DE69737682T2

DE69737682T2 - Gene von moraxella, die für transferrin-rezeptoren kodieren.

Info

Publication number: DE69737682T2
Application number: DE69737682T
Authority: DE
Inventors: Lisa E. Guelph MYERS; Anthony B. Calgary SCHRYVERS; Robin E. Willowdale HARKNESS; Sheena M. Aurora LOOSMORE; Run-Pan Thornhill DU; Yan-Ping Willowdale YANG; Michel H. Willowdale Klein
Original assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Current assignee: Sanofi Pasteur Ltd
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2008-01-10
Anticipated expiration: 2017-03-08
Also published as: AU1865397A; US6437096B1; DK0885300T3; CA2248095A1; PT885300E; RU2235128C2; ES2285730T3; ATE361362T1; CN1217748A; NZ331777A; EP0885300B1; DE69737682D1; EP0885300A1; EP1777293A1; WO1997032980A1; AU722681B2; CN1128876C; JP2000503855A; BR9710435A; US6090576A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die molekulare Klonierung von Genen, welche Transferrinrezeptor(TfR)-Proteine codieren, und insbesondere die Klonierung von Transferrinrezeptorgenen aus Moraxella (Branhamella) catarrhalis.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Moraxella (Branhamella) catarrhalis-Bakterien sind gramnegative diplococcale Pathogene, welche asymptomatisch im gesunden humanen Atmungswegstrakt mitgetragen werden. In den letzten Jahren ist M. catarrhalis als ein bedeutendes auslösendes Agens von Mittelohrentzündung bzw. Otitis media erkannt worden. Darüber hinaus ist M. catarrhalis mit Sinusitis, Conjunctivitis und urogenitalen Infektionen assoziiert worden, sowie mit einer Anzahl entzündlicher Erkrankungen des des unteren Atemweges in Kindern und Erwachsenen, einschließlich Pneumonie, chronischer Bronchitis, Tracheitis und Emphysem (Bezugsstellen bzw. Ref. 1 bis 8). (Überall in dieser Anmeldungen werden verschiedene Bezugsstellen in Klammern zitiert, um den Stand der Technik vollständiger zu beschreiben, auf welchen diese Erfindung Bezug nimmt. Die volle bibliografische Information für jedes Zitat findet sich am Ende der Beschreibung, unmittelbar vorausgehend vor den Patentansprüchen). Gelegentlich vollführt M. catarrhalis eine Invasion unter Verursachung von Septikämie, Arthritis, Endocarditis und Meningitis (Ref. 9 bis 13).
Mittelohrentzündung ist eine der häufigsten Krankheiten der frühen Kindheit, und ungefähr 80% aller Kinder leiden unter mindestens einer Mittelohrinfektion, vor einem Alter von drei Jahren (Ref. 14). Chronische Mittelohrentzündung ist mit Hör- und Sprachbeeinträchtigung in Kindern assoziiert worden, und ist in einigen Fällen mit Lernstörungen assoziiert worden. Herkömmliche Behandlungen für Mittelohr entzündung schließen Verabreichung von Antibiotika und chirurgische Vorgehensweisen, einschließlich Tonsillektomien, Adenoidektomien und Tympanozentese ein. In den Vereinigten Staaten belaufen sich die Behandlungskosten für Mittelohrentzündung schätzungsweise auf zwischen eine und zwei Milliarden Dollar pro Jahr.
In Fällen von Mittelohrentzündung wird M. catarrhalis häufig aus Mittelohrfluid gemeinsam mit Streptococcus pneumoniae und nicht-typisierbaren Haemophilus influenzae isoliert, von welchen angenommen wird, für 50% bzw. 30% der Otitis media-Infektionen verantwortlich zu sein. M. catarrhalis ist angenommenerweise für ungefähr 20% der Otitis media-Infektionen verantwortlich (Ref. 15). Epidemiologische Berichte zeigen an, dass die Anzahl von Fällen von Otitis media, welche auf M. catarrhalis zurückzuführen sind, zunimmt, zusammen mit der Anzahl von Antibiotikumresistenten Isolaten von M. catarrhalis. Vor 1970 wurden somit keine β-Lactamaseproduzierenden M. catarrhalis-Isolate berichtet, aber seit Mitte der 70er-Jahre ist eine wachsende Anzahl an β-Lactamase-exprimierenden Isolaten nachgewiesen worden. Jüngere Untersuchungen legen nahe, dass 75% der klinischen Isolate β-Lactamase produzieren (Ref. 16, 26).
Eisen ist ein essenzieller Nährstoff für das Wachstum vieler Bakterien. Mehrere Bakterienspezies, einschließlich M. catarrhalis, erhalten Eisen aus dem Wirt durch Verwenden von Transferrin-Rezeptorproteinen, um Transferrin einzufangen. Eine Reihe von Bakterien, einschließlich Neisseria meningitidis (Ref. 17), N. gonorrhoeae (Ref. 18), Haemophilus influenzae (Ref. 19) sowie M. catarrhalis (Ref. 20), erzeugen Außenmembranproteine, welche spezifisch humanes Transferrin binden. Die Expression dieser Proteine wird durch die Menge an Eisen in der Umgebung reguliert.
Die zwei Transferrin-Rezeptorproteine von M. catarrhalis, bezeichnet als Transferrin-Bindeprotein 1 (Tbp1) und Transferrin-Bindeprotein 2 (Tbp2), besitzen Molekulargewichte von 115 kDa (Tbp1) und ungefähr 80 bis 90 kDa (Tbp2). Anders als die Transferrin-Rezeptorproteine anderer Bakterien, welche eine Affinität für Apotransferrin besitzen, weisen die M. catarrhalis-Tbp2-Rezeptoren eine bevorzugte Affinität für eisengesättigtes (d. h. Fern-)Transferrin auf (Ref. 21).
Eine M. catarrhalis-Infektion kann zu einer ernsten Erkrankung führen. Es wäre vorteilhaft, eine rekombinante Quelle für Transferrin-Bindeproteine als Antigene in immunogenen Präparationen, einschließlich Impfstoffen, Trägern für andere Antigene und Immunogenen, und die Erzeugung von diagnostischen Reagenzien bereitzustellen. Die Transferrin-Bindeproteine und Fragmente davon codierenden Gene sind besonders wünschenswert und nützlich bei der spezifischen Identifizierung und Diagnose von Moraxella und für die Immunisierung gegen Krankheit, welche durch M. catarrhalis verursacht wird, und für die Erzeugung von diagnostischen Reagenzien.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Bereitstellung von gereinigten und isolierten Nukleinsäuremolekülen, welche einen Transferrinrezeptor eines Stammes von Moraxella oder ein Fragment oder ein Analog des Transferrin-Rezeptorproteins codieren. Die hierin bereitgestellten Nukleinsäuremoleküle sind nützlich für den spezifischen Nachweis von Stämmen von Moraxella und für die Diagnose einer Infektion durch Moraxella. Die hierin bereitgestellten gereinigten und isolierten Nukleinsäuremoleküle, wie DNA, sind ebenfalls nützlich zum Exprimieren der tbp-Gene durch rekombinante DNA-Methoden zur Bereitstellung von gereinigten und isolierten Transferrin-Rezeptorproteinen sowie Untereinheiten, Fragmenten oder Analogen davon auf wirtschaftliche Weise. Der Transferrin-Rezeptor, Untereinheiten oder Fragmente davon oder Analoge davon, sowie Nukleinsäuremoleküle, welche selbige codieren, und Vektoren, welche derartige Nukleinsäuremoleküle enthalten, sind in immunogenen Zusammensetzungen zur Impfung gegen durch Moraxella verursachte Krankheiten, der Diagnose einer Infektion durch Moraxella und als Werkzeuge für die Erzeugung immunologischer Reagenzien anwendbar. Monoklonale Antikörper oder mono-spezifische Antiseren (Antikörper), welche gegen das Transferrin-Rezeptorprotein herangezogen wurden, welches gemäß den Aspekten der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, sind für die Diagnose einer Infektion durch Moraxella, den spezifischen Nachweis von Moraxella (in beispielsweise in vitro- und in vivo-Assays) und für die Behandlung von durch Moraxella verursachten Krankheiten verwendbar.
Gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, das für ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert, im Genaueren eines Stammes von M. catarrhalis, spezifisch des M. catarrhalis-Stammes 4223, Q8 oder R1.
In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das Nukleinsäuremolekül nur das Tbp1-Protein des Moraxella-Stammes oder nur das Tbp2-Protein des Moraxella-Stammes codieren.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül bereitgestellt, welches eine DNA-Sequenz aufweist, die aus der Gruppe gewählt wird, welche besteht aus (a) einer DNA-Sequenz, wie dargestellt in der 5, 6, 10, 11 oder 27 (SEQ ID Nr: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45 oder 46) oder der dazu komplementären DNA-Sequenz; (b) einer DNA-Sequenz, welche eine Aminosäuresequenz codiert, wie dargestellt in 5, 6, 10, 11 oder 27 (SEQ ID Nr: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder 47) oder die dazu komplementäre DNA-Sequenz; und (c) einer DNA-Sequenz, die unter stringenten Bedingungen an irgendeine der in (a) oder (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisiert und die ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert. Die in (c) definierte DNA-Sequenz weist vorzugsweise mindstens etwa 90% Sequenz-Identität mit einer der in (a) und (b) definierten DNA-Sequenzen auf. Die in (c) definierte DNA-Sequenz kann diejenige sein, die für das äquivalente Transferrin-Rezeptorprotein eines anderen Moraxella-Stammes codiert.
In einem weiteren Aspekt schließt die vorliegende Erfindung einen Vektor ein, der für die Transformation eines Wirtes angepasst bzw. geeignet ist.
Der Vektor kann angepasst sein für die Expression des codierten Transferrin-Rezeptors in einem heterologen oder homologen Wirt, in entweder einer lipidierten oder nicht-lipidierten Form. Folglich sieht ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung einen Expressionsvektor vor, der angepasst ist für die Transformation eines Wirtes, umfassend ein Nukleinsäuremolekül, wie hierin bereitgestellt, und Mittel zur Expression, die funktionsfähig mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden sind, für die Expression des Transferrin-Rezeptorproteins oder des Fragmentes oder Analoges des Transferrin-Rezeptorproteins durch den Wirt. In spezifischen Ausführungsformen dieses Aspekts der Erfindung kann das Nukleinsäuremolekül im Wesentlichen das gesamte bzw. alle Transferrin-Rezeptorprotein(e), lediglich das Tbp1-Protein oder lediglich das Tbp2-Protein des Moraxella-Stammes codieren. Die Mittel zur Expression können einen Promotor und einen Nukleinsäurebereich, welcher eine Leader-Sequenz für die Sekretion des Transferrin-Rezeptorproteins aus dem Wirt codiert, einschließen.
Die Mittel zur Expression können auch einen Nukleinsäurebereich einschließen, der ein Lipidierungssignal für die Expression einer lipidierten Form des Transferrin-Rezeptorproteins aus dem Wirt codiert. Der Wirt kann zum Beispiel ausgewählt werden aus Escherichia coli, Bordetella, Bacillus, Haemophilus, Moraxella, Pilzen, Hefe oder Baculovirus, und Semliki-Forest-Virus-Expressionssysteme können verwendet werden. In einer besonderen Ausführungsform ist das Plasmid, welches für die Expression für Tbp1 angepasst ist, pLEM29, und jenes für die Expression von Tbp2 ist pLEM33. Weitere Vektoren schließen pLEM-37, SLRD35-D und SLRD-35-B ein.
In einem zusätzlichen Aspekt der Erfindung wird ein transformierter Wirt bereitgestellt, welcher einen Expressionsvektor, wie hierin bereitgestellt, enthält. Ein rekombinantes Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes ist durch den transformierten Wirt produzierbar.
Ein derartiges rekombinantes Transferrin-Rezeptorprotein kann in im Wesentlichen reiner Form gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung bereitgestellt werden, welcher ein Verfahren zur Bildung eines im Wesentlichen reinen rekombinanten Transferrin-Rezeptorproteins vorsieht, das das Kultivieren des hierin bereitgestellten transformierten Wirts, so dass ein Transferrin-Rezeptorprotein in Form von Einschlusskörpern exprimiert wird, das Reinigen der Einschlusskörper, um sie von zellulärem Material und löslichen Proteinen zu befreien, das Solubilisieren des Transferrin-Rezeptorproteins aus den gereinigten Einschlusskörpern, und das Reinigen des Transferrin-Rezeptorproteins, um es von anderen solubilisierten Materialien zu befreien, umfasst. Das im Wesentlichen reine rekombinante Transferrin-Rezeptorprotein kann nur Tbp1, nur Tbp2 oder ein Gemisch daraus umfassen. Das rekombinante Protein besitzt im Allgemeinen eine Reinheit von mindestens etwa 70% rein, vorzugsweise mindestens etwa 90% rein.
Der Moraxella-Stamm kann der M. catarrhalis-4223-Stamm, M. catarrhalis-Q8-Stamm oder M. catarrhalis-R1-Stamm sein.
Gemäß eines anderen Aspekts der Erfindung wird eine immunogene Zusammensetzung bereitgestellt, welche mindestens eine aktive Komponente umfasst, die ausgewählt wird aus mindestens einem Nukleinsäuremolekül, wie hierin bereitgestellt, und einem pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür oder Vektor dafür. Die wenigstens eine aktive Komponente erzeugt eine Immunantwort bei Verabreichung an einen Wirt.
Die hierin bereitgestellten immunogenen Zusammensetzungen können als Impfstoffe zur in vivo-Verabreichung an einen Wirt formuliert werden. Für einen derartigen Zweck können die Zusammensetzungen als eine Mikropartikel-, Kapsel-, ISCOM- oder Liposomen-Präparation formuliert werden. Die immunogene Zusammensetzung kann in Kombination mit einem Ziellenkungs-Molekül für die Zuführung an spezifische Zellen des Immunsystems oder an Schleimhautoberflächen vorgesehen werden. Die immunogenen Zusammensetzungen der Erfindung (einschließlich Impfstoffen) können ferner mindestens ein anderes immunogenes oder immunstimulierendes Material umfassen, und das immunstimulierende Material kann mindestens ein Adjuvans oder mindestens ein Cytokin sein. Geeignete Adjuvantien zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen (ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein) Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, QS21, Quil A, Derivate und Komponenten davon, ISCOM-Matrix, Calciumphosphat, Calciumhydroxid, Zinkhydroxid, ein Glycolipid-Analog, einen Octadecylester einer Aminosäure, ein Muramyldipeptid-Polyphosphazen, ISCOPREP, DC-Chol, DDBA und ein Lipoprotein ein. Vorteilhafte Kombinationen von Adjuvantien werden in den gleichzeitig anhängigen U.S.-Patenten 6 764 682 und 5 837 250 und der WO 95/34308 beschrieben.
Die Erfindung ist nützlich in einem Verfahren zur Erzeugung einer Immunantwort in einem Wirt, welches den Schritt der Verabreichung einer wirksamen Menge der hierin vorgesehenen immunogenen Zusammensetzung an einen empfänglichen Wirt, wie einen Menschen, umfasst. Die Immunantwort kann eine humorale oder eine zellvermittelte Immunantwort sein und kann Schutz gegen durch Moraxella verursachte Krankheit bereitstellen. Wirte, an welche ein Schutz gegen Krankheit vermittelt werden kann, beinhalten Primaten, einschließlich Menschen.
In einem weiteren Aspekt wird ein Lebendvektor zur Zuführung von Transferrin-Rezeptor an einen Wirt bereitgestellt, welcher einen Vektor umfasst, der das wie oben beschriebene Nukleinsäuremolekül enthält. Der Vektor kann ausgewählt werden aus Salmonella, BOG, Adenovirus, Pockenvirus, Vaccinia und Poliovirus.
Die hierin bereitgestellten Nukleinsäuremoleküle sind nützlich in diagnostischen Anwendungen. Folglich wird in einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens von Nukleinsäure, in einer Probe, bereitgestellt, welche ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert, das die folgenden Schritte umfasst:

(a) Inkontaktbringen der Probe mit einem Nukleinsäuremolekül, wie hierin bereitgestellt, zur Bildung von Doppelsträngen, die das Nukleinsäuremolekül und jedwedes Nukleinsäuremolekül, das für das Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert, das in der Probe vorliegt und damit spezifisch hybridisierbar ist, umfassen; und
(b) Bestimmung der Bildung der Doppelstränge.

Darüber hinaus sieht die vorliegende Erfindung ein diagnostisches Kit zur Bestimmung des Vorliegens von Nukleinsäure, die für ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert, in einer Probe vor, welches Folgendes umfasst:

(a) ein Nukleinsäuremolekül, wie hierin bereitgestellt;
(b) Mittel zum Kontaktieren des Nukleinsäuremoleküls mit der Probe zur Bildung von Doppelsträngen, die das Nukleinsäuremolekül und jedwede derartige Nukleinsäure, die in der Probe vorhanden und mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisierbar ist, umfassen; und
(c) Mittel zum Bestimmen der Bildung der Doppelstränge.

Die hierin bereitgestellten Nukleinsäuremoleküle und Proteine sind nützlich als Arzneimittel und in der Herstellung von Medikamenten zum Schutz gegen eine Infektion durch Moraxella-Stämme.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Die vorliegende Erfindung wird ferner aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen verständlich werden, in welchen:
die 1 die Aminosäuresequenzen (SEQ ID Nr: 17 und 18) eines konservierten Bereichs von Tbp1-Proteinen zeigt, verwendet für die Synthese von degenerierten Primern, welche für die PCR-Amplifizierung eines Bereichs des M. catarrhalis-4223-tbpA-Gens verwendet werden;
2 zeigt eine Restriktionskarte von Klon LEM3-24, der die tbpa- und tbpB-Gene aus dem M. catarrhalis-Isolat 4223 enthält;
3 zeigt eine Restriktionskarte des tbpA-Gens für M. catarrhalis 4223;
4 zeigt eine Restriktionskarte des tbpB-Gens für M. catarrhalis 4223;
5 zeigt die Nukleotidsequenz des tbpA-Gens (SEQ ID Nr: 1 – gesamte Sequenz, und SEQ ID Nr: 2 – codierende Sequenz) und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Tbp1-Proteins aus M. catarrhalis 4223 (SEQ ID Nr: 9 – Volllänge, und SEQ ID Nr: 10 – reifes Protein). Die Leader-Sequenz (SEQ ID Nr: 19) wird durch Unterstreichen gezeigt;
6 zeigt die Nukleotidsequenz des tbpB-Gens (SEQ ID Nr: 3 – gesamte Sequenz, und SEQ ID Nr: 4 – codierende Sequenz) und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Tbp2-Proteins aus M. catarrhalis 4223 (SEQ ID Nr: 11 – Volllänge, und SEQ ID Nr: 12 – reifes Protein). Die Leader-Sequenz (SEQ ID Nr: 20) wird durch Unterstreichen gezeigt;
7 zeigt eine Restriktionskarte von Klon SLRD-A, welcher die tbpA- und tbpB-Gene aus M. catarrhalis Q8 enthält;
8 zeigt eine Restriktionskarte des tbpA-Gens aus M. catarrhalis Q8;
9 zeigt eine Restriktionskarte des tbpB-Gens aus M. catarrhalis Q8;
10 zeigt die Nukleotidsequenz des tbpA-Gens (SEQ ID Nr: 5 – gesamte Sequenz, und SEQ ID Nr: 6 – codierende Sequenz) und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Tbp1-Proteins aus M. catarrhalis Q8 (SEQ ID Nr: 13 – Volllänge, und SEQ ID Nr: 14 – reifes Protein);
11 zeigt die Nukleotidsequenz des tbpB-Gens (SEQ ID Nr: 7 – gesamte Sequenz, und SEQ ID Nr: 8 – codierende Sequenz), und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Tbp2-Proteins aus M. catarrhalis Q8 (SEQ ID Nr: 15 – Volllänge, und SEQ ID Nr: 16 – reifes Protein);
12 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von Tbp1 aus M. catarrhalis-Stamm 4223 (SEQ ID Nr: 9) und Q8 (SEQ ID Nr: 13), H. influenzae-Stamm Eagan (SEQ ID Nr: 21), den N. meningitidis-Stämmen B16B6 (SEQ ID Nr: 22) und M982 (SEQ ID Nr: 23) und N. gonorrhoeae-Stamm FA19 (SEQ ID Nr: 24). Punkte stehen für identische Reste und Bindestriche sind für eine Maximum-Alignierung eingefügt worden;
13 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von Tbp2 aus M. catarrhalis-Isolat 4223 (SEQ ID Nr: 11) und Q8 (SEQ ID Nr: 15), H. influenzae-Stamm Eagan (SEQ ID Nr: 25), den N. meningitidis-Stämmen B1666 (SEQ ID Nr: 26) und M918 (SEQ ID Nr: 27) und N. gonorrhoeae-Stamm FA19 (SEQ ID Nr: 28). Punkte stehen für identische Reste und Bindestriche sind für eine Maximum-Alignierung eingefügt worden;
14 zeigt die Konstruktion des Plasmids pLEM29 für die Expression von rekombinantem Tbp1-Protein aus E. coli;
15 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse der Expression von Tbp1-Protein durch E. coli-Zellen, welche mit dem Plasmid pLEM29 transformiert worden sind;
16 zeigt ein Flussdiagramm für die Reinigung von rekombinantem Tbp1-Protein;
17 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse von gereinigtem rekombinantem Tbp1-Protein;
18 zeigt die Konstruktion des Plasmids pLEM33 und pLEM37 für die Expression von TbpA-Gen aus M. catarrhalis 4223 in E. coli ohne bzw. mit einer Leader-Sequenz;
19 zeigt eine SDS-PAGE-Analyse der Expression von rTbp2-Protein durch E. coli-Zellen, welche mit dem Plasmid pLEM37 transformiert worden sind;
20 zeigt die Konstruktion des Plasmids sLRD35B für die Expression des tbpB-Gens aus M. catarrhalis Q8 in E. coli ohne eine Leader-Sequenz, und die Konstruktion von Plasmid SLRD35A für die Expression des tbpB-Gens aus M. catarrhalis Q8 in E. coli mit einer Leader-Sequenz. Restriktionsstelle B = BamHI; Bg = Bgl II; H = Hind III; R = EcoRI;
21 zeigt die SDS-PAGE-Analyse der Expression von rTbp2-Protein in E. coli-Zellen, welche mit den Plasmiden SLRD35A und SLRD35B transformiert wurden;
22 zeigt ein Flussdiagramm für die Reinigung von rekombinantem Tbp2-Protein aus E. coli;
23, welche die Tafeln A und B einschließt, zeigt eine SDS-PAGE-Analyse der Reinigung von rekombinantem Tbp2-Protein aus den M. catarrhalis-Stämmen 4223 (Tafel A) und Q8 (Tafel B) aus einer Expression in E. coli;
24 zeigt die Bindung von Tbp2 an humanes Transferrin;
25, welche die Tafeln A, B und C einschließt, zeigt die antigenische Konservierung von Tbp2-Protein unter Stämmen von M. catarrhalis;
26 zeigt eine Restriktionskarte des tbpB-Gens für M. catarrhalis R1;
27 zeigt die Nukleotidsequenz des tbpB-Gens (SEQ ID Nr: 45 – gesamte Sequenz, und SEQ ID Nr: 46 – codierende Sequenz) und die abgeleitete Aminosäuresequenz des Tbp2-Proteins von M. catarrhalis R1 (SEQ ID Nr: 47); und
28 zeigt einen Vergleich der Aminosäuresequenzen von Tbp2 für M. catarrhalis 4223 (SEQ ID Nr: 21), Q8 (SEQ ID Nr: 15) und R1 (SEQ ID Nr: 47). Punkte zeigen identische Reste an, und Bindestriche sind für eine Maximum-Alignierung eingefügt worden. Die Asterisken stehen für Stop-Codons.
ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Jedweder Moraxella-Stamm kann zweckmäßigerweise verwendet werden, um die gereinigte und isolierte Nukleinsäure bereitzustellen, welche in der Form von DNA-Molekülen vorliegen kann, die mindestens einen Bereich der Nukleinsäure umfassen, welcher für einen Transferrinrezeptor codiert, wie es von Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung exemplifiziert wird. Derartige Stämme sind im Allgemeinen aus klinischen Quellen und aus Bakterienkultursammlungen, wie der American Type Culture Collection, erhältlich.
In dieser Anmeldung werden die Begriffe "Transferrinrezeptor" (TfR) und "Transferrin-Bindeproteine" (Tbp) verwendet, um eine Familie von Tbp1- und/oder Tbp2-Proteinen zu definieren, welche diejenigen einschließt, die Variationen in ihren Aminosäuresequenzen aufweisen, einschließlich denjenigen, die natürlich in verschiedenen Stämmen von beispielsweise Moraxella vorkommen. Die gereinigten und isolierten DNA-Moleküle, die mindestens einen Bereich umfassen, der für Transferrinrezeptor der vorliegenden Erfindung codiert, schließen auch diejenigen ein, welche funktionelle Analoge von Transferrin-Rezeptorproteinen Tbp1 und Tbp2 von Moraxella codieren. In dieser Anmeldung ist ein erstes Protein ein "funktionelles Analog" eines zweiten Proteins, wenn das erste Protein immunologisch verwandt ist mit, und/oder die gleiche Funktion aufweist wie das zweite Protein. Das funktionelle Analog kann zum Beispiel ein Fragment des Proteins oder eine Substitutions-, Additions- oder Deletionsmutante davon sein.
Chromosomale DNA aus M. catarrhalis 4223 wurde mit Sau3A verdaut, um Fragmente im Größenbereich von 15 bis 23 kb zu erzeugen, und in die BamHI-Stelle des Lambda-Vektors EMBL3 kloniert. Die Bibliothek wurde mit Anti-Tbp1-Meerschweinchen-Antiseren gescreent, und ein positiver Klon, LEM3-24, enthaltend ein Insert von ungefähr 13,2 kb Größe, wurde für die weitere Analyse ausgewählt. Lysat von E. coli LE392, infiziert mit LEM3-24, enthielt festgestelltermaßen ein Protein von ungefähr 115 kDa Größe, welches auf Western-Blots mit Anti-Tbp1-Antiseren reagierte. Ein zweites Protein von ungefähr 80 kDa Größe reagierte mit den Anti-Tbp2-Meerschweinchen-Antiseren auf Western-Blots.
Um das tbpA-Gen auf dem 13,2 kb großen Insert von LEM3-24 zu lokalisieren, wurden degenierte PCR-Primer verwendet, um eine kleine Region des mutmaßlichen tbpA-Gens von M. catarrhalis 4223 zu amplifizieren. Die Sequenzen der degenierten Oligonukleotidprimer basierten auf konservierten Aminosäuresequenzen innerhalb der Tbp1-Proteine von mehreren Neisseria- und Haemophilus-Spezies, und sind in der 1 gezeigt (SEQ ID Nr: 17 und 18). Ein 300 Basenpaare großes, amplifiziertes Produkt wurde erzeugt, und seine Lokalisierung innerhalb des 4223-tbpA-Gens ist durch fettgedruckte Buchstaben in der 5 angegeben (SEQ ID Nr: 29). Das amplifizierte Produkt wurde in den Vektor pCRII subkloniert, markiert und verwendet, um einen Southern-Blot zu sondieren, der mit Restriktionsendonuklease verdaute DNA des Klons LEM3-24 enthielt. Die Sonde hybridisierte an ein 3,8 kb großes HindIII-HindIII-, ein 2,0 kb großes AvrII-AvrII- und 4,2 kb große SalI-SphI-Fragmente (2).
Das 3,8 kb große HindIII-HindIII-Fragment wurde in pACYC177 subkloniert und sequenziert. Ein großer offener Leserahmen wurde identifiziert, und von ihm wurde anschließend festgestellt, ungefähr 2 kb des vermeintlichen tbpA-Gens zu enthalten. Die restlichen 1 kb des tbpA-Gens wurden durch Subklonieren eines angrenzenden, stromabwärts gelegenen HindIII-HindIII-Fragmentes in den Vektor pACYC177 erhalten. Die Nukleotidsequenz des tbpA-Gens aus M. catarrhalis 4223 (SEQ ID Nr: 1 und 2), und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 9 – Volllänge; SEQ ID Nr: 10 – reifes Protein) sind in der 5 gezeigt.
Chromosomale DNA aus dem M. catarrhalis-Stamm Q8 wurde mit Sau3A I verdaut und 15-23 kb große Fragmente wurden mit BamHI-Armen von EMBL3 ligiert. Eine Hochtiter-Bibliothek wurde in E. coli-LE392-Zellen erzeugt und wurde unter Verwendung von Oligonukleotidsonden, die auf der 4223-tbpA-Sequenz basierten, gescreent. Phagen-DNA wurde hergestellt, und eine Restriktionsenzym-Analyse offenbarte, dass Inserts von etwa 13-15 kb kloniert worden waren. Der Phagenklon SLRD-A wurde verwendet, um Fragmente für die Sequenzanalyse zu subklonieren. Ein Klonierungsvektor (pSKMA) wurde erzeugt, um die Klonierung der Fragmente zu erleichtern, und die Plasmide pSLRD1, pSLRD2, pSLRD3, pSLRD4 und pSLRD5 wurden erzeugt, welche die Gesamtheit von tbpA und den Grossteil von tbpB enthielten. Die Nukleotid-(SEQ ID Nr: 5 und 6) und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 13 – Volllänge, SEQ ID Nr: 14 – reifes Protein) des tbpA-Gens aus dem Stamm Q8 werden in der 10 gezeigt.
Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für das Tbp1-Protein, welche von den tbpA-Genen codiert wurden, haben festgestelltermaßen eine gewisse Homologie mit den Aminosäuresequenzen gemeinsam, welche von Genen aus einer Anzahl von Neisseria- und Haemophilus-Spezies codiert werden (12; SEQ ID Nr: 21, 22, 23 und 24).
Vor der vorliegenden Feststellung bzw. Offenlegung wurde von tbpA-Genen, welche in Spezies von Neisseria, Haemophilus und Actinobacillus identifiziert wurden, festgestellt, dass ihnen ein tbpB-Gen mit mehreren konservierten Regionen vorausgeht. Die zwei Gene sind typischerweise durch eine kurze intergenische Sequenz getrennt. Allerdings wurde ein tbpB-Gen nicht stromaufwärts des tbpA-Gens in M. catarrhalis 4223 gefunden. Um das tbpB-Gen innerhalb des 13,2 kb großen Inserts von Klon LEM3-24 zu lokalisieren, wurde eine degenerierte Oligonukleotidsonde synthetisiert, welche auf einer Aminosäuresequenz EGGFYGP (SEQ ID Nr: 30), die unter Tbp2-Proteinen mehrerer Spezies konserviert ist, basierte. Das Oligonukleotid wurde markiert und verwendet, um einen Southern-Blot zu sondieren, der unterschiedliche Restriktionsendonuklease-Fragmente des Klons LEM3-24 enthielt. Die Sonde hybridisierte an ein 5,5 kb großes NheI-SalI-Fragment, welches anschließend in pBR328 subkloniert und sequenziert wurde. Das Fragment enthielt den Großteil des vermeintlichen tbpB-Gens, mit Ausnahme der Promotor-Region. Der Klon LEM3-24 wurde sequenziert, um die restliche Stromaufwärts-Sequenz zu erhalten. Das tbpB-Gen war ungefähr 3 kb stromabwärts vom Ende des tbpA-Gens lokalisiert, im Gegensatz zur genetischen Organisation der tbpA- und tbpB-Gene in Haemophilus und Neisseria. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr: 3 und 4) des tbpB-Gens aus M. catarrhalis 4223 und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 11, 12) sind in der 6 gezeigt. Das tbpB-Gen aus M. catarrhalis Q8 wurde ebenfalls kloniert und sequenziert. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr: 7 und 8) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 15 und 16) sind in der 11 gezeigt. Das tbpB-Gen aus M. catarrhalis R1 wurde ebenfalls kloniert und sequenziert. Die Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr: 45 und 46) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr: 47) sind in der 27 gezeigt. Regionen mit Homologie sind zwischen den M. catarrhalis-Tbp2-Aminosäuresequenzen, wie gezeigt in der vergleichenden Alignierung von 28 (SEQ ID Nr: 11, 15 und 47), und zwischen den M. catarrhalis-Tbp2-Aminosäuresequenzen und den Tbp2-Sequenzen einer Anzahl von Neisseria- und Haemophilus-Spezies, wie gezeigt in der vergleichenden Alignierung in 13 (SEQ ID Nr: 25, 26, 27, 28), offensichtlich.
Klonierte tbpA- und tbpB-Gene wurden in E. coli exprimiert, um rekombinante Tbp1- und Tbp2-Proteine, die frei von anderen Moraxella-Proteinen waren, herzustellen. Diese rekombinanten Proteine wurden gereinigt und für die Immunisierung verwendet.
Die antigenische Konservierung von Tbp2-Protein unter Stämmen von M. catarrhalis wurde durch Trennen der Proteine in Ganzzelllysaten von M. catarrhalis oder Stämmen von E. coli, welche rekombinante Tbp2-Proteine exprimieren, mittels SDS-PAGE und Antiserum-Immunoblotting mit Anti-4223-rTbp2-Antiserum oder Anti-Q8-rTbp2-Antiserum, herangezogen in Meerschweinchen, aufgezeigt. Die M. catarrhalis-Stämme 3, 56, 135, 585, 4223, 5191, 8185 und ATCC 25240 wurden auf diese Weise getestet, und alle zeigten spezifische Reaktivität mit Anti-4223-rTbp2- oder Anti-Q8-rTbp2-Antikörper (25).
Darüber hinaus ist die Fähigkeit von Anti-rTbp2-Antikörpern aus einem Stamm, natives oder rekombinantes Protein aus dem homologen oder heterologen Stamm durch ELISA zu erkennen, in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt.
Die Aminosäuresequenzierung der N-Termini und Cyanogenbromidfragmente von Transferrinrezeptor aus M. catarrhalis 4223 wurde durchgeführt. Sowohl N-Termini von Tbp1 als auch Tbp2 wurden blockiert. Die vermeintlichen Signalsequenzen von Tbp1 und Tbp2 sind jeweils in den 5 bzw. 6 (SEQ ID Nr: 19 und 20) durch Unterstreichung angezeigt. Die abgeleiteten Aminosäuresequenzen für die N-terminale Region von Tbp2 legt eine Lipoprotein-Struktur nahe.
In den nachstehenden Tabellen 1 und 2 gezeigte Resultate veranschaulichen die Fähigkeit von Anti-Tbp1- und Anti-Tbp2-Meerschweinchen-Antiseren, welche durch die Immunisierung mit Tbp1 oder Tbp2 hergestellt wurden, M. catarrhalis zu lysieren. Die Ergebnisse zeigen, dass die Antiseren, die durch Immunisierung mit Tbp1- oder Tbp2-Protein, isoliert aus M. catarrhalis-Isolat 4223, hergestellt worden waren, bakterizid waren gegen einen homologen, nicht-klumpenbildenden M. catarrhalis-Stamm RH408 (ein Stamm, der früher im Zusammenhang mit der US-Patentanmeldung Nr. 08/328 589 , überfragen an den Patentinhaber hiervon, ( WO 96/12733 ), bei der American Type Culture Collection, 1301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, 20852, USA, unter den Bestimmungen des Budapester Vertrages, am 13. Dezember 1994 unter der ATCC-Hinterlegungs-Nr. 55 637 hinterlegt wurde), welcher aus dem Isolat 4223 abgeleitet worden war. Darüber hinaus waren Antiseren, welche hergestellt wurden durch Immunisierung mit Tbp1-Protein, das aus M. catarrhalis 4223 isoliert wurde, bakterizid gegen den heterologen, nicht-klumpenbildenden Stamm Q8 (ein Geschenk von Dr. M.G. Bergeron, Centre Hospitalier de I'Université Laval, St. Foy, Quebec). Darüber hinaus war das gegen rekombinantes Tbp2 (rTbp2)-Protein herangezogene Antiserum bakterizid gegen den homologen Stamm von M. catarrhalis.
Die Fähigkeit von isolierten und gereinigten Transferrin-Bindeproteinen, bakterizide Antikörper zu erzeugen, ist ein in-vivo-Beweis der Verwendbarkeit dieser Proteine als Impfstoffe zum Schutz gegen durch Moraxella verursachte Krankheit.
1. Impfstoffherstellung und -anwendung
Immunogene Zusammensetzungen, die geeignet sind, um als Impfstoffe verwendet zu werden, können aus immunogenen Transferrin-Rezeptorproteinen, Analogen und Fragmenten davon, welche codiert werden von den Nukleinsäuremolekülen, sowie den hierin offenbarten Nukleinsäuremolekülen, hergestellt werden. Der Impfstoff ruft eine Immunantwort hervor, welche Antikörper produziert, einschließlich Anti-Transferrinrezeptor-Antikörpern und Antikörpern, welche opsonisierend oder bakterizid sind. Sollte das geimpfte Subjekt durch Moraxella herausgefordert werden, binden die Antikörper an den Transferrinrezeptor und verhindern dadurch den Zugang der Bakterien zu einer Eisenquelle, welche für die Lebensfähigkeit erfordert wird. Darüber hinaus können opsonisierende oder bakterizide Anti-Transferrinrezeptor-Antikörper auch einen Schutz durch alternative Mechanismen bereitstellen.
Immunogene Zusammensetzungen, einschließlich Impfstoffen, können als injizierbare Formen, als flüssige Lösungen oder Emulsionen hergestellt werden. Die Transferrin-Rezeptorproteine, Analoge und Fragmente davon und codierende Nukleinsäuremoleküle können mit pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten gemischt werden, welche kompatibel mit den Transferrin-Rezeptorproteinen, Fragmenten, Analogen oder Nukleinsäuremolekülen sind. Derartige Exzipienten können Wasser, Kochsalzlösung, Dextrose, Glycerol, Ethanol und Kombinationen davon einschließen. Die immunogenen Zusammensetzungen und Impfstoffe können ferner Hilfssubstanzen, wie Benetzungs- oder Emulgiermittel, pH-Pufferungsmittel oder Adjuvantien enthalten, um die Wirksamkeit der Impfstoffe zu steigern. Immunogene Zusammensetzungen und Impfstoffe können parenteral, mittels Injektion subkutan, intradermal oder intramuskulär verabreicht werden. Alternativ dazu können die gemäß der vorliegenden Erfindung bereitgestellten immunogenen Zusammensetzungen in einer Weise formuliert und zugeführt werden, um eine Immunantwort an Schleimhautoberflächen hervorzurufen. Somit kann die immunogene Zusammensetzung an Schleimhautoberflächen durch zum Beispiel den nasalen oder oralen (intragastrischen) Wegen verabreicht werden. Die immunogene Zusammensetzung kann in Kombination mit einem Ziellenkungsmolekül für die Zuführung an spezifische Zellen des Immunsystems oder an Schleimhautoberflächen bereitgestellt werden. Einige derartige Ziellenkungsmoleküle schließen Vitamin B12 und Fragmente von bakteriellen Toxinen, wie beschrieben in der WO 92/17167 (Biotech Australia Pty. Ltd.), und monoklonale Antikörper, wie beschrieben im U.S.-Patent Nr. 5 194 254 (Barber et al.), ein. Alternativ dazu können andere Arten der Verabreichung, einschließlich Suppositorien und oraler Formulierungen, wünschenswert sein. Für Suppositorien können Bindemittel und Träger beispielsweise Polyalkalenglycole oder Triglyceride einschließen. Orale Formulierungen können normal verwendete Inzipienten bzw. Trägersubstanzen einschließen, wie zum Beispiel pharmazeutische Güteklassen von Saccharin, Zellulose und Magnesiumcarbonat. Diese Zusammensetzungen können die Form von Lösungen, Suspensionen, Tabletten, Pillen, Kapseln, Formulierungen mit verzögerter Freisetzung oder Pulvern einnehmen und enthalten etwa 1 bis 95% der Transferrin-Rezeptorproteine, Fragmente, Analoge und/oder Nukleinsäuremoleküle.
Die Impfstoffe werden in einer mit der Dosierungsformulierung verträglichen Weise und in einer solchen Menge verabreicht, wie sie therapeutisch wirksam, schützend und immunogen sein wird. Die zu verabreichende Menge hängt von dem zu behandelnden Subjekt ab, einschließlich zum Beispiel dem Vermögen des Immunsystems des Individuums, Antikörper zu synthetisieren, und, falls benötigt, eine zell-vermittelte Immunantwort hervorzubringen. Die genauen Mengen an aktivem Bestandteil, deren Verabreichung erforderlich ist, hängen von der Beurteilung des Arztes ab. Allerdings sind geeignete Dosierungsbereiche ohne Weiteres vom Fachmann auf dem Gebiet feststellbar und können in der Größenordnung von Mikrogramm der Transferrin rezeptor-Proteine, Analoge und Fragmente davon und/oder Nukleinsäuremoleküle liegen. Geeignete Zeitpläne zur anfänglichen Verabreichung und für Auffrisch- bzw. Booster-Dosen sind ebenfalls variabel, können aber eine anfängliche Verabreichung, auf welche anschließende Verabreichungen folgen, einschließen. Die Dosierung des Impfstoffs kann auch von dem Weg der Verabreichung abhängen und wird gemäß der Größe des Wirtes variieren.
Die Nukleinsäuremoleküle, welche den Transferrinrezeptor von Moraxella codieren, können direkt für die Immunisierung durch direktes Verabreichen der DNA, zum Beispiel durch Injektion für genetische Immunisierung, oder durch Konstruieren eines Lebendvektors, wie Salmonella, BOG, Adenovirus, Pockenvirus, Vaccinia oder Poliovirus, welcher die Nukleinsäuremoleküle enthält, verwendet werden. Eine Erörterung einiger Lebendvektoren, welche verwendet worden sind, um heterologe Antigene zum Immunsystem zu tragen, ist beispielsweise in O'Hagan (Ref. 22) enthalten. Verfahren für die direkte Injektion von DNA in Testsubjekte für die genetische Immunisierung werden zum Beispiel in Ulmer et al. (Ref. 23) beschrieben.
Die Immunogenität kann signifikant verbessert werden, wenn die Antigene mit Adjuvantien gemeinsam verabreicht werden, die üblicherweise als eine 0,05- bis 1,0-prozentige Lösung in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verwendet werden. Adjuvantien verstärken die Immunogenität eines Antigens aber sind selbst nicht notwendigerweise immunogen. Adjuvantien können durch örtliches Zurückhalten des Antigens nahe der Stelle der Verabreichung wirken, um einen Depoteffekt hervorzurufen, der eine langsame, anhaltende Freisetzung von Antigen an Zellen des Immunsystems erleichtert. Adjuvantien können ebenfalls Zellen des Immunsystems zu einem Antigendepot locken und derartige Zellen dazu stimulieren, Immunantworten auszulösen.
Immunstimulatorische Agenzien oder Adjuvantien sind viele Jahre lang verwendet worden, um die Wirt-Immunantworten, zum Beispiel auf Impfstoffe, zu verbessern. Intrinsische Adjuvantien, wie Lipopolysaccharide, sind normalerweise die Bestandteile von abgetöteten oder abgeschwächten Bakterien, welche als Impfstoffe verwendet werden. Extrinsische Adjuvantien sind Immunmodulatoren, welche typischerweise nicht-kovalent mit Antigenen verbunden sind, und werden formuliert, um die Wirt-Immunantworten zu verstärken. Somit sind Adjuvantien identifiziert worden, welche die Immunantwort gegen parenteral zugeführte Antigene verstärken. Einige dieser Adjuvantien sind jedoch toxisch und können unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, die sie ungeeignet zur Verwendung in Menschen und vielen Tieren machen. Tatsächlich werden nur Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat (zusammen üblicherweise bezeichnet als Alum) routinemäßig als Adjuvantien in humanen und tiermedizinischen Impfstoffen verwendet. Die Wirksamkeit von Alum bei der Erhöhung von Antikörperantworten gegen Diphtherie- und Tetanus-Toxoide ist allgemein anerkannt, und ein HBsAg-Impfstoff ist mit Alum adjuvantiert worden. Obgleich die Verwendbarkeit von Alum für manche Anwendungen allgemein anerkannt ist, weist sie Einschränkungen auf. Zum Beispiel ist Alum unwirksam für Influenza-Impfung und ruft eine zellvermittelte Immunantwort in inkosistenter Weise hervor. Die durch Alumadjuvantierte Antigene hervorgerufenen Antikörper sind hauptsächlich vom IgG1-Isotyp in der Maus, was für einen Schutz durch einige Impfstoff-Mittel nicht optimal sein kann.
Eine breite Auswahl von extrinsischen Adjuvantien kann wirkungsvolle Immunantworten gegen Antigene hervorrufen. Diese beinhalten Saponine, welche an Membranprotein-Antigene komplexiert sind (immun-stimulierende Komplexe), Pluronic-Polymere mit Mineralöl, abgetötete Mycobakterien und Mineralöl, Freund'sches vollständiges Adjuvans, bakterielle Produkte, wie Muramyldipeptid (MOP) und Lipopolysaccharid (LPS) sowie Lipid A und Liposomen.
Um humorale Immunantworten (HIR) und zellvermittelte Immunität (CMI) wirkungsvoll zu induzieren, werden Immunogene häufig in Adjuvantien emulgiert. Viele Adjuvantien sind toxisch, wobei sie Granulome, akute und chronische Entzündungen (Freund'sches vollständiges Adjuvans, FCA), Cytolyse (Saponine und Pluronic-Polymere) und Pyrogenizität, Arthritis und anteriore Uveitis (LPS und MOP) hervorrufen. Obwohl FCA ein hervorragendes Adjuvans ist und in der Forschung weithin verwendet wird, ist es für die Verwendung in humanen oder tiermedizinischen Impfstoffen aufgrund seiner Toxizität nicht zugelassen.
Wünschenswerte Merkmale von idealen Adjuvantien schließen Folgendes ein:

(1) das Fehlen von Toxizität;
(2) die Fähigkeit, eine langanhaltende Immunantwort zu stimulieren;
(3) die Einfachheit der Herstellung und Stabilität bei langfristiger Aufbewahrung;
(4) die Fähigkeit, sowohl CMI als auch HIR gegen auf verschiedenen Wegen verabreichte Antigene hervorzurufen, falls erforderlich;
(5) die Synergie mit anderen Adjuvantien;
(6) das Vermögen, selektiv mit Populationen von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) wechselzuwirken;
(7) die Fähigkeit, geeignete T_H1- oder T_H2-zellspezifische Immunantworten spezifisch hervorzurufen; und
(8) die Fähigkeit, geeignete Antikörperisotyp-Spiegel (zum Beispiel IgA) gegen Antigene selektiv zu erhöhen.

Das U.S.-Patent Nr. 4 855 283 lehrt Glycolipidanaloge, einschließlich N-Glycosylamiden, N-Glycosylharnstoffen und N-Glycosylcarbamaten, von denen jedes im Zuckerrest mit einer Aminosäure substituiert ist, als Immunmodulatoren oder Adjuvantien. So berichteten Lockhoff et al., 1991 (Ref. 24), dass N-Glycolipid-Analoge, welche Strukturähnlichkeiten zu den natürlich vorkommenden Glycolipiden, wie Glycophospholipiden und Glycoglycerolipiden, aufzeigen, zur Hervorrufung starker Immunantworten sowohl in Herpes-Simplex-Virus-Impfstoff als auch Pseudorabies-Virus-Impfstoff in der Lage sind. Manche Glycolipide sind aus langkettigen Alkylaminen und Fettsäuren synthetisiert worden, welche direkt über das anomere Kohlenstoffatom mit den Zuckern verknüpft sind, um die Funktionen der natürlich vorkommenden Lipidreste nachzuahmen.
Das U. S.-Patent Nr. 4 258 029 lehrt, dass Octadecyltyrosinhydrochlorid (OTH) als ein Adjuvans fungiert, wenn es komplexiert ist mit Tetanustoxoid und Formalininaktiviertem Typ-I-, II- und III-Poliomyelitis-Virus-Impfstoff. Des Weiteren berichteten Nixon-George et al., 1990 (Ref. 25), dass Octadecylester von aromatischen Aminosäuren, welche mit einem rekombinanten Hepatitis-B-Oberflächenantigen komplexiert sind, die Wirtsimmunantworten gegen Hepatitis-B-Virus verstärkten.
2. Immunoassays
Die Transferrin-Rezeptorproteine, Analoge und/oder Fragmente davon sind nützlich als Immunogene, als Antigene in Immunoassays, einschließlich Enzym-verknüpften Antikörper-Bindungsassays oder Vorgehensweisen, welche im Fachgebiet für den Nachweis von Anti-Moraxella-Transferrin-Rezeptorprotein-Antikörpern bekannt sind. In ELISA-Assays werden das Transferrin-Rezeptorprotein, Analoge und/oder Fragmente, welche Bereichen von TfR-Protein entsprechen, auf einer gewählten Oberfläche immobilisiert, zum Beispiel einer Oberfläche, die fähig ist, Proteine oder Peptide zu binden, wie die Mulden einer Polystyrol-Mikrotiterplatte. Nach dem Waschen zur Entfernung von unvollständig adsorbiertem Transferrinrezeptor, Analogen und/oder Fragmenten kann ein nicht-spezifisches Protein, wie eine Lösung von Rinderserumalbumin (BSA) oder Casein, welches bekannterweise antigenisch neutral in Hinsicht auf die Testprobe ist, an die gewählte Oberfläche gebunden werden. Dies gestattet die Blockierung von nichtspezifischen Adsorptionsstellen auf der immobilisierenden Oberfläche und reduziert daher den durch nicht-spezifische Bindungen von Antiseren auf die Oberfläche verursachten Hintergrund.
Die immobilisierende Oberfläche wird dann mit einer zu testenden Probe, wie klinischen oder biologischen Materialien, auf eine Weise kontaktiert, welche der Bildung eines Immunkomplexes (Antigen/Antikörper) förderlich ist. Diese Vorgehensweise kann das Verdünnen der Probe mit Verdünnungsmitteln, wie BSA, Rindergammaglobulin (BGG) und/oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)/Tween, einschließen. Die Probe wird dann etwa 2 bis 4 Stunden lang inkubieren gelassen, bei Temperaturen, wie denjenigen der Größenordnung von etwa 25° bis 37°C. Im Anschluss an die Inkubation wird die Proben-kontaktierte Oberfläche gewaschen, um nicht-immunkomplexiertes Material zu entfernen. Das Waschvorgehen kann das Waschen mit einer Lösung, wie PBS/Tween oder einem Boratpuffer, einschließen.
Im Anschluss an die Bildung von spezifischen Immunkomplexen zwischen der Testprobe und dem gebundenen Transferrin-Rezeptorprotein, Analogen und/oder Fragmenten und anschließendem Waschen kann das Auftreten, und sogar die Menge, von Immunkomplex-Bildung bestimmt werden durch Aussetzen des Immunkomplexes an einen zweiten Antikörper, welcher Spezifität für den ersten Antikörper aufweist. Wenn die Testprobe von menschlichem Ursprung ist, ist der zweite Antikörper ein Antikörper mit Spezifität für humane Immunglobuline und im Allgemeinen IgG. Um Nachweis-Mittel bereitzustellen, kann der zweite Antikörper eine assoziierte Aktivität aufweisen, wie eine enzymatische Aktivität, welche zum Beispiel eine Farbentwicklung nach Inkubieren mit einem geeigneten chromogenen Substrat erzeugen wird. Eine Quantifizierung kann dann bewerkstelligt werden durch Messen des Ausmaßes der Farberzeugung unter Verwendung von zum Beispiel einem Spektrophotometer.
3. Verwendung von Sequenzen als Hybridisierungssonden
Die Nukleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung, umfassend die Sequenz des Transferrinrezeptor-Gens, gestatten nun die Identifizierung und Klonierung der Transferrinrezeptor-Gene aus jeglicher Spezies von Moraxella.
Die Nukleotidsequenzen, welche die Sequenz der Transferrinrezeptor-Gene der vorliegenden Erfindung umfassen, sind nützlich hinsichtlich ihres Vermögens, selektiv Doppelstrangmoleküle mit komplementären Abschnitten von anderen TfR-Genen zu bilden. Abhängig von der Anwendung kann eine Vielzahl von Hybridisierungsbedingungen angewandt werden, um variierende Ausmaße von Selektivität der Sonde gegenüber den anderen TfR-Genen zu erzielen. Für einen hohen Grad an Selektivität werden relativ stringente Bedingungen verwendet, um die Doppelstränge zu bilden, wie Niedrigsalz- und/oder Hochtemperatur-Bedingungen, wie sie vorgesehen werden durch 0,02 M bis 0,15 M NaCl bei Temperaturen von zwischen etwa 50°C bis 70°C. Für einige Anwendungen werden weniger stringente Hybridisierungsbedingungen erfordert, wie 0,15 M bis 0,9 M Salz, bei Temperaturen im Bereich von zwischen etwa 20°C bis 55°C. Hybridisierungsbedingungen können ebenfalls stringenter gemacht werden durch die Zugabe von steigenden Mengen an Formamid, um den Hybrid-Doppelstrang zu destabilisieren. Somit können jeweilige Hybridisierungsbedingungen ohne weiteres manipuliert werden und werden im Allgemeinen eine Methode der Wahl, abhängig von den gewünschten Ergebnissen, sein. Im Allgemeinen sind zweckmäßige Hybridisierungstemperaturen in Gegenwart von 50% Formamid: 42°C für eine Sonde, welche 95 bis 100% homolog zu dem Zielfragment ist; 37°C für 90 bis 95% Homologie, und 32°C für 85 bis 90% Homologie.
In einer klinischen diagnostischen Ausführungsform können die Nukleinsäuresequenzen der TfR-Gene der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem geeigneten Mittel, wie einer Markierung, zum Bestimmen von Hybridisierung verwendet werden. Eine große Vielzahl von geeigneten Indikatormitteln sind im Fachgebiet bekannt, einschließlich radioaktiven, enzymatischen oder anderen Liganden, wie Avidin/Biotin und Digoxigenin-Markierung, welche zur Bereitstellung eines nachweisbaren Signals in der Lage sind. In manchen diagnostischen Ausführungsformen kann ein Enzym-Tag bzw. -Markierungsanhängsel, wie Uresse, alkalische Phosphatase oder Peroxidase, anstatt eines radioaktiven Tags verwendet werden. Im Falle von Enzym-Tags sind kolorimetrische Indikatorsubstrate bekannt, welche eingesetzt werden können, um ein für das menschliche Auge oder spektrophotometrisch sichtbares Mittel vorzusehen, um spezifische Hybridisierung mit TfR-Gensequenzen enthaltenden Proben zu identifizieren.
Die Nukleinsäuresequenzen von TfR-Genen der vorliegenden Erfindung sind nützlich als Hybridisierungssonden in Lösungs-Hybridisierungen und in Ausführungsformen, welche Festphasen-Vorgehensweisen verwenden. In Ausführungsformen, welche Festphasen-Vorgehensweisen beinhalten, wird die Test-DNA (oder -RNA) aus Proben, wie klinischen Proben, einschließlich Ausscheidungen, Körperfluiden (z. B. Serum, Amnionfluid, Mittelohr-Effusion, Sputum, Bronchioalveolar-Waschfluid) oder sogar Geweben, an eine gewählte Matrix oder Oberfläche adsorbiert oder anderweitig angeheftet. Die angeheftete bzw. fixierte, einzelsträngige Nukleinsäure wird dann einer spezifischen Hybridisierung mit ausgewählten Sonden, welche die Nukleinsäuresequenzen der TfR-Gene oder Fragmente davon der vorliegenden Erfindung umfassen, unter gewünschten Bedingungen unterzogen. Die gewählten Bedingungen werden von den jeweiligen Umständen abhängen, basierend auf den jeweiligen Kriterien, welche erforderlich sind, abhängig von zum Beispiel den G+C-Gehalten, dem Typ von Ziel-Nukleinsäure, der Quelle von Nukleinsäure, der Größe der Hybridisierungssonde etc. Im Anschluss an das Waschen der Hybridisierungsoberfläche, so dass nicht-spezifische gebundene Sondenmoleküle entfernt werden, wird eine spezifische Hybridisierung mittels der Markierung nachgewiesen oder sogar quantifiziert. Es wird bevorzugt, Nukleinsäuresequenzbereiche zu wählen, welche unter Spezies von Moraxella konserviert sind. Die gewählte Sonde kann mindestens 18 bp lang sein und kann im Bereich von etwa 30 bis 90 bp liegen.
4. Expression der Transferrinrezeptor-Gene
Plasmidvektoren, die Replikon- und Steuerungssequenzen enthalten, welche aus mit der Wirtszelle kompatiblen Spezies abgeleitet sind, können für die Expression der Transferrinrezeptor-Gene in Expressionssystemen verwendet werden. Der Vektor trägt gewöhnlicherweise eine Replikationsstelle sowie Markierungs-Sequenzen, welche zur Bereitstellung einer phänotypischen Selektion in transformierten Zellen in der Lage sind. Zum Beispiel kann E. coli unter Verwendung von pBR322 transformiert werden, welcher Gene für Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz enthält und daher einfache Methoden zur Identifizierung transformierter Zellen vorsieht. Das pBR322-Plasmid, oder ein anderes mikrobielles Plasmid oder Phage, muss des Weiteren Promotoren enthalten oder modifiziert sein, um diese zu enthalten, welche von der Wirtszelle für die Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können.
Darüber hinaus können Phagenvektoren, welche Replikon- und Steuerungssequenzen enthalten, die mit dem Wirt kompatibel sind, als ein transformierender Vektor im Zusammenhang mit diesen Wirten angewandt werden. Zum Beispiel kann der Phage in Lambda GEM^TM-11 bei der Herstellung rekombinanter Phagenvektoren verwendet werden, welche zum Transformieren von Wirtszellen, wie E. coli LE392, verwendet werden können.
Promotoren, welche üblicherweise bei rekombinanter DNA-Konstruktion verwendet werden, schließen die β-Lactamase(Penicillinase)- und Lactose-Promotorsysteme und andere mikrobielle Promotoren, wie das T7-Promotorsystem, wie beschrieben im U.S.-Patent Nr. 4 952 496 , ein. Einzelheiten, welche die Nukleotidsequenzen von Promotoren betreffen, sind bekannt, was einen Fachmann dazu befähigt, sie funktionsfähig mit Genen zu ligieren. Der jeweilige verwendete Promotor wird im Allgemeinen eine wahlfreie Angelegenheit in Abhängigkeit von den gewünschten Ergebnissen sein. Wirte, welche für die Expression der Transferrinrezeptor-Gene, Fragmente, Analoge oder Varianten davon geeignet sind, können E. coli, Bacillus-Spezies, Haemophilus, Pilze, Hefe, Moraxella, Bordetella einschließen, oder das Baculovirus-Expressionssystem kann verwendet werden.
Es wird bevorzugt, das Transferrin-Rezeptorprotein, ein Fragment oder ein Analog davon, durch rekombinante Verfahren herzustellen, insbesondere weil das natürlich vorkommende TfR-Protein, wie es aus einer Kultur einer Spezies von Moraxella gereinigt wird, Spurenmengen an toxischen Materialien oder andere Kontaminanten einschließen kann. Dieses Problem kann vermieden werden durch Verwenden von in heterologen Systemen rekombinant hergestelltem TfR-Protein, welches aus dem Wirt auf eine Weise isoliert werden kann, um Kontaminanten in dem gereinigten Material zu minimieren. Besonders wünschenswerte Wirte zur Expression in dieser Hinsicht schließen grampositive Bakterien ein, welche kein LPS aufweisen und daher frei von Endotoxin sind. Derartige Wirte schließen Spezies von Bacillus ein und können besonders nützlich für die Herstellung von nicht-pyrogenem Transferrinrezeptor, Fragmenten oder Analogen davon sein. Darüber hinaus gestatten rekombinante Verfahren zur Herstellung die Erzeugung von Tbp1 oder Tbp2 oder jeweiligen Analogen oder Fragmenten davon, getrennt voneinander, was unterschiedlich zu den normalerweise kombinierten Proteinen ist, welche in Moraxella vorhanden sind.
Biologische Hinterlegungen

Bestimmte Vektoren, die wenigstens einen Bereich enthalten, der für ein Transferrin-Rezeptorprotein aus Stämmen von Moraxella catarrhalis-Stamm 4223 und Q8 und einem Stamm von M. catarrhalis RH408 codiert, welche hierin beschrieben sind und auf welche hierin Bezug genommen wird, sind bei der American Type Culture Collection (ATCC), ansässig 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, unter Befolgung des Budapester Vertrages hinterlegt worden. Hinterlegungs-Zusammenfassung

HINTERLEGUNG	ATCC-BEZEICHNUNG	HINTERLEGUNGS-DATUM
Phage LEM3-24	97 381	4. Dezember 1995
Phage SLRD-A	97 380	4. Dezember 1995
Plasmid pLEM29	97 461	8. März 1996
Plasmid pSLRD35A	97 833	13. Januar 1997
Plasmid pLEM37	97 834	13. Januar 1997
Stamm RH408	55 637	9. Dezember 1994

BEISPIELE
Die obenstehende Offenbarung beschreibt die vorliegende Erfindung im Allgemeinen. Ein vollständigeres Verständnis kann unter Bezugnahme auf die folgenden spezifischen Beispiele erhalten werden. Diese Beispiele sind lediglich aus Zwecken der Veranschaulichung beschrieben, und mit ihnen wird nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung einzuschränken. Änderungen in der Form und die Substitution von Äquivalenten werden in Betracht gezogen, wie es die Umstände nahelegen oder als zweckdienlich erscheinen lassen können. Obwohl hierin spezifische Begriffe verwendet worden sind, sind derartige Begriffe in einem beschreibenden Sinn und nicht zu Zwecken von Einschränkungen beabsichtigt.
Verfahren der Molekulargenetik, Proteinbiochemie und Immunologie, welche angewandt, aber in dieser Offenbarung und diesen Beispielen nicht explizit beschrieben werden, sind in der wissenschaftlichen Literatur in breitem Umfang berichtet und liegen durchaus innerhalb des Kenntnisstands bzw. der Fähigkeiten des Fachmanns auf dem Gebiet.
Beispiel 1
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung und Immunisierung von Meerschweinchen mit Tbp1- und Tbp2-Proteinen aus M. catarrhalis.
Tbp1- und Tbp2-Proteine wurden wie folgend erhalten:
Eisen-ausgezehrte unreine Gesamtmembranpräparationen wurden auf 4 mg Protein/ml in 50 mM Tris.HCl-1M NaCl, pH 8, in einem Gesamtvolumen von 384 ml verdünnt. Membranen wurden durch die Zugabe von jeweils 8 ml 0,5 M EDTA und 30% Sarkosyl solubilisiert, und Proben wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur unter vorsichtigem Rühren inkubiert. Solubilisierte Membranen wurden bei 10 K U/min 20 Minuten lang zentrifugiert. 15 ml Apo-hTf-Sepharose 4B wurden zu dem Überstand zugesetzt und 2 Stunden lang bei Raumtemperatur, mit vorsichtigem Schütteln, inkubiert. Die Mischung wurde in eine Säule gegeben. Die Säule wurde mit 50 ml 50 mM Tris.HCl-1 M NaCl-250 mM Guanidinhydrochlorid gewaschen, um kontaminierende Proteine zu entfernen. Tbp2 wurde aus der Säule eluiert durch Zugeben von 100 ml 1,5 M Guanidinhydrochlorid. Tbp1 wurde durch die Zugabe von 100 ml 3 M Guanidinhydrochlorid eluiert. Die ersten 20-ml-Fraktionen wurden gegen 3 Wechsel von 50 mM Tris.HCl, pH 8,0, dialysiert. Proben wurden bei –20°C aufbewahrt oder gegen Ammoniumbicarbonat dialysiert und lyophilisiert.
Meerschweinchen (Charles River) wurden intramuskulär am Tag +1 mit einer 10-μg-Dosis von Tbp1 oder Tbp2, welche in Freund'schem vollständigen Adjuvans emulgiert war, immunisiert. Die Tiere erhielten eine Auffrischdosis an den Tagen +14 und +29 mit der gleichen Dosis von Protein, welches in Freund'schem unvollständigem Adjuvans emulgiert war. Blutproben wurden am Tag +42 entnommen, und Seren wurden für die Analyse von bakterizider Antikörperaktivität verwendet. Darüber hinaus wurden alle Antiseren durch Immunoblot-Analyse hinsichtlich Reaktivität mit M. catarrhalis-4223-Proteinen überprüft.
Die bakterizide Antikörperaktivität von Meerschweinchen-Anti-M. catarrhalis 4223-Tbp1- oder -Tbp2-Antiseren wurde wie folgend bestimmt. Ein nicht-klumpenbildender M. catarrhalis-Stamm RH408, der aus dem Isolat 4223 abgeleitet war, wurde in 20 ml BHI-Nährmedium inokuliert und 18 Stunden lang bei 37°C unter Schütteln bei 170 U/min wachsen gelassen. Ein ml dieser Kultur wurde verwendet, um 20 ml BHI zu inokulieren, welches mit 25 mM Ethylendiamin-di-hydroxyphenylessigsäure (EDDA; Sigma) ergänzt worden war. Die Kultur wurde bis zu einer OD₅₇₈ von 0,5 herangezogen. Die Zellen wurden 1:200 000 in 140 mM NaCl, 93 mM NaHCO₃, 2 mM Na-Barbiturat, 4 mM Barbitursäure, 0,5 mM MgCl₂·6H₂O, 0,4 mM CaCl₂·2H₂O, pH 7,6 (Veronal-Puffer), enthaltend 0,1% Rinderserumalbumin (VBS), verdünnt und auf Eis gestellt. Meerschweinchen-Anti-M. catarrhalis 4223-Tbp1- oder -Tpb2-Antiseren, zusammen mit Vorabblutproben-Kontrollantiseren, wurden 30 min. lang auf 56°C erwärmt, um endogenes Komplement zu inaktivieren. Zweifache serielle Verdünnungen von jedem Antiserum in VBS wurden in die Mulden einer 96-Mulden-Nunclon-Mikrotiterplatte (Nunc, Roskilde, Dänemark) zugegeben. Die Verdünnungen begannen bei 1:8 und wurden zu einem Endvolumen von 25 μl in jeder Mulde vorgenommen. 25 μl der verdünnten Bakterienzellen wurden in jede der Mulden zugegeben. Ein Meerschweinchen-Komplement (Biowhittaker, Walkersville, MD) wurde 1:10 in VBS verdünnt, und 25-μl-Portionen wurden in jede Mulde zugegeben. Die Platten wurden bei 37°C während 60 min. inkubiert, wobei vorsichtig bei 70 U/min auf einer Rotationsplattform geschüttelt wurde. 50 μl jeder Reaktionsmischung wurden auf Mueller-Hinton (Becton-Dickinson, Cockeysviille, MD)-Agarplatten ausplattiert. Die Platten wurden bei 37°C während 72 Stunden inkubiert, und die Anzahl an Kolonien pro Platte wurden ausgezählt. Bakterizide Titer wurden als der Kehrwert der höchsten Verdünnung von Antiserum, welche zum Töten von mehr als 50% Bakterien, verglichen mit Kontrollen, welche Vorab-Immunseren enthielten, in der Lage ist, bewertet. Die Ergebnisse, welche in der nachstehenden Tabelle 1 gezeigt sind, veranschaulichen das Vermögen der Anti-Tbp1- und Anti-Tbp2-Meerschweinchen-Antiseren, M. catarrhalis zu lysieren.
Beispiel 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Herstellung von chromosomaler DNA aus den M. catarrhalis-Stämmen 4223 und Q8.
Das M. catarrhalis-Isolat 4223 wurde in 100 ml BHI-Nährmedium inokuliert und 18 Stunden lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 10 000 × g während 20 Minuten geerntet. Das Pellet wurde für die Extraktion von chromosomaler DNA von M. catarrhalis 4223 verwendet.
Das Zellpellet wurde in 20 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,5)-1,0 mM EDTA (TE) resuspendiert. Pronase und SDS wurden zu Endkonzentrationen von 500 μg/ml bzw. 1,0% zugegeben, und die Suspension wurde bei 37°C während 2 Stunden inkubiert. Nach mehreren sequenziellen Extraktionen mit Phenol, Phenol:Chloroform (1:1), und Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) wurde der wässrige Extrakt bei 4°C während 4 Stunden gegen 1,0 M NaCl und weitere 48 Stunden lang gegen TE (pH 7,5), mit drei Puffer-Wechseln, dialysiert. Zwei Volumina von Ethanol wurden zu dem Dialysat zugesetzt, und die DNA wurde auf einem Glasstab aufgespult. Die DNA wurde an Luft trocknen gelassen und wurde in 3,0 ml Wasser aufgelöst. Die Konzentration wurde durch UV-Spektrophotometrie auf etwa 290 μg/ml eingeschätzt.
Der M. catarrhalis-Stamm Q8 wurde in BHI-Nährlösung kultiviert, wie es in Beispiel 1 beschrieben wurde. Zellen wurden aus 50 ml Kultur durch 20-minütige Zentrifugation bei 5000 U/min bei 4°C pellettiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) resuspendiert, und Proteinase K und SDS wurden zu Endkonzentrationen von 500 μg/ml bzw. 1% zugesetzt. Die Probe wurde bei 37°C 4 Stunden lang inkubiert, bis ein klares Lysat erhalten wurde. Das Lysat wurde zweimal mit Tris-gesättigtem Phenol/Chloroform (1:1), und zweimal mit Chloroform extrahiert. Die letztendliche wässrige Phase wurde 24 Stunden lang gegen 2 × 1000 ml 1 M NaCl bei 4°C dialysiert, wobei der Puffer einmal gewechselt wurde, und 24 Stunden lang gegen 2 × 1000 ml TE bei 4°C dialysiert, wobei der Puffer einmal gewechselt wurde. Das letztendliche Dialysat wurde mit zwei Volumen 100%igem Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde aufgespult, getrocknet und in 5 bis 10 ml TE-Puffer resuspendiert.
Beispiel 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion von chromosomalen M. catarrhalis-Bibliotheken in EMBL3.
Eine Serie von Sau3A-Restriktionsverdaus von chromosomaler DNA, in Endvolumina von jeweils 10 μl wurde durchgeführt, um die Bedingungen zu optimieren, welche zur Erzeugung maximaler Mengen an Restriktionsfragmenten innerhalb eines Größenbereichs von 15 bis 23 kb notwendig sind. Unter Anwendung der optimierten Verdaubedingungen wurde ein Verdau im großen Maßstab in einem Volumen von 100 μl angesetzt, welcher Folgendes enthielt:
50 μl chromosomale DNA (290 μg/ml), 33 μl Wasser, 10 μl 10X Sau3a-Puffer (New England Biolabs), 1,0 μl BSA (10 mg/ml, New England Biolabs) und 6,3 μl Sau3a (0,04 U/μl). Im Anschluss an eine 15 Minuten lange Inkubation bei 37°C wurde der Verdau durch die Zugabe von 10 μl 100 mM Tris-HCl (pH 8,0) – 10 mM EDTA-0,1% Bromphenolblau – 50% Glycerol (Auftragpuffer) beendet. Verdaute DNA wurde durch ein 0,5%iges Agarosegel in 40 mM Tris-Acetat – 2 mM Na₂EDTA·2H₂O (pH 8,5) (TAE-Puffer) bei 50 V während 6 Stunden elektrophoretisch aufgetrennt. Die Region, welche Restriktionsfragmente innerhalb eines Molekulargrößenbereichs von 15 bis 23 kb enthielt, wurde aus dem Gel ausgeschnitten und in einen Dialyseschlauch, welcher 3,0 ml TAE-Puffer enthielt, eingebracht. DNA wurde aus dem Gelfragment durch Anlegen einer Feldstärke von 1,0 V/cm während 18 Stunden elektroeluiert. Elektroeluierte DNA wurde jeweils einmal mit Phenol und Phenol:Chloroform (1:1) extrahiert und mit Ethanol gefällt. Die getrocknete DNA wurde in 5,0 μl Wasser gelöst.
Größenfraktionierte chromosomale DNA wurde mit BamHI-verdauten EMBL3-Armen (Promega) unter Verwendung von T4-DNA-Ligase in einem Endvolumen von 9 μl ligiert. Die gesamte Ligationsmischung wurde in Lambda-Phage verpackt, wobei ein handelsübliches Verpackungs-Kit (Amersham) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers verwendet wurde.
Die verpackte DNA-Bibliothek wurde auf festen Medien amplifiziert. 0,1 ml große Aliquots von Escherichia coli-Stamm NM539 in 10 mM MgSO₄ (OD₂₆₀ = 0,5) wurden bei 37°C 15 Minuten lang mit 15 bis 25 μl der verpackten DNA-Bibliothek inkubiert. Die Proben wurden mit 3 ml 0,6% Agarose, die 1,0% BBL-Trypticase-Pepton – 0,5% NaCl enthielt (BBL-Top-Agarose), gemischt, und die Mischungen wurden auf 1,5%ige Agarplatten ausplattiert, welche 1,0% BBL-Trypticase-Pepton – 0,5% NaCl enthielten, und 18 Stunden lang bei 37°C inkubiert. 3 ml große Mengen von 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) – 8 mM Magnesiumsulfat-Heptahydrat – 100 mM NaCl – 0,01% (w/v) Gelatine (SM-Puffer) wurden zu jeder Platte gegeben, und die Platten wurden 7 Stunden lang bei 4°C stehen gelassen. SM-Puffer, welcher Phage enthielt, wurde von den Platten abgesammelt, gemeinsam vereinigt und in einem Röhrchen mit Schraubdeckel bei 4°C mit Chloroform aufbewahrt.
Chromosomale DNA aus dem M. catarrhalis-Stamm Q8 wurde mit Sau3A I (0,1 Units/30 μg DNA) bei 37°C während 30 Minuten verdaut und auf einem 0,6%igen Agarosegel mit niedrigem Schmelzpunkt nach der Größe aufgetrennt. DNA-Fragmente von 15-23 kb wurden herausgeschnitten, und die DNA wurde 25 Minuten lang in Dialyseschlauch, welcher TAE (40 mM Tris-Acetat pH 8,5, 2 mM EDTA) enthielt, bei 150 V elektroeluiert. Die DNA wurde einmal mit Phenol/Chloroform (1:1) extrahiert, gefällt und in Wasser resuspendiert. Die DNA wurde über Nacht mit EMBL3-BamH I-Armen (Promega) ligiert, und die Ligationsmischung wurde unter Verwendung des Lambda-in vitro-Verpackungs-Kits (Stratagene) verpackt und auf E. coli-LE392-Zellen ausplattiert. Die Bibliothek wurde titriert und bei 4°C in Gegenwart von 0,3% Chloroform aufbewahrt.
Beispiel 4
Dieses Beispiel veranschaulicht das Screening der M. catarrhalis-Bibliotheken.
Zehn-μl-Aliquots der Phagen-Stammlösung aus der in Beispiel 3 obenstehend hergestellten EMBL3/4223-Probe wurden jeweils mit 100 μl E. coli-Stamm LE392 in 10 mM MgSO₄ (OD₂₆₀ = 0,5) (Ausplattierungs-Zellen) vereinigt und 15 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden mit jeweils 3 ml BBL-Top-Agarose gemischt, und die Mischungen wurden auf 1,5% Agarose-Platten gegossen, welche 1% Bacto-Trypton – 0,5% Bacto-Hefeextrakt – 0,05% NaCl (LB-Agarose; Difco) enthielten und mit 200 μM EDDA supplementiert worden waren. Die Platten wurden bei 37°C 18 Stunden lang inkubiert. Plaques wurden auf Nitrozellulose-Filtern (Amersham Hybond-C Extra) unter Verwendung eines Standard-Protokolls abgehoben, und die Filter wurden in 5%igem Rinderserumalbumin (BSA; Boehringer) in 20 mM Tris-HCl (pH 7,5) – 150 mM NaCl (TBS) 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, oder bei 4°C über Nacht, eingetaucht. Die Filter wurden mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur oder 18 Stunden bei 4°C in TBS inkubiert, welches eine 1/1000-Verdünnung von Meerschweinchen-Anti-M. catarrhalis 4223-Tbp1-Antiserum enthielt. Im Anschluss an vier aufeinanderfolgende 10-Minuten-Waschungen in TBS mit 0,05% Tween 20 (TBS-Tween) wurden die Filter 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in TBS-Tween inkubiert, welches eine 1/4000-Verdünnung von rekombinantem Protein G enthielt, welches mit Meerrettichperoxidase markiert war (rProtein G-HRP; Zymed). Die Filter wurden wie oben gewaschen und in CN/DAB-Substratlösung (Pierce) eingetaucht. Die Farbentwicklung wurde durch Untertauchen der Filter in Wasser angehalten. Positive Plaques wurden aus den Platten ausgestanzt, und jeweils in 0,5 ml SM-Puffer, welcher einige Tropfen Chloroform enthielt, eingebracht. Das Screening-Vorgehen wurde zwei weitere Male wiederholt, bis 100% der abgehobenen Plaques unter Verwendung des Meerschweinchen-Anti-M. catarrhalis 4223-Tbp1-Antiserums positiv waren.
Die EMBL3/Q8-Bibliothek wurde auf LE392-Zellen auf YT-Platten unter Verwendung von 0,7% Top-Agar in YT als Überschichtung ausplattiert. Die Plaques wurden auf Nitrozellulose-Filtern abgehoben, und die Filter wurden mit Oligonukleotidsonden, die mit ³²Pα-dCTP markiert waren ("Random Primed"-DNA-Markierungskit, Boehringer Mannheim), sondiert. Die Vorhybridisierung wurde in Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC)-Puffer (Ref. 27) bei 37°C während 1 Stunde durchgeführt, und die Hybridisierung wurde bei 42°C über Nacht durchgeführt. Die Sonden basierten auf einer internen Sequenz von 4223-tbpA:
IRDLTRYDPG

(SEQ ID Nr: 31) 4236-RD 5' ATTCGAGACTTAACACGCTATGACCCTGGC 3'
(SEQ ID Nr: 32) 4237-RD 5' ATTCGTGATTTAACTCGCTATGACCCTGGT 3'
(SEQ ID Nr: 33).

Vermutliche Plaques wurden erneut ausplattiert und zweiten und dritten Screening-Runden unter Anwendung der gleichen Vorgehensweisen unterzogen.
Der Phagenklon SLRD-A wurde verwendet, um die tfr-Gene für eine Sequenzanalyse zu subklonieren.
Beispiel 5
Dieses Beispiel veranschaulicht die Immunoblot-Analyse der Phagenlysate unter Verwendung von Anti-M. catarrhalis 4223-Tbp1- und -Tbp2-Antiseren.
Durch die in Beispiel 4 obenstehend selektierten Phagen-Eluate exprimierte Proteine wurden wie folgend gefällt. 60 μl jedes Phagen-Eluats wurden mit 200 μl E. coli-LE392-Plattierungszellen vereinigt und bei 37°C 15 Minuten lang inkubiert. Die Mischung wurde in 10 ml 1,0% NZamine A – 0,5% NaCl – 0,1% Casaminosäuren – 0,5% Hefeextrakt – 0,2% Magnesiumsulfatheptahydrat (NZCYM-Nährmedium), welches mit 200 mM EDDA supplementiert war, inokuliert und bei 37°C während 18 Stunden unter Schütteln herangezogen. DNAse wurde zu 1,0 ml der Kultur zu einer Endkonzentration von 50 μg/ml zugegeben, und die Probe wurde bei 37°C während 30 Minuten inkubiert. Trichloressigsäure wurde zu einer Endkonzentration von 12,5% zugesetzt, und die Mischung wurde 15 Minuten lang auf Eis stehen gelassen. Proteine wurden durch 10 Minuten lange Zentrifugation bei 13 000 × g pellettiert, und das Pellet wurde mit 1,0 ml Aceton gewaschen. Das Pellet wurde an der Luft getrocknet und in 50 μl 4% SDS – 20 mM Tris-HCl (pH 8,0) – 0,2 mM EDTA (Lyse-Puffer) resuspendiert.
Im Anschluss an eine SDS-PAGE-Elektrophorese durch ein 11,5%iges Gel wurden die Proteine auf Immobilon-P-Filter (Millipore) bei einer konstanten Spannung von 20 V während 18 Stunden, in 25 mM Tris-HCl, 220 mM Glycin – 20% Methanol (Transferpuffer), transferiert. Die Membranen wurden in 5% BSA in TBS während 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Die Blots wurden entweder an Meerschweinchen-Anti-M. catarrhalis 4223-Tbp1- oder an Meerschweinchen-Anti-M. catarrhalis 4223-Tbp2-Antiserum, welches 1/500 in TBS-Tween verdünnt war, 2 Stunden lang bei Raumtemperatur ausgesetzt. Im Anschluss an drei aufeinanderfolgende 10-minütige Waschungen in TBS-Tween wurden die Membranen 30 Minuten lang in TBS-Tween, welches eine 1/4000-Verdünnung von rProtein G-HRP enthielt, bei Raumtemperatur inkubiert. Die Membranen wurden wie oben beschrieben gewaschen und in CN/DAB-Substratlösung eingetaucht. Die Farbentwicklung wurde durch Eintauchen von Blots in Wasser angehalten.
Drei EMBL3-Phagenklone exprimierten sowohl ein 115 kDa großes Protein, welches mit Anti-Tbp1-Antiserum reagierte, als auch ein 80 kDa großes Protein, welches mit Anti-Tbp2-Antiserum auf Western-Blots reagierte, und von ihnen wurde daher gefolgert, Gene zu enthalten, welche die Transferrin-Rezeptorproteine von Moraxella catarrhalis codieren.
Beispiel 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die Subklonierung des M. catarrhalis 4223-Tbp1-Proteingens, tbpA.
Platten-Lysatkulturen des in Beispiel 5 beschriebenen rekombinanten Phagen wurden durch Vereinigen von Phageneluat und E. coli-LE392-Plattierungszellen zur Erzeugung einer konfluenten Lyse auf LB-Agarplatten hergestellt. Phagen-DNA wurde aus den Platten-Lysaten unter Verwendung eines "Wizard Lambda Preps"-DNA-Reinigungssystems (Promega) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.
Es wurde festgestellt, dass der EMBL3-Klon LM3-24 ein 13,2 kb großes Insert, flankiert von zwei SalI-Stellen, enthielt. Eine Sonde gegen ein tbpA-Gen wurde hergestellt und bestand aus einem 300 Basenpaare großen, amplifizierten Produkt, welches mittels PCR hergestellt wurde unter Verwendung von zwei degenerierten Oligonukleotid-Primern, entsprechend einer Aminosäuresequenz eines Teils des Tbp1-Proteins (1). Die Primersequenzen basierten auf den Aminosäuresequenzen NEVTGLG (SEQ ID Nr: 17) und GAINEIE (SEQ ID Nr: 18), welche festgestelltermaßen unter den abgeleiteten Aminosäuresequenzen aus mehreren unterschiedlichen N. meningitidis- und Haemophilus influenzae-tbpA-Genen konserviert sind. Das amplifizierte Produkt wurde in pCRII (Invitrogen, San Diego, CA) kloniert und sequenziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz hatte Homologie mit anderen vermeintlichen Aminosäuresequenzen gemeinsam, welche aus N. meningitidis- und H. influenzae-tbpA-Genen abgeleitet werden (12). Der Subklon wurde mit NotI (New England Biolabs) linearisiert und unter Verwendung eines Digoxigenin-Zufallsmarkierungs-Kits (Boehringer Mannheim) gemäß den Anweisungen des Herstellers markiert. Die Konzentration der Sonde belief sich schätzungsweise auf 2 ng/μl.
DNA aus dem Phagenklon wurde mit HindIII, AvrII, SalI/SphI oder SalI/AvrII verdaut und durch ein 0,8%iges Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt. DNA wurde auf eine Nylonmembran (Genescreen Plus, Dupont) unter Verwendung eines LKB-VacuGene XL-Vakuumtransfer-Gerätes (Pharmacia) überführt. Im Anschluss an den Transfer wurde der Blot an der Luft getrocknet und in 5×SSC – 0,1% N-Lauroylsarcosin – 0,02% Natriumdodecylsulfat – 1,0% Blockierungsreagenz (Boehringer Mannheim) in 10 mM Maleinsäure – 15 mM NaCl (pH 7,5) (Vorhybridisierungs-Lösung) vorhybridisiert. Markierte Sonde wurde zu der Vorhybridisierungslösung zu einer Endkonzentration von 6 ng/ml zugegeben, und der Blot wurde in der Sondenlösung 18 Stunden lang bei 42°C inkubiert. Der Blot wurde zweimal in 2×SSC – 0,1% SDS jeweils 5 Minuten lang beim Raumtemperatur, und dann zweimal in 0,1×SSC – 0,1% SDS jeweils 15 Minuten lang bei 60°C gewaschen. Im Anschluss an die Waschungen wurde die Membran in 100 mM Maleinsäure – 150 mM NaCl (pH 7,5) (Puffer 1) eine Minute lang äquilibriert, und dann 60 Minuten lang bei Raumtemperatur in 1,0% Blockierungs-Reagenz (Boehringer Mannheim) in Puffer 1 (Puffer 2) belassen. Der Blot wurde an Anti-DIG-Alkalische-Phosphatase (Boehringer Mannheim), welcher 1/5000 in Puffer 2 verdünnt war, bei Raumtemperatur 30 Minuten lang ausgesetzt. Im Anschluss an zwei 15-minütige Waschungen in Puffer 1 wurde der Blot in 100 mM Tris-HCl (pH 9,5), 100 mM NaCl, 50 mM MgCl₂ (Puffer 3) 2 Minuten lang äquilibriert. Der Blot wurde mit Lumigen-PPD-Substrat (Boehringer-Mannheim), welches 1/100 in Puffer 3 verdünnt worden war, angefeuchtet bzw. benetzt, dann in Saran-Einwickelfolie eingewickelt und 30 Minuten lang an Röntgenfilm exponiert. Die Sonde hybridisierte an ein 3,8 kb großes HindIII-HindIII-, ein 2,0 kb großes AvrII-AvrII- und ein 4,2 kb großes SalI-SphI-Fragment.
Um das 3,8 kb große HindIII-HindIII-Fragment in pACYC177 zu subklonieren, wurden Phagen-DNA aus dem EMBL3-Klon und Plasmid-DNA aus dem Vektor pACYC177 (New England Biolabs) mit HindIII verdaut und durch Elektrophorese auf einem 0,8%igen Agarosegel fraktioniert. Das 3,8 kb große HindIII-HindIII-Phagen-DNA-Fragment und das 3,9 kb große HindIII-HindIII-pACYC177-Fragment wurden aus dem Gel herausgeschnitten und unter Verwendung eines Geneclean-Kits (Bio 101 Inc., LaJolla, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt. Gereinigtes Insert und Vektor wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) zusammenligiert und in E. coli HB101 (Gibco BRL) transformiert. Ein Qiagen-Plasmid-Midi-Kit (Qiagen) wurde verwendet, um DNA von Sequenzierungsqualität aus einer der Ampicillin-resistenten/Kanamycin-empfindlichen Transformanten zu extrahieren und zu reinigen, von welcher festgestellt wurde, ein 3,8 kb großes HindIII-HindIII-Insert zu tragen. Der Subklon wurde pLEM3 genannt. Wie beschrieben im nachstehenden Beispiel 7 zeigte die anschließende Sequenzierung, dass pLEM3 die ersten ungefähr 2,0 kb der tbpA-Sequenz enthielt (2 und 5).
Um die verbleibenden 1 kb des tbpA-Gens zu subklonieren, wurde ein 1,6 kb großes HindIII-HindIII-Fragment in pACYC177, wie oben beschrieben, subkloniert und durch Elektroporation in E. coli HB101 (Gibco BRL) transformiert. Ein Midi-Plasmid-DNA-Kit (Qiagen) wurde verwendet, um Plasmid-DNA aus einer vermeintlichen Kanamycinempfindlichen Transformante, welche ein Plasmid mit einem 1,6 kb großen HindIII-HindIII-Insert trug, zu extrahieren. Der Subklon wurde pLEM25 genannt. Wie beschrieben im nachstehenden Beispiel 7, enthüllte die Sequenzierung, dass pLEM25 die restlichen 1 kb des tbpA-Gens enthielt (2 und 5).
Beispiel 7
Dieses Beispiel veranschaulicht die Subklonierung des tbpB-Gens von M. catarrhalis 4223.
Wie oben beschrieben, sind in allen Spezies von Neisseriae und Haemophilus, welche vor der vorliegenden Erfindung untersucht worden sind, tbpB-Gene unmittelbar stromaufwärts der tbpA-Gene gefunden worden, welche Homologie mit dem tbpA-Gen von M. catarrhalis 4223 gemeinsam haben. Allerdings entsprach die Stromaufwärts-Sequenz von M. catarrhalis 4223 nicht den anderen tbpB-codierenden Sequenzen.
Um das tbpB-Gen innerhalb des EMBL3-Phagenklons zu lokalisieren, wurde ein Southern-Blot unter Verwendung einer degenerierten Sonde aus einer hochkonservierten Aminosäure-Region innerhalb des Tbp2-Proteins durchgeführt. Eine degenerierte Oligonukleotidsonde wurde entsprechend der Sequenz entworfen, die EGGFYGP codiert (SEQ ID Nr: 30), welche innerhalb des Tbp2-Proteins in einer Vielzahl von Neisseriae- und Haemophilus-Spezies konserviert ist. Die Sonde wurde mit Digoxigenin unter Verwendung eines Oligonukleotid-"Tailing"-Kits (Boehringer Mannheim) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers markiert. Mit HindIII verdaute EMBL3-Klon-DNA wurde durch ein 0,8%iges Agarosegel fraktioniert und auf eine "Geneclean Plus"-Nylonmembran überführt, wie es in Beispiel 6 beschrieben wird. Im Anschluss an eine Hybridisierung, wie oben beschrieben, wurde die Membran zweimal in 2×SSC – 0,1% SDS jeweils 5 Minuten lang bei Raumtemperatur, und dann zweimal jeweils 15 Minuten lang in 0,1×SSC – 0,1% SDS bei 50°C gewaschen. Der Nachweis der markierten Sonde wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Sonde hybridisierte an ein 5,5 kb großes NheI-SalI-Fragment.
Das 5,5 kb große NheI-SalI-Fragment wurde wie folgend in pBR328 subkloniert. LEM3-24-DNA und pBR328-DNA wurden mit NheI-SalI verdaut und durch 0,8%ige Agarose elektrophoretisch behandelt. Das 5,5 kb große NheI-SalI-Fragment und die 4,9 kb großen pBR328-NheI-SalI-Fragmente wurden aus dem Gel herausgeschnitten und unter Verwendung eines Geneclean-Kits wie in Beispiel 6 beschrieben, gereinigt. Die Fragmente wurden unter Verwendung von T4-DNA-Ligase zusammen-ligiert und in E. coli DH5 transformiert. Ein Midi-Plasmid-DNA-Kit (Qiagen) wurde verwendet, um DNA aus einem Ampicillin-resistenten/Tetracyclin-empfindlichen Klon zu extrahieren, welche ein 5,5 kb großes NheI-SalI-Insert enthielt. Dieser Subklon wurde als pLEM23 bezeichnet. Eine Sequenzierung ergab, dass pLEM23 2 kb des tbpB-Gens aus M. catarrhalis 4223 enthielt (2).
Beispiel 8
Dieses Beispiel veranschaulicht die Subklonierung von M. catarrhalis Q8-tfr-Genen.
Die M. catarrhalis Q8-tfr-Gene wurden wie folgend subkloniert. Phagen-DNA wurde von Platten hergestellt. Kurz gesagt, wurde die Top-Agaroseschicht von drei konfluenten Platten in 9 ml SM-Puffer (0,1 M NaCl, 0,2% MgSO₄, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 0,01% Gelatine) abgeschabt, und 100 μl Chloroform wurden zugesetzt. Die Mischung wurde 10 Sekunden lang verwirbelt bzw. auf dem Vortex gemischt und dann 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation bei 8000 U/min während 15 Minuten bei 4°C in einem SS34-Rotor (Sorvall Modell RC5C) entfernt. Der Phage wurde durch Zentrifugation bei 35 000 U/min in einem 70.1 Ti-Rotor bei 10°C während 2 Stunden (Beckman Modell L8-80) pellettiert und wurde in 500 μl SM-Puffer resuspendiert. Die Probe wurde bei 4°C über Nacht inkubiert, und dann wurden RNAse und DNAse zu Endkonzentrationen von 40 μg/ml bzw. 10 μg/ml zugegeben, und die Mischung wurde bei 37°C während 1 Stunde inkubiert. Zu der Mischung wurden 10 μl 0,5 M EDTA und 5 μl 10% SDS zugegeben, und die Probe wurde bei 6°C während 15 Minuten inkubiert. Die Mischung wurde zweimal mit Phenol/Chloroform (1:1) und zweimal mit Chloroform extrahiert, und die DNA wurde durch die Zugabe von 2,5 Volumina absolutem Ethanol gefällt.
Eine partielle Restriktionskarte wurde erstellt, und Fragmente wurden unter Verwendung der externen SalI-Stellen von EMBL3 und der internen AvrII- oder EcoR I-Stellen, wie gezeigt in 4, subkloniert. Um die Subklonierung zu erleichtern, wurde das Plasmid pSKMA konstruiert, das eine neue Mehrfachklonierungsstelle in pBluescript.SK (Stratagene) einführt. Oligonukleotide wurden verwendet, um Restriktionsstellen für Mst II, Sfi I und Avr II zwischen den Sal I- und Hind III-Stellen von pBluescript.SK einzuführen:
Das Plasmid pSLRD1 enthält ein ~1,5 kb großes Sal I-Avr II-Fragment, welches in pSKMA kloniert ist; die Plasmide pSLRD2 und pSLRD4 enthalten ~2 kb bzw. 4 kb große AvrII-AvrII-Fragmente, welche in pSKMA kloniert sind, und enthalten das vollständige tbpA-Gen. Das Plasmid pSLRD3 enthält ein ~2,3 kb großes AvrII-EcoR I-Fragment, welches in pSKMA kloniert ist, und das Plasmid SLRD5 ist ein 22,7 kb großes EcoRI-EcoRI-Fragment, das in pSKMA kloniert ist. Diese zwei Klone enthalten das vollständige tbpB-Gen (7).
Beispiel 9
Dieses Beispiel veranschaulicht die Sequenzierung der M. catarrhalis-tbp-Gene.
Beide Stränge der gemäß den Beispielen 6 bis 8 subklonierten tbp-Gene wurden unter Verwendung eines Applied Biosystems-DNA-Sequenzierers sequenziert. Die Sequenzen der tbpA-Gene von M. catarrhalis 4223 und Q8 sind in den 5 bzw. 10 gezeigt. Eine abgeleitete Aminosäuresequenz wurde mit anderen Tbp1-Aminosäuresequenzen verglichen, einschließlich denjenigen von Neisseriae meningitidis, Neisseriae gonorrhoeae und Haemophilus influenzae (12). Die Sequenz der tbpB-Gene von M. catarrhalis 4223 und Q8 sind in den 6 bzw. 11 gezeigt. Um die Sequenz vom vermutlichen Beginn des tbpB-Gens von M. catarrhalis 4223 zu erhalten, wurden Sequenzdaten direkt von der DNA des Klons LEM3-24 erhalten. Diese Sequenz wurde durch Screening des Klons DS-1754-1 bestätigt. Die Sequenz der translatierten tbpB-Gene aus M. catarrhalis 4223 und Q8 hatten eine Homologie mit abgeleiteten Tbp2-Aminosäuresequenzen von Neisseriae meningitidis, Neisseriae gonorrhoeae und Haemophilus influenzae gemeinsam (13).
Beispiel 10
Dieses Beispiel veranschaulicht die Erzeugung eines Expressionsvektors, um rekombinantes Tbp1-Protein herzustellen. Das Konstruktionsschema ist in der 14 gezeigt.
Plasmid-DNA aus dem Subklon pLEM3, der wie beschrieben in Beispiel 6 hergestellt worden war, wurde mit HindIII und BglI verdaut, um ein 1,84 kb großes BglI-HindIII-Fragment, das ungefähr zwei Drittel des tbpA-Gens enthielt, zu erzeugen. BamHI wurde dem Verdau zugesetzt, um ein co-migrierendes 1,89 kb großes BglI-HindIII-Vektorfragment zu eliminieren. Darüber hinaus wurde Plasmid-DNA aus dem Vektor pT7-7 mit NdeI und HindIII verdaut. Um den Anfang des tbpA-Gens zu erzeugen, wurde ein Oligonukleotid synthetisiert, basierend auf den ersten 61 Basen des tbpA-Gens bis zur BglI-Stelle; eine NdeI-Stelle wurde in das 5'-Ende eingebaut. Gereinigtes Insert, Vektor und Oligonukleotid wurden unter Verwendung von T4-Ligase (New England Biolabs) zusammen ligiert und in E. coli DH5α transformiert. DNA wurde aus einer der 4,4 kb großen Ampicillin-resistenten Transformanten gereinigt, welche die korrekten Restriktionsstellen enthielt (pLEM27).
Gereinigte pLEM27-DNA wurde mit HindIII verdaut, an das 1,6 kb große HindIII-HindIII-Insert-Fragment von pLEM25, das wie in Beispiel 6 beschrieben hergestellt worden war, ligiert und in E. coli DH5α transformiert. DNA wurde aus einer Ampicillinresistenten Transformante gereinigt, welche die korrekten Restriktionsstellen enthielt (pLEM29), und wurde durch Elektroporation in BL21(DE3) (Novagen; Madison, WI) transformiert, um E. coli pLEM29B-1 herzustellen.
Eine einzelne isolierte transformierte Kolonie wurde verwendet, um 100 ml YT-Nährmedium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, anzuimpfen, und die Kultur wurde bei 37°C über Nacht unter Schütteln bei 200 U/min wachsen gelassen. 200 μl der Übernachtkultur wurden in 10 ml YT-Nährbrühe, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, angeimpft, und die Kultur wurde bei 37°C bis zu einer OD₅₇₈ von 0,35 wachsen gelassen. Die Kultur wurde durch die Zugabe von 30 μl 100 mM IPTG induziert, und die Kultur wurde bei 37°C weitere 3 Stunden lang wachsen gelassen. Ein ml Kultur wurde zur Zeit der Induktion (t = 0) und bei t = 1 Stunde und t = 3 Stunden entnommen. Ein-ml-Proben wurden mittels Zentrifugation pellettiert und in 4% SDS – 20 mM Tris.Cl, pH 8 – 200 μM EDTA (Lyse-Puffer) resuspendiert. Die Proben wurden auf einem 11,5%igen SDS-PAGE-Gel fraktioniert und auf Immobilon-Filter (Amersham) überführt. Die Blots wurden unter Verwendung von Anti-Tbp1 (M. catarrhalis 4223)-Antiserum, das 1:1000 verdünnt war, als dem primären Antikörper, und von rProteinG, das mit Meerrettichperoxidase konjugiert war (Zymed), als dem sekundären Antikörper, entwickelt. Ein chemolumineszentes Substrat (Lumiglo; Kirkegaard and Perry Laborstories, Gaithersburg, MD) wurde für den Nachweis verwendet. Induzierte rekombinante Proteine waren auf den Coomassie-gefärbten Gelen sichtbar (15). Das Anti-Tbp1(4223)-Antiserum erkannte die rekombinanten Proteine auf Western-Blots.
Beispiel 11
Dieses Beispiel veranschaulicht die Extraktion und Reinigung von rekombinantem Tbp1 von M. catarrhalis 4223.
Rekombinantes Tbp1-Protein, welches in Einschlusskörpern enthalten ist, wurde aus E. coli-Zeilen, die das tbpA-Gen exprimierten (Beispiel 10), durch ein Verfahren aufgereinigt, wie es in der 16 gezeigt ist. E. coli-Zellen aus einer 500-ml-Kultur, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 10, wurden in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, welches 0,1 M NaCl und 5 mM AEBSF (Protease-Inhibitor) enthielt, resuspendiert und durch Schallbehandlung (3 × 10 min. 70% Intensitäts-Zyklus) aufgeschlossen. Der Extrakt wurde 30 Minuten lang bei 20000 × g zentrifugiert, und der resultierende Überstand, welcher > 85% der löslichen Proteine aus E. coli enthielt, wurde verworfen.
Das verbleibende Pellet (16, PPT,) wurde ferner in 50 ml 50 mM Tris, pH 8,0, welches 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA enthielt, extrahiert. Nach Zentrifugation bei 20000 × g während 30 Minuten wurde der Überstand, welcher restliche lösliche Proteine und den Großteil der Membranproteine enthielt, verworfen.
Das verbleibende Pellet (16, PPT₂) wurde weiter in 50 ml 50 mM Tris, pH 8,0, welcher 2 M Harnstoff und 5 mM Dithiothreitol (DTT) enthielt, extrahiert. Nach Zentrifugation bei 20000 × g während 30 Minuten enthielt das resultierende Pellet (16, PPT₃), das nach der oben genannten Extraktion erhalten wurde, die gereinigten Einschlusskörper.
Das Tbp1-Protein wurde aus PPT3 in 50 mM Tris, pH 8,0, welcher 6 M Guanidinhydrochlorid und 5 mM DTT enthielt, solubilisiert. Nach der Zentrifugation wurde der resultierende Überstand weiter auf einer Superdex 200-Gelfiltrationssäule gereinigt, die in 50 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 2 M Guanidinhydrochlorid und 5 mM DTT, äquilibriert worden war. Die Fraktionen wurden durch SDS-Page analysiert, und diejenigen, welche gereinigtes Tbp1 enthielten, wurden vereinigt. Triton X-100 wurde zu der vereinigten Tpb1-Fraktion zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben. Die Fraktion wurde dann über Nacht bei 4°C gegen 50 mM Tris, pH 8,0, dialysiert und dann bei 20000 × g während 30 Minuten zentrifugiert. Das Protein blieb unter diesen Bedingungen löslich, und das gereinigte Tbp1 wurde bei –20°C aufbewahrt. Das in der 16 gezeigte Reinigungsvorgehen stellte Tbp1-Protein her, welches eine Reinheit von mindestens 70% besaß, wie man durch SDS-PAGE-Analyse bestimmte (17).
Beispiel 12
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion eines Expressionsplasmids für rTbp2 von M. catarrhalis 4223 ohne Leader-Sequenz.
Das Konstruktionsschema für das rTbp2 exprimierende Plasmid ist in der 18 gezeigt. Oligonukleotide wurden verwendet, um die ersten ungefähr 58 bp des M. catarrhalis 4223-tbpB-Gens, welches das reife Protein codiert, zu konstruieren. Eine NdeI-Stelle wurde in das 5'-Ende der Oligonukleotide eingebaut:
Ein NheI-ClaI-Fragment, welches ungefähr 1 kb des tbpB-Gens aus pLEM23 enthielt, der wie in Beispiel 7 beschrieben hergestellt worden war, wurde an die oben genannten Oligonukleotide ligiert und in pT7-7 inseriert, welcher mit NdeI-ClaI geschnitten worden war, wobei pLEM31 erzeugt wurde, welcher somit die 5'-Hälfte von tbpB enthält. Oligonukleotide wurden ebenfalls verwendet, um die letzten ungefähr 104 bp des tbpB-Gens zu konstruieren, von der AvaII-Stelle bis zum Ende des Gens. Eine BamHI-Stelle wurde in das 3'-Ende der Oligonukleotide eingebaut:
Ein ClaI-AvaII-Fragment aus pLEM23, das ungefähr 0,9 kb des 3'-Endes des tbpB-Gens enthielt, wurde an die AvaII-BamHI-Oligonukleotide ligiert, und es erfolgte eine Insertion in pT7-7, welcher mit ClaI-BamHI geschnitten worden war, wodurch man pLEM32 erzeugte. Das 1,0 kb große NdeI-ClaI-Insert aus pLEM31 und das 1,0 kb große ClaI-BamHI-Insert aus pLEM32 wurden dann in pT7-7, welcher mit NdeI-BamHI geschnitten worden war, inseriert, wodurch pLEM33 erzeugt wurde, welcher ein Volllängen-tbpB-Gen unter der Steuerung des T7-Promotors aufweist.
DNA wurde aus pLEM33 gereinigt und mittels Elektroporation in elektrokompetente BL21(DE3)-Zellen (Novagen; Madison, WI) transformiert, wodurch der Stamm pLEM33B-1 erzeugt wurde. Der Stamm pLEM33B-1 wurde wachsen gelassen und unter Verwendung von IPTG induziert, wie es oben in Beispiel 10 beschrieben wurde. Exprimierte Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf für Immunoblotting geeignete Membranen überführt. Die Blots wurden unter Verwendung von Anti-4223- Tbp2-Antiserum, welches 1:4000 verdünnt worden war, als dem primären Antikörper, und rProtein G, das mit Meerettichperoxidase konjugiert war (Zymed), als dem sekundären Antikörper, entwickelt. Ein chemolumineszentes Substrat (Lumiglo; Kirkegaard and Perry Laborstories, Gaithersburg, MD) wurde für den Nachweis verwendet. Induzierte rekombinante Proteine waren auf den mit Coomassie-Blau gefärbten Gelen sichtbar (19). Das Anti-4223-Tbp2-Antiserum erkannte die rekombinanten Proteine auf Western-Blots.
Beispiel 13
Dieses Beispiel veranschaulicht die Erzeugung eines Expressionspiasmids für rTbp2 von M. catarrhalis 4223 mit einer Leader-Sequenz.
Das Konstruktionsschema ist in 18 gezeigt. Oligonukleotide, welche die natürliche Leader-Sequenz des M. catarrhalis 4223-tbpB-Gens enthielten, wurden verwendet, um die ersten ungefähr 115 bp des tbpB-Gens bis zur NheI-Stelle zu konstruieren. Eine NdeI-Stelle wurde in das 5'-Ende der Oligonukleotide eingebaut:
Die NdeI-NheI-Oligonukleotide wurden an mit NdeI-NheI geschnittenen pLEM33 ligiert, wodurch pLEM37 erzeugt wurde, welcher somit ein Volllängen-4223-tbpB-Gen, welches das Tbp2-Protein mit seiner Leader-Sequenz codiert, angetrieben von dem T7-Promotor, enthält.
DNA aus pLEM37 wurde gereinigt und durch Elektroporation in elektrokompetente BL21(DE3)-Zellen (Novagen; Madison, WI) transformiert, um den Stamm pLEM37B-2 zu erzeugen. pLEM37B-2 wurde wachsen gelassen und unter Verwendung von IPTG induziert, wie es oben in Beispiel 10 beschrieben wurde. Exprimierte Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf für Immunoblotting geeignete Membranen überführt. Blots wurden unter Verwendung von Anti-4223-Tbp2-Antiserum, welches 1:4000 verdünnt war, als dem primären Antikörper, und rProtein G, welches mit Meerrettichperoxidase konjugiert war (Zymed), als dem sekundären Antikörper, entwickelt. Ein chemolumineszentes Substrat (Lumiglo; Kirkegaard und Perry Laborstories, Gaithersburg, MD) wurde für den Nachweis verwendet. Induzierte rekombinante Proteine waren auf mit Coomassie-Blau gefärbten Gelen sichtbar (21). Das Anti-4223-Tbp2-Antiserum erkannte die rekombinanten Proteine auf Western-Blots.
Beispiel 14
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion eines Expressionsplasmids für rTbp2 von M. catarrhalis Q8 ohne Leader-Sequenz.
Das Konstruktionsschema für rTbp2 ist in der 20 gezeigt. Das 5'-Ende des tbpB-Gens von M. catarrhalis Q8 wurde mittels PCR von dem Cys¹-Codon des reifen Proteins durch die bzw. bis zur Bsm I-Restriktionsstelle amplifiziert. Eine Nde I-Restriktionsstelle wurde am 5'-Ende für die spätere Klonierung in pT7-7 eingeführt, und das letztendliche PCR-Fragment wies eine Länge von 238 bp auf. Die PCR-Primer sind nachstehend angegeben:
Das Q8-tbpB-Gen wurde in zwei Fragmenten, welche auf den Plasmiden SLRD3 und SLRD5 enthalten waren, die wie in Beispiel 8 beschrieben hergestellt wurden, subkloniert. Das Plasmid SLRD3-5 wurde zum Erhalten des Volllängen-tbpB-Gens konstruiert durch Verdauen von SLRD5 mit EcoR I und Dra I, was das 3'-Ende von tbpB freigibt, und Insertion dieses ~619 bp großen Fragmentes in SLRD3, welcher mit EcoR I und Sma I verdaut worden war. Das 1,85 kb große Bsm I-BamH I-Fragment aus SLRD3-5 wurde mit dem 238 bp großen PCR-Fragment ligiert und in pT7-7 inseriert, welcher mit Nde I und BamH I verdaut worden war, wodurch das Plasmid SLRD35B erzeugt wurde. Dieses Plasmid enthält somit das Volllängen-tbpB-Gen ohne seine Leader-Sequenz unter der Steuerung des T7-Promotors. DNA aus SLRD35B wurde gereinigt und durch Elektroporation in elektrokompetente BL21(DE3)-Zellen transformiert, wodurch der Stamm SLRD35BD erzeugt wurde, welcher wachsen gelassen und unter Verwendung von IPTG, wie oben in Beispiel 10 beschrieben, induziert wurde. Exprimierte Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgelöst, und das induzierte Tbp2-Protein war durch Coomassie-Blau-Färbung deutlich sichtbar (19).
Beispiel 15
Dieses Beispiel veranschaulicht die Erzeugung eines Expressionsplasmids für rTbp2 von M. catarrhalis Q8 mit einer Leader-Sequenz.
Das Konstruktionsschema für das rTbp2 ist in der 20 gezeigt. Das 5'-Ende des Q8-tbpB-Gens wurde vom ATG-Startcodon bis zur Bsm I-Restriktionsstelle mittels PCR amplifiziert. Eine Nde I-Stelle wurde am 5'-Ende eingebaut, um die Klonierung in den pT7-7-Expressionsvektor zu erleichtern, und das letztendliche PCR-Fragment war 295 bp lang. Die PCR-Primer sind nachstehend angegeben:
SLRD3-5 (Beispiel 14) wurde mit Bsm I und BamH I verdaut, wodurch ein 1,85 kb großes Fragment erzeugt wurde, welches mit dem 295 bp großen PCR-Fragment ligiert und in pT7-7, welcher mit Nde I und BamH I verdaut worden war, ligiert wurde. Das resultierende Plasmid SLRD35A enthält daher das Volllängen-Q8-tbpB-Gen mit seiner endogenen Leader-Sequenz unter der Steuerung des T7-Promotors. DNA aus SLRD35A wurde gereinigt und durch Elektroporation in elektrokompetente BL21(DE3)-Zellen transformiert, um den Stamm SLRD35AD zu erzeugen, welcher wachsen gelassen und unter Verwendung von IPTG, wie oben im Beispiel 10 beschrieben, in duziert wurde. Exprimierte Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, und das induzierte Tbp2-Protein war mittels Coomassie-Blau-Färbung deutlich sichtbar (19).
Beispiel 16
Dieses Beispiel veranschaulicht die Extraktion und Reinigung von rTbp2 von M. catarrhalis 4223 und Q8 aus E. coli.
pLEM37B (4223)- und SLRD35AD (Q8)-Transformanten wurden wachsen gelassen, um Tbp2 in Einschlusskörpern herzustellen, und dann wurde das Tbp2 gemäß des Schemas in 22 gereinigt. E. coli-Zellen aus einer 500-ml-Kultur wurden in 50 ml 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, der 5 mM AEBSF (Protease-Inhibitor) enthielt, resuspendiert und durch Schallbehandlung (3 × 10 min, 70% Intensitäts-Zyklus) aufgeschlossen. Der Extrakt wurde bei 20000 × g während 30 Minuten zentrifugiert, und der resultierende Überstand, der >95% der löslichen Proteine aus E. coli enthielt, wurde verworfen.
Das verbleibende Pellet (PPT,) wurde ferner in 50 ml 50 mM Tris, pH 8,0, mit 0,5% Triton X-100 und 10 mM EDTA, extrahiert. Die Mischung wurde bei 4°C mindestens 2 Stunden lang gerührt und dann bei 20000 × g während 30 Minuten gerührt, und der Überstand, der restliche lösliche Proteine und den Großteil der Membranproteine enthielt, wurde verworfen.
Das resultierende Pellet (PPT₂), welches nach der oben genannten Extraktion erhalten wurde, enthielt die Einschlusskörper. Das Tbp2-Protein wurde in 50 mM Tris, pH 8,0, enthaltend 6 M Guanidin und 5 mM DTT, solubilisiert. Nach der Zentrifugation wurde der resultierende Überstand weiter auf einer Superdex-200-Gelfiltrationssäule gereinigt, welche in 50 mM Tris, pH 8,0, welches zwei 2 M Guanidin und 5 mM DTT enthielt, äquilibriert worden war. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert, und diejenigen, welche gereinigtes Tbp2 enthielten, wurden vereinigt. Triton X-100 wurde zu der vereinigten Tbp2-Fraktion zu einer Endkonzentration von 0,1% zugegeben. Die Fraktion wurde dann über Nacht bei 4°C gegen PBS dialysiert und dann bei 20000 × g 30 Minuten lang zentrifugiert. Das Protein blieb unter diesen Bedingungen löslich, und das gereinigte Tbp2 wurde bei –20°C aufbewahrt. Die 22 zeigt die SDS-PAGE-Analyse von Fraktionen des Aufreinigungsverfahrens für rTbp2 aus Stamm 4223 (Tafel A) und Stamm Q8 (Tafel B). Das rTbp2 wies eine Reinheit von mindestens 70% auf.
Gruppen von fünf BALB/c-Mäusen erhielten eine dreimalige subkutane (s.c.) Injektion mit gereinigtem rTbp2 (0,3 mg bis 10 mg) aus den M. catarrhalis-Stämmen 4223 und Q8 in Gegenwart oder Abwesenheit von AlPO₄ (1,5 mg pro Dosis) an den Tagen 1, 29 und 43. Blutproben wurden an den Tagen 14, 28, 42 und 56 zum Analysieren der Anti-rTbp2-Antikörpertiter mittels EIAs entnommen.
Gruppen von zwei Kaninchen und zwei Meerschweinchen (Charles River, Quebec) wurden am Tag 1 mit einer 5-mg-Dosis von gereinigtem rTbp2-Protein, welches in Freund'schem vollständigen Adjuvans (CFA) emulgiert war, intramuskulär (i.m.) immunisiert. Die Tiere erhielten eine Auffrischdosis an den Tagen 14 und 29 mit der gleichen Dosis an Protein, welches in Freund'schem unvollständigen Adjuvans (IFA) emulgiert war. Blutproben wurden am Tag 42 zum Analysieren von Anti-rTbp2-Antikörpertitern und der bakteriziden Aktivität entnommen. Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die bakterizide Aktivität von gegen die rekombinanten Transferrin-Bindeproteine rTbp1 (4223), rTbp2 (4223) und rTbp2 (Q8) herangezogenen Antikörpern, die wie in diesen Beispielen beschrieben gegen die M. catarrhalis-Stämme 4223 und Q8 erzeugt wurden.
Beispiel 17
Dieses Beispiel veranschaulicht die Bindung von Tbp2 an humanes Transferrin in vitro.
Transferrin-Bindungsaktivität von Tbp2 wurde gemäß den Vorgehensweisen von Schryvers und Lee (Ref. 28) mit Modifikationen überprüft. Kurz gesagt, wurde gereinigtes rTbp2 einer diskontinuierlichen Elektrophorese durch 12,5%ige SDS-PAGE-Gele unterzogen. Die Proteine wurden elektrophoretisch auf PVDF-Membran überführt und mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem humanem Transferrin (HRP-Human-Transferrin, Verdünnung von 1:50) (Jackson ImmunoResearch Labs Inc., Mississauga, Ontario) bei 4°C über Nacht inkubiert. LumiGLO-Substrat (Kirkegaard & Perry Laborstories, Inc., Gaithersburg, MD) wurde für den chemolumineszenten Nachweis von HRP-Aktivität gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Sowohl 4223-rTbp2 als Q8-rTbp2 binden unter diesen Bedingungen an humanes Transferrin, wie es in der 24 gezeigt ist.
Beispiel 18
Dieses Beispiel veranschaulicht die antigenische Konservierung von Tbp2 unter M. catarrhalis-Stämmen.
Ganzzelllysate von M. catarrhalis-Stämmen und E. coli-Stämmen, welche rekombinante Tbp2-Proteine exprimieren, wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und elektrophhoretisch auf PVDF-Membran überführt. Anti-4223-rTbp2- oder Anti-Q8-rTbp2-Meerschweinchen-Antiseren wurden als erster Antikörper verwendet, und an alkalische Phosphatase konjugierter Ziege-Anti-Meerschweinchen-Antikörper wurde als zweiter Antikörper verwendet, um Tbp2 nachzuweisen. Die M. catarrhalis-Stämme 3, 56, 135, 585, 4223, 5191, 8185 und ATCC 25240 wurden getestet, und alle zeigten eine spezifische Reaktivität mit Anti-4223-rTbp2- oder Anti-Q8-rTbp2-Antikörper (25).
Die Tabelle 3 veranschaulicht die Fähigkeit von Anti-rTbp2-Antikörpern aus einem M. catarrhalis-Stamm, natives oder rekombinantes Protein aus einem homologen oder heterologen M. catarrhalis-Stamm zu erkennen.
Beispiel 19
Dieses Beispiel veranschaulicht die PCR-Amplifikation des tbpB-Gens aus dem M. catarrhalis-Stamm R1 und die Charakterisierung des amplifizierten R1-tbpB-Gens.
Chromosomale DNA aus dem M. catarrhalis-Stamm R1 wurde unter Anwendung von Standardtechniken hergestellt. Der Entwurf des Oligonukleotid-Sinn-Primers beruhte auf einer Region ungefähr 274 Basen stromaufwärts des M. catarrhalis-4223-tbpB-Gens, und der Antisinn-Primer beruhte auf einer Region ungefähr 11 Basen stromabwärts des Endes von 4223-tbpB. Es wurden die folgenden Primer verwendet:

Sinn-Primer (4940): 5' GATATAAGCACGCCCTACTT 3' (SEQ ID Nr: 48)
Antisinn-Primer (4967): 5' CCCATCAGCCAAACAAACATTGTGT 3' (SEQ ID Nr: 49)

Jedes Reaktionsröhrchen enthielt 10 mM Tris-HCl (pH 8,85), 25 mM KCl, 5 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 800 mM dNTPs, 1,0 mg jeweils Primer 4940 und 4967, 10 ng R1-DNA und 2,5 U Pwo-DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) in einem Gesamtvolumen von 100 μl. Der Thermozykler war programmiert für 5 min bei 95°C, gefolgt von 25 Zyklen von 95°C während 30 Sekunden, 50°C während 45 Sekunden und 72°C während 2 Minuten, und einer 10 Minuten langen End-Elongation bei 72°C. Das amplifizierte Produkt wurde unter Verwendung einer "Geneclean" (BIO 101) gemäß den Anweisungen des Herstellers gereinigt und sequenziert.

Eine partielle Restriktionskarte von tbpB von M. catarrhalis-Stamm R1, welche wie eben beschrieben hergestellt worden war, ist in der 26 gezeigt. Die Nukleotid- und abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen des PCR-amplifizierten R1-tbpB-Gens sind in der 27 gezeigt. Das R1-tbpB-Gen codiert ein 714 Aminosäuren großes Protein mit einem Molekulargewicht von 76,8 kDa. Die Leader-Sequenz des R1-Tbp2-Proteins ist identisch zu derjenigen der 4223- und Q8-Tbp2-Proteine. Als die abgeleitete R1-Tbp2-Sequenz mit der 4223-Tbp2-Sequenz aligniert wurde, wurde festgestellt, dass sie zu 83% identisch und 88% homolog war (28). Das konservierte Epitop LEGGFYG (SEQ ID Nr: 50) war vorhanden, wie es in Tbp2 aus anderen M. catarrhalis-Stämmen sowie den Tbp2-Proteinen von H. influenzae und N. meningitidis vorgefunden wird. TABELLE 1 BAKTERIZIDE ANTIKÖRPER-TITER FÜR M. CATARRHALIS-ANTIGENE

ANTIGEN¹	QUELLE VON ANTISERUM²	BAKTERIZIDER TITER³ RH408⁴		BAKTERIZIDER TITER Q8⁵
ANTIGEN¹	QUELLE VON ANTISERUM²	Vor- Immun.	Nach-Immun.	Vor- Immun.	Nach-Immun.
TBP1	GP	<3,0	4,2-6,9	<3,0	4,4-6,2
TBP2	GP	<3,0	12,0-13,6	<3,0	<3,0-4,0

¹Antigene, isoliert aus M. catarrhalis 4223
²GP = Meerschweinchen
³Bakterizide Titer: Ausgedrückt in log2 als die Verdünnung von Antiserum, welche zum Abtöten von 50% der Zellen in der Lage ist.
⁴M. catarrhalis RH408 ist ein nicht-klumpenbildendes Derivat von M. catarrhalis 4223.
⁵M. catarrhalis Q8 ist ein klinisches Isolat, welches einen nicht-klumpenbildenden Phänotyp aufzeigt.

Antigen	Bakterizider Titer – RH408		Bakterizider Titer – Q8
Antigen	Vor-Immun	Nach-Immun	Vor-Immun	Nach-Immung
rTbp1 (4223)	<3,0	<3,0	<3,0	<3,0
rTbp2 (4223)	<3,0	10-15	<3,0	<3,0
rTbp2 (Q8)	NT	NT	<3,0	5,5-7,5

Antikörpertiter sind in log₂ als die Verdünnung von Antiserum ausgedrückt, welche zum Abtöten von 50% der Zellen in der Lage ist. NT = nicht getestet
TABELLE 3

ELISA-Titer für Anti-rTbp2-Antikörper, welche natives oder rTbp2 aus dem Stamm 4223 oder rTbp2 aus dem Stamm Q8 erkennen

Aufbeschichtetes Antigen	Anti-rTbp2(4223)-Antikörpertiter		Anti-rTbp2(Q8)-Antikörpertiter
Aufbeschichtetes Antigen	Kaninchen-Antiseren	Meerschweinchen-Antiseren	Kaninchen-Antiseren	Meerschweinchen-Antiseren
Natives Tbp2 (4223)	409 600 204 800	1 638 400 1 638 400	25 600 25 600	51 200 102 400
rTbp2 (4223)	409 600 409 600	1 638 400 1 638 400	102 400 102 400	204 800 204 800
rTbp2 (Q8)	409 600 102 400	1 638 400 1 638 400	1 638 400 409 600	1 638 400 1 638 400

REFERENZEN

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SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Gereinigtes und isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert.
Das Nukleinsäuremolekül, das in Anspruch 1 beansprucht wird, wobei das Transferrin-Rezeptorprotein das Transferrin-Bindeprotein 1 (Tbp1) des Moraxella-Stammes ist.
Das Nukleinsäuremolekül, das in Anspruch 2 beansprucht wird, wobei das Transferrin-Rezeptorprotein das Transferrin-Bindeprotein 2 (Tbp2) des Moraxella-Stammes ist.
Das Nukleinsäuremolekül, das in einem der Ansprüche 1 bis 3 beansprucht wird, wobei der Moraxella-Stamm ein Moraxella catarrhalis-Stamm ist.
Das Nukleinsäuremolekül, das in Anspruch 4 beansprucht wird, wobei der Moraxella catarrhalis-Stamm Moraxella catarrhalis 4223, Q8 oder R1 ist.
Das Nukleinsäuremolekül, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 beansprucht, das eine DNA-Sequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA-Sequenz, wie sie in 5, 6, 10, 11 oder 27 (SEQ ID Nr: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45 oder 46) dargelegt ist, oder die dazu komplementäre DNA-Sequenz; (b) DNA-Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz codiert, wie sie in 5, 6, 10, 11 oder 27 (SEQ ID Nr: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder 47) dargelegt ist, oder die dazu komplementäre DNA-Sequenz; und (c) DNA-Sequenz, die für ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert, die unter stringenten Bedingungen mit einer der in (a) oder (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisiert.
Das Nukleinsäuremolekül, das in Anspruch 6 beansprucht wird, wobei die DNA-Sequenz, die in (c) definiert ist, mindestens 90% Sequenz-Identität mit einer der DNA-Sequenzen, die in (a) oder (b) definiert sind, besitzt.
Das Nukleinsäuremolekül, das in Anspruch 6 oder 7 beansprucht wird, wobei die DNA-Sequenz, die in (c) definiert ist, eine Sequenz ist, die für das äquivalente Transferrin-Rezeptorprotein eines anderen Moraxella-Stammes codiert.
Vektor, der zur Transformation eines Wirts geeignet ist, wobei dieser Vektor das Nukleinsäuremolekül enthält, das in einem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht wird.
Der Vektor, der in Anspruch 9 beansprucht wird, weiterhin gekennzeichnet durch Mittel zur Expression, die funktionsfähig mit dem Nukleinsäuremolekül verbunden sind, für die Expression des besagten Transferrin-Rezeptorproteins eines Moraxella-Stammes durch den Wirt.
Der Vektor nach Anspruch 10, der ein Plasmid ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus pLEM-29 (ATCC-Hinterlegung Nr. 97.461), pLEM-37 (ATCC-Hinterlegung Nr. 97.834) und SLRD35-A (ATCC-Hinterlegung Nr. 97.833).
Transformierte Wirtszelle, die einen Expressionsvektor enthält, wie er in Anspruch 10 oder 11 beansprucht wird.
Verfahren der Bildung eines im Wesentlichen reinen rekombinanten Transferrin-Rezeptorproteins eines Moraxella-Stammes, gekennzeichnet durch: Kultivieren des transformierten Wirts nach Anspruch 12, so dass ein Transferrin-Rezeptorprotein in Form von Einschlusskörpern exprimiert wird, Reinigen der Einschlusskörper, um sie von zellulärem Material und löslichen Proteinen zu befreien, Solubilisieren des Transferrin-Rezeptorproteins aus den gereinigten Einschlusskörpern, und Reinigen des Transferrin-Rezeptorproteins, um es von anderen solubilisierten Materialien zu befreien.
Das Verfahren, das in Anspruch 13 beansprucht wird, wobei das Transferrin-Rezeptorprotein nur Tbp1, nur Tbp2 oder ein Gemisch aus Tbp1 und Tbp2 ist.
Das Verfahren, das in Anspruch 13 oder 14 beansprucht wird, wobei das Transferrin-Rezeptorprotein eine Reinheit von mindestens 70% besitzt.
Das Verfahren, das in Anspruch 15 beansprucht wird, wobei das Transferrin-Rezeptorprotein eine Reinheit von mindestens 90% besitzt.
Immunogene Zusammensetzung, gekennzeichnet durch mindestens eine aktive Komponente, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (A) gereinigtem und isoliertem Nukleinsäuremolekül, das für ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert; (B) gereinigtem und isoliertem Nukleinsäuremolekül, das für ein Transferrin-Rezeptorprotein von Moraxella codiert und eine DNA-Sequenz besitzt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) DNA-Sequenz, wie sie in 5, 6, 10, 11 oder 27 (SEQ ID Nr: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 45 oder 46) dargelegt ist, oder die dazu komplementäre DNA-Sequenz; (b) DNA-Sequenz, die für eine Aminosäuresequenz codiert, wie sie in 5, 6, 10, 11 oder 27 (SEQ ID Nr: 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder 47) dargelegt ist, oder die dazu komplementäre DNA-Sequenz; und (c) DNA-Sequenz, die für ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert, die unter stringenten Bedingungen mit einer der in (a) oder (b) definierten DNA-Sequenzen hybridisiert; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger dafür, wobei die besagte mindestens eine aktive Komponente eine Immunantwort auslöst, wenn sie einem Wirt verabreicht wird.
Verfahren der Bestimmung des Vorliegens von Nukleinsäure, die für ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert, in einer Probe, gekennzeichnet durch die Schritte: (a) Inkontaktbringen der Probe mit dem Nukleinsäuremolekül, das in einem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht wird, zur Bildung von Doppelsträngen, die das Nukleinsäuremolekül und eines der besagten Nukleinsäuremoleküle, die für das Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codieren, das in der Probe vorliegt und damit spezifisch hybridisierbar ist, umfassen; und (b) Bestimmung der Bildung der Doppelstränge.
Diagnostisches Kit zur Bestimmung des Vorliegens von Nukleinsäure, die für ein Transferrin-Rezeptorprotein eines Moraxella-Stammes codiert, in einer Probe, gekennzeichnet durch: (a) das Nukleinsäuremolekül, das in einem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht wird; (b) Mittel, um das Nukleinsäuremolekül mit der Probe in Kontakt zu bringen, zur Bildung von Doppelsträngen, die das Nukleinsäuremolekül und eine der besagten Nukleinsäuren, die in der Probe vorliegen und mit dem Nukleinsäuremolekül hybridisierbar sind, umfassen; und (c) Mittel zur Bestimmung der Bildung der Doppelstränge.