粒，例如超过10个，或甚至超过100个。
在基因取代中，发生基因添加但是伴随着删除所述基因的原有拷贝。例如，在参考文献3中使用这种方法，其中删除了细菌的内源染色体fHbp基因并且用质粒编码的拷贝取代(也参见参考文献32)。使用本发明的启动子，来自取代拷贝的表达高于之前的拷贝，因此导致过表达。
在一些实施方式中，发生基因取代，其中基因添加伴随着另一个基因的删除。例如，当需要敲除内源基因但不是正由本发明的启动子过表达的感兴趣的基因时。
在一些实施方式中，可以出现超过一个事件的基因添加或基因取代，使得能发生通过本发明的启动子表达多重拷贝的感兴趣基因或通过本发明的启动子过表达感兴趣的不同基因。
至少一个抗原的过表达会使用本发明的启动子，但是这些启动子可以与其他技术联用。例如，启动子可以与抑制物敲除联用，其中抑制感兴趣抗原的表达的蛋白被敲除。这种敲除意味着不发生抑制并且可以更高的水平表达感兴趣的抗原。
例如，在NadA过表达的情况中，nadA基因可以使用本发明的启动子，但是另外可以删除编码NadR(NMB1843)的基因。NadR是一种转录抑制物蛋白[33]，其在所有测试的菌株中下调或抑制NadA编码基因。NadR的敲除导致NadA的组成型表达。过表达NadA的另一个方式是在培养基中加入4-羟基苯基乙酸。因此，本发明的启动子可以单独用作过表达策略，或与其他方法结合。
在一些实施方式中，细菌过表达NadA。
在一些实施方式中，细菌过表达NHBA。
在一些实施方式中，细菌过表达fHbp。
在一些实施方式中，细菌过表达NHBA和NadA。
在一些实施方式中，细菌过表达fHbp和NadA。
在一些实施方式中，细菌过表达fHbp和NHBA。
在一些实施方式中，细菌过表达fHbp、NHBA和NadA。
除了过表达NHBA和/或NadA以外，细菌可以过表达一种或多种其他的抗原。例如，细菌可以过表达以下的一种或多种：(a)NhhA；(b)TbpA；(c)HmbR；(d)TbpB；(e)NspA；(f)Cu，Zn-超氧化物歧化酶；(g)Omp85；(h)App；和/或(i)fHbp。已经在参考文献5和34中报道了NhhA的过表达。已经在参考文献5、34和35中报道了TbpA的过表达。已经在参考文献36中报道了HmbR的过表达。已经在参考文献35中报道了TbpB的过表达。已经在参考文献37中报道了NspA的过表达与porA和cps敲除的结合。已经在参考文献35中报道了Cu，Zn-超氧化物歧化酶的过表达。已经在参考文献1-3和32中报道fHbp的过表达并且在参考文献38和39中以不同方法(表达组成型活性突变FNR)进行。在过表达超过一种抗原的情况中，使用本发明的启动子过表达至少一种抗原，并且在一些情况中，会使用本发明的启动子过表达超过一种抗原。
在一些实施方式中，细菌过表达NHBA、NadA和fHbp。这三种抗原是在参考文献40中公开的“通用疫苗”或“4CMenB”[41，42]的组分。在一个实施方式中，通过本发明的启动子控制NHBA的表达，敲除NadR，并且该菌株表达组成型的活性突变FNR。在另一个实施方式中，通过本发明的启动子控制NHBA的表达，通过本发明的启动子控制fHbp的表达，并且敲除NadR。
过表达型经修饰的菌株通常会是与其亲本菌株等基因，除了遗传修饰以外。作为修饰的结果，(在相同条件下)感兴趣的抗原在经修饰的菌株中的表达高于在亲本菌株中。
细菌
如上述，从由于遗传修饰而过表达相关抗原的脑膜炎球菌制备本发明的囊泡，至少包括使用本发明的启动子。本发明也提供了这些细菌。它们可用于制备本发明的囊泡。
除了包括本发明的启动子以外，脑膜炎球菌可以包括一个或多个其他修饰。例如，其可以敲除lpxL1、lgtA、lgtB、porA、frpB、synX、mltA和/或lst中的一种或多种。例如，参考文献43报道了从具有灭活的synX、lpxL1和lgtA基因的细菌制备的NOMV疫苗。敲除至少lpxL1和synX是特别有用的。
通过敲除参与LPS生物合成的酶，细菌可以具有低的内毒素水平[44，45]。
细菌可以来自任意的血清组，例如A、B、C、W135或Y。优选血清组B或血清组W135。
细菌可以是任何血清型(例如，1、2a、2b、4、14、15、16等)、任何血清亚型和任何免疫型(例如，L1；L2；L3；L3，3，7；L10；等)。可以从具有以下亚型之一的菌株有效地制备囊泡：P1.2；P1.2，5；P1.4；P1.5；P1.5，2；P1.5，c；P1.5c，10；P1.7，16；P1.7，16b；P1.7h，4；P1.9；P1.15；P1.9，15；P1.12，13；P1.13；P1.14；P1.21，16；P1.22，14。
细菌可以来自任何合适的谱系，包括高侵袭性和超毒力谱系，例如下列7个超毒力谱系中的任何一个：亚组I、亚组III、亚组IV-1、ET-5复合系、ET-37复合系、A4簇、谱系3。这些谱系通过多位点酶电泳(MLEE)确定，但也使用多位点序列分型(MLST)也已用于对脑膜炎球菌分类[参考文献46]，例如ET-37复合系为由MLST所分的ST-11复合系，ET-5复合系为ST-32(ET-5)，谱系3为ST-41/44等。
在一些实施方式中，细菌可以包括一个或多个在参考文献8、37、47和48中公开的敲除和/或过表达突变。适于修饰的基因包括：(a)Cps、CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB[8]；(b)CtrA、CtrB、CtrC、CtrD、FrpB、GalE、HtrB/MsbB、LbpA、LbpB、LpxK、Opa、Opc、PhoP、PilC、PmrE、PmrF、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；(c)ExbB、ExbD、rmpM、CtrA、CtrB、CtrD、GalE、LbpA、LpbB、Opa、Opc、PilC、PorB、SiaA、SiaB、SiaC、SiaD、TbpA和/或TbpB；和(d)CtrA、CtrB、CtrD、FrpB、OpA、OpC、PilC、PorB、SiaD、SynA、SynB和/或SynC。
如上述，脑膜炎球菌有利地不表达活性MltA(GNA33)，使其自发释放囊泡，例如，其含有使用本发明的启动子表达的抗原。
理想地，细菌并不表达天然LPS，例如，其具有LpxL1和/或LgtB的突变或敲除。
在细菌具有敲除的情况中，这种敲除通过插入序列方便地实现，所插入的序列包括控制感兴趣蛋白转录的本发明的启动子。例如，基因组synX或lpxL1基因可以通过在其中插入序列来敲除，插入的序列包括控制外膜蛋白如fHbp的表达的本发明的启动子。因此可以使用单个转化事件来实现两个目标。
本发明的细菌可以包括选择标记物，例如抗生素耐受性标记物。
细菌可以有以下的一种或多种或全部特征：(i)LgtB和/或GalE下调或敲除，以截短脑膜炎球菌LOS；(ii)TbpA上调；(iii)NhhA上调；(iv)Omp85上调；(v)LbpA上调；(vi)NspA上调；(vii)PorA敲除；(viii)FrpB下调或敲除；(ix)Opa下调或敲除；(x)Opc下调或敲除；(xii)cps基因复合体缺失。截短的LOS可以不包括唾液酸-乳糖-N-新四糖表位，例如，其可以为半乳糖缺陷型LOS。所述LOS可以没有α链。
细菌可具有以下的一种或多种或全部特征：(i)LgtA下调或敲除；(ii)LpxLl下调或敲除；(iii)SynX下调或敲除；(iv)超过一种PorA亚型，诸如两种不同的PorA亚型；和/或(v)上调的外膜抗原，诸如NadA或fHbp。
菌株生产
本发明提供了用于制备适于囊泡制备的脑膜炎球菌菌株的方法，该方法包含以下步骤：(i)选择在特定培养条件下生长时表达第一个量的抗原的起始菌株，然后(ii)修饰该起始菌株以提供包括本发明的启动子的经修饰的菌株，其中经修饰的菌株在相同的特定培养条件下生长时表达第二个量的抗原，第二个量高于第一个量。以每单位质量的细菌中相关抗原的质量测量，第二个量高于第一个量至少10％是有益的，并且高至少20％、30％、40％、50％、75％、100％或更多是更有益地。
该方法之后可以有步骤(iii)培养在步骤(ii)中得到的经修饰的细菌以得到细菌培养物。
该方法也可以包括在引入本发明的启动子之前或之后的其他步骤的遗传操作。本发明的启动子引入细菌可以超过一次并可在超过一个位点上，例如有多个受控制的基因。
本发明也提供了制备脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包含处理通过本发明的方法所得的细菌培养物(如上述)的步骤，使其外膜形成囊泡。该处理步骤可以使用任意的上述技术。
本发明也提供了制备脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包含处理本发明的脑膜炎球菌的步骤，使其外膜形成囊泡。该处理步骤可以使用任意的上述技术。
本发明也提供了制备脑膜炎球菌囊泡的方法，该方法包含在外膜自发脱落囊泡的条件下培养本发明的脑膜炎球菌的步骤。例如，该脑膜炎球菌可能不表达活性的MltA。
可用的起始菌株是脑膜炎球菌血清组B。三种可用于制备过表达感兴趣的抗原的细菌的起始脑膜炎球菌菌株是MC58、NZ98/254和H44/76。MC58具有PorA血清亚型1.7，16；NZ98/254具有血清亚型P1.7-2，4；并且H44/76具有血清亚型1.7，16。也可使用具有这些血清亚型的其它菌株。
载体等
本发明提供了如上述的启动子。这些可以存在于细菌染色体，或染色体外或在附加体核酸如质粒内。细菌可以包括一个或多个拷贝的本发明的启动子。在细菌包括2个拷贝的情况中，这些可以在染色体和/或附加体中。
因此，本发明提供的细菌包含：(i)包括至少一个本发明的启动子的染色体和/或(ii)包括至少一个本发明的启动子的附加体，诸如质粒。
本发明也提供了包含本发明的启动子的核酸载体，诸如细菌表达载体。
这些载体或细菌中的这些启动子可以是没有任何下游可转录序列的“孤独”启动子，但是它们通常会可操作地与转录的序列连接，并且转录的序列然后经翻译表达感兴趣的蛋白。
抗原
NHBA(奈瑟菌属肝素结合抗原)
NHBA[51]作为基因NMB2132(GenBank登录号GI：7227388；本文的SEQ ID NO：9)包括在奈瑟球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌株的NHBA序列。例如，NHBA(称为蛋白“287”)的等位基因形式可见参考文献49的图5和15，以及例如文献50的实施例13和图21所示(其中的SEQ ID 3179到3184)。已报道了各种NHBA的免疫原性片段。
本发明优选使用的NHBA抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：9有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：9的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：9的表位。
最有用的NHBA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：9组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NHBA抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
已经通过各种方式实现了NHBA的过表达，例如，引入NHBA基因到IPTG诱导型启动子的控制下[51]。
NadA(奈瑟菌粘附素A)
NadA抗原作为基因NMB1994(GenBank登录号GI：7227256；本文的SEQ ID NO：10)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。迄今已公布了许多菌株的NadA抗原序列，并详细记载了作为奈瑟菌粘附素的蛋白活性。已报道了许多NadA的免疫原性片段。
本发明所用的优选NadA抗原包含以下的氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：10具有50％或更高的相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包含SEQ ID NO：10的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：10的表位。
最有用的NadA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：10组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NadA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。SEQ ID NO：6是一种这样的片段。
HmbR
全长HmbR序列作为基因NMB1668(本文的SEQ ID NO：7)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。参考文献52报道了来自不同菌株的HmbR序列(本文的SEQ ID NO：8)，并且参考文献36报道了其他的序列(本文的SEQ ID NO：19)。SEQ ID NO：7和8差异为1个氨基酸并且具有94.2％相同性。SEQ ID NO：19比SEQ ID NO：7短一个氨基酸并且由CLUSTALW确定它们具有99％相同性(1个插入，7个差异)。本发明可使用任何这种HmbR多肽。本发明可使用包含HmbR全长序列的多肽，但常用含有部分HmbR序列的多肽。因此在一些实施方式中，按照本发明使用的HmbR序列可包含与SEQ ID NO：7具有至少i％序列相同性的氨基酸序列，其中i值为50、60、70、80、90、95、99或更高。在其它实施方式中，按照本发明使用的HmbR序列可包含SEQ ID NO：7的至少j个连续氨基酸的片段，其中i值为7、8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更高。在其它实施方式中，按照本发明使用的HmbR序列可包含以下的氨基酸序列：(i)与SEQ ID NO：7具有至少i％序列相同性，和/或(ii)包含SEQ ID NO：7中至少j个连续氨基酸的片段。
优选j个氨基酸的片段包含来自SEQ ID NO：7的表位。这些表位通常包含位于HmbR表面上的氨基酸。有用的表位包括涉及HmbR与血凝素结合的氨基酸，因为与这些表位结合的抗体能够阻断细菌与宿主血凝素结合的能力。HmbR的拓扑学及其关键功能性残基如文献53所述。保留跨膜序列的片段是特别有用的，因为它们能够显示在细菌表面上，例如囊泡中。HmbR的长片段的示例对应于SEQ ID NO：21和22。然而，如果使用可溶性HmbR，则可以使用省略跨膜序列但是通常保留来自胞外部分的表位的序列。
本发明最有用的HmbR抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：7组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选HmbR抗原可在给予对象后引发杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
fHbp(H因子结合蛋白)
已详细确定了fHbp抗原的特征。它也被称为蛋白“741”[参考文献50的SEQ ID 2535和2536]、“MB1870”、“GNA1870”[54-56]、“P2086”、“LP2086”或“ORF2086”[57-59]。它是一种天然脂蛋白，在所有脑膜炎球菌血清组中有表达。已经通过NMR确定了fHbp的C-端免疫决定结构域(“fHbpC”)的结构[60]。蛋白的这个部分形成了8-链的β-桶，其链通过不同长度的环相连。桶之前是短α-螺旋和柔性的N-端尾部。
fHbp抗原分为三种不同变体[61]已发现对给定家族产生的血清对同一家族产生杀细菌活性，但对表达另两个家族之一的菌株无活性，即存在家族内、而非家族间交叉保护。本发明可以使用单个fHbp变体，但是可以有益地包括来自两种或三种变体的fHbp。因此，其可以使用两种或三种选自以下的fHbp的组合：(a)第一蛋白，包含与SEQ ID NO：1具有至少a％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；(b)第二蛋白，包含与SEQ ID NO：2具有至少b％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；和/或(c)第三蛋白，包含与SEQ ID NO：3具有至少c％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。
a值为至少85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。b值为至少85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。c值为至少85，例如86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.5或更高。a、b和c的值本质上彼此并不相关。
x值为至少7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。y值为至少7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。z值为至少7，例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、225、250。x、y和z的值本质上彼此并不相关。
在本发明使用单个fHbp变体的情况下，组合物可以包括包含以下的多肽：(a)与SEQ ID NO：1具有至少a％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；或(b)包含与SEQ ID NO：2具有至少b％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；或(c)包含与SEQ ID NO：3具有至少c％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。
在本发明使用来自变体中的两种或三种fHbp的情况下，组合物可以包括两种或三种选自以下的不同fHbp的组合：(a)第一多肽，包含与SEQ IDNO：1具有至少a％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；(b)第二多肽，包含与SEQ ID NO：2具有至少b％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQID NO：2的至少y个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；和/或(c)第三多肽，包含与SEQ ID NO：3具有至少c％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。第一、第二和第三多肽具有不同的氨基酸序列。
在本发明使用来自变体中的两种fHbp的情况下，组合物可以包括以下的两种：(a)第一多肽，包含与SEQ ID NO：1具有至少a％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；和(b)第二多肽，包含与SEQ ID NO：2具有至少b％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：2的至少y个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序列。
在本发明使用来自变体中的两种fHbp的情况下，组合物可以包括以下的两种：(a)第一多肽，包含与SEQ ID NO：1具有至少a％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：1的至少x个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列；(b)第二多肽，包含与SEQ ID NO：3具有至少c％的序列相同性的氨基酸序列和/或包含由来自SEQ ID NO：3的至少z个连续氨基酸的片段组成的氨基酸序列。第一和第二多肽具有不同的氨基酸序列。
另一种可按照本发明使用的fHbp是在例如参考文献62中公开的经修饰形式中的一种，例如，包含其中的SEQ ID NO：20或23。这些经修饰的形式可以引发抗体应答，其对脑膜炎球菌具有广泛的杀菌作用。参考文献62中的SEQ ID NO：77是另一个可以使用的fHbp序列。
fHbp的可用修饰，包括上述序列，是一种突变，其降低或去除蛋白对因子H的亲和力。例如，参考文献63和64公开了根据它们的编号位于残基Glu-283和/或Glu-304的这类突变(从这种编号方式中减去72来匹配本文的SEQ ID NO：1)。相似地，参考文献65和66公开了变体1根据残基编号在位置Arg-41处(减去7来匹配SEQ ID NO：1)的突变(例如，变为Ser)和变体2根据残基编号在位置80、211、218、220、222和/或236处(减去7来匹配SEQ ID NO：2)的突变(例如，变为Ser)。比对会快速揭示任意感兴趣的fHbp序列的相应残基。特别优选在变体1序列中的Arg-41-Ser突变。
在OMV中的fHbp蛋白会通常在例如N端半胱氨酸处发生脂化。在其他实施方式中，它们未发生脂化。
NspA(奈瑟菌表面蛋白A)
NspA抗原作为基因NMB0663(GenBank登录号GI：7225888；本文中的SEQ ID NO：11)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。先前已从文献67和68知晓该抗原。之后已公布了来自许多菌株的NspA抗原序列。还报道了许多NspA的免疫原性片段。
本发明优选使用的NspA抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：11有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：11的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：11的表位。
本发明最有用的NspA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：11组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NspA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
NhhA(奈瑟菌hia同源物)
NhhA抗原作为基因NMB0992(GenBank登录号GI：7226232；本文的SEQ ID NO：12)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。自从例如文献49和69已公开了来自许多菌株的NhhA抗原序列，也已报道了多种NhhA的免疫原性片段。它也被称为Hsf。
本发明优选使用的NhhA抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：12有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：12的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：12的表位。
本发明最有用的NhhA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：12组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选NhhA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
App(粘附和渗透蛋白)
App抗原作为基因NMB1985(GenBank登录号GI：7227246；本文的SEQ ID NO：13)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已公布了来自许多菌株的App抗原序列。它也被称为“ORF1”和“Hap”。还报道了许多App的免疫原性片段。
本发明优选使用的App抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：13有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：13的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：13的表位。
本发明最有用的App抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：13组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选App抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
Omp85(85kDa外膜蛋白)
Omp85抗原作为基因NMB0182(GenBank登录号GI：7225401；本文的SEQ ID NO：14)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已公布了来自许多菌株的Omp85抗原序列。Omp85的其它信息可见文献70和71。还报道了许多Omp85的免疫原性片段。
本发明优选使用的Omp85抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：14有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：14的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：14的表位。
本发明最有用的Omp85抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：14组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选Omp85抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
TbpA
TbpA抗原作为基因NMB0461(GenBank登录号GI：7225687；本文中的SEQ ID NO：23)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌株的TbpA序列。还报道了多种TbpA的免疫原性片段。
本发明优选使用的TbpA抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：23有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：23的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：23的表位。
本发明最有用的TbpA抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：23组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选TbpA抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
TbpB
TbpB抗原作为基因NMB1398(GenBank登录号GI：7225686；本文的SEQ ID NO：24)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌株的TbpB序列。还报道了多种TbpB的免疫原性片段。
本发明优选使用的TbpB抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ IDNO：24有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：24的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：24的表位。
本发明最有用的TbpB抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：24组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选TbpB抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
Cu，Zn-超氧化物歧化酶
Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原作为基因NMB1398(GenBank登录号GI：7226637；本文的SEQ ID NO：25)包括在脑膜炎球菌血清组B菌株MC58[78]的公开基因组序列中。之后已出版了来自许多菌株的Cu，Zn-超氧化物歧化酶序列。还报道了多种Cu，Zn-超氧化物歧化酶的免疫原性片段。
本发明优选使用的Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原包括以下的氨基酸序列：(a)与SEQ ID NO：25有50％或更高相同性(例如，60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或更高)；和/或(b)包括SEQ ID NO：25的至少“n”个连续氨基酸的片段，其中“n”是7或更多(例如，8、10、12、14、16、18、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250或更多)。(b)的优选片段包含来自SEQ ID NO：25的表位。
本发明最有用的Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原可引发抗体，其在给予对象后能与由氨基酸序列SEQ ID NO：25组成的脑膜炎球菌多肽结合。用于本发明的优选Cu，Zn-超氧化物歧化酶抗原可在给予对象后引起杀菌性抗脑膜炎球菌抗体。
药物组合物
本发明的囊泡可用作给予患者的免疫原性药物组合物中的活性成分。这些通常会包括药学上可接受的运载体，并且这类运载体的充分讨论见于参考文献72。
可用常规方法确定有效剂量体积，但组合物的人用剂量一般为约0.5ml体积，例如用于肌内注射时。以0.5ml的体积通过向大腿或上臂肌肉内注射给予基于RIVM OMV的疫苗[73]。以0.5ml通过向大腿前侧面或上臂的三角肌内肌肉内注射给予MeNZBTM。对于其他递送途径可以使用相似的剂量，例如雾化的基于OMV的鼻内疫苗可以具有每次喷雾约100μl或约130μl的体积，4次喷雾给予约0.5ml的总剂量。
本发明的组合物的pH通常为6-8，并且更优选6.5-7.5(例如，约7)。基于RIVM OMV的疫苗的pH为7.4[74]，并且对于本发明的组合物优选pH＜7.5。通过使用10mM Tris/HCl缓冲液来维持基于RIVM OMV的疫苗的pH，并且可以通过使用缓冲液(例如，Tris缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液)来维持本发明的组合物中的稳定pH。因此，本发明组合物通常会包括缓冲液。
该组合物可以是无菌和/或无热原的。本发明的组合物可以与人体等张。
用于给予患者的本发明组合物有免疫原性，更优选是疫苗组合物。本发明的疫苗可以是预防性(即预防感染)或治疗性(即治疗感染)疫苗，但通常是预防性疫苗。用作疫苗的免疫原性组合物包含免疫有效量的抗原，以及需要的任何其它组分。‘免疫学有效量’是指以单一剂量或一系列剂量的部分给予个体的对治疗或预防有效的量。该量根据所治疗个体的健康和身体状况、年龄、所治疗个体的分类组(例如，非人的灵长动物、灵长动物等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗配方、治疗医生对医学情况的评估和其它相关因素而变化。预计所述量将落入可通过常规试验可确定的相对较宽范围内。本发明组合物的抗原含量通常以每剂量中蛋白的量表示。对于基于OMV的鼻内疫苗，通常是约0.9mg蛋白/ml的剂量。
本发明的组合物可以包括免疫佐剂。因此，例如，它们可以包括铝盐佐剂或水包油乳液(例如，水包鲨烯乳液)。合适的铝盐包括氢氧化物(例如，羟基氧化物)、磷酸盐(羟基磷酸盐、正磷酸盐)，(例如，参见参考文献75的第8和9章)，或其混合物。这些盐可以是任意合适的形式(例如，凝胶、结晶、无定形物等)，优选抗原吸附于盐。给予患者的组合物中Al+++的浓度优选小于5mg/ml，例如≤4mg/ml、≤3mg/ml、≤2mg/ml、≤1mg/ml等。优选范围是0.3-1mg/ml。优选最大值0.85mg/剂量。氢氧化铝佐剂特别适用于脑膜炎球菌疫苗。
脑膜炎球菌会影响身体的各个部分，因此本发明中的组合物可以制备成各种液体形式。例如，可将所述组合物制备为溶液或悬浮液形式的注射剂。可制备所述组合物供肺部给药，例如，通过吸入器，采用细雾进行所述给药。可制备所述组合物供鼻部、耳部或眼部给药，例如，作为喷雾或滴剂进行所述给药。通常是供肌肉内给药的注射剂。
本发明组合物可包含抗微生物剂，特别是以多剂量形式包装时。在疫苗中常见诸如硫柳汞和2-苯氧乙醇的抗微生物剂，但是优选使用不含汞的防腐剂或完全不用防腐剂。
本发明组合物可包含去污剂，如吐温(聚山梨酯)，如吐温80。去污剂的含量水平通常较低，如＜0.01％。
本发明的组合物可以包括来自OMV制剂的残留去污剂(例如，脱氧胆酸盐)。对于每μg的MenB蛋白，残留的去污剂的量优选为低于0.4μg(更优选低于0.2μg)。
如果本发明的组合物包括LOS，对于每μg的蛋白，LOS的量优选低于0.12μg(更优选低于0.05μg)。
本发明组合物可含有钠盐(如氯化钠)以产生张力。NaCl浓度通常为10±2mg/ml，例如，约9mg/ml。
除了本发明的囊泡以外，免疫原性组合物可以包括可溶的蛋白抗原。例如，可用的组合物可以包括本发明的组合物联同以下的一种或多种：(i)NHBA抗原、(ii)NadA抗原和(iii)fHbp抗原。例如，囊泡可以与“4CMenB”疫苗混合(参见上述)。在一个可用的实施方式中，组合物同时包括可溶形式和过表达囊泡形式的fHbp，两种形式是不同的fHbp变体，例如，可溶形式的变体1(4CMenB)和囊泡表面上存在的变体2和/或3，其由从本发明的启动子表达变体2或3序列的细菌制备。
因此，本发明的一个组合物包括：(i)本发明的囊泡，诸如显示fHbp序列的自发释放的囊泡；(ii)可溶的NHBA抗原，诸如SEQ ID NO：4；(iii)可溶的fHbp抗原，诸如SEQ ID NO：5；和(iv)可溶的NadA抗原，诸如SEQ ID NO：6。
治疗方法
本发明还提供了一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，包含将本发明的组合物给予所述哺乳动物。免疫反应优选为保护性，优选涉及抗体。在已接受针对脑膜炎奈瑟球菌的初免的患者中，该方法可产生加强应答。
所述哺乳动物优选人。当疫苗用于预防性用途时，人优选为儿童(例如，幼童或婴儿)或青少年；当疫苗用于治疗用途时，人优选为成人。为儿童准备的疫苗也可给予成年人，例如，以评估安全性、剂量、免疫原性等。
本发明也提供用作药物的本发明的囊泡。药物优选用于引起哺乳动物的免疫反应(即，它是一种免疫原性组合物)，并且更优选是疫苗。
本发明也提供本发明的囊泡在制备引起哺乳动物免疫应答的药物中的应用。
这些应用和方法优选用于预防和/或治疗由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病，例如，细菌性(或者，更具体地，脑膜炎球菌)脑膜炎，或败血症。
检测治疗性治疗的功效的一种方式包括在给予本发明组合物后监测奈瑟球菌感染。监测预防性治疗的功效的一种方式包括监测给予该组合物后针对抗原产生的免疫应答。本发明组合物的免疫原性可以通过给予受试对象(例如，12-16个月大的儿童或动物模型[76])，然后测定标准参数，包括血清杀菌性抗体(SBA)和ELISA效价(GMT)来进行测定。通常在给予该组合物后约4周测定这些免疫应答，并与给予该组合物之前测定的值作比较。优选至少4倍或8倍的SBA增长。给予一个以上剂量的组合物时，可以进行超过一次的给药后测定。
通常，在给予对象之后，本发明的组合物能够诱导血清杀菌活性抗体应答。这些应答可以在小鼠中方便地测得，并且是疫苗效力的标准指标。血清杀菌活性(SBA)测量由补体介导的细菌杀伤，并且可以使用人或幼兔补体进行试验。WHO标准要求疫苗在超过90％的接受者中诱导至少4-倍的SBA上升。在给予第三次剂量4-6周之后，MeNZBTM引起4-倍的SBA上升。
优选的组合物可以在人对象患者中对于可接受百分比的对象产生优于血清保护标准的抗体效价。众所周知抗原的关联抗体效价，高于该效价就认为宿主针对所述抗原发生血清转化，该类效价由诸如WHO的组织公布。优选多于80％的具有统计学显著性的对象样品发生血清转化，更优选多于90％，更优选多于93％，最优选96-100％。
本发明的组合物通常直接给予患者。可以通过胃肠道外注射(例如，皮下、腹膜内、静脉内、肌肉内或递送至组织间隙)，或通过任意其他合适的途径实现直接递送。本发明可用来引发全身和/或粘膜免疫。优选肌肉内给予到大腿或上臂。注射可以通过针头(例如皮下针头)进行，但也可以采用无针注射。肌内剂量通常是0.5ml。
剂量治疗可采用单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强的免疫方案。初次给药方案之后，可以进行加强给药方案。可以常规确定初次剂量之间(例如4-16周)以及初次和加强剂量之间的适当时机。使用3-或4-剂量初免方案测试基于OMV的RIVM疫苗，在0、2和8个月或0、1、2和8个月时接种疫苗。以三次间隔6周的剂量给予MeNZBTM。
可以使用本发明的组合物来诱导针对超过一种的脑膜炎球菌超毒力谱系的杀菌性抗体应答。具体地，它们可以优选诱导针对以下三种超毒力谱系中的两种或三种的杀菌应答：(i)A4簇；(ii)ET5复合系；和(iii)谱系3。它们可以另外诱导针对超毒力谱系血清组I、血清组III、血清组IV-1或ET-37复合系中的一种或多种和其他谱系如高侵袭性谱系的杀菌性抗体应答。这并不一定表示所述组合物可以诱导针对这些超毒力谱系中各个和每个脑膜炎球菌菌株的杀菌性抗体，例如，相反，对具体超毒力谱系内脑膜炎球菌菌株中的4种或更多种菌株的任何给定组来说，所述组合物诱导的抗体对所述组的至少50％(例如，60％、70％、80％、90％或更多)具有杀菌作用。优选的菌株组包括以下国家中的至少4个中分离到的菌株：GB、AU、CA、NO、IT、US、NZ、NL、BR和CU。所述血清优选具有至少为1024(例如，210、211、212、213、214、215、216、217、218或更高，优选至少为214)的杀菌效价，例如所述血清可以在以1∶1024稀释时杀死特定菌株中至少50％的测试细菌。
可用的组合物可以诱导针对血清组B脑膜炎球菌的以下菌株的杀菌性应答：(i)来自A4簇，菌株961-5945(B：2b：P1.21，16)和/或菌株G2136(B：-)；(ii)来自ET-5复合系，菌株MC58(B：15：P1.7，16b)和/或菌株44/76(B：15：P1.7，16)；(iii)来自谱系3，菌株394/98(B：4：P1.4)和/或菌株BZ198(B：NT：-)。更优选的组合物可以诱导针对菌株961-5945、44/76和394/98的杀菌性应答。
菌株961-5945和G2136都是奈瑟球菌MLST参比菌株(参考文献77中的编号638和1002)。菌株MC58是广泛可得的(例如，ATCC BAA-335)并且是在参考文献78中测序的菌株。菌株44/76已被广泛使用并表征(例如，参考文献79)并且是奈瑟球菌MLST参比菌株中的一种(参考文献77中的编号237；参考文献46中表2第32行)。菌株394/98原始于1998年在新西兰分离，并且存在几个使用该菌株的公开研究(例如，参考文献80和81)。菌株BZ198是另一种MLST参比菌株(参考文献77中编号409；参考文献46中表2第41行)。
其它抗原组分
除了本发明的囊泡以外，免疫原性组合物可以包括其他非囊泡抗原。
在一些实施方式中，组合物包括一种或多种来自脑膜炎球菌的荚膜糖，例如来自血清组A、C、W135和/或Y。这些糖通常与蛋白运载体偶联。本发明的组合物可以包括来自脑膜炎球菌血清组A、C、W135和Y的1、2、3或4种的荚膜糖的一种或多种偶联物，例如，A+C、A+W135、A+Y、C+W135、C+Y、W135+Y、A+C+W135、A+C+Y、A+W135+Y、A+C+W135+Y等。包含来自所有四种血清组A、C、W135和Y中的糖的组分是理想的。
除了含有来自脑膜炎奈瑟球菌的抗原以外，组合物可以包括来自其他病原体的抗原。例如，所述组合物可以包含一种或多种下列其它抗原：
-来自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的抗原，诸如糖(通常是偶联的)。
-来自乙型肝炎病毒的抗原，诸如表面抗原HBsAg。
-来自百日咳博德特菌(Bordetella pertussis)的抗原，诸如百日咳博德特菌的百日咳全毒素(PT)和丝状血凝素(FHA)，也可任选与百日咳杆菌黏附素(百日咳杆菌粘附素)和/或凝集原2和3的组合。
-白喉抗原，诸如白喉类毒素。
-破伤风抗原，诸如破伤风类毒素。
-来自B型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae B)(Hib)的糖抗原，通常是偶联的。
-灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。
所述组合物中包含白喉抗原时，也优选包含破伤风抗原和百日咳抗原。相似地，包含破伤风抗原时，也优选包含白喉和百日咳抗原。相似地，包含百日咳抗原时，也优选包含白喉和破伤风抗原。因此，优选DTP组合。
如果包括Hib糖(通常是偶联物)，糖部分可以是多糖(例如，从细菌中纯化的全长磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但也可能将纯化的糖片段化来制备寡糖(例如，约1-约5kDa的MW)，例如通过水解。组合物中Hib偶联物的浓度通常范围为0.5μg-50μg，例如1-20μg、10-15μg、12-16μg等。在一些实施方式中，这个量为约15g，或约12.5μg。小于5μg的质量也是合适的[82]，例如1-5μg，2-4μg，或约2.5μg。如上述，在包括Hib糖和脑膜炎球菌糖的组合中，可以基于后者的剂量(具体地，有多种脑膜炎球菌血清组时，它们的平均质量)选择前者的剂量。Hib偶联物的其他特征如以上就脑膜炎球菌偶联物所述，包括运载体蛋白的选择(例如，CRM197或破伤风类毒素)、连接、比率等。
如果包括肺炎链球菌(S.pneumoniae)抗原，这可以是多肽或糖。偶联物荚膜糖特别用于针对肺炎球菌(pneumococcus)的免疫。所述糖可以是多糖，其大小是在从细菌纯化该糖期间形成，或者可以是这种多糖片段化产生的寡糖。例如，在7价PREVNAR产品中，6种糖是完整多糖，而1种(18C血清型)是寡糖。一种组合物可包含来自以下一种或多种肺炎球菌血清型的荚膜糖：1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和/或33F。组合物可包含多种血清型，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多种血清型。本领域已知7价、9价、10价、11价和13价偶联物组合，也了解23价非偶联组合。例如，10价组合可包含来自血清型1、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F的糖。11价组合还可包含来源于血清型3的多糖。12价组合可向10价混合物加入：血清型6A和19A；6A和22F；19A和22F；6A和15B；19A和15B；r22F和15B；13价组合可向11价混合物加入：血清型19A和22F；8和12F；8和15B；8和19A；8和22F；12F和15B；12F和19A；12F和22F；15B和19A；15B和22F；等等。肺炎球菌偶联物的其他特征如以上脑膜炎球菌偶联物就所述，包括运载体蛋白的选择(例如，CRM197或破伤风类毒素)、连接、比率等。当组合物包含超过一种偶联物时，每种偶联物可使用相同的载体蛋白或不同的载体蛋白。参考文献83描述了在多价肺炎球菌偶联物疫苗中使用不同载体蛋白的潜在优点。
概述
除非另有说明，本发明的实施将采用化学、生物化学、分子生物学、免疫学和药理学的常规方法，这些方法在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见，例如，参考文献84-90等。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由……组成”，例如，“包含”X的组合物可以仅由X组成或可包括其它物质，例如X+Y。
与数值x相关的术语“约”是可任选的，并且表示，例如x±10％。
当本发明涉及“表位”时，该表位可以是B-细胞表位和/或T-细胞表位，但通常是B-细胞表位。这类表位可凭经验确定(例如，使用PEPSCAN[91，92]或相似方法)，或它们可被预测(如利用Jameson-Wolf抗原性指数[93]、基于矩阵的方法[94]、MAPITOPE[95]、TEPITOPE[96，97]、神经网络[98]、OptiMer和EpiMer[99，100]、ADEPT[101]、T位点(Tsites)[102]、亲水性[103]、抗原性指数[104]或参考文献105-106、107、108、109公开的方法等)。表位是由抗体或T细胞受体的抗原结合位点识别并与之结合的抗原某部分，它们也称作“抗原决定簇”。
两个氨基酸序列间的序列相同性百分数表示进行比对时所比较的两条序列中相同氨基酸的百分数。这种比对和同源性百分数或序列相同性百分数可利用本领域所知软件程序来确定，例如用参考文献110的7.7.18部分所描述的那些。优选的比对通过史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法使用仿射缺口搜索确定，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。参考文献111中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。
术语“基本上”不排除“完全”，如“基本上不含”Y的组合物可能完全不含Y。如有需要，“基本上”一词可从本发明的定义中省略。
附图说明
图1说明在相同背景中使用5种不同的启动子在相同背景菌株(NZ98/254)和过表达相同fHbp等位基因的基准菌株[112，113]中的fHbp表达水平。如图所示，fHbp的变体2等位基因在基准菌株中或来自在间隔区(spacer tract)中具有11个G或13个G的porA启动子的2个野生型相变体或由修饰的ST1、ST2和ST3 porA启动子过表达。如图所示，从0.5倍到2倍上样对各菌株进行等当量总蛋白的Western印迹，并且箭头表示fHbp。
图2表示来自porA和16S修饰的启动子的fHbp表达的比较分析。在所示的启动子控制下表达fHBP变体2的NZ98/254菌株生长在板上(A)和在液体中生长到对数期(B)和稳定期(C)，并且通过western印迹测量来自重复培养基(#1，#2)或来自基准过表达菌株的fHBP表达水平。实线箭头指示fHbp，而较低的虚线箭头指示上样对照。
图3显示来自以下3种菌株的fHbp的表达：(a)ΔlpxL1敲除；(b)ΔsynX敲除；和(c)ΔlpxL1ΔsynX双敲除。在所有情况中，由经修饰的PorA启动子控制下的fHbp取代敲除的基因。通过在细胞粗提取物上使用抗-fHbp血清的western印迹来评价fHbp的表达，并且与作为对照的Hfq比较。图3A显示western印迹，并且图3B以人为单位(arbitrary unit)来定量表达。
图4显示在分离自(i)ΔlpxL1ΔsynX和(ii)ΔlpxL1ΔsynXΔmltA敲除菌株的囊泡中的fHbp水平。图4A以mg/OD显示产量，并且图4B是0.5μg囊泡的western印迹。
图5显示fHbp在两个在不同基因座中过表达变体1或变体2fHbp的菌株中的表达(泳道c和d)和在相应的基因座中同时过表达变体1和变体2的菌株中的表达(泳道e)。泳道a是野生型菌株，并且泳道b是该菌株的ΔfHbp敲除。
图6显示了从三敲除纯化的囊泡的银染SDS-PAGE。
具体实施方式
经修饰的PorA启动子
转录起始位点上游在间隔子区域中含有11和13个连续G的野生型脑膜炎球菌porA启动子的2个相变体的序列如下，用下划线表示-35和-10区域：
AAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGAC(SEQ IDNO：31)
AAAAATGGTTTTTTGCGGGGGGGGGGGGGTATAATTGAAGAC(SEQ ID NO：40)
在-35和-10区域之间的间插序列包括G11聚-G序列，其与PorA表达的相转变有关系。为了稳定来自这种启动子的表达，测试了3种修饰(小写字母表示修饰)：
AAAAATGGTTTTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC(“ST1”；SEQ ID NO：32)
AAAAATtGacaTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC(“ST2”；SEQID NO：33)
AAAAtTGacaTTTTGCGaGGGaGGtGGTATAATTGAAGAC(“ST3”；SEQID NO：34)
因此，在“ST1”中，G11序列在3个位置上被间断，留下不超过3个连续的G残基。在“ST2”中，使用相同的间插序列，但是用共有的-35区域TTGACA取代-35区域。在“ST3”中，额外的T残基插入紧接-35区域的下游。
使用这三种启动子来驱动NZ98/258菌株中fHbp序列的表达(fHbp变体2)。当与已经在文献[112，113]中报道的同等过表达菌株比较时，所有的3个修饰的启动子在菌株中导致fHBP的高水平过表达。在ST2中看到最佳的表达(图1和2)。
经修饰的rRNA启动子
在进一步的实验中，16S rRNA启动子与以下porA基因的5′UTR融合：
ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATAATTCGCAAC...(SEQID NO：35)
该启动子经过突变并且3种在-35区域的下游的变体的测序结果如下：
ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATAATTCGCAAC(“wt”；SEQ ID NO：35)
ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATATTCGCAAC...(“#5”；SEQ ID NO：36)
ATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTTAATTCGCAC...(“#6”；SEQ ID NO：37)
ATATCTTGACAGGCGGAAGGAAACTTTATAATTCGCAAC...(“#8”；SEQ ID NO：38)
因此，在变体#5和#6中，-10序列是5聚体，并且变体#6也在-10区域和转录起始位点之间丢失了一个核苷酸。在变体#8中，-10区域及其下游序列与野生型相同，但是在-35和-10区域之间的间插序列比野生型短一个核苷酸。
来自经修饰启动子的fHbp表达
这些启动子与porA基因的5′UTR区域融合并且用于驱动fHbp编码序列的表达。如图2所见，变体#5和#6，变体#5和#6显示出最强的表达，接近ST2所见的水平。
横跨野生型启动子(SEQ ID NO：35)，向下游延伸至转录区域并且向上样延伸的全区域如下(SEQ ID NO：41；358聚体)，用下划线表示-35和-10区域，并且用双下划线表示核苷酸+1(按照参考文献10)：
...CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAGAGGAAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTCCCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAGTGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTT ATAATTCGCAACTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTACAAAAGGAAGCC...(SEQ ID NO：41)
相似地，变体#5和#6的周围序列如下：
#5：...CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAGAGGAAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTCCCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAGTGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTATATTCGCAACTATCGGGTGTTTGCCNNANGTTTTTAGGTTTTTATCAAATTTCAAAAGGAAGCC...(SEQ ID NO：42)
#6：...CGTCTGAGTCCCCGAGTTTCAGACAGCATATTCACAAAGGCGCACCAGCCGGAGGAGGGAGAGGAAAGGATTGTTGGAGGCGGCGCAGTATTTAGCAGAAATAAAAAACCTTATCCGACAGCGACATGACGAATTTCCCCAAAAAAATCCCGCTGAAAGCATTGACCGTTTTTCCCTGTGGGCGTATAGTTCGGTTCTTCGCTGCTGCAGAAGTGGCGGACGAACTGAAAAGTATAGCACAGAATGTTGGGGATATCGAGAGATATCTTGACAGGCGGAAGGAATACTTTTAATTCGCACTATCGGGTGTTTGCCCGATGTTTTTAGGTTTTTATTAAATTTACAAAAGGAAGCCCATANGAATCGAACTGC...(SEQ ID NO：43)
任意的这些较长序列可以用于本发明，虽然当然可以如本文所述作出修饰。
在变体启动子控制下的fHbp基因在内源lpxL1和/或synX基因的位置上稳定地插入脑膜炎球菌(菌株NZ98/254)的染色体中。可以在synX基因座上看到稍高的表达水平，并且具有两种插入的菌株(ΔlpxL1ΔsynX双敲除)的表达是来自个体基因座的表达之和(图3)。
也制备如下菌株，其中2个不同的fHbp变体(1和2)在经修饰的PorA启动子的控制下表达。两个变体的共表达对来自各自不同的基因座的表达没有明显的负面影响，而是产生叠加作用(图5)。
在ΔlpxL1ΔsynX双敲除中内源mltA(GNA33)基因的敲除进一步增加了表达水平，并且对于fHbp蛋白定位于菌株的囊泡中没有负面影响。图4显示了从这些菌株中分离的囊泡中的fHbp水平，显示了(A)相对于培养基的光密度(OD)的蛋白产量(mg)，和(B)针对0.5μg囊泡的抗-fHbp western印迹。SDS-PAGE显示在三敲除菌株中的fHbp条带与PorA和PorB一起是囊泡中最丰富的蛋白之一(图6)。
应理解，仅以举例的方式描述了本发明，可对之进行修改而仍在本发明的范围和精神内。
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Claims (24)

1.一种包含启动子的核酸，所述启动子包括
(i)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域和
(ii)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域，
其中所述-10区域和-35区域由12-20个核苷酸的间插序列隔开，并且其中所述间插序列不含聚-G序列或者包括具有不超过8个连续G核苷酸的聚-G序列。
2.一种包含与下游的蛋白编码基因可操作连接的启动子的核酸，其特征在于，所述启动子包括(i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域和/或(ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。
3.一种包含与蛋白编码基因可操作连接的启动子区域的核酸，所述启动子区域来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子，所述蛋白编码基因具有5′UTR，所述5′UTR含有用于表达所述蛋白的翻译调节元件。
4.一种包含启动子的核酸，所述启动子包括来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域和来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。
5.一种包含启动子的核酸，所述启动子包括SEQ ID NO：18，或SEQ IDNO：18的变体，所述变体与SEQ ID NO：18之间存在最多4个单核甘酸插入、删除或取代的差异。
6.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于
所述-10区域是TATAAT；
所述来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域是TGGTTT；和/或
所述来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域是TTGACA。
7.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述在-35区域和-10区域之间的间插序列具有12-20个核苷酸，例如，SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：29。
8.如权利要求7所述的核酸，其特征在于，所述间插序列不包括序列GGGGG。
9.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述-10序列的非转录下游但是所述转录起始位点的上游具有5-10个核苷酸，例如，TGAAGAC或TCGCAAC。
10.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID NO：30。
11.如前述权利要求中任一项所述的核酸，其特征在于，所述核酸包含SEQ ID NO：18或其变体，例如，SEQ ID NO：36的核苷酸6-39、SEQ ID NO：37的核苷酸6-38或SEQ ID NO：38的核苷酸6-39。
12.一种包含DNA序列的细菌表达载体，所述DNA序列包括前述权利要求中任一项中所述的启动子。
13.一种包含DNA序列的脑膜炎球菌，所述DNA序列包括前述权利要求中任一项中所述的启动子。
14.如权利要求13所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述启动子驱动外膜蛋白的表达。
15.如权利要求14所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述外膜蛋白是fHbp。
16.如权利要求13-15中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述细菌不表达活性MltA。
17.如权利要求13-16中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述细菌具有SynX和/或LpxL1的敲除。
18.如权利要求13-17中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌是血清组B。
19.如权利要求13-17中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌是血清组W135。
20.如权利要求13-19中任一项所述的脑膜炎球菌，其特征在于，所述脑膜炎球菌是免疫型L3。
21.从权利要求13-20中任一项所述的脑膜炎球菌制备的外膜囊泡。
22.一种免疫原性药物组合物，所述组合物包含权利要求21所述的囊泡。
23.如权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述组合物包括一种或多种来自脑膜炎球菌的偶联的荚膜糖。
24.一种在哺乳动物中引起免疫应答的方法，所述方法包含向所述哺乳动物给予权利要求22或23所述的组合物。
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