CN111321141A

CN111321141A - 稳定期特异性启动子及其应用

Info

Publication number: CN111321141A
Application number: CN201811531081.2A
Authority: CN
Inventors: 陈玲; 周豪宏; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; Cathay Biotech Inc; CIBT America Inc
Priority date: 2018-12-14
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2038-12-14
Also published as: CN111321141B

Abstract

本发明提供30个稳定期特异性启动子(序列如SEQ ID NO:1‑30所示)及其应用。本发明提供的稳定期诱导的启动子主要集中在菌体生长稳定期启动重组表达，这对于发酵生产具有很重要的意义，特别是在发酵生产对宿主细胞有毒性的产品等。在发酵过程中，在稳定期时才会启动表达，避免了因宿主细胞受到毒害而导致减产。本发明为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供有力的技术支持。

Description

稳定期特异性启动子及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种稳定期特异性启动子序列及其应用。

背景技术

赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,简称LDC,分类号为EC 4.1.1.18)广泛存在于微生物、动物和高等植物中，其可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO₂。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法戊二胺生产主要采用微生物发酵生产和微生物体外酶催化生产戊二胺。

利用微生物发酵生产或微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺时，使用较多的是根据乳糖操纵子来构建赖氨酸脱羧酶基因表达盒，CN105441497A中通过构建结构为LacIq-IPTG/乳糖诱导型启动子(Ptac)-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的表达盒，使得赖氨酸脱羧酶基因分泌表达。而使用这种方法在大规模工业生产时需额外添加乳糖，增加了生产成本。

研究人员发现原核生物体内自然存在着一些启动子是当菌体生长到稳定期后才会启动下游基因的表达的，称为稳定期诱导的启动子，或称稳定期特异性启动子，如csiE，bolA，osmY，katE等。除此之外，还需进一步开发在稳定期特异性诱导的且能够高水平驱动目的基因表达的新型启动子。

发明内容

本发明的目的是提供稳定期特异性启动子及其应用。

本发明的另一目的是提供一步法发酵生产1,5-戊二胺的方法。

为了实现本发明目的，本发明人提供的稳定期诱导的启动子能够在稳定期利用微生物大量表达异源蛋白，为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供技术支持。进一步地，为了实现一步法发酵生产1,5-戊二胺，将编码赖氨酸脱羧酶的基因构建至具有生产L-赖氨酸能力的菌株中。考虑到若赖氨酸脱羧酶和赖氨酸同时表达，生成的具有毒性的1,5-戊二胺会影响细胞生长。于是采用稳定期启动子，以使菌株先发酵生产赖氨酸，进入稳定期后再发酵生产赖氨酸脱羧酶，减少产物1,5-戊二胺对菌体生长的不利影响。

第一方面，本发明提供的稳定期特异性启动子，所述启动子的大小为37-45bp，至少包括-10区、RNA聚合酶б^s特异性识别位点和-35区；

其中，将所述启动子序列的3’末端碱基对应于下游基因转录起始位点的位置记为-1位，所述-10区位于-12～-7位，碱基组成为5’-TATACT-3’；

所述启动子序列的-13位碱基为C；

所述RNA聚合酶б^s特异性识别位点位于-18～-14位，碱基组成为5’-TTGTT-3’；

所述-35区的碱基组成为5’-TCCCGCC-3’或5’-TCCCGAC-3’，且所述-35区和-10区之间间隔的碱基数为15-20bp。

进一步地，所述稳定期特异性启动子的序列为：

i)SEQ ID NO:1-30任一所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1-30任一所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或

iii)在严格条件下与SEQ ID NO:1-30任一所示序列杂交且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或

iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列。

第二方面，本发明提供含有所述稳定期启动子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

第三方面，本发明提供所述稳定期启动子的以下任一应用：

1)作为原核生物的稳定期特异性启动子的应用；

2)在构建重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌中的应用。

所述原核生物为细菌，例如埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的细菌；优选地，所述细菌选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌。

进一步地，本发明提供所述稳定期启动子作为大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)在发酵生产赖氨酸脱羧酶中调控赖氨酸脱羧酶基因表达的稳定期特异性启动子的用途，或者作为大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)或谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)在发酵生产1,5-戊二胺中调控赖氨酸脱羧酶基因表达的稳定期特异性启动子的用途。

第四方面，本发明提供一种重组DNA，由所述启动子与下游目的基因可操作连接而成。

本发明中，所述目的基因选自编码蛋白质的核酸、编码核酶的核酸、编码反义RNA的核酸；优选地，所述蛋白质为酶、激素、抗体或生长因子；更优选地，所述酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。进一步地，所述裂合酶为脱羧酶；所述脱羧酶为氨基酸脱羧酶，如赖氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶或谷氨酸脱羧酶。又进一步地，所述赖氨酸脱羧酶来源于大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜碱芽孢杆菌(Bacillus halodurans)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)或奥克西托克雷白杆菌(Klebsiella oxytoca)。更进一步地，所述赖氨酸脱羧酶由cadA基因、ldcC基因、haldc基因、cadA基因的片段、ldcC基因的片段或haldc基因的片段所编码。更进一步优选由cadA基因编码的赖氨酸脱羧酶。

第五方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体包含所述的重组DNA。

在一些实施例中，所述表达载体携带含有赖氨酸脱羧酶基因的表达盒，且所述表达盒由所述稳定期特异性启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。

第六方面，本发明提供一种转化体，所述转化体为携带所述表达载体的宿主菌。

所述宿主菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的菌种；优选地，所述宿主菌选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌；更优选地，所述宿主菌为大肠杆菌(E.coli)或蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。

第七方面，本发明提供所述转化体在发酵生产氨基酸、多肽或蛋白质中的应用。

第八方面，本发明提供一种产赖氨酸脱羧酶的工程菌，所述工程菌的出发菌株为具有生产L-赖氨酸能力的大肠杆菌，并携带含有赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒，所述赖氨酸脱羧酶基因表达盒由所述稳定期特异性启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。

优选地，所述出发菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)Ela6116，保藏编号CCTCCM 2018736。

优选地，所述赖氨酸脱羧酶基因是来自大肠杆菌内源的cadA基因。

优选地，所述稳定期特异性启动子为SEQ ID NO:4、6、11、14、16、18、19、22、25、26、28任一所示的启动子。

第九方面，本发明提供一种发酵生产1,5-戊二胺的方法，包括在发酵培养基中对所述产赖氨酸脱羧酶的工程菌进行培养以生产1,5-戊二胺。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的稳定期诱导的启动子主要集中在菌体生长稳定期启动重组表达，这对于发酵生产具有很重要的意义，特别是在发酵生产对宿主细胞有毒性的产品，如1,5-戊二胺等。在发酵过程中，在稳定期时才会启动表达，降低了因宿主细胞受到毒害而导致减产。另外，本发明筛选到的一些启动子相对现有技术中已公开的稳定期启动子而言，更适合应用于发酵培养生产1,5-戊二胺。本发明为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供有力的技术支持。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

本发明中采用如下定义：

本发明中所使用的碱基序列，核苷酸、氨基酸(单字母)的缩写，是基于国际理论和应用化学联合会及国际生物联合会对生物化学命名的规定，可参考European Journal ofBiochemistry 1984年底138卷第9期的＂准备含碱基序列和氨基酸序列的说明书的指导＂一文中的缩写，以及在生物技术领域中通用的缩写。

以下实施例中述及的PCR扩增、质粒提取、酶切、酶切产物连接、转化的具体步骤、条件参数等均按所购相关酶和试剂的说明书建议的条件进行。其中PCR扩增所用的DNA聚合酶、酶切所用的限制性内切酶、酶切产物连接所用的连接酶均购自宝生物工程(大连)有限公司。质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒、PCR纯化试剂盒均购自康宁生命科学(吴江)有限公司，商标Axygen，引物均购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，商标INVITROGEN。大肠杆菌E.coli BL21购自宝生物工程(大连)有限公司。

以下实施例中述及的质粒转化方法如下：将连接产物加入至100μl的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴20min后在42℃中热激90s。冰上孵育5min后加入1ml的LB(即LB液体培养基)。涂布至相对应的抗性平板上。

以下实施例中所用的引物如下：

实施例1稳定期表达的启动子序列

本发明设计并合成了30条启动子序列，所述启动子的长度为37-45bp，分别如下所示(5’-3’，启动子序列中3’端最后一个碱基对应下游基因转录起始位点的位置为-1位)，其中双下划线标注的为-10区(-12～-7)，-10区碱基组成为5’-TATACT-3’；延伸的-10区为(-13位)保守碱基C；-18～-14位碱基组成为5’-TTGTT-3’，该区域为RNA聚合酶б^s的特异性识别所必须；单下划线标注为可能的-35区，为本发明发现的保守区域所在，所述启动子-35区和-10区之间的间隔区碱基数可以为15-20bp。

1.TCCCGCCTAATTATTAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:1)

2.TCCCGCCTTATTATTAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:2)

3.TCCCGCCTTTTTATTAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:3)

4.TCCCGCCAAATCCCTAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:4)

5.TCCCGCCTTTATATTATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:5)

6.TCCCGCCTTTAAATTAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:6)

7.TCCCGCCTTTAGGTTAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:7)

8.TCCCGCCTTTAGGATCAAAATTGTTC

GAATAG(SEQ ID NO:8)

9.TCCCGCCTTTAGGCTAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:9)

10.TCCCGCCTTTAGGGTAAAATTGTTC

GTATAG(SEQ ID NO:10)

11.TCCCGCCAAATTATTAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:11)

12.TCCCGCCTTTAGGGAAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:12)

13.TCCCGCCTTTAGGGGAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:13)

14.TCCCGCCAAATTTGCAATTTTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:14)

15.TCGGATCCCGCCTTTAGGGGTAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:15)

16.CGCGTTCCCGCCTTTAGGGGCAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:16)

17.TCCCGCCTTTAGGGGGAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:17)

18.TCCCGCCAAATCTGCAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:18)

19.TCCCGCCAAATTATCAATATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:19)

20.CCCGTTCCCGCCTTTAGGGGTTTTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:20)

21.CACTCCCGCCTTTAGGGGTCAAAATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:21)

22.TCCCGCCAAATTCCCAATTTTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:22)

23.TCCCGCCTTTAGGGGTGAATTGTTC

GAATTG(SEQ ID NO:23)

24.TCCCGCCTTTAGGGGCTAATTGTTC

GAAATG(SEQ ID NO:24)

25.TCCCGCCAAATCACCAATATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:25)

26.TCCCGCCAAATTTACAAATTTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:26)

27.TCCCGACAAATTTACAATTTTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:27)

28.TCCCGCCAAATCCATAATATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:28

29.TCCAGACAAATCCATAATATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:29)

30.TCAAGACAAATCCATAATATTGTTC

GTATTG(SEQ ID NO:30)

实施例2构建含有不同启动子的红色荧光蛋白表达质粒

mCherry红色荧光蛋白的编码基因均为利用基因组装的方法合成。红色荧光蛋白mCherry的氨基酸序列为SEQ ID No：31，经过密码子优化后得到其核苷酸序列SEQ ID No：32。密码子优化及其DNA组装的操作参考Hoover DM&Lubkowski J,Nucleic AcidsResearch 30:10,2002。

利用引物mCherry-F(SEQ ID No：33)和mCherry-R(SEQ ID No：34)对密码子优化后的mCherry基因进行PCR扩增，并在其基因起始密码子上游引入核糖结合位点(RBS，SEQID No：35)；切胶回收目的大小的DNA片段后，进行加A反应，然后与pMD18-T(购自宝生物工程大连有限公司)载体进行连接，连接产物转化至E.coli BL21感受态细胞(购自宝生物工程(大连)有限公司，下同)中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素抗性的平板中进行筛选，37℃培养过夜(16h，下同)，分别多挑取几个克隆摇菌后送样测序，选取测序序列正确且mCherry基因反向连入乳糖启动子plac后的克隆抽提质粒，得到含有mCherry基因的质粒T-mCherry。在测序过程中发现，mCherry基因测序验证正确且正向插入至plac后的克隆，在平板上可以表现为红色。由此，所克隆的mCherry基因可以在大肠杆菌中顺利表达且翻译产物均为有功能的蛋白。而mCherry基因反向插入至plac后的克隆，虽然测序验证正确，克隆也没有红色出现，说明质粒T-mCherry可以用于后续验证启动子的启动时间。

以质粒T-mCherry为模板，首先利用引物T-mC-F1(SEQ ID No:36)和引物T-mC-R1(SEQ ID No:37)进行质粒扩增，利用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，用限制性内切酶DpnI将模板消化掉后，转化至E.coli BL21细胞中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，37℃培养过夜。随机挑取三个单克隆进行测序鉴定。选择测序正确的克隆抽提质粒，以该质粒为模板，利用引物T-mC-F2(SEQ ID No:38)和引物T-mC-R2(SEQ ID No:39)对质粒进行PCR扩增，利用PCR纯化试剂盒对PCR产物进行纯化后，利用限制性内切酶DpnI将质粒模板消化掉后，转化至E.coli BL21感受态细胞中，在含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的抗性平板上进行筛选，37℃培养过夜。随机挑取三个单克隆进行测序鉴定。选择测序正确的克隆抽提质粒，得到在mCherry基因之前插入了RBS序列及多克隆位点的质粒T-Psyn-mCherry。

使用本领域常用基因序列合成方法分别合成含有实施例1所列的30条启动子的双链DNA序列，并在序列5’和3’端分别连接有KpnI和ClaI的酶切位点，利用KpnI和ClaI双酶切后，分别连接至KpnI和ClaI双酶切的质粒T-Psyn-mCherry中。得到含有30个启动子的质粒。分别将这30个质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21感受态细胞中，得到分别含有这30个质粒的菌株，并分别命名为BL21-1～BL21-30。

实施例3利用红色荧光蛋白验证启动子的启动时间

分别从30个质粒转化的平板上长出的克隆中各挑取4个于96孔深孔板中的600μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、250rpm的摇床中培养过夜后，分别吸取20μl菌液转接至新鲜的600μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、250rpm的摇床中培养2hrs，再转接8μl菌液转接至酶标板中新鲜的200μl含有终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素的LB液体培养基中(设置四个重复)，置于酶标仪中。设置确定不含有红色荧光蛋白的菌株的菌液为阴性对照，阴性对照菌体正常生长，但无荧光检测到。设置温度为37℃，设置工作流程：首先摇菌15s，测定菌体的OD_600nm的值，然后测定菌体在575nm的激发光、610nm的发射光条件下的荧光值，最后摇菌600s，该流程循环，每隔15min测定一次，全长时间为24hrs。测定结束后，分别绘制菌体的生长曲线和单位OD的荧光曲线(菌体某个时间点的荧光值于该时间点测定的OD的比值)曲线。根据两条曲线的对应关系获得该菌体荧光显著增强的时间点为菌体生长的哪个阶段。当菌体生长的稳定期后荧光值才开始显著提高的克隆中所含有的启动子即确定为稳定期诱导的启动子。

从表1可以看出，含有本发明启动子的重组菌株，培养时间为480～960min时，菌体OD增加缓慢，从约0.45增加至约0.55，但菌体的荧光值/OD显著增加，可以从约50单位增加至约150单位，说明这些启动子都是在菌体的生长进入稳定期时(生长速度显著减慢时)才开始启动下游基因转录的。

表1利用酶标仪检测的各菌株不同培养时间的OD值和荧光值/OD

实施例4不同稳定期启动子用于赖氨酸生产菌株表达赖氨酸脱羧酶进行一步法DN5生产

(一)构建能够生产L-赖氨酸的大肠杆菌Ela6116菌株

1.构建四环素外流泵表达载体骨架

利用引物psyn-1(SEQ ID NO:43)和psyn-2(SEQ ID NO:44)合成启动子序列(SEQID NO:67)，其中引物psyn-1包启动子序列和一段与pUC18同源的序列，引物psyn-2包含一段与pUC18同源的序列，这两个PCR引物用于扩增合成的启动子序列和pUC18载体的一部分序列，其中包括多克隆位点，限制性内切酶EcoRI和ScaI用于消化扩增出来的DNA片段，进一步连接质粒如pUC18中构建得到pCIB10。

2.构建四环素外流泵表达载体

利用引物tetA-F(SEQ ID NO:45)和tetA-R(SEQ ID NO:46)四环素外流泵TetA(SEQ ID NO:69)编码基因(tetA，SEQ ID NO:68)，从大肠杆菌克隆载体pBR322中扩增得到，利用SacI和XbaI双酶切后连接至pCIB10质粒中得到pCIB20。

3.L-赖氨酸合成途径上三个蛋白LysC、DapA和LysA阅读框的构建

大肠杆菌基因组中编码L-赖氨酸生物合成途径上的三个蛋白的基因，lysC、dapA和lysA：天冬氨酸激酶(LysC或AKIII，由lysC编码)，二氢吡啶二羧酸合酶(DapA或DHDPS，由dapA编码)，二氨基庚酸脱羧酶(LysA，由lysA编码)，将这三个基因克隆至质粒载体中，由此三个蛋白LysC(SEQ ID NO:71),DapA(SEQ ID NO:73),LysA(SEQ ID NO:75)可以实现在大肠杆菌中过表达。首先利用引物lysC-F(SEQ ID NO:47)和lysC-R(SEQ ID NO:48)将基因lysC(SEQ ID NO:70)从大肠杆菌E.coli MG1655K12的基因组中扩增出来，用SacI和BamHI双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pUC18中得到质粒pCIB7。利用引物dapA-F(SEQID NO:49)和dapA-R(SEQ ID NO:50)将基因dapA(SEQ ID NO:72)从大肠杆菌E.coliMG1655K12的基因组中扩增出来，用BamHI和XbaI双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pCIB7中得到质粒pCIB8。利用引物lysA-F(SEQ ID NO:51)和lysA-R(SEQ ID NO:52)将基因lysA(SEQ ID NO:74)从大肠杆菌E.coli MG1655K12的基因组中扩增出来，用XbaI和SalI双酶切消化之后连接至同样双酶切的质粒pCIB8中得到质粒pCIB9。再进一步利用lysC-F(SEQID NO:47)和lysA-R(SEQ ID NO:52)将这三个基因一并从pCIB9中扩增出来，并利用SacI和SalI双酶切消化，连接至同样双酶切的质粒pCIB10中得到pCIB32。

4.天冬氨酸激酶编码基因突变载体的构建

为了提高L-赖氨酸的产量，进一步对天冬氨酸激酶(LysC或AKIII，由lysC,SEQ IDNO:70编码)进行突变，利用引物318-F(SEQ ID NO:55),318-R(SEQ ID NO:56),323-F(SEQID NO:57),323-R(SEQ ID NO:58)从大肠杆菌E.coli MG1655K12的基因组中扩增得到LysC-1(LysC-M318I,G323D，SEQ ID NO:77)编码基因lysC-1(SEQ ID NO:76)，并通过替换pCIB32中的野生型lysC，得到质粒pCIB43。突变后的LysC-1能够进一步减弱L-赖氨酸的反馈抑制。

5.构建L-赖氨酸合成通路中另外三种蛋白Asd、DapB和AspC的共表达载体

进一步地，对L-赖氨酸合成通路中的另外三个基因asd、dapB和aspC进行过表达。这些基因分别编码下列三个蛋白：天冬氨酸盐半醛脱氢酶(Asd(SEQ ID NO:79，由asd编码)，二氢吡啶二羧酸还原酶(DapB或DHDPR(SEQ ID NO:81),由dapB编码)，天冬氨酸转氨酶(AspC(SEQ ID NO:83),由aspC编码)。利用引物asd-F(SEQ ID NO:59)和asd-R(SEQ ID NO:60)将asd(SEQ ID NO:78)从大肠杆菌MG1655K12基因组中扩增出来，利用SacI和BamHI双酶切后，连接至pUC18中构建得到pCIB12；利用引物dapB-F(SEQ ID NO:61)和dapB-R(SEQ IDNO:62)将dapB(SEQ ID NO:80)从大肠杆菌MG1655 K12基因组中扩增出来，利用BamHI和XbaI双酶切后，连接至pCIB12中构建得到pCIB13；利用引物aspC-F(SEQ ID NO:63)和aspC-R(SEQ ID NO:64)将aspC(SEQ ID NO:82)从大肠杆菌MG1655K12基因组中扩增出来，利用XbaI和SalI双酶切后，连接至pCIB13中构建得到pCIB31；利用引物tetA-F3(SEQ ID NO:53)和tetA-R3(SEQ ID NO:54)，以质粒pCIB20为模板，扩增得到tetA编码基因，利用XhoI和SphI双酶切后连入pCIB31构建得到pCIB59。

6.构建L-赖氨酸合成通路中六个基因共表达质粒

利用引物LAL-F(SEQ ID NO:65)和LAL-R(SEQ ID NO:66)从pCIB43中将lysC-1、dapA和lysA一起扩增出来，ApaI和KpnI双酶切后，与同样双酶切的质粒pCIB59连接，得到pCIB6116质粒。

7.构建能够生产L-赖氨酸的大肠杆菌Ela6116菌株

将构建好的pCIB6116质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21中，得到能够生产L-赖氨酸的大肠杆菌Ela6116菌株，大肠杆菌(Escherichia coli)Ela6116现已保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉，武汉大学，邮编430072，保藏编号CCTCC M 2018736，保藏日期2018年11月1日。

(二)30个稳定期启动子诱导表达赖氨酸脱羧酶：

以大肠杆菌MG1655K12的基因组为模板，利用引物cadA-F(SEQ ID No:40)和cadA-R(SEQ ID No:41)进行第一轮扩增，对目的片段切胶回收后，作为模板，再利用引物cadA-F2(SEQ ID No:42)进行第二轮扩增，切胶回收后得到5’端带有HindIII酶切位点以及核糖体结合位点的cadA基因(SEQ ID No:99)；抽提实施例2中得到的含有30种启动子的质粒，利用HindIII和XbaI双酶切，与同样双酶切的cadA基因进行连接，得到T-1-cadA，T-2-cadA，T-3-cadA，T-4-cadA，T-5-cadA，T-6-cadA，T-7-cadA，T-8-cadA，T-9-cadA，T-10-cadA，T-11-cadA，T-12-cadA，T-13-cadA，T-14-cadA，T-15-cadA，T-16-cadA，T-17-cadA，T-18-cadA，T-19-cadA，T-20-cadA，T-21-cadA，T-22-cadA，T-23-cadA，T-24-cadA，T-25-cadA，T-26-cadA，T-27-cadA，T-28-cadA，T-29-cadA，T-30-cadA这30个cadA表达质粒，将这30个质粒分别转化至上述步骤7获得的能够生产L-赖氨酸的大肠杆菌Ela6116菌株中，得到30个重组菌株。

(三)天然存在的稳定期启动子csiE，bolA，katE，osmY诱导表达赖氨酸脱羧酶

以大肠杆菌MG1655K12的基因组为模板，分别利用引物pcsiE-F(SEQ ID No：88)/pcsiE-R(SEQ ID No：89),pbolA-F(SEQ ID No：90)/pbolA-R(SEQ ID No：91),posmY-F(SEQID No：92)/posmY-R(SEQ ID No：93),pkatE-F(SEQ ID No：94)/pkatE-R(SEQ ID No：95)扩增得到稳定期启动子csiE(SEQ ID No：84)，bolA(SEQ ID No：85)，osmY(SEQ ID No：86)，katE(SEQ ID No：87)，分别利用KpnI和ClaI双酶切后，与同样双酶切的质粒T-1-cadA连接，得到T-pcsiE-cadA，T-pbolA-cadA，T-posmY-cadA和T-pkatE-cadA；将质粒T-pcsiE-cadA，T-pbolA-cadA，T-posmY-cadA和T-pkatE-cadA转化至上述步骤7获得的能够生产L-赖氨酸的大肠杆菌Ela6116菌株中，得到Ela6116-pcsiE-cadA，Ela6116-pbolA-cadA，Ela6116-posmY-cadA和Ela6116-pkatE-cadA这四个重组菌株。

已知文献(Gerhard Miksch et al.,Appl Microbiol Biotechnol(2005)69:312□320)中报道的稳定期启动子5’-TCCCGACAAATCCATAATATTGTTCTATACTGTATTG-3’，含有与本发明启动子相似的可能的-35区序列，为进一步比较它们驱动下游基因表达的能力，合成该启动子序列，并在序列5’和3’端分别合成KpnI和ClaI的酶切位点，KpnI和ClaI双酶切后，与同样经KpnI、ClaI双酶切的质粒T-1-cadA连接，得到质粒T-P1-cadA。将其转化至上述步骤7获得的能够生产L-赖氨酸的大肠杆菌Ela6116菌株中，得到Ela6116-P1-cadA重组菌株。

同时，以pUC18质粒为模板，利用引物plac-F(SEQ ID No：96)和plac-R(SEQ IDNo：97)扩增得到plac组成型启动子(SEQ ID No:98)，KpnI、ClaI双酶切后，与同样双酶切的质粒T-1-cadA连接，得到质粒T-plac-cadA。将其转化至上述步骤7获得的能够生产L-赖氨酸的大肠杆菌Ela6116菌株中，得到Ela6116-plac-cadA重组菌株。

以Ela6116菌株作为对照，各重组菌株分别挑取三个单克隆至5mL液体培养基中(含有4％葡萄糖,0.1％KH₂PO₄,0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸,10μg/mL四环素,100μg/mL氨苄青霉素)，于37℃培养过夜。次日，每个菌株再分别转接至100ml新鲜的含有30g/L葡萄糖,0.7％Ca(HCO₃)₂,10μg/mL四环素和100μg/mL氨苄青霉素，0.1％KH₂PO₄，0.1％MgSO₄,1.6％(NH₄)₂SO₄,0.001％FeSO₄,0.001％MnSO₄,0.2％酵母提取物,0.01％L-苏氨酸,0.005％L-异亮氨酸的培养基中于37℃继续培养72小时，取样，利用核磁检测并计算各培养基中的L-赖氨酸和1,5-戊二胺的含量(表2)。

表2检测能同时表达赖氨酸合成蛋白及赖氨酸脱羧酶的菌株L-赖氨酸和1,5-戊二胺的水平

从表2可以看出，通过比较本发明中的30个稳定期启动子与已报道的天然存在的稳定期启动子csiE，bolA，katE，osmY以及稳定期启动子P1诱导表达赖氨酸脱羧酶，结果表明本发明提供的稳定期启动子1-30均能在稳定期表达，可以应用于一步法发酵生产1,5-戊二胺，而且部分启动子诱导的cadA基因表达在进行一步法1,5-戊二胺生产时还体现了明显的优势，如启动子4、6、11、14、16、18、19、22、25、26、28对应的重组菌株在发酵72小时后，检测到发酵液中1,5-戊二胺的含量约为5.0g/L以上，相应地，发酵液中L-赖氨酸的含量约为1.5g/L以下。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方式对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 上海凯赛生物技术研发中心有限公司凯赛生物产业有限公司

<120> 稳定期特异性启动子及其应用

<130> KHP181115189.5

<160> 99

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcccgcctaa ttattaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 2

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcccgcctta ttattaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccgccttt ttattaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcccgccaaa tccctaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 5

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcccgccttt atattattgt tctatactgt attg 34

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcccgccttt aaattaattg ttctatactg tattg 35

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tcccgccttt aggttaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 8

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcccgccttt aggatcaaaa ttgttctata ctgaatag 38

<210> 9

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tcccgccttt aggctaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcccgccttt agggtaaaat tgttctatac tgtatag 37

<210> 11

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tcccgccaaa ttattaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tcccgccttt agggaaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcccgccttt aggggaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tcccgccaaa tttgcaattt tgttctatac tgtattg 37

<210> 15

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tcggatcccg cctttagggg taaattgttc tatactgtat tg 42

<210> 16

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgcgttcccg cctttagggg caattgttct atactgtatt g 41

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tcccgccttt agggggaatt gttctatact gtattg 36

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcccgccaaa tctgcaaaat tgttctatac tgtattg 37

<210> 19

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcccgccaaa ttatcaatat tgttctatac tgtattg 37

<210> 20

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cccgttcccg cctttagggg ttttgttcta tactgtattg 40

<210> 21

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cactcccgcc tttaggggtc aaaattgttc tatactgtat tg 42

<210> 22

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcccgccaaa ttcccaattt tgttctatac tgtattg 37

<210> 23

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

tcccgccttt aggggtgaat tgttctatac tgaattg 37

<210> 24

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tcccgccttt aggggctaat tgttctatac tgaaatg 37

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcccgccaaa tcaccaatat tgttctatac tgtattg 37

<210> 26

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tcccgccaaa tttacaaatt tgttctatac tgtattg 37

<210> 27

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcccgacaaa tttacaattt tgttctatac tgtattg 37

<210> 28

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tcccgccaaa tccataatat tgttctatac tgtattg 37

<210> 29

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tccagacaaa tccataatat tgttctatac tgtattg 37

<210> 30

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tcaagacaaa tccataatat tgttctatac tgtattg 37

<210> 31

<211> 236

<212> PRT

<213> 红色荧光蛋白(mCherry)

<400> 31

Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala Ile Ile Lys Glu Phe

1 5 10 15

Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val Asn Gly His Glu Phe

20 25 30

Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Thr Gln Thr

35 40 45

Ala Lys Leu Lys Val Thr Lys Gly Gly Pro Leu Pro Phe Ala Trp Asp

50 55 60

Ile Leu Ser Pro Gln Phe Met Tyr Gly Ser Lys Ala Tyr Val Lys His

65 70 75 80

Pro Ala Asp Ile Pro Asp Tyr Leu Lys Leu Ser Phe Pro Glu Gly Phe

85 90 95

Lys Trp Glu Arg Val Met Asn Phe Glu Asp Gly Gly Val Val Thr Val

100 105 110

Thr Gln Asp Ser Ser Leu Gln Asp Gly Glu Phe Ile Tyr Lys Val Lys

115 120 125

Leu Arg Gly Thr Asn Phe Pro Ser Asp Gly Pro Val Met Gln Lys Lys

130 135 140

Thr Met Gly Trp Glu Ala Ser Ser Glu Arg Met Tyr Pro Glu Asp Gly

145 150 155 160

Ala Leu Lys Gly Glu Ile Lys Gln Arg Leu Lys Leu Lys Asp Gly Gly

165 170 175

His Tyr Asp Ala Glu Val Lys Thr Thr Tyr Lys Ala Lys Lys Pro Val

180 185 190

Gln Leu Pro Gly Ala Tyr Asn Val Asn Ile Lys Leu Asp Ile Thr Ser

195 200 205

His Asn Glu Asp Tyr Thr Ile Val Glu Gln Tyr Glu Arg Ala Glu Gly

210 215 220

Arg His Ser Thr Gly Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

225 230 235

<210> 32

<211> 711

<212> DNA

<213> 红色荧光蛋白(mCherry)

<400> 32

atggtgtcta aaggcgagga agataatatg gcgattatca aagaatttat gcgttttaaa 60

gtgcatatgg aaggcagcgt gaatgggcat gagtttgaaa ttgaaggcga aggagaaggc 120

cgtccgtatg aaggcaccca gaccgctaaa ctgaaagtga ccaaaggcgg accactgccg 180

tttgcgtggg acattctgag cccgcagttt atgtatggca gcaaagcgta tgtgaaacat 240

ccggcggata ttccggatta tctgaaactg agctttccgg agggcttcaa atgggaacgt 300

gtgatgaatt ttgaagatgg cggcgtggtg accgtgaccc aggatagcag cctgcaagac 360

ggcgaattca tttacaaggt gaagctgcgt ggcaccaact ttcccagcga tggcccggtg 420

atgcagaaaa agaccatggg ctgggaggcg agcagcgaac gtatgtaccc ggaggatggc 480

gcgctgaagg gcgaaattaa gcagcgtctg aagttaaaag atggtgggca ctatgatgcg 540

gaagtgaaaa ccacctataa agcgaaaaaa ccggtgcagt taccaggcgc ttataatgtg 600

aacattaagc tggatattac cagccataat gaagattata ccattgtgga acagtatgag 660

cgtgcggagg gacggcatag cacgggcgga atggatgaac tgtataaata a 711

<210> 33

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gctctagagt ttttttggga attcacacac aggaggagct gatggtgtct aaaggcgag 59

<210> 34

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gctctagatt atttatacag ttcatccatt ccgcccg 37

<210> 35

<211> 744

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gtttttttgg gaattcacac acaggaggag ctgatggtgt ctaaaggcga ggaagataat 60

atggcgatta tcaaagaatt tatgcgtttt aaagtgcata tggaaggcag cgtgaatggg 120

catgagtttg aaattgaagg cgaaggagaa ggccgtccgt atgaaggcac ccagaccgct 180

aaactgaaag tgaccaaagg cggaccactg ccgtttgcgt gggacattct gagcccgcag 240

tttatgtatg gcagcaaagc gtatgtgaaa catccggcgg atattccgga ttatctgaaa 300

ctgagctttc cggagggctt caaatgggaa cgtgtgatga attttgaaga tggcggcgtg 360

gtgaccgtga cccaggatag cagcctgcaa gacggcgaat tcatttacaa ggtgaagctg 420

cgtggcacca actttcccag cgatggcccg gtgatgcaga aaaagaccat gggctgggag 480

gcgagcagcg aacgtatgta cccggaggat ggcgcgctga agggcgaaat taagcagcgt 540

ctgaagttaa aagatggtgg gcactatgat gcggaagtga aaaccaccta taaagcgaaa 600

aaaccggtgc agttaccagg cgcttataat gtgaacatta agctggatat taccagccat 660

aatgaagatt ataccattgt ggaacagtat gagcgtgcgg agggacggca tagcacgggc 720

ggaatggatg aactgtataa ataa 744

<210> 36

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gatatcgaat tcttaacttt aagaaggaat atacatatgg tgtctaaagg cgaggaa 57

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

aaagttaaga attcgatatc ggcactggcc gtcgttttac 40

<210> 38

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gaattcgagc tcggtaccat cgataagctt gatatcgaat tc 42

<210> 39

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gatggtaccg agctcgaatt cggcactggc cgtcgtttta c 41

<210> 40

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gaattcttaa ctttaagaag gaatatacat atgaacgtta ttgcaatatt g 51

<210> 41

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gcctctagac cacttccctt gtacgagc 28

<210> 42

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gccaagcttg atatcgaatt cttaacttta agaag 35

<210> 43

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

ggcgaattca gtttattctt gacatgtagt gagggggctg gtataatgag ctcggtaccc 60

ggggat 66

<210> 44

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

ggcagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtg 34

<210> 45

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa atctaacaat gcgctcatc 49

<210> 46

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ggctctagat caacgacagg agcacgatc 29

<210> 47

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ggcgagctca cacaggaaac agaccatgtc tgaaattgtt gtctcc 46

<210> 48

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

ggcggatcct tactcaaaca aattactatg cag 33

<210> 49

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

ggcggatcca cacaggaaac agaccatgtt cacgggaagt attgtc 46

<210> 50

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

ggctctagat tacagcaaac cggcatgc 28

<210> 51

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

ggctctagaa cacaggaaac agaccatgcc acattcactg ttcagc 46

<210> 52

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

ggcgtcgact taaagcaatt ccagcgccag 30

<210> 53

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

ggcctcgaga gtttattctt gacatgtagt gagg 34

<210> 54

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

ggcgcatgct caacgacagg agcacgatc 29

<210> 55

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 55

cagcctgaat atactgcatt ctc 23

<210> 56

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 56

gagaatgcag tatattcagg ctg 23

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 57

gcattctcgc gatttcctcg 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 58

cgaggaaatc gcgagaatgc 20

<210> 59

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 59

ggcgagctca cacaggaaac agaccatgaa aaatgttggt tttatcgg 48

<210> 60

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 60

ggcggatcct tacgccagtt gacgaagc 28

<210> 61

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 61

ggcggatcca cacaggaaac agaccatgca tgatgcaaac atccg 45

<210> 62

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 62

ggctctagat tacaaattat tgagatcaag tacatctc 38

<210> 63

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 63

ggctctagaa cacaggaaac agaccatgtt tgagaacatt accgcc 46

<210> 64

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 64

ggcgcatgcg acctcgaggt agtcgactta cagcactgcc acaatcg 47

<210> 65

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 65

ggcggtacca gtttattctt gacatgtagt gagg 34

<210> 66

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 66

ggcgggccct taaagcaatt ccagcgcca 29

<210> 67

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 67

agtttattct tgacatgtag tgagggggct ggtataat 38

<210> 68

<211> 1191

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 68

atgaaatcta acaatgcgct catcgtcatc ctcggcaccg tcaccctgga tgctgtaggc 60

ataggcttgg ttatgccggt actgccgggc ctcttgcggg atatcgtcca ttccgacagc 120

atcgccagtc actatggcgt gctgctagcg ctatatgcgt tgatgcaatt tctatgcgca 180

cccgttctcg gagcactgtc cgaccgcttt ggccgccgcc cagtcctgct cgcttcgcta 240

cttggagcca ctatcgacta cgcgatcatg gcgaccacac ccgtcctgtg gatcctctac 300

gccggacgca tcgtggccgg catcaccggc gccacaggtg cggttgctgg cgcctatatc 360

gccgacatca ccgatgggga agatcgggct cgccacttcg ggctcatgag cgcttgtttc 420

ggcgtgggta tggtggcagg ccccgtggcc gggggactgt tgggcgccat ctccttgcat 480

gcaccattcc ttgcggcggc ggtgctcaac ggcctcaacc tactactggg ctgcttccta 540

atgcaggagt cgcataaggg agagcgtcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc 600

agctccttcc ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt 660

atcatgcaac tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc 720

tttcgctgga gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc 780

ctcgctcaag ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt 840

atcgccggca tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc 900

tggatggcct tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg 960

caggccatgc tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc 1020

gcggctctta ccagcctaac ttcgatcatt ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc 1080

gcctcggcga gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc 1140

tgcctccccg cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg a 1191

<210> 69

<211> 396

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 69

Met Lys Ser Asn Asn Ala Leu Ile Val Ile Leu Gly Thr Val Thr Leu

1 5 10 15

Asp Ala Val Gly Ile Gly Leu Val Met Pro Val Leu Pro Gly Leu Leu

20 25 30

Arg Asp Ile Val His Ser Asp Ser Ile Ala Ser His Tyr Gly Val Leu

35 40 45

Leu Ala Leu Tyr Ala Leu Met Gln Phe Leu Cys Ala Pro Val Leu Gly

50 55 60

Ala Leu Ser Asp Arg Phe Gly Arg Arg Pro Val Leu Leu Ala Ser Leu

65 70 75 80

Leu Gly Ala Thr Ile Asp Tyr Ala Ile Met Ala Thr Thr Pro Val Leu

85 90 95

Trp Ile Leu Tyr Ala Gly Arg Ile Val Ala Gly Ile Thr Gly Ala Thr

100 105 110

Gly Ala Val Ala Gly Ala Tyr Ile Ala Asp Ile Thr Asp Gly Glu Asp

115 120 125

Arg Ala Arg His Phe Gly Leu Met Ser Ala Cys Phe Gly Val Gly Met

130 135 140

Val Ala Gly Pro Val Ala Gly Gly Leu Leu Gly Ala Ile Ser Leu His

145 150 155 160

Ala Pro Phe Leu Ala Ala Ala Val Leu Asn Gly Leu Asn Leu Leu Leu

165 170 175

Gly Cys Phe Leu Met Gln Glu Ser His Lys Gly Glu Arg Arg Pro Met

180 185 190

Pro Leu Arg Ala Phe Asn Pro Val Ser Ser Phe Arg Trp Ala Arg Gly

195 200 205

Met Thr Ile Val Ala Ala Leu Met Thr Val Phe Phe Ile Met Gln Leu

210 215 220

Val Gly Gln Val Pro Ala Ala Leu Trp Val Ile Phe Gly Glu Asp Arg

225 230 235 240

Phe Arg Trp Ser Ala Thr Met Ile Gly Leu Ser Leu Ala Val Phe Gly

245 250 255

Ile Leu His Ala Leu Ala Gln Ala Phe Val Thr Gly Pro Ala Thr Lys

260 265 270

Arg Phe Gly Glu Lys Gln Ala Ile Ile Ala Gly Met Ala Ala Asp Ala

275 280 285

Leu Gly Tyr Val Leu Leu Ala Phe Ala Thr Arg Gly Trp Met Ala Phe

290 295 300

Pro Ile Met Ile Leu Leu Ala Ser Gly Gly Ile Gly Met Pro Ala Leu

305 310 315 320

Gln Ala Met Leu Ser Arg Gln Val Asp Asp Asp His Gln Gly Gln Leu

325 330 335

Gln Gly Ser Leu Ala Ala Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ile Ile Gly Pro

340 345 350

Leu Ile Val Thr Ala Ile Tyr Ala Ala Ser Ala Ser Thr Trp Asn Gly

355 360 365

Leu Ala Trp Ile Val Gly Ala Ala Leu Tyr Leu Val Cys Leu Pro Ala

370 375 380

Leu Arg Arg Gly Ala Trp Ser Arg Ala Thr Ser Thr

385 390 395

<210> 70

<211> 1350

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 70

atgtctgaaa ttgttgtctc caaatttggc ggtaccagcg tagctgattt tgacgccatg 60

aaccgcagcg ctgatattgt gctttctgat gccaacgtgc gtttagttgt cctctcggct 120

tctgctggta tcactaatct gctggtcgct ttagctgaag gactggaacc tggcgagcga 180

ttcgaaaaac tcgacgctat ccgcaacatc cagtttgcca ttctggaacg tctgcgttac 240

ccgaacgtta tccgtgaaga gattgaacgt ctgctggaga acattactgt tctggcagaa 300

gcggcggcgc tggcaacgtc tccggcgctg acagatgagc tggtcagcca cggcgagctg 360

atgtcgaccc tgctgtttgt tgagatcctg cgcgaacgcg atgttcaggc acagtggttt 420

gatgtacgta aagtgatgcg taccaacgac cgatttggtc gtgcagagcc agatatagcc 480

gcgctggcgg aactggccgc gctgcagctg ctcccacgtc tcaatgaagg cttagtgatc 540

acccagggat ttatcggtag cgaaaataaa ggtcgtacaa cgacgcttgg ccgtggaggc 600

agcgattata cggcagcctt gctggcggag gctttacacg catctcgtgt tgatatctgg 660

accgacgtcc cgggcatcta caccaccgat ccacgcgtag tttccgcagc aaaacgcatt 720

gatgaaatcg cgtttgccga agcggcagag atggcaactt ttggtgcaaa agtactgcat 780

ccggcaacgt tgctacccgc agtacgcagc gatatcccgg tctttgtcgg ctccagcaaa 840

gacccacgcg caggtggtac gctggtgtgc aataaaactg aaaatccgcc gctgttccgc 900

gctctggcgc ttcgtcgcaa tcagactctg ctcactttgc acagcctgaa tatgctgcat 960

tctcgcggtt tcctcgcgga agttttcggc atcctcgcgc ggcataatat ttcggtagac 1020

ttaatcacca cgtcagaagt gagcgtggca ttaacccttg ataccaccgg ttcaacctcc 1080

actggcgata cgttgctgac gcaatctctg ctgatggagc tttccgcact gtgtcgggtg 1140

gaggtggaag aaggtctggc gctggtcgcg ttgattggca atgacctgtc aaaagcctgc 1200

ggcgttggca aagaggtatt cggcgtactg gaaccgttca acattcgcat gatttgttat 1260

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caaaaactgc atagtaattt gtttgagtaa 1350

<210> 71

<211> 449

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 71

Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp

1 5 10 15

Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn

20 25 30

Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu

35 40 45

Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu

50 55 60

Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp

100 105 110

Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu

115 120 125

Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys

130 135 140

Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu

165 170 175

Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg

180 185 190

Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu

195 200 205

Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro

210 215 220

Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile

225 230 235 240

Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile

260 265 270

Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu

275 280 285

Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu

290 295 300

Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His

305 310 315 320

Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn

325 330 335

Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr

340 345 350

Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln

355 360 365

Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu

370 375 380

Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys

385 390 395 400

Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg

405 410 415

Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro

420 425 430

Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe

435 440 445

Glu

<210> 72

<211> 879

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 72

atgttcacgg gaagtattgt cgcgattgtt actccgatgg atgaaaaagg taatgtctgt 60

cgggctagct tgaaaaaact gattgattat catgtcgcca gcggtacttc ggcgatcgtt 120

tctgttggca ccactggcga gtccgctacc ttaaatcatg acgaacatgc tgatgtggtg 180

atgatgacgc tggatctggc tgatgggcgc attccggtaa ttgccgggac cggcgctaac 240

gctactgcgg aagccattag cctgacgcag cgcttcaatg acagtggtat cgtcggctgc 300

ctgacggtaa ccccttacta caatcgtccg tcgcaagaag gtttgtatca gcatttcaaa 360

gccatcgctg agcatactga cctgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtactggc 420

tgcgatctgc tcccggaaac ggtgggccgt ctggcgaaag taaaaaatat tatcggaatc 480

aaagaggcaa cagggaactt aacgcgtgta aaccagatca aagagctggt ttcagatgat 540

tttgttctgc tgagcggcga tgatgcgagc gcgctggact tcatgcaatt gggcggtcat 600

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aacaaactat ttgtcgaacc caatccaatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggaactgggt 780

cttgtggcga ccgatacgct gcgcctgcca atgacaccaa tcaccgacag tggtcgtgag 840

acggtcagag cggcgcttaa gcatgccggt ttgctgtaa 879

<210> 73

<211> 292

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 73

Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys

1 5 10 15

Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val

20 25 30

Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser

35 40 45

Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu

50 55 60

Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln

100 105 110

Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu

115 120 125

Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu

130 135 140

Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile

145 150 155 160

Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu

165 170 175

Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu

180 185 190

Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Ala Asn

195 200 205

Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Gly

210 215 220

His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His

225 230 235 240

Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys

245 250 255

Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr

260 265 270

Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His

275 280 285

Ala Gly Leu Leu

290

<210> 74

<211> 1263

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 74

atgccacatt cactgttcag caccgatacc gatctcaccg ccgaaaatct gctgcgtttg 60

cccgctgaat ttggctgccc ggtgtgggtc tacgatgcgc aaattattcg tcggcagatt 120

gcagcgctga aacagtttga tgtggtgcgc tttgcacaga aagcctgttc caatattcat 180

attttgcgct taatgcgtga gcagggcgtg aaagtggatt ccgtctcgtt aggcgaaata 240

gagcgtgcgt tggcggcggg ttacaatccg caaacgcacc ccgatgatat tgtttttacg 300

gcagatgtta tcgatcaggc gacgcttgaa cgcgtcagtg aattgcaaat tccggtgaat 360

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gcagctgatg gtcgttctct ggaacacgcg ccaacggtgg aaaccgtcgt cgccggaccg 1020

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tcaatgtcat ccaactacaa tagccgtccg ctgttaccag aagttctgtt tgataatggt 1200

caggcgcggt tgattcgccg tcgccagacc atcgaagaat tactggcgct ggaattgctt 1260

taa 1263

<210> 75

<211> 420

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 75

Met Pro His Ser Leu Phe Ser Thr Asp Thr Asp Leu Thr Ala Glu Asn

1 5 10 15

Leu Leu Arg Leu Pro Ala Glu Phe Gly Cys Pro Val Trp Val Tyr Asp

20 25 30

Ala Gln Ile Ile Arg Arg Gln Ile Ala Ala Leu Lys Gln Phe Asp Val

35 40 45

Val Arg Phe Ala Gln Lys Ala Cys Ser Asn Ile His Ile Leu Arg Leu

50 55 60

Met Arg Glu Gln Gly Val Lys Val Asp Ser Val Ser Leu Gly Glu Ile

65 70 75 80

Glu Arg Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Asn Pro Gln Thr His Pro Asp Asp

85 90 95

Ile Val Phe Thr Ala Asp Val Ile Asp Gln Ala Thr Leu Glu Arg Val

100 105 110

Ser Glu Leu Gln Ile Pro Val Asn Ala Gly Ser Val Asp Met Leu Asp

115 120 125

Gln Leu Gly Gln Val Ser Pro Gly His Arg Val Trp Leu Arg Val Asn

130 135 140

Pro Gly Phe Gly His Gly His Ser Gln Lys Thr Asn Thr Gly Gly Glu

145 150 155 160

Asn Ser Lys His Gly Ile Trp Tyr Thr Asp Leu Pro Ala Ala Leu Asp

165 170 175

Val Ile Gln Arg His His Leu Gln Leu Val Gly Ile His Met His Ile

180 185 190

Gly Ser Gly Val Asp Tyr Ala His Leu Glu Gln Val Cys Gly Ala Met

195 200 205

Val Arg Gln Val Ile Glu Phe Gly Gln Asp Leu Gln Ala Ile Ser Ala

210 215 220

Gly Gly Gly Leu Ser Val Pro Tyr Gln Gln Gly Glu Glu Ala Val Asp

225 230 235 240

Thr Glu His Tyr Tyr Gly Leu Trp Asn Ala Ala Arg Glu Gln Ile Ala

245 250 255

Arg His Leu Gly His Pro Val Lys Leu Glu Ile Glu Pro Gly Arg Phe

260 265 270

Leu Val Ala Gln Ser Gly Val Leu Ile Thr Gln Val Arg Ser Val Lys

275 280 285

Gln Met Gly Ser Arg His Phe Val Leu Val Asp Ala Gly Phe Asn Asp

290 295 300

Leu Met Arg Pro Ala Met Tyr Gly Ser Tyr His His Ile Ser Ala Leu

305 310 315 320

Ala Ala Asp Gly Arg Ser Leu Glu His Ala Pro Thr Val Glu Thr Val

325 330 335

Val Ala Gly Pro Leu Cys Glu Ser Gly Asp Val Phe Thr Gln Gln Glu

340 345 350

Gly Gly Asn Val Glu Thr Arg Ala Leu Pro Glu Val Lys Ala Gly Asp

355 360 365

Tyr Leu Val Leu His Asp Thr Gly Ala Tyr Gly Ala Ser Met Ser Ser

370 375 380

Asn Tyr Asn Ser Arg Pro Leu Leu Pro Glu Val Leu Phe Asp Asn Gly

385 390 395 400

Gln Ala Arg Leu Ile Arg Arg Arg Gln Thr Ile Glu Glu Leu Leu Ala

405 410 415

Leu Glu Leu Leu

420

<210> 76

<211> 1349

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 76

tgtctgaaat tgttgtctcc aaatttggcg gtaccagcgt agctgatttt gacgccatga 60

accgcagcgc tgatattgtg ctttctgatg ccaacgtgcg tttagttgtc ctctcggctt 120

ctgctggtat cactaatctg ctggtcgctt tagctgaagg actggaacct ggcgagcgat 180

tcgaaaaact cgacgctatc cgcaacatcc agtttgccat tctggaacgt ctgcgttacc 240

cgaacgttat ccgtgaagag attgaacgtc tgctggagaa cattactgtt ctggcagaag 300

cggcggcgct ggcaacgtct ccggcgctga cagatgagct ggtcagccac ggcgagctga 360

tgtcgaccct gctgtttgtt gagatcctgc gcgaacgcga tgttcaggca cagtggtttg 420

atgtacgtaa agtgatgcgt accaacgacc gatttggtcg tgcagagcca gatatagccg 480

cgctggcgga actggccgcg ctgcagctgc tcccacgtct caatgaaggc ttagtgatca 540

cccagggatt tatcggtagc gaaaataaag gtcgtacaac gacgcttggc cgtggaggca 600

gcgattatac ggcagccttg ctggcggagg ctttacacgc atctcgtgtt gatatctgga 660

ccgacgtccc gggcatctac accaccgatc cacgcgtagt ttccgcagca aaacgcattg 720

atgaaatcgc gtttgccgaa gcggcagaga tggcaacttt tggtgcaaaa gtactgcatc 780

cggcaacgtt gctacccgca gtacgcagcg atatcccggt ctttgtcggc tccagcaaag 840

acccacgcgc aggtggtacg ctgatgtgca ataaaactga aaatccgccg ctgttccgcg 900

ctctggcgct tcgtcgcaat cagactctgc tcactttgca cagcctgaat atactgcatt 960

ctcgcgattt cctcgcggaa gttttcggca tcctcgcgcg gcataatatt tcggtagact 1020

taatcaccac gtcagaagtg agcgtggcat taacccttga taccaccggt tcaacctcca 1080

ctggcgatac gttgctgacg caatctctgc tgatggagct ttccgcactg tgtcgggtgg 1140

aggtggaaga aggtctggcg ctggtcgcgt tgattggcaa tgacctgcca aaagcctgcg 1200

gcgttggcaa agaggtattc ggcgtactgg aaccgttcaa cattcgcatg atttgttatg 1260

gcgcatccag ccataacctg tgcttcctgg tgcccggcga agatgccgag caggtggtgc 1320

aaaaactgca tagtaatttg tttgagtaa 1349

<210> 77

<211> 449

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 77

Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp

1 5 10 15

Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn

20 25 30

Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu

35 40 45

Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu

50 55 60

Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp

100 105 110

Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu

115 120 125

Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys

130 135 140

Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu

165 170 175

Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg

180 185 190

Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu

195 200 205

Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro

210 215 220

Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile

225 230 235 240

Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile

260 265 270

Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu

275 280 285

Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu

290 295 300

Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Ile Leu His

305 310 315 320

Ser Arg Asp Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn

325 330 335

Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr

340 345 350

Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln

355 360 365

Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu

370 375 380

Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys

385 390 395 400

Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg

405 410 415

Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro

420 425 430

Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe

435 440 445

Glu

<210> 78

<211> 1104

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 78

atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggtatggtcg gctccgttct catgcaacgc 60

atggttgaag agcgcgactt cgacgccatt cgccctgtct tcttttctac ttctcagctt 120

ggccaggctg cgccgtcttt tggcggaacc actggcacac ttcaggatgc ctttgatctg 180

gaggcgctaa aggccctcga tatcattgtg acctgtcagg gcggcgatta taccaacgaa 240

atctatccaa agcttcgtga aagcggatgg caaggttact ggattgacgc agcatcgtct 300

ctgcgcatga aagatgacgc catcatcatt cttgaccccg tcaatcagga cgtcattacc 360

gacggattaa ataatggcat caggactttt gttggcggta actgtaccgt aagcctgatg 420

ttgatgtcgt tgggtggttt attcgccaat gatcttgttg attgggtgtc cgttgcaacc 480

taccaggccg cttccggcgg tggtgcgcga catatgcgtg agttattaac ccagatgggc 540

catctgtatg gccatgtggc agatgaactc gcgaccccgt cctctgctat tctcgatatc 600

gaacgcaaag tcacaacctt aacccgtagc ggtgagctgc cggtggataa ctttggcgtg 660

ccgctggcgg gtagcctgat tccgtggatc gacaaacagc tcgataacgg tcagagccgc 720

gaagagtgga aagggcaggc ggaaaccaac aagatcctca acacatcttc cgtaattccg 780

gtagatggtt tatgtgtgcg tgtcggggca ttgcgctgcc acagccaggc attcactatt 840

aaattgaaaa aagatgtgtc tattccgacc gtggaagaac tgctggctgc gcacaatccg 900

tgggcgaaag tcgttccgaa cgatcgggaa atcactatgc gtgagctaac cccagctgcc 960

gttaccggca cgctgaccac gccggtaggc cgcctgcgta agctgaatat gggaccagag 1020

ttcctgtcag cctttaccgt gggcgaccag ctgctgtggg gggccgcgga gccgctgcgt 1080

cggatgcttc gtcaactggc gtaa 1104

<210> 79

<211> 350

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 79

Met Lys Asn Val Gly Phe Ile Gly Trp Arg Gly Met Val Gly Ser Val

1 5 10 15

Leu Met Gln Arg Met Val Glu Glu Arg Asp Phe Asp Ala Ile Arg Pro

20 25 30

Val Phe Phe Ser Thr Ser Gln Leu Gly Gln Ala Ala Pro Ser Phe Gly

35 40 45

Gly Thr Thr Gly Thr Leu Gln Asp Ala Phe Asp Leu Glu Ala Leu Lys

50 55 60

Ala Leu Asp Ile Ile Val Thr Cys Gln Gly Gly Asp Tyr Thr Asn Glu

65 70 75 80

Ile Tyr Pro Lys Leu Arg Glu Ser Gly Trp Gln Gly Tyr Trp Ile Asp

85 90 95

Ala Ala Ser Ser Leu Arg Met Lys Asp Asp Ala Ile Ile Ile Leu Asp

100 105 110

Pro Val Asn Gln Asp Val Ile Thr Asp Gly Leu Asn Asn Gly Ile Arg

115 120 125

Thr Phe Val Gly Gly Asn Cys Thr Val Ser Leu Met Leu Met Ser Leu

130 135 140

Gly Gly Leu Phe Ala Asn Asp Leu Val Asp Trp Val Ser Val Ala Thr

145 150 155 160

Tyr Gln Ala Ala Ser Gly Gly Gly Ala Arg His Met Arg Glu Leu Leu

165 170 175

Thr Gln Met Gly His Leu Tyr Gly His Val Ala Asp Glu Leu Ala Thr

180 185 190

Pro Ser Ser Ala Ile Leu Asp Ile Glu Arg Lys Val Thr Thr Leu Thr

195 200 205

Arg Ser Gly Glu Leu Pro Val Asp Asn Phe Gly Val Pro Leu Ala Gly

210 215 220

Ser Leu Ile Pro Trp Ile Asp Lys Gln Leu Asp Asn Gly Gln Ser Arg

225 230 235 240

Glu Glu Trp Lys Gly Gln Ala Glu Thr Asn Lys Ile Leu Asn Thr Ser

245 250 255

Ser Val Ile Pro Val Asp Gly Leu Cys Val Arg Val Gly Ala Leu Arg

260 265 270

Cys His Ser Gln Ala Phe Thr Ile Lys Leu Lys Lys Asp Val Ser Ile

275 280 285

Pro Thr Val Glu Glu Leu Leu Ala Ala His Asn Pro Trp Ala Lys Val

290 295 300

Val Pro Asn Asp Arg Glu Ile Thr Met Arg Glu Leu Thr Pro Ala Ala

305 310 315 320

Val Thr Gly Thr Leu Thr Thr Pro Val Gly Arg Leu Arg Lys Leu Asn

325 330 335

Met Gly Pro Glu Phe Leu Ser Ala Phe Thr Val Gly Asp Gln

340 345 350

<210> 80

<211> 822

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 80

atgcatgatg caaacatccg cgttgccatc gcgggagccg gggggcgtat gggccgccag 60

ttgattcagg cggcgctggc attagagggc gtgcagttgg gcgctgcgct ggagcgtgaa 120

ggatcttctt tactgggcag cgacgccggt gagctggccg gagccgggaa aacaggcgtt 180

accgtgcaaa gcagcctcga tgcggtaaaa gatgattttg atgtgtttat cgattttacc 240

cgtccggaag gtacgctgaa ccatctcgct ttttgtcgcc agcatggcaa agggatggtg 300

atcggcacta cggggtttga cgaagccggt aaacaagcaa ttcgtgacgc cgctgccgat 360

attgcgattg tctttgctgc caattttagc gttggcgtta acgtcatgct taagctgctg 420

gagaaagcag ccaaagtgat gggtgactac accgatatcg aaattattga agcacatcat 480

agacataaag ttgatgcgcc gtcaggcacc gcactggcaa tgggagaggc gatcgcccac 540

gcccttgata aagatctgaa agattgcgcg gtctacagtc gtgaaggcca caccggtgaa 600

cgtgtgcctg gcaccattgg ttttgccacc gtgcgtgcag gtgacatcgt tggtgaacat 660

accgcgatgt ttgccgatat tggcgagcgt ctggagatca cccataaggc gtccagccgt 720

atgacatttg ctaacggcgc ggtaagatcg gctttgtggt tgagtggtaa ggaaagcggt 780

ctttttgata tgcgagatgt acttgatctc aataatttgt aa 822

<210> 81

<211> 273

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 81

Met His Asp Ala Asn Ile Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Gly Arg

1 5 10 15

Met Gly Arg Gln Leu Ile Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Val Gln

20 25 30

Leu Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser Asp

35 40 45

Ala Gly Glu Leu Ala Gly Ala Gly Lys Thr Gly Val Thr Val Gln Ser

50 55 60

Ser Leu Asp Ala Val Lys Asp Asp Phe Asp Val Phe Ile Asp Phe Thr

65 70 75 80

Arg Pro Glu Gly Thr Leu Asn His Leu Ala Phe Cys Arg Gln His Gly

85 90 95

Lys Gly Met Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe Asp Glu Ala Gly Lys Gln

100 105 110

Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Val Phe Ala Ala Asn

115 120 125

Phe Ser Val Gly Val Asn Val Met Leu Lys Leu Leu Glu Lys Ala Ala

130 135 140

Lys Val Met Gly Asp Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Ile Glu Ala His His

145 150 155 160

Arg His Lys Val Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu Ala Met Gly Glu

165 170 175

Ala Ile Ala His Ala Leu Asp Lys Asp Leu Lys Asp Cys Ala Val Tyr

180 185 190

Ser Arg Glu Gly His Thr Gly Glu Arg Val Pro Gly Thr Ile Gly Phe

195 200 205

Ala Thr Val Arg Ala Gly Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ala Met Phe

210 215 220

Ala Asp Ile Gly Glu Arg Leu Glu Ile Thr His Lys Ala Ser Ser Arg

225 230 235 240

Met Thr Phe Ala Asn Gly Ala Val Arg Ser Ala Leu Trp Leu Ser Gly

245 250 255

Lys Glu Ser Gly Leu Phe Asp Met Arg Asp Val Leu Asp Leu Asn Asn

260 265 270

Leu

<210> 82

<211> 1191

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 82

atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60

cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120

ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180

accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240

ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300

ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360

aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420

ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480

gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540

tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600

tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660

ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720

gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780

gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840

gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900

gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960

atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020

atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080

ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140

acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191

<210> 83

<211> 396

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 83

Met Phe Glu Asn Ile Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro Ile Leu Gly Leu

1 5 10 15

Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys Ile Asn Leu Gly

20 25 30

Ile Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser

35 40 45

Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn

50 55 60

Tyr Leu Gly Ile Asp Gly Ile Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu

65 70 75 80

Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu Ile Asn Asp Lys Arg Ala Arg

85 90 95

Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp

100 105 110

Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro

115 120 125

Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val

130 135 140

Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp

145 150 155 160

Ala Leu Ile Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu

165 170 175

Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly Ile Asp Pro Thr Leu Glu

180 185 190

Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro

195 200 205

Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp

210 215 220

Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu Ile Val

225 230 235 240

Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly

245 250 255

Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe

260 265 270

Ser Gln Met Lys Ala Ala Ile Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala

275 280 285

His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr Ile Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg

290 295 300

Ala Ile Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg Ile Gln Arg

305 310 315 320

Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg

325 330 335

Asp Phe Ser Phe Ile Ile Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly

340 345 350

Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr

355 360 365

Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn

370 375 380

Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala Ile Val Ala Val Leu

385 390 395

<210> 84

<211> 235

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 84

tgctttttcc gatcgtcacg gcgatgttta tcgcgaacag atggtggact ttatccttag 60

cgcgttgaat ccgcagaact aacccatgat cgctagcacg ataatcattc acaaaaccac 120

cttaagacat gctaatccac tggtcagaac agtttaagat gagaaaaatt ctgtgacgct 180

tgccaacatt tctgatgatt agcattccct tcgccatttc cttgagcaaa cttta 235

<210> 85

<211> 238

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 85

tgtttggtaa aaattcccgc catcataaca ttgccaacgg cgaggggaag tgggtaaggc 60

atgtaaattc atcatgttga cgaaataatc gcccctggta aaagaaacac tgatgcgagg 120

cctgtgtttc aatctttaaa tcagtaaact tcatacgctt gacggaaaaa ccaggacgaa 180

acctaaatat ttgttgttaa gctgcaatgg aaacggtaaa agcggctagt atttaaag 238

<210> 86

<211> 233

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 86

ctcgcttaca tcgctaccag catggtcaac ctgcgcctgg cacaggaacg ttatccggac 60

gttcagttcc accagacccg cgagcattaa ttcttgcctc cagggcgcgg tagccgctgc 120

gccctgtcaa tttcccttcc ttattagccg cttacggaat gttcttaaaa cattcacttt 180

tgcttatgtt ttcgctgata tcccgagcgg tttcaaaatt gtgatctata ttt 233

<210> 87

<211> 237

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 87

gcagaaatga ctctcccatc agtacaaacg caacatattt gccacgcagc atccagacat 60

cacgaaacga atccatcttt atcgcatgtt ctggcggcgc gggttccgtg cgtgggacat 120

agctaataat ctggcggttt tgctggcgga gcggtttctt cattactggc ttcactaaac 180

gcatattaaa aatcagaaaa actgtagttt agccgattta gcccctgtac gtcccgc 237

<210> 88

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 88

ggggtacctg ctttttccga tcgtcacg 28

<210> 89

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 89

ccatcgatta aagtttgctc aaggaaatgg c 31

<210> 90

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 90

ggggtacctg tttggtaaaa attcccg 27

<210> 91

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 91

ccatcgatct ttaaatacta gccgctttta c 31

<210> 92

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 92

ggggtaccct cgcttacatc gctaccagc 29

<210> 93

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 93

ccatcgataa atatagatca caattttgaa 30

<210> 94

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 94

ggggtaccgc agaaatgact ctcccatc 28

<210> 95

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 95

ggatcgatgc gggacgtaca ggggc 25

<210> 96

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 96

ggggtaccga gtgagctgat accgctcgcc g 31

<210> 97

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 97

ggatcgatag ctgtttcctg tgtgaaattg 30

<210> 98

<211> 286

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 98

gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 60

gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 120

tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 180

gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 240

ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagct 286

<210> 99

<211> 2196

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 99

aagcttgata tcgaattctt aactttaaga aggaatatac atatgaacgt tattgcaata 60

ttgaatcaca tgggggttta ttttaaagaa gaacccatcc gtgaacttca tcgcgcgctt 120

gaacgtctga acttccagat tgtttacccg aacgaccgtg acgacttatt aaaactgatc 180

gaaaacaatg cgcgtctgtg cggcgttatt tttgactggg ataaatataa tctcgagctg 240

tgcgaagaaa ttagcaaaat gaacgagaac ctgccgttgt acgcgttcgc taatacgtat 300

tccactctcg atgtaagcct gaatgacctg cgtttacaga ttagcttctt tgaatatgcg 360

ctgggtgctg ctgaagatat tgctaataag atcaagcaga ccactgacga atatatcaac 420

actattctgc ctccgctgac taaagcactg tttaaatatg ttcgtgaagg taaatatact 480

ttctgtactc ctggtcacat gggcggtact gcattccaga aaagcccggt aggtagcctg 540

ttctatgatt tctttggtcc gaataccatg aaatctgata tttccatttc agtatctgaa 600

ctgggttctc tgctggatca cagtggtcca cacaaagaag cagaacagta tatcgctcgc 660

gtctttaacg cagaccgcag ctacatggtg accaacggta cttccactgc gaacaaaatt 720

gttggtatgt actctgctcc agcaggcagc accattctga ttgaccgtaa ctgccacaaa 780

tcgctgaccc acctgatgat gatgagcgat gttacgccaa tctatttccg cccgacccgt 840

aacgcttacg gtattcttgg tggtatccca cagagtgaat tccagcacgc taccattgct 900

aagcgcgtga aagaaacacc aaacgcaacc tggccggtac atgctgtaat taccaactct 960

acctatgatg gtctgctgta caacaccgac ttcatcaaga aaacactgga tgtgaaatcc 1020

atccactttg actccgcgtg ggtgccttac accaacttct caccgattta cgaaggtaaa 1080

tgcggtatga gcggtggccg tgtagaaggg aaagtgattt acgaaaccca gtccactcac 1140

aaactgctgg cggcgttctc tcaggcttcc atgatccacg ttaaaggtga cgtaaacgaa 1200

gaaaccttta acgaagccta catgatgcac accaccactt ctccgcacta cggtatcgtg 1260

gcgtccactg aaaccgctgc ggcgatgatg aaaggcaatg caggtaagcg tctgatcaac 1320

ggttctattg aacgtgcgat caaattccgt aaagagatca aacgtctgag aacggaatct 1380

gatggctggt tctttgatgt atggcagccg gatcatatcg atacgactga atgctggccg 1440

ctgcgttctg acagcacctg gcacggcttc aaaaacatcg ataacgagca catgtatctt 1500

gacccgatca aagtcaccct gctgactccg gggatggaaa aagacggcac catgagcgac 1560

tttggtattc cggccagcat cgtggcgaaa tacctcgacg aacatggcat cgttgttgag 1620

aaaaccggtc cgtataacct gctgttcctg ttcagcatcg gtatcgataa gaccaaagca 1680

ctgagcctgc tgcgtgctct gactgacttt aaacgtgcgt tcgacctgaa cctgcgtgtg 1740

aaaaacatgc tgccgtctct gtatcgtgaa gatcctgaat tctatgaaaa catgcgtatt 1800

caggaactgg ctcagaatat ccacaaactg attgttcacc acaatctgcc ggatctgatg 1860

tatcgcgcat ttgaagtgct gccgacgatg gtaatgactc cgtatgctgc attccagaaa 1920

gagctgcacg gtatgaccga agaagtttac ctcgacgaaa tggtaggtcg tattaacgcc 1980

aatatgatcc ttccgtaccc gccgggagtt cctctggtaa tgccgggtga aatgatcacc 2040

gaagaaagcc gtccggttct ggagttcctg cagatgctgt gtgaaatcgg cgctcactat 2100

ccgggctttg aaaccgatat tcacggtgca taccgtcagg ctgatggccg ctataccgtt 2160

aaggtattga aagaagaaag caaaaaataa tctaga 2196

Claims

1.稳定期特异性启动子，其特征在于，所述启动子的大小为37-45bp，至少包括-10区、RNA聚合酶б^s特异性识别位点和-35区；

所述启动子序列的-13位碱基为C；

2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子为：

i)SEQ ID NO:1-30任一所示的核苷酸序列；或

3.含有权利要求1或2所述启动子的生物材料，所述生物材料包括重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体或工程菌。

4.权利要求1或2所述启动子的以下任一应用：

1)作为原核生物的稳定期特异性启动子的应用；

5.一种重组DNA，其特征在于，由权利要求1或2所述启动子与下游目的基因可操作连接而成；所述目的基因选自编码蛋白质的核酸、编码核酶的核酸、编码反义RNA的核酸；优选地，所述蛋白质为酶、激素、抗体或生长因子；更优选地，所述酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含权利要求5所述的重组DNA。

7.一种转化体，其特征在于，所述转化体为携带权利要求6所述表达载体的宿主菌。

8.根据权利要求7所述的转化体，其特征在于，所述宿主菌选自埃希氏菌属(Escherichia)、棒杆菌属(Corynebacterium)、短杆菌属(Brevibacterium)、链霉菌属(Streptomyces)、哈夫尼菌属(Hafnia)中的菌种；优选地，所述宿主菌选自大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)、蜂房哈夫尼菌(H.alvei)、谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)，或经过诱变或随机突变之后的菌株或基因工程菌；更优选地，所述宿主菌为大肠杆菌(E.coli)或蜂房哈夫尼菌(H.alvei)。

9.权利要求7或8所述转化体在发酵生产氨基酸、多肽或蛋白质中的应用。

10.产赖氨酸脱羧酶的工程菌，其特征在于，所述工程菌的出发菌株为具有生产L-赖氨酸能力的大肠杆菌，并携带含有赖氨酸脱羧酶基因表达盒的质粒，所述赖氨酸脱羧酶基因表达盒由权利要求1或2所述启动子驱动赖氨酸脱羧酶基因的表达。

11.根据权利要求10所述的工程菌，其特征在于，所述出发菌株为大肠杆菌(Escherichia coli)Ela6116，保藏编号CCTCC M 2018736。

12.发酵生产1,5-戊二胺的方法，其特征在于，包括在发酵培养基中对权利要求10或11所述的工程菌进行培养，以生产1,5-戊二胺。