MX2007004035A - Vesciculas bacterianas inmunogenicas con proteinas de membrana externa - Google Patents

Abstract

La supresión de expresión del homólogo meningocócico mltA da bacterias que liberan espontáneamente vesículas que son ricas en proteínas de membrana externa inmunogénicas y que pueden inducir respuestas de anticuerpos de protección cruzada con títulos bacterianos más altos que OMVs preparadas por procedimientos de producción normales. Por lo tanto, la invención provee una bacteria que tiene unamutación"knockout"de su gen mltA. La invención también provee una bacteria, en donde la bacteria:(i) tiene una pared celular que incluye peptidoglican;y (ii) no expresa una proteína que tiene la actividad de transglicosilasa lítica de proteína mltA. La invención también provee composiciones que comprenden vesículas que, durante el cultivo de bacterias de la invención, son liberadas al medio de cultivo.

Description

VESICULAS BACTERIANAS INMUNOGENICAS CON PROTEINAS DE MEMBRANA EXTERNA Todos los documentos citados aquí son incorporados por referencia en su totalidad.

Campo de la Invención Esta invención está en el campo de preparación de vesículas para propósitos de inmunización.

Antecedentes de la Invención Uno de los diversos enfoques para inmunizar contra infección de N.meningitidis es usar vesícula de membrana externa (OMVs) . Una vacuna de OMV eficaz contra serogrupo B ha sido producida por el Norwegian Nacional Institute of Public Health (Instituto Nacional Noruego de Salud Pública) [v.gr., referencia 1] pero, aunque esta vacuna es segura y evita enfermedad de MenB, su eficacia es limitada a la cepa homologa usada para hacer la vacuna. La vacuna * RIVM' se basa en OMVs que contienen seis diferentes subtipos de PorA. Se han mostrado que es inmunogénico en niños en pruebas clínicas de fase II [2] . La referencia 3 describe la vacuna contra serotipos de meningococos de serogrupo B basados en OMVs que retiene un complejo de proteína de 65-kDa. La referencia 4 describe una Ref. 180877 vacuna que comprende OMVs de cepas meningocósicas manipuladas por ingeniería genética, en donde OmVs comprende: por lo menos una proteína de membrana externa (OMP) de clase 1 pero no comprende una OMP de clase 2/3. La referencia 5 describe OMVs que comprenden OMPs que tienen mutaciones en sus bucles de superficie y OMVs que comprenden derivados de lipopolisacárido meningocósico (LPS) . Igual que N.meningi idis de serogrupo B, las vesículas se han preparado para otras bacterias. La referencia 6 describe un procedimiento para preparar vacunas a base de OMV para meningococos de serogrupo A. Las referencias 7 y 8 describen vesículas de N. gonorrhoeae. La referencia 9 describe preparaciones de vesícula de N. lactamica . Las vesículas también se han preparado a partir de Moraxella catarrhalis [10,11], Shigella flexneri [12,13], Pseudomonas aeruginosa [12,13], Porphyromonas gingivalis [14] , Treponema pallidum [15] , Haemophilus influenzae [16 y 21] y Helicobacter pylori [17] . La falla de OMVs para inducir protección cruzada contra cepas no homologas es bien entendida, particularmente puesto que la mayoría de los aislados de N.meningitidis comparten un número pequeño de antígenos de superficie protectores conservados que, si están presentes en OMVs, se esperaría que proveyeran amplia cobertura protectora. Una posible explicación para la falla es la existencia de antígenos de superficie inmuno-dominantes variables que evitan que los antígenos conservados ejerzan su acción protectora, y la presencia de proteínas hipervariables inmuno-dominantes tales como PorA ha sido extensivamente documentada y demostrada. Otras posibles explicaciones son que los métodos para preparación de OMV dan por resultado contaminación con proteínas citoplásmicas y/o de membrana externa que diluyen las proteínas de membrana externa protectora, o los antígenos se pierden por la extracción con detergente. Ha habido varias propuestas para mejorar la eficacia de OMV. La referencia 18 describe composiciones que comprenden OMVs complementadas con proteínas de unión de transferina (v.gr., TbpA y TbpB) y/o Cu, Zn-superóxido dismutasa. La referencia 19 describe composiciones que comprenden OMVs complementadas por varias proteínas. La referencia 20 describe preparaciones de vesículas de membrana obtenidas de N.meningitidis con un gen fur modificado. La referencia 21 enseña que la expresión de nspA sería regulada ascendentemente con porA y cps "knockout" concomitantes. Mutantes "knockout" adicionales de N. meningitidis para la producción de OMV se describen en las referencias 21 a 23 . A diferencia de estos intentos para mejorar OMVs al cambiar los patrones de expresión, la referencia 24 se enfoca en el cambio de los métodos para la preparación de OMV, y enseña que los antígenos tales como NspA podrían ser retenidos durante la extracción de vesículas al evitar el uso de detergentes tales como desoxicolato . Un objeto de la invención es proveer preparaciones de vesículas adicionales y mejoradas, junto con procedimientos para su preparación. En particular, un objeto de la invención es proveer vesículas que retengan componentes inmunogenicos bacterianos importantes de N.meningitidis .

Sumario de la Invención La invención se basa en el sorprendente descubrimiento de que la perturbación de las vías implicadas en degradación de peptidoglican (la capa de mureína) da bacterias que liberan vesículas en su medio de cultivo, y que estas vesículas son ricas en proteínas de membrana externa inmunogénicas y pueden inducir respuestas inmunes bactericidas de alto alcance. Las vesículas son diferentes de las OMVs que pueden ser preparadas al perturbar bacterias enteras (v.gr., por sonicación y extracción con sarcosilo [25] ) , y se pueden preparar sin perturbar incluso células bacterianas v.gr., simplemente al separar las vesículas de las bacterias mediante un procedimiento tal como centrifugación . En particular, los inventores han encontrado que la supresión de expresión del homólogo ltA meningocósico (también referido como ' GNA33 ' o " MB0033' [ 26 ] ) conduce a la liberación espontánea de vesículas que son ricas en proteínas de membrana externa inmunogénicas y que pueden inducir respuestas de anticuerpo de protección ampliamente cruzada con títulos bactericidas más altos que OMVs preparados mediante procedimientos de producción normal . Esta eficacia incrementada es sorprendente por dos razones: primero, la proteína NMB0033 ha sido anteriormente reportada como altamente efectiva en producir anticuerpos bactericidas (v.gr., véase tabla 1 de la referencia 196 ) y ser un candidato de vacuna fuerte (v.gr., véase tabla 2 de ka referencia 27 ) , con una recomendación en la referencia 28 de que debe ser ascendentemente regulada para producción de vesículas, de modo que su pérdida a priori se esperaría que redujera la eficacia bactericida más que incrementarla; segundo, las cepas "knockout" no tienen la organización topológica correcta de la membrana celular, y las proteínas de constituyentes principales de OMVs normales (v.gr., las proteínas de membrana externa de clase 4 y clase 5 PorA, PIB, ) se ha reportado anteriormente que son liberadas en el medio de cultivo [ 25 ] . Los inventores ahora han encontrado que la liberación anteriormente reportada no implica la secreción de proteínas discretas, sino que más bien las proteínas de membrana externa son liberadas en forma de vesículas. Estas vesículas son ventajosas sobre OMVs preparadas simplemente y eficientemente sin los métodos de alteración y purificación complicados y que consumen tiempo que normalmente se usan para preparar OMVs. Por lo tanto, la invención provee una bacteria que tienen una mutación "knockout" de su gen mltA. La bacteria preferiblemente tiene también una mutación "knockout" de por lo menos un gen adicional v.gr., los genes porA y/o porB y/o lpxA. La invención también provee una bacteria, en donde: (i) la bacteria tiene una pared celular que incluye peptidoglican; y (ii) la bacteria no expresa una proteína que tiene la actividad de transglicosilasa lítica de la proteína MltA. La bacteria es preferiblemente una bacteria mutante es decir, la bacteria es una cepa mutante de una especie de tipo silvestre que expresa proteína MltA. La bacteria preferiblemente no expresa tampoco por lo menos una proteína adicional v.gr., las proteínas PorA y/o PorB y/o Lpxa. Las bacterias referidas de la invención son del género Neisseria , tal como JV meningitidis, y por tanto la invención provee una bacteria meningocócica que tiene una mutación "knockout" de su gen gna.33. Un meningococo preferido es gna33~ laxA' PorA'. La invención también provee una composición que comprende vesículas que, durante el cultivo de bacterias de la invención, son liberadas al medio de cultivo. Esta composición preferiblemente no comprende ninguna bacteria viva y/o entera. Esa composición se puede usar para preparación de vacunas . La invención también provee una composición que comprende vesículas, en donde las vesículas están presentes en el filtrado obtenible después de filtración a través de un filtro 0.22 um de un medio de cultivo en el cual la bacteria de la invención ha sido crecida. Esa composición se puede usar para preparación de vacuna. La invención también provee una vesícula meningococica, en donde la vesícula no incluye por lo menos de (es decir, no incluye 1, 2 ó 3 de) MinD, FtsA, y/o fosfoenolpiruvato sintasa. La invención también provee una vesícula meningococica, en donde la vesícula no incluye por lo menos una de las proteínas de NMB 0126, 0154, 0157, 0171, 0219, 0359, 0387, 0426, 0595, 0617, 0618, 0631, 0757, 0763, 0875, 0876, 09435 0946, 0957, 1131, 1252, 1323, 1341, 1445, 1497, 1574, 1576, 1869, 1934, 1936, 2096 y/o 2101. La invención también provee una vesícula meningococica, en donde la vesícula es sustancialmente libre de ribosomas. La invención también provee una vesícula meningococica, en donde la vesícula es sustancialmente libre de cualquier aminoácido-AR t-sintetasas . La invención también provee una vesícula meningococica, en donde la vesícula es sustancialmente libre de cualquier enzima de ciclo de Krebs . Estas vesículas tampoco incluirán MltA (debido a la mutación "knockout"), pero incluirán proteínas de membrana externa. Las vesículas pueden incluir proteínas de membrana externa triméricas ( figura 13 ) . La invención también provee una vesícula meningococica, que incluye las siguientes 47 proteínas : NMB0035, MB0044 , MB0086 , MB0088 , MMB0109 , NMB0124, MB0138, MB0182 , MB0204 , NMB0278 , MMB0294, B0313 , NMB0345 , NMB0346 , NMB0382 , NMB0460, MB0461 , MB0550, MB0554, MB0623 , NMB0634, MB0663 , NMB0703 , NMB0787 , MB0873 , MB0928, MB1030, NMB1053 , MB1057, MB1126, MB1285, MB1301, NMB1332, NMB1429, NMB1483 , NMB1533, MB1567, MB1612 , MB1710, MB1870, NMB1898 , NMB1949 , MB1961, MB 1972, NMB1988, MB2039 y NMB2091. La invención también provee una vesícula meningococica, que incluye uno o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, ó 19) de las siguientes 19 proteínas: MB0044, MB0086, MMB0204, NMB0278, B0294, NMB0313, NMB0345, NMB0346, MB0460, NMB0550, MB0873, MB0928, MB1030, NMB1057, MB1483, NMB1870, MB1898, NMB1961, y/o MB2091. Véase también Tabla 4 siguiente . La invención también provee una composición que comprende un primer conjunto de vesículas de la invención y un segundo conjunto de vesículas de la invención, en donde el primer y segundo conjunto se preparan a partir de diferentes cepas de meningococos . La invención también provee un procedimiento para preparar una mezcla de vesículas que comprende: (a) preparar vesículas de la invención a partir de una primera cepa meningocócica; (b) preparar vesículas de la invención a partir de una segunda cepa meningocócica; y (c) combinar las vesículas de (a) y (b) . La combinación de vesículas de diferentes cepas puede mejorar la cobertura de cepas clínicas. La invención también provee un procedimiento para preparar vesículas bacterianas, que comprende los pasos de: (i) cultivar una bacteria MltA" en un medio de cultivo de tal manera que la bacteria libera vesículas en medio; y (ii) recolectar las vesículas del medio. La bacteria MltA" es preferiblemente un mutante "knockout" MltA. Las vesículas también pueden ser recolectadas por separación de tamaño (v.gr., filtración, mediante el uso de un filtro que permite que las vesículas pasen a través del mismo pero que no permite que bacterias intactas pasen a través del mismo) , que pueden ser convenientemente llevadas a cabo después de centrifugación para formar preferentemente pastillas de células en relación con vesículas pequeñas (v.gr., centrifugación de baja velocidad) .

Metabolismo de peptidoglican El peptidoglican (también conocido como mureína, mucopéptido o glicosaminopéptido) es un heteropolímero encontrado en la pared celular de la mayoría de las bacterias . El peptidoglican es el componente que es principalmente responsable de la resistencia mecánica de la pared celular bacteriana y de mantener la forma de la célula. En las bacterias Gram-positivas, es el principal componente de la pared celular. En las bacterias Gram-negativas se presenta como una capa entre la membranas citoplásmica y externa, y está covalentemente enlazada a la membrana externa mediante la lipoproteína Braun. El peptidoglican principalmente de cadenas de estructura de base de heteropolisacárido lineales que son entrelazadas por péptidos "madre" para formar una estructura de retícula. Es un polímero tan grande que se puede pensar como una sola molécula inmensa covalentemente enlazada. En E.coli , la estructura de base del sacárido se forma al alternar residuos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetilmurámico (MurNAc) . Un residuo de MurNAc puede ser enlazado a un tetrapéptido madre. Los entrelazamientos entre cadenas de estructura de base usualmente se forman directamente entre D-alanina en un péptido madre y un meso-DAP de otro. La estructura de E.coli es típica para bacterias Gram-negativas , pero hay más variación dentro de bacterias Gram-positivas v.gr., en S. aureus 30-50% los residuos de ácido murámico no son acetilados, el péptido madre a menudo tiene L-lysine en lugar de meso-DAP e isoglutamina en lugar de D-glutamato, y los entrelazamientos pueden ocurrir entre péptidos madre. El paso inicial en la biosíntesis de peptidoglican de E.coli es la formación del derivado de UDP de GlcNAc, que ocurre en el citoplasma. Algún UDP-GlcNAc es convertido a UDP-MurNAc en una reaccón de UDP-GlcNAc y fosfoenolpiruvato (PEP), catalizado por PEP : UDP-GlcNAc enolpiruvil transferasa. Aún dentro del citoplasma, los aminoácidos se añaden secuencialmente a UDP-MurNAc para formar un UDP-MurNAc-pentapéptido conocido como el "nucleótido de Park" que incluye una D-alanil-D-alanina terminal. El nucleótido de parque es después transferido a monofosfato de bactoprenol en la membrana citoplásmica, en donde UDP-GlcNAC también se añade para hacer una subunidad de bactoprenol-disacárido-pentapéptido . La subunidad de disacárido-pentapéptido es después transferida a la región periplásmica, y el bactoprenol-pirofosf to permanece en la membrana. Dentro del periplasma, la subunidad transferida es insertada en un peptidoglican en crecimiento. Para permitir la división celular, cambios en la forma e importación/exportación de complejos grandes (durante la conjugación) entonces la degradación de peptidoglican debe ocurrir. En E.coli esta degradación es causada por enzimas referidas como mure na hidrolasas [ 29 ] , que como una familia incluye transglicosilasas l ticas (mltA, mltB, mltC, ltD, slt70, emtA) , endopeptidasas (pbp4, pbp7, epA) y amidasas (amiC) . Las muramidasas tales como lisozima digieren los mismos enlaces B- ( 1-4 ) -glicosídico entre residuos MurNAc y GlcNAc; a diferencia de las muramidasas, sin embargo, las transglicosilasas digieren el enlace glicosídico con formación concomitante de residuos de 1 , 6-anhidromuramoilo (AnhMurNAc) . Las vías anabólica y catabólica de peptidoglican estándares están por lo tanto bien caracterizadas, como son las variaciones y modificaciones menores que ocurren entre bacterias. Las enzimas son bien caracterizadas y las proteínas han sido fácilmente indicadas como implicadas en las vías cuando las nuevas secuencias genómicas bacterianas han sido publicadas. El experto en la técnica por lo tanto puede determinar fácilmente las enzimas implicadas en las vías metabólicas de peptidoglican para cualquier bacteria dada, pueden identificar fácilmente las enzimas implicadas, y pueden identificar fácilmente los genes que codifican estas enzimas . La invención se basa en la supresión de expresión del gen mltA, que codifica una transglicosilasa lítica unida a membrana. La familia MltA es reconocida en INTERPRO (entrada "ipr005300") y PFAM (entrada "MltA" o "PF03562"), y el registro de PFAM da una lista de proteínas MltA en bacterias tan diversas como Rhizobium loti, Bradyrhizobium japonicum, Brucella melitensis, Brucella suis, Rhizobium meliloti , Agrohacterium tumefaciens, Zymo onas mobilis, Caulobacter crescentus, Yersinia pestis, Salmonella typhimurium, Budinera aphidicola, Photorhabdus luminescens, Escherichia coli, Shigella flexneri, Salmonella typhi, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Coxiella burnetii , Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Vibrio parahaemolyticus, Haemophilus ducreyi, Pasteurella multocida, Chro obacterium violaceum, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella pertussis, Nitrosomonas europaea, Ralstonia solanacearum, Synechococcus elongatus, Gloeobacter violaceus, y Leptospira inteirogans . Las bacterias preferidas para supresión de expresión de MltA en el género Neisseria, en donde N. meningitidis es la bacteria más preferida. El gen MltA en N. meningitidis serogrupo B ha sido referido a la literatura como "GNA33" [25,26,196]; y una secuencia de ejemplo en número de acceso al banco de genes GenBank "AF226391.1" . El gen MltA en el serogrupo (" MA0279") tiene un número de acceso a banco de genes GenBank NP_283118.1. Las formas polimórficas alineadas de MltA meningocosicas se pueden ver en las figuras 7 y 18 de la referencia 30. Dos secuencias de genoma de N.meningitidis están disponibles [31,32]. Para cualquier cepa dada de N.meningitidis, por lo tanto, el experto en la técnica podrá identificar el gen mltA. Para meningococo, el gen mltA knocked-out es preferiblemente el gen que, en la cepa de tipo silvestre, tiene la identidad de secuencia más alta para SEQ ID NO: 1 aquí. MltA es una lipoproteína en meningococo [26] . La supresión de expresión (knockout) de mltA puede dar como resultado virulencia reducida, separación de células anormal, morfología de células anormal, septos no divididos, septos dobles, agregación de células y compartición de membranas externas [25] . Al mismo tiempo, sin embargo, se ha encontrado sorprendentemente que la mutación "knockout" da bacterias que pueden producir vesículas que son inmunogénicas y enriquecidas en proteínas de membrana externa.

Bacteria La bacteria de la cual se preparan vesículas puede ser Gram-positiva, pero es preferiblemente Gram-negativa . La bacteria puede ser el género Moraxella, Shigella, Pseudomonas, Treponema, Porphyromonas o Helicobacter (véase lo anterior para especies preferidas) pero preferiblemente es del género Neisseria. Especies Neisseria preferidas son N.meningitidis y N. gonorrhoeae.

Dentro de N.meningitidis cualesquiera de los serogrupos A, C, W135 y Y se pueden usar, pero se prefiere preparar vesículas del serogrupo B. En donde es relevante, el meningococo puede ser de cualquier serotipo (v.gr., 1, 2a, 2b, 4, 14, 15, 16, etc.) , de cualquier serosubtipo (Pl.2; Pl.4; P1.5; Pl .5 , 2 ; Pl.7,16; Pl.7,16b; Pl .9 ; Pl.9,15; Pl.12,13; P1.13; P1.14; Pl.15; Pl.21,16; Pl.22,14; etc.) y de cualquier inmunotipo (v.gr., Ll; L33,7; LIO; etc.) , y las bacterias preferidas incluyen: B: 4: Pl.4; B: 4: Pl.15; B : 15 :pl .7 , 16. El meningococo puede ser de cualquier linaje adecuado, que incluyen linajes hiperinvasivos e hipervirulentos , v.gr., cualquiera de los siguientes siete linajes hipervirulentos: subgrupo I; subgrupo III; subgrupo IV- 1; complejo ET-5; complejo ET-37; agregación A4; linaje 3. Estos linajes han sido definidos por electroforesis de enzima multilocus (MLEE) , pero la tipificación de secuencia multilocus (MLST) también se ha usado para clasificar meningococos [ref.33] v.gr., el complejo ET-37 es el complejo ST-11 por MLST, el complejo ET-5 es ST-32(ET-5) , linaje 3 es ST-41/44, etc. Las cepas preferidas dentro del serogrupo B son MC58, 2996, H4476 y 394/98. En algunas modalidades de la invención, sin embargo, el meningococo no es la cepa MC58 y no es la cepa BZ232. Igual que tener una supresión de expresión de mltA, la bacteria puede tener una o más mutaciones "knockout" de otros genes. Para reducir la actividad pirogénica, por ejemplo, la bacteria debe tener niveles de endotoxina bajos (LoS/LPS) , y esto se puede lograr mediante supresión de expresión de enzimas implicadas en la biosíntesis de LPS . Las bacterias mutantes adecuadas son ya conocidas v.gr., imitante Neisseria [34,35] y imitante Helicobacter [36] . El mutante laxa de meningococo es preferido. Los procedimientos para preparar membranas externas con LPS agotado de bacterias Gram-negativas se describen en la referencia 37. En N. meningitidis, una supresión de expresión preferida es la proteína de membrana externa de clase I PorA. Ventajosamente, esas supresiones no desplegarán la proteína PorA específica de cepa hipervariable inmunodominante, de modo que se enfoca en una respuesta inmune del receptor sobre otros antígenos. En un aspecto específico, la invención provee una bacteria N. meningitidis, que comprende tanto una mutación "knockout" MltA como una mutación "knockout" de PorA. La bacteria también puede llevar a cabo mutaciones "knockout" v.gr., en vías de síntesis de LOS/LPS (v.gr., laxA) , proteínas variables inmunodominantes , PorB, OpA, OpC, etc . Igual que tener supresiones de genes endógenos particulares, la bacteria puede expresar uno o más genes que no son endógenos. Por ejemplo, la invención puede usar una cepa recombinante que exprese nuevos genes en relación con la cepa de tipo silvestre correspondiente. Aunque se prefiere suprimir la expresión de PorA, en un enfoque alternativo si es posible manipular por ingeniería genética un meningococo para expresar subtipos PorA múltiples (v.gr., 2, 3, 4, 5 ó 6 de subtipos PorA: Pl.7,16; Pl .5 , 2 ; Pl.19,15; Pl.5c,10; Pl.12,13; y pl.7h,4 [v.gr., referencias 38, 39]) . La expresión de genes no endógenos de esta manera se puede regular mediante varias técnicas v.gr., inserción cromosómica (como se usa para introducir múltiples genes PoA [40] ) , mutaciones "knockout", expresión de vectores extracromosómicos (v.gr., de plásmidos) , etc. Igual que la regulación descendente de la expresión de proteínas específicas, la bacteria puede sobreexpresar (en relación con la cepa de tipo silvestre correspondiente) inmunogenes tales como NspA, proteína 287 [19], proteína 741 (41], TbpA [18], TbpB [18], superóxido dismutasa [18], etc. La bacteria también puede incluir una o más mutaciones "knockout" y/o de sobre expresión descritas en la referencia 16, 21-24 y/o 42-43. Los genes preferidos para regulación descendente y/o supresión de expresión incluyen: (a) Cps, CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [16]; (b) CtrA, CtrB, CtrC, CtrD, FrpB, GalE, HtrB/MsbB, LbpA, LbpB, LpxK, Opa, Ope, P oP, PilC, PmrE, PmrF, PorA, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [21]; (c) ExbB, ExbD, rmpM, CtrA, CtrB, CtrD, GalE , LbpA, LpbB, Opa, Ope, PilC, PorA, PorB, SiaA, SiaB, SiaC, SiaD, TbpA, y/o TbpB [42]; y (d) CtrA, CtrB, CtrD, FrpB, OpA, OpC, PilC, PorA, PorB, SiaD, SynA, SynB, y/o SynC [43] . Para composiciones meningocósicas , se pueden usar los criterios de selección de la referencia 44. Las vesículas preferidas se preparan a partir de meningococos que tienen uno de los siguientes subtipos: P 1.2; Pl.2,5; Pl .4 ; Pl .5 ; Pl .5 , 2 ; Pl .5 , c ; Pl.5c,10; Pl.7,16; Pl.7,16b; Pl.7h,4; Pl .9 ; Pl.15; Pl.9,15; Pl.12,13; Pl.13; P1.14; Pl.21,16; Pl.22,14. El meningococo está preferiblemente en el serogrupo B. Las vesículas también se pueden preparar a partir del género Escherichia, tal como las especies E.coli. Cepas de E.coli han sido clasificadas tradicionalmente ya sea como comensales o patógenas, y las cepas patógenas son entonces subclasificadas como cepas intestinales o extraintestinales . La clasificación también se puede basar en antígenos "K" . El antígeno "K" mejor estudiado es "Kl", que se considera que es el principal determinante de virulencia entre aquellas cepas de E.coli que causan meningitis neonatal. Las vesículas de la invención se pueden preparar a partir de cualquiera de las cepas de E.coli, pero preferiblemente son de la cepa patógena, con la inclusión de la cepa patógena extraintestinal ("ExPEC" [45]), una cepa uropatogénica (UPEC) o cepas de meningitis /asociada con sepsia (MNEC) . Las secuencias de genoma de cepas patogénicas están disponibles en las bases de datos bajo números de acceso AE005174, BA000007 y NC-004431. Más que usar una supresión de expresión de mltA, puede ser preferido suprimir la expresión de uno o más de los componentes de complejo Tol-Pal de E.coli [46], tales como tolA, Tolú, Tolú, pal y/o tolR. La supresión de expresión de tolR es preferida. Los meningococos no tienen un homólogo del sistema Tol-Pal.

Composiciones de vesícula La invención provee las vesículas que son espontáneamente liberadas al medio de cultivo por bacteria de la invención. Estas vesículas son distintas de las vesículas que pueden ser preparadas artificialmente a partir de las mismas bacterias, tales como OMVs extraídas con sarkosil preparadas en la referencia 25 de meningococo "? GNA33". También son distintas de las microvesículas (MVs [47] y "OMVs" nativas ("NOMVs" [64]), aunque las vesículas de la invención parecen ser más similares a MVs y NOMVs que a OMVs extraídas con sarcosilo. Las vesículas también son distintas de las ampollas, que son proyecciones de la membrana externa que permanecen unidas a bacterias antes de liberarse como MVs [48, 49] .

Las vesículas de la invención tienen un diámetro de 50-100 nm, por microscopía electrónica, que es menor que el de OMVs meningocósicas arificiales (diámetro de -270 nm [ 50 ] ) . El diámetro es aproximadamente el mismo que el de OMVs artificiales que han sido desnaturalizados con calor (~ 105 nm [ 50 ] ) , pero las vesículas de la invención han retenido antigenicidad mientras que OMVs artificiales desnaturalizadas con calor pierden su antigenicidad. Más aun, las vesículas de la invención (a diferencia de MVs, OMVs y NOMVs) son sustancialmente libres de contaminación citoplásmica . Las vesículas de la invención preferiblemente contienen no más de 20% en peso de LOS/LPS, medido en relación con la proteína total (es decir, habría por lo menos 4x más proteína que LOS/LPS, en peso) . El nivel de LOS/LPS máximo es preferiblemente aún menor que 20% v.gr., 15% , 10% , 5% o menor. A diferencia del cultivo de inicio, las composiciones que contienen vesícula de la invención generalmente serán sustancialmente libres de bacterias enteras, ya sea vivas o muertas. El tamaño de las vesículas de la invención significa que pueden ser fácilmente separadas de las bacterias enteras por filtración a través de un filtro de 0 . 22 µp\ v.gr., como se usa típicamente para esterilización por filtro. Por lo tanto, la invención provee un procedimiento para preparar vesículas de la invención, que comprende filtrar el medio de cultivo a partir de bacterias de la invención a través de un filtro que retraza las bacterias enteras pero que deja pasar las vesículas a través v.gr., un filtro de 0 . 22 um. Aunque las vesículas pasarán a través de filtros de 0 . 22 um estándares, estas rápidamente pueden ser obstruidas por otro material, y de esta manera se prefiere realizar pasos secuenciales de esterilización por filtro a través de una serie de filtros de tamaño de poro cada vez menor, y acabar con un filtro de esterilización estándar (v.gr., un filtro de 0 . 22 um) . Ejemplos de filtros anteriores serían aquellos con tamaño de poro de 0 . 8 um, 0 . 45 um, etc. El filtrado puede ser tratado adicionalmente v.gr., por ultracentrifugación . Las vesículas de la invención contienen lípidos y proteínas. El contenido de proteína de vesículas meningocósicas ha sido analizado y sustancialmente todas las proteínas de las vesículas se clasifican como proteínas de membrana externa mediante análisis bioinformáticas . Las proteínas de membrana externa vistas en las vesículas incluyen: PilE; endopeptidasa de serina específica de IgA; PorA; FrpB; PlB; etc. A diferencia de las OMVs, que han sido previamente analizadas proteomicamente [ 51 ] , las vesículas de la invención se encontraría que carecen de proteínas tales como MinD, FtsA y fosfoenolpiruvato sintasa. Las vesículas también carecen de MltA. Las vesículas de la invención son ventajosas cuando se comparan con vesículas preparadas al alterar las bacterias cultivadas debido a que no se requiere alteración artificial. La separación a base de tamaño simple se puede usar para separar bacterias y vesículas, sin ninguna necesidad de tratamientos químicos, etc. Igual que con un procedimiento más simple, esto evita el riesgo de desnaturalización causado por los detergentes etc., que se usan durante procedimientos preparativos de OMV de la técnica anterior. Como se mencionó antes, las vesículas de la invención pueden ser similares a las microvesículas (MVs) y "OMVs nativas" ("NOMVs"), que son vesículas membrana que ocurren naturalmente que se forman espontáneamente durante el crecimiento bacteriano y son liberadas al medio de cultivo. Las MVs se pueden obtener al cultivar Neisseria en un medio de cultivo de caldo, al separar células enteras del medio de cultivo de caldo (v.gr., por filtración o por centrifugación de baja velocidad para formar pastillas únicamente con las células y no con las vesículas más pequeñas) y después recolectar las MVs que están presentes en el medio agotado de células (v.gr., por filtración, por precipitación diferencial o agregación de MVs, por centrifugación de alta velocidad a pastillas de las MVs) . Las cepas para usarse en la producción de MVs generalmente se pueden seleccionar con base en la cantidad de MVs producidas en cultivo. Las referencias 52 y 53 describen Neisseria con alta producción de MV.

Combinaciones de vesículas La invención permite la producción de vesículas inmunogénicas a partir de una bacteria de elección. La bacteria típicamente habrá sido generada por mutación de una cepa de inicio escogida. En donde hay múltiples cepas de inicio de interés entonces la invención provee métodos para preparar vesículas a partir de cada una de las cepas, y las diferentes vesículas se pueden combinar. Esta estrategia de combinación es particularmente útil para bacterias en donde la variación de cepa a cepas significa que una sola cepa generalmente no ofrece protección clínicamente útil, v.gr., meningococo de serogrupo B. Por lo tanto la invención provee una composición que comprende una mezcla de n conjunto de vesículas de la invención, preparadas a partir de n diferentes cepas de una bacteria. El valor de n puede ser 1, 2, 3, 4, 5, etc. Las diferente cepas pueden estar en el mismo o diferentes serogrupos . Mezclas preferidas de serogrupos incluyen: A+B; A+C; A+W135; A+Y; B+C ; B+W135; B+Y; C+W135; C+Y; W135+Y; A+B+C; A+B+W135; A+B+Y; A+C+W135; A+C+Y; A+W135+Y; B+C+W135; B+C+Y; C+W135+Y; A+B+C+W135; A+B+C+Y; B+C+W135+Y; y A+B+C+W135+Y. La invención también provee un equipo que comprende vesículas de la invención preparadas a partir de n diferentes cepas de una bacteria. Las vesículas se pueden mantener y almacenar por separado en el equipo hasta que son requeridas APRA usarse juntas v.gr., como una mezcla, o para uso separado o secuencial simultáneo. La invención también provee un procedimiento que comprende: preparar n conjuntos de vesículas de la invención, uno de cada una de n diferentes cepas de una bacteria; y combinar los n conjuntos de vesículas. Los diferentes conjuntos se pueden combinar en un equipo o en una mezcla. La invención también provee el uso de vesículas a partir de una primera cepa de bacteria en la fabricación de un medicamento para inmunizar a un paciente, en donde el medicamento se administra simultáneamente en forma separada o secuencial con vesículas de una segunda cepa de bacteria. La invención también provee el uso de vesículas a partir de una primera cepa de una bacteria en la fabricación de un medicamento para inmunizar a un paciente, en donde el paciente ha sido previamente inmunizado con vesículas de una segunda cepa de la bacteria. La bacteria es preferiblemente N. eningitidis , y es muy preferiblemente del serogrupo B. las diferentes cepas se pueden seleccionar de acuerdo con varios criterios.

Ejemplos de criterios incluyen: subtipo y/o serosubtipo [v.gr., 47]; inmunotipo; origen geográfico de las cepas; predominancia local de cepas clínicas; linaje hipervirulento v.gr., uno o más de los subgrupos I, III y IV-1, complejo ET-5, complejo ET-37, agregación A4 y linaje 3; tipo de secuencia multilocus (MLST) [54] . Los criterios preferidos para seleccionar cepas son: selección de más de un serotipo PorB (clase 2 ó 3 OMP) ; selección de más de un serosubtipo PorA (clase 1 OMP) ; selección de más de un inmunotipo diferente (lipopolisacárido o lipooligosacárido) ; selección de más de una de las tres diferentes variantes de MB1860 [55] . MB1870 se ve en las partículas de la invención, muestra distintas variantes y es buen antígeno candidato para vacunación [55-57]. Una combinación de vesículas cubre dos o tres diferentes variantes de NMB1870 es particularmente ventajosa. Igual que son seleccionadas de diferentes cepas meningocósicas , las vesículas se pueden seleccionar de diferentes patógenos. Por lo tanto, la invención provee una composición que comprende una mezcla de n conjuntos de vesículas de la invención, preparadas a partir de n diferentes especies de bacteria. De manera similar, la invención provee un equipo que comprende vesículas de la invención preparadas a partir de n diferentes especies de bacteria, y provee un procedimiento que comprende el paso de preparar n conjuntos de vesículas de la invención, uno de cada una de n especies diferentes de bacterias.

Expresión de MltA Las bacterias de la invención no poseen actividad enzimática de MltA funcional. La prevención de expresión de proteína MltA se puede lograr de dos maneras diferentes: remoción o alteración del gen mltA endógeno que incluye sus regiones de control) para dar una cepa MltA"; o supresión de expresión de MltA en una cepa MltA+. Se prefiere usar una cepa MltA". Las cepas MltA" se pueden construir mediante técnicas de supresión de expresión convencionales. Las técnicas para supresión de expresión de genes son bien conocidas, y se han reportado anteriormente los mutantes "knockout" de meningococos [v.gr., referencias 25 y 58-60] . La supresión de expresión se logra preferiblemente mediante la deleción de por lo menos una porción de la región codificadora (preferiblemente deleción isogénica) , pero se puede usar otra técnica adecuada v.gr., deleción o mutación promotor, deleción o mutación del codón de inicio. La bacteria puede contener un gen marcador en lugar del gen suprimido v.gr., un marcador de resistencia a antibióticos. En donde la supresión de la expresión de un gen mltA endógeno se usa, entonces técnicas tales como inhibición de antisentido y AR inhibidor se pueden usar, aunque estas técnicas muy típicamente se usan en hospederos eucarióticos . En la bacteria resultante, ARNra que codifica la proteína "knockout" estará sustancialmente ausente y/o su traducción será sustancialmente inhibida (v.gr., a menos de 1% del nivel de expresión que se vería en ausencia de supresión) . Como una alternativa a "knockout" o supresión de expresión, se puede usar la mutagénesis dirigida al sitio del gen mltA endógeno. La referencia 61 describe imitantes de ltA meningocósico en los cuales los residuos Glu255, Glu323 y Asp362 se mutaron y después se probaron para actividad catalítica de MltA. Un mutante #255G mostró una reducción de 50% en actividad, y un mutante E323G mostró una reducción de 70% en actividad. La mutagénesis de residuos específicos dentro de la región codificadora de MltA por lo tanto se puede usar como una técnica para suprimir la actividad enzimática de transglicolasa lítica sin realizar supresión de expresión de la región codificadora. Cualquiera que sea la técnica (o combinación de técnicas) que se escoja, la bacteria resultante será sustancialmente libre de actividad enzimática de MltA.

Composiciones farmacéuticas La invención provee una composición farmacéutica que comprende (a) vesículas de la invención y (b) un vehículo farmacéuticamente aceptable. La invención también provee un procedimiento para preparar esa composición, que comprende el paso de mezclar vesículas de la invención con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los "vehículos farmacéuticamente aceptables" típicos incluyen cualquier vehículo que como tal no induzca la producción de anticuerpos nocivos al individuo que recibe la composición. Los vehículos adecuados son típicamente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos , ácidos polilácticos , ácidos poliglicólicos , aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas) . Esos vehículos también son conocidos por los expertos en la técnica. Las vacunas también pueden contener diluyentes, tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Además, sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias reguladoras de pH, sacarosa y similares, pueden estar presentes. La solución salina regulada en su pH con fosfato, libre de pirógeno estéril (v.gr., pH 7.4) es un vehículo típico. Una discusión completa de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en la referencia 62. Las composiciones de la invención típicamente estarán en forma acuosa (es decir, soluciones o suspensiones) en vez de estar en forma seca (v.gr., liofilizada) . Las composiciones acuosas también son adecuadas para reconstitución distinta a las vacunas a partir de una forma liofilizada (v.gr., vacuna conjugada Hib liofilizada, una vacuna de conjugado meningocósico liofilizado, etc.) . En donde una composición de la invención se ha de usar para esta reconstitución extemporánea, la invención provee un equipo, que puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringa fácilmente llenada y un vial, con el contenido acuoso de la jeringa usado para reactivar los contenidos secos del vial antes de la inyección. Las composiciones de la invención pueden estar presentes en viales, o pueden estar presentes en jeringas fácilmente llenadas. Las jeringas pueden ser suministradas con o sin agujas. Las composiciones pueden estar empacadas en forma de dosis unitaria o en forma de dosis múltiple. Una jeringa típicamente incluirá una sola dosis de la composición, mientras que un vial puede incluir una sola dosis o dosis múltiple. Para forma de dosis múltiples, por lo tanto, los viales son preferidos para jeringas prellenadas. Volúmenes de dosis efectivos pueden ser rutinariamente establecidos, pero una dosis humana típica de la composición tiene un volumen de aproximadamente 0.5 mi v.gr., para inyección intramuscular. La vacuna basada en RIVM O V se administró en un volumen de 0.5 mi [63] por inyección intramuscular al muslo o brazo superior. Dosis similares se pueden usar para otras vías de administración, v.gr., una vacuna basada en OMV intranasal para atomización puede tener un volumen de aproximadamente 100 µ? o de aproximadamente 130 µ? por aspersión [64], con cuatro aspersiones administradas para dar un total de dosis de aproximadamente 0.5 mi. El pH de la composición es preferiblemente entre 6 y 8, y muy preferiblemente entre 6.5 y 7.5 (v.gr., aproximadamente 7 a aproximadamente 7.4). El pH de la vacuna basada en RIVM OMV es de 7.4 [65], y un pH <8 (preferiblemente <75) es preferido para composiciones de la invención. El pH estable se puede mantener mediante el uso de un regulador de pH v.gr., un regulador de pH de Tris, un regulador de pH de fosfato o un regulador de pH de histidina. Las composiciones de la invención generalmente incluirán un regulador de pH. Si una composición comprende una sal de hidróxido de aluminio, preferiblemente se usará un regulador de pH de histidina [66] v.gr., entre 1-10 mM, preferiblemente aproximadamente 5mM. La vacuna basada en RIVM OMV mantiene un pH mediante el uso de un regulador de PH Tris/HCl 10 mM. La composición puede ser estéril y/o libre de pirógenos. Las composiciones de la invención pueden ser isotónicas con respecto a humanos. Las composiciones de la invención son inmunogénicas , y muy preferiblemente son composiciones de vacuna. Las vacunas de conformidad con la invención pueden ser ya sea profilácticas (es decir, para prevenir infección) o terapéuticas (es decir, para tratar infección) , pero típicamente serán profilácticas. Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente efectivas de antígeno(s), así como cualesquiera otros componentes, según sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente efectiva", se entiende que la administración de la cantidad a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es efectiva para tratamiento o prevención. Esta cantidad varía según la salud y condición física del individuo que ha de ser tratado, edad, el grupo taxonómico del individuo que se ha de tratar (v.gr., primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación por el médico que trata al paciente de la situación médica, y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad caiga en un espectro relativamente amplio que puede ser determinado a través de pruebas de rutina. El contenido de antígeno de las composiciones de la invención generalmente se expresará en términos de la cantidad de proteína por dosis. Una dosis de aproximadamente 0.9 mg de proteína por mi es típico para vacunas intranasales basadas en OMV [64] . Las vacunas basadas en MeNZB™ OMV contienen entre 25 y 200 ug de proteína por mililitro v.gr., entre 45 y 90 ug/ml, o 50±10 g/ml . Las composiciones de la invención preferiblemente incluirán menos de 100 \ig/ml de OMV por cepa de bacteria. Los meningococos afectan varias áreas del cuerpo y por lo tanto las composiciones de la invención se pueden preparar de varias formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como materiales inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las composiciones se pueden preparar para administración pulmonar v.gr., como un inhalador, mediante el uso de un polvo fino o una aspersión. La composición se puede preparar como un supositorio o pesario. La composición se puede preparar para administración nasal, aural u ocular v.gr., como aspersión, gotas, gel o polvo [v.gr., referencias 67 y 68] . Las composiciones de la invención pueden incluir antimicrobianos, particularmente cuando se empacan en un formato de dosis múltiples. Los antimicrobianos tales como tiomersal y 2-fenoxietanol se encuentran comúnmente en vacunas, pero se prefiere usar ya sea un conservador libre de mercurio o ningún conservador en absoluto. Las composiciones de la invención pueden comprender detergente v.gr., Tween (polisorbato) , tal como Tween 80. Los detergentes generalmente están presentes a niveles bajos v.gr., <0.01%. Las composiciones de la invención pueden incluir sales de sodio (v.gr., cloruro de sodio) para dar tonicidad. Una concentración de 10±2 mg/ml de NaCl es típica. La concentración de cloruro de sodio es preferiblemente mayor que 7.5 mg/ml . Las composiciones de la invención generalmente se administrarán junto con otros agentes inmunoreguladores. En particular, las composiciones generalmente incluirán uno o más adyuvantes, y la invención provee un procedimiento para preparar una composición de la invención, que comprende el paso de mezclar vesículas de la invención con un adyuvante v.gr., en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes adecuados incluyen pero no se limitan a: A. Composiciones que contienen minerales Las composiciones que contienen minerales adecuadas para usarse como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales tales como hidróxidos (v.gr., oxihidróxidos) , fosfatos (v.gr., hidroxifosfatos , ortofosfatos ) , sulfatos, etc. [v.gr., véase capítulos 8 y 9 de la referencia 69], o mezclas de diferentes compuestos minerales, en donde los compuestos alertan cualquier forma adecuada (v.gr., gel, cristalina, amorfa, etc.), y es preferida la adsorción. Las composiciones que contienen minerales también se pueden formular como una partícula de sal de metal [70] . Un adyuvante de fosfato de aluminio típico es hidroxifosfato de aluminio amorfo con relación molar de PO4/AI entre 0.84 y 0.92, incluida a 0.6 mg Al3+/ml. La adsorción con una dosis baja de fosfato de aluminio se puede usar v.gr., entre 50 y 100 ug Al3+ por conjugado por dosis. En donde el fosfato de aluminio se usa y se desea que no adsorba un antígeno al adyuvante, esto es favorecido al incluir iones de fosfato libres en solución (v.gr., mediante el uso de un regulador de pH de fosfato) . La vacuna RIVM se probó con adsorción ya sea con un fosfato de aluminio o a un adyuvante de hidróxido de aluminio, y el adyuvante de fosfato de aluminio se encontró que da resultados superiores [65] . Los productos MeNZB™, MenBvac™ y VA-MENINGOC-BC™ incluyen todos ellos un adyuvante de hidróxido de aluminio. Una dosis típica de adyuvante de aluminio es aproximadamente 3.3 mg/ml (expresada como concentración de Al3+) .

B. Emulsiones en aceites Las composiciones de emulsión en aceite adecuadas para usarse como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno-agua, tales como MF59 [capítulo 10 de la referencia 69; véase también referencia 71] (5% de escualeno, 0.5% de Tween 80, y 0.5% de Span 85, formulada en partículas de submicras mediante el uso de un microfluidizador) . Adyuvante de Freund completo (CFA) y adyuvante de Freíd incompleto (IFA) también se pueden usar.

C. Formulaciones de saponina [capítulo 22 de la referencia 69] Las formulaciones de saponina también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las saponinas son un grupo heterólogo de glicósidos de esterol y glicósidos de triterpenoide que se encuentran en la corteza, hojas, tallos, raíces e incluso flores de una amplia gama de especies vegetales. La saponina de la corteza del árbol Quillaza saponaria Molina ha sido ampliamente estudiada como adyuvantes. La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla) , Gypsophilla paniculada (velo de novia) , y Saponaria officianalis (raíz de jabón) . Las formulaciones de adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como formulaciones de lípido, tales como ISCOMs. QS21 es comercializado como Stimulon™. Las composiciones de saponina han sido purificadas mediante el uso de CLAR y CLAR-FI . Fracciones purificadas específicas que usan esas técnicas han sido identificadas, que incluye QS7, 1S17, QS18, QS21, QH-A, QH-B y QH-C.

Preferiblemente, la saponina es QS21. Un método de producción de QS21 se describe en la referencia 72. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol [73 ] . Combinaciones de saponinas y colesteroles se pueden usar para fiormar partículas únicas llamadas complejos inmunoestimulantes (ISCOMs) [capítulo 23 de la referencia 69]. ISCOMs típicamente también incluyen un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina . Cualquier saponina conocida se puede usar en ISCOMs. Preferiblemente, laISCOM incluye una o más de QuilA, QHA y QHC. Las ISCOMs además se describen en las referencias 73-75. Opcionalmente, las ISCOMS pueden estar desprovistas de detergente adicional [76] Una revisión del desarrollo de adyuvantes basados en saponinas se puede encontrar en las referencias 77 y 78.

D. Virosomas y partículas similares a virus Los virosomas y partículas similares a virus (VLPs) también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente combinado o formulado con un fosfolípido. Son generalmente no patógenas, no replicantes y generalmente no contienen ninguno del genoma viral nativo. Las proteínas virales se pueden producir recombinantemente o aislarse de virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para usarse en virosomas o VLPs incluyen proteínas derivadas del virus de la influenza (tal como HA o NA) , virus de hepatitis B (tal como proteínas de grupo o cápside) , virus de hepatitis E, virus de sarampión, virus de Sindbis, Rotavirus, virus de enfermedad de pies y boca, Retrovirus, virus de Norwalk, virus de papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fagos QS (tales como proteínas de revestimiento) , fago de GA, fago de fr, fago de AP205, y Ty (tal como proteína pl de transposon Ty) . VLPs se describen además en las referencias 79-84. Los virosomas se describen además en, por ejemplo, la referencia 85.

E. Derivados bacterianos o microbianos Adyuvantes adecuados para usarse en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS) , derivados de lípido A, oligonucleótidos inmunoestimulantes y toxinas ADP-ribosilantes y derivados detoxificantes de los mismos. Los derivados no tóxicos de LPS incluye monofosforil lípido A (MPL) y MPL 3 -O-deacilado (3dMPL) . 3dMPL es una mezcla de monofosforil lípido A 3 des-O-acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. Una forma de "partícula pequeña" preferida de monofosforil lípido A 3 Des-O-acilado se describe en la referencia 86. Esas "partículas pequeñas" de 3dMPL son suficientemente pequeñas para ser filtradas en forma estéril a través de una membrana de 0.22 um [86]. Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen simuladores de monofosforil lípido A, tales como derivados de fosfato de aminoalquilglucosaminida, v.gr., RC-529 [87,88]. Los derivados de lípido A incluyen derivados de lípido A de Escherichia coli tal como OM-174. OM-174 se describe por ejemplo en las referencias 89 y 90. Oligonucleótidos inmunoestimulantes para usarse como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia dinucleótido que contiene una citosina no metilada ligada por un enlace de fosfato a una guanosina) . Los ARN de doble cadena son oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poli(dG) también se ha mostrado que son inmunoes imuladoras . Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos tales como modificaciones de fosforotioato y pueden ser de doble cadena o de una sola cadena. Las referencias 91, 92 y 93 describen posibles sustituciones análogas v.gr., reemplazables de guanosina con 2'-desoxi-7-deazaguanosina . El efecto adyuvante de oligonucleótidos de CpG se describe además en las referencias 94-99. La secuencia de CpG puede ser dirigida a TLR9 , tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT [100] . La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune de T l, tal como una CpG-A ODN, o puede ser más específica para inducir una respuesta de célula B, tal como CpG-B ODN. CpG-A y CpG-B Odas como se describe en las referencias 101-103. Preferiblemente, la CpG es una CpG-A ODN. Preferiblemente, el oligonucleótido de CpG se construye de tal manera que el extremo 5' es accesible para reconocimiento de receptor. Opcionalmente, dos secuencias de oligonucleótido de CpG se pueden unir en sus extremos 3' para formar "inmunómeros" . Véase, por ejemplo, las referencias 100 y 104-106. Las toxinas ADP ribosilantes bacterianas y derivados destoxificados de las mismas se pueden usar como adyuvantes en la invención. Preferiblemente, la proteína se deriva de E. coli (enterotoxina lábil a calor de E.coli "LT"), cólera ("CT"), o pertusis ("PT"). El uso de toxinas ADP-ribosilantes destoxificadas como adyuvantes de mucosa se describen en la referencia 107 y como adyuvantes parenterales en la referencia 108. La toxina o toxoide está preferiblemente en forma de una holotoxina, que comprende subunidades A y B. Preferiblemente, la subunidad A que contiene una mutación destoxificante ,· preferiblemente la subunidad B no es mutada. Preferiblemente, el adyuvante es mutante de LT destoxificado tal como LT-K63 , LT-R72, y LT- G192. El uso de toxinas ADP-ribosilantes y derivados destoxificados de las mismas, particularmente LT-K63 y LT-R72, como adyuvantes, se pueden encontrar en las referencias 109-116. Números de referencia para sustituciones de aminoácidos preferiblemente se basa en las alineaciones de las subunidades A y B de toxinas ADP-ribosilantes expuestas en la referencia 117, específicamente incorporada aquí por referencia en su totalidad.

F . Inmunomoduladores humanos Los inmunomoduladores humanos adecuados para usarse como adyuvantes en la invención incluyen citocinas, tales como interleucinas (v.gr., IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [118], etc.) [119], interferones (v.gr., interferón-?) , factor estimulante de colonia de macrófagos y factor de necrosis tumoral .

G. Bioadhesivos y Mucoadhesivos Los bioadhesivos y mucoadhesivos también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos incluyen microesferas de ácido hialuronico esterificado [120] o mucoadhesivos tales como derivados entrelazados de ácido poli (acrílico) , alcohol polivinílico , polivinilpirrolidona , polisacáridos y carboximetilceluklosa . Quitosán y derivados del mismo también se pueden usar como adyuvantes en la invención [121] .

H. Micropartículas Las micropartículas también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Las micropartículas (es decir, una partícula de -100 a -150 µ en diámetro, muy preferiblemente ~200nm a -30 um en diámetro, y muy preferiblemente aun de ~500nm a -lOum en diámetro) formadas de materiales que son biodegradables no tóxicos (v.gr., un ácido poli (a-hidroxílico) , un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster , un polianhídrido , una policaprolactona, etc.), en donde se prefiere poli (láctido-co-glicólido) , opcionalmente tratados para tener una superficie negativamente cargada (v.gr., con SDS) o una superficie positivamente cargada (v.gr., con un detergente catiónico, tal como CTAB) .

I. Liposomas (capítulos 13 y 14 de la referencia 69) Ejemplos de formulaciones de liposoma adecuadas para usarse como adyuvantes se describen en las referencias 122-124.

J. Formulaciones de éter polioxietileno y polioxietileno Adyuvantes adecuados para usarse en la invención incluyen éteres de polioxietileno y ásteres de polioxietileno [125] . Esas formulaciones además incluyen agentes tensioactivos de éster de polioxietilen sorbitan en combinación con un octoxinol [126] asi como éteres alquílicos de polioxietileno o agentes tensioactivos de éster en combinación con por lo menos un agente tensioactivo no iónico adicional tal como octoxinol [127]. Los éteres de polioxietileno se seleccionan del siguiente grupo: éter 9-laurílico de polioxietileno (laureth 9), éter 8-esteorílico de polioxietileno, éter 8-esteorílico de polioxietileno, éter 4-laurílico de polioxietileno, éter 35-laurílico de polioxietileno y éter 23-laurílico de polioxietileno.

K. Polifosfaceno (PCPP) Se describen formulaciones de PCPP, por ejemplo, en las referencias 128 y 129.

L. Péptidos de muramilo Ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para usarse como adyuvantes en la invención incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP) y N- acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2- ( 1 ' -2 ' -dipalmitoil-577-glicero-3-hidroxifosforiloxi ) -etilamina MTP-PE) .

M. Compuestos de imidazoquinolona Ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para usarse como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos (v.gr., "Resiquimod 3M"), descrito además en las referencias 130 y 131. La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados antes. Por ejemplo, las siguientes composiciones adyuvantes se pueden usar en la invención: (1) una saponina y una emulsión de aceite en agua [132]; (2) una saponina (v.gr., QS21) + un derivado de LPS no tóxico (v.gr., 3dMPL) [133]; (3) una saponina (v.gr., QS21) + un derivado de LPS no tóxico (v.gr., 3dMPL) + un colesterol; (4) una saponina (v.gr., QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + un esterol) [134]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [135] ; (6) SAF, que contienen 10% de escualano, 0.4% de Tween 80™, 5% de polímero plurónico-bloqueador L121, y thr-MDP, ya sea microfluidizado en una emulsión de submicras o sometido a acción de remolino para generar una emulsión de tamaño de partícula más grande. (7) sistema de adyuvante Ribi™ (RAS) , (Ribi Immunochem) que contiene 2% de escualano, 0.2% de Tween 80, y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste de monofosforilípido A (MPL) , dimicolato de trehalosa (TDM) , y estructura de base de pared celular (CWS) , preferiblemente MPL + CWS (Detox™) ; y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL) . Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se describen en el capitulo 7 de la referencia 69. El uso de adyuvantes de sal de aluminio es particularmente preferido, y los antigenos son generalmente adsorbidos a esas sales. Es posible en composiciones de la invención adsorber algunos antígenos a un hidróxido de aluminio pero tener otros antígenos en asociación con un fosfato de aluminio. En general, sin embargo, se prefiere usar únicamente una sola sal v.gr., un hidróxido o un fosfato, pero no ambos. No todas las vesículas necesitan ser adsorbidas, es decir, algunas o todas pueden ser libres en solución.

Métodos de tratamiento La invención también provee un método para producir una respuesta inmune en un mamífero, que comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al mamífero. La respuesta inmune es preferiblemente protectora y preferiblemente implica anticuerpos. El método puede producir una respuesta de refuerzo en un paciente que ya ha sido iniciado contra N. meningitidis . Los regímenes de inicio/refuerzo subcutáneos e intranasales para OMVs se describen en la referencia 136. El mamífero es preferiblemente un humano. En donde la vacuna es para uso profiláctico, el humano es preferiblemente un niño (v.gr., un niño que gatea o un niño pequeño) o un adolescente; en donde la vacuna es para uso terapéutico, el humano es preferiblemente un adulto. Una vacuna diseñada para niños también puede ser administrada a adultos v.gr., para evaluar seguridad, dosis, inmunogenicidad, etc. La invención también provee vesículas de la invención para usarse como un medicamento. El medicamento es preferiblemente capaz de producir una respuesta inmune en un mamífero (es decir, es una composición inmunogénica) y es muy preferiblemente una vacuna. La invención también provee el uso de vesículas de la invención en la fabricación de un medicamento para producir una respuesta inmune en un mamífero. La invención también provee el uso de vesículas de la invención en la fabricación de un medicamento para inmunizar a un paciente, en donde el paciente ha sido pre-inmunizado con por lo menos uno de los siguientes: toxoide de difteria; toxoide tetánico; antígenos acelular o celular; un sacárido capsular de Hib conjugado; antígeno de superficie de virus de hepatitis B virus; un sacárido capsular meningocócigo conjugado; y/o un sacárido capsular pneumocócico corrugado. Estos usos y métodos son preferiblemente para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad causada por N meningitidis v.gr., meningitis bacteriana (o, de manera más específica, meningocócica) , o septicemia. Una forma de verificar la eficacia de tratamiento terapéutico implica monitorear infección por Neisserial después de la administración de la composición de la invención. Una forma de verificar la eficacia de tratamiento profiláctico implica monitorear las respuestas inmunes contra los antígenos de vesículas después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención se puede determinar mediante la administración a sujetos de prueba (v.gr., niños de 12-16 meses de edad, o modelos animales [137]) y después al determinar parámetros estándares que incluyen anticuerpos bactericidas en el suero (SBA) y títulos ELISA (GMT) . Estas respuestas inmunes generalmente se determinarán aproximadamente 4 semanas después de la administración de la composición, y comparadas con los valores determinados antes de la administración de la composición. Un incremento de SBA de por lo menos 4-veces o 8-veces es preferido. En donde más de una dosis de la composición se administra, se puede hacer más de una determinación de post-administración. Las composiciones preferidas de la invención pueden conferir un título de anticuerpo en un paciente que es superior al criterio para seroprotección para un porcentaje aceptable de sujetos humanos. Los antígenos con un título de anticuerpo asociado por arriba de los cuales se considera que un hospedero es seroconvertido contra el antígeno con bien conocidos, y esos títulos son publicados por organizaciones tales como WHO . Preferiblemente más de 80% de una muestra significativa de sujetos es seroconvertida, muy preferiblemente más de 90% , muy preferiblemente aún más de 93 % y muy preferiblemente todavía de 96 - 100% . Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. El suministro directo se puede lograr mediante inyección parenteral (v.gr. , subcutáneamente, intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, o al especio intersticial de un tejido), o por administración rectal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración de la mucosa. La administración intramuscular al mismo o el brazo superior es preferida. La inyección puede ser por medio de una aguja (v.gr., una aguja hipodérmica) , pero la inyección sin aguja se puede usar alternativamente. Una dosis intramuscular típica es 0.5 mi. El tratamiento por dosificación puede ser un programa de una sola dosis o un programa de dosis múltiples. Las dosis múltiples se pueden usar en un programa de inmunización primario y/o en un programa de inmunización de refuerzo. Un programa de dosis primario puede ser seguido por un programa de dosis de refuerzo. El tiempo adecuado entre dosis de inicio (v.gr., entre 4-16 semanas), y entre inicio y refuerzo, se pueden determinar rutinariamente. La vacuna de RIVM basada en OMV se probó mediante el uso de un programa de primario 3 ó 4 dosis, con vacunación a O, 2 y 8 ó 0, 1, 2 y 8 meses. MeNZB™ se administra como tres dosis a intervalos de seis semanas. Estos programas se pueden usar de conformidad con la invención. Las preparaciones de vesícula dadas en cada etapa de dosis pueden ser la misma o diferentes. En los métodos de la invención, en donde una primera dosis se da en tiempo cero, después una segunda dosis y una tercera dosis se pueden dar en los siguientes dos meses, y una cuarta dosis de puede dar entre 11 y 13 meses después del tiempo cero. La primera, segunda y tercera dosis pueden comprender vesículas con el mismo serosubtipo que la otra, y la cuarta dosis puede comprender vesículas con un serosubtipo diferente de las primeras tres dosis. La cuarta dosis puede contener vesículas sólo con un serosubtipo diferente de las primeras tres dosis, o puede contener dos tipos de vesícula, una con un serosubtipo diferente de las primeras tres dosis y una con el mismo subtipo. La primera, segunda y tercera dosis se dan preferiblemente a intervalos de entre 6 y 8 semanas. La cuarta dosis se da preferiblemente aproximadamente 1 año después del tiempo cero. El paciente preferiblemente recibe la misma cantidad de vacuna en cada una de las cuatro dosis. Como se describió antes, la invención puede implicar la administración de vesículas de más de un subtipo y/o serosubtipo de N. meningitidis [v.gr., referencia 47], ya sea por separado o en mezcla. La invención se puede usar para inducir inmunidad sistémica y/o de mucosa. En general, las composiciones de la invención pueden inducir respuestas de anticuerpo bactericida en el suero después de administrarse a un sujeto. Estas respuestas se miden convenientemente en ratones y son un indicador estándar de eficacia de vacuna [v.gr., véase nota final 14 de la referencia 196] . La actividad bactericida en el suero (SBA) mide la muerte bacteriana mediada por complemento, y se puede probar mediante el uso de complemento humano o de conejo recién nacido. Las normas de WHO requieren una vacuna para inducir por lo menos un aumento de 4 veces en SBA en más de 90 % de los receptores. MeNZB™ induce un aumento de 4 veces en SBA 4 - 6 semanas después de la administración de la tercera dosis . En vez de ofrecer protección estrecha, las composiciones de la invención pueden inducir respuestas de anticuerpo bactericida contra más de un linaje hipervirulento de serogrupo B. En particular, preferiblemente puede inducir respuestas bactericidas contra dos o tres de los siguientes tres linajes hipervirulentos : (i) agregado A4 ; (ii) complejo de ET5 ; y (iii) linaje 3 . Además pueden inducir respuestas de anticuerpo bactericida contra uno o más de linajes hipervirulentos de subgrupo I, subgrupo IH5 subgrupo IV-I o complejo de ET- 37 , y contra otros linajes v.gr., linajes hiperinvasivos . Esto no necesariamente significa que la composición puede inducir anticuerpos bactericidas contra cada una y todas las cepas de meningococos del serogrupo B dentro de estos linajes hipervirulentos v.gr., en vez de, para cualquier grupo dado de cuatro o más cepas de meningococos de serogrupo B dentro de un linaje hipervirulento particular, los anticuerpos inducidos por la composición son bactericidas contra por lo menos 50% (v.gr., 60% , 70 % , 80 % , 90 % o más) del grupo. Los grupos preferidos de cepas incluirán cepas aisladas en por lo menos cuatro de los siguientes países: GB, AU, CA, NO, IT, US, NZ, NL, BR y CU. El suero preferiblemente tiene un título bactericida de por lo menos 1024 (v.gr., 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218 o mayor, preferiblemente por lo menos 214) v.gr., el suero es capaz de matar por lo menos 50% de bacterias de prueba de una cepa particular cuando se diluya 1/1024, como se describe en la referencia 196. Las composiciones preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las siguientes cepas de meningococos del serogrupo B: (i) del agregado A4, cepa 961-5945 (B:2b:Pl.21,16) y/o cepa G2136 (B:-) ; (ii) del complejo de ET-5, cepa MC58 (B: 15 : Pl .7 , 16b) y/o cepa 44/76 (B: 15 : Pl .7, 16) ; (iii) del linaje 3, cepa 394/98 (B:4:P1.4) y/o cepa BZ198 ( B : NT : - ) . Las composiciones más preferidas pueden inducir respuestas bactericidas contra las cepas 961-5945, 44/76 y 394/98. Las cepas 961-5945 y G2136 son ambas cepas de referencia MLST de Neisseria [ids 638 y 1002 en la referencia 138] . La cepa MC58 está ampliamente disponible (v.gr., ATCC BAA-335) y fue la cepa secuenciada en la referencia 32. La cepa 44/76 ha sido ampliamente usada y caracterizada (v.gr., referencia 139) y es una de las cepas de referencia MLST de Neisseria [id 237 en la referencia 138; hilera 32 de la tabla 2 en la referencia 33] . La cepa 394/98 fue originalmente aislada en Nueva Zelanda en 1998, y se han publicado algunos estudios en los que se usa esta cepa (v.gr., referencias 140 y 141) . La cepa BZ198 es otra cepa de referencia MLST [id 409 en la referencia 138; hilera 41 de la tabla 2 en la referencia 33].

Componentes antigénicos adicionales Así como contienen vesículas antigénicas de la invención, las composiciones de la invención pueden incluir antígenos no vesiculares adicionales. Por ejemplo, la composición puede comprender uno o más de los siguientes antígenos adicionales: — un antígeno de sacárido de serogrupo A, C, Wl 35 y/o Y de jV. meningitidis, tales como el oligosacárido descrito en la referencia 142 del serogrupo C o el oligosacáridos de la referencia 143. El producto de VA-MENINGOC-BC™ contiene polisacárido de serogrupo C. — un antígeno de sacárido de Streptococcus pneumoniae [v.gr., referencias 144-146; capítulos 22 y 23 de la referencia 153]. — un antígeno de virus de hepatitis A, tal como virus inactivado [v.gr., 147, 148; capítulo 15 de la referencia 153]. — un antígeno de virus de hepatitis B, tal como la superficie y/o antígenos de núcleo [v.gr., 148,149; capítulo 16 de la referencia 153] . - un antígeno de virus de hepatitis C [v.gr., 150] . - un antígeno de Bordetella pertussis , tal como holotoxina de pertussis (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA) de B . pertussis , opcionalmente también en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [v.gr., referencias 151 y 152; capítulo 21 de la referencia 153] . un antígeno de difteria, tal como un toxoide de difteria [v.gr., capítulo 13 de la referencia 153] . - un antígeno de tétano, tales como a toxoide tetánico [v.gr., capítulo 27 de la referencia 153] . - un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B [v.gr., capítulo 14 de la referencia 153] - un antígeno de N . gonorrhoeae [v.gr., referencia 154] . - un antígeno de Chlamydia pneumoniae [v.gr., 155- 161] . - un antígeno de Chlamydia trachomatis [v.gr., 162] un antígeno de Porphyromonas gingivalis [v.gr., 163] antígeno(s) de polio [v.gr., 164, 165; capítulo 24 de la referencia 153 ] tal como IPV. - antígeno(s) de rabia [v.gr., 166 ] tal como virus inactivado liofilizado [v.gr. , 167 , Rab Avert™] . antígenos de sarampión, paperas ylo rubéola [v.gr., capítulos 19 , 20 y 26 de la referencia 153 ] . - antígeno (s) de influenza [v.gr., capítulos 17 y 18 de la referencia 153 ] , tal como la hemaglutinina y/o proteínas de superficie de neuraminidasa. un antígeno de Moraxella catarrhalis [v.gr., 168 ] . un antígeno de proteína de Streptococcus agalactiae (estreptococo de grupo B) [v.gr., 169 , 170 ] . un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo de grupo A) [v.gr., 170 , 171 , 172 ] . En donde se usa un antígeno de sacárido o carbohidrato, es preferiblemente conjugado a un vehículo para incrementar la inmunogenicidad. La conjugación de antígenos de sacárido de H. influenzae B, meningocócico y neumocócico es bien conocida. Los antígenos de proteína tóxicos pueden ser destoxificados en donde es necesario (v.gr., destoxificación de toxina de pertussis por medios químicos y/o genéticos [ 152 ] ) . En donde se incluye un antígeno de difteria en la composición, también se prefiere incluir antígeno de tétano y antígenos de pertussis . De manera similar, en donde se incluye un antígeno de tétano, también se prefiere incluir antígenos de difteria y pertussis . De manera similar, en donde se incluye un antígeno de pertussis , también se prefiere incluir antígenos de difteria y tétanos. Combinaciones de DTP son por lo tanto preferidas. Los antígenos de sacárido están preferiblemente en forma de conjugados. Las proteínas portadoras preferidas para conjugados son toxinas o toxoides bacterianos, tales como toxoide de difteria o toxoide tetánico. El mutante CRMl 97 de toxina de difteria [173-175] es un portador particularmente preferido, como lo es el toxoide de difteria. Otras proteínas portadoras adecuadas incluyen la proteína de membrana externa N. meningitidis [176], péptidos sintéticos [177,178], protepinas de choque término [179,180], proteínas de pertussis [181,182], citocinas [183], linfocinas [183], hormonas [183], factores de crecimiento [183], proteínas artificiales que comprenden epítopes de células T CD4+ T humanas múltiples de varios antígenos derivados de patógenos [184] tales como Ni 9, proteína D de H. influenzae [185,186], proteína de superficie pneumocócica PspA [187], neumolisina [188], proteínas de ingesta de hierro [189], toxina A o B de C. difficile [190] , etc. Las composiciones preferidas incluyen vesículas meningocócicas como se describió antes, más un sacárido capsular conjugado de uno o más (es decir, 1, 2, 3 ó 4) de serogrupos meningocócicos A, C, 135 y Y. En donde las vesículas son del serogrupo B, entonces este enfoque permite que los siguientes serogrupos sean cubiertos: B+A; B+C; B+W135; B+Y; B+C+W135; B+C+Y; B+W135+Y; B+A+C+W135; B+A+C+Y; B+A+W135+Y; B+C+W135+Y; y B+A+C+ 135+Y . Dos combinaciones preferidas usan vesículas de serogrupo B más antígenos conjugados ya sea de los serogrupos A+W135+Y o los serogrupos A+C+W135+Y. En general, es posible cubrir todos los cinco serogrupos A, B, C, Wl 35 y Y al escoger vesículas para x serogrupo (s) y sacáridos conjugados para los 5 serogrupos x restantes . Antígenos de proteína meningocócicos preferidos (preferiblemente del serogrupo B) también se pueden añadir para complementar las composiciones de vesícula. En particular, un antígeno de proteína tal como se describe en las referencias 41 y 191 a 199 se pueden añadir. Un pequeño número de antígenos definidos se pueden añadir (una mezcla de 10 o menos (v.gr., 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2) antígenos purificados) . Polipéptidos inmunogénicos adicionales preferidos para usarse con la invención son aquellos descritos en la referencia 199: (1) una proteína 'NadA' ; (2) una proteína '741'; (3) una proteína '936'; (4) una proteína '953'; y (5) una proteína '287'. Otros posibles antígenos meningocócicos complementarios incluyen proteínas que se unen a la transferina (v.gr., TbpA y TbpB) y/o CusZn-superóxido dismutasa [18] . Otros posibles antígenos meningocócicos complementarios incluyen ORF40 (también conocido como Hsf o 'NhhA' [200,201]), LctP [202] y ExbB [202]. Otros posibles antígenos meningocócicos complementarios incluyen proteínas que comprenden una de los siguientes secuencias de aminoácidos: SEQ ID NO: 650 de la referencia 191; SEQ ID NO: 878 de la referencia 191; SEQ ID NO: 884 de la referencia 191; SEQ ID NO : 4 de la referencia 192; SEQ ID NO: 598 de la referencia 193; SEQ ID NO: 818 de la referencia 193; SEQ ID NO: 864 de la referencia 193; SEQ ID NO: 866 de la referencia 193; SEQ ID NO: 1196 de la referencia 193; SEQ ID NO: 1272 de la referencia 193; SEQ ID NO: 1274 de la referencia 193; SEQ ID NO: 1640 de la referencia 193; SEQ ID NO: 1788 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2288 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2466 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2554 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2576 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2606 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2608 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2616 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2668 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2780 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2932 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2958 de la referencia 193; SEQ ID NO. -2970 de la referencia 193; SEQ ID NO: 2988 de la referencia 193, o un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que: (a) tiene 50% o más de identidad (v.gr., 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% o más) a las secuencias; y/o (b) comprende un fragmento de por lo menos n aminoácidos consecutivos de esas secuencias, en donde n es 7 o más (eg. 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más) . Los fragmentos más preferidos para (b) comprenden un epítope de la secuencia pertinente. Se puede incluir más de uno (v.gr., 2, 3, 4, 5, 6) de éstos polipéptidos . Los antígenos meningocócicos de proteína de unión a transferina y/o de proteína Hsf también se pueden añadir [203]. La complementación de los OMVs por antígenos meningocócicos definidos de esta manera es particularmente útil en donde los OMVs son de un meningococo de serosubtipo Pl.7b,4 o un meningococo de serosubtipo Pl.7,16. La complementación de una mezcla de OMVs de estos dos serosubtipos es preferida. También es posible añadir vesículas que no sean vesículas de la invención v.gr., OMVs, MVs, NOMVs, etc., que se preparan por métodos distintos a los de la invención (v.gr., preparadas por métodos que implican alteración de membranas bacterianas, como se describe en la técnica anterior) . Los antígenos en la composición típicamente estarán presentes a una concentración de por lo menos 1 g/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para inducir una respuesta inmune contra ese antígeno . Como una alternativa a usar antígenos e proteína en la composición de la invención, se puede usar el ácido nucleico que codifica el antígeno. Los componentes de proteína de las composiciones de la invención por lo tanto pueden ser reemplazadas por ácido nucleico (preferiblemente ADN v.gr., en forma de un plásmido) que codifica la proteína.

Nuevas proteínas meningocócicas La secuencia del genoma del meningococo de serogrupo B se reporta en la referencia 32. La observación inicial del genoma no ha sido aceptada para todos los >2000 genes, v.gr., el codón de inicio en NMB 1870 subsecuentemente ha sido asignado de nuevo [41,55]. Los inventores han encontrado que los codones de inicio para NMB0928, NMBO 109 y NMB 1057 también deben ser asignados de nuevo: " La secuencia original de NMB0928 se muestra en la figura 6 (SEQ ID NO: 3) . Los inventores creen que el codón de inicio verdadero para NMB0928 es el ATG que codifica la metionina en el residuo 24 de la figura 6. Con el nuevo codón de inicio ( SEQ ID NO: 6), NMB0928 presenta una firma típica de una proteína expuesta a la superficie, caracterizada por un péptido de señal con un motivo de caja lipo (subrayado) . " La secuencia original de NMBO 109 se muestra en la figura 7 (SEQ ID NO: 4) . Los inventores creen que el codón de inicio verdadero para MB0109 es la ATG que codifica la Met en el residuo 39 de la figura 7 (SEQ ID NO: 7) . ¦ La secuencia original de NMB1057 se muestra en la figura 8 (SEQ ID NO: 5) . Los inventores creen que el codón de inicio verdadero para NMB 1057 es la GTG que codifica la Val en el residuo 14 de la figura 8 (SEQ ID NO: 8) . Por lo tanto, la invención provee un polipéptido que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50% (v.gr., 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) identidad de secuencia a SEQ ID NO : 6 , y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de por lo menos 7 (v.gr., 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) aminoácidos contiguos de SEQ ID NO:6. Los polipéptidos preferidos tienen un residuo de cisteína N-terminal , preferiblemente correspondiente a Cys-19 de SEQ ID NO: 6, y la cisteína N-terminal es preferiblemente lipidada. Los polipéptidos preferidos no incluyen la secuencia de aminoácidos MTHIKPVIAALALIGLAA (SEQ ID NO : 9) dentro de 30 aminoácidos de su N-terminal. La invención también provee un polipéptido que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 7 ; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50% (v.gr., 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) identidad de secuencia a SEQ ID NO: 7, y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de por lo menos 7 (v.gr., 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) aminoácidos contiguos de SEQ ID NO: 7. Los polipéptidos preferidos no incluyen la secuencia de aminoácidos MLKCGTFFITRHIPRGCRRFFQPNQARQTEIYQIRGTV (SEQ ID NO: 10) dentro de 20 aminoácidos de su N-terminal. La invención también provee un polipéptido que comprende: (a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ; (b) una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 50% (v.gr., 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% o más) identidad de secuencia a SEQ ID NO: 8, y/o que comprende una secuencia de aminoácidos que consiste de un fragmento de por lo menos 7 (v.gr., 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 225, 250) aminoácidos contiguos de SEQ ID NO : 8. Los polipéptidos preferidos tienen un residuo N-terminal, preferiblemente correspondiente a Cys-Gln de SEQ ID NO: 8, y la cisteína N-terminal es preferiblemente lipidada. Otros polipéptidos preferidos no incluyen la secuencia de aminoácidos PCMNHQSNS (SEQ ID NO: 11) dentro de 20 aminoácidos de su N-terminal. Los polipéptidos se pueden preparar por varios medios, v.gr., por síntesis química (por lo menos en parte), al digerir polipéptidos más largos mediante el uso de proteasas, por traducción de ARN, por purificación de cultivo de células (v.gr., de expresión recombinante o de cultivo de N. meningitidis) , etc. La expresión heteróloga en un hospedero de E.coli es una vía de expresión preferida. Los polipéptidos de la invención pueden ser fijados o inmovilizados a un soporte sólido. Los polipéptidos de la invención pueden comprender un marcador detectable v.gr., un marcador radioactivo, un marcador fluorescente, o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil en técnicas de inmunoensayo . Los polipéptidos pueden adoptar varias formas (v.gr., nativos, fusiones, glicosilados , non-glicosilados , lipidados, puentes de disulfuro, etc.). Los polipéptidos son preferiblemente polipéptidos meningocócicos . Los polipéptidos se preparan preferiblemente en forma sustancialmente pura o sustancialmente aislada (es decir, sustancialmente libre de otros polipéptidos de Neisseria u otra célula hospedera) o forma sustancialmente aislada, en general, los polipéptidos se proveen en un ambiente no natural v.gr., son separados de su ambiente natural. En ciertas modalidades, el presente polipéptido está presente en una composición que es enriquecida para el polipéptido en comparación con un control. Como tal, se provee un polipéptido purificado, en donde por purificado significa que el polipéptido está presente en una composición que es sustancialmente libre de otros polipéptidos expresados, en donde por sustancialmente libre se entiende que menos de 50%, usualmente menos de 30% y muy usualmente menos de 10% de la composición está hecha de otros polipéptidos expresados. El término "polipéptido" se refiere a polímeros de aminoácido de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede ser interrumpido por compuestos que no sean aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que ha sido modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo formación de enlace de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente marcador. También, incluidos dentro de la definición están, por ejemplo, los polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden presentarse como cadenas individuales o cadenas asociadas .

Generalidades El término "que comprende" abarca "que incluye" asi como "que consiste", v.gr., una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente de X o puede incluir algo adicional, v.gr., X + Y. El término "aproximadamente" en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo, x±10%. La palabra "sustancialmente" no excluye "completamente", v.gr., una composición que es "sustancialmente libre" de Y puede ser completamente libre de Y. En donde es necesario, la palabra "sustancialmente" puede ser omitida de la definición de la invención. Referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significa que, cuando están alineadas, el porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. Esta alineación y el por ciento de homología o identidad de secuencia se puede determinar mediante el uso de programas de software conocidos en la técnica, por ejemplo, aquellos descritos en la sección 7.7.18 de la referencia 204. Una alineación preferida es determinada por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman mediante el uso de una búsqueda de espacio afín con una sanción abierta de espacio de 12 y una sanción de extensión de espacio de 2, matriz de BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman es bien conocido y se describe en la referencia 205. Las referencias a proteínas ' MB ' con un número de cuatro dígitos se refiere a la nomenclatura estándar de la referencia 32, asignada sobre la base de una secuencia de genoma de una cepa prototípica de meningococo de serogrupo B. Las bases de datos de secuencia públicas incluyen estas secuencias de NMB. Para cualquier meningococo dado, el experto en la técnica puede encontrar fácilmente y de manera no ambigua el gen correspondiente a la secuencia de NMBnnnn mediante el uso de la secuencia existente a partir de la base de datos y/o el ambiente genético del NMBnaan ORF en la cepa de prototipo, v.gr., para designar iniciadores, sondas, etc. Los términos ' GNA33 ' , 'NMB0033' y 'mltA' se pueden usar intercambiablemente cuando se refiera a meningococos .

Breve Descripción de los Figuras Las figuras 1A y IB muestran la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) y secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 2) de la mureína transglicosilasa A lítica unida a membrana (mltA) a partir de la secuencia de genoma de la cepa MC58 de Neisseria meningitidis de serogrupo B, tomada del acceso al GenBank AAF40504.1 [32]. La figura 2 muestra 2D-PAGE de vesicular de la invención. La figura 3 muestra salidas de filtración de gel con proteínas estándares (inferiores) y con la pastilla de centrifugación (superior) del sobrenadante de cultivo de la cepa ? mltA. El eje y muestra absorbancia a 28Oran. Las figuras 4A y 4B muestran microscopía electrónica de vesículas de la invención. Las figuras 5A-5F muestran análisis de western blot de vesículas de la invención. Seis anticuerpos diferentes (A-F) se usaron para teñir las transferencias: Fig. 5A = suero de ratón producido contra OMVs preparado a partir de la cepa NZ por extracción de desoxicolato; Fig. 5B= suero de ratón producido contra mutantes "knockout" ? GA33; Fig. 5C= anti-PorAPi.4 monoclonal de ratón; Fig. 5D= suero anti-NMB2132 de ratón; Fig. 5E= suero anti-NMB1030 de ratón; Fig. 5F= suero anti- MB1870 de ratón. Las figura 6 a 8 muestran secuencias de aminoácidos de NMB0928, NMB0109 y MB1057. Las figuras 9 a 11 muestran secuencias de aminoácidos de NMB0928, NMB0109 y NMB1057 que cambian codones de inicio. La figura 12 compara las proteínas liberadas en sobrenadantes de cultivo por bacterias de tipo silvestre o 7GNA33. Franja 1: marcadores de peso molecular; franja 2: control de medio de cultivo; franja 3: 20 µg de proteínas recolectadas por centrifugación a alta velocidad de medio de cultivo 7GNA33 a DO620nm=0.5, correspondiente a 6.5 mi de medio de cultivo; franja 4: proteínas recolectadas por centrifugación a alta velocidad a partir de 6.5 mi de medio de cultivo MC58 de tipo silvestre a La figura 13 muestra SDS-PAGE de extracto total de MC58 de tipo silvestre (franjas 2 y 4) y de vesículas liberadas por mutante "knockout" ?GNA33 (franjas 3 y 5) . Las franjas 2 y 3 son proteínas no desnaturalizadas a 95°C antes de SDS-PAGE; las franjas 4 y 5 fueron desnaturalizadas a 95°C. Las figuras 14 y 15 muestran ID y 2D SDS-PAGE de vesículas preparadas a partir de la cepa 394/98. En la figura 15, el eje horizontal corre de pl 3 a 10 y el eje vertical corre de 10 a 200 kDa . Las figuras 16 y 17 muestran ID SDS-PAGE de vesículas preparadas a partir de cepas "knockout" tolR ExPEC . Las figuras 18 a 20 muestran ID y 2D SDS-PAGE de vesículas de meningococos "knockout" de ? mltA.

Descripción Detallada de la Invención Preparación de cepa "knockout" de ? mltA meningocócica Una cepa meningocócica se preparó en la cual el gen mltA es reemplazado por intercambio alélico con un cásete de antibiótico.

La cepa MC58 de N. meningitidis fue transformada con plásmido pBSUDGNA33ERM . Este plásmido contiene regiones de flanqueo hacia el extremo 5' y hacia el extremo 3' para intercambio alélico, un gen mltA truncado y un gen ermC (que codifica resistencia a eritromicina) . La región de flanqueo hacia el extremo 5' (que incluye el codón de inicio) de la posición -867 a +75 y la región de flanqueo hacia el extremo 3' (que incluye el codón de detención) de la posición +1268 a +1744 fueron amplificadas a partir de MC58 mediante el uso de iniciadores U33FOR, U33REV, D33FOR y D33REV [25] . Los fragmentos fueron clonados en pBluescript™ y transformados en E.coli DH5 mediante el uso de técnicas estándares. Una vez que se completó toda la subclonación, la cepa MC58 de Neisseria naturalmente competente fue transformada al seleccionar unas cuantas colonias que crecieron durante la noche en placas de agar GC y al mezclarlas con 20 µ? de Tris-HC1 de 10 mM(pH 6.5) que contenía 1 g de ADN de plásmido. La mezcla se aplicó mediante manchas sobre una placa de agar-chocolate, se incubó durante 6 horas a 37 °C con 5% de C02, y después se diluyó en solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) y se diseminó sobre placas de agar de GC que contenían 7 µg/ml de eritromicina. El intercambio alélico con el gen mltA cromosómico fue verificado por PCR, y la falta de expresión de MltA fue confirmado por análisis de Western blot . Como se reporta en la referencia 25, la cepa con supresión de expresión de ? mltA no tiene la organización topológica correcta de la membrana celular, tiene una separación de células anormal, morfología de células anormal, septos no divididos, septos dobles, agrupación de células, compartición de membranas externas y virulencia reducida. La referencia 25 también reporta que la cepa "knockout" libera varias proteínas de membrana en el sobrenadante de cultivo, que incluye proteínas de membrana externa PorA, PIB, clase 4 y clase 5. Una supresión de expresión de ? mltA también se hizo a partir de la cepa 394/98 de Nueva Zelanda (lin3; B:4:P1.4), que es la cepa de la cual se produce el producto MeNZB™ .

Análisis de proteínas liberadas La cepa de ? mltA que se hizo crecer en medio de cultivo GC en una atmósfera humidificada que contenía 5% de C02 hasta D06oonm 0.5. Las bacterias fueron recolectadas por 10 minutos de centrifugación a 3500 x g. El sobrenadante (es decir, medio de cultivo) se filtró a través de un filtro de tamaño de poro de 0.22 |im (Millipore) , y el filtrado libre de células se sometió a centrifugación de alta velocidad (200,000 x g, 90 min) . Esta centrifugación dio por resultado la formación de una pastilla, con aproximadamente 8-12 mg de proteína por litro de medio de cultivo. No se vio la pastilla si la bacteria MC58 de tipo silvestre se trató de la misma manera, y de esta manera la formación de pastilla es un resultado del la supresión de expresión de ? mltA. La pastilla se lavó dos veces con PBS (centrifugación 200,000 x g, 30 min) para análisis adicional. En un primer análisis, el material de la pastilla se volvió a suspender en PBS y se aplicó a una columna de filtración de gel Superdex 200 PC3.2/30, se hizo correr en un sistema SMART (Amersham Biosciences) que había sido equilibrado en PBS. La velocidad de flujo fue de 40 µ?/min y el material eluido se monitoreó a 280 nm. La columna se calibró con 20 µg Bleu de dextrano (2,000 kDa) , 10 µg de ferrita (440 kDa) , 140 µg de albúmina de suero de bovino (65 kDa) y 200 g de ribonucleasa A (15 kDa) . Como se muestra en la figura 3, la mayoría de las proteínas se eluyeron en un pico mayor correspondiente a un peso molecular sustancialmente mayor que 2,000 kDa. Este resultado sugiere que las diversas proteínas están asociadas. En un segundo análisis, el material presente en el pico de peso molecular alto se sometió a microscopía electrónica de tinción negativa. Este análisis reveló la presencia de vesículas de membrana bien organizadas con un diámetro de aproximadamente 50-100 nm (figura 4) . Estos experimentos sugirieron que la deleción del gen mltA perturba el ensamble normal de la membrana bacteriana, y que esto da por resultado la liberación espontánea en el sobrenadante de cultivo de estructuras de membrana que se ensamblan en vesículas homogéneas esféricas . La figura 12 muestra análisis de SDS-PAGE de medio de cultivo después del crecimiento de bacterias de tipo silvestre o ?GNA33, y muestra diferentes características de liberación de proteína.

Análisis de vesículas Las vesículas derivadas de ? mltA se compararon con vesículas meningocócicas preparadas por el método de extracción de detergente 'normal' . Las cepas meningocócicas MC58, NZ394/98 y NZ98/254, y sus mutantes ? mltA isogénicos respectivos, se hicieron crecer en 20 mi o 200 mi de medio de cultivo GC en atmósfera humidificada que contenía 5% de C02 hasta DO620nm 0.5. Las bacterias fueron recolectadas por centrifugación de 10 minutos a 3500g. Las vesículas ('DOMVs') se prepararon a partir de las bacterias de tipo silvestre por extracción con detergente como se describe en la referencia 206. Las vesículas de la invención ('mOMVs') se prepararon a partir de cepas "knockout" por filtración a través de filtro de tamaño de poro de 0.22 um, seguido por centrifugación a alta velocidad (200,000g, 90 min) de los filtrados, el lavado de las pastillas que contenían vesícula (centrifugación 200,000g, 30 min) dos veces con solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS) , y la re-suspensión con PBS . Tanto las mOMVs como las DOMVs se analizaron mediante electroforesis mono-dimensional desnaturalizadora . En breve, 20 µg de proteínas de vesícula se resolvieron por SDS-PAGE y se visualizaron mediante tinción con azul de Coomassie de 12.5% de geles. Las condiciones de desnaturalización (2% de SDS) y semi-desnaturalización (0.2% de SDS, sin ditiotreitol , sin calentamiento) fueron sometidas a electroforesis mono-dimensional . La cantidad de proteína (20 µg) se determinó por prueba de proteína DC (Bio-Rad) , mediante el uso de albúmina de suero como una proteína estándar . Las vesículas fueron desnaturalizadas durante 3 minutos a 95°C en regulador de pH de muestra de SDS-PAGE que contenía 2% de SDS. 20 g de proteína fueron después cargados sobre 12.5% de geles de acrilamida, que se tiñeron con azul de Coomassie R-250. La electroforesis bidimensional también se realizó sobre 200 pg de proteína llevada a un volumen final de 125Ú1 con regulador de pH de re-hinchazón que contenía 7M de urea, 2M de tiourea, 2% (p/v) de (3-((3-colamidopropil ) dimetilamonio) -1-propano-sulfonato) , 65 mM de ditiotreitol , 2% (p/v) de amidosulfobetain-14 , 2 mM de tributilfosfina, 20mM de Tris, y 2% (v/v) de amfolito como vehículo. Las proteínas fueron adsorbidas durante la noche en Immobiline DryStrips (7 cm; pH-gradiente 3-10 no lineal) . Las proteínas fueron después 2D-separadas . La primera dimensión se hizo correr mediante el uso de una unidad de enfoque isoeléctrico IPGphor, mediante la aplicación secuencial de 150 V durante 35 minutos, 500 V durante 35 minutos, 1,000 V durante 30 minutos, 2,600 V durante 10 minutos, 3,500 V durante 15 minutos, 4,200 V durante 15 minutos, y finalmente 5,000 V para alcanzar 12 kVh. Para la segunda dimensión, las tiras se equilibraron y las proteínas se separaron sobre 9-16.5% de geles de poliacrilamida lineales (1.5-mm de espesor, 4 x 7 cm) . Los geles nuevamente se tiñeron con azul brillante de Coomassie G-250. 266 manchas de proteína se pudieron ver después de tinción con azul de Coomassie coloidal (figura 2) . Los geles ID y 2D se sometieron después a una digestión con proteína in-gel y preparación de muestra para análisis de espectrometría de masa. Las manchas de proteína se cortaron de los geles, se lavaron con 100 mM de bicarbonato de amonio/acetonitrilo 50/50 (V/V) , y se secaron con el uso de una centrífuga SpeedVac . Las manchas secas fueron digeridas 2 horas a 37°C en 12 µ? de 0.012 pg/µ? de tripsina de grado de secuenciación (Promega) en 50 mM de bicarbonato de amonio, 5 mM. Después de la digestión, 5 µ? de ácido trifluoroacético al 0.1% se añadió, y los péptidos se desalaron y se concentraron con ZIP-TIPs (C18, Millipore) . La muesra después se eluyó con 2 µ? de 5 g/1 de ácido 2,5-dihidroxibenzoico en 50% de acetonitrilo/0.1% de ácido trifluoroacético en el espectómetro de masa Anchorchip 384 (400 pm, Bruker, Bremen, Alemania) y se dejó secar con aire a temperatura ambiente. El espectro de MALDI-TOF se adquirió en un Bruker Biflex III MALDI-TOF equipado con un láser de 337 nm de N2 y una fuente de ion de multisonda SCOUT 384 preparada en un modo de reflector de ion positivo. Los voltajes de aceleración y reflector se fijaron a 19 kV y 20 kV, respectivamente. Típicamente, cada espectro se determinó al promedio 100 disparos de láser. Los espectros fueron externamente equilibrados mediante el uso de una combinación de cuatro péptidos estándares, angiotensina II (1,046.54 Da), sustancia P (1,347.74 Da), bombensina (1,619.82 Da) y ACTH18-39 Clip humana (2,465.20 Da), se aplicaron como manchas sobre posición adyacente a las muestras. La identificación de proteína se llevó a cabo por comparación automática y manual de valores monoisotópicos experimentalmente generados de péptidos en el intervalo de masa de 700-3000 Da con huellas generadas por computadora con el uso de software Mascot. Los resultados del mutante MC58 ? mltA se muestran en la figura 18. De las 20 bandas cortadas en el gel ID, 25 proteínas únicas fueron identificadas; 24 (96%) de las cuales se predijo que eran proteínas de membrana externa por el algoritmo PSORT (Tabla 1 siguiente) . 170 manchas de proteína en el gel 2D, correspondientes a 51 proteínas únicas, fueron identificadas de manera no ambigua por MALDI-TOF (Tabla 1) . 44/51 proteínas identificadas han sido asignadas al compartimiento de membrana externa por la anotación de genoma [32] . Las 7 proteínas restantes se analizaron para posibles errores en la anotación original. Cuatro proteínas (las proteínas hipotéticas MB1870, NMB0928 y MB0109, y la glutamiltranspeptidasa NMB1057) pudieron ser clasificadas como proteínas de membrana externa mediante el uso de diferentes codones de inicio a partir de aquellos en la referencia 32, v.gr., para MB1870, mediante el uso del codón de inicio asignado en la referencia 55. Los experimentos de electroforesis ID y 2D combinados identificaron un total de 65 proteínas en las vesículas derivadas del mutante MC58 ? mltA. De estas, 6 proteínas fueron identificadas en los geles ID y 2D, mientras que 14 y 45 fueron específicas para los geles ID y 2D, respectivamente (Tabla 1) . Más aún, 61 de las 65 proteínas identificadas se predijeron como proteínas asociadas a membrana mediante algoritmos actuales, lo que indicó que las vesículas ?mltA (mOMVs) son en su mayoría, y posiblemente exclusivamente constituidas por proteína de membrana. La supresión de expresión de ?mltA de la cepa NZ394/98 fue similarmente sometida a SDS-PAGE ID y 2D (figuras 14 4 15). La tabla 2 muestra 66 proteínas que fueron identificadas en uno o ambos de los geles, junto con la ubicación predicha de las proteínas. Nuevamente, la mayoría de las proteínas se predijeron como asociadas a membrana. Las 47 proteínas comunes a las tablas 1 y 2 se muestran en la tabla 3. Los resultados del mutante NZ98/254 ? mltA se muestran en la figura 19. 66 proteínas fueron identificadas de estos dos geles, 57 de las cuales fueron asignadas al compartimiento de membrana externa. Nuevamente, por lo tanto, las mOMVs fueron altamente enriquecidas en proteínas de membrana externa. 46 de las 57 proteínas también habían sido identificadas en las mOMVs derivadas de MC58. Para comparación, la figura 20 muestra los resultados de NZ98/254 DOMVs . El análisis proteómico reveló 138 proteínas, solo 44 de las cuales fueron asignadas al compartimiento de membrana externa. Las 94 proteínas restantes pertenecieron a los compartimientos citoplásmico y de membrana interna. De estas 44 proteínas de membrana, 32 también se encontraron en las 57 proteínas de membrana externa encontradas en las mOMVs de la cepa isogénica. Aunque las mOMVs están constituidas en gran medida por proteínas de membrana externa, por lo tanto, aproximadamente 70% de proteínas DOMV son ya sea proteínas citoplásmicas o de membrana interna. Las DOMVs difieren de las mOMVs no solo por la proporción de proteínas citoplásmicas sino también para el perfil diferente de sus proteínas de membrana externa. De las 44 proteínas de membrana externa vistas en DOMVs, sólo 32 también se vieron en mOMVs . 19 proteínas vistas en mOMVs tanto de MC58 como de NZ98 / 254 , pero no en DOMVs de NZ98 / 254 , se listan en la tabla 4 que se da más adelante. Un extracto de células total de bacterias se preparó como sigue: las células bacterianas se lavaron con PBS, y la pastilla bacteriana se volvió a suspender en 8 mi de Tris-HCl 50 mM, pH 7.3, que contenía un cóctel de inhibidor de proteasa (Roche Diagnostic) . 2 mM de EDTA y 2000 unidades de benzonasa (Merck) se añadieron, las células fueron alteradas a 4°C con alterador de células modelo Basic Z 0.75V equipado con una "cabeza de un disparo" (Constant System Ltd) por 2 ciclos, y las células no rotas fueron removidas por centrifugación 10 minutos a 8 000 x g a 4°C. Este extracto se analizó por SDS-PAGE, para comparación con un extracto de proteína de las vesículas producidas por bacterias ? GNA33. Como se muestra en la figura 13, las porinas PorA y PorB (identidades verificadas por secuenciación de MALDI-TOF) se ven en la membrana externa bacteriana de tipo silvestre (franjas 2 y 4 ) y también en vesículas de mutante "knockout" de ? GNA33 (franjas 3 y 5 ) . Más aún, estas proteínas con retenidas como trímeros estables en las vesículas que no se disocian en monómeros en el regulador de pH de muestra de SDS-PAGE con una baja concentración de SDS ( 0 . 2 % ) bajo condiciones seminativas (sin calentar antes de la electroforesis ; franjas 2 y 3 ) , pero que se desnaturalizan a 95°C (franjas 4 y 5 ) . Los niveles de LPS en OMVs extraído con detergente son típicamente 5 - 8 % en peso, en relación con la proteína [ 2 07 ] . Cuando se prueba con la prueba de Limulus, el contenido de endotoxina de las vesículas fue aproximadamente dos veces tan alto como el encontrado en las OMVs extraídas con detergente. Finalmente, la producción de vesículas en un cultivo en crecimiento se evaluó. Se encontró que hasta 2 0 mg de proteínas asociadas a OMV pudieron ser recuperadas por gramo de células (peso húmedo) en sobrenadante de cultivo de cultivos en crecimiento exponencial tempranos (DO620nm= 0 . 5 ) .

Inmunogenicidad de vesículas Puesto que las vesículas derivadas de ? mltA son altamente enriquecidas en proteínas de membrana externa, su capacidad para inducir anticuerpos bactericidas capaces de matar un panel amplio de aislados clínicos de MenB se investigó . La cepa escogida para prueba fue 394 / 98 . Esta cepa se escogió porgue es la cepa de la cual se prepara la vacuna basada en OMV MeNZB™, por lo que ayuda a una comparación directa de vesículas ?mltA de la invención con OMVs preparadas a partir de la cepa de tipo silvestre por métodos de la técnica anterior típicos. 10 \ig de cada tipo de vesicular fue adsorbido a un adyuvante de hidróxido de aluminio ( 3 mg/ml) e inyectado en ratones hembra CDl de 5 semanas de edad ( 5 - 10 ratones por grupo) . Las vesículas se dieron intraperitonealmente en los días 0 y 21 . Muestras de sangre para análisis se tomaron el día 34 , y se probaron para SBA contra 15 cepas de serogrupo B diferentes correspondientes a 11 subtipos diferentes que, incluían los cuatro linajes hipervirulentos principales, mediante el uso de suero de conejo recién nacido de acervo como la fuente de complemento. Los títulos bactericidas en el suero fueron identificados como la dilución de suero que da por resultado 50% de disminución en unidades formadoras de colonia (CFU) por mi después de 60 minutos de incubación de bacterias con mezcla de reacción, comparada con CFU de control por mi en el tiempo 0 . Típicamente, las bacterias incubadas con el anticuerpo de control negativo en presencia de complemento mostraron un 150 a 200% de incremento en CFU/ml durante la incubación de 60 minutos. Los títulos fueron los siguientes, expresados como el recíproco del rendimiento de dilución en el suero =50% de aniquilación de bacterias : Título de BCA Serogrupo: tipo: subtipo mOMVs DOMVs B: : 4 : Pl .4 >8192 >32768 B: :15:P1.7, 4 >65536 32768 B: :4,7:P1.7,4 >32768 >32768 B: :14:P1.3 >32768 >65536 B: :4:P1.7,4 >32768 8192 B: :4, :P1.4 >8192 >8192 B: :14:P1.13 16384 512 B: :4,7 :P1.7, 13 >8192 128 B: :4:P1.15 >8192 128 B: :21:P1.9 >8192 >16 B: :2b:Pl.lO 1024 >16 B: :4,7:P1.19,15 1024 >16 B: :2b:Pl.5,2 1024 >16 B: :2a:Pl.2 >16 >16 B: : NT : Pl .3 >16 >16 Los resultados muestran que el suero de vesícula derivada de ?mltA fueron por lo menos tan efectivas bactericidamente y usualmente mejores que, OMVs preparadas por extracción química, excepto para la cepa homologa. Las vesículas de la invención por lo tanto dan una mucho mejor reactividad de cepa cruzada que OMVs típica. Más aún, al tomar una dilución de 1:1024 como el umbral para eficacia bactericida, las vesículas de la invención fueron efectivas contra el 87% de las cepas, mientras que las OMVs artificiales fueron sólo 40% efectivas. Por lo tanto, las mOMVs son mejores que DOMVs para inducir aniquilación de anticuerpo dependiente de complemento cuando se prueban sobre un panel de 15 cepas de serogrupo B diferentes. Los sueros de ratón anti-mOMV mostraron actividades bactericidas altas contra la cepa homologa y contra 14 cepas adicionales, que incluían 10 subtipos de PorA diferentes. Por el contrario, los sueros de ratón producidos contra DOMVs mostraron títulos bactericidas altos sólo contra seis cepas MenB, pertenecientes a dos subtipos de PorA. Estos resultados indican que la protección de sueros anti-mOMV no solo se debieron a la inducción de anticuerpos bactericidas contra PorA, que es una de las proteína de membrana externa más abundantes y el inductor más potente de los anticuerpos bactericidas, sino también a otros antígenos bactericidas que en las mOMVs están presentes en cantidades más altas que en DOMVs .

Western blot Para confirmar que las vesículas derivadas de ?mltA contienen antígenos protectores conservados, se hicieron correr en un SDS-PAGE, se transfirieron a un filtro PDF y se inmunotransfirieron mediante el uso de antisuero específico contra seis antígenos de proteína previamente mostrados que eran protectores y altamente conservados, con la inclusión de '287', '953', '741' (GNA1870) y vNadA' . Las vesículas se separaron en 10% de geles de acrilamida SDS-PAGE mediante el uso de un aparato de electroforesis Mini-Protean II (Bio-Rad) . Después de la separación de proteínas, los geles se equilibraron con 48 mM de Tris-HCl, 39 mM de glicina, pH 9.0, 20% (v/v) de metanol y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad) mediante el uso de células de transferencia electroforéticas semisecas Trans-Blot™. Las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas con 10% (p/v) de leche descremada en PBS que contenía 0.2% (p/v) de azida de sodio. Como se muestra en la figura 5, todas las seis proteínas fueron abundantes en las vesículas. Por el contrario, las mismas seis proteínas fueron deficientemente representadas en las DOMVs . En conclusión, las vesículas derivadas de ?mltA están predominantemente constituidas por proteínas de membrana externa, mientras que las DOMVs están fuertemente contaminadas por proteínas citoplásmicas. Cuando se usan para inmunizar ratones, los sueros producidos contra vesículas derivadas de ?mltA mostraron una cobertura de cepa más alta y más ancha que DOMVs .

E.coli patogénico extraintestinal Una cepa "knockout" ExPEC CFT073 se preparó por deleción isogénica al gen tolR, al reemplazarlo con un marcador de resistencia a la canamicina. La cepa "knockout" se hizo crecer a DOeoonm 0.4, y el cultivo se centrifugó después. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0. 22 µp? y el filtrado se precipitó mediante el uso de TCA. La pastilla después se volvió a suspender en regulador de pH Tris . El mismo procedimiento de crecimiento y purificación se uso para la cepa progenitora, sin la supresión de expresión, y análisis de SDS - PAGE de las dos preparaciones finales se muestra en la figura 16. La banda derecha es de la cepa "knockout" y muestra enriquecimiento de varias bandas de proteína. Cepas ExPEC "knockout" tolR adicionales se prepararon a partir de DH5a, 536 y IHE3034. Se prepararon vesículas igual que antes, y el análisis de SDS-PAGE de precipitado de TCA se muestra en la figura 17. El imitante "knockout" produce altas cantidades de vesículas, y estas vesículas se sometieron a análisis proteómico, que incluía SDS-PAGE ID y 2D y digestión tríptica de proteínas expuestas a la superficie en las vesículas seguidas por análisis de secuencia de péptidos liberados. Se entenderá que la invención se ha descrito a manera de ejemplo únicamente y que se pueden hacer modificaciones mientras permanezcan dentro del alcance y espíritu de la invención.

Tabla 1 Nombre de proteína/PM teórico/pl MB Id 3-10 Psort teórico/índice de 1 NMB0018 Pilina PiiE/15 246/9 : 21/-0.571 X OM-PS Proteína hipotética conservada/40 2 NMB0035 X OM-IN 218/4.74/-0.371 Péptido-dulfóxido de metionina 3 MB0044 X OM-IN reductada/55 718/6.54/-0.569 Proteína hipotética/34 987/4.82/- 4 MB0086 X OM-IN 0.505 Proteína de membrana externa Pl, 5 MB0088 X OM-PS putativa/45 902/-0.428 Proteína hipotética conservada/13 6 MB0109 X X OM-PS (b) 188/6.77/-0.587 Factor de alargamiento-traducción NMB0124 cito TU/42 90909/5.07/-0.136 X Factor de alargamiento-traducción MB0139 cito TU/42 925/5.07/-0.142 Factor de alargamiento G (EF-G) /77 NMB0138 X cito 244/5.08/-0.293 Proteína de membrana externa OmpH, MB0181 x OM-PS putativa(16 829/9.07/-0.897 Proteína de membrana externa NMB0182 X X OM-PS Omp85/86 254/8.37/-0.505 Lipoproteína, putativa/12 207/8.08/- NMB0204 X OM-PS 0.446 Proteína de intercambio de NMB0278 tiol : disulfuro DsbA/-23 428/5.16/- X OM-IN 0.298 Peptidil-prolil cis-trans NMB0281 X OM-PS isomerasa/35 248/9.62 /-O .388 Proteína de intercambio de MB0294 tiol : disulfuro DsbA/23 566/5.09/- X OM-IN 0.477 Lipoproteína, putativa/52 645/9.97/- MB0313 X OM-PS 0.824 Factor de unión celular, putativa/29 NMB0345 X X OM-PS 448/9.13/-0.570 Proteína hipotética/26439/5.15/- NMB0346 X OM-PS 0.716 Proteína de membrana externa clase MB0382 X X OM-PS 4/23 969/6.26/-0.456 Proteína de intercambio de MB0407 tiol :disulfuro DsbA/21 721/9.23/- X OM-PS 0.308 Proteína de unión de transferina NMB0460 x OM-IN 2/75 292/5.79/-0.982 Proteína de unión de transferina NMB0461 X OM-PS 1/99 314/9.45/-0.699 Proteína de intercambio de NMB0550 tiol rdisulfuro DsbC/26 451/6.93/- X OM-IN 0.345 MB0554 Proteína dna /68 792/4.85/-0.357 X cito Proteína portadora de lipoproteína MB0622 de membrana externa /19 996/9.47/- X OM-PS 0.490 Transportador ABC MB0623 espermidina/putrescina/39 511/5.38/- X OM-PS 0.437 Hierro ( III ) ABC tranbsportador, NMB0634 proteína de unión periplásmica/35 X OM-PS 806/9.60/-0.338 Proteína de membrana externa NsgA/16 NMB0663 X OM-PS 563/9.49/-0.214 Serina endopeptidasa específica de MB070Ó X OM-PS IgA Lipoproteína de competencia ComL/29 NMB0703 X OM-IN 275/8.72/-0.761 Proteína hipotética conservada/15 NMB0783 OM-PS 029/7.05/-0.221 Transportador ABC de aminoácido/26 NMB0787 OM-IN 995/5.42/-0.287 Lipoproteína de membrana externa NMB0873 OM-IN LoIB, putativa/-19 575/5.23/-0.470 Proteína hipotética/39 502/9.13/- NMB0928 x OM-IN(b) 0.596 Proteína hipotética conservada/18 NMB1030 OM-PS 700/7.16/-0.429 Proteína de membrana externa clase NMB1053 x OM-PS 5/28 009/9.68/-0.610 Gamma-glutamiltranspeptidasa/61 NMB1057 OM-I (b) 590/5.94/-0.160 Proteína hipotética/22 025/8.03/- NMB1126 X OM-IN 0.355 X Proteína hipotética/22 025/8.03/- NMB1164 OM-IN 0.355 NMB1285 Enolasa/46 134/4.78/-0.200 X cito Proteína ribosomal 30S Sl/61 MB1301 X cito 177/4.9/-0.240 Peptidasa carboxi-terminal/53 NMB1332 X IN 238/9.12/-0. 20 Proteína hipotética/13 699/9.52/- NMB1352 X OM-PS 1.397 Proteína de membrana externa PorA/40 MB1429 X X OM-PS 129/8.73 MB1457 Transcetolasa/71 659/5.45/-0.183 X cito Lipoproteína NlpD, putativa/40 MB1483 X X OM-PS 947/9.55/-0.266 Proteína de membrana externa H.8/16 NMB1533 X OM-IN 886/4.61/17 Proteína hipotética conservada/15 MB1557 X OM-PS 419/7.34/-0.429 Potenciador de infectividad de B1567 X OM-IN macrófago/26 875/5.50/-0.540 Proteína hipotética conservada/21 NMB1578 X OM-IN 135/4.86/-0.381 Transportador ABC de aminoácido/27 NMB1612 X OM-PS 970/4.87/-0.408 Proteína de opacidad, cambio de NMB1636 - X X OM-PS marco aüténtico/27180/9.52 Glutamato deshidrogenasa, NADP- B1710 X cito específico/48 490/5.98/-0.190 Proteína de canal de bomba de eflujo NMB1714 X OM de multifármaco/48 482/8.38/-0.261 Proteína hipotética/26 964/7.23/- NMB1870 X OM-I (b) 0.485 NMB1898 Lipoproteína/17 155/7.01/-0.709 X OM-IN Lipoproteína de membrana externa/29 MB1946 X OM 258/5.01/-0.354 Transglicosilasa de mureína lítica MB1949 X OM-IN soluble, putativa/65 617/9.31/-0.525 Proteína relacionada con VacJ/27 NMB1961 X OM-PS 299/4.65/-0.344 Antígeno específico de serotipo 1, N B1969© X cito putativo MB1972 Chaperonina 60 kDa/57 423/4.9/-0.052 X cito Proteína de membrana externa NMB1988 regulada con hierro FrpB/76 X OM-PS 823/9.42/-0.700 Proteína de membrana externa mayor NMB2039 X X V PIB/33 786/6.54/-0.468 Hemolisina, putativa/19 412/9.55/- MB2091 X O -IN 0.152 Proteína de complejo de adhesina, MB2095 X OM-IN putativa/11 385/9.52 /-O .470 Factor de alargamiento TS (EF-TS)/30 NMB2102 X cito 330/5.30/-0.016 Gliceraldehído 3-fosfato NMB2159 X cito deshidrogenasa/35 845/5.40/-0.028 Tabla 2 NMB Anotación Psort ID 2D MB0035 Proteína hipotética conservada OM-IM X N B0044 Sulfóxido de péptido metionina OM-IM X reductasa NMB0086 Proteína hipotética OM-IM X NMB0088 Proteína de membrana externa Pl, OM-PS X X putativa MB0109 Proteína hipotética conservada OM-PS (B) X X NMB0124 cito (c,x) X X NMB0138 Factor de alargamiento G (EF-G) cito (x) X NMB0182 Proteína de membrana externa Omp85 OM-PS X X NMB0204 Lipoproteína, putativa OM-PS X NMB0278 Proteína de intercambio de OM-IM X tiol : disulfuro DsbA NMB0294 Proteína de intercambio de OM- IM X tiol : disulfuro DsbA MB0313 Lipoproteína, putativa OM X NMB0345 Factor de unión cellular, putativa OM-PS X X NMB0346 Proteína hipotética OM-PS X X NMB0382 Proteína de membrana externa clase 4 OM-PS X X NMB0460 Proteína de unión a transferina 2 OM-IM X NMB0461 Proteína de unión a transferina 1 OM-PS X NMB0462 Transportador de espermidina/putrescina ABC, proteína OM-PS (b) X de unión de espermidina/putrescina periplásmica NMB0550 Proteína de intercambio de OM-IM X X tiol : disulfuro DsbC MB0554 Proteína dnaK LITT . X NMB0604 Alcohol deshidrogenasa, que contiene IM X zinc MB0623 Transportador de espermidina/putrescina ABC, proteína OM-IM X de unión de espermidina/putrescina periplásmica MB0631 Fosfato acetiltransferasa Pta IM X NMB0634 Transportador ABC hierro (III) , OM-PS X proteína de unión periplásmica NMB0663 Proteína de membrana externa NspA OM-PS X X MB0669 Proteína hipotética conservada OM-PS X MB0703 Lipoproteína de competencia ComL OM-IM X X comí .. NMB0787 Transportador de aminoácido ABC, proteína de unión a aminoácido OM X periplásmico MB0872 Proteína hipotética conservada OM-PS X NMB0873 Lipoproteína de membrana externa OM-IM X X LolB, putativa NMB0928 Proteína hipotética OM-IM(b) X X NMB0944 5- metiltetrahidropteroiltriglutamato- IM X homocisteína metiltransferasa NMB0983 Fosforibosilaminoinidazolcarboxamida IM X formiltransferasa/INP ciclohidrolasa MB1030 Proteína hipotética conservada OM-PS X X NMB1040 Proteína hipotética OM-PS X MB1053 Proteína de membrana externa clase 5 OM-PS X X opc NMB1057 Gamma-glutamiltranspeptidasa OM-IM (b) X NMB1124 Proteína hipotética OM-IM X NMB1125 Proteína hipotética OM-IM X X NMB1126 Proteína hipotética OM-IM X X NMB1285 Enolasa LITT . X MB1301 Proteína ribosomal 30S SI LITT. X MB1309 Biogénesis de FiNbrial y proteína de IM X X motilidad crispada MB1313 Factor de activación FACS+ X MB1332 Peptidasa carboxi-terminal IM X X MB1398 Cu-Zn-superóxido dismutasa OM-PS X N B1429 Proteína de membrana externa PorA OM-PS X X porA MB1483 Lipoproteína Nipd OM-PS X X NMB1497 Receptor dependiente de TonB OM X NMB1518 Acetato cinasa IM X NMB1533 Proteína de membrana externa H .8 OM-PS X NMB1567 Potenciador de inefectividad de OM-IM X macrófago NMB1574 Ceto-ácido reductoisomerasa CYTO X MB1612 Transportador ABC de aminoácido, proteína de unión a aminoácido OM-IM X periplásmico NMB1710 Glutamato deshidrogenasa, NADP- LIT . X específico NMB1812 Putativa OM-PS X MB1870 Proteína hipotética OM-IM (b) X NMB1898 Lipoproteína mlp OM-IM X X NMB1902 ADN polimerasa III, subunidad beta CYTO X MB1949 Transglicosilasa de mureína lítica OM-IM X soluble, putativa NMB1961 Proteína relacionada con VacJ OM-PS X NMB1972 Chaperonina, 60 kDa LITT. X X NMB1988 Proteína de membrana externa OM-PS X X regulada con hierro FrpB MB2039 Proteína de membrana externa mayor OM-PS X X PIB NMB2091 Hemolisina, putativa OM- IM X MB2139 Proteína hipotética conservada OM-IM X 34 56 Tabla 3 Tabla 4 Referencias (los contenidos de los cuales se incorporan aquí por referencia) . [1] Bjune et al (1991) Lancet 338(8775) : 1093-1096. [2] de Kleijn et al. (2001) Vaccine 20:352-358. [3] Patentes de E.U.A 5,591,512 y 5,747,653; véase también Patente europea 0301992. [4] Patente europea 0449958 (concedida de WO90/06696) . [5] Patente de E.U.A. 5,705,161; véase también WO94/08021. [7] Pannar et al . (1997) Vaccine 15:1641-1651. [8] 099/59625. [9] WO00/50074. [10] Patentes de E.U.A 5,552,146, 5,981,213 y 5,993,826; véase también WO93/03761. [11] Zhou et al. (1998) FEMS Microbiol Lett 163 :223-228. [ 12 ] Kadurugamuwa y Beveridge (1999) Microbiology 145:2051-2060. [13] WO97/05899. [14] Kesavalu et al. (1992) Infect. Immun. 60:1455- 1464. [15] Blanco et al. 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Claims (25)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Una bacteria caracterizada porque: (i) tiene una pared celular que incluye peptidoglican; y (ii) no expresa una proteína que tiene la actividad de transglicosilasa lítica de proteína mltA. 2. Una bacteria caracterizada porque tiene una mutación "knockout" de su gen mltA.
3. 3. La bacteria de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque tiene también una mutación "knockout" de por lo menos un gen adicional .
4. 4. La bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque está en el género Neisseria o Escherichia .
5. 5. La bacteria de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque es N. meningitidis .
6. 6. La bacteria de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la N. meningitidis es del serogrupo A, B, C, W135 o Y.
7. 7. La bacteria de conformidad con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, caracterizada porque es un meningococo gna33~ lpxa' PorA' .
8. 8. La bacteria de conformidad con la reivindicación 4 , caracterizada porque es E. coli.
9. 9. La bacteria de conformidad con la reivindicación 8 , caracterizada porque es una E. coli patógena.
10. 10 . La bacteria de conformidad con la reivindicación 9 , caracterizada porque la E.coli patógena es una bacteria patógena extraintestinal , una bacteria uropatogénica, o una bacteria asociada con meningitis/sepsia .
11. 11 . Una bacteria Escherichia coli patógena, caracterizada porque no expresa una proteína del complejo Tol-Pal .
12. 12 . La E.coli de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada porque es una cepa tolR".
13. 13 . Una composición que comprende vesículas que, durante el cultivo de la bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque las vesículas se liberan al medio de cultivo.
14. 14 . La composición de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizada porque no comprende ninguna bacteria viva y/o entera.
15. 15 . Una composición que comprende vesículas, caracterizada porque las vesículas están presentes en el filtrado obtenible después de la filtración a través de un filtro de 0 . 22 µp? de un medio de cultivo en el cual ha crecido una bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.
16. 16. Una vesícula meningococica caracterizada porque es obtenible al cultivar la bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.
17. 17. La vesícula meningococica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque no incluye por lo menos una de las proteínas MinD, FtsA, y/o fosfoenolpiruvato sintasa .
18. 18. La vesícula meningococica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es sustancialmente libre de ribosomas .
19. 19. La vesícula meningococica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es sustancialmente libre de cualquier aminoácido ARNt-sintetasas .
20. 20. La vesícula meningococica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque es sustancialmente libre de cualquier enzima del ciclo de Krebs .
21. 21. La vesícula meningococica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque incluye las siguientes 47 proteínas: MB0035, NMB0044, MB0086, MB0088, NMB0109, NMB0124, NMB0138, NMB0182, NMB0204, NMB0278, NMB0294, NMB0313, NMB0345, NMB0346, NMB0382, NMB0460, NMB0461, NMB0550 , NMB0554, NMB0623, NMB0634, NMB0663, NMB0703, NMB0787, NMB0873, NMB0928, N B1030, NMB1053, NMB1057, MB1126, MMB1285, MB1301, NMB1332, MB1429, NMB1483, MB1533, NMB1567, NMB1612, NMB1710, NMB1870, NMB1898, NMB1949, B1961, NMB1972, MB1988, NMB2039 and NMB2091.
22. 22. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende vesículas meningocócicas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21.
23. 23. Una composición que comprende (i) un primer conjunto de vesículas meningocócicas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21 y (ii) un segundo conjunto de vesículas meningocócicas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, caracterizada porque el primer y segundo conjuntos se preparan de diferentes cepas de meningococos .
24. 24. La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13, 14, 15, 22 ó 23, caracterizada porque incluye un adyuvante.
25. 25. Un procedimiento para preparar vesículas bacterianas, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) cultivar la bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en un medio de cultivo de tal manera que la bacteria libera vesículas a ese medio; y (ii) recolectar las vesículas de ese medio.