JP5957541B2 - 髄膜炎菌における増加したタンパク質発現のためのプロモータ - Google Patents

Description

本出願は、２０１２年２月２日に出願された米国特許仮出願第６１／５９４，１５９号の利益を請求し、その全内容は、あらゆる目的に対して参照によって本開示に援用される。

この発明は、髄膜炎菌性細菌において転写を制御するためのプロモータの分野にある。

Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓは、細菌性髄膜炎の原因である。髄膜炎菌ワクチン接種への一つのアプローチは、Ｎｏｖａｒｔｉｓ ＭＥＮＺＢ（商標）製品およびＮｏｒｗｅｇｉａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ＭＥＮＢＶＡＣ（商標）製品において用いられているような、外膜小胞（ＯＭＶ）に頼っており、それらの製品のどちらも、髄膜炎菌の界面活性剤処理によって作製されている。

髄膜炎菌外膜のタンパク質組成を変化させること、およびそれゆえＯＭＶの組成を変化させることは公知である。望ましくない遺伝子のノックアウトおよび望ましい遺伝子の過剰発現のどちらも記載されている。参考文献１〜３は、ｆＨｂｐ（ＧＮＡ１８７０としても知られている）が過剰発現している（およびこの過剰発現は、ＬｐｘＬ１のノックアウトと組み合わせることができる［４］）ＯＭＶワクチンの前臨床研究を報告している。参考文献５は、ＰｏｒＡおよびＦｒｐＢがノックアウトされ、かつＨｓｆおよびＴｂｐＡが過剰発現しているＯＭＶワクチンの５つの製剤の臨床研究を報告した。参考文献６は、ｓｙｎＸ遺伝子およびｌｐｘＬ１遺伝子が不活性化され、ｆＨｂｐが過剰発現され、２つの異なるＰｏｒＡタンパク質を有し、ならびにＯｐｃＡ発現が安定化された細菌から調製される天然の外膜小胞ワクチンの第Ｉ相臨床研究を報告している。参考文献７は、ｓｙｎＸ遺伝子およびｌｐｘＬ１遺伝子が不活性化され（および、２つの場合において、ｌｇｔＡが不活性化されている）、２つの異なるＰｏｒＡタンパク質を有し、ならびにＮａｄＡまたはｆＨｂｐが過剰発現された細菌から調製される三価の天然の外膜小胞ワクチンを報告している。小胞が、ＬＰＳを除去しない方法によって作製される場合には、ｌｐｘＬ１などの遺伝子の不活性化は重要である。

タンパク質組成におけるこれらの変化は、様々な方法でもたらすことができる。例えば、細菌は、鉄代謝に関係したある特定のタンパク質の発現を刺激するために、鉄制限条件下で成長することができる。他の技術は、細菌を操作することを含み得る。例えば、参考文献８は、強いプロモータ（ｐｏｒＡプロモータ、ｐｏｒＢプロモータ、ｌｇｔＦプロモータ、またはｈｐｕＡＢプロモータなど）が、保護性外膜タンパク質の発現を上方制御するために用いられ得ること、または抑制性転写制御機構が除去され得ることを示唆している。参考文献９は、遺伝子を操作して、それらの相変異性を除去することができることを示唆している。ｐｏｒＡプロモータは、参考文献７において、ＮａｄＡを過剰発現するために用いられ、他方、ｆＨｂｐは、ｔａｃプロモータを用いて過剰発現された。

髄膜炎菌においてタンパク質発現を改変する改善されたさらなる方法を提供すること、特に、目的の遺伝子の発現を駆動させるためのプロモータを提供することが本発明の目的である。上方制御は、ＯＭＶにおいて有用なタンパク質のレベルを増加させるために用いることができる。

国際公開第２００９／０３８８８９号 国際公開第０１／０９３５０号 国際公開第２００４／０１５０９９号

Ｋｏｅｂｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００７） Ｖａｃｃｉｎｅ ２５：１９１２−２０． Ｋｏｅｂｅｒｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９８：２６２−７０． Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ １９２：５８０−９０． Ｂｏｎｖｅｈi ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７：１４６０−６． Ｋｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：１４１３−２０． Ｐｉｎｔｏ ｅｔ ａｌ． （２０１１） Ｖａｃｃｉｎｅ ２９：７７５２−８．

本発明の第１態様は、転写を駆動させるための改変型ｐｏｒＡプロモータを用いる。参考文献８の例１０〜１６に用いられているような天然ｐｏｒＡプロモータは、その３５領域と−１０領域の間にポリＧ配列を含有するが、この配列は、相変異を引き起こすことができ、それゆえに、天然ｐｏｒＡプロモータからの発現は不安定であり得る。本発明の改変型ｐｏｒＡプロモータは、それらが、野生型ポリＧ配列を欠損するため、改善されている。

したがって、本発明は、以下を含むプロモータを含む核酸を提供する：
（ｉ）髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域および／または
（ｉｉ）髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域、
ここで、−１０領域と−３５領域は、１２〜２０個のヌクレオチドの介在（またはスペーサー）配列によって分離されており、かつ介在配列は、ポリグアニジン配列を含有しないか、または８個以下の連続したグアニジンヌクレオチドを有するポリグアニジン配列を含むかのいずれかである。

本発明の第２の態様は、タンパク質コード遺伝子の転写を駆動させるための髄膜炎菌ｒＲＮＡコード遺伝子（１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子など）由来のプロモータを用いる。したがって、本発明はまた、下流タンパク質コード遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸であって、プロモータが（ｉ）髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域および／または（ｉｉ）髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域を含む、核酸を提供する。

本発明はまた、タンパク質の発現のための翻訳制御エレメントを含有する５’ＵＴＲを有するタンパク質コード遺伝子に作動可能に連結されたｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来のプロモータ領域を含む核酸を提供する。プロモータ領域は、（ｉ）髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域、（ｉｉ）髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域、および（ｉｉｉ）ｐｏｒＡ遺伝子などの遺伝子由来の５’ＵＴＲを含むことができる。

本発明はまた、配列番号１８、または４つまで（すなわち、１つ、２つ、３つ、または４つ）の一ヌクレオチド挿入、欠失、または置換だけ配列番号１８と異なる配列番号１８の変異体を含むプロモータを含む核酸を提供する。

ｐｏｒＡプロモータおよびｒＲＮＡプロモータは、例えば、ｐｏｒＡプロモータ由来の−１０領域、および（コンセンサス−３５領域であり得る）ｒＲＮＡプロモータ由来の−３５領域を有するハイブリッドの形として用いることができる。したがって、本発明はまた、以下のいずれかを含むプロモータを含む核酸を提供する：
（ｉ）髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子由来の−１０領域および髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子由来の−３５領域、または
（ｉｉ）髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子由来の−１０領域および髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子由来の−３５領域。

本発明の核酸は、細菌中、特に髄膜炎菌中に存在し得る。プロモータは、それらが作動可能に連結されている下流のタンパク質コード遺伝子（特に、外膜タンパク質をコードする遺伝子）の発現を駆動させることができ、この細菌は、ワクチン（特に、小胞に基づいたワクチン）を調製するために用いることができる。本発明はまた、これらの細菌、これらの小胞、およびこれらのワクチンを提供する。

本発明のプロモータ
細菌プロモータにおける２つの必須の配列は、−１０領域（プリブノーボックスとしても知られている）および−３５領域である。これらは、介在配列によって分離されており、−１０領域と転写開始部位（＋１）との間には短い非転写上流配列がある。

ＰｏｒＡプロモータは、詳細に研究されている。参考文献１０は、６−ｍｅｒの−３５領域、続いて１６−ｍｅｒまたは１７−ｍｅｒの介在配列、その後、７−ｍｅｒのプリブノーボックス、その後、７−ｍｅｒの非転写上流配列、続いて、転写ヌクレオチド＋１を報告している。野生型ｐｏｒＡ遺伝子における開始コドンは、転写産物のヌクレオチド＋５９にあり、この５９−ｍｅｒのスペーシングは、参考文献８において確認された。

本発明のプロモータが、髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域を含む場合、これは、典型的には、６−ｍｅｒのＴＡＴＡＡＴ、すなわち、典型的な−１０領域の６−ｍｅｒである。

本発明のプロモータは、髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域を含む場合、これは、典型的には、６−ｍｅｒのＴＧＧＴＴＴまたはＡＴＧＧＴＴである。

−３５領域と−１０領域との間の介在配列は、１２〜２０個の間のヌクレオチド、例えば、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、または２０個のヌクレオチドであり得る。１６個、１７個、または１８個のヌクレオチドの介在配列が典型的である。

短い非転写上流配列は、典型的には、５〜１０個の間のヌクレオチド、例えば、６個、７個、または８個のヌクレオチドである。それは、Ｇ：Ｃリッチであり得、例えば、配列におけるヌクレオチドの少なくとも１／２がＧまたはＣ、例えば、６−ｍｅｒの非転写上流配列において、少なくとも３個がＧ／Ｃ残基であり得る。

したがって、プロモータは、６−ｍｅｒの−３５領域、１６−ｍｅｒまたは１７−ｍｅｒの介在配列、６−ｍｅｒの−１０領域、および６−ｍｅｒまたは７−ｍｅｒの非転写上流配列を含むことができ、合計で３４個、３５個、または３６個のヌクレオチドのコアプロモータを示す。

当然のことながら、プロモータは、−３５領域の上流に続くことができる。−３５領域の上流の配列は、そのプロモータからの高レベルの発現、またはそのプロモータからの発現の制御にとって重要であり得る。例えば、ｒＲＮＡプロモータにおいて、ＵＰエレメントと呼ばれるコアプロモータの上流の配列が、３００倍もの転写を増加させるそれらの並外れた強度の主な原因となり得る［１１、１２］。これらは、ＲＮＡポリメラーゼコアのα−サブユニットによって認識され得る。したがって、本発明のプロモータは、通常Ａ：Ｔリッチである上流ＵＰエレメントを含み得る。同様に、本発明のプロモータは、上流ＣＲＥＮ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの接触制御エレメント）を含み得る［１３］。

本発明のプロモータが、ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域および／または−１０領域を含む場合、短い非転写上流配列は、ＴＧＡＡＧＡＣであり得る。

本発明のプロモータが、ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域および／または−１０領域を含む場合、介在配列は、例に示されているように、様々であり得る。例えば、それは、ＴＴＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（野生型１６−ｍｅｒ；配列番号２６）またはＴＴＴＧＣＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（野生型１８−ｍｅｒ；配列番号１７）であり得るが、これらの野生型配列は好ましくない。むしろ、この１６−ｍｅｒまたは１８−ｍｅｒにおける１１−ｍｅｒまたは１３−ｍｅｒのポリＧ配列が、非Ｇヌクレオチド（複数可）によって中断され得る。２つの好ましい介在配列は、ＴＴＴＧＣＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧ（１６−ｍｅｒ；配列番号２７）およびＴＴＴＴＧＣＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧ（１７−ｍｅｒ；配列番号２８）である。

いくつかの実施形態において、介在配列は、ポリグアニジン配列を含有せず、すなわち、介在配列内にＧＧジヌクレオチドが存在しない。他の実施形態において、介在配列は、ポリグアニジン配列を含有することができるが、それは、８個以下の連続したグアニジンヌクレオチドを含有し、すなわち、それは、配列ＧＧＧＧＧＧＧＧを含まない。理想的には、介在配列は、配列ＧＧＧＧＧＧＧを含まない。理想的には、介在配列は、配列ＧＧＧＧＧＧを含まない。理想的には、介在配列は、配列ＧＧＧＧＧを含まない。理想的には、介在配列は、配列ＧＧＧＧを含まない。介在配列は、ＧＧＧトリヌクレオチドまたはＧＧジヌクレオチドを含むことができる。したがって、介在配列内のポリＧ配列は、合計で８個以下のヌクレオチドまで伸長するが、理想的には、３個以下の連続したグアニジン残基を有する。

本発明のプロモータが髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域を含む場合、これは、典型的には、６−ｍｅｒのＴＡＴＡＡＴ、すなわち、典型的な−１０領域の６−ｍｅｒである。

本発明のプロモータが髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域を含む場合、これは、典型的には、（コンセンサス−３５領域である）６−ｍｅｒのＴＴＧＡＣＡである。

本発明のプロモータが髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域および／または−１０領域を含む場合、介在配列は、ＧＧＣＧＧＡＡＧＧＡＡＴＡＣＴＴ（配列番号２９）であり得る。

本発明のプロモータがｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域および／または−１０領域を含む場合、短い非転写上流配列は、ＴＣＧＣＡＡＣであり得る。

ｐｏｒＡプロモータおよびｒＲＮＡプロモータは、ハイブリッドの形で用いることができ、有用なプロモータは、ｒＲＮＡ遺伝子由来の−３５領域（例えば、ＴＴＧＡＣＡ）、ｐｏｒＡ遺伝子から改変された介在配列（例えば、ＴＴＴＧＣＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧ；配列番号２７）、典型的なプリブノーボックス（ＴＡＴＡＡＴ）、およびｐｏｒＡ遺伝子由来の短い非転写上流配列（例えば、ＴＧＡＡＧＡＣ）を含む。したがって、プロモータは、配列番号３０（ＴＴＧＡＣＡＴＴＴＧＣＧＡＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＡＴＡＡＴＴＧＡＡＧＡＣ）を含むことができる。

いくつかの実施形態において、プロモータは、配列番号１８（野生型髄膜炎菌１６Ｓ ｒＲＮＡプロモータの転写開始部位の直前の３５−ｍｅｒの断片）を含む。この配列は、本明細書に示されているように、その３５−ｍｅｒ内での１つ、２つ、３つ、または４つの単一ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換によって改変することができる。

細菌内で機能性ＤＮＡの形で存在する場合、これらのプロモータは、目的のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結され、そのタンパク質の転写は、そのプロモータによって制御される。本発明は、目的の任意のタンパク質を発現するために用いることができるが、そのタンパク質は、有利なことに、小胞において保持され得る外膜タンパク質である。外膜タンパク質の適切な例は下に示されているが、本発明は、好ましくは、ＰｏｒＡ外膜タンパク質をコードする転写産物の発現を駆動させるためには用いられない。

本発明のプロモータの下流のコードＤＮＡ配列において、そのＤＮＡは、転写開始部位、続いて、５’非翻訳領域（典型的には、シャイン・ダルガーノ配列を含む）、およびその後、目的のコードされるタンパク質についての開始コドンを含む。

プロモータがｒＲＮＡ遺伝子由来である場合、転写配列の開始は、理想的には、ｒＲＮＡ遺伝子由来よりむしろタンパク質コード遺伝子由来である。したがって、ｒＲＮＡプロモータ（例えば、配列番号１８または変異体）は、髄膜炎菌タンパク質コード遺伝子由来の５’ＵＴＲに融合することができる。いくつかの実施形態において、ｒＲＮＡプロモータは、ｐｏｒＡ遺伝子由来の５’ＵＴＲ（５８−ｍｅｒ）に融合し、この５’ＵＴＲが、その後、目的のコード配列に融合する。５’ＵＴＲは、タンパク質コード遺伝子からタンパク質の翻訳を可能にする翻訳制御エレメントを含むべきである。したがって、この実施形態は、ｒＲＮＡプロモータを用いて、翻訳され得るタンパク質コード転写産物を産生する。５’ＵＴＲの内部で、プロモータの下流の配列は、転写の制御または下流遺伝子の発現に対する転写後の効果にとって重要であり得る。

ｐｏｒＡ遺伝子の５’ＵＴＲはまた、改変型ｐｏｒＡプロモータがｐｏｒＡ遺伝子由来の５’ＵＴＲに連結し、その後、その５’ＵＴＲが、目的のタンパク質のコード配列と融合するように、本発明の改変型ｐｏｒＡプロモータと共に用いることができる。

有用なｐｏｒＡ ５’ＵＴＲは、配列番号３９のヌクレオチド配列、すなわち、ＧＴＡＴＣＧＧＧＴＧＴＴＴＧＣＣＣＧＡＴＧＴＴＴＴＴＡＧＧＴＴＴＴＴＡＴＣＡＡＡＴＴＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣ、または５つまで（すなわち、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）の単一ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換だけ配列番号３９と異なる配列を含むことができる。

本明細書におけるプロモータ配列の議論は、センス鎖に言及することは認識されているだろう。転写が起こる二本鎖ＤＮＡにおいて、プロモータは相補鎖を有する。２つのプロモータエレメントが「ｎ個」のヌクレオチドによって分離しているといわれる場合、これもまた、センス鎖におけるヌクレオチドの数への言及である；二本鎖ＤＮＡにおいて、エレメントは、「ｎ個」の塩基対によって分離される。プロモータエレメントがグアニジン残基を欠くといわれる場合には、これもまた、センス鎖への言及である；二本鎖ＤＮＡにおいて、例えば、グアニジンを含まないプロモータは、グアニジン残基を含めることができるが、センス鎖におけるシトシン残基についてのアンチセンス鎖における相補塩基としてのみ含むだけである。本発明は、センス鎖への言及によって記載されるが、本発明の範囲は、そのようなセンス鎖を含む二本鎖核酸、ならびにそのようなセンス鎖またはこれらのセンス鎖のアンチセンス型を含む一本鎖核酸を含む（当然のことながら、これらのアンチセンス鎖は、標準技術によってセンス鎖を調製するために用いることができる）。

小胞
本発明は、髄膜炎菌の小胞、すなわち、外膜由来の抗原を保持する小胞を形成する髄膜炎菌外膜の破壊またはそれからのブレブ形成によって得られる任意のプロテオリポソーム小胞を調製する場合、特に有用である。したがって、その用語としては、例えば、ＯＭＶ（「ブレブ」と呼ばれることもある）、微小胞（ＭＶ［１４］）、および「天然ＯＭＶ」（「ＮＯＭＶ」［１５］）が挙げられる。

ＭＶおよびＮＯＭＶは、細菌成長中に自発的に形成し、培地へ放出される天然に存在する膜小胞である。ＭＶは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａをブロス培地中で培養され、ブロス培地において全細胞をより小さいＭＶから（例えば、濾過により、または細胞だけをペレット化して、より小さい小胞はペレット化しない低速遠心分離により）分離し、その後、細胞を除去した培地からＭＶを（例えば、濾過により、ＭＶの示差的沈殿または凝集により、あるいはＭＶをペレット化する高速遠心分離により）回収することによって、得ることができる。ＭＶの産生に用いられる菌株は、一般的に、培養中に産生されるＭＶの量に基づいて選択することができ、例えば、参考文献１６および１７は、高いＭＶ産生を有するＮｅｉｓｓｅｒｉａを記載している。

自発的な外膜小胞の産生のための別の有用な技術は、参考文献１８に開示されているように、髄膜炎菌においてｍｌｔＡ遺伝子を不活性化することである。これらの変異細菌は、成長中、培地へ小胞を放出する。

ＯＭＶは、細菌から人工的に調製され、（例えば、デオキシコレートでの）界面活性剤処理を用いて、または界面活性剤を使用しない手段によって調製されてもよい（例えば、参考文献１９参照）。ＯＭＶを形成するための技術には、細菌を胆汁酸塩の界面活性剤（例えば、リトコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、コール酸、ウルソコール酸（ｕｒｓｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）などの塩、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａを処理するためにはデオキシコール酸ナトリウム［２０および２１］が好ましい）で、その界面活性剤を沈殿させないよう十分に高いｐＨにおいて処理することが挙げられる［２２］。超音波処理、ホモジナイゼーション、顕微溶液化、キャビテーション、浸透圧ショック、粉砕、フレンチプレス、ブレンディングなどの技術を用いて、他の技術が、界面活性剤の非存在下で、実質的に実施され得る［１９］。界面活性剤を用いないか、または低濃度の界面活性剤を用いる方法は、ＮｓｐＡなどの有用な抗原を保持することができる［１９］。したがって、方法は、約０．５％またはそれ未満、例えば、約０．２％、約０．１％、＜０．０５％、またはゼロのデオキシコレートを含むＯＭＶ抽出緩衝液を用いてもよい。ＯＭＶ調製のための有用な工程は、参考文献２３に記載されており、高速遠心分離の代わりというよりむしろ、粗製ＯＭＶにおける限界濾過を含む。工程は、限外濾過が行われた後に超遠心のステップを含んでもよい。

小胞を精製する便利な方法は、参考文献２４に開示された二層濾過方法である。

好ましい小胞は、細菌の物理的または化学的処理後のみに放出される小胞よりむしろ、細菌培養中に自発的に形成する小胞である。ＭｌｔＡが不活性化された髄膜炎菌の成長は、このようにして小胞を産生する好ましい方法である。参考文献４７は、高ブレブ形成菌株を産生する他の方法を開示している。自発的に放出される小胞について、インタクトＬＯＳを産生しない細菌を用いることが好ましい（界面活性剤抽出された小胞は、潜在的反応源性ＬＯＳのレベルを低下させている）。

リポオリゴ糖（ＬＯＳ）が小胞内に存在する場合には、小胞を、そのＬＯＳとタンパク質成分と結合させる（「ブレブ内」コンジュゲーション［４８］）ために処理することが可能である。

小胞は、ＬＯＳを完全に欠損してもよく、またはそれらは、ヘキサアシル化ＬＯＳを欠損してもよく、例えば、小胞内のＬＯＳは、ＬＯＳ分子あたりの第二級アシル鎖の低下した数を有してもよい［２５］。例えば、小胞は、ペンタアシル化ＬＯＳの産生が生じるｌｐｘＬ１の欠失または変異を有する菌株由来であってもよい［２、４３］。菌株内のＬＯＳは、ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを欠損してもよく、例えば、それは、ｌｓｔおよび／またはｌｇｔＢノックアウト株であってもよい［５］。ＬＯＳは、少なくとも１つの野生型のＯ連結型一級脂肪酸を欠損してもよい［２６］。ＬＯＳは、α鎖を有しなくてもよい。ＬＯＳは、ＧｌｃＮＡｃ−Ｈｅｐ_２ホスホエタノールアミン−ＫＤＯ_２−リピドＡを含んでもよい［２７］。

小胞は、１つ、１つより多く、または（好ましくは）ゼロのＰｏｒＡ血清サブタイプを含んでもよい。複数のＰｏｒＡ ＯＭＶを提供するための髄膜炎菌の改変は、例えば、６個の異なるＰｏｒＡサブタイプを発現するように改変された菌株からの小胞の構成を開示する参考文献２８から、および参考文献２９から、公知である。逆に、ＰｏｒＡを除去するための改変もまた、例えば参考文献５から、公知である。

小胞は、ＰｏｒＡおよびＦｒｐＢの一方または両方を含まなくてもよい。好ましい小胞はＰｏｒＡを含まない。

小胞は、莢膜サッカライドを欠損してもよい。例えば、それらは、莢膜生合成および／または搬出についての遺伝子のうちの１つまたは複数（例えば、ｓｙｎＸ）が非活性化されている菌株に由来してもよい。

本発明は、異なる菌株由来の小胞の混合物と共に用いられてもよい。例えば、参考文献３０は、使用される国において流行している血清サブタイプを有する髄膜炎菌株に由来する第１の小胞、および使用される国において防止される血清サブタイプを有する必要がない菌株に由来する第２の小胞を含む、多価髄膜炎菌小胞組成物を含むワクチンを開示している。参考文献３１もまた、異なる小胞の有用な組み合わせを開示している。Ｌ２およびＬ３免疫型のそれぞれにおける菌株由来の小胞の組み合わせが、いくつかの実施形態において用いられてもよい。

過剰発現
本発明のプロモータは、髄膜炎菌において目的の遺伝子を過剰発現するために用いることができる。その遺伝子が外膜タンパク質抗原をコードする場合、この過剰発現は、その抗原を有利に保持する小胞を提供するために用いることができる。そのような小胞は、下記でより詳細に論じられている。過剰発現の結果として、改変型髄膜炎菌から調製された小胞は、対応する野生型髄膜炎菌において見られるものより高いレベルの過剰発現した抗原（複数可）を含有する。小胞における発現の増加は、有用には、小胞の単位質量あたりの関連抗原の質量において測定される少なくとも１０％であり、より有用には、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれ以上である。

本発明のプロモータを用いることにより抗原を過剰発現するために用いることができる適切な組換え改変には、（ｉ）プロモータ置換、（ｉｉ）遺伝子付加、および／または（ｉｉｉ）遺伝子置換が挙げられるが、それらに限定されない。これらの３つの技術は、必要に応じて、（ｉｖ）リプレッサノックアウトと併せて用いることができる。

プロモータ置換において、細菌における抗原の遺伝子の発現を制御するプロモータは、より高いレベルの発現を提供するために本発明のプロモータで置換される。

遺伝子付加において、すでに抗原を発現する細菌は、その関連遺伝子の第２のコピーを受け入れる。この第２のコピーは、細菌染色体へ組み込まれることができ、またはプラスミドなどのエピソームエレメント上に存在することができる。第２のコピーは、本発明のプロモータを用いて発現され得る。遺伝子付加の効果は、発現する抗原の量を増加させることである。プラスミドが用いられる場合、それは、理想的には、高コピー数、例えば、１０個より多く、またはさらに１００個より多くを有するプラスミドである。

遺伝子置換において、遺伝子付加は起こるが、遺伝子の現存するコピーの欠失を伴う。例えば、このアプローチは参考文献３において用いられ、その参考文献において、細菌の内因性染色体ｆＨｂｐ遺伝子が除去され、プラスミドにコードされたコピーで置換された（参考文献３２も参照）。本発明のプロモータを用いる、置換コピーからの発現は、前のコピーからよりも高く、したがって、過剰発現をもたらす。

いくつかの実施形態において、遺伝子付加が別の遺伝子の欠失を伴う、遺伝子置換が起こる。例えば、内因性遺伝子のノックアウトが必要とされるが、目的の遺伝子、すなわち本発明のプロモータによって過剰発現する遺伝子ではない場合である。

いくつかの実施形態において、１つより多い遺伝子付加または遺伝子置換事象は、本発明のプロモータによる目的の遺伝子の複数のコピーからの発現、または本発明のプロモータによる目的の異なる遺伝子の過剰発現の組み合わせが起こり得るように、生じ得る。

少なくとも１つの抗原の過剰発現は、本発明のプロモータを用いるが、これらのプロモータは、他の技術と併せて用いることができる。例えば、プロモータは、目的の抗原の発現を抑制するタンパク質がノックアウトされるリプレッサノックアウトと併せて用いることができる。このノックアウトとは、抑制が生じず、目的の抗原がより高いレベルで発現することができることを意味する。

例えば、ＮａｄＡが過剰発現する場合、ｎａｄＡ遺伝子は本発明のプロモータを用いることができるが、さらに、ＮａｄＲをコードする遺伝子（ＮＭＢ１８４３）を除去することができる。ＮａｄＲは、試験される全ての菌株において、ＮａｄＡコード遺伝子を下方制御し、または抑制する転写リプレッサタンパク質である［３３］。ＮａｄＲのノックアウトは、結果として、ＮａｄＡの恒常的発現を生じさせる。ＮａｄＡを過剰発現させる代替方法は、培地へ４−ヒドロキシフェニル酢酸（４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｃｅｔｉｃ）を加えることである。したがって、本発明のプロモータは、過剰発現戦略として単独で、または他のアプローチと組み合わせて用いることができる。

いくつかの実施形態において、細菌はＮａｄＡを過剰発現する。

いくつかの実施形態において、細菌はＮＨＢＡを過剰発現する。

いくつかの実施形態において、細菌はｆＨｂｐを過剰発現する。

いくつかの実施形態において、細菌はＮＨＢＡとＮａｄＡの両方を過剰発現する。

いくつかの実施形態において、細菌はｆＨｂｐとＮａｄＡの両方を過剰発現する。

いくつかの実施形態において、細菌はｆＨｂｐとＮＨＢＡの両方を過剰発現する。

いくつかの実施形態において、細菌はｆＨｂｐ、ＮＨＢＡ、およびＮａｄＡを過剰発現する。

ＮＨＢＡおよび／またはＮａｄＡを過剰発現することに加えて、細菌は、１つまたは複数のさらなる抗原を過剰発現してもよい。例えば、細菌は、以下のうちの１つまたは複数を過剰発現してもよい：（ａ）ＮｈｈＡ；（ｂ）ＴｂｐＡ；（ｃ）ＨｍｂＲ；（ｄ）ＴｂｐＢ；（ｅ）ＮｓｐＡ；（ｆ）Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ；（ｇ）Ｏｍｐ８５；（ｈ）Ａｐｐ；および／または（ｉ）ｆＨｂｐ。ＮｈｈＡの過剰発現は、参考文献５および３４においてすでに報告されている。ＴｂｐＡの過剰発現は、参考文献５、３４、および３５においてすでに報告されている。ＨｍｂＲの過剰発現は、参考文献３６においてすでに報告されている。ＴｂｐＢの過剰発現は、参考文献３５においてすでに報告されている。ＮｓｐＡの過剰発現は、ｐｏｒＡおよびｃｐｓノックアウトと組み合わせて、参考文献３７においてすでに報告されている。Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼの過剰発現は、参考文献３５においてすでに報告されている。ｆＨｂｐの過剰発現は、参考文献１〜３および３２において、ならびに参考文献３８および３９において異なるアプローチ（恒常的活性のある変異体ＦＮＲを発現すること）によって、すでに報告されている。１つより多い抗原が過剰発現される場合、少なくとも１つの抗原が、本発明のプロモータを用いて過剰発現され、いくつかの実施形態において、１つより多い抗原が、本発明のプロモータを用いて過剰発現される。

いくつかの実施形態において、細菌は、ＮＨＢＡ、ＮａｄＡ、およびｆＨｂｐを過剰発現する。これらの３つの抗原は、参考文献４０において開示された「万能ワクチン」の成分、または「４ＣＭｅｎＢ」［４１、４２］である。一実施形態において、ＮＨＢＡの発現は、本発明のプロモータによって制御され、ＮａｄＲはノックアウトされ、菌株は、恒常的に活性のある変異体ＦＮＲを発現する。別の実施形態において、ＮＨＢＡの発現は、本発明のプロモータによって制御され、ｆＨｂｐの発現は本発明のプロモータによって制御され、ＮａｄＲはノックアウトされている。

過剰発現する改変型菌株は、一般的に、遺伝子改変を除けば、その親株と同質遺伝子的である。改変の結果として、改変型菌株における目的の抗原の発現は、親株より（同じ条件下で）高い。

細菌
上述のように、本発明の小胞は、少なくとも本発明のプロモータの使用を含む、遺伝子改変に起因して関連抗原（複数可）を過剰発現する髄膜炎菌から調製される。本発明はまた、これらの細菌を提供する。それらは、本発明の小胞を調製するために用いることができる。

本発明のプロモータを含むことに加えて、髄膜炎菌は、１つまたは複数のさらなる改変を含んでもよい。例えば、それはｌｐｘＬ１、ｌｇｔＡ、ｌｇｔＢ、ｐｏｒＡ、ｆｒｐＢ、ｓｙｎＸ、ｍｌｔＡ、および／またはｌｓｔのうちの１つまたは複数のノックアウトを有することができる。例えば、参考文献４３は、不活性化されたｓｙｎＸ遺伝子、ｌｐｘＬ１遺伝子、およびｌｇｔＡ遺伝子が不活性化された細菌から調製されたＮＯＭＶワクチンを報告している。少なくともｌｐｘＬ１およびｓｙｎＸのノックアウトは特に有用である。

細菌は、ＬＰＳ生合成に関与する酵素のノックアウトによって達成される低いエンドトキシンレベルを有してもよい［４４、４５］。

細菌は、任意の血清群、例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５、またはＹ由来であってもよい。それは、好ましくは、血清群Ｂまたは血清群Ｗ１３５である。

細菌は、任意の血清型（例えば、１、２ａ、２ｂ、４、１４、１５、１６など）、任意の血清サブタイプおよび任意の免疫型（例えば、Ｌ１；Ｌ２；Ｌ３；Ｌ３，３，７；Ｌ１０など）であってもよい。小胞は、有用には、以下の亜型の１つを有する菌株から調製することができる：Ｐ１．２；Ｐ１．２，５；Ｐ１．４；Ｐ１．５；Ｐ１．５，２；Ｐ１．５，ｃ；Ｐ１．５ｃ，１０；Ｐ１．７，１６；Ｐ１．７，１６ｂ；Ｐ１．７ｈ，４；Ｐ１．９；Ｐ１．１５；Ｐ１．９，１５；Ｐ１．１２，１３；Ｐ１．１３；Ｐ１．１４；Ｐ１．２１，１６；Ｐ１．２２，１４。

細菌は、任意の適切な系統由来であってもよく、その系統には、高侵襲性系統および高毒性系統、例えば、以下の７つの高毒性系統：サブタイプＩ；サブタイプＩＩＩ；サブタイプＩＶ−１；ＥＴ−５複合体；ＥＴ−３７複合体；Ａ４クラスター；系統３のいずれかが挙げられる。これらの系統は、多座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）によって定義されているが、多座配列タイピング（ＭＬＳＴ）もまた、髄膜炎菌を分類するために用いられており［参考文献４６］、例えば、ＥＴ−３７複合体は、ＭＬＳＴによりＳＴ−１１複合体であり、ＥＴ−５複合体は、ＳＴ−３２（ＥＴ−５）であり、系統３はＳＴ−４１／４４であるなど。

いくつかの実施形態において、細菌は、参考文献８、３７、４７、および４８に開示されたノックアウトおよび／または過剰発現変異のうちの１つまたは複数を含んでもよい。改変についての適切な遺伝子には、以下が挙げられる：（ａ）Ｃｐｓ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ［８］；（ｂ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＣ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＧａｌＥ、ＨｔｒＢ／ＭｓｂＢ、ＬｂｐＡ、ＬｂｐＢ、ＬｐｘＫ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｈｏＰ、ＰｉｌＣ、ＰｍｒＥ、ＰｍｒＦ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ；（ｃ）ＥｘｂＢ、ＥｘｂＤ、ｒｍｐＭ、ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＧａｌＥ、ＬｂｐＡ、ＬｐｂＢ、Ｏｐａ、Ｏｐｃ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＡ、ＳｉａＢ、ＳｉａＣ、ＳｉａＤ、ＴｂｐＡ、および／またはＴｂｐＢ；ならびに（ｄ）ＣｔｒＡ、ＣｔｒＢ、ＣｔｒＤ、ＦｒｐＢ、ＯｐＡ、ＯｐＣ、ＰｉｌＣ、ＰｏｒＢ、ＳｉａＤ、ＳｙｎＡ、ＳｙｎＢ、および／またはＳｙｎＣ。

上述のように、髄膜炎菌は、有利なことに、それが、例えば本発明のプロモータを用いて発現する抗原を含有する小胞を自発的に放出するように、活性ＭｌｔＡ（ＧＮＡ３３）を発現しない。

理想的には、細菌は、天然ＬＰＳを発現せず、例えば、それは、ＬｐｘＬ１および／またはＬｇｔＢの変異体またはノックアウトを有する。

細菌がノックアウトを有する場合、目的のタンパク質の転写を制御する本発明のプロモータを含む配列の挿入によってこのノックアウトを達成することが好都合である。例えば、ゲノムのｓｙｎＸ遺伝子またはｌｐｘＬ１遺伝子は、ｆＨｂｐなどの外膜タンパク質の発現を制御する本発明のプロモータを含む配列をその内部に挿入することにより、ノックアウトすることができる。したがって、単一の形質転換事象が、２つの目的を達成するために用いることができる。

本発明の細菌は、選択マーカー、例えば、抗生物質抵抗性マーカーを含んでもよい。

細菌は、以下の特性のうちの１つもしくは複数、または全部を有してもよい：（ｉ）髄膜炎菌のＬＯＳを切断するために下方制御またはノックアウトされたＬｇｔＢおよび／またはＧａｌＥ；（ｉｉ）上方制御されたＴｂｐＡ；（ｉｉｉ）上方制御されたＮｈｈＡ；（ｉｖ）上方制御されたＯｍｐ８５；（ｖ）上方制御されたＬｂｐＡ；（ｖｉ）上方制御されたＮｓｐＡ；（ｖｉｉ）ノックアウトされたＰｏｒＡ；（ｖｉｉｉ）下方制御またはノックアウトされたＦｒｐＢ；（ｉｘ）下方制御またはノックアウトされたＯｐａ；（ｘ）下方制御またはノックアウトされたＯｐｃ；（ｘｉｉ）除去されたｃｐｓ遺伝子複合体。切断されたＬＯＳは、シアリル−ラクト−Ｎ−ネオテトラオースエピトープを含まないものであり得、例えば、それは、ガラクトース欠損ＬＯＳであってもよい。そのＬＯＳはα鎖を有しなくてもよい。

細菌は、以下の特性のうちの１つもしくは複数、または全部を有してもよい：（ｉ）下方制御もしくはノックアウトされたＬｇｔＡ；（ｉｉ）下方制御もしくはノックアウトされたＬｐｘＬ１；（ｉｉｉ）下方制御もしくはノックアウトされたＳｙｎＸ；（ｉｖ）２つの異なるＰｏｒＡサブタイプなどの１つより多いＰｏｒＡサブタイプ；および／または（ｖ）ＮａｄＡもしくはｆＨｂｐなどの上方制御された外膜抗原。

菌株作製
本発明は、（ｉ）特定の培養条件において増殖させた場合、第１の量の抗原を発現する出発菌株を選択するステップ、その後（ｉｉ）出発菌株を改変して、本発明のプロモータを含む改変型菌株を供給するステップであって、その改変型菌株が、同じ特定の培養条件において増殖させた場合、第２の量の抗原を発現し、第２の量が、第１の量より高い、ステップを含む、小胞調製に適切な髄膜炎菌株を調製するための工程を提供する。第２の量は、有用には、細菌の単位質量あたりの関連抗原の質量において測定される場合、少なくとも１０％第１の量より高く、より有用には、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、またはそれより高い。

この工程の後に、（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）において得られた改変型細菌を培養して、細菌培養物を供給するステップが続くことができる。

上記工程はまた、本発明のプロモータの導入の前かまたは後のいずれかに遺伝子操作のさらなるステップを含むことができる。本発明のプロモータは、１度より多く、かつ１つより多い部位に、例えば、複数の制御される遺伝子と共に、細菌へ導入することができる。

本発明はまた、（上記のような）本発明の工程によって得られた細菌培養物を、その外膜が小胞を形成するように、処理するステップを含む、髄膜炎菌小胞を調製するための工程を提供する。この処理ステップは、上述の技術のいずれかを用いることができる。

本発明はまた、本発明の髄膜炎菌を、その外膜が小胞を形成するように、処理するステップを含む、髄膜炎菌小胞を調製するための工程を提供する。この処理ステップは、上述の技術のいずれかを用いることができる。

本発明はまた、本発明の髄膜炎菌を、その外膜が小胞を自発的に排出する条件下で培養するステップを含む、髄膜炎菌小胞を調製するための工程を提供する。例えば、髄膜炎菌は、活性ＭｌｔＡを発現しなくてもよい。

有用な出発菌株は、髄膜炎菌血清群Ｂである。目的の抗原を過剰発現する細菌を調製するための３つの有用な出発髄膜炎菌株は、ＭＣ５８、ＮＺ９８／２５４、およびＨ４４／７６である。ＭＣ５８は、ＰｏｒＡ血清サブタイプ１．７，１６を有する；ＮＺ９８／２５４は血清サブタイプＰ１．７−２，４を有する；およびＨ４４／７６は血清サブタイプ１．７，１６を有する。これらの血清サブタイプを有する他の菌株もまた用いることができる。

ベクターなど
本発明は、上記のようなプロモータを提供する。これらは、細菌の染色体中に、または染色体外の、もしくはエピソームの核酸中に、例えば、プラスミド内に、存在することができる。細菌は、本発明のプロモータの１または複数のコピーを含むことができる。細菌が２コピーを含む場合、これらは、染色体および／またはエピソーム（複数可）中に存在することができる。

したがって、本発明は、（ｉ）本発明の少なくとも１つのプロモータを含む染色体、および／または（ｉｉ）本発明の少なくとも１つのプロモータを含むプラスミドなどのエピソームを、含む細菌を提供する。

本発明はまた、細菌発現ベクターなどの、本発明のプロモータを含む核酸ベクターを提供する。

これらのベクターまたは細菌内のこれらのプロモータは、下流の転写可能な配列も有さない「オーファン」プロモータ（ｏｒｐｈａｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）であり得るが、それらは、典型的には、転写され、かつその後、翻訳されて目的のタンパク質を発現する配列に作動可能に連結される。

抗原
ＮＨＢＡ（ナイセリアのヘパリン結合抗原）
ＮＨＢＡ［５１］は、遺伝子ＮＭＢ２１３２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２７３８８；本明細書では配列番号９）として髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。多くの菌株由来のＮＨＢＡの配列が、それ以来、公開されている。例えば、ＮＨＢＡの対立形質（タンパク質「２８７」と呼ばれている）は、参考文献４９の図５および図１５、ならびに参考文献５０の実施例１３および図２１（そこでは、配列番号３１７９〜３１８４）で見られる。ＮＨＢＡの様々な免疫原性断片もまた報告されている。

本発明と共に用いられる好ましいＮＨＢＡ抗原は、（ａ）配列番号９と５０％より高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号９の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより高い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより多い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号９由来のエピトープを含む。

最も有用なＮＨＢＡ抗原は、被験体への投与後に配列番号９のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＮＨＢＡ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

ＮＨＢＡの過剰発現は、以前に、様々な方法、例えば、ＩＰＴＧ誘導性プロモータの制御下のＮＨＢＡ遺伝子の導入において達成されている［５１］。

ＮａｄＡ（ナイセリアのアドヘシンＡ）
ＮａｄＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ１９９４（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２７２５６；本明細書では配列番号１０）として、髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。多くの菌株由来のＮａｄＡ抗原の配列が、それ以来、公開されており、ナイセリアのアドヘシンとしてのタンパク質活性は、文書で十分立証されている。ＮａｄＡの様々な免疫原性断片もまた報告されている。

本発明と共に用いられる好ましいＮａｄＡ抗原は、（ａ）配列番号１０と５０％より高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号１０の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより多い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより多い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１０由来のエピトープを含む。

最も有用なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後に配列番号１０のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＮａｄＡ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。配列番号６は１つのそのような断片である。

ＨｍｂＲ
全長ＨｍｂＲ配列は、遺伝子ＮＭＢ１６６８（本明細書では配列番号７）として、髄膜炎菌血清群ＢＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。参考文献５２は、異なる菌株由来のＨｍｂＲ配列（本明細書では配列番号８）を報告し、参考文献３６は、さらなる配列（本明細書では配列番号１９）を報告している。配列番号７と配列番号８は、長さが１アミノ酸、異なり、９４．２％同一性を有する。配列番号１９は、配列番号７より１アミノ酸、短く、それらは、ＣＬＵＳＴＡＬＷにより９９％同一性（１つの挿入、７つの違い）を有する。本発明は、任意のそのようなＨｍｂＲポリペプチドを用いることができる。

本発明は、全長ＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを用いることができるが、部分的なＨｍｂＲ配列を含むポリペプチドを用いることが多い。したがって、いくつかの実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、配列番号７と少なくともｉ％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、ｉの値が、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９、またはそれより大きい、アミノ酸配列を含んでもよい。他の実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、配列番号７由来の少なくともｊ個の連続したアミノ酸の断片であって、ｊの値が、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより大きい、断片を含んでもよい。他の実施形態において、本発明に従って用いられるＨｍｂＲ配列は、（ｉ）配列番号７と少なくともｉ％の配列同一性を有し、および／または（ｉｉ）配列番号７由来の少なくともｊ個の連続したアミノ酸の断片を含むアミノ酸配列を含んでもよい。

ｊ個のアミノ酸の好ましい断片は、配列番号７由来のエピトープを含む。そのようなエピトープは、通常、ＨｍｂＲの表面上に位置するアミノ酸を含む。有用なエピトープには、ＨｍｂＲのヘモグロビンへの結合に関与するアミノ酸を含むエピトープが挙げられる。なぜなら、これらのエピトープに結合する抗体が、宿主のヘモグロビンに結合する細菌の能力をブロックすることができるからである。ＨｍｂＲおよびその重要な機能性残基のトポロジーは、参考文献５３において調べられた。膜貫通配列を保持する断片は、それらが、細菌表面上、例えば小胞において、提示（ｄｉｓｐｌａｙ）され得るため、有用である。ＨｍｂＲの長い断片の例は、配列番号２１および配列番号２２に対応する。しかしながら、可溶性ＨｍｂＲが用いられる場合には、膜貫通配列が取り除かれているが、典型的には、細胞外部分由来のエピトープ（複数可）を保持する配列を、用いることができる。

最も有用なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後に配列番号７のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＨｍｂＲ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

ｆＨｂｐ（Ｈ因子結合タンパク質）
ｆＨｂｐ抗原は詳細に特徴づけられている。それはまた、タンパク質「７４１」［参考文献５０における配列番号２５３５および２５３６］、「ＮＭＢ１８７０」、「ＧＮＡ１８７０」［５４〜５６］、「Ｐ２０８６」、「ＬＰ２０８６」、または「ＯＲＦ２０８６」［５７〜５９］として知られている。それは、天然では、リポタンパク質であり、全ての髄膜炎菌血清群にわたって発現している。ｆＨｂｐのＣ末端免疫優性ドメイン（「ｆＨｂｐＣ」）の構造は、ＮＭＲによって決定されている［６０］。そのタンパク質のこの部分は、８本鎖のβ−バレルを形成し、その鎖は可変長のループによって結合している。バレルは、短いα−ヘリックスおよび可動性Ｎ末端テールによって先行される。

ｆＨｂｐ抗原は、３つの別々の変異体に分類され［６１］、所定のファミリーに対して生じた血清は同じファミリー内で殺菌性であるが、その他の２つのファミリーのうちの１つを発現する菌株に対して活性がなく、すなわち、ファミリー内交差防御が存在するが、ファミリー間交差防御が存在しないことが見出されている。本発明は、単一のｆＨｂｐ変異体を用いることができるが、有用には、その変異体のうちの２つまたは３つ由来のｆＨｂｐを含む。したがって、本発明は、以下から選択される２つまたは３つの異なるｆＨｂｐの組み合わせを用いてもよい：（ａ）配列番号１と少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号１由来の少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第１のタンパク質；（ｂ）配列番号２と少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号２由来の少なくともｙ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第２のタンパク質；ならびに／または（ｃ）配列番号３と少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号３由来の少なくともｚ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第３のタンパク質。

ａの値は、少なくとも８５であり、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれより大きい。ｂの値は、少なくとも８５であり、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれより大きい。ｃの値は、少なくとも８５であり、例えば、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５、またはそれより大きい。ａ、ｂ、およびｃの値は、本質的にお互いに関連しているものではない。

ｘの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｙの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｚの値は、少なくとも７、例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２５、２５０である。ｘ、ｙ、およびｚの値は、本質的にお互いに関連しているものではない。

本発明が単一のｆＨｂｐ変異体を用いる場合、組成物は、（ａ）配列番号１と少なくともａ％の配列同一性を有し、および／もしくは配列番号１由来の少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列；または（ｂ）配列番号２と少なくともｂ％の配列同一性を有し、および／もしくは配列番号２由来の少なくともｙ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列、または（ｃ）配列番号３と少なくともｃ％の配列同一性を有し、および／もしくは配列番号３由来の少なくともｚ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含んでもよい。

本発明が、変異体のうちの２つまたは３つ由来のｆＨｂｐを用いる場合、組成物は、以下から選択される２つまたは３つの異なるｆＨｂｐの組み合わせを含んでもよい：（ａ）配列番号１と少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号１由来の少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号２と少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号２由来の少なくともｙ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド；ならびに／または（ｃ）配列番号３と少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号３由来の少なくともｚ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第３のポリペプチド。第１、第２、および第３のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。

本発明が、変異体のうちの２つ由来のｆＨｂｐを用いる場合、組成物は、以下の両方を含むことができる：（ａ）配列番号１と少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号１由来の少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；ならびに（ｂ）配列番号２と少なくともｂ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号２由来の少なくともｙ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド。第１および第２のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。

本発明が、変異体のうちの２つ由来のｆＨｂｐを用いる場合、組成物は、以下の両方を含むことができる：（ａ）配列番号１と少なくともａ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号１由来の少なくともｘ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第１のポリペプチド；（ｂ）配列番号３と少なくともｃ％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、および／もしくは配列番号３由来の少なくともｚ個の連続したアミノ酸の断片からなるアミノ酸配列を含む、第２のポリペプチド。第１および第２のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。

本発明に従って用いることができる別の有用なｆＨｂｐは、例えば、参考文献６２において開示された改変型のうちの１つ、例えば、その参考文献からの配列番号２０または２３を含む改変型である。これらの改変型は、髄膜炎菌に対して幅広く殺菌性である抗体応答を誘発することができる。参考文献６２における配列番号７７は、用いることができる別の有用なｆＨｂｐ配列である。

上述の配列を含むｆＨｂｐの有用な改変は、Ｈ因子に対するそのタンパク質の親和性を低下させ、または除去する変異である。例えば、参考文献６３および６４は、それらのナンバリングによる残基Ｇｌｕ−２８３および／またはＧｌｕ−３０４（このナンバリングスキーム（ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ）から７２を引き算すると、本明細書における配列番号１に対応する）におけるそのような変異を開示する。同様に、参考文献６５および６６は、変異体１について、それらのナンバリングによる位置Ａｒｇ−４１（７を引き算すると、配列番号１に対応する）、ならびに変異体２について、それらのナンバリングによる位置８０、２１１、２１８、２２０、２２２、および／または２３６（７を引き算すると、配列番号２に対応する）における（例えば、Ｓｅｒへの）変異を開示する。アラインメントは、目的の任意のｆＨｂｐ配列についての対応する残基を迅速に明らかにする。変異体１の配列におけるＡｒｇ−４１−Ｓｅｒ変異が、特に好ましい。

ＯＭＶにおけるｆＨｂｐタンパク質（複数可）は、例えば、Ｎ末端のシステインにおいて、通常脂質付加される。他の実施形態において、それらは、脂質付加されない。

ＮｓｐＡ（ナイセリアの表面タンパク質Ａ）
ＮｓｐＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ０６６３（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２５８８８；本明細書では配列番号１１）として、髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。その抗原は、参考文献６７および６８により、以前公知となった。多くの菌株由来のＮｓｐＡ抗原の配列が、それ以来、公開されている。ＮｓｐＡの様々な免疫原性断片もまた、報告されている。

本発明と共に用いられる好ましいＮｓｐＡ抗原は、（ａ）配列番号１１と５０％またはそれより高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号１１の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより多い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより多い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１１由来のエピトープを含む。

最も有用なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後に配列番号１１のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＮｓｐＡ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

Ｎｈｈａ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｈｉａ相同体）
ＮｈｈＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ０９９２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２６２３２；本明細書では配列番号１２）として、髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。多くの菌株由来のＮｈｈＡ抗原の配列は、例えば参考文献４９および６９以来、公開されており、ＮｈｈＡの様々な免疫原性断片が報告されている。それはまた、Ｈｓｆとしても知られている。

本発明と共に用いられる好ましいＮｈｈＡ抗原は、（ａ）配列番号１２と５０％またはそれより高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号１２の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより多い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより多い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１２由来のエピトープを含む。

最も有用なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後に配列番号１２のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＮｈｈＡ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

Ａｐｐ（接着および透過タンパク質）
Ａｐｐ抗原は、遺伝子ＮＭＢ１９８５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２７２４６；本明細書では配列番号１３）として、髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。多くの菌株由来のＡｐｐ抗原の配列は、それ以来、公開されている。それはまた、「ＯＲＦ１」および「Ｈａｐ」としても知られている。Ａｐｐの様々な免疫原性断片もまた報告されている。

本発明と共に用いられる好ましいＡｐｐ抗原は、（ａ）配列番号１３と５０％またはそれより高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号１３の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより多い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより多い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１３由来のエピトープを含む。

最も有用なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後に配列番号１３のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＡｐｐ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

Ｏｍｐ８５（８５ｋＤａ外膜タンパク質）
Ｏｍｐ８５抗原は、遺伝子ＮＭＢ０１８２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２５４０１；本明細書では配列番号１４）として、髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。多くの菌株由来のＯｍｐ８５抗原の配列は、それ以来、公開されている。Ｏｍｐ８５に関するさらなる情報は、参考文献７０および７１において見出すことができる。Ｏｍｐ８５の様々な免疫原性断片もまた、報告されている。

本発明と共に用いられる好ましいＯｍｐ８５抗原は、（ａ）配列番号１４と５０％またはそれより高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号１４の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより多い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより多い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号１４由来のエピトープを含む。

最も有用なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後に配列番号１４のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＯｍｐ８５抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

ＴｂｐＡ
ＴｂｐＡ抗原は、遺伝子ＮＭＢ０４６１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２５６８７；本明細書では配列番号２３）として、髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。多くの菌株由来のＴｂｐＡの配列は、それ以来、公開されている。ＴｂｐＡの様々な免疫原性断片もまた、報告されている。

本発明と共に用いられる好ましいＴｂｐＡ抗原は、（ａ）配列番号２３と５０％またはそれより高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号２３の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより多い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより多い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２３由来のエピトープを含む。

最も有用なＴｂｐＡ抗原は、被験体への投与後に配列番号２３のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＴｂｐＡ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

ＴｂｐＢ
ＴｂｐＢ抗原は、遺伝子ＮＭＢ１３９８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２５６８６；本明細書では配列番号２４）として、髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。多くの菌株由来のＴｂｐＢの配列は、それ以来、公開されている。ＴｂｐＢの様々な免疫原性断片もまた、報告されている。

本発明と共に用いられる好ましいＴｂｐＢ抗原は、（ａ）配列番号２４と５０％またはそれより高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号２４の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより多い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより高い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２４由来のエピトープを含む。

最も有用なＴｂｐＢ抗原は、被験体への投与後に配列番号２４のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＴｂｐＢ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ
Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ抗原は、遺伝子ＮＭＢ１３９８（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＧＩ：７２２６６３７；本明細書では配列番号２５）として、髄膜炎菌血清群Ｂ ＭＣ５８株についての公開されたゲノム配列［７８］中に含まれた。多くの菌株由来のＣｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼの配列は、それ以来、公開されている。Ｃｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼの様々な免疫原性断片もまた、報告されている。

本発明と共に用いられる好ましいＣｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ抗原は、（ａ）配列番号２５と５０％またはそれより高い（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより高い）同一性を有し、および／または（ｂ）配列番号２５の少なくとも「ｎ」個の連続したアミノ酸の断片を含む（ここで、「ｎ」は７またはそれより多い（例えば、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、またはそれより多い））、アミノ酸配列を含む。（ｂ）の好ましい断片は、配列番号２５由来のエピトープを含む。

最も有用なＣｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ抗原は、被験体への投与後に配列番号２５のアミノ酸配列からなる髄膜炎菌ポリペプチドに結合することができる抗体を誘発することができる。本発明と共に用いられる有利なＣｕ、Ｚｎ−スーパーオキシドジスムターゼ抗原は、被験体への投与後、殺菌性抗髄膜炎菌抗体を誘発することができる。

薬学的組成物
本発明の小胞は、患者への投与のための免疫原性薬学的組成物における活性成分として有用である。これらは、典型的には、薬学的に許容され得る担体を含み、そのような担体の徹底的な議論は、参考文献７２において入手可能である。

有効投与体積は、定期的に規定することができるが、組成物の典型的なヒト用量は、例えば、筋肉内注射について、約０．５ｍｌの体積を有する。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンは、大腿部または上腕への筋肉内注射により０．５ｍｌの体積で投与された［７３］。ＭｅＮＺＢ（商標）は、大腿前外側部または腕の三角筋部への筋肉内注射により０．５ｍｌで投与される。同様の用量が、他の送達経路について用いられてもよく、例えば、噴霧用の鼻腔内のＯＭＶベースのワクチンは、１回のスプレーあたり約１００μｌまたは約１３０μｌの体積を有し得、４回のスプレーが投与されて、約０．５ｍｌの総用量を与える。

本発明の組成物のｐＨは、通常、６から８の間であり、より好ましくは、６．５から７．５の間（例えば、約７）である。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンのｐＨは、７．４であり［７４］、ｐＨ＜７．５は、本発明の組成物にとって好ましい。ＲＩＶＭ ＯＭＶベースのワクチンは、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液を用いることによりｐＨを維持し、本発明の組成物における安定なｐＨは、緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液の使用によって維持されてもよい。したがって、本発明の組成物は、一般的に緩衝液を含む。

組成物は、無菌であり得、および／または発熱物質を含まないものであり得る。本発明の組成物は、ヒトに対して、等張性であり得る。

患者への投与のための本発明の組成物は、免疫原性であり、より好ましくは、ワクチン組成物である。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち、感染を予防するため）または治療的（すなわち、感染を処置するため）のいずれでもあり得るが、典型的には、予防的である。ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）、ならびに必要に応じて、任意の他の成分を含む。「免疫学的有効量」とは、単回投与におけるその量の個体への投与、または連続の一部としてのその量の個体への投与のいずれかが、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体的状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば、非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、望まれる防御の程度、ワクチンの剤形、処置を行う医師の医学的状況の評価、および他の関連した因子によって異なる。その量は、日常的試行を通して決定することができる相対的に幅広い範囲になることが予想される。本発明の組成物の抗原含有量は、一般的に、用量あたりのタンパク質の量に関して表される。１ｍｌあたり約０．９ｍｇのタンパク質の用量は、ＯＭＶベースの鼻腔内ワクチンについて典型的である。

本発明の組成物は、免疫学的アジュバントを含んでもよい。したがって、例えば、それらは、アルミニウム塩アジュバントまたは水中油型エマルション（例えば、水中スクアレンエマルション）を含んでもよい。適切なアルミニウム塩には、水酸化物（例えば、オキシ水酸化物）、リン酸塩（例えば、ヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、（例えば、参考文献７５の８章および９章参照）、またはそれらの混合物が挙げられる。上記塩は、任意の適切な形（例えば、ゲル、結晶、非晶質など）をとることができ、抗原が塩に吸着することが好ましい。患者への投与のための組成物におけるＡｌ^＋＋＋の濃度は、好ましくは５ｍｇ／ｍｌ未満、例えば、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３ｍｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの間である。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。水酸化アルミニウムアジュバントは、髄膜炎菌ワクチンと共に用いるのに特に適している。

髄膜炎菌は身体の様々な部位を冒し、それゆえに、本発明の組成物は、様々な液体の形で調製されてもよい。例えば、上記組成物は、溶液または懸濁液としてのいずれかの注射剤として調製されてもよい。上記組成物は、例えば、吸入器による、微細なスプレーを用いる肺投与用に調製されてもよい。上記組成物は、例えば、スプレーまたは液滴として、鼻、耳、または目の投与用に調製されてもよい。筋肉内投与用の注射剤が典型的である。

本発明の組成物は、特に複数回投与形式でパッケージされる場合、抗菌剤を含んでもよい。チオメルサールおよび２−フェノキシエタノールなどの抗菌剤が、ワクチンにおいて一般的に見られるが、水銀を含まない保存剤を用いるかまたは全く保存剤を用いないかのいずれかが好ましい。

本発明の組成物は、界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０などのＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでもよい。界面活性剤は、一般的に、低レベル、例えば、＜０．０１％で存在する。

本発明の組成物は、ＯＭＶ調製物からの残留界面活性剤（例えば、デオキシコレート）を含んでもよい。残留界面活性剤の量は、好ましくは、１μｇのＭｅｎＢタンパク質ごとに０．４μｇ未満（より好ましくは０．２μｇ未満）である。

本発明の組成物がＬＯＳを含む場合には、ＬＯＳの量は、好ましくは、１μｇのタンパク質ごとに０．１２μｇ未満（より好ましくは０．０５μｇ未満）である。

本発明の組成物は、浸透圧を与えるためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでもよい。１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌの濃度が、典型的であり、例えば、約９ｍｇ／ｍｌである。

本発明の小胞に加えて、免疫原性組成物は、可溶性タンパク質抗原を含むことができる。例えば、有用な組成物は、（ｉ）ＮＨＢＡ抗原、（ｉｉ）ＮａｄＡ抗原、および（ｉｉｉ）ｆＨｂｐ抗原のうちの１つまたは複数と組み合わせて本発明の小胞を含むことができる。例えば、小胞は、「４ＣＭｅｎＢ」ワクチン（上記参照）と混合することができる。一つの有用な実施形態において、組成物は、可溶型、かつ過剰発現する小胞型の両方の型のｆＨｂｐを含み、その２つの型は異なるｆＨｂｐ変異体、例えば、（４ＣＭｅｎＢのような）可溶型での変異体１、ならびに本発明のプロモータから変異体２または３の配列を発現する細菌から調製される小胞の表面に存在する変異体２および／または３である。

したがって、本発明の１つの組成物は、（ｉ）ｆＨｂｐ配列を提示する自発的に放出される小胞などの本発明の小胞；（ｉｉ）配列番号４などの可溶性ＮＨＢＡ抗原；（ｉｉｉ）配列番号５などの可溶性ｆＨｂｐ抗原；および（ｉｖ）配列番号６などの可溶性ＮａｄＡ抗原を含む。

処置の方法
本発明はまた、本発明の組成物を哺乳動物へ投与することを含む、哺乳動物における免疫応答を生じさせるための方法を提供する。免疫応答は、好ましくは、防御性であり、好ましくは、抗体を含む。この方法は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓに対してすでにプライミングされている患者において追加免疫応答を生じさせ得る。

上記哺乳動物は、好ましくはヒトである。ワクチンが予防的に用いられる場合、ヒトは好ましくは子ども（例えば、幼児または乳児）またはティーンエージャである；ワクチンが治療的に用いられる場合、ヒトは好ましくは成人である。小児を対象とするワクチンはまた、成人に、例えば、安全性、投与量、免疫原性などを評価するために、投与される場合もある。

本発明はまた、薬物として用いられる本発明の小胞を提供する。薬物は、好ましくは、哺乳動物において免疫応答を生じさせるために用いられ（すなわち、それは、免疫原性組成物である）、より好ましくはワクチンである。

本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を生じさせるための薬物の製造における本発明の小胞の使用を提供する。

これらの使用および方法は、好ましくは、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓによって引き起こされる疾患、例えば、細菌性（または、より具体的には、髄膜炎菌性）髄膜炎または敗血症の予防および／または処置のためのものである。

治療的処置の効力をチェックする一つの方法は、本発明の組成物の投与後、ナイセリア感染をモニターすることを含む。予防的処置の効力をチェックする一つの方法は、その組成物の投与後、抗原に対する免疫応答をモニターすることを含む。本発明の組成物の免疫原性は、それらを被験体（例えば、生後１２〜１６ヶ月の子ども、または動物モデル［７６］）に投与し、その後、血清殺菌性抗体（ＳＢＡ）およびＥＬＩＳＡ力価（ＧＭＴ）を含む標準パラメータを決定することにより決定することができる。これらの免疫応答は、一般的に、組成物の投与から約４週間後に決定され、組成物の投与前に決定された値と比較される。少なくとも４倍または８倍のＳＢＡの増加が好ましい。単回投与より多く組成物が投与される場合、１回より多い投与後の決定が行われてもよい。

一般的に、本発明の組成物は、被験体に投与された後に、血清殺菌性抗体応答を誘導することができる。これらの応答は、簡便にマウスにおいて測定され、ワクチン効力の標準指標である。血清殺菌活性（ＳＢＡ）は、補体によって媒介される細菌の死滅を測定し、ヒトまたはベビーラビットの補体を用いてアッセイすることができる。ＷＨＯ標準は、ワクチンが、９０％より多いレシピエントにおいてＳＢＡの少なくとも４倍の上昇を誘導することを要求する。ＭｅＮＺＢ（商標）は、３回目の用量の投与から４〜６週間後、ＳＢＡの４倍の上昇を誘発する。

好ましい組成物は、許容され得る割合の被験体についての抗体保有率の基準よりも優れている、ヒト被験患者における抗体価を与えることができる。宿主が、抗原に対して血清転換されたとみなされる抗体価より高い関連抗体価を有する抗原は周知であり、そのような力価は、ＷＨＯなどの機構によって公開されている。好ましくは、被験体の統計学的に有意な試料の８０％より多くが、血清転換されており、より好ましくは９０％より多く、さらにより好ましくは９３％より多く、最も好ましくは９６〜１００％、血清転換されている。

本発明の組成物は、一般的に、患者へ直接的に投与される。直接的送達は、（例えば、皮下に、腹腔内に、静脈内に、筋肉内に、または組織の間質腔への）非経口的注射により、または任意の他の適切な経路によって達成されてもよい。本発明は、全身免疫および／または粘膜免疫を誘発するために用いられてもよい。大腿部または上腕への筋肉内投与が好ましい。注射は針（例えば、皮下針）を介してもよいが、代わりとして、無針注射が用いられてもよい。典型的な筋肉内用量は０．５ｍｌである。

投与処置は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであり得る。複数回投与は、一次免疫スケジュールおよび／または追加免疫スケジュールにおいて用いられてもよい。一次投与スケジュールの後に、追加免疫投与スケジュールが続いてもよい。プライミング投与間の適切なタイミング（例えば、４〜１６週間の間）、およびプライミングと追加免疫との間の適切なタイミングは、定期的に決定することができる。ＯＭＶベースのＲＩＶＭワクチンを、０ヶ月目、２ヶ月目および８ヶ月目、または０ヶ月目、１ヶ月目、２ヶ月目および８ヶ月目におけるワクチン接種での３回または４回投与の一次スケジュールを用いて試験した。ＭｅＮＺＢ（商標）は、６週間の間隔で３回投与として投与される。

本発明の組成物は、１つより多い髄膜炎菌の高毒性系統に対する殺菌性抗体応答を誘導するために用いられてもよい。特に、それらは、好ましくは、以下の３つの高毒性系統のうちの２つまたは３つに対する殺菌性応答を誘導することができる：（ｉ）クラスターＡ４；（ｉｉ）ＥＴ５複合体；および（ｉｉｉ）系統３。それらは、さらに、高毒性系統サブグループＩ、サブグループＩＩＩ、サブグループＩＶ−１、またはＥＴ−３７複合体のうちの１つまたは複数に対する殺菌性抗体応答、および他の系統、例えば、高侵襲性系統に対する殺菌性抗体応答を誘導し得る。これは、組成物が、これらの高毒性系統内の髄膜炎菌の全ての菌株に対する殺菌性抗体を誘導することができることを必ずしも意味するわけではなく、例えば、むしろ、特定の高毒性系統内の髄膜炎菌の４つまたはそれより多くの菌株の任意の所定の群について、組成物によって誘導される抗体が、その群の少なくとも５０％（例えば、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれより高く）に対して殺菌性である。菌株の好ましい群は、以下の国：ＧＢ、ＡＵ、ＣＡ、ＮＯ、ＩＴ、ＵＳ、ＮＺ、ＮＬ、ＢＲ、およびＣＵのうちの少なくとも４ヶ国において単離される菌株を含む。血清は、好ましくは、少なくとも１０２４（例えば、２^１０、２^１１、２^１２、２^１３、２^１４、２^１５、２^１６、２^１７、２^１８、またはそれより多く、好ましくは少なくとも２^１４）の殺菌性力価を有し、例えば、血清は、１／１０２４に希釈された場合、特定の菌株の試験細菌の少なくとも５０％を死滅させることができる。

有用な組成物は、血清群Ｂ髄膜炎菌の以下の菌株に対して殺菌性応答を誘導することができる：（ｉ）クラスターＡ４由来、９６１−５９４５株（Ｂ：２ｂ：Ｐ１．２１、１６）および／またはＧ２１３６株（Ｂ：−）；（ｉｉ）ＥＴ−５複合体由来、ＭＣ５８株（Ｂ：１５：Ｐ１．７、１６ｂ）および／または４４／７６株（Ｂ：１５：Ｐ１．７、１６）；（ｉｉｉ）系統３由来、３９４／９８株（Ｂ：４：Ｐ１．４）および／またはＢＺ１９８株（Ｂ：ＮＴ：−）。より好ましい組成物は、９６１−５９４５株、４４／７６株、および３９４／９８株に対する殺菌性応答を誘導することができる。

９６１−５９４５株およびＧ２１３６株はどちらもＮｅｉｓｓｅｒｉａ ＭＬＳＴ参照株である（参考文献７７におけるｉｄ ６３８およびｉｄ １００２）。ＭＣ５８株は、広く入手可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＢＡＡ−３３５）、参考文献７８において配列決定された菌株であった。４４／７６株は、広く用いられ、特徴づけられており（例えば、参考文献７９）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ＭＬＳＴ参照株のうちの１つである［参考文献７７におけるｉｄ ２３７；参考文献４６における表２の３２行目］。３９４／９８株は、最初、１９９８年にニュージーランドで単離され、この菌株を用いたいくつかの発表された研究がある（例えば、参考文献８０および８１）。ＢＺ１９８株は、別のＭＬＳＴ参照株である（参考文献７７におけるｉｄ ４０９；参考文献４６における表２の４１行目）。

さらなる抗原性成分
本発明の小胞に加えて、免疫原性組成物は、さらなる非小胞抗原を含むことができる。

いくつかの実施形態において、組成物は、髄膜炎菌由来、例えば、血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および／または血清群Ｙ由来の１つまたは複数の莢膜糖を含む。これらのサッカライドは、通常、タンパク質担体にコンジュゲートされている。本発明の組成物は、髄膜炎菌血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および血清群Ｙのうちの１つ、２つ、３つ、または４つ、例えば、Ａ＋Ｃ、Ａ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｙ、Ｃ＋Ｗ１３５、Ｃ＋Ｙ、Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５、Ａ＋Ｃ＋Ｙ、Ａ＋Ｗ１３５＋Ｙ、Ａ＋Ｃ＋Ｗ１３５＋Ｙなど由来の莢膜糖の１つまたは複数のコンジュゲートを含んでもよい。血清群Ａ、血清群Ｃ、血清群Ｗ１３５、および血清群Ｙの全ての４つ由来のサッカライドを含む成分が理想的である。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来の抗原を含有することに加えて、組成物は、さらなる病原体由来の抗原を含んでもよい。例えば、組成物は、以下のさらなる抗原のうちの１つまたは複数を含んでもよい：
− （典型的にはコンジュゲートされた）サッカライドなどのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原
− 表面抗原ＨＢｓＡｇなどのＢ型肝炎ウイルス由来の抗原
− Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の百日咳ホロトキシン（ＰＴ）および線維状赤血球凝集素（ＦＨＡ）などのＢｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ由来の抗原（さらに、必要に応じて、パータクチンならびに／または凝集原２および３と組み合わせてもよい）
− ジフテリアトキソイドなどのジフテリア抗原
− 破傷風トキソイドなどの破傷風抗原
− 典型的にはコンジュゲートされた、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ（Ｈｉｂ）由来のサッカライド抗原
− 不活性化ポリオウイルス抗原
ジフテリア抗原が組成物中に含まれる場合、さらに破傷風抗原および百日咳抗原を含むことが好ましい。同様に、破傷風抗原が含まれる場合、さらにジフテリア抗原および百日咳抗原を含むことが好ましい。同様に、百日咳抗原が含まれる場合、さらにジフテリア抗原および破傷風抗原を含むことが好ましい。したがって、ＤＴＰ組み合わせが好ましい。

Ｈｉｂサッカライドが（典型的には、コンジュゲートとして）含まれる場合には、サッカライド部分は、ポリサッカライド（例えば、細菌から精製されるような全長ポリリボシルリビトールホスフェート（ＰＲＰ））であってもよいが、例えば、加水分解によって、精製されたサッカライドを断片化して、オリゴサッカライド（例えば、約１ｋＤａ〜約５ｋＤａの分子量）を生成することも可能である。組成物中のＨｉｂコンジュゲートの濃度は、通常、０．５μｇ〜５０μｇ、例えば、１〜２０μｇ、１０〜１５μｇ、１２〜１６μｇなどの範囲内である。いくつかの実施形態において、量は、約１５ｇ、または約１２．５μｇであってもよい。５μｇ未満の質量、例えば、１〜５μｇ、２〜４μｇの範囲内、または約２．５μｇが適し得る［８２］。上記にように、Ｈｉｂサッカライドおよび髄膜炎菌サッカライドを含む組み合わせにおいて、前者の用量は、後者の用量（特に、複数の髄膜炎菌血清群に関して、それらの平均質量）に基づいて選択されてもよい。担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）の選択、連結、割合などを含む、Ｈｉｂコンジュゲートのさらなる特性は、髄膜炎菌コンジュゲートについて上記で開示されている通りである。

Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原が含まれる場合には、これは、ポリペプチドまたはサッカライドであってもよい。コンジュゲート莢膜糖は、肺炎球菌に対して免疫化するために特に有用である。サッカライドは、細菌由来のサッカライドの精製中に生じるサイズを有するポリサッカライドであってもよいし、またはそれは、そのようなポリサッカライドの断片化によって達成されるオリゴサッカライドであってもよい。例えば、７価のＰＲＥＶＮＡＲ（商標）製品において、サッカライドのうちの６個は、インタクトのポリサッカライドとして存在し、他方、１個（１８Ｃ血清型）はオリゴサッカライドとして存在する。組成物は、以下の肺炎球菌血清型：１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、および／または３３Ｆのうちの１つまたは複数由来の莢膜糖を含んでもよい。組成物は、複数の血清型、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、またはそれより多くの血清型を含んでもよい。７価、９価、１０価、１１価、および１３価コンジュゲート組み合わせは、当技術分野においてすでに公知であり、２３価の非コンジュゲート化組み合わせも公知である。例えば、１０価の組み合わせは、血清型１、４、５、６Ｂ、７Ｆ、９Ｖ、１４、１８Ｃ、１９Ｆ、および２３Ｆ由来のサッカライドを含んでもよい。１１価の組み合わせは、さらに血清型３由来のサッカライドを含んでもよい。１２価の組み合わせは、１０価の混合物に血清型：６Ａおよび１９Ａ；６Ａおよび２２Ｆ；１９Ａおよび２２Ｆ；６Ａおよび１５Ｂ；１９Ａおよび１５Ｂ；ｒ ２２Ｆおよび１５Ｂを加えてもよい；１３価の組み合わせは、１１価の混合物に血清型：１９Ａおよび２２Ｆ；８および１２Ｆ；８および１５Ｂ；８および１９Ａ；８および２２Ｆ；１２Ｆおよび１５Ｂ；１２Ｆおよび１９Ａ；１２Ｆおよび２２Ｆ；１５Ｂおよび１９Ａ；１５Ｂおよび２２Ｆなどを加えてもよい。担体タンパク質（例えば、ＣＲＭ１９７または破傷風トキソイド）の選択、連結、割合などを含む、肺炎球菌コンジュゲートのさらなる特性は、髄膜炎菌コンジュゲートについて上記で開示されている通りである。組成物は、１つより多いコンジュゲートを含む場合、各コンジュゲートは、同じ担体タンパク質または異なる担体タンパク質を用いてもよい。参考文献８３は、多価肺炎球菌コンジュゲートワクチンにおいて異なる担体タンパク質を用いる場合の潜在的な利点を記載している。

一般
本発明の実施は、他に指示がない限り、当業者の技能の範囲内の化学、生化学、分子生物学、免疫学、および薬理学の従来の方法を用いる。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば、参考文献８４〜９０などを参照されたい。

用語「を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなること（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」に加えて、「を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘ「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、追加の何かを含んでもよく、例えば、Ｘ＋Ｙでもよい。

数値ｘに関しての用語「約」は、任意および平均、例えば、ｘ±１０％である。

本発明が「エピトープ」に関する場合、このエピトープは、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープであってもよいが、通常、Ｂ細胞エピトープである。そのようなエピトープは、実験的に（例えば、ＰＥＰＳＣＡＮ［９１、９２］または類似した方法を用いて）同定することができ、または、それらは（例えば、Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原指標［９３］、マトリックスに基づいたアプローチ［９４］、ＭＡＰＩＴＯＰＥ［９５］、ＴＥＰＩＴＯＰＥ［９６、９７］、神経ネットワーク［９８］、ＯｐｔｉＭｅｒ ＆ ＥｐｉＭｅｒ［９９、１００］、ＡＤＥＰＴ［１０１］、Ｔｓｉｔｅｓ［１０２］、親水性［１０３］、抗原指標［１０４］、または参考文献１０５〜１０９に開示された方法などを用いて）予測され得る。エピトープは、抗体またはＴ細胞受容体の抗原結合部位によって認識され、かつ抗体またはＴ細胞受容体に結合する抗原の一部であり、それらはまた、「抗原決定基」とも呼ばれる場合がある。

２つのアミノ酸配列間の配列同一性パーセンテージへの言及は、アラインメントされた場合、その２つの配列を比較して、そのパーセンテージのアミノ酸が同じであることを意味する。このアラインメントおよび相同性％または配列同一性は、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、参考文献１１０のセクション７．７．１８に記載されたプログラムを用いて決定され得る。好ましいアラインメントは、１２のギャップオープンペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスを含むアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムによって、決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献１１１において開示されている。

単語「実質的に」は、「完全に」を排除せず、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを全く含まなくてもよい。必要な場合、単語「実質的に」は、本発明の定義から除外されてもよい。
上記に加えて、本発明は以下を提供する：
（項目１）
（ｉ）髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域および
（ｉｉ）髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域
を含むプロモータを含む核酸であって、該−１０領域および該−３５領域が、１２〜２０個のヌクレオチドの介在配列によって分離されており、かつ該介在配列が、ポリＧ配列を含有しないか、または８個以下の連続したＧヌクレオチドを有するポリＧ配列を含むかのいずれかである、核酸。
（項目２）
下流のタンパク質コード遺伝子に作動可能に連結されたプロモータを含む核酸であって、前記プロモータが、（ｉ）髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域および／または（ｉｉ）髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域を含む、核酸。
（項目３）
タンパク質の発現のための翻訳制御エレメントを含有する５’ＵＴＲを有するタンパク質コード遺伝子に作動可能に連結された髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来のプロモータ領域を含む核酸。
（項目４）
髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域および髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域を含むプロモータを含む核酸。
（項目５）
配列番号１８、または配列番号１８とは４つまでの単一ヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換だけ異なる配列番号１８の変異体を含むプロモータを含む核酸。
（項目６）
前記−１０領域がＴＡＴＡＡＴであり；
前記髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域がＴＧＧＴＴＴであり；および／または
前記髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域がＴＴＧＡＣＡである、前記項目のいずれか一項に記載の核酸。
（項目７）
−３５領域と−１０領域との間の前記介在配列が１２〜２０個の間のヌクレオチド、例えば、配列番号２７または配列番号２８または配列番号２９を有する、前記項目のいずれか一項に記載の核酸。
（項目８）
前記介在配列が配列ＧＧＧＧＧを含まない、項目７に記載の核酸。
（項目９）
前記−１０配列の下流であるが、転写開始部位の上流の非転写配列が、５〜１０個の間のヌクレオチド、例えば、ＴＧＡＡＧＡＣまたはＴＣＧＣＡＡＣを有する、前記項目のいずれか一項に記載の核酸。
（項目１０）
配列番号３０を含む、前記項目のいずれか一項に記載の核酸。
（項目１１）
配列番号１８またはその変異体、例えば、配列番号３６のヌクレオチド６〜３９、配列番号３７のヌクレオチド６〜３８、または配列番号３８のヌクレオチド６〜３９を含む、前記項目のいずれか一項に記載の核酸。
（項目１２）
前記項目のいずれか一項に記載のプロモータを含むＤＮＡ配列を含む細菌発現ベクター。
（項目１３）
前記項目のいずれか一項に記載のプロモータを含むＤＮＡ配列を含む髄膜炎菌。
（項目１４）
前記プロモータが外膜タンパク質の発現を駆動させる、項目１３に記載の髄膜炎菌。
（項目１５）
前記外膜タンパク質がｆＨｂｐである、項目１４に記載の髄膜炎菌。
（項目１６）
前記細菌が、活性ＭｌｔＡを発現しない、項目１３〜１５のいずれか一項に記載の髄膜炎菌。
（項目１７）
前記細菌がＳｙｎＸおよび／またはＬｐｘＬ１のノックアウトを有する、項目１３〜１６のいずれか一項に記載の髄膜炎菌。
（項目１８） 血清群Ｂを有する、項目１３〜１７のいずれか一項に記載の髄膜炎菌。
（項目１９） 血清群Ｗ１３５を有する、項目１３〜１７のいずれか一項に記載の髄膜炎菌。
（項目２０） 免疫型Ｌ３を有する、項目１３〜１９のいずれか一項に記載の髄膜炎菌。
（項目２１） 項目１３〜２０のいずれか一項に記載の髄膜炎菌から調製される外膜小胞。
（項目２２） 項目２１に記載の小胞を含む免疫原性薬学的組成物。
（項目２３） 髄膜炎菌由来の１つまたは複数のコンジュゲート化莢膜サッカライドを含む、項目２２に記載の組成物。
（項目２４）
哺乳動物において免疫応答を生じさせるための方法であって、項目２２または項目２３に記載の組成物を該哺乳動物に投与することを含む、方法。

図１は、５つの異なるプロモータを用いる同じバックグラウンドの菌株（ＮＺ９８／２５４）、および同じバックグラウンドにおいて同じｆＨｂｐ対立遺伝子を過剰発現するベンチマーク株［１１２、１１３］における、ｆＨｂｐ発現レベルを示す。ｆＨｂｐの変異体２対立遺伝子が、ベンチマーク株において、またはスペーサー区間（ｔｒａｃｔ）において１１個のＧもしくは１３個のＧのいずれかを含むｐｏｒＡプロモータの２つの野生型相変異体（ｗｉｌｄｔｙｐｅ ｐｈａｓｅ ｖａｒｉａｎｔ）のいずれかから、または示されているような改変型ＳＴ１ ｐｏｒＡプロモータ、ＳＴ２ ｐｏｒＡプロモータ、およびＳＴ３ ｐｏｒＡプロモータを用いて、過剰発現させた。総タンパク質の等価量のウェスタンブロッティングを、各菌株について示されているように０．５×〜２×でロードされ、矢印はｆＨｂｐを示す。 図２は、ｐｏｒＡおよび１６Ｓの改変型プロモータからのｆＨｂｐ発現の比較分析を示す。示されたプロモータの制御下でｆＨＢＰ変異体２を発現するＮＺ９８／２５４株を、プレート上で（Ａ）、および液体中で対数期まで（Ｂ）、および液体中で定常期まで（Ｃ）増殖させ、ｆＨＢＰ発現のレベルを、２重の培養物（＃１、＃２）からの、またはベンチマーク過剰発現株からのウェスタンブロットにより測定した。実線の矢印はｆＨｂｐを示し、他方で下の方の破線の矢印はロード対照（ｌｏｄｉｎｇ ｃｏｎｔｒｏｌ）を示す。 図３は、３つの菌株：（ａ）ΔｌｐｘＬ１ノックアウト；（ｂ）ΔｓｙｎＸノックアウト；および（ｃ）ΔｌｐｘＬ１ΔｓｙｎＸ二重ノックアウトからのｆＨｂｐの発現を示す。全ての場合において、ノックアウトされた遺伝子（複数可）は、改変型ＰｏｒＡプロモータの制御下でｆＨｂｐに置換された。ｆＨｂｐの発現を、抗ｆＨｂｐ血清を用いる粗細胞抽出物におけるウェスタンブロットによって評価し、対照としてのＨｆｑと比較した。図３Ａは、ウェスタンブロットを示し、図３Ｂは、発現を任意の単位で定量化している。 図４は、（ｉ）ΔｌｐｘＬ１ΔｓｙｎＸノックアウト株および（ｉｉ）ΔｌｐｘＬ１ΔｓｙｎＸΔｍｌｔＡノックアウト株から単離された小胞におけるｆＨｂｐレベルを示す。図４Ａは、ｍｇ／ＯＤでの収量を示し、図４Ｂは、０．５μｇの小胞のウェスタンブロットである。 図５は、別個の遺伝子座において変異体１ ｆＨｂｐもしくは変異体２ ｆＨｂｐのいずれかを過剰発現する２つの菌株（レーンｃおよびｄ）、またはそれぞれの遺伝子座で変異体１と変異体２の両方を過剰発現する菌株（レーンｅ）におけるｆＨｂｐの過剰発現を示す。レーンａは野生型株であり、レーンｂは、その株のΔｆＨｂｐノックアウトである。 図６は、三重ノックアウトから精製された小胞の銀染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。

改変型ＰｏｒＡプロモータ
スペーサー領域に１１個の連続したＧ、および１３個の連続したＧを含有する、野生型髄膜炎菌ｐｏｒＡプロモータの２つの相変異体の転写開始部位の上流の配列は以下の通りであり、−３５領域および−１０領域に下線が引かれている：

−３５領域と−１０領域との間の介在配列は、ＰｏｒＡ発現の相変異に関連するＧ_１１ポリＧ配列を含む。このプロモータからの発現を安定化させるために、以下の３つの改変を試験した（改変は小文字）：

したがって、「ＳＴ１」において、Ｇ_１１配列は、３カ所で中断され、３個以下の連続したＧ残基になった。「ＳＴ２」において、同じ介在配列が用いられたが、−３５領域は、コンセンサス−３５領域ＴＴＧＡＣＡによって置換された。「ＳＴ３」において、追加のＴ残基が、−３５領域のすぐ下流に挿入された。

これらの３つのプロモータを用いて、ＮＺ９８／２５８株においてｆＨｂｐ配列（ｆＨｂｐ変異体２）の発現を駆動させた。全ての３つの改変型プロモータは、文献［１１２、１１３］に報告されている同等に過剰発現する菌株と比較した場合、その菌株におけるｆＨＢＰの高レベルの過剰発現を生じさせた。最良の発現は、ＳＴ２において見られた（図１および２）。

改変型ｒＲＮＡプロモータ
さらなる実験において、１６Ｓ ｒＲＮＡプロモータを、ｐｏｒＡ遺伝子の５’ＵＴＲに融合させた：

このプロモータを変異に供し、−３５領域の下流の３つの変異体が以下の通り配列決定された：

したがって、変異体＃５および変異体＃６において、−１０配列は５−ｍｅｒであり、変異体＃６はまた、−１０領域と転写開始部位との間に１個のヌクレオチドを欠損した。変異体＃８において、−１０領域およびその下流配列は、野生型と同じであるが、−３５領域と−１０領域との間の介在配列は、野生型より１ヌクレオチド短い。

改変型プロモータからのｆＨｂｐの発現
これらのプロモータを、ｐｏｒＡ遺伝子の５’ＵＴＲ領域に融合させ、それらを用いて、ｆＨｂｐコード配列の発現を駆動させた。図２、変異体＃５および変異体＃６で見られるように、変異体＃５および変異体＃６は、ＳＴ２において見られたレベルに迫る最も強い発現を示した。

下流から転写領域まで、さらに上流にまで及ぶ、野生型プロモータ（配列番号３５）にわたる完全な領域は以下の通りであり（配列番号４１；３５８ｍｅｒ）、−３５領域および−１０領域は下線が引かれ、ならびに（参考文献１０に従って）ヌクレオチド＋１は二重下線が引かれている。

同様に、変異体＃５および変異体＃６についての周囲配列は以下の通りであった：

これらのより長い配列のいずれかが本発明と共に用いることができるが、本明細書で述べられているような改変が、当然のことながら、なされ得る。

変異体プロモータの制御下のｆＨｂｐ遺伝子を、髄膜炎菌（ＮＺ９８／２５４株）の染色体中へ、内因性ｌｐｘＬ１遺伝子および／またはｓｙｎＸ遺伝子の代わりに安定的に挿入した。ｓｙｎＸ遺伝子座においてわずかに高い発現レベルが見られ、両方の挿入（ΔｌｐｘＬ１ΔｓｙｎＸ二重ノックアウト）を有する菌株についての発現は、個々の遺伝子座からの発現の合計であった（図３）。

２つの異なるｆＨｂｐ変異体（１および２）を改変型ＰｏｒＡプロモータの制御下で発現する菌株もまた作製された。両方の変異体の共発現は、それぞれ別個の遺伝子座からの発現に対して顕著な悪影響を与えず、それどころか、相加的な効果を生じた（図５）。

ΔｌｐｘＬ１ΔｓｙｎＸ二重ノックアウトにおける内因性ｍｌｔＡ（ＧＮＡ３３）遺伝子のノックアウトはさらに、発現レベルを増加させ、ｆＨｂｐタンパク質の菌株の小胞への局在化対して悪影響を及ぼさなかった。図４は、これらの菌株から単離された小胞におけるｆＨｂｐレベルを示し、（Ａ）培養物の光学密度（ＯＤ）に対するタンパク質の収量（ｍｇ）、および（Ｂ）０．５μｇの小胞に対する抗ｆＨｂｐウェスタンブロットを示している。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、三重ノックアウト菌株におけるｆＨｂｐバンドが、小胞において、ＰｏｒＡおよびＰｏｒＢと共に、最も大量のタンパク質の１つであったことを示している（図６）。

本発明は単なる例として、上で記載されており、本発明の範囲および精神の範囲内に留まりながら改変がなされ得ることは理解されるだろう。

Claims (9)

1. 髄膜炎菌ｐｏｒＡ遺伝子プロモータ由来の−１０領域および髄膜炎菌ｒＲＮＡ遺伝子プロモータ由来の−３５領域を含むプロモータを含む核酸であって、配列番号３６、配列番号３７または配列番号３８を含む、核酸。
2. 請求項１に記載のプロモータを含むＤＮＡ配列を含む細菌発現ベクター。
3. 請求項１に記載のプロモータを含むＤＮＡ配列を含む髄膜炎菌。
4. 前記プロモータが外膜タンパク質の発現を駆動させ、該外膜タンパク質がｆＨｂｐである、請求項３に記載の髄膜炎菌。
5. 前記細菌が、活性ＭｌｔＡを発現せず、ならびに／あるいは前記細菌がＳｙｎＸおよび／またはＬｐｘＬ１のノックアウトを有する、請求項３〜４のいずれか一項に記載の髄膜炎菌。
6. 血清群Ｂを有する、請求項３〜５のいずれか一項に記載の髄膜炎菌。
7. 請求項３〜６のいずれか一項に記載の髄膜炎菌から調製される外膜小胞。
8. 請求項７に記載の小胞を含む免疫原性薬学的組成物。
9. 髄膜炎菌由来の１つまたは複数のコンジュゲート化莢膜サッカライドを含む、請求項８に記載の組成物。

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