JP2000503855A

JP2000503855A - モラクセラ菌のトランスフェリン受容体遺伝子

Info

Publication number: JP2000503855A
Application number: JP9531288A
Authority: JP
Inventors: マイアーズ、リサ、イー．; スクライヴァーズ、アンソニー、ビー．; ハークネス、ロビン、イー．; ルースモアー、シーナ、エム．; デュ、ラン―パン; ヤン、ヤン―ピン; クレイン、マイケル、エイチ．
Original assignee: コノートラボラトリーズリミテッド
Priority date: 1996-03-08
Filing date: 1997-03-07
Publication date: 2000-04-04
Also published as: PT885300E; RU2235128C2; US6437096B1; AU1865397A; DE69737682T2; ATE361362T1; BR9710435A; EP0885300B9; CN1128876C; ES2285730T3; DK0885300T3; EP1777293A1; AU722681B2; WO1997032980A1; EP0885300B1; CA2248095A1; NZ331777A; US6090576A; CN1217748A; DE69737682D1

Abstract

(57)【要約】カタル球菌のようなモラクセラ菌のトランスフェリン受容体タンパク質またはフラグメント、または類似体の精製・分離した核酸分子を提供する。診断と医療治療に使用する目的で、モラクセラ菌の他のタンパク質を含まないモラクセラ菌株の組み換えトランスフェリン受容体タンパク質Ｔｂｐ１およびＴｂｐ２を産生させるために、この核酸配列を使用する。この核酸は感染症の診断にも使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】モラクセラ菌のトランスフェリン受容体遺伝子発明の属する技術分野本発明は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）タンパク質をコードする遺伝子の分子クローニング、特に、モラクセラ属（ブランハメラ属）カタル球菌由来のトランスフェリン受容体遺伝子のクローニングに関する。関連出願の参考資料本出願は、同時継続出願である、１９９７年１月３日出願の米国特許出願番号第０８／７７８，５７０の一部継続出願で、それは１９９６年３月８日出願の米国特許出願第０８／６１３，００９の一部継続出願である。発明の背景モラクせラ属（ブランハメラ属）カタル球菌は、健常なヒトの気道に無症候的に保持されるグラム陰性の双球菌病原菌である。最近、カタル球菌が中耳炎の原因菌であることが判明した。さらに、カタル球菌は、副鼻腔炎、結膜炎、泌尿性器感染、小児および成人における肺炎、慢性気管支炎、気腫などの下部気道の多数の炎症疾患と関連がある(参考文献１〜８参照)。（この出願書には、本発明が完成する技術をより詳しく説明するために多様な参考文献を丸括弧で囲んで引用している。各引用文献の完全な文献情報は、この明細書の最後のクレームの記載のすぐ後に記載してある。これらの参考文献で開示されていることを、それらの文献名を参照することで、本発明の開示内容の説明に使用している。）このカタル球菌は、ヒトに侵入して、敗血症、関節炎、心内膜症、髄膜炎の原因ともなる (参考文献９〜１３)。中耳炎は、若年の小児に最も多く見られる疾病の１つであり、全小児のおよそ８０％は、１３歳までに、少なくとも１種類の中耳感染症にかかる(文献１４)。慢性中耳炎は、小児の聴覚障害、言語障害と関連があり、学習障害にも関係する場合もある。中耳炎に対する従来の治療法としては、抗生物質の投与、扁桃摘出、アデノイド切除、鼓室穿刺などの外科手術がある。米国では、中耳炎の治療経費は年間１０〜２０億ドルになると推定される。中耳炎の症例においては、カタル球菌は、通常、肺炎連鎖球菌および型別不能インフルエンザ菌と一緒に分離され、肺炎連鎖球菌は、中耳炎感染原因の５０％、インフルエンザ菌は中耳炎感染原因の３０％まで関与していると考えられている。カタル球菌は、中耳炎感染原因のおよそ２０％まで関与しているとされている(文献１５)。疫学的報告によれば、カタル球菌が原因で発症する中耳炎の症例が増加しており、同時に、抗生物質に耐性を獲得したカタル球菌の分離菌も増えているとのことである。このように、１９７０年以前には、β-ラクトマーゼ産生カタル球菌分離菌の検出は報告されていないが、７０年代中頃以来、β-ラクトマーゼ産生カタル球菌が多く検出されているとの報告がある。最近の研究では、臨床的に分離された菌の７５％がβ-ラクトマーゼを産生している(文献１６，２６)。鉄は多数の細菌が増殖するための必須の栄養源である。カタル球菌を含む数種の細菌は、トランスフェリンを獲得するトランスフェリン受容体タンパク質を利用して宿主から鉄を取り入れている。カタル球菌（文献２０）と同様に、髄膜炎菌(文献１７)、淋菌(文献１８)、インフルエンザ菌（文献１９）を含む多数の細菌は、ヒト・トランスフェリンと特異的に結合する外膜タンパク質を産生する。これらのタンパク質の発現は、環境中にある鉄量により規制を受ける。カタル球菌には、２つのトランスフェリン受容体があり、その１つであるトランスフェリン結合タンパク質１（Ｔｂｐ１）の分子量は１１５ｋＤａ（Ｔｂｐ１）であり、他方のトランスフェリン結合タンパク質２（Ｔｂｐ２）の分子量はおよそ８０〜９０ｋＤａ（Ｔｂｐ２）である。アポトランスフェリンに親和性を示す他の細菌のトランスフェリン受容体タンパク質と違って、カタル球菌のＴｂｐ２受容体は、鉄飽和トランスフェリン（例えば、フェリトランスフェリン）（文献２１）に親和性を示す。カタル球菌感染は重篤な疾病に至る。トランスフェリン結合タンパク質の組み換え源を、他の抗原や免疫原のキャリヤやワクチンなどの免疫原調剤にした抗原の形で提供することにはメリットがあり、診断薬の生産につながる。トランスフェリン結合タンパク質およびそのフラグメントをコードしている遺伝子が特に望ましく、モラクセラ菌の特異的同定と診断、カタル球菌が原因である疾病に対する免疫、診断薬の生産のために有益である。発明の概要本発明の目的は、モラクセラ菌のトランスフェリン受容体またはそのトランスフェリン受容体タンパク質のフラグメントまたは類似体をコードしている、精製・分離した核酸分子を提供することである。ここで提供する核酸分子は、モレクセラ菌の特異的検出およびモレクセラ菌の感染の診断に有益である。ここで提供する分離・精製した、ＤＮＡのような核酸分子は、組み換えＤＮＡ法を使用することにより、ｔｂｐ遺伝子を発現させたい場合に有益であり、これを利用することで、精製・分離したトランスフェリン受容体タンパク質、そのサブユニット、フラグメント、類似体を安価に提供できることになる。トランスフェリン受容体、そのサブユニット、フラグメント、類似体は、それらをコードしている核酸分子は、それらを含有しているベクターと同様に、モラクセラ菌が原因で起こる疾病に対するワクチン用の免疫原性成分として、モラクセラ菌感染の診断用として、あるいは、免疫原性試薬の生産のツールとして使用する場合に有用である。本発明の態様として、生産されたトランスフェリン受容体タンパク質に対して産生されたモノクローナル抗体または単一特異性抗血清（抗体）は、モラクセラ菌感染の診断、モラクセラ菌の特異的検出(インビトロおよびインビボ試験で使用)、モラクセラ菌が原因で発症した疾病の治療に有効である。本発明の態様の１つによれば、本発明は、モラクセラ（Moraxella）菌株、特に、カタル球菌（M.catarrhalis）の４２２３，Ｑ８，Ｒ１株のトランスフェリン受容体タンパク質またはトランスフェリン受容体タンパク質のフラグメントまたは類似体をコードしている、精製・分離した核酸分子を提供するものである。本発明の好適な実施例では、核酸分子はモラクセラ菌株のＴｂｐ１タンパク質だけ、あるいは、Ｔｂｐ２タンパク質だけをコードしているものでもよい。本発明の別の好適な実施例では、この核酸は、保存的なアミノ酸を有しているモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質のフラグメントをコードしているものでもよい。本発明のさらに別の態様によれば、（ａ）図５，６，１０，１１，２７に示されたＤＮＡ配列（配列番号：１，２，３，４，５，６，７，８，４５，４６）または、これらの配列に相補的なＤＮＡ配列、（ｂ）図５，６，１０，１１，２７に示されたアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列（配列番号：９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６、４７）および（ｃ）（ａ）または、（ｂ）でのＤＮＡ配列のどれか１つに、厳しい条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列から成るグループから選択されたＤＮＡ配列を有する、精製・分離した核酸分子を提供する。（ｃ）で規定されたＤＮＡ配列が、（ａ）および（ｂ）で規定されたＤＮＡ配列のいずれか１つと、少なくとも約９０％の配列上の同一性を有することが望ましい。（ｃ）で規定されたＤＮＡ配列は、モラクセラ菌の別の株由来のトランスフェリン受容体タンパク質の同等物質をコードするものである。追加の態様によれば、本発明には、宿主の形質転換のための、本発明で提供する核酸分子から成るベクタを含み、ベクターであるＬＥＭ３−２４，ｐＬＥＭ３，ｐＬＥＭ２５，ｐＬＥＭ２３，ＳＬＲＤ-Ａ、ＤＳ-１６９８-１-１、ＤＳ-１７５４-１，ｐＳＬＲＤ２、ｐＳＬＲＤ３，ｐＳＬＲＤ４，ｐＳＬＲＤ５に含まれるヌクレオチド配列の特質を持つ。このベクターは、コードされたトランスフェリン受容体、そのフラグメント、またはその類似体を、非相同または相同宿主内での脂質化した状態または脂質化していない状態で発現させるようにしたものである。従って、さらに別の態様によれば、本発明は、宿主の形質転換のための、本発明で提供された核酸から成る発現ベクターを提供すると共に、トランスフェリン受容体またはそのフラグメントまたはその類似体を宿主内で発現させるために、核酸分子と有効に連動して作用するような発現手段も提供するものである。本発明の特別な態様によれば、この核酸分子は、実質的には、モラクッセラ菌のすべてのトランスフェリン受容体タンパク質、あるいは、Ｔｂｐ１タンパク質だけ、または、Ｔｂｐ２タンパク質だけをコードするものである。この発現手段には、プロモータと、トランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたは類似体の宿主からの分泌のためのリーダ配列をコードする核酸タンパク質が含まれている。この発現手段には、ホストからの脂質化したトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体を発現させるための脂質化シグナルをコードする核酸部分も含まれている。宿主には、例えば、大腸菌、ボルデテラ菌、バチルス菌、ヘモフィルス菌、モラクセラ菌、真菌、酵母があり、バキュロウイルス発現システム、セムリキ森林ウイルスの発現システムも使用できる。さらに、別の実施例では、Ｔｂｐ１を発現させるためのプラスミドとしてｐＬＥＭ２９、Ｔｂｐ２を発現させるためのプラスミドとしてｐＬＥＭ３３が使用される。ベクターとしては、ｐＬＥＭ-３７，ＳＬＲＤ３５-Ａ、ＳＬＲＤ-３５-Ｂが使われる。さらに追加の態様によれば、本発明は、ここで提供した発現ベクターを取り込んだ形質転換宿主を提供する。本発明は、さらに、モラクセラ菌の、形質転換宿主を使用した組み換えトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体も提供するものである。別の態様によれば、本発明は、実質的に純粋の組み換えトランスフェリン受容体タンパク質を提供すると同時に、この純粋の組み換えトランスフェリンを作成する方法も提供し、その方法には、トランスフェリン受容体タンパク質を封入体として発現させるために提供された形質転換させた宿主を増殖させること、発現した封入体を別の細胞物質や溶解性タンパク質から分離・精製すること、精製した封入体からトランスフェリン受容体タンパク質だけを溶解させること、溶解したトランスフェリン受容体タンパク質から他の溶解物質を除去・精製することを含む。実質的に純粋な組み換えトランスフェリン受容体タンパク質は、Ｔｂｐ１のみ、Ｔｂｐ２のみ、あるいは、それらの混合物から成る。この組み換えタンパク質の純度は、一般的には少なくとも７０％、好ましくは、約９０％である。さらに別の態様によれば、本発明は、組み換えにより産生させたモラクセラ菌Ｔｂｐ２タンパク質が欠失しているモラクセラ菌Ｔｂｐ１タンパク質およびモラクセラ菌のその他のタンパク質、モラクセラ菌Ｔｂｐ１タンパク質を欠失している組み換えにより産生させたモラクセラ菌Ｔｂｐ２タンパク質およびモラクセラ菌のその他のタンパク質も提供する。ここで使用するモラクセラ菌としては、カタル球菌４２２３株、カタル球菌Ｑ８株、カタル球菌Ｒ１株がある。さらに別の態様では、本発明は、ここで提供する少なくとも１つの核酸分子から選択した少なくとも１つの活性成分から成る免疫原性成分、本発明の提供した少なくとも１つの組み換えタンパク質および製薬的に受け入れ可能なキャリヤ（担体）またはベクターを提供する。少なくとも１つの活性分子は、宿主に投与した時には免疫反応を起こさせるものである。ここで提供する免疫成分は、宿主へのインビボ投与が可能なワクチンとして調剤ができるものである。インビボ投与のために、この成分は、ミクロ粒子、カプセル、ＩＳＣＯＭ、リポソームに製剤化が可能なものである。この成分は免疫系の特定の細胞または粘膜表面にデリバリーするためのターゲット分子と組み合わせて提供してもよい。本発明の免疫原性成分（ワクチンを含む）は、少なくとも１つの免疫原性物質または免疫刺激物質から成り、その免疫刺激物質としては、少なくとも１つのアジュバンド、または少なくとも１つのサイトカインである。本発明で使用できる適当なアジュバントには、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＱＳ２１，Ｑｕｉ１Ａ、それらの誘導体、ＩＳＣＯＭマトリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類似体、アミノ酸のオクタデシルエステル、ムラミルジペプチド・ポリホスファゼン、ＩＳＣＯＰＲＥＰ、ＤＣ-ｃｈｏｌ、ＤＤＢＡ、リポタンパク質があるが、これらに限定されるものではない。アジュバントの望ましい組み合わせは同時係属出願の米国特許出願番号０８／２６１，１９４（１９９６年６月７日出願、現在は譲受人に譲渡されている）に記載されており、この出願で開示されている内容は、参考文献番号を示して、本出願でも触れている(ＷＯ９５／３４３０８)。発明の別の態様によれば、本発明は、宿主に免疫応答を起こさせる方法を提供し、その方法には、ヒトのような感受性のある宿主に本発明による提供される免疫原性成分の有効量を投与するステップから成る。免疫応答は、体液性あるいは細胞性免疫応答であり、マラクセラ菌により発症する疾病の予防をするものである。疾病に対する保護の対象となる宿主はヒトを含む霊長動物である。さらに別の態様によれば、本発明は、宿主に対してトランスフェリン受容体を運搬する生きたベクターを提供するものであり、このベクターは、上記で述べた核酸分子から構成されている。ベクターは、サルモネラ菌、ＢＣＧ、アデノウイルス、天然痘ウイルス、ワクシノウイルス、ポリオウイルスから選択してもよい。ここで提供される核酸分子は診断分野に使用できる。本発明は、試料中におけるモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードしている核酸の存否を決定する方法を提供し、その方法は、（ａ）試料と本発明で提供する核酸分子を接触させ、核酸分子と、試料中に存在し、本発明で提供する核酸分子と特異的にハイブリダイズが可能な、モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードしている核酸分子から成る複合体を産生させるステップと（ｂ）その複合体の産生量を定量するステップから成る。さらに、本発明は、試料中に存在する、モラクセラ菌のトランスフェリン受容体タンパク質をコードしている核酸の存否を決定するための診断キットを提供し、そのキットは、（ａ）本発明により提供された核酸分子を含み、（ｂ）試料中に存在し、本発明の提供する核酸とハイブリダイズが可能な核酸との複合体を産生させるために、試料と本発明の提供する核酸分子を接触させる手段、おおよび（ｃ）複合体の産生量を定量する方法から成る。さらに、本発明の提供する核酸分子とタンパク質は、モラクセラ菌による感染を予防するための薬剤を生産する場合に使用されるものである。本発明の長所として以下の点が挙げられる。・本発明で提供するものは、モラクセラ菌のトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体をコードしている、分離・精製した核酸分子であること。・組み換え技術で生産した、他のタンパク質を含んでいない純粋なトランスフェリン受容体タンパク質（Ｔｂｐ１タンパク質およびＴｂｐ２タンパク質）であること。・モラクセラ菌の特異的な同定を可能にする診断キットおよび免疫原性試薬の生産に使用できるものであること。図面の簡単な説明本発明は、添付図面と下記の説明により、さらに詳しく理解されるであろう。図１は、カタル球菌株４２２３のｔｂｐＡ遺伝子のＰＣＲ増幅用の縮重プライマーの合成に使用したＴｂｐ１タンパク質の保存部分のアミノ酸配列（配列番号：１７、１８）である。図２は、カタル球菌分離菌４２２３由来のｔｂｐＡとｔｂｐＢ遺伝子を含むクローンＬＭＥ３−２４の制限酵素切断地図である。図３は、カタル球菌４２２３のｔｂｐＡ遺伝子の制限酵素切断地図である。図４は、カタル球菌４２２３のｔｂｐＢの制限酵素切断地図である。図５は、ｔｂｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号：１−全配列、配列番号：２―コード配列)および、カタル球菌４２２３由来のＴｂｐ１タンパク質の推定のアミノ酸配列(配列番号：９−全長、配列番号：１０―成熟タンパク質)である。下線部はリーダ配列(配列番号：１９)である。図６は、ｔｂｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号：３は全配列、配列番号：４はコード配列)、および、カタル球菌４２２３由来のＴｂｐ２タンパク質の推定のアミノ酸配列(配列番号：１１−全長、配列番号：１２−成熟タンパク質)である。下線部はリーダ配列(配列番号：２０)である。図７は、カタル球菌Ｑ８由来のｔｂｐＡとｔｂｐＢ遺伝子を含むクローンＳＬＲＤ−Ａの制限酵素切断地図である。図８は、カタル球菌Ｑ８由来のｔｂｐＡの制限酵素切断地図である。図９は、カタル球菌Ｑ８由来のｔｂｐＢの制限酵素切断地図である。図１０は、ｔｂｐＡ遺伝子のヌクレトチド配列(配列番号：５−全配列、配列番号：６−コード配列)、および、カタル球菌Ｑ８由来のＴｂｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列(配列配列：１３−全長、配列番号：１４−成熟タンパク質)である。図１１は、ｔｂｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号：７−全配列、配列番号：８−コード配列)、および、カタル球菌のＴｂｐ２タンパク質の推定アミノ酸配列(配列番号：１５−全長、配列番号：１６−成熟タンパク質)である。図１２は、カタル球菌株４２２３由来のＴｂｐ１(配列番号：９)とＱ８(配列番号：１３)、インフルエンザ菌株Eagan(配列番号：２１)、髄膜炎菌株Ｂ１６Ｂ６(配列番号：２２)とＭ９８２(配列番号：２３)、淋菌株ＦＡ１９(配列番号：２４)のアミノ酸配列の比較である。ドットは、同一の残基を示し、最大列にはダッシュが挿入されている。図１３は、カタル球菌の分離菌４２２３(配列番号：１１)、Ｑ８(配列番号：１５)と、インフルエンザ株Eagan(配列番号：２５)と、髄膜炎菌株Ｂ１６Ｂ６（ (列番号：２６)、Ｍ９１８(配列番号：２７)、淋菌株ＦＡ１９(配列番号２８)とのアミノ酸配列の比較である。ドットは、同一の残基を示し、最大列にはダッシュが挿入されている。図１４は、組み換えＴｂｐ１タンパク質の発現のための大腸菌由来のプラスミドｐＬＥＭ２９の構造を示す。図１５は、プラスミドｐＬＥＭ２９で形質転換した大腸菌細胞によるＴｂｐ１タンパク質の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。図１６は、組み換えＴｂｐ１タンパク質の精製のためのフローチャートを示す。図１７は、精製した組み換えＴｂｐ１タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示したものである。図１８は、カタル球菌株４２２３のＴｂｐＡ遺伝子の大腸菌内での発現のためのプラスミドｐＬＥＭ３３とｐＬＥＭ３７の構造を示したものである。リーダ配列がある場合とない場合をそれぞれ示す。図１９は、プラスミドｐＬＥＭ３７により形質転換した大腸菌によるｒＴｂｐ２の発現に関してのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示したものである図２０は、カタル球菌株Ｑ８由来のｔｂｐＢ遺伝子の大腸菌内での発現のためのプラスミドｓＬＲＤ３５Ｂの構造を示したものでリーダ配列のない場合、およびカタル球菌Ｑ８由来のｔｂｐＢ遺伝子の大腸菌内での発現のためのプラスミドＳＬＲＤ３５Ａの構造を示したものでリーダ配列がある場合を示したものである。制限酵素位置は下記の通り。Ｂ＝ＢａｍＨＩ；Ｂｇ＝ＢｇＩＩＩ；Ｈ＝ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。図２１は、プラスミドＳＬＲＤ３５ＡおよびＳＬＲＤ３５Ｂにより形質転換した大腸菌内でのｒＴｂｐ２タンパク質の発現に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示したものである。図２２は、大腸菌由来の組み換えＴｂｐ２タンパク質の精製のフローチャートである。図２３（パネルＡ，Ｂを含む）は、大腸菌内で発現させた、カタル球菌株４２２３（パネルＡ）と株Ｑ８（パネルＢ）由来の組み換えＴｂｐ２タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示したものである。図２４は、Ｔｂｐ２のヒト・トランスフェリンとの結合を示したものである。図２５（パネルＡ，Ｂ，Ｃを含む）は、カタル球菌株でのＴｂｐ２タンパク質の抗原性保存を示したものである。図２６は、カタル球菌Ｒ１のｔｂｐＢ遺伝子の制限酵素切断地図である。図２７は、ｔｂｐＢ遺伝子のヌクレトチド配列(配列番号：４５―全体配列、配列番号：４６−コード配列)、および、カタル球菌Ｒ１のＴｂｐ２タンパク質の推定アミノ酸配列(配列番号：４７)である。図２８は、カタル球菌４２２３(SEQW ID番号：２１)およびＲ１(配列番号：１５)、Ｑ８(配列番号：４７)のアミノ酸配列の比較である。ドットは、同一の残基を示し、最大列にはダッシュが挿入されている。アスタリスクは、停止コドンを示す。発明の一般的説明どのモラクセラ菌でも、本発明の実施例で利用するようなトランスフェリン受容体をコードする核酸の少なくとも１つの部分から精製・分離した核酸（ＤＮＡ分子として）を得るための細菌として使用可能である。これらの菌株は、臨床現場や、「アメリカ型細菌培養コレクション」のような細菌培養コレクション機関から一般に入手が可能である。本出願においては、「トランスフェリン受容体(Ｔｆｒ)」および「トランスフェリン結合タンパク質(Ｔｂｐ)」という用語は、Ｔｂｐ１および／またはＴｂｐ２タンパク質群を定義するために使用されるが、多様なアミノ酸配列を有するタンパク質も含まれ、例えば、モラクセラ菌に属する種々の菌株の中に天然に存在するタンパク質も含むものとする。さらに、本発明にかかるトランスフェリン受容体をコードする部分から成る精製・分離したＤＮＡ分子には、モラクセラ菌のトランスフェリン受容体タンパク質であるＴｂｐ１およびＴｂｐ２の機能的な類似体をコードする分子も含まれる。本出願において、第１のタンパク質が免疫的に第２のタンパク質に関連があるか、あるいは、第１のタンパク質が第２のタンパク質と同じ機能を有する場合には、第１のタンパク質は、第２のタンパク質の「機能的類似体」であるとする。ここで「機能的類似体」とは、例えば、同じタンパク質のフラグメントやそのタンパク質の置換突然変異体、付加突然変異体、欠失突然変異体のことである。カタル球菌由来の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａにて切断し、１５〜２３ｋｂの長さ範囲のフラグメントとし、それをλベクタ-ＥＭＢＬ３のＢａｍＨＩ位置にクローン化した。ライブラリーを抗-Ｔｂｐ１モルモット抗血清でスクリーニングを行い、約１３．２ｋｂの挿入フラグメントを含むポジティブ・クローンＬＥＭ３-２４を分析用に選択した。ＬＥＭ３-２４で感染させた大腸菌ＬＥ３９２由来のリゼイトには、約１１５ｋＤａのタンパク質を含んでいることが判明した。このリゼイトをウェスタンブロット法により抗-Ｔｂｐ１抗血清と反応させた。約８０ｋＤａの第２のタンパク質を、ウェスタンブロット法により、抗-Ｔｂｐ２モルモット抗血清と反応させた。ｔｂｐＡ遺伝子の、ＬＥＭ３-２４の１３．２ｋｂ挿入フラグメント上の位置を決めるために、縮重ＰＣＲプライマーを使用して、カタル球菌４２２３の推定ｔｂｐＡの小さい部位を増幅させた。縮重オリゴヌクレオチド・プライマの配列は、数個のナイセリア菌およびヘモフィリア菌のＴｂｐ１タンパク質の保存アミノ酸配列を基礎にした（これは図１に示されている）(配列番号：１７，１８)。３００塩基対の増幅産物が産生され、４２２３ｔｂｐＡ遺伝子内の位置は、図５内の太文字で示されている(配列番号：２９)。増幅産物はベクターｐＣＲＩＩにサブクローン化して、ラベルを付けて、サザンブロット法により、制限エンドヌクレアーゼで切断したクローンＬＥＭ３-２４ＤＮＡのプローブとして使用した。このプローブは、３．８ｋｂのＨｉｎＩＩＩｌ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメント、２．０ｋｂのＡｖｒＩＩＡｖｒＩＩフラグメント、４．２ｋｂのＳａｌｔ-ＳＰｈＩフラグメントとハイブリダイズした(図２)。３.８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＡＣＹＣ１７７にサブクローン化して、シーケンスをした。大きなオーオプン・リーディングフレームが同定され、約２ｋｂのｔｂＰａ遺伝子を含んでいることが判明した。隣接する下流のＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをベクターｐＡＣＹＣ１７７にサブクローン化することにより、ｔｂｐＡ遺伝子の残りの１ｋｂを得た。カタル球菌４２２３由来のｔｂｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号：１，２)と推定のアミノ酸配列(配列番号：９−全長、配列番号：１０成熟タンパク質)を図５に示す。カタル球菌株Ｑ８由来の染色体ＤＮＡをＳａｕ３Ａ・Ｉで消化し、１５-２３ｂｐのフラグメントをＥＭＢＬ３のＢａｍＭＩアームに結合させた。高力価ライブラリーを大腸菌ＬＥ３９２細胞内に産生させ、４２２３ｔｂｐＡ配列を基礎にしたオリゴヌクレトチド・プローブを使用してスクリーニングを行った。ファージＤＮＡを準備して、制限酵素分析を実施した結果、約１３−１５ｋｂの挿入フラグメントがクローニングされていることが判明した。ファージクローンＳＬＲＤ -Ａを使用して、配列分析のためのフラグメントのサブクローン化を行った。クローニングベクター（ｐＳＫＭＡ）を作製し、フラグメントのクローニングを促進させた。ｔｂｐＡの全部およびｔｂｐＢのほとんどを含むプラスミドｐＳＲＲＤ１，ｐＳＬＲＤ２，ｐＳＬＲＤ３，ｐＳＬＲＤ４，ｐＳＬＲＤ５を産生させた。図１０は、菌株Ｑ８由来のｔｂｐＡ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号：５，６)と推定アミノ酸配列(配列番号：１３−全長、配列番号：１４−成熟タンパク質)を示したものである。ｔｂｐＡ遺伝子によりコードされたＴｂｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列は、ナイセリア菌とヘモフィリス菌株由来の遺伝子によりコードされたアミノ酸と、その配列に相同性があることが判明した(図１２，配列番号：２１，２２，２３，２４)。今回の発見に先だって、ナイセリア菌、ヘモフィリス菌、アクチニノバチルス菌で同定されたｔｂｐＡ遺伝子の前の位置に、数個の保存的部位と共に、ｔｂｐＢ遺伝子が存在することが判明した。この２つの遺伝子は、通常、短い遺伝子間配列により分離されている。しかし、カタル球菌においては、このｔｂｐＢ遺伝子は、ｔｂｐＡ遺伝子の上流には見つからなかった。クローンＬＥＭ３-２４の１３．２ｋｂの挿入フラグメント内のｔｂｐＢ遺伝子の位置を同定するために、Ｔｂｐ２タンパク質の中に保存されているアミノ酸配列ＥＧＧＦＹＧＰ(配列番号：３０)を基礎にして縮重オリゴヌクレトチドプローブを合成した。オリゴヌクレオチドにラベルを付けて、サザンブロット法により、制限エンドヌクレアーゼで切断したクローンＬＥＭ３-２４ＤＮＡのプローブとして使用した。このプローブは、５．５ｋｂのＮｈｅＩ-ＳａｌＩフラグメントとハイブリダイズさせ、その後ｐＢＲ３２８にサブクローン化して、配列決定をした。このフラグメントには、プロモータ部位を除いて、大抵の推定ｔｂｐＢ遺伝子を含んでいた。このクローンＬＥＭ３-２４は、残りの上流部分の配列を知るために、シーケンスした。ヘモフィリス菌やナイセリア菌内でのｔｂｐＡとｔｂｐＢ遺伝子の場合と違って、ｔｂｐＢ遺伝子の場合は、ｔｂｐＡ遺伝子の先端から約３ｋｂ下流に位置していた。図６は、カタル球菌のｔｂｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号：３，４) と推定アミノ酸配列(配列番号：１１，１２)を示したものである。カタル球菌株Ｑ８由来のｔｂｐＢ遺伝子もクローニングをして配列決定を行った。図１１は、ヌクレオチド配列(配列番号：７，８)と推定アミノ酸配列(配列番号：１５，１６)を示したものである。カタル球菌株Ｒ１由来のｔｂｐＢ遺伝子もクローニングをして配列決定を行った。図２７は、ヌクレオチド配列(配列番号：４５，４６)と推定アミノ酸配列(配列番号：４７)を示したものである。図２８の比較で示されているカタル球菌Ｔｂｐ２アミノ酸配列(配列番号：１１，１５，４７)と、カタル球菌Ｔｂｐ２アミノ酸配列と、図１３の比較で示されている多数のナイセリア菌とヘモフィリス菌のＴｂｐ２配列(配列番号：２５，２６，２７，２８) との間に相同性のある部位があることは明白である。クローン化されたｔｂｐＡとｔｂｐＢ遺伝子が大腸菌内に発現し、他のモラクセラ菌のタンパク質の混入していない組み換えＴｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質が産生された。これらの組み換えタンパク質を精製して免疫に使用した。カタル球菌または組み換えＴｂｐ２タンパク質を発現している大腸菌の全細胞リゼイト内のタンパク質を、ＳＤＳ―ＰＡＧＥ法により分離することにより、さらに、モルモットを使用した、抗-４２２３ｒＴｂｐ２抗血清または抗-Ｑ８ｒＴｂｐ２抗血清との抗血清免疫ブロッティングを実施することで、カタル球菌株でのＴｂｐ２タンパク質の抗原性の保存を確認した。この方法により、カタル球菌株３，５６，１３５，５８５，４２２３，５１９１，８１８５およびＡＴＣＣ２５２４０を試験した結果、これら全部が、抗-４２２３ｒＴｂｐ２または抗-Ｑ８ｒＴｂｐ２抗体に対して特異的な反応を示した(図２５)。さらに、下の表１は、ある株由来の抗-ｒＴｂｐ２抗体の、相同または非相同株由来の天然あるいは組み換えタンパク質を認識する能力を、ＥＬＩＳＡを使用して測定したものを示したものである。カタル球菌株４２２３由来のトランスフェリン受容体のＮ末端と臭化シアンフラグメントのアミノ酸配列決定を行った。Ｔｂｐ１とＴｂｐ２の両方のＮ末端をブロックした。図５と６の中の下線を引いた部分は、Ｔｂｐ１とＴｂｐ２の推定シグナル配列(配列番号：１９と２０)をそれぞれ示している。Ｔｂｐ２のＮ末端部分の推定アミノ酸配列は、多糖の構造を示唆している。下記表１，２の結果は、Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２で免疫することで産生された抗.Ｔｂｐ１と抗-Ｔｂｐ２モルモット抗血清のカタル球菌を溶菌する能力を示している。結果は、カタル球菌分離株４２２３由来Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２タンパク質を使用した免疫により産生された抗血清が、分離株４２２３由来の相同的非凝集性カタル球菌株ＲＨ４０８(以前に、すでに譲受人に譲渡されている米国特許出願番号０８／３２８，５８９に関して,１９９４年１２月１３にブタベスト条約下により「アメリカンタイプカルチャーコレクション」(Amerlcan Type Cul uture Collection、またはＡＴＴＣＣ、住所：1301 Parklawn Drlve,Rockville, Maryland 20852,USA)に寄託された株、寄託番号：５５，６３７))(WO96/12733) に対して殺菌性であることを示している。さらに、カタル球菌株４２２３から分離されたＴｂｐ１タンパク質で免疫することにより産生された抗血清が、非相同性の非凝集性株Ｑ８（Centre Hospitalier de l'Unlversite Laval,St.Foy,Queb ecのM.G.Bergeron博士により提供された株）に対して殺菌性を示した。さらに、組み換えＴｂｐ２（ｒＴｂｐ２）タンパク質に対して生産された抗血清は、カタル球菌の相同株に殺菌性を示した。分離・精製結合タンパク質の殺菌性抗体を産生する能力がインビボで明らかであることから、モラクセラ菌が原因となる疾病に対する予防としてワクチンに使用できることになる。このように、本発明の別の態様によれば、本発明はモラクセラ菌が原因となる感染に対するワクチンを提供することであり、このワクチンは、免疫原性効果のある量の、モラクセラ菌由来のトランスフェリン結合タンパク質と薬学的に受け入れ可能なキャリヤから成る。ワクチン製剤は、抗原として使用できる、配列の分岐したトランスフェリン結合タンパクで構成するようにしてもよい。本発明で提供されるトランスフェリン結合タンパク質は、診断試薬としても有効である。つまり、抗トランスフェリンタンパク質結合抗体の産生を誘導する抗原として、あるいは、モラクセラ菌が原因となる疾病に対するワクチン用の抗原、モラクセラ菌や同種の細菌の感染を探知する抗原として使用できるのである。ここで提供されるトランスフェリン結合タンパク質は、トランスフェリン結合タンパク質と関係のない抗原決定基に対する複合ワクチンを生産する場合の、ハプテン、多糖、ペプチドの担体タンパク質としても利用できる。さらに、本発明の別の実施例によれば、このトランスフェリン結合タンパク質は、被包性細菌のような病原菌に対するキメラ分子や複合ワクチン（複合糖質を含む）を作製するために担体分子としても使用可能である。このように、例えば、本発明の複合糖質は、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）やＰＲＰのような多糖抗原を有する細菌による疾病や感染に対する予防をするためにも使用できる。これが使用できる細菌性病原菌には、例えば、ヘモフィリス属インフルエンザ菌、肺炎連鎖球菌、大腸菌、髄膜炎菌、チフス菌、ストレプトコッカス・ミュータンス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、クレブシェラ菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌がある。トランスフェリン結合タンパク質と接合させることのできる特別な抗原、そのような接合を行う方法については、１９９３年１２月２３日出願の米国特許出願番号０．８／４３３，５２２（現在は譲受人に譲渡されている：ＷＯ９４／１２６４１）に開示されており、その開示内容は、本出願の中でも参考文献を参照することで説明している。別の実施例では、トランスフェリン結合タンパク質のキャリヤ機能が、腫瘍細胞の異常な多糖に対する免疫応答を誘導するために、あるいは、化学療法剤または生物活性剤と接合可能な抗-腫瘍抗体を生産するために利用されている。本発明では、カタル球菌由来のトランスフェリン結合タンパク質をモラクセラ菌による感染が原因である疾病用のワクチンの有効成分として使用している。さらに、本発明では、カタル球菌由来のトランスフェリン結合タンパク質を含むワクチン製剤の成分として使用し、任意で、薬学的に受け入れ可能なキャリヤおよび／または希釈剤と一緒に使用する。本発明のさらに別の態様によれば、本発明では、このトランスフェリン結合タンパク質をモラクセラ菌による感染が原因である疾病に対する免疫用としてのワクチン製剤に使用する。本発明の実施例で示した技術は、予防接種、診断、モラクセラ菌の感染による疾病の治療、免疫薬剤や診断薬の生産などに広く応用可能であることは当業者には明白である。以下に、そのような応用について説明をする。１．ワクチン製剤およびその使用ワクチンとして使用できる免疫原性成分を、核酸分子によりコードされている、免疫原性のあるトランスフェリン受容体タンパク質、その類似体、そのフラグメントから調剤可能である。ワクチンは免疫応答を誘導し、抗-トランスフェリン受容体抗体あるいは、食菌作用または殺菌作用のある抗体を産生させる。モラクセラ菌がワクチン投与をした患者に感染すると、抗体がトランスフェリン受容体に結合し、それにより、細菌が、生存に必要な鉄源に接近することを阻止する。さらに、食菌作用または殺菌作用のある抗-トランスフェリン受容体抗体が、代替メカニズムにより保護作用を与える。ワクチンを含む免疫原性成分は、液体溶液やエマルジョンの形で、注射が可能な薬剤に製剤が可能である。核酸によりコードされるトランスフェリン受容体タンパク質、その類似体やフラグメントを、トランスフェリン受容体タンパク質、そのフラグメントまたは核酸と適合する、薬学的に受け入れ可能な添加物と混合させることができる。この添加物して、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせたものがある。免疫原性成分およびワクチンには、さらに、ワクチンの効果を高めるために、湿潤剤や乳化剤、ｐＨ緩衝液、アジュバントなどの補助物質を混入してもよい。免疫原性成分およびワクチンは、非経口でも、皮下注射、皮内、筋肉内経由でも投与できる。本発明の免疫原性成分は、粘膜表面での免疫応答を誘発するような方法で調製し投与してもよい。このように、この免疫原性成分は、例えば、経鼻経由または経口（胃内）で投与して粘膜表面を刺激できるようにしてもよい。この免疫原性成分は、免疫系の特定の細胞または粘膜表面に、その免疫成分を送り込むターゲット分子と一緒に投与してもよい。このようなターゲット分子として、ビタミンＢ１２や、ＷＯ９２／１７１６７(Biotech Australia Pty Ltd)で開示されているような細菌毒素のフラグメント、米国特許第５，１９４，２５４(Barber et al)で開示されているようなモノクローナル抗体でもよい。代替の投与法として、座薬による投与やその他の経口調剤なども使用できる。座薬の場合には、例えば、ポリアルカリン・グリコールまたはトリグリセリドなどの結合剤やキャリヤを併用する。経口調剤には、通常、薬剤として使用されているサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムのような添加剤を含む。これらの成分は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放剤、粉末などの製剤の形にして、約１〜９５％のトランスフェリン受容体タンパク質、そのフラグメントや類似体および／または核酸分子を含有するようにする。ワクチンは、製剤形態に適合した方法で、しかも、薬学的に有効であり、予防作用と免疫原性を与えるだけの十分な量を投与する必要がある。投与量は、治療を行う対象により異なり、例えば、各対象の抗体を合成する能力、あるいは、必要によっては、細胞性免疫を起こさせる免疫系の能力などに依存する。投与すべき有効成分の正確な量は、担当医の判断による。しかし、適切な投与量の範囲は、当業者には容易に決定することができ、トランスフェリン受容体タンパク質およびそのフラグメントや類似体では、マイクログラムのオーダである。当初投与の適切な処方およびブースタ投与をするかどうかは状況により多様である。ワクチンの投与量は投与経路や宿主の体重によっても違ってくる。モラクセラ菌のトランスフェリン受容体をコードしている核酸分子は、免疫に使う場合には、直接ＤＮＡを投与してもよいし、例えば、免疫原性成分の注射をしたり、核酸分子を含むサルモネラ菌、ＢＣＧ、アデノウイルス、ポックスウイルス、バクシニア、ボリオウイルスなどの生きたベクターを作製して使用してもよい。非相同性の抗原を免疫系に送り込むために使用する数種の生きたベクターに関する検討がO'Haganによりなされている(文献２２)。免疫のために、ＤＮＡを直接に試験対象に注射する方法がUlmerらにより検討されている(文献２３)。免疫原性は、抗原をアジュバントと同時投与することにより大きく改善され、通常の場合、リン酸緩衝生理食塩水の０．０５〜１．０％溶液として使用される。アジュバントは抗原の免疫原性を強化するが、それ自体は免疫原性がない。アジュバントは、抗原を投与部位の近くに保持・貯蔵させ、抗原の免疫系に対するゆっくりした徐放性効果をもたらす。さらに、アジュバントは、免疫系の細胞を抗原が貯蔵されている場所に引出し、その細胞に免疫応答を誘発させる作用がある。免疫刺激剤またはアジュバントは、ワクチンに対する宿主の免疫応答を改善する薬剤として長年使用されている。リポ多糖のような内因性のアジュバントは、通常、ワクチンとして使用される弱毒化細菌の構成成分である。外因性のアジュバントは、通常、非共有的に抗原に結合している免疫調整剤であり、宿主の免疫応答機構を強化するものとして調製される。このように、アジュバントは、非経口的に投与された抗原に対する免疫応答を強化するものとして認められている。アジュバントには、毒性を有し、望ましくない副作用を起こすものもあり、それらはヒトまたは多くの動物には使用できない。実際のところ、通常、ヒトおよび動物ワクチン用のアジュバントとして使用されているのは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムのみである。ジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体応答を増加させる明ばんの有効性についてはすでによく認識されており、例えば、ＨＢｓＡＧワクチンには、明ばんがアジュバントとして使用されている。明ばんが非常に有益なアジュバントである分野もあるが、一方限界もある。明ばんは、インフルエンザのワクチンではアジュバントとして効果はないし、細胞性免疫応答を刺激する作用もない。マウスにおいては、明ばんをアジュバントとして使用した抗原により誘導された抗体は、主として、ＩｇＧ１アイソタイプのものであり、２．３のワクチンによる予防効果はない。広範囲の外因性アジュバントは、抗原に対する潜在的な免疫応答を誘導する。このようなアジュバントとして、膜タンパク抗原と錯体を作るサポニン(免疫刺激錯体)、鉱物油と結合したプルロン高分子物質、死マイコバクレリア、フロインド完全アジュバント、ムラミルジペプタイド(ＭＤＰ)、リポ多糖、リピドＡ、リポソームなどがある。効果的に体液性および細胞性免疫を誘発するために、免疫原をアジュバントの中で乳化させて使用することがよくある。多くのアジュバントには毒性があり、肉芽腫、急性および慢性炎症を引き起こしたり（フロインド完全アジュバント） (ＦＣＡ)、細胞崩壊（サポニンおよびプルロン高分子）や、発熱、関節炎、全部ブドウ膜炎（ＬＰＳ、ＭＤＰ）の原因となる。ＦＣＡは、優れたアジュバントであり、研究用として広く使用されているが、毒性があるので、ヒトおよび動物用のワクチンでは使用許可がなされていない。理想的なアジュバントの特性としては下記のことが挙げられる。（１）毒性がないこと。（２）長時間持続する免疫応答を刺激する能力があること。（３）生産が簡単であり、長期保存でも安定性があること。（４）種々の経路で投与された抗原に対して、体液性、細胞性の両方の免疫応答を誘起させること。（５）他のアジュバントとの相乗効果を発揮すること。（６）抗原提示細胞（ＡＰＣ）との選択的な相互作用をする能力があること。（７）適当なＴ_H１またはＴ_H２細胞特異的免疫応答を誘起する特別な能力があること。（８）抗原に対する適当な抗体アイソタイプレベル（例えば、ＩｇＡ）を選択的に増加させる能力があること。公告日が１９８９年８月８日である米国特許第４，８５５，２８３（Lockhoff ら）（これは本出願でも参考文献として引用）には、Ｎ−グリコシルアミド、Ｎ ―グリコシルウリア、Ｎ−グリコシルカーバメートを含むグリコリピド類似体( これらは糖残基がアミノ酸で置換されている)が、免疫調整剤またはアジュバントとして使用できることを開示している。Lockhoffら（１９９１）（文献２４）は、グリコホスホリピドやグリコグリセロリピドのような天然に存在するグリコリピドと構造上の類似性のあるＮ−グリコリピド類似体は、単純ヘルペスウイルスワクチンと仮性狂犬病ウイルスワクチンと併用した場合には、強い免疫応答を誘起する能力があることを報告している。ある種のグリコリピドが、アノマー炭素原子により糖と直接に結合している長鎖アルカリアミンと脂肪酸から合成されており、これは天然のリピドの機能をまねたものである。米国特許第４，２５８，０２９(Moloney、現在は譲受人に譲渡されている。本出願でも引用)は、オクタデシル・チロシン・ヒドロクロリド（ＯＴＨ）が、破傷風トキソイドとホルマリンで不活化させたタイプＩ，ＩＩ，ＩＩＩポリオウイルス・ワクチンとの錯体を形成して、アジュバントとして機能することを示している。また、Nixonら（１９９０）（文献２５）は、組み換えＢ型肝炎ウイルス・表面抗原と錯体を形成している芳香族アミノ酸のオクタデシルエステルが、宿主のＢ型肝炎ウイルスに対する免疫応答を強化することを報告している。２．免疫検定（イムノアッセイ）本発明にかかるトランスフェリン受容体タンパク質、その類似体および／または、そのフラグメントは免疫原、ＥＬＩＳＡ(固相酵素免疫検定法)、ＲＩＡおよびその他の非酵素抗体結合検定または抗-モラクセラ菌、トランスフェリン受容体タンパク質抗体の検出手順を含む免疫検定における抗原として有益である。ＥＬＩＳＡ検定において、ＴｆＲタンパク質の部分に対応するトランスフェリン受容体タンパク質、その類似体および／またはそのフラグメントが選択された表面上に固定化される。この表面は、例えば、ボリスチレン・マイクロプレートのようなタンパク質またはペプチドを結合することができるものである。不完全に吸着したトランスフェリン受容体、その類似体および／またはフラグメントを除去するために洗浄をした後、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような非特異的タンパク質またはテスト試料に対して抗原性では中立であることが知られているカゼインを選択された表面に結合させる。これにより、固定表面での非特異的吸着部位がブロッキングされ、抗血清の、表面への非特異的結合が原因となるバックグラウンドを小さくする。その後、固定表面に臨床的または生物学的試料を接触させて、免疫錯体（抗原／抗体）の形成を誘導するような方法で試験をする。この手順には、ＢＳＡやウシγグロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝液（ＰＢＳ）／トゥイーンのような希釈剤で試料を希釈するステップを含む。その後、試料は、約２５℃〜３７℃の温度で、２〜４時間インキュベートされる。インキュベーションの後、試料が付着している表面を、非免疫錯体物質を除去するために洗浄する。この洗浄手順には、ＰＢＳ／トゥイーンまたはホウ酸塩緩衝液のような溶液で洗浄するステップを含む。試料と結合したトランスフェリン受容体タンパク質、その類似体および／またはフラグメントとの間の特異的な免疫錯体の形成およびその後の洗浄に続いて、免疫錯体形成の発生とその発生量を、その免疫錯体を第１の抗体に特異性を有している第２の抗体に触れさせることにより定量する。試料がヒト由来のものであれば、この第２の抗体はヒト免疫グロブリンに特異性を有する抗体、一般にはＩｇＧである。検出手段を提供するために、第２の抗体は適当な色素物質とインキュベートすると発色する酵素活性のような関連活性を有する。分光光度計を使用して発色の度合いを測定することにより定量を実施する。３．ハイブリダイゼーションプローブとしてのシーケンスの使用トランスフェリン受容体遺伝子から成る本発明のヌクレオチド配列を使用することで、モラクセラ菌のすべての菌株由来のトランスフェリン受容体遺伝子の同定とクローニングが可能である。本発明のトランスフェリン受容体遺伝子の配列から成るヌクレオチド配列は、他のＴｆＲ遺伝子の相補的伸長により選択的に複製分子を作製する場合に有益である。他のＴｆＲ遺伝子に対するプローブの選択性の幅を広げるために、多様なハイブリダイゼーション条件を使用することができる。選択性を広げるために、複製の作製では、少ない塩および／または高い温度（例えば、温度を約５０℃〜７０℃にして、０．０２Ｍ〜０．１５ＭＮａＣｌを使用）などの比較的厳しい条件を使用する。温度が約２０℃〜５５℃で、０．１５Ｍ〜０．９ＭＮａＣｌを使用するという、条件がやや緩やかなハイブリダイゼーションでもよい応用分野もある。ハイブリッド複製物質を不安定化させるより多量のホルムアミドを添加することで、ハイブリダイゼーションの条件をより厳しくすることもできる。このように、ハイブリダイゼーション条件を容易に特殊なものにすることができ、一般的には、望ましい結果を得るために多様な方法を選択できる。一般的には、５０％ホルムアミド存在下での、便利なハイブリダイゼーション温度は、以下の通りである。つまり、ターゲットフラグメントに対して９５〜１００％の相同性を有するプローブには４２℃、９０〜９５％の相同性を有するプローブには３７℃、８５〜９０％の相同性を有するプローブには３２℃である。臨床診断のための実施例においては、ハイブリダイゼーションの方法を決定する場合には、本発明のＴｆＲ遺伝子の核酸配列をラベルのような適当な手段と組み合わせて使用することができる。例えば、検出シグナルを出すことができる、アビジン／ビオチン、ジゴキシを使用したラベル標識、放射標識、酵素標識、その他のリガンド標識を含む多様な指示方法が知られている。放射性標識の代わりに、ウレアーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはペロキシダーゼのような酵素標識を使用する診断分野用の実施例もある。酵素標識の場合、ＴｆＲ遺伝子配列を含む試料との特定のハイブリダイゼーションをさせる場合に、ヒトの目に見える、あるいは、分光光度計で観察できる比色基質が知られている。本発明にかかるＴｆＲ遺伝子配列は、溶液ハイブリダィゼーションおよび固相法を採用する実施例において、プローブとしても有用であることを示している。固相法を含む実施例では、浸出液、体液（例：血清、羊水、中耳流出液、唾、気管支肺胞洗浄液（場合によっては組織そのもの）を含む臨床試料から得た試験対象のＤＮＡ（またはＲＮＡ）が吸着されるか、選択したマトリックスまたは表面に付着する。固定された１本鎖核酸が、本発明のＴｆＲ遺伝子またはそのフラグメント核酸配列を含むプローブと、望ましい条件下で、特別にハイブリダイズされる。ここで採用される選択条件は、必要な特別の基準（例えば、Ｇ＋Ｃ含有量、ターゲット核酸の型、核酸のソース、ハイブリダイゼーションプローブのサイズ）に基づいた環境により変動する。非特異的に結合しているプローブ分子を除去するためにハイブリダイズさせた表面を洗浄した後、ラベルを使用して、特別なハイブリダイゼーションまたは定量分析を実施する。モラクセラ菌内に保存されている核酸配列を選択することが好ましい。選択するプローブの長さは、最小で１８ｂｐであり、通常は、およそ３０〜９０ｂｐの範囲である。４．トランスフェリン受容体遺伝子の発現レプリコンおよび宿主細胞と適合する菌由来のコントロール配列を含むプラスミドベクターを、発現システム内でのトランスフェリン受容体遺伝子の発現のために使用できる。ベクターには、通常、複製部位があり、それは、形質転換細胞に発現型選択を与える配列を作る。例えば、大腸菌をアンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性を有し、それにより、細胞の形質転換を容易に見分けることのできるｐＢＲ３２２を使用して形質転換が可能である。ｐＢＲ３２２プラスミド、またはその他の細胞プラスミドまたはファージには、宿主細胞がタンパク質を発現するために利用できるようなプロモータが含まれているか、含まれているように改変されていることが必要である。さらに、宿主に適合するようなレプリコンとコントロール配列を含むファージベクターを、その宿主の形質転換ベクターとして使用可能である。例えば、大腸菌ＬＥ３９２のような宿主細胞を形質転換するために使用できる組み換えファージベクターを作製するために、λＧＥＭ^TM-１１のファージが利用できる。組み換えＤＮＡ構築で通常使用されるプロモータには、β-ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース・プロモータシステム、米国特許第４，９５２，４９６で開示されているＴ７プロモータ・システムのようなその他の細菌プロモータがある。プロモータのヌクレオチド配列の詳細はすでに既知であり、当業者はこれらを機能的に遺伝子に結合させることができる。どのような特別なプロモータを使用するかは、一般的には、どのような結果を望むかにより違ってくるので、選択の問題である。トランスフェリン受容体遺伝子、そのフラグメントまたはその類似体またはその変種の発現に適している宿主としては、大腸菌、バチルス菌、ヘモフィリス菌、真菌、酵母、モラセ七ラ菌、ボルデテラ菌がああり、バキュロウイルス発現システムも使用できる。本発明によるトランスフェリン受容体タンパク質、そのフラグメント、またはその類似体は、モラクセラ菌の培養・精製から得られる天然に存在するＴｆｒタンパク質には微量の毒性があるか、または他の汚染物質を含むために、遺伝子組み換え法により作製することが望ましい。非相同システム内で組み換え技術により作製したＴｆＲタンパク質を使用することで、精製上での汚染物質の混入を最小にする方法で宿主から分離できる。発現のための宿主として、ＬＰＳを持っていない、つまり、エンドトキシンのないグラム陽性細菌を使用することが望ましい。そのような宿主として、バチルス菌があり、これは特に非発熱性のトランスフェリン受容体、そのフラグメントまたはその類似体の生産に有用である。さらに、組み換え法により、Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２またはこれらの類似体やフラグメントの生産と分離が可能である。細菌の寄託カタル球菌株４２２３、Ｑ８由来のトランスフェリン受容体タンパク質をコードする部分を含む数種のプラスミドベクターとカタル球菌株ＲＨ４０８は、本出願より前に、ＡＴＣＣ(住所:12301 Parklawn Drlve,rockville,Maryland,USA,) にブタベスト条約により寄託をしていたものである。本米国特許出願が特許として認められ次第、その寄託をしているベクターと細菌株のサンプルは一般に利用できるようになり、その寄託にアクセスするための制限も無くなる。さらに、寄託したものが分配できなくなれば、その取り替えがなされる。本出願では、説明目的のために、寄託した材料や実施例を示したが、本発明は、ここに寄託された生物材料に限定されるものではないし、実施例で使用したものに限定されない。同じようなベクターや、この出願で記載している抗原をコードしている菌株についても、本発明の範囲内にあるものである。寄託物の概要例本発明の一般的な開示は以上の通りであるが、本発明をさらに詳しく理解できるように、以下では、例について説明をしている。これらの例は、単に例示が目的であって、本発明の範囲を限定するものではない。状況により例の内容や構造を変更することが可能である。特別な用語が使用されているが、それらは説明目的のためであり、それにより限定的な意味をもつものではない。本開示では、分子遺伝学、タンパク質生化学、免疫学の方法が使用されているが、その内容を詳しくは説明しておらず、これらの例も科学文献に報告されているものを含んでいるが、それらの点は本技術分野の当業者には明らかなことである。例１この例は、カタル球菌由来のＴｂｐ１，Ｔｂｐ２タンパク質の調製及びこれらによるモルモットの免疫を説明したものである。Ｔｂｐ１とＴｂｐ２タンパク質は、下記の手順で入手した。鉄欠乏の粗全膜液を、合計容量が３８４ｍｌの５０ｍＭトリス・ＨＣｌ-１Ｍ・ＮａＣｌ（ｐＨ８）で希釈して、その濃度を４ｍｇ／ｍｌとした。膜を０．５Ｍ・ＥＤＴＡの８ｍｌ、３０％サルコシルの８ｍｌを添加して溶解させ、その試料を静かに撹拌しながら、室温で２時間インキュベートした。溶解した膜を１０Ｋ・ｒｐｍで２０分間遠心分離を行った。１５ｍｌのアポ-ｈＴｆ-セファロース／４Ｂをその上清に加え、静かに撹拌しながら、室温にて２時間インキュベートした。その混合液をカラムに注入した。そのカラムを、汚染タンパク質を除去するために、５０ｍｌの５０ｍＭ・トリス・ＨＣｌ-１Ｍ-ＮａＣｌ-２５０ｍＭ塩酸グアニジンで洗浄した。１００ｍｌの１．５Ｍ塩酸グアニジンを添加してカラムからＴｂｐ２を溶出させた。１００ｍｌの３Ｍ塩酸グアニジンを添加することでＴｂｐｌを溶出させた。最初の２０ｍｌの分画を、５０ｍＭトリス・ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を３回取り替えてながら透析をした。試料を−２０℃で貯蔵するか、重炭酸塩アンモニウムで透析し、凍結乾燥した。モルモット(Charles River)に、フロインド完全アジュバントで乳化させた１０μｇのＴｂｐ１またはＴｂｐ２を筋肉内投与することにより免疫した。投与後１４日目、２９日目に、フロインド不完全アジュバントで乳化させたタンパク質を同じ量だけブースタとして投与した。４２日目に血液サンプルを採取して、その血清を使って、細菌の抗体活性を分析した。さらに、イムノブロット法により、全部の抗血清のカタル球菌４２２３タンパク質との反応性を検討した。モルモット抗-カタル球菌４２２３Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２抗血清の細菌抗体活性を以下の方法で測定した。非凝集性のカタル球菌株ＲＨ４０８（分離菌４２２３由来のもの）を２０ｍｌブイヨン（ＢＨＩ）に播種して、１７０ｒｐｍで振動させながら、３７℃で１８時間増殖させた。この培養物の１ｍｌを、２０ｍｌの２５ｍＭエチレンジアミン-ジ-ヒドロキシフェニル酢酸（ＥＤＤＡ、シグマ）を補充したＢＨＩと共にインキュベートするために使用した。この培養物を、５７０ｎｍの吸光度が０．５になるまで増殖させた。細胞を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＶＢＳ）を含む、１４０ｍＭ・ＮａＣｌ、９３ｍＭ・ＮａＨＣＯ₃、０．４ｍＭ・ＣａＣｌ、０．４ｍＭ・ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ、（ｐＨ７．６，ベロナール緩衝液）により１：２００，０００になるように希釈し、氷水に入れた。モルモット抗-カタル球菌４２２３Ｔｂｐ１またはＴｂｐ２抗血清を、事前に採取していた対照抗血清と一緒に、内在性の補体を不活化させるために、５６℃で３０分間加熱した。各抗血清をＶＢＳで２倍に連続希釈したものを、９６ウエル型 NunC１onマイクロプレート（Nunc社、Roskilde,Denmark）のウエルに添加した。希釈は１：８の希釈率で始め、最終的に、各ウエルの容量が２５μｌになるように調製した。希釈した細菌細胞の２５μｌを各ウエルに添加した。モルモット補体(Biowhittaker 社，Walkersville,MD)を、ＶＢＳで１：１０に希釈し、そのうちの２５μｌを各ウエルに添加した。プレートを回転プレート上で７０ｒｐｍで撹拌しながら、３７℃で６０分間インキュベートした。各反応混合物の５０μｌをMuel1er Hinton寒天プレート(Becton-Dicklnson 社,Cockeysvil1e,MD)に移した。プレートを３７℃で７２分間インキュベートし、プレート当たりのコロニー数を計数した。免疫前の血清の殺菌力よりも５０％以上の強い殺菌力のある抗血清における高希釈率の逆数としての殺菌力価を評価した。下表１で示された結果は、カタル球菌を溶菌する抗-Ｔｂｐ１と抗-Ｔｂｐ２モルモット抗血清の能力を示したものである。例２この例は、カタル球菌株４２２３とＱ８由来の染色体ＤＮＡとその調製法を説明したものである。カタル球菌分離菌４２２３をＢＨＩブイヨンに接種して、撹拌しながら、３７゜Ｃで１８時間インキュベートした。細胞を、１０，０００ｘｇで２０分間遠心分離した後、集めた。カタル球菌株４２２３染色体ＤＮＡの抽出にはペレットを使用した。細胞の入ったペレットを１０ｍＭトリス-HCl（ｐＨ７．５）と１．０ｍＭ・ＥＤＴＡ（ＴＥ）の２０ｍｌ溶液中に再懸濁させた。最終濃度５００μｇ／ｍｌ及び１．０でプロナーゼ及びＳＤＳをそれぞれ添加し、この懸濁液を３７゜Ｃで２時間インキュベートした。フェノール、フェノール:クロロフオルム（１：１）およびクロロフォルム：イソアミールアルコール（２４：１）で数回抽出した後、液体抽出物を１．０Ｍ・NaClで温度４℃、４時間、および、ＴＥ（ｐＨ７．５）で、さらに４８時間、３回緩衝液を変えて透析を行った。この透析液に２容量のエタノールを添加し、ＤＮＡをガラス棒に巻き付けた。ＤＮＡを空気で乾燥して、３．０ｍｌの水に溶解させた。分光光度計にて濃度を測定した結果、２９０μｇ／ｍｌであると判明した。カタル球菌株Ｑ８を、例１と同様に、ＢＨＩブイヨンで増殖させた。細胞を、４℃、５０００ｒｍｐで２０分間遠心分離をして、５０ｍｌの培養基からペレットで取り出した。細胞の付いたペレットを１０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭトリス-ＨＣｌ、１ｍＭ-ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に懸濁させ、プロテナーゼＫとＳＤＳを最終濃度５００μｇ／ｍｌ及び１％でそれぞれ添加した。透明な溶解物（リゼイト）が得られるまで、試料を３７℃で４時間インキュベートした。リゼイトを、トリスー飽和フェノール／クロロフォルム（１：１）にて２回抽出し、クロロフォルムで２回抽出した。最終液状産物を、４℃で２４時間、１Ｍ・ＮａＣｌの２ｘ１０００ｍｌで、緩衝液を１回変えて透析し、さらに、４℃で２４時間、ＴＥの２ｘ１０００ｍｌで、緩衝液を１回変えて透析した。最終透析物を１００％エタノールの２容量で沈殿させた。ＤＮＡを巻き取って乾燥して、５〜１０ｍｌのＴＥ緩衝液中に再懸濁させた。例３この例は、ＥＭＢＬ３におけるカタル球菌染色体ライブラリの構造を説明したものである。サイズが１５から２３ｋｂ以内の制限フラグメントの最大量を産生させるのに必要な条件を最適にするために、最終容量が１０μｌである染色体ＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３Ａで消化させた。最適の消化条件で、下記のものを含む１００μｌ容量で大規模な消化がなされるように設定をした。染色体ＤＮＡ（２９０μｇ／ｍｌ）の５０μｌ、水３３μｌ、１０ＸＳａｕ３Ａ緩衝液(New England Biolab 社)の１０μｌ、ＢＳＡ(10mg/ml,New England Biolabs)の１．０μｌ、Ｓａｕ３Ａの６．３μｌ（０．０４Ｕ／μｌ）。３７℃で１５分間インキュベートをした後、１０μｌの１００ｍＭ・トリス- ＨＣｌ（ｐＨ８．０）-１０ｍＭ-ＥＤＴＡ-0.1％ブロモフェノールブル-５０％グリセロール（ローディング緩衝液）を加えて消化を終了させた。４０ｍＭ・トリス・酢酸-２ｍＭ・Ｎａ₂ＥＤＴＡ・２Ｈ₂Ｏ（ｐＨ８．５）（ＴＡＥ緩衝液）を使用して、切断したＤＮＡを、５０Ｖで６時間、０．５％アガロースゲル電気泳動させた。長さが１５〜２３ｋｂの制限フラグメントを含む部分をゲルから切り取り、３．０ｍｌのＴＡＥを含む透析チューブの中に入れた。１．０Ｖ／ｃｍの電場強度を１８時間与えて、ＤＮＡをゲルフラグメントから電気溶出させた。電気溶出させたＤＮＡをフェノールとフェノール：クロロフオルム（１：１）でそれぞれ１回抽出させ、エタノールで沈殿させた。乾燥したＤＮＡを５．０μｌの水に溶解させた。サイズにより分画した染色体ＤＮＡを、最終容積９μｌ中で、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて、ＢａｍＨＩで切断したＥＭＢＬ３アーム(Promega)と結合させた。結合した全体混合物をラムダファージに、市販のパッキングキット（詰め込みキット）(Amersham)を使用して、製造者の指示に従ってパッキングした。パッキングしたＤＮＡライブラリを固体培地で増幅させた。１０ｍＭ・ＭｇＳ０₄（ＯＤ₂₆₀＝０．５）内の大腸菌株ＮＭ５３９の０．１ｍｌ部分を、１５〜２５μｌのパッキングしたＤＮＡライブラリと一緒に３７℃で１５分間インキュベートをした。試料を、１．０％ＢＢＬトリプチカーゼ・ペプトン-０．５％ＮａＣｌ（ＢＢＬトップ・アガロース）を含む３ｍｌの０．６％アガロースと混合して、その混合物を、１．０％ＢＢＬトリプチカーゼ・ペプトン-０．５％ＮａＣｌを含む１．５％寒天プレートにプレーティングした後、３７℃で１８分間インキュベートをした。３ｍｌの５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）−８ｍＭマグネシウムサルファイトヘプタハイドレート（magnesium sulfate heptahyd rate）−１００ｍＭ NaCl-０．０１％（ｗ／ｖ）ジェラチン（ＳＭ緩衝液）を各プレートに添加し、そのプレートを４℃で７時間放置した。ファージを含むＳＭ緩衝液をプレートから集め、一緒にプールをして、クロロフォルムを使用して、４℃でスクリュウカップ内に保管した。カタル球菌株Ｑ８由来の染色体ＤＮＡを、３７℃で３０分間、Ｓａｕ３Ａ／Ｉ（０．１ユニット／３０μｇ−ＤＮＡ）で切断して、０．６％低融点アガロースゲルでサイズごとに分画した。長さが１５〜２３ｋｂであるＤＮＡフラグメントを切り出し、ＤＮＡをＴＡＥ（４０ｍＭトリスアセテートｐＨ８．５，２ｍＭ／ＥＤＴＡ）を含む透析チューブ内において、１５０Ｖで２５分間、電気溶出させた。ＤＮＡをフェノール／クロロフォルム（１：１）で１回抽出し、沈殿させ、水に懸濁させた。ＤＮＡを１晩ＥＭＢＬ３・Ｉアーム(Promega)と結合させ、その結合混合物をラムダ・インビトロ・パッキングキット(Stratagene社)を使用してパッキングを行い、大腸菌ＬＥ３９２細胞にプレーティングした。ライブラリーを滴定し、０．３％クロロフォルム存在下、４℃で貯蔵した。例４この例は、カタル球菌ライブラリのスクリーニングを説明したものである。例３において調製されたＥＭＢＬ３／４２２３試料から取ったファージストックの１０μｌ部分を、１０ｍＭ・ＭｇＳＯ₄（ＯＤ₂₆₀＝０．５）(プレーティング細胞)内の１００μｌの大腸菌株ＬＥ３９２と結合させ、３７℃で１５分間インキュベートをした。試料を３ｍｌのＢＢＬトップアガロースと混合させ、１％バクト・トリプトーン-０．５％バクト・酵母抽出-０．０５％ＮａＣｌ（ＬＢアガロース:Difco）を含み、２００μＭ・ＥＤＤＡを補給した１．５％アガロース・プレートに注入した。このプレートを３７℃で１８時間インキュベートをした。プラークを、標準プロコルを使用して、ニトロセルロース・フイルタ(Amersha m Hybond-CEtract)に載せ、そのフィルタを、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Boehringer）の２０ｍＭ・トリス-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）-１５０ｍＭ・ＮａＣｌ（ＴＢＳ）溶液に室温で３０分間または４℃で１晩浸した。フィルタを室温で少なくとも１時間、または４℃で１８時間、１：１０００に希釈したモルモット抗-カタル球菌４２２３Ｔｂｐ１抗血清を含むＴＢＳ内でインキュベートした。０．０５％トゥイーン２０（ＴＢＳ-Tween）の入ったＴＢＳで４回連続で１０分間洗浄を行った後、このフィルタを、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ｒタンパク質・Ｇ-ＨＲＰ：Zymed）で標識した組み換えタンパク質Ｇの１／４０００希釈を含んだＴＢＳ-トゥイーン内において、室温で３０分間インキュベートした。上記と同様にフィルタを洗浄し、そのフィルタをＣＮ／ＤＡＢ基質溶液（Pierce）に浸した。フィルタを水に浸すことにより、発色を阻止した。陽性のプラークをプレートから抜き取り、それぞれを０．５ｍｌのクロロフォルムを数滴加えたＳＭ緩衝液にプレーティングした。モルモット抗-カタル球菌４２２３Ｔｂｐ１抗血清を使用して、取り上げたプラークが１００％陽性になるまでスクリーニングを２回以上繰り返した。ＥＭＢＬ３／Ｑ８ライブラリを、被覆層としてのＹＴ中の０．７％トップ寒天を使用してＹＴプレート上のＬＥ３９２細胞にプレーティングした。プラークをニトロセルロース・フィルタに載せ、そのフィルタを³²Ｐα-ｄＣＴＰ（ランダム・プライムＤＮＡラベルキット、Boehringer Mannheim社）で標識したオリゴヌクレオチド・プローブで検出した。塩酸ナトリム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）緩衝液（文献２７）中で、温度３７℃で１時間、プリ・ハイブリダイゼーションを実施し、その後、４２℃で１晩ハイブリダイゼーションを行った。プローブは、下記のような４２２３ｔｂｐＡの内部配列を基礎にした。推定のプラークを再度プレーティングして、同じ手順で２．３回スクリーニングした。配列分析のために、ファージクローンＳＬＲＤ−Ａを使用して、ｔｆｒ遺伝子のサブクローン化をした。例５この例は、抗-カタル球菌４２２３Ｔｂｐ１とＴｂｐ２抗血清を使用して行うファージリゼイトのイムノブロット分析を説明したものである。例４で選択されたファージ溶出物により発現したタンパク質を以下の手順で沈殿させた。６０μｌのファージ溶出物を２００μｌの大腸菌ＬＥ３９２プレーティング細胞に結合させ、３７℃で１５分間インキュベートした。混合物を１０ｍｌの１．０％ＮＺアミン・Ａ-０．５％ＮａＣｌ-０．１％カザミノ酸-０．５％酵母抽出物-０．２％硫酸マグネシウム・ヘプタ水和物（ＮＺＣＹＭブイヨン）（２００ｍＭ・ＥＤＤＡを補充）に接種し、撹拌しながら３７℃で１８時間増殖させた。ＤＮアーゼ（ＤＮＡｓｅ）を１．０ｍｌの培養基に添加して、最終濃度を５０μｇ／ｍｌとし、その試料を３７℃で３０分間インキュベートした。トリクロロ酢酸を添加して最終濃度を１２．５％とし、その混合物を氷水内に１５分間放置した。１３，０００ｘｇにて１０分間遠心分離をして、ペレットでタンパク質を取り、そのペレットを１．０ｍｌのアセトンで洗浄した。このペレットを風乾させ、５０μｌの４％ＳＤＳ-２０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）-０．２ｍＭ／ＥＤＴＡ（溶解緩衝液）内に再懸濁させた。１１．５％ゲルを使用したＳＤＳ-ＰＡＧＥ電気泳動を、２５ｍＭトリス-ＨＣ１、２２０ｍＭグリシン-２０％メタノール（移転バッフア）内で、２０Ｖの一定電圧で１８時間実施して、タンパク質をイモビロン−Ｐ(Immobilon-P)フィルタに移した。膜を５％ＢＳＡのＴＢＳ溶液を使用して、室温で３０分間、ブロックした。ブロットを、ＴＢＳ-トゥイーンで１：５００に希釈したモルモット抗- カタル球菌４２２３Ｔｂｐ１抗血清またはモルモット抗-カタル球菌４２２３Ｔｂｐ２抗血清のいずれかに、室温で２時間、曝露させた。ＴＢＳ-トゥイーンによる１０分間洗浄を３回行った後、１：４０００に希釈したｒタンパク質Ｇ-ＨＲＰを含むＴＢＳ-トゥイーン内で膜をインキュベートした。上記の方法で、膜を洗浄し、ＣＮ／ＤＡＢ基質溶液に浸した。ブロットを水に浸すことにより、発色を阻止した。３個のＥＭＢＬ３ファージクローンは、ウエスタンブロット法により、抗-Ｔｂｐ１抗血清と反応した１１５ｋＤａタンパク質と、抗-Ｔｂｐ２抗血清と反応した８０ｋＤａタンパク質の両方を発現し、これにより、カタル球菌のトランスフェリン受容体タンパク質をコードする遺伝子を含むと結論された。例６この例は、カタル球菌４２２３Ｔｂｐ１タンパク質遺伝子，ｔｂｐＡのサブクローニングを説明したものである。ＬＢ寒天プレート上での全面溶菌（コンフルエントリシス）を起こさせるために、例５に記載された組み換えファージのプレートリゼイト培養物を、ファージ溶出物と大腸菌ＬＥ３９２プレーティング細胞を組み合わせることにより調製した。Wizard Lamda Prep DNA精製システム（Promega）を使用して、メーカの指示により、ファージＤＮＡをプレートリゼイトから抽出した。ＥＭＢＬ３クローンＬＭ３−２４には、２つのＳａＩＩ部位に隣接している１３．２ｋｂの挿入フラグメントが含まれていることが判明した。Ｔｂｐ１タンパク質の一部のアミノ酸配列に対応する、２つの縮重オリゴヌクレオチド・プライマーを使用したＰＣＲにより産生された３００塩基対の増幅産物から成るｔｂｐＡ遺伝子に対するプローブを調製した(図１)。プライマ配列は、数種の髄膜炎菌とインフルエンザ菌のｔｂｐＡ遺伝子由来の推定アミノ酸配列に保存されていることが判明しているアミノ酸配列・ＮＥＶＴＧＬＧ(配列番号：１７)と、ＧＡＩＮＥＩＥ(配列番号：１８)を基礎にしている。この増幅産物をｐＣＲＩＩ(Invit rogen社、San Diego,CA)にクローン化して、配列決定をした。推定のアミノ酸配列は、髄膜炎菌とインフルエンザ菌のｔｂｐＡ遺伝子由来の他の推定アミノ酸配列と相同性がある(図１２)。このサブクローンをＮｏｔＩ(New England Biolabs )で線状化し、デゴキシジニン・ランダム標識キットを使用し、メーカの指示に従って標識した(Boehringer Mannheim社)。プローブの濃度は、２ｎｇ／μｌであると推定された。ファージクローン由来のＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｖｒＩＩ、ＳａＩＩ／ＳｐｈＩまたはＳａｌＩ／ＡｖｒＩＩで切断し、０．８％アガロースゲルを使用して電気泳動した。ＬＫＢ・ＶａｃｕＧｅｎｅ・ＸＬ真空移転装置(Pharmacia) を使用して、ＤＮＡをナイロン膜(Genescreen Plus,Dupont)に移転した。転移の後、ブロットを風乾させ、５Ｘ・ＳＳＣ-０．１％・Ｎ-ラウリルサルコシン-０．０２％ドデシル硫酸ナトリム-１．０％ブロッキング試薬(Boehringer Mannhei m社)の１０ｍＭ・マレイン酸-１５ｍＭ・ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）（プレ・ハイブリダイゼーション溶液）溶液中で、プレ・ハイブリダイズさせた。標識したプローブをプレ・ハイブリダイゼーションした溶液に添加して、最終濃度を６ｎｇ／ｍｌとし、プローブ溶液の中でブロットを４２℃で１８時間インキュベートした。ブロットを２Ｘ・ＳＳＣ-０．１％ＳＤＳで、室温で５分間、２回洗浄し、その後、０．１Ｘ−ＳＳＣ-０．１６％・ＳＤＳで、温度６０℃で１５分間、洗浄した。洗浄後、膜を１００ｍＭマレイン酸-１５０ｍＭ・ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）（緩衝液１）で１分間、平衡化させ、その後、１．０％ブロッキング試薬(B oehring Mannheim社)の緩衝液１溶液（緩衝液２）中で、室温で６０分間放置した。ブロットを、緩衝液２で１：５０００に希釈した抗-ＤＩＧアルカリ性フォスファターゼに、室温で３０分間曝露した。緩衝液１で１５分間の洗浄を２回実施した後、ブロットを、１００ｍＭ・トリス-ＨＣｌ（ｐＨ９．５）、１００ｍＭ・ＮａＣｌ、５０ｍＭ／ＭｇＣｌ₂（緩衝液３）で２分間平衡化させた。ブロットを、緩衝液３で１；１００に希釈したLumigenn PPD(Boehringer-Mannhelm社)基質で湿潤化させ、サランラップで包み、３０間Ｘ-線に暴露した。プローブを、３．８ｋｂのＨｉｎＩＩＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ、２．０ｋｂのＡｖｒＩＩ-ＡｖｒＩＩ、４．２ｋｂのＳａｌＩ-ＳｐｈＩフラグメントとハイブリダイズさせた。３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを、ｐＡＣＹＣ１７７にサブクローン化するために、ＥＭＢＬ３クローン由来のファージＤＮＡ、ベクターｐＣＹＣ１７７(New England Biolabs)由来のプラスミドＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断し、０．８％アガロースゲル電気泳動により分画化した。３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｄＩＩＩファージフラグメント及び３．９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ・ｐＡＣＹＣ１７７フラグメントをゲルから切り離し、Genecleanキット(Bio 101 Inc.，LaJolla,CA)を使用し、メーカの指示に従って精製した。精製した挿入フラグメントとベクターを、Ｔ４・ＤＮＡリガーゼ(New England Biolabs)を使用して結合させ、大腸菌ＨＢ１０１に形質転換させた(Gibco BRL)。Qiagen Plasmid Midikit(Qiagen社)を使用して、アンピシリン抵抗性／カナマイシン感受性形質転換体の１つから取り出したＤＮＡを抽出・精製した(このＤＮＡには、３．８ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ挿入フラグメントを有していることが判明した)。ここで得られたサブクローンをｐＬＥＭ３と名付けた。下記の例７で説明しているように、この後に行った配列決定により、ｐＬＥＭ３には、約２．０ｋｂのｔｂｐＡ配列が含まれていることが判明した(図２，５)。残りの１ｋｂのｔｂｐＡ遺伝子をサブクローン化するために、１．６ｋｂのＨｉｄＩＩＩ-ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントをｐＡＣＹＣ１７７にサブクローン化して、電気穿孔法により大腸菌ＨＢ１０１(Gibco BRL)に形質転換させた。Ｍｉｄｉ−ｐｌａｓｍｉｄＤＮＡｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）が１．６ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ挿入断片を含むプラスミドを有すると思われるカナマイシン感受性の形質転換体からのＤＮＡの抽出に利用された。ここで得られたサブクローンをｐＬＭＥ２５と名付けた。例７で説明しているように、配列決定により、ｐＬＥＭ２５には、残りの１ｋｂのｔｂｐＡ遺伝子が含まれていることが判明した(図２，５)。例７この例は、カタル球菌４２２３ｔｂｐＢ遺伝子のサブクローニングを説明したものである。上記で説明したように、本発明に先立って実施した全部のナイセリア菌とヘモフィルス菌では、ｔｂｐＢ遺伝子が、ｔｂｐＡ遺伝子のすぐ上流で見つかっており、これは、カタル球菌４２２３のｔｂｐＡ遺伝子と相同性がある。しかし、カタル球菌４２２３の上流にある配列にはｔｂｐＢをコードしている他の配列とは対応していなかった。ＥＭＢＬ３ファージクローン内にあるｔｂｐＢ遺伝子の位置を特定するために、Ｔｂｐ２タンパク質内の保存性の高いアミノ酸部位由来の縮重プローブを使用して、サザンブロット法を実施した。多数のナイセリア菌とヘモフィリス菌内のＴｂｐ２タンパク質に保存されているＥＧＧＦＹＧＰ(配列番号：３０)をコードしている配列に対応するような縮重オリゴヌクレオチド・プローブを作製した。オリゴヌクレオチド・テーリングキツト(Boehringer Mannheim社)をメーカの指示に従って使用して、プローブを標識した。ＨｉｎｄＩＩＩで切断したＥＭＢＬ３クローンＤＮＡを０．８％アガロースゲルにより分画し、例６の場合と同様に、Geneclean Plusナイロン膜に移した。上記で述べたようなハイブリダイゼーションを行った後、膜を２Ｘ・ＳＳＣ-０．１％ＳＤＳにより、室温で５分間２回、０．１Ｘ・ＳＳＣ-０．１％ＳＤＳにより、５０℃で１５分、２回洗浄した。上記の通り、標識をしたプローブによる探知を行った。このプローブを５．５ｋｂのＮｈｅＩ・ＳａｌＩフラグメントにハイブリダイズさせた。５．５ｋｂのＮｈｅＩ-ＳａｌＩフラグメントをｐＢＲ３２８にサブクローン化した。ＬＥＭ-２４ＤＮＡとｐＢＲ３２８ＤＮＡをＮｈｅＩ-ＳａｌＩで切断して、０．８％アガロースゲル電気泳動した。５．５ｋｂのＮｈＩ-.ＳａｌＩフラグメントおよび４．９ｋｂのｐＢＲ３２８ＮｈｅＩ-ＳａｌＩフラグメントをゲルから切り離し、例６と同様に、Geneleanキットを使用して精製した。そのフラグメントをＴ４ＤＮＡリガーゼで結合させ、大腸菌ＤＨ５に形質転換させた。Mi diプラスミドＤＮＡキット(Qiagen社)を使用して、ＤＮＡを、５．５ｋｂのＮｈｅＩ-ＳａｌＩ挿入フラグメントを含むアンピシリン抵抗性／テトラサイクリン感受性クローンから抽出した。このサブクローンはｐＬＥＭ２３と名付けた。配列決定により、ｐＬＥＭ２３には、２ｋｂのカタル球菌由来のｔｂｐＢ遺伝子が含まれていることが判明した(図２)。例８この例は、カタル球菌Ｑ８ｔｆｒ遺伝子を説明したものである。カタル球菌Ｑ８ｔｆｒ遺伝子を以下のようにサブクローン化した。プレートでファージＤＮＡを調製した。簡単に言えば、３本のコンフルエントプレートからトップアガロース層を掻き取り、９ｍｌのＳＭ緩衝液（０．１Ｍ・ＮａＣｌ、０．２％ＭｇＳＯ₄、５０ｍＭトリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．６，０．０１％ジェラチン）に入れ、それに１００μｌのクロロフォルムを添加した。混合物を１０分間ボルテックスにかけた後、室温で２時間インキュベートした。ＳＳ３４ロータ(Sor vall model RC5C)内で、８０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離をして、細胞破片を除去した。ファージを、７０．１Ｔｉロータ（ベックマンモデルＬ８−８０）内で、３５０００ｒｐｍ、１０℃で２時間遠心分離にかけ、ペレットで取り出し、５００μｌのＳＭ緩衝液内で再懸濁させた。試料を４℃で１晩インキュベートし、ＲＮＡｓｅとＤＮＡｓｅを添加して、最終濃度をそれぞれ４０μｇ／ｍｌと１０μｇ／ｍｌとし、混合物を３７℃で１時間インキュベートした。１０μｌの０．５Ｍ／ＥＤＴＡと５μｌの１０％ＳＤＳをその混合物に添加し、サンプルを６゜Ｃで１５分間インキュベートした。混合物をフェノール／クロロフォルム（１：１）で２回、クロロフォルムで２回抽出し、絶対エタノールの２．５容量を添加してＤＮＡを沈殿させた。部分制限地図を作製し、図４で示したように、ＥＭＢＬ３由来の外部ＳａｌＩ部位、内部ＡｖｒＩＩまたはＥｃｏＲＩ部位を使用してフラグメントをサブクローンした。このサブクローニングを促進するために、新規の複数クローニング部位をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．ＳＫ(Straragene)に導入するプラスミドｐＳＫＭＡを構築した。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ．ＳＫのＭｓｔＩ、ＬＳｆｉＩ、ＳａＩＩとＨｉｎｄＩＩＩ部位との間のＡｖｒＩＩのための制限酵素切断位置を導入するためにオリゴヌクレオチドを使用した。プラスミドｐＳＬＲＤ１には、ｐＳＫＭＡにクローン化された約１．５ｋｂのＳａｌＩ-ＡｖｒＩＩフラグメントが含まれ、プラスミドｐＳＬＲＤ２とｐＳＬＲＤ４には、ｐＳＫＭＡにクローン化された約２ｋｂおよび４ｋｂのＡｖｒＩＩフラグメントがそれぞれ含まれる。すなわち、完全ｔｂｐＡ遺伝子が含まれる。プラスミドｐＳＬＲＤ３には、ｐＳＫＭＡにクローン化された約２．３ｋｂのＡｖｒＩＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントが含まれ、プラスミドＳＬＲＤ５は、ｐＳＫＭＡにクローン化された２２．７ｋｂＥｃｏＲＩ-ＥｃｏＲＩフラグメントである。これらの２つのクローンには、完全ｔｂｐＢ遺伝子が含まれる(図７)。例９この例は、カタル球菌ｔｂｐ遺伝子の配列を説明したものである。例６〜８に従ってサブクローン化したｔｂｐ遺伝子の両方の鎖を、Applied Bi osystem DNAシーケンサーを使用して配列決定をした。図５と図１０は、カタル球菌４２２３とＱ８ｔｂｐＡ遺伝子の配列をそれぞれ示している。誘導アミノ酸配列を、髄膜炎菌(Neisseriae meningitidis)、淋菌(Neisseriae gonorrhoeae) 、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の配列を含む別のＴｂｐ１アミノ酸配列と比較した(図１２)。図６と図１１は、カタル球菌４２２３とＱ８ｔｂｐＢ遺伝子の配列をそれぞれ示している。カタル球菌４２２３のｔｂｐＢ遺伝子の推定の開始部分の配列を得るために、配列データをクローンＬＥＭ３-２４・ＤＮＡから直接に入手した。クローンＤＳ-１７５４-１をスクリーニングすることにより配列の正確度を確認した。カタル球菌４２２３とＱ８のｔｂｐＢ遺伝子から翻訳されたものの配列は、髄膜炎菌、淋菌、インフルエンザ菌の推定のＴｂｐ２アミノ酸配列との相同性が認められた(図１３)。例１０この例は、組み換えＴｂｐ１タンパク質を産生させるための発現ベクターの作製について説明したものである。構築スキームは図１４に示してある。例６で説明したような、サブクローンｐＬＥＭ３由来のプラスミドＤＮＡを、ｔｂｐＡ遺伝子の約２／３を含む１．８４ｋｂのＢｇｌＩ-ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを生産するために、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｇｌＩで切断した。共同移入をした１．８９ｋｂのＢｇｌＩ-ＨｉｎｄＩＩＩベクターフラグメントを除去するために、消化物にＢａｍＨＩを添加した。さらに、ベクターｐＴ７−７から得られたプラスミドＤＮＡをＮｄｅＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した。ｔｂｐＡ遺伝子の開始部分を作製するために、ｔｂｐＡ遺伝子のＢｇｌＩ部位までの最初の６１塩基に基づいて、オリゴヌクレオチドを合成した。ＮｄｅＩ部位を５'末端に導入した。精製した挿入物、ベクター、オリゴヌクレチドを、Ｔ４リガーゼを用いて結合させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ＤＮＡを、正確な制限部位（ｐＬＥＭ２７）を含む４．４ｋｂのアンピシリン抵抗性の形質転換細胞のうちの１つから精製した。精製したｐＬＥＭ２７・ＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩで切断して、例６に記載されたような、ｐＬＥＭ２５の１．６ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ-ＨｉｎｄｉｉＩ挿入物フラグメントに結合させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換させた。ＤＮＡを、正確な制限部位（ｐＬＥＭ２９）を含むアンピシリン抵抗性形質転換細胞から精製し、大腸菌ｐＬＥＭ２９Ｂ-１を産生するために、電気穿孔法によりＢＬ２１（ＤＥ３）(Novagen社,Madison WI)に形質転換した。単一の分離形質転換コロニーを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１００ｍｌのＹＴブイヨンをインキュベートし、その培養物を２００ｒｍｐで振とうしながら、３７℃で１晩増殖させた。２００μｌの１夜培養物を１００ μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＹＴブイヨンに接種し、５７８ｎｍでの吸光度が０．３５になるまで、３７℃で増殖させた。３０μｌの１００ｍＭ／ＩＰＴＧを添加することにより、その培養物を誘導し、３７℃で、さらに３時間追加して増殖させた。１ｍｌの培養物を誘導時(ｔ＝０)、１時間後(ｔ＝１)、３時間後（ｔ−３）に取り出した。１ｍｌの試料を、遠心分離してペレットで採取し、４％ＳＤＳ-２０ｍＭトリス・Ｃｌ（ｐＨ８）−２００μＭ・ＥＤＴＡ（溶解緩衝液）中で再懸濁させた。試料を１１．５％ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲル上で分画し、Immobilonフィルタ(Amersham社)に移した。１：１０００に希釈した抗-Ｔｂｐｌ（カタル球菌４２２３）抗血清を第１抗体として、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ(Zymd)結合ｒｐｒｏｔｅｉｎＧを第２抗体として使用した、ブロットを発生させた。化学発光基質(Lumiglo; Kirkegaard and Laboratories,Gait hersburg,MD)を使用して検出を実施した。誘導した組み換えタンパク質がクマシブルー染色ゲル上に観察できた。ウエスタンブロット法で、抗-Ｔｂｐ１（４２２３）により、組み換えタンパク質が確認できた。例１１この例は、カタル球菌４２２３の組み換えＴｂｐ１の抽出と精製を説明したものである。図１６で示された手順により、細胞封入体に含まれている組み換えＴｂｐ１タンパク質をｔｂｐＡ遺伝子（例１０）を発現する大腸菌細胞から精製した。例１０で記載された方法で作製した５００ｍｌの培養物から得た大腸菌細胞を、０．１Ｍ・ＮａＣｌと５ｍＭ・ＡＥＢＳＦ（プロテアーゼ阻害剤）を含む５０ｍｌの５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で懸濁させ、その後、超音波処理（３ｘ１０分、７０％デューティサイクル）により破壊させた。抽出物を２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離を行い、その上清（大腸菌由来の溶解性タンパク質を８５％以上含む）を破棄した。０．５％TritonX-100 および１０ｍＭ・ＥＤＴＡを含む５０ｍｌの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中で、残りのペレットについても、抽出を行った。２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離をした後、残留溶解性タンパク質と膜タンパク質（これが大部分）を含む上清を破棄した。２Ｍ尿素および５ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含む５０ｍｌの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中で、残りのペレット（図１６，ＰＰＴ₂）についても、抽出を行った。２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離を行った後、上記のような抽出をして得られたペレット（図１６，ＰＰＴ₃）には、精製した細胞封入体を含んでいた。６Ｍ塩酸グアニジンと５ｍＭ・ＤＴＴを含むＰＰＴ３の５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）溶液からＴｂｐ１を溶解させた。遠心分離をした後、その上清を、さらに２Ｍ塩酸グアニジンと５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で平衡化させたSuperdex200ゲル濾過カラム上で精製した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、精製したＴｂｐ１を含む分画をプールした。最終濃度が０．１％になるように、そのプールをしたＴｂｐ１分画にトリトンＸ−１００を添加した。この分画を、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）にて、４℃で一晩透析し、その後、２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離を行った。この条件下で溶解性であるタンパク質を精製したＴｂｐ１を−２０℃で貯蔵した。図１６で示された精製手順により純度が少なくも７０％（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析）であるＴｂｐ１タンパク質を生産できた(図１７)。例１２この例は、カタル球菌４２２３の、リーダ配列のないｒＴｂｐ２タンパク質の発現プラスミドの構築について説明したものである。図１８は、ｒＴｂｐ２を発現するプラスミドのための構築スキームを示したものである。成熟タンパク質をコードするカタル球菌４２２３ｔｂｐＢ遺伝子の最初の約５８ｂｐを構築するためにオリゴヌクレオチドを使用した。ＮｄｅＩ部位をオリゴヌクレオチドの５'末端に組み込んだ。例７での調製と同じように、ｐＬＥＭ２３由来の約１ｋｂのｔｂｐＢ遺伝子を含むＮｈｅＩ-ＣｌａＩフラグメントを上記のオリゴヌクレオチドに結合させ、ＮｄｅＩ−ＣｌａＩで切断したｐＴ７−７に挿入した。こうすることで、ｔｂｐＢの5'末端の半分が含まれるｐＬＥＭ３１が産生された。同じように、ｔｂｐＢ遺伝子の、ＡｖａＩＩ部位から遺伝子の末端までの最後の約１０４ｂｐを構築するために、オリゴヌクレオチドを使用した。ＢａｍＨＩ部位を、オリゴヌクレオチドの3'末端に導入した。約０．９ｋｂのｔｂｐＢ遺伝子の3'末端を含むｐＬＥＭ２３由来のＣｌａＩ− AvaIIフラグメントをＡｖａIＩ-ＢａｍＨＩオリゴヌクレチドに結合させ、ＣｌａＩ-ＢａｍＨＩで切断したｐＴ７−７に挿入して、Ｔ７プロモータの制御下にある全長のｔｂｐＢを有するｐＬＥＭ３３を産生させた。ｐＬＥＭ３３Ｂ-１を作製するために、ｐＬＥＭ３３からＤＮＡを精製し、電気穿孔によりエレクトロコンピテントＢＬ２１（DE ３）細胞に形質転換させた( Novagen社:Madison、I)。例１０で記載したような方法で、p LEM33B-１株を増殖させ、ＩＰＴＧを使用して誘導した。発現したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶解させ、適当なメンブレンに移してイムノブロットを実施した。第１の抗体として、１：４０００に希釈した抗-４２２３・Ｔｂｐ２抗血清を、第２の抗体としてホースラディッシュ・ペロキシダーゼ(Zymed)と接合させたｒｐｒｏｔｅｉｎＧを使用してブロットを作製した。検出には化学発光物質(Lumiglo,Kirkegaar d and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)を使用した。クマシブルー染色ゲル上に誘導した組み換えタンパク質を目で確認できた(図１９)。ウエスタンブロット法を使用することで、抗-４２２３Ｔｂｐ２抗血清により組み換えタンパク質を確認できた。例１３この例は、カタル球菌のリーダ配列のある、ｒＴｂｐ２の発現プラスミドの作製について説明したものである。図１８は、構築スキームを示したものである。ＮｈｅＩ部位までのｔｂｐＢ遺伝子の最初の約１１５ｂｐを構築するために、カタル球菌４２２３ｔｂｐＢ遺伝子の、天然リーダ配列を含むオリゴヌクレオチドを使用した。ＮｄｅＩ部位をオリゴヌクレチドの5'末端に導入した。ＮｄｅＩ-ＮｈｅＩオリゴヌクレオチドを、ＮｄｅＩ-ＮｈｅＩで切断したｐＬＥＭ３３に結合させ、リーダ配列のあるＴｂｐ２タンパク質をコードしている全長の４２２３ｔｂｐＢ遺伝子を含むｐＬＥＭ３７を作製した。ｐＬＥＭ３７Ｂ−２を作製するために、ｐＬＥＭ３７から得たＤＮＡを精製し、電気穿孔により、エレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換した(Novagen 社，Madison,WI)。例１０に記載されたと同じ方法で、ＬＥＭ３７Ｂ−２を増殖させ、ＩＰＴＧを使用して誘導した。発現したタンパク質をＳＤＳ −ＰＡＧＥにより溶解させ、適当なメンブレンに移してイムノブロットを行った。第１の抗体として、１：４０００に希釈した抗.４２２３・Ｔｂｐ２抗血清を、第２の抗体としてホースラディッシュ・ペロキシダーゼ(Zymed)と接合させたｒｐｒｏｔｅｉｎＧを使用して、ブロットを作製した。検出には化学発光物質(L umiglo,Kirkegaard and Perry Laboratories，Gaithersburg,MD)を使用した。クーマシーブル染色ゲル上に誘導した組み換えタンパク質を目で確認できた(図１９)。ウエスタンブロット法を使用して、抗-４２２３Ｔｂｐ２抗血清により組み換えタンパク質を確認できた。例１４この例は、カタル球菌Ｑ８の、リーダ配列のないｒＴｂｐ２の発現プラスミドの構築を説明したものである。図２０は、ｒＴｂｐ２タンパク質の構築スキームを示したものである。カタル球菌のｔｂｐＢ遺伝子の5'末端において、成熟タンパク質のＣｙｓ¹コドンからＢａｍＩ制限部位までをＰＣＲ増幅させた。ＮｄｅＩ制限部位を、後でｐＴ７−７にクローン化できるように5'末端に導入した。最終ＰＣＲフラグメントの長さは２３８ｂｐであった。ＰＣＲプライマは以下の通りである。例８の場合と同様に、Ｑ８ｔｂｐＢ遺伝子を、プラスミドＳＬＲＤ３とＳＬＲＤ５に含まれていた２つのフラグメントにサブクローン化した。ＳＬＲＤ５をＥｃｏＲＩとＤｒａＩで切断し(これにより、ｔｂｐＢの3'末端を離す)、約６１９ｂｐのフラグメントを、ＥｃｏＲＩとＳｍａＩですでに切断してあるＳＬＲＤ３に挿入することにより、全長のｔｂｐＢ遺伝子を含むプラスミドＳＬＲＤ３−５を構築した。ＳＬＲＤ３−５から得た１．８５ｋｂ・Ｂｓｍ・Ｉ−ＢａｍＨ・Ｉフラグメントを、２３８ｂｐ／ＰＣＲフラグメントと結合させ、ＮｄｅＩとＢａｍＨＩですでに切断されているｐＴ７−７に挿入し、プラスミドＳＬＲＤ３５Ｂを作製した。このプラスミドには、Ｔ７プロモータの制御下にあるリーダ配列のない全長のｔｂｐＢ遺伝子が含まれている。ＳＬＲＤ３５ＢＤ株を作製するために、ＳＬＲＤ３５Ｂから得たＤＮＡを精製し、電気穿孔により、エレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換させ(Novagen社,Madison,WI)、例１０に記載されたと同じ方法で増殖させ、ＩＰＴＧを使用して誘導した。発現したタンパク質4は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶解させ、クマシブルー染色で誘導したＴｂｐ２タンパク質を観察し、その結果、目で確認できた。例１５この例は、カタル球菌Ｑ８の、リーダ配列のあるＴｂｐ２の発現プラスミドの作製について説明している。図２０は、ｒＴｂｐ２の構築スキームを示したものである。カタル球菌のＱ８ｔｂｐＢ遺伝子の5'末端を、ＡＴＧスタートコドンからＢａｍＩ制限部位までＰＣＲ増幅させた。5'末端でＮｄｅＩ部位を調整して、ｐＴ７−７発現ベクタへのクローニングを促進させた。その結果、最終ＰＣＲフラグメントの長さは２９５ｂｐとなった。ＰＣＲプライマは以下の通りであった。ＳＬＲＤ３−５（例１４）をＢｓｍＩとＢａｍＨＩで切断して、１．８５ｋｂのフラグメントを作製し、これを２９５ｂｐのＰＣＲフラグメントに結合させ、ＮｄｅＩおよびＢａｍＩですでに切断してあるｐＴ７−７に結合させた。このようにして作製されたプラスミドＳＬＲＤ３５Ａには、Ｔ７プロモータの制御下にある内在性のリーダ配列を有する全長のＱ８ｔｂｐＢ遺伝子が含まれていた。ＳＬＲＤ３５ＡＤ株を作製するために、ＳＬＲＤ３５Ａから得たＤＮＡを精製し、電気穿孔により、エレクトロコンピテントＢＬ２１（ＤＥ３）細胞に形質転換させ、例１０に記載されたと同じ方法で、ＳＬＲＤ３５Ａを増殖させ、ＩＰＴＧを使用して誘導した。発現したタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで溶解させ、クーマシーブル染色で、誘導したＴｂｐ２タンパク質を観察し、その結果、目で確認できた。例１６この例は、大腸菌からのカタル球菌４２２３とＱ８のｒＴｂｐ２の抽出・精製を説明したものである。細胞封入体内にＴｂｐ２を産生させるために、ｐＬＥＭ３７Ｂ（４２２３）とＳＬＲＤ３５ＡＤ（Ｑ８）の形質転換細胞を増殖させ、その後、Ｔｂｐ２を図２２のスキームに従って精製した。５００ｍｌ培養からの大腸菌細胞を、５ｍＭ・ＡＥＢＳＦ（プロテアーゼ阻害剤）を含む５０ｍｌの５０ｍＭトリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．０懸濁化させ、超音波（３ｘ１０分、７０％デューティ・サイクル）により破壊させた。抽出物を、２０，０００ｘｇで３０分間遠心分離し、その上清（大腸菌の溶解性タンパク質の９５％以上を含む）を廃棄した。残りのペレット（ＰＰＴ₁）を、０．５％のTriton X-100と１０ｍＭ／ＥＤＴＡを含む５０ｍｌの５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）中でさらに抽出させた。混合物を、４℃で少なくとも２時間、撹拌して、２０，０００ｘｇで３０分間、遠心分離を行い、残留溶解タンパク質を含み、大部分を占める膜タンパク質を含む上清を廃棄した。上記の抽出を行った後に得られたペレット（ＰＰＴ₂）には、細胞封入体が含まれていた。Ｔｂｐ２タンパク質を、６Ｍグアニジンと５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）に溶解させた。遠心分離を行った後、２Ｍグアニジンと５ｍＭＤＴＴを含む５０ｍＭトリスで平衡化したSuperdex200ゲル濾過カラムを使用して、上清をさらに精製した。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、精製Ｔｂｐ２を含むものをプールした。Triton X-100をプールしたＴｂｐ２分画に加えて、最終濃度が０．１％になるようにした。分画をＰＢＳを使用して４℃ で一晩透析した。そのタンパク質は、この条件下で溶解性であった。精製したＴｂｐ２を＝２０℃で貯蔵した。図２２は、株４２２３（パネルＡ）とＱ８（パネルＢ）由来のｒＴｂｐ２の精製プロセスの分画ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示したものである。ｒＴｂｐ２の純度は、少なくとも７０％であった。５匹のBALB／ｃからなるマウスの群に、カタル球菌株４２２３とＱ８から精製したｒＴｂｐ２(０．３〜１０ｍｇ）を、ＡｌＰＯ₄の存在下または非存在下で(１回投与当たり１．５ｍｇ)、第１日目、２９日目、４３日目に、３回皮内（ｓ．ｃ．）注射をした。抗-ｒＴｂｐ２抗体力価のＥＩＡ分析のために、１４日目、２８日目、４２日目、５６日目に採血した。第１日目に、２匹のウサギと２匹のモルモットに対して、完全フロインドアジュバントで乳化させた精製ｒＴｂｐ２タンパク質の５ｍｇ投与量を筋肉内経由で免疫した。これらの動物に対して、第１４日目、２９日目に、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）で乳化させた同容量のタンパク質で二次免疫した。第４２日目に、抗-ｒＴｂｐ２抗体力価と抗細菌活性を分析するために採血した。表２は、組み換えトランスフェリン結合タンパク質ｒＴｂｐ１(４２２３)，ｒＴｂｐ２(４２２３)，ｒＴｐ２（Ｑ８）によって生成された抗体の、カタル球菌株４２２３とＱ８由来に対する抗細菌活性を示したものである。例１７この例は、Ｔｂｐ２のヒトトランスフェリンに対するインビトロでの結合を説明したものである。改良型のSchryvers and Lee（文献２８）の方法に従って、Ｔｂｐ２のトランスフェリン結合活性を評価した。簡単に言えば、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを使用して、精製したｒＴｂｐ２の連続電気泳動を行った。タンパク質を電気泳動によりＰＶＤＦ膜に移し、ホースラディッシュ・ペロキシダーゼ接合のヒトトランスフェリン（ＨＲＰ−ヒトトランスフェリン、１：５０希釈）（Jackso n ImmunoResearch Labs Inc.,Mississuga Ontario)と一緒に、４℃で一晩インキュベートした。ＨＲＰ活性の検出のために、LumiGLO基板(Kirkegaard & Perry Laboratories,Inc.,Gaithersburg,MD)を、メーカの指示に従って使用した。図２４に示したように、これらの条件下で、４２２３ｒＴｂｐ２とＱ８ｒＴｂｐ２の両方がヒトトランスフェリンに結合した。例１８この例は、カタル球菌株由来のＴｂｐ２抗原の保存性を説明したものである。組み換えＴｂｐ２タンパク質を発現するカタル球菌と大腸菌株の全細胞リゼートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、分離し、電気泳動によりＰＶＤＦ膜に移転させた。Ｔｂｐ２を検出するために、モルモット抗-４２２３ｒＴｂｐ２または抗-Ｑ８ｒＴｂｐ２抗血清を第１抗体として、ヤギ抗-モルモット抗体と接合したアルカリ性ホスファターゼを第２抗体として使用した。カタル球菌３，５６，１３５，５８５，４２２３，５１９１，８１８５、ＡＴＣＣ２５２４０を試験した結果、その全部が、抗-４２２３ｒＴｂｐ２または抗-Ｑ８ｒＴｂｐ２抗体に対して特定の反応性を示した(図２５)。表３は、１つのカタル球菌株由来の抗-ｒＴｂｐ２抗体の、相同または非相同カタル球菌株由来の天然または組み換えタンパク質を認識する能力を示したものである。例１９この例は、カタル球菌Ｒ１由来のｔｂｐＢ遺伝子のＰＣＲ増幅と増幅したＲ１・ｔｂｐＢ遺伝子のキャラクタリゼーションを説明したものである。標準技術を使用して、カタル球菌株Ｒ１由来の染色体ＤＮＡを調製した。オリゴヌクレオチドセンスプライマーは、カタル球菌４２２３ｔｂｐＢ遺伝子の約２７４塩基上流の部位を基礎にし、そして、アンチセンス・プライマーは、４２２３ｔｂｐＢの末端から約１１塩基下流の部位を基礎にした。下記の配列のプライマーを使用した。各反応チューブには、１０ｍＭトリス-ＨＣＬ(ｐＨ８．８５)、２５ｍＭ-ＫＣｌ、５ｍＭ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、２ｍＭ・ＭｇＳ０₄、８００ｍＭ・ｄＮＴＰｓ、１．０ｍｇのプライマー４９４０，１．０ｍｇのプライマー４９６７，１０ｎｇのＲ１・ＤＮＡ、２．５Ｕ・Ｐｗｏ・ＤＮＡポリメラーゼ(Boehringer Mannheim) が含まれ、総容量は１００μｌであった。サーモサイクラーを５分間９５℃にプログラムし、さらに、３０秒で９５℃を２５回、４５秒で５０℃、７２℃で２分、最後に７２で１０分にプログラムした。Geneclean(BIO 101)を、メーカの指示に従って使用して、増幅産物を精製した。図２６は、カタル球菌株Ｒ１・ｔｂｐＢの部分制限地図である。図２７は、ＰＣＲ増幅したＲ１・ｔｂｐＢ遺伝子のヌクレオチド配列とそれから推定されるアミノ酸配列である。Ｒ１・ｔｂｐＢ遺伝子は、分子量が７６．８ｋＤａである７１４アミノ酸タンパク質をコードする。Ｒ１・Ｔｂｐ２タンパク質のリーダ配列は、４２２３、Ｑ８Ｔｂｐ２タンパク質のリーダ配列と同じである。推定されたＲ１・Ｔｂｐ２配列を４２２３・Ｔｂｐ２配列を並べてみた時、その配列の８３％が同一であり、８８％が相同であった(図２８)。インフルエンザ菌や髄膜炎菌のＴｂｐ２タンパク質や他のカタル球菌株由来のＴｂｐ２タンパク質で見つかったような、保存されているＬＥＧＧＦＹＧ(配列番号：５０)エピトープが存在した。開示の概要本開示の概要として、本発明は、カタル球菌のトランスフェリン受容体遺伝子配列、これらの遺伝子の塩基配列、これらの遺伝子の推定塩基配列を含む精製・分離したＤＮＡ分子を提供することである。これらの遺伝子、ＤＮＡ配列は、診断、免疫、診断薬や免疫製剤の生産に有用である。本発明にかかるワクチンなどの発現組み換えＴｂｐ１および／またはＴｂｐ２タンパク質、その断片や類似体に基礎を置いた免疫原成分を、モラクセラ菌が原因となる疾病の予防に使用することができる。本発明の範囲内において改変が可能である。表１カタル球菌抗原に対する抗細菌抗体力価１）カタル球菌４２２３から分離された抗原２）ＧＰ＝モルモット３）抗細菌抗体力価：細菌を５０％殺菌する能力のある抗血清の希釈率として、ｌｏｇ₂で表す。４）カタル球菌ＲＨ４０８は、カタル球菌４２２３の非凝集誘導体である。５）カタル球菌Ｑ８は、非凝集性発現型を現すものとして臨床的に分離された菌である。抗細菌抗体力価を細菌を５０％殺菌する能力のある抗血清の希釈率として、ｌｏｇ₂で現す。 NT=無試験表３ＥＬＩＳＡで測定した場合の、４２２３株由来の天然またはｒＴｂｐ２、Ｑ８株由来のｒＴｂｐ２タンパク質を認識する抗-ｒＴｂｐ２抗体の力価

【手続補正書】【提出日】１９９８年９月１０日（１９９８．９．１０）【補正内容】請求の範囲１．モラクセラ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ）菌株のトランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体をコードすることを特徴とする単離精製された核酸分子。２．トランスフェリン受容体タンパク質が、モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体結合タンパク質１（Ｔｂｐ１）である請求項１に記載の核酸分子。３．トランスフェリン受容体タンパク質が、モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体結合タンパク質２（Ｔｂｐ２）である請求項１に記載の核酸分子。４．モラクセラ菌株がカタル球菌（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）株である請求項１〜３のいずれかに記載の核酸分子。５．カタル球菌株がカタル球菌４２２３株、Ｑ８株またはＲ１株である請求項４に記載の核酸分子。６．以下のＤＮＡ配列：（ａ）図５、６、１０、１１及び２７（配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、４５及び４６）に記載されているＤＮＡ配列またはその相補的ＤＮＡ配列、（ｂ）図５、６、１０、１１及び２７(配列番号：９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６及び４７)に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列またはその相補的ＤＮＡ、及び（ｃ）モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体をコードするＤＮＡ配列であって、厳しい条件下で、（ａ）または（ｂ）に記載されたＤＮＡ配列のいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列からなる群から選択されたＤＮＡ配列を有する請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子。７．（ｃ）に規定されているＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）に規定されたＤＮＡ配列のいずれか１つと、少なくとも９０％以上の配列上の同一性を有する請求項６に記載の核酸分子。８．（ｃ）に規定されたＤＮＡ配列が、別のモラクセラ菌株由来のトランスフェリン受容体タンパク質と同等のタンパク質をコードする配列である請求項６または７に記載の核酸分子。９．請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子を含み、宿主の形質転換に適した構造を有することを特徴とするベクター。１０．トランスフェリン受容体の部分断片をコードしており、ｐＬＥＭ３、ｐＬＥＭ２５、ｐＬＥＭ２３、ＤＳ-１６９８-１-１、ＤＳ-１７５４-１、ｐＳＬＲＤ２、ｐＳＬＲＤ３、ｐＳＬＲＤ４及びｐＳＬＲＤ５からなる群から選択される１つのプラスミドの特徴的構造を有している請求項９に記載のベクター。１１．宿主による、前記モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体の発現のために機能的に核酸分子に結合している発現手段を更に有する請求項９に記載のベクター。１２．プラスミドｐＬＥＭ-２９、ｐＬＥＭ-３３、ｐＬＥＭ-３７及びＳＬＲＤ３５-Ａからなる群から選択された１つのプラスミドの特徴的構造を有する請求項１１に記載のベクター。１３．請求項１１または１２に記載された発現用のベクターを有する形質転換宿主。１４．実質的に純粋なモラクセラ菌株からの組換えトランスフェリン受容体、その免疫原性フラグメントまたはその類似体を形成する方法であって、請求項１３に記載の形質転換宿主を増殖させて、トランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体を封入体として発現させる工程と、その封入体を細胞物質と溶解性タンパク質を含まないものに精製する工程と、精製した封入体からトランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体を溶解させる工程と、他の溶解物質を含まないようにトランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体を精製する工程とを有することを特徴とする方法。１５．トランスフェリン受容体タンパク質が、Ｔｂｐ１のみ、Ｔｂｐ２のみ、あるいはＴｂｐ１とＴｂｐ２の混合物として得られる請求項１４の方法。１６．トランスフェリン受容体タンパク質の純度が少なくとも７０％である請求項１４または１５に記載の方法。１７．トランスフェリン受容体タンパク質の純度が少なくとも９０％である請求項１６に記載の方法。１８．請求項１３に記載の形質転換された宿主により生産され得る組換えトランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体。１９．（ａ）モラクセラ菌株の他のタンパク質を含まないモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体結合蛋白質１（Ｔｂｐ１）、または（ｂ）モラクセラ菌株の他のタンパク質を含まないモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体結合蛋白質２（Ｔｂｐ２）である請求項１８に記載の組換えトランスフェリン受容体タンパク質。２０．免疫原性の組成物であって、以下の（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）：（Ａ）モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体をコードしている単離精製された核酸分子；（Ｂ）（ａ）図５、６、１０、１１及び２７（配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、４５及び４６）に記載されているＤＮＡ配列またはその相補的ＤＮＡ配列、（ｂ）図５、６、１０、１１及び２７（配列番号：９、１０、１１，１２、１３、１４、１５、１６及び４７）に記載されているアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列またはその相補的ＤＮＡ配列、（ｃ）モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードするＤＮＡ配列であって、厳しい条件下で（ａ）または（ｂ）に規定されたＤＮＡ配列のいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列からなる群から選択されたＤＮＡ配列を有する、モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードする単離精製されたＤＮＡ配列；（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に規定された核酸分子と、組換えトランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体の宿主での発現のために、該核酸分子と機能的に結合した発現手段とを有する発現ベクターを有する形質転換された宿主によって生産され得る、組換えトランスフェリン受容体タンパク質、その免疫原性フラグメントまたはその類似体、から選択された少なくとも１つの活性成分と、該活性成分の薬学的に許容される担体とを含み、該少なくとも１つの活性成分が、免疫対象の宿主への投与時に免疫応答を引き起こすことを特徴とする組成物。２１．試料中におけるモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードする核酸分子の存在を決定する方法であって、（ａ）試料に、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子を接触させ、該核酸分子と、該試料中に含まれる該核酸分子とハイブリダイズ可能なモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードする核酸分子との二本鎖体を形成する工程と、（ｂ）該二本鎖体を検出する工程とを有することを特徴とする方法。２２．試料中におけるモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードする核酸分子の存在を決定するための診断用のキットであって、（ａ）請求項１〜８のいずれかに記載の核酸分子、（ｂ）該核酸分子と、該試料中に含まれる該核酸分子とハイブリダイズ可能なモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードする核酸分子との二本鎖体を形成するための手段と、（ｃ）該二本鎖体の産生を検出するための手段とを有することを特徴とするキット。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｆ 33/569 33/68 33/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ハークネス、ロビン、イー. カナダ国エム２ケー１ビー８オンタリオ州ウィロウダールシェパードアヴェニューイースト 640 アパートメント 1706番 (72)発明者ルースモアー、シーナ、エム. カナダ国エル４ジー４アール４オンタリオ州オーロラクロフォードローズドライヴ 70 (72)発明者デュ、ラン―パンカナダ国エル４ジェイ７ワイ８オンタリオ州トルンヒルシェルウッドドライヴ 299 (72)発明者ヤン、ヤン―ピンカナダ国エム２アール３エヌ７オンタリオ州ウィロウダールトレスダールアヴェニュー 120 アパートメント 1709 (72)発明者クレイン、マイケル、エイチ. カナダ国エム２ピー１ビー９オンタリオ州ウィロウダールムンロブールヴァード 16

Claims

【特許請求の範囲】１．モラクセラ菌のトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体をコードする精製・分離した核酸分子。２．トランスフェリン受容体タンパク質が、モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体結合タンパク質１（Ｔｂｐ１）である請求項１に記載の核酸分子。３．モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質がトランスフェリン受容体結合タンパク質２（Ｔｂｐ２）である請求項２に記載の核酸分子。４．モラクセラ菌株がカタル球菌の株である請求項１に記載の核酸分子。５．カタル球菌株がカタル球菌株４２２３、Ｑ８またはＲ１である請求項４に記載の核酸分子。６．（ａ）図５，６，１０，１１，２７(配列番号：１，２，３，４，５，６，７，８、４５、４６)に記載されているＤＮＡ配列またはその相補的ＤＮＡ配列、（ｂ）図５，６，１０，１１，２７(配列番号：９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，４７)に記載のＤＮＡ配列またはその相補的ＤＮＡ、（ｃ）厳しい条件下で、（ａ）または（ｂ）に記載されたＤＮＡ配列のいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列から成るグループから選択されたＤＮＡ配列を有する精製・分離核酸分子。７．（ｃ）に記載されているＤＮＡ配列が、（ａ）または（ｂ）に記載されたＤＮＡ配列のいずれか１つと、少なくとも約９０％以上の配列上の同一性を有する請求項６に記載の核酸分子。８．（ｃ）に記載されたＤＮＡ配列が、別のモラクセラ菌由来のトランスフェリン受容体タンパク質と同等のタンパク質をコードする配列である請求項６に記載の核酸分子。９．請求項１または６の核酸分子から成る宿主の形質転換に適しているベクター。１０．トランスフェリン受容体のフラグメントをコードしており、ｐＬＥＭ３，ｐＬＥＭ２５，ｐＬＥＭ２３，ＤＳ-１６９８-１-１、ＤＳ-１７５４-１，ｐＳＬＲＤ２，ｐＳＬＲＤ３，ｐＳＬＲＤ４，ｐＳＬＲＤ５から成るグループから選択されるプラスミドの特質を有している請求項９に記載のベクター。１１．宿主による、上記のモラクセラ菌のトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体の発現のために共働的に核酸分子に結合する発現手段から成る請求項９に記載のベクター。１２．プラスミドｐＬＥＭ-２９，ｐＬＥＭ-３３，ｐＬＥＭ-３７，ＳＬＲＤ３５-Ａの特質をゆうする請求項１１に記載のベクター。１３．請求項１１で記載されているような発現ベクターを含む形質転換宿主。１４．トランスフェリン受容体タンパク質を封入体として発現するために、請求項１３での形質転換宿主を増殖させるステップ、その封入体を細胞性物質と溶解性タンパク質を含まないものに精製するステップ、精製した封入体からトランスフェリン受容体タンパク質を溶解するステップ、他の溶解物質を含まないようにトランスフェリン受容体タンパク質を精製するステップから成る、モラクセラ菌の実質的に純粋な組み換えトランスフェリン受容体タンパク質を作製する方法。１５．上記のトランスフェリン受容体タンパク質が、Ｔｂｐ１だけ、Ｔｂｐ２だけ、Ｔｂｐ１とＴｂｐ２の混合物から成る請求項１４の方法。１６．上記のトランスフェリン受容体タンパク質の純度が少なくとも約７０％である請求項１５に記載の方法。１７．上記のトランスフェリン受容体タンパク質の純度が少なくとも約９０％である請求項１６に記載の方法。１８．請求項１２の形質転換された宿主により生産される組み換えトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体。１９．他のモラクセラ菌の別のタンパク質を含まないモラクセラ菌株由来のトランスフェリン受容体結合タンパク質１（Ｔｂｐ１）である請求項１８に記載のタンパク質。２０．他のモラクセラ菌の別のタンパク質を含まないモラクセラ菌株由来のトランスフェリン受容体結合タンパク質２（Ｔｂｐ２）である請求項１８に記載のタンパク質。２１．由来するモラクセラ菌がカタル球菌株である請求項１８に記載のタンパク質。２２．（Ａ）モラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体をコードしている精製・分離した核酸分子、(Ｂ)( ａ) 図５，６，１０，１１，２７(配列番号：１，２，３，４，５，６，７，８，４５，４，６)に記載されているようなＤＮＡ配列またはその相補的ＤＮＡ配列、（ｂ）図５，６，１０，１１，２７(配列番号：９１０１１１２１３１４１５１６４７)に記載されているようなアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ配列またはその相補的ＤＮＡ配列，（ｃ）厳しい条件下で（ａ）または（ｂ）に記載されたＤＮＡ配列のいずれか１つにハイブリダイズするＤＮＡ配列から成るグループから選択されたＤＮＡ配列を有する精製・分離した核酸分子、（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に記載された核酸から成る発現ベクターを含む形質転換された宿主による産生が可能な組み換えトランスフェリン受容体タンパク質またはそのフラグメントまたはその類似体、および宿主による組み換えトランスフェリン受容体タンパク質またはフラグメントまたはその類似体の発現のための核酸分子と共働的に結合する発現手段、および薬学的に受け入れ可能なキャリヤ、宿主に投与された時に免疫応答をする活性成分から成るグループから選択された少なくとも１つの活性成分から成る免疫原性成分。２３．宿主に対して、免疫的に有効な量の請求項２２の免疫原性成分を投与することを含む、宿主内で免疫応答をさせる方法。２４．（ａ）核酸分子と、この核酸分子と特異的にハイブリダイズすることのできる、試料に含まれているモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードしているその他の上記の核酸分子との複合体を産生させるために、試料を請求項１と６の核酸分子と接触させるステップと、（ｂ）複合体の産生を定量するステップから成るモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパク質をコードする核酸の試料内における存否を決定する方法。２５．（ａ）請求項１または６に記載の核酸分子、（ｂ）核酸分子と、試料中に存在し、その核酸分子とハイブリダイズすることのできるそのほかの核酸との複合体を産生させるために、核酸と試料を接触させる方法、（ｃ）複合体の産生を定量する方法から成る試料中のモラクセラ菌株のトランスフェリン受容体タンパ質をコードしている核酸の存否を決定する診断キット。