MXPA99011210A - Genes receptores de lactoferrina de moraxella - Google Patents

Abstract

Se proporcionan moléculas deácido nucleico purificadas y aisladas que codifican para proteínas de receptor de lactoferrina de Moraxella, por ejemplo M. Catarrhalls o un fragmento o un análogo de la proteína de receptor de lactoferrina. La secuencia deácido nucleico puede utilizarse para producir un proteínas recombinantes de receptor de lactoferrina Lbp1, Lbp2 y ORF3 de la cepa de Moraxella libre de otras proteínas de la cepa Moraxella para propósitos de diagnósticos y tratamiento médico. Además, la molécula deácido nucleico puede utilizarse en el diagnóstico de la infección.

Description

GENES RECEPTORES DE LACTOFERRINA DE MORAXEL A CAMPO DE LA INVENCIÓN "" La presente invención se refiere a la clonación molecular de los genes que codifican para las proteínas receptoras de lactoferrina (LfR) y, en particular, a la clonación de los genes de la proteína de unión de lactoferrina (genes lbp) a partir de Moraxella (Branhamella) catarrhalis .

REFERENCIA A Lfl. SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente norteamericana copendiente No. de serie 08/867,941 presentada el 3 de junio de 1997.

ANTECEDENTES DÉ LA INVENCIÓN Las bacterias Moraxella (Branhamela) catarrhalis son patógenos diplococos Gram-negativos que son portados asintomáticamente en las vías respiratorias de los seres humanos sanos. En los años recientes, M. Catarrhalis ha sido j reconocido como un agente causal importante de otitis media. Además, M. Catarrhalis ha sido asociado con sinusitis, conjuntivitis e infecciones urogenitales, así como con un número de enfermedades inflamatorias de las vías respiratorias inferiores en niños y adultos, incluyendo neumonía, bronquitis crónica, traqueítis, y enfisema (referencias 1 a la 8) . (A todo lo largo de esta solicitud, se citan diversas referencias en paréntesis para describir más completamente el estado de la técnica al cual pertenece esta invención. La información bibliográfica completa para cada cita se encuentra al final de la especificación, inmediatamente precedente a las reivindicaciones. Las descripciones de estas referencias son incorporadas por referencia en la presente descripción) . Ocasionalmente, M. Catarrhalis invade para provocar septicemia, artritis, endocarditis y meningitis (referencias 9 a la 13) . M. Catarrhalis coloniza las vías respiratorias superiores en humanos y es una causa importante de la otitis media en lactantes y niños, y también causa infecciones de las vías respiratorias inferiores en adultos con-padecimiento pulmonar crónico . La otitis media es una de las enfermedades más comunes de los niños de corta edad y aproximadamente 80% de todos los niños sufren al menos una infección ótica media antes de la edad de tres años (ref. 14) . La otitis media crónica ha sido asociada con deterioro auditivo y de la voz en los niños, y en algunos casos, ha sido asociada con incapacidades del aprendizaje. Los tratamientos convencionales para la otitisjiedia incluyen administración P660 de antibióticos y procedimientos quirúrgicos, incluyendo tonsilectomías, adenoidectomías, y timpanocentesis . En los Estados Unidos, los costos de tratamiento para la otitis media se estima que están entre mil y dos mil millones de dólares al año . En casos de otitis media, M. Catarrhalis comúnmente es coaislado a partir del fluido del oído medio junto con Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae no tipificable, los cuales se cree que son responsables del 50% y del 30% de las infecciones de otitis media, respectivamente. Se cree que_M. Catarrhalis es responsable de aproximadamente 20% de las infecciones de otitis media (ref_. 15) . Los reportes epidemiológicos indican que el número de casos de otitis media atribuibles a M. Catarrhalis es cada vez mayor, junto con el número de aislados resistentes a los antibióticos de M. Catarrhalis . De este modo, antes de los años 1970, no habían sido reportados aislados de M. Catarrhalis productores de ß-lacta asa, pero desde mediados de los años setenta, ha sido detectado un número cada vez mayor de aislados que expresan ß-lactamasa. Los estudios recientes sugieren que hasta el 80 a 85% de los aislados clínicos producen ß-lactamasa (ref. 16, 22, 23) . La restricción de hierro es un mecanismo de defensa general del hospedero contra los patógenos P660 microbianos. Muchas especies bacterianas, incluyendo Neisseria eningi tidis (ref. 17, 24), N. gonorrhoeae (ref. 25) y M. Catarrhalis (ref. 17) expresan proteínas membranales externas las cuales se enlazan específicamente a la lactoferrina humana. ^_ La infección por .__ Catarrhalis puede conducir a enfermedad seria. Sería ventajoso proporcionar una fuente recombinante de proteínas de unión a lactoferrina como antígenos en preparaciones inmunogénicas incluyendo vacunas, portadores para otros antígenos e inmunógenos y la generación de reactivos de diagnóstico. Los genes que codifican para las proteínas de unión a lactoferrina y los fragmentos de la misma son particularmente deseables y útiles en la identificación y diagnóstico específico de Moraxella y para la inmunización contra la enfermedad provocada por M. Catarrhalis y para la generación de reactivos de diagnóstico.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN __ La presente invención está dirigida hacia la provisión de moléculas purificadas y aisladas de ácido nucleico que codifican para una proteína receptora de la lactoferrma de una cepa de Moraxella, o un fragmento o un análogo de la proteína receptora de la lactoferrina. Las moléculas de ácido nucleico y las proteínas de unión de P660 lactoferrina aisladas y purificadas proporcionadas en la presente son útiles para la detección específica de cepas de Moraxella y para el diagnóstico de infección por Moraxella . Las moléculas de ácido nucleico purificadas y aisladas, proporcionadas en la presente, tales como ADN, son también útiles para la expresión de los genes lbp por medio de ADN recombinante para la provisión, de una manera económica, de proteínas receptoras de lactoferrina, purificadas y aisladas, libres de otras subunidades de proteínas de Moraxella, así como subunidades, fragmentos o análogos de las mismas. El receptor de lactoferrina, las subunidades o fragmentos del mismo o análogos del mismo, así como las moléculas de ácido nucleico que codifican para los mismos y los vectores que contienen tales moléculas de ácido nucleico, son útiles en composiciones inmunogénicas para la vacunación contra enfermedades provocadas por Moraxella, para " el diagnóstico de infección de Moraxella y como herramientas para la generación de reactivos inmunológicos. Los anticuerpos monoclonales o antisueros monoespecíficos (anticuerpos) producidos contra la proteína receptora de lactoferrina, producidos de acuerdo con aspectos de la presente invención, son útiles para el diagnóstico de la infección por Moraxella, la detección específica de Moraxella (por ejemplo en ensayos in vi tro e in vivo) y para el tratamiento de enfermedades provocadas por Moraxella . De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona una molécula purificada y aislada de ácido nucleico que codifica para una proteína receptora de lactoferrina de una . cepa de Moraxella, más particularmente una cepa de M. Catarrhalis , específicamente M. Catarrhalis cepa 4223, Q8 o VH19, o un fragmento o un análogo de la proteína receptora de lactoferrina. un fragmento" o un análogo de la proteína receptora de lactpferrina es una porción de la proteína que retiene las propiedades inmunológicas de la proteína. En una modalidad preferida de la invención, la molécula de ácido nucleico puede codificar únicamente para la proteína Lbpl de la cepa dé Moraxella, o únicamente para la proteína Lbp2 de la cepa de Moraxella o solo la proteína ORF3 de la sepa de Moraxella . En otra modalidad preferida de la invención, el ácido nucleico puede codificar para un fragmento de la proteína receptora de lactoferrina de una cepa de Moraxella que tiene una secuencia de aminoácidos que está conservada. _ ar- En otro aspecto más" de la presente invención, se proporciona una molécula purificada y aislada de ácido nucleico que codifica para por lo menos una proteína de unión de lactoferrina de Moraxella, que tiene un mapa de restricción que se muestra en la Figura 3 para M. Catarrhalis 4223, Figura 5 para M. Catarrhalis Q8 o Figura 17 para M. Catarrhalis VH19 o el mapa equivalente para otras cepas de Moraxella . - En otro aspecto más de la presente invención, se proporciona una molécula purificada y aislada de ácido nucleico que tiene una secuencia de ADN" seleccionada del grupo que consiste de (a) una secuencia de ADN como se describe en las Figuras 2 ó 4 (SEQ ID No : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 69) o la secuencia de ADN complementaria para las mismas; (b) una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos como se describe en las Figuras 2 ó 4 (SEQ ID No: 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 70) o la secuencia de ADN complementaria de éstas; y (c) una secuencia de ADN que codifica para una proteína receptora de lactoferrina de Moraxella, que puede ser una secuencia de _ADN que se híbrida bajo condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de ADN definidas en (a) o (b) . La secuencia de ADN definida en (c) tiene preferentemente al menos aproximadamente 90% de identidad secuencial con cualquiera otra de las secuencias de ADN definidas en (a) y (b) . Las condiciones estrictas de hibridación se describen más adelante. La identidad de secuencia se determina en la forma que se describirá aquí. " En un aspecto adicional, la presente invención incluye un vector adaptado para la transformación de un hospedero, que comprende una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente, y puede tener las características de una secuencia nucleotídica contenida dentro de los vectores pLD3 , pLDW3 , pLDl-8 y pLDWl . El vector puede ser adaptado para la expresión del receptor de lactoferrina codificado, fragmentos o análogos del mismo, en un hospedero heterólogo u homólogo, ya sea en una forma lipidada o no lipidada. En consecuencia, un aspecto adicional de la presente invención proporciona un vector de expresión adaptado para la transformación de un hospedero que comprende una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente, y los medios de expresión operativamente acoplados a la molécula de -ácido nucleico, para que el hospedero exprese la proteína receptora de lactoferrina o el fragmento o análogo de la proteína receptora de lactoferrina. En las modalidades específicas de este aspecto de la invención, la molécula de ácido nucleico puede codificar substancialmente para toda _ la proteína receptora de lactoferrina, únicamente para la proteína Lbpl de la cepa de Moraxella, únicamente para la proteína Lbp2 de la cepa de Moraxella, únicamente la proteína ORF3 de la cepa de Moraxella o fragmentos de las proteínas Lbpl , Lbp2 u ORF3 . Los medios de expresión pueden incluir —un P660 promotor y una porción de ácido nucleico que codifica para una secuencia guía para la secreción a partir del hospedero de la proteína receptora de lactoferrina o el fragmento o el análogo de la proteína receptora de lactoferrina. Los medios de expresión pueden también incluir una porción de ácido nucleico que codifica para una señal de lipidación para que el hospedero exprese una forma lipidada de la proteína receptora de lactoferrina o el fragmento o el análogo de la proteína receptora de lactoferrina. El hospedero puede ser seleccionado de, por ejemplo, Escherichia coli , Bordetella, Bacillus, Haemophilus , Moraxella, hongos, levaduras o baculovirus y pueden ser utilizados sistemas de expresión virales como el virus de Semliki Forest. En una modalidad particular, el plásmido adaptado para la expresión de Lbp2 es el pRD2A, pRD2B, pQW2A ó pQW2B; el plásmido adaptado para la expresión de Lbpl es pRDlA, pRDlB o pQlB; y el plásmido adaptado para la expresión de ORF3 es pLRD3 ó pLQ 3. En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un hospedero transformado que contiene un vector de expresión como se proporciona en la presente. La invención incluye además una proteína recombinante receptora de lactoferrina o un fragmento o un análogo de la misma, de una cepa de Moraxella producible por el hospedero transformado.

P660 Tal proteína recombinante receptora de lactoferrina puede ser proporcionada substancialmente en forma pura de acuerdo a un aspecto adicional de la invención, en donde se proporciona un método para la formación de una proteína recombinante receptora de lactoferrina, substancialmente pura, la cual comprende cultivar el hospedero transformado proporcionado aquí y aislar y purificar la proteína receptora de lactoferrina los análogos y fragmentos de la misma. La proteína receptora de lactoferrina puede expresarse en cuerpos de inclusión, purificando los cuerpos de inclusión libres de material celular y proteínas solubles, solubilizando la proteína receptora de lactoferrina a partir de los cuerpos de inclusión purificados, y purificando la proteína receptora de lactoferrina para liberarla de otros materiales solubilizados. La proteína recombinante receptora de lactoferrina, ya substancialmente pura, puede comprender Lbpl solo, Lbp2 solo, 0RF3 o una mezcla de dos o más _ de estas proteínas . La^proteína recombinante es en general al menos aproximadamente 70% pura, preferentemente al menos aproximadamente 90% pura. Los aspectos adicionales de la presente invención, por lo tanto, proporcionan proteína Lbpl recombinantemente (o un fragmento o análogo de la misma) producida de una cepa de Moraxella desprovista de las P660 proteínas Lbp2 y 0RF3 de la cepa de Moraxella y cualquier otra proteína de la cepa de Moraxella, una proteína Lbp2 producida recombinantemente (o un fragmento o análogo de la misma) de una cepa de Moraxella desprovista de las proteínas Lbpl y ORF3 de la cepa de Moraxella, y cualquier otra proteína de la cepa de Moraxella y proteína ORF3 producida por técnicas recombinantes (o un fragmento o análogo de la misma) de una cepa de Moraxella desprovista de las proteínas Lbpl y Lbp2 de la cepa de Moraxella y cualquier otra proteína de la cepa de Moraxella . La cepa de 'Moraxella puede ser M. Catarrhalis cepa 4223, M. Catarrhalis cepa Q8 o M. Catarrhalis cepa VH19. La invención incluye además, en un aspecto adicional, una proteína de cuadro de lectura abierto 3 ( ORF3) de una cepa de Moraxella o un fragmento o análogo de la proteína de unión de lactoferrina «que es codificada por una región corriente abajo de_los genes que codifican para las proteína Lbpl y Lbp2 de la cepa de Moraxella . Lia ORF3 puede proceder de una cepa de M. Catarrhalis , que puede ser la cepa 4223 o Q8. La Lbp3 puede tener una masa molecular de 60 Da. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona una composición inmunogénica que comprende al menos un componente activo seleccionado de al menos una molécula de ácido nucleico .como se proporciona en la P660 presente, y al menos una proteína recombinante como se proporciona en la presente, o al menos una proteína novedosa como se proporciona en la presente, y un portador farmacéuticamente aceptable para la misma o un vector para la misma. Al menos un componente activo produce una respuesta inmunitaria cuando se administra a un hospedero. Las composiciones inmunogénicas proporcionadas en la presente pueden ser formuladas como vacunas para la administración irz vivo a un hospedero para proporcionar protección contra la enfermedad causada por M. Catarrhalis . Para tal propósito, las composiciones pueden ser formuladas co o una micropartícula, cápsula, ISCOM o preparación de liposoma. La composición inmunogénica puede ser proporcionada en combinación, con una molécula diana o blanco para la distribución a las células específicas del sistema inmunológico o a las superficies mucosales. Las composiciones inmunogénicas de la invención (incluyendo vacunas) pueden comprender además al menos otro material inmunogénico o inmunoestimulador y el material inmunoestimulador puede ser al menos un adyuvante o al menos una citosina. Los adyuvantes adecuados para el uso en la presente invención (sin estar limitados es estos) son: fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, QS21, Quil A, derivados y componentes de los mismos, matriz ISCOM, P660 fosfato de calcio, hidróxido de calcio, hidróxido de zinc, un análogo de glucolípido, un éster de octadecilo de un aminoácido, un polifosfazeno, un dipéptido de muramilo, ISCOPREP, DC-chol, DDBA y una lipoproteína y otros adyuvantes para inducir una respuesta THl . Las combinaciones ventajosas de adyuvantes se describen en las Solicitudes de Patente Norteamericana copendientes Nos. 08/261,194 presentada el 16 de junio de 1994 y 08/483,856 presentada el 7 de junio de 1995, cedidas a la cesionaria de la presente, y las descripciones de las cuales se incorporan por referencia en la presente ( O95/34308, publicada el 21 de noviembre de 1995) . De acuerdo con otro aspecto más de la invención, se proporciona un método para la generación de una respuesta inmunitaria en un hospedero, que comprende el paso de administrar a un hospedero susceptible, tal como un humano, una cantidad efectiva de la composición inmunogénica proporcionada en la presente. La respuesta inmunitaria puede ser una respuesta inmunitaria humoral o mediada por células, y puede proporcionar protección contra enfermedad provocada por Moraxella . Los hospederos en los cuales puede ser conferida la protección contra la enfermedad, incluyen primates, incluyendo los humanos. En un aspecto adicional, se proporciona un vector vivo para la distribución del receptor de lactoferrina a un P6S0 hospedero, que comprende un vector que contiene la molécula de ácido nucleico como se describe anteriormente. El vector puede ser seleccionado de Salmonella , Mycobacterium bovis, BCG, adenovirus, poxvirus, vaccinia y poliovirus. Las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en la presente son útiles en aplicaciones diagnósticas. En consecuencia, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para la determinación de la presencia, en una muestra, del ácido nucleico que codifica para una proteína receptora de lactoferrina de una cepa de Moraxella , que comprende los pasos de: a) poner en contacto la muestra con una molécula de ácido nucleico, como se proporciona en la presente, para producir dúplex o parejas que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquier molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína receptora de lactoferrina de una cepa de Moraxella presente en la muestra, e hibridable específicamente con ésta; y b) determinar la "producción de las parejas o dúplex. - Además, la presente invención proporciona un equipo de diagnóstico para la determinación de la presencia, en una muestra, del ácido nucleico que codifica para una proteína receptora de lactoferrina de una cepa de Moraxella, que comprende: P660 a) una molécula de ácido nucleico como se proporciona en la presente; b) medios para poner en contacto la molécula de ácido nucleico con la muestra, para producir dúplex o parejas que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualguier ácido nucleico presente en la muestra, y «que se puede hibridar con la molécula de ácido nucleico; y c) medios para la determinación de la producción de las parejas o dúplex. ___ La invención incluye además el uso de las moléculas de ácido nucleico y las proteínas proporcionadas en la presente, como medicamentos. La invención incluye además el uso de las moléculas de ácido nucleico y las proteínas proporcionadas en la presente, en la fabricación de medicamentos para la protección contra infecciones por cepas de Moraxella . Las ventajas de la presente invención, incluyen: una molécula aislada y purificada de ácido nucleico «que codifica para una proteína receptora de lactoferrina de una cepa de Moraxella o un fragmento o un análogo de la proteína receptora de lactoferrina; proteínas receptoras de lactoferrina producidas por técnicas recombinantes, incluyendo Lbpl y Lbp2 y ORF3 y fragmentos y análogos de las mismas, libres unas de otras así como de cualesquiera otras proteínas de P660 Moraxella; proteína de cuadro de lectura abierto 3 ; y equipos de diagnóstico y reactivos inmunológicos para la identificación específica de Moraxella .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La presente invención será además comprendida a partir de la siguiente descripción con referencia a los dibujos, en los cuales: la Figura 1 muestra la secuencia parcial de los fragmentos amplificados por PCR de 2.2 kb o los genes lbpA de M. Catarrhalis 4223 o Q8, que se utilizaron para las sondas de las bibliotecas de f go. En la Figura Tbpl es la secuencia Tbpl de 4223 deducida (como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 08/613,009 presentada el 8 de marzo de 1996, cedida a la cesionaria de la presente y cuya exposición se incorporó aquí como referencia) (SEQ ID No: 19) , Lbpl es la secuencia Lbpl de 4223 de longitud completa deducida (SEQ ID No: 3) utilizada aquí solamente para alinear los fragmentos PCR, PCR4 es el fragmento PCR 4223 (SEQ ID No: 20) y PCR5 es una secuencia parcial del fragmento PCR de Q8 (SEQ ID No : 21) . Sólo se obtuvo una secuencia de una sola cadena para los fragmentos PCR y "X" se insertó en donde hubo una secuencia dudosa. Se han P660 — utilizado guiones para un máximo alineamiento. Las secuencia subrayada en Lbpl (MVQYTYRKGKENKAH - SEQ ID No: 22) representa la posición d un péptido CNBr utilizando pará generar el cebador 5' -PCR. La Figura 2 muestra al nucleótido (SEQ ID No: 1, de secuencia completa; SEQ ID No: 2, secuencia codificadora Lbp2 ; SEQ ID No: 3, secuencia codificadora Lbpl , primera metionina; SEQ ID No: 4, secuencia codificadora Lbpl , segunda metionina; SEQ ID No: 5 secuencia codificadora ORF3) y secuencias de aminoácido deducidas (SEQ ID No: 11, Lb 2 ; SEQ ID No: 12 Lbpl , primera metionina; SEQ ID No: 13, Lbpl , segunda metionina; SEQ ID No: 14, ORF3 ) del locus Ifr putativo de M. Catarrhalis _4223. Existen tres genes aleatorios en el locus lfr putativo identificado como IbpB, IbpA y orf3 . Los elementos del promotor potencial encontrados en aguas arriba de los genes IbpB y lbpA están indicados por subrayado . La Figura 3 muestra un mapa de restricción de la clona pLDl-8 que contiene los genes lbpA, lbpB, y orf3 a partir del aislado de M. Catarrhalis 4223. La Figura 4 muestra al nucleótido (SEQ ID No: 6, de secuencia completa; SEQ ID No: 7, secuencia codificadora Lbp2 ; SEQ ID No: 8, secuencia codificadora Lbpl, primera metionina; SEQ ID No: 9 Lbp2 , segunda metionina; SEQ ID No: 10, secuencia codificadora ORF3 ) y secuencias de P660 -_ aminoácidos deducidas (SEQ IDdNo : 15, Lbp2 ; SEQ ID No: 16, Lbpl, primera metionina; SEQ ID No: 17, Lbpl, segunda metionina; SEQ ID No: 18, Lbp3 ) del locus lfr putativo que proviene de M. Catarrhalis Q8. Hay tres genes en cascada en el locus lfr putativo identificados como lbpB, IbpA y orf3. Los elementos promotores pontenciales encontrados corriente arriba de los genes lbpB y lbpA están indicados mediante un subrayado . La Figura 5 muestra un mapa de restricción de la clona pLDWl que contiene a los genes lbpA, lbpB y orf3 que provienen del aislado de M. Catarrhalis Q8. La Figura 6 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Lbpl proveniente de las cepas de M. Catarrhalis 4223 (SEQ ID No : 12) y Q8 (SEQ ID No: 16), las cepas de N. Meningi iidis BNCV (SEQ ID No : 23) y H44/76 (SEQ ID No : 75) y la cepa de N. gonorrhoeae FA19 (SEQ ID ?o : 24. También se muestra la secuencia parcial de carboxiterminal de Lbp2 proveniente de las cepas N.

Meningi tidis B?CV (S?Q ID ?o : 76) y H44/76 (SEQ ID ?o : 77) y la cepa N. gonorrhoeae FA19 (SEQ ID ?o : 75) . Los puntos indican residuos idénticos y los guiones han sido introducidos para lograr un alineamiento máximo de la secuencia . La Figura 7 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Lbp2 provenientes de las cepas P660 de M. Catarrhalis 4223 (SEQ ID No: 11) . Q8 (SEQ ID No: 15 y VH19 (SEQ ID No: 70). Los puntos indican residuos idénticos. La flecha indica la cisteína lipidada de una lipoproteína Lbp2 potencial madura. Los residuos conservados con las proteínas Tbp2 están subrayados y la secuencia RGD está en letra itálicas. La Figura 8 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de Tbp2 (USPA No. 08/613,009) (SEQ* ID No: 25) y Lbp2 de la cepa M. Catarrhalis 4223 (SEQ ID No: 11) . Los puntos indican residuos idénticos y los guiones han sido insertados para lograr una máxima alineación de secuencia. Los" asteriscos indican residuos conservados y el sitio putativo de lipidación de las dos proteínas está indicado por la. flecha. La Figura 9 muestra una comparación de las secuencias de aminoácidos de ORF3 provenientes de las cepas 4223_ de M. Catarrhalis (SEQ ID No: 14) y Q8 (SEQ ID No: 18) . Los puntos indican residuos idénticos y los guiones se han introducidos para un máximo alineamiento. La Figura 10 muestra la construcción de los plásmidos para la expresión de la proteína Lbpl recombinante proveniente de E. coli . Los plásmido pRDlA y pRDlB expresan Lbpl de 4223 proveniente del primero y segundo residuos de metionina, respectivamente. Los plásmidos pQWlA y pQWlB expresan Lbpl de Q8 proveniente del P660 primero y el segundo residuos de metionina, respectivamente . La Figura 11 comprende paneles A y B, muestra la expresión de las proteínas Lbpl recombinantes (rLbpl) provenientes de E. coli . El panel a muestra la expresión de las proteínas Lbpl de Q8 y el panel B muestra la expresión de las proteínas Lbpl de 4223. Carril 1, marcador de peso molecular. Carriles 2 y 3 demuestran la expresión inducida de Lbpl más largo que inicia a partir de los primeros residuos de metionina y los carriles 4 y 5 ilustran la expresión de las proteínas Lbpl más cortas que inician a partir de los segundos residuos de metionina. Los carriles 6, 7, 8 y 9 son muestras no inducidas. La Figura 12 muestra la construcción de los plásmidos para la construcción de proteína Lbp2 recombinante (rLbp2) proveniente de E. coli . Los plásmidos prD2A' y pRD2B expresan Lbp2 de 4223 con o sin la secuencia guía nativa, respectivamente. __ Los plásmidos pQW2 y pQW2B expresan Lbp2 de Q8 con o sin la secuencia guía nativa, respectivamente. La Figura 13 muestra la construcción de un plásmido para la expresión de proteínas 0RF3 recombinantes (rORF3) a partir de E. coli . La Figura 14 muestra un esquema de purificación para rLbpl expresado a partir de E. coli .

P660 -1 La Figura 15 muestra un gel de SDS-PAGE para la purificación de Lbpl de Q8 a partir de E. coli . Carril 1, lisado BL21(DE3); carril 2, proteínas solubles después de 50 mM Tris/5 mM AEBSF/0.5 M. Catarrhalis NaCl, extracción pH 8.0; carril 3, proteínas solubles después de 50 mM Tris/0.5% Tritón X-100/10 mM EDTA, extracción pH 8.0; carril 4, proteínas solubles "después de 50 mM Tris-HCl/1% octilglucósido, pH 8.0 extracción; carril 5, cuerpos de inclusión solubilizados; carril 6, Lbpl purificado. La Figura 16 muestra la secuencia de nucleótido (SEQ ID No: 69) del gen IbpB de la cepa M. Catarrhalis VH19 y la secuencia de aminoácidos "deducida (SEQ ID No: 70 de la proteína Lbp2 correspondiente. La Figura 17 muestra un mapa de restricción parcial del gen IbpB de la cepa BH19 de M. Catarrhalis . La Figura 18, comprende los paneles A, B y C y muestra a los geles SDS-PAGE de la purificación de las proteínas Lbp recombinantes . El panel A muestra un gel SDS-PAGE de la purificación de rLbpl de Q8. Los paneles B y C muestran la purificación de rLbp2 de Q8 y rLbp2 de 4223, respectivamente: carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, lisados de célula completa; carril 3, cuerpos de inclusión; carril 4, proteína purificada. La Figura 19 comprende a los paneles A y B que muestran la unión de las proteínas Lbp recombinantes a P660 lactoferrina. El panel A muestra un gel SDS-PAGE de proteínas recombinantes purificadas. El panel B muestra la unión de las proteínas recombinantes a la lactoferrina humana. El carril 1, marcadores de peso molecular; carril 2, rLbpl; de Q8; carril 3, rLbp2 de Q8; carril 4, rLbps de 4223'". La Figura 20 comprende los paneles A, B, y C y muestra un inmunoblot de la cepas M. Catarrhalis que reaccionaron con anticuerpos anti-rLbpl y anti-rLbp2. Panel A: lisados de célula completa que sondearon con antisueros anti-rLbpl de Q8 + anti-rLbp2 de Q8. Todas las células se cultivaron en presencia de EDDA. Panel B: lisados de célula completa sondeados con anticuerpo anti-rLbp2 de Q8. Panel C: lisados de célula completa sondeados con "anticuerpo anti-rLbp2 de Q8. Carril 1, cepa Q8, carril 2, cepa 4223, carril 3, cepa VH19, carril 4, cepa LES-1, carril 5, cepa H-04; carril 6, cepa 3. + indicó crecimiento en presencia de EDDA y - indicó crecimiento en ausencia de EDDA.

DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA INVENCIÓN Cualquier cepa de Moraxella puede ser convenientemente utilizada para proporcionar el ácido nucleico purificado y aislado, el cual puede estar en la forma de moléculas de ADN, que comprende al menos una P660 porción del ácido nucleico que codifica para un receptor de lactoferrina, como es tipificado por las modalidades de la presente invención. Tales cepas están en general disponibles de las fuentes clínicas y de las colecciones de cultivo bacterianos, tales como la Colección Norteamericana de Cultivos de Especies (American Type Culture Collection) . En esta solicitud, los términos "receptor de lactoferrina" (LfR) y "proteínas de enlace o unión a la lactoferrina" (Lbp) son utilizadas para definir una familia de proteínas Lbpl , Lbp2 y/o ÓRF3 , la cual incluye aquellas que tienen variaciones en sus secuencias de aminoácidos incluyendo aquéllas de origen natural que se encuentran en diversas cepas de, por ejemplo, Moraxella . Las moléculas de ADN purificadas y aisladas que comprenden al menos una porción que codifica para el receptor de la lactoferrina de la presente invención también incluyen aquéllas que codifican para los análogos funcionales de las proteínas Lbpl y Lbp2 y/o Lbp3 del receptor de la lactoferrina de Moraxella . En esta solicitud, una primera proteína es un "análogo" de una segunda proteína si la primera proteína está inmunológicamente relacionada y/o tiene la misma función que la segunda proteína. El análogo puede ser, por ejemplo, un mutante de sustitución, adición o deleción de la misma. Las proteínas receptoras del lactoferrina se P660 purifican a partir de las preparaciones de membrana de M. Catarrhalis por cromatografía de afinidad en lactoferrina humana biotinilada. Los fragmentos de bromuro de cianógeno se generaron y el análisis dé secuencia de aminoácidos de un fragmento 13 kDa proporcionó una secuencia Lbpl interna de MVQYTYRKGKENKAH (SEQ ID No : 22) subrayada en la Figura 6. El C-terminal de Tbpl de M. Ca tarrhalis (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 08/613,009). El Tbpl N. Meningi tidis (ref. 27) y Tbpl de H. influenzae (ref . 31) tiene una secuencia conservada LEMKF (SEQ ID No: 26) . Los cebadores de oligonucleótido se generaron con base en estas dos secuencias y se utilizaron para amplificar por PCR un fragmento de aproximadamente 2.2 kb del gen IbpA de las cepas 4223, Q8 y VH19 de M. Catarrhalis . El análisis de secuencia parcial demostró que los genes amplificados fueron lbpA y no tbpA (ver Figura 1) . Los fragmentos PCR de 2.2 kb se utilizaron para separar bibliotecas genómicas. El ADN cromosómico de 4223, Q8 y VH19 fue digerido con Sau3A I y los fragmentos dentro de un intervalo de tamaño de 15 a 23 kb se purificaron antes de su clonación en los brazos BamH I del vector lambda EMBL3. La genoteca fue seleccionada con los fragmentos PCR, las clonas positivas se sometieron a tres rondas de purificación en placa. La clona del fago 4223LfR.17 que contiene un inserto de aproximadamente 16 kb proveniente de P660 4223 y la clona del fago Q8LÍR.13 que contiene un inserto de aproximadamente 16 kb proveniente de Q8, fueron selecionadas para un análisis adicional. Los análisis de enzima de restricción y Southern blot (transferencia Southern) revelaron que un fragmento interno Hind III de aproximadamente 9 kb contuvo por lo menos una porción del gen lbpA para las dos clonas de fago. Los fragmentos Hind II de aproximadamente 9 kb se subclonaron en plásmidos basados en pUC o pBluescript y se secuenciaron. En cada Caso, contuvieron un gen lbpA completo así como un gen corriente arriba identificado como lbpBj un gen corriente abajo designado como orf3. El arreglo del gel lbpB-lbpA es el mismo que se presenta para las cepas de Neisseria, pero no ha habido identificación de un tercer gen de estos organismos . El arreglo del gen es diferente al observado para el "operón tfr de M. Catarrhalis que era tbpA-orf-tbpB (Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 08/613,009) . Hay elementos promotores corriente arriba de los dos genes lbpB y lbpA provenientes de la cepas 4223 y Q8. El tercer ORF está ubicado inmediatamente corriente abajo de lbpA, separado por un solo nucleótido. Por analogía con los operones de receptor de transferrina de N. Meningi tidis y N. gonorrhoeae (referencias 26, 27, 28,), el operón receptor de lactoferrina se cree consiste de dos P660 genes que cofidican para las proteínas 1 y 2 de unión a lactoferrina (Lbpl y Lbp2) (ref. 29). Sin embargo, reportamos que para M. Catarrhalis también existe un tercer gen ^ubicado inmediatamente corriente abajo de lbpA, que codifica para una proteína die unión a lactoferrina 3, potencial (0RF3) . Los genes lbpA de_ M. Catarrhalis 4223 y Q8 codifican para proteínas de masa molecular de aproximadamente 110 kDa y que son altamente conservadas con sólo 7 residuos de diferencia entre ellas. La secuencia N-terminal de la proteína lbp nativa es desconocida y hay dos codones de inicio ATG posibles en las posiciones 1 o 16. La primera de estas está adyacente a las secuencias de consenso para los elementos promotores y la segunda está seguida por una secuencia de señal putativa. La secuencia de péptido exacta utilizada para designar a los cebadores de amplificación PCR no se encontró. Cuando se comparó con otras secuencias Lbpl conocidas de N. Meningi tidis (refs. 31, 24) o íf. gonorrhoeae (ref. 25) hubo aproximadamente un 32% de identidad de secuencia y aproximadamente 50% de homologa de secuencia entre las proteínas de M. Catarrhalis y Neisseria . Hay cierta homología entre las proteínas Lbpl y Tbpl de M. Catarrhalis como se muestra en la Figura 1, pero está muy dispersada. Los genes de lbpB para M. Catarrhalis 4223, Q8 y P660 VH19 codifican para proteínas de 898, 894 y 906 aminoácidos, respectivamente. Las proteínas Lbp2 de M. Catarrhalis provenientes de s cepas 4223 y Q8 son 92% idénticas y tienen 95% de homología mientras que para VH19 son 77% idénticas y 84% similares al s proteínas Lbp2 de 4223 y Q8 (Figura 7) . Existe una secuencia de consenso para la lipidación en el residuo Cys32, sugirieron que el Lbp2 es una _lipoproteína parecida a Tbp2. Existe poca homología entre las proteínas Lbp2 y Tbp2 de M. Catarrhalis (Figura 8), con excepción de una secuencia de péptido previamente identificada (LEGGFY (SEQ ID No: 27)) que también se encuentra en Tbp2 de N. Meningitidis y H. influenzae (ref. 30) . La secuencia de la orf3 propuesta corriente abajo, relacionada con Ikfr de M. Catarrhalis se conserva entre las cepas 4223 y Q8. Las proteínas codificadas ORF3 de 4223 y Q8 cuando se comparan con las bases de datos de proteínas PIR y Swiss Prot resultaron previamente desconocidas. La proteína 0RF3 puede unirse así misma a lactoferrina o puede ser una proteína asociada o regulatoria para Lbpl y/o Lbp2. Los vectores de expresión se han ensamblado de los genes lbpA y lbpB y las proteínas Lbpl y Lbp2 recombinantes aisladas y purificas, como se describe con detalle en los siguientes ejemplos.

P660 Los resultados mostrados en la Tabla 1 siguiente ilustran la habilidad de los antisueros de cobayo anti-Lbpl , producidos por inmunización con Lbpl purificada por afinidad, para lisar M. Catarrhalis . Los resultados muestran que los antisueros producidos mediante inmunización con la proteína Lbpl aislada de M. Catarrhalis 4223 fueron bactericidas contra una cepa RH408 de M. Catarrhalis homologa que no se aglomera, (una cepa previamente depositada en relación con la Solicitud de Patente. Norteamericana No. J 08/328,589, cedida a la cesionaria de la presente, (W096/12733 publicada el 2 de mayo__ de_ 1996) derivada del aislado 4223. Además, los antisueros producidos por inmunización con la proteína Lbpl aislada de M. Catarrhalis 4223, fueron bactericidas contra la cepa Q8 heteróloga que no se aglomera. Los resultados de la Tabla 3 muestran que los antisueros de cobayos producidos similarmente anti- p2 fueron bactericidas para la cepa homologa y para tres de las cinco cepas heterólogas. La habilidad de las proteínas de unión a lactoferrina, aisladas y purificadas, para generar anticuerpos bactericidas in vivo , es evidencia de la utilidad de estas proteínas como vacunas para proteger contra la enfermedad provocada por Moraxella . De este modo, de acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una vacuna contra la P660 infección provocada por las cepas de Moraxella, que comprende una cantidad inmunogénicamente efectiva de una proteína de unión a lactoferrina o un fragmento o análogo de la misma, o una molécula de ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica para la proteína de unión a lactoferrina o un fragmento o análogo de la misma, y un portador fisiológicamente aceptable de la misma. La proteína de unión a lactoferrina o un fragmento o análogo de la misma que se proporcionan aquí se pueden utilizar como proteína portadora para haptenos, polisacáridos o péptidos para elaborar vacunas conjugadas contra determinantes antigénicos no relacionados con las proteínas de unión a lactoferrina . En modalidades adicionales de la presente invención, por lo tanto, la proteína de unión a lactoferrina como se proporciona en la presente, puede ser utilizada como una molécula portadora para preparar moléculas quiméricas y vacunas conjugadas (incluyendo glucoconjugados) contra bacterias patógenas, incluyendo bacterias encapsuladas. De -este modo, por ejemplo, los glucoconjugados de la presente invención pueden ser utilizados para conferir protección contra enfermedades e infecciones provocadas por cualguier bacteria «que tiene antígenos polisacáridos, incluyendo lipopoligosacáridos (LOS) y PRP. Tales patógenos bacterianos pueden incluir, P660 por ._ ejemplo, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli , Neisseria meningi tidis, Salmonella typhi , Streptococcus mutans, Criptococcus neoformans, Klebsiella, Staphulococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa . Los antígenos particulares que pueden ser conjugados a la proteína de unión a lactoferrina y los métodos para lograr tales conjugaciones, se describen en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 08/433,522 presentada el 23 de noviembre de 1993 ( 094/12641) , cedida a la cesionaria de la presente, y la descripción de la cual se incorpora por referencia en la presente. En otra modalidad más, la función portadora de la proteína de unión a lactoferrina puede ser utilizada, por ejemplo, para inducir una respuesta inmunitaria contra polisacáridos anormales de células tumorales, o para producir anticuerpos antitumorales que pueden ser conjugados a agentes quimioterapéuticos o bioactivos. La proteína de unión a lactoferrina que se proporciona en la presente es útil como reactivo de diagnóstico, como un antígeno o para la generación de anticuerpos de unión a proteína, anti-lactoferrina, como antígeno para la vacunación contra enfermedades provocadas por la especie Moraxella y para detectar las infecciones con Moraxella y otras bacterias de este tipo. " La invención se extiende a las proteínas de unión P660 a lactoferrina, fragmentos o análogos de las mismas o moléculas de ácido nucleico que codifican para las mismas, provenientes de Moraxella catarrhalis, para el uso como un ingrediente activo en una vacuna contra la enfermedad provocada por infección con Moraxella . La invención también se extiende a una composición de vacuna farmacéutica que contiene las proteínas de unión a lactóferrina, fragmentos o análogos de las mismas o moléculas de ácido nucleico que codifican para las mismas, provenientes de Moraxella catarrhalis y, opcionalmente, un portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de las proteínas de unión a lactoferrina, fragmentos o análogos de las mismas o moléculas de ácido nucleico que codifican para las mismas, para la preparación de una composición de vacuna farmacéutica para la inmunización contra la enfermedad provocada por infección con Moraxella . Es claramente evidente para alguien de experiencia en la técnica, que las diversas modalidades de la presente invención tienen muchas aplicaciones en los campos de la vacunación, diagnóstico, tratamiento, por ejemplo, de infecciones por Moraxella y la generación de reactivos inmunológicos y otros reactivos de diagnóstico. Una "discusión no limitante adicional de tales usos se presenta en seguida.

P660 1. Preparación y Uso d? la Vacuna Las composiciones inmunogénicas adecuadas para ser utilizadas en vacunas pueden ser preparadas a partir de proteínas inmunogénicas receptoras de lactoferrina, análogos y fragmentos de la misma, codificados por las moléculas de ácido nucleico, así como las moléculas de ácido nucleico descritas en la presente. La vacuna provoca una respuesta inmunitaria que produce anticuerpos, incluyendo anticuerpos anti-receptor de lactoferrina y anticuerpos que son de opsonización o bactericidas. Si el sujeto vacunado es inoculado con Moraxella, los anticuerpos se unen al receptor de la lactoferrina y con esto previenen el acceso de la bacteria a una fuente de hierro que es requerida para la viabilidad. Además, los anticuerpos anti-receptor de lactoferrina opsonizantes o bactericidas pueden también proporcionar protección mediante mecanismos alternativos . Las composiciones inmunogénicas, incluyendo las vacunas, pueden ser preparadas como soluciones inyectables líquidas o en emulsión. Las proteínas receptoras de lactoferrina, los análogos y fragmentos de las mismas y las moléculas de ácido nucleico que las codifican y las moléculas de ácido nucleico que se describen aquí pueden ser dtiezclados con excipientes farmacéuticamente aceptables P660 que son compatibles con las proteínas receptoras de lactoferrina, los fragmentos, análogos o moléculas de ácido nucleico. Tales excipientes pueden incluir agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. Las composiciones inmunogénicas y vacunas pueden además contener sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes amortiguadores del pH o adyuvantes, para mejorar la efectividad de las vacunas. Las -_ composiciones inmunogénicas y vacunas pueden ser administradas parenteralmente, mediante inyección subcutánea, intradérmica o intramuscular. Alternativamente, las composiciones inmunogénicas proporcionadas de acuerdo a la presente inyección pueden ser _formuladas y distribuidas de una manera para provocar una respuesta inmunitaria en las superficies mucosales. De este modo, la composición inmunogénica puede ser administrada a las superficies mucosales mediante, por ejemplo, las rutas nasal u oral (intragástricas) . La composición inmunogénica puede ser proporcionada - en combinación con una molécula blanco para la distribución en las" células específicas del sistema inmunológico, o a las superficies mucosas. Algunas de tales moléculas blanco incluyen la vitamina B12 " y fragmentos de toxinas bacterianas, como se describe en la Patente Internacional W092717167 (Biotech Australia Pty. Ltd.), y anticuerpos P660 monoclonales, como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,194,254 (Barber y colaboradores). Alternativamente, pueden ser deseables otros modos de administración, incluyendo supositorios y formulaciones orales. Para supositorios, se pueden incluir aglutinantes y portadores, por _' ejemplo, polialquenglicoles o triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir excipientes normalmente empleados tales como, por ejemplo, sacarina, celulosa y carbonato de magnesio grado farmacéutico. Estas composiciones pueden tomar las formas de soluciones, suspensiones, tabletas, pildoras, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos, y contener aproximadamente 1 a 95% de las proteínas receptoras de lactoferrina, fragmentos, análogos y/o moléculas de ácido nucleico. Las vacunas son administradas de una manera compatible con la formulación de dosis y en una cantidad tal" «que será terapéuticamente efectiva, protectora e inmunogénica. La cantidad que va a ser administrada depende del sujeto que va a ser tratado, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos y, si se necesita, para producir la respuesta inmunitaria mediada por células. Las" cantidades precisas del ingrediente activo requerido para ser administrado, dependen del juicio del practicante. ' P660 ~ No obstante, los intervalos de dosis adecuados son fácilmente determinados por alguien de experiencia en la técnica, y pueden ser del orden de microgramos de las proteínas receptoras de lactoferrina, análogos y fragmentos de las mismas, y/o moléculas de ácido nucleico. Los regímenes adecuados para la administración inicial y las dosis de refuerzo, son también variables, pero pueden incluir una administración inicial seguida por administraciones subsecuentes ._ La dosis de la vacuna puede también depender de la ruta de administración y variará de acuerdo a la talla del hospedero. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para el receptor de la lactoferrina de Moraxella, pueden ser ^utilizadas directamente para la inmunización mediante administración del ADN directamente, por ejemplo, mediante inyección para inmunización genética o mediante construcción de un vector vivo, tal como Salmonella, BCG, adenovirus, poxvirus, vaccinia o poliovirus que contienen las moléculas de ácido nucleico . Una descripción de algunos vectores vivos que han sido utilizados para llevar los antígenos heterólogos hacia el sistema inmunológico, está contenida por ejemplo _en 0' Hagan (ref. 18) . Los procesos para la inyección directa del ADN dentro de los sujetos de prueba para la inmunización genética se describen por ejemplo en Ulmer y colaboradores (ref. 19) .

P660 La inmunogenicidad puede ser significativamente mejorada si los antígenos son coadministrados con adyuvantes, comúnmente utilizados como una solución al 0.05-1.0 por ciento en solución salina amortiguada con fosfato. Los adyuvantes mejoran la inmunogenicidad de un antígeno, pero no son necesariamente inmunogénicos por sí mismos. Los adyuvantes pueden actuar mediante la retención del antígeno localmente cerca del sitio de administración, para producir un efecto depósito facilitando una liberación sostenida y lenta del antígeno hacia las células del sistema inmunológico. Los adyuvantes pueden también atraer a las células del sistema inmunológico hacia un depósito de antígeno y estimular tales células para provocar las respuestas inmunitarias. Los agentes o adyuvantes inmunoestimuladores han sido utilizados por muchos años para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedero, por ejemplo, para las vacunas. Los adyuvantes intrínsecos, tales como lipopolisacáridos, normalmente son los componentes de bacterias muertas o atenuadas utilizadas como vacunas. Los adyuvantes extrínsecos son inmunomoduladores que están típicamente no covalentemente enlazados a los antígenos, y son formulados para mejorar las respuestas inmunitarias del hospedero. De este modo, han sido identificados adyuvantes que mejoran la respuesta inmunitaria a los antígenos administrados P660 parenteralmente. Algunos de "estos adyuvantes son tóxicos, no obstante, y pueden provocar efectos colaterales indeseables, haciéndolos inadecuados para el uso en humanos y en muchos animales. Por supuesto, únicamente el hidróxido de aluminio y el fosfato de aluminio (colectiva y comúnmente denominados como alumbre) son rutinariamente utilizados como adyuvantes en vacunas humanas y veterinarias . La eficacia del alumbre en las respuestas de anticuerpo cada vez mayores para los toxoides de la difteria y del tétanos, está bien establecida y una vacuna de HBsAg ha sido agregada con Jadyuvante de alumbre. Una amplia gama de adyuvantes extrínsecos pueden provocar respuestas inmunitarias potentes a los antígenos. Éstos incluyen saponinas acomplejadas con los antígenos de proteína membranal (complejos de estimulación inmunológica) , polímeros plurónicos con aceite mineral, micobacterias muertas y aceite mineral, adyuvante completo de Freund, productos bacterianos, tales como dipéptido de murámilo (MDP) y lipopolisacárido (LPS) , así como lípido A y liposomas. Para inducir eficientemente las respuestas inmunitarias humorales (HIR) y la inmunidad mediada por células (CMI) , los inmunógenos son frecuentemente emulsificados en adyuvantes . Muchos adyuvantes son tóxicos, induciendo granulomas, inflamaciones agudas y P660 crónicas (adyuvante completo de Freund, FCA) , citolisis (saponinas y polímeros plurónicos) y pirogenicidad, artritis y uveítis anterior (LPS y MDP) . Aunque el FCA es un excelente adyuvante y ampliamente utilizado en la investigación, éste no está probado para el uso en vacunas humanas y veterinarias, debido a su toxicidad. Las características deseables de los adyuvantes ideales incluyen: 1) falta de toxicidad; 2) habilidad para estimular -una respuesta inmunitaria de larga duración; 3) simplicidad de fabricación y estabilidad en el almacenamiento a largo plazo; 4) habilidad para provocar_ CMI y HIR a los antígenos administrados mediante diversas rutas, si se requiere; ) sinergia con otros adyuvantes; 6) capacidad de interactuar selectivamente con - poblaciones de células presentadoras de antígeno - (APC) ; 7) habilidad para provocar específicamente respuestas inmunitarias apropiadas específicas de células Thl o Th2; y 8) habilidad para incrementar selectivamente los niveles apropiados de isotipo de anticuerpo (por ejemplo IgA) contra antígenos.

P660 La Patente Norteamericana No. 4,855,283 otorgada a Lockhoff y colaboradores del 8 de agosto de 1989, la cual es incorporada en la presente por referencia, enseña los análogos de glucolípido que incluyen N-glucosilamidas, N-glucosilureas y N-glucosilcarbamatos, cada uno de los cuales está sustituido en el residuo de azúcar por un aminoácido, como inmunomoduladores o adyuvantes. De este modo, Lockhoff y colaboradores 1991 (ref. 20) reportaron que los análogos de N-glucolípido que muestran similitudes estructurales a los glucolípidos de origen natural, tales como glucofosfolípidos y glucoglicerolípidos , son capaces de provocar respuestas inmunitarias fuertes en las vacunas del "virus del herpes simple y vacuna del virus de la pseudorrabia. Algunos glucolípidos han sido sintetizados a partir de alquilaminas de cadena larga y ácidos grasos que son --enlazados directamente con los azúcares a través del átomos de carbono anomérico, para imitar las funciones de los residuos lipidíeos de origen natural. La Patente Norteamericana No. 4,258,029 otorgada a Moloney, cedida a la cesionaria de la presente e incorporada por referencia a la misma, enseña que el clorhidrato de octadecil-tirosina (OTH) funciona como un adyuvante cuando_ se forma en complejo con el toxoide tetánico y la vacuna del virus de la poliomielitis tipo I, II y III inactivada con formalina. También, Nixon-George y P660 colaboradores 1990, (ref. 21) reportaron que los esteres de octadecilo de los aminoácidos aromáticos formados en complejo con un antígeno recombinante superficial de la hepatitis B, mejoraban las respuestas inmunitarias del hospedero contra el virus de la hepatitis B. 2. Inmunoensayos Las proteínas receptoras de la lactoferrina, los análogos y/o fragmentos de las mismas de la presente invención, son útiles como inmunógenos, como antígenos en inmunoensayos, incluyendo ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) , RIAs y otros ensayos de enlace a anticuerpos, no ligados a enzimas, o procedimientos conocidos en la técnica para la detención de anticuerpos anti-proteínas receptoras de~_ lactoferrina, de Moraxella . En las pruebas de ELISA, la proteína receptora de lactoferrina, los análogos y/o fragmentos correspondientes a las porciones de la proteína LfR, son inmovilizados sobre una* superficie seleccionada, _ por ejemplo, una superficie capaz de enlazarse a las proteínas o a los péptidos, tales como las cavidades de una placa de microtitulación de poliestireno. Después del lavado para eliminar el receptor de dactoferrina incompletamente adsorbido, análogos y/o fragmentos del mismo, puede ser enlazada a la superficie seleccionada una proteína no específica tal como una P660 _ solución de albúmina sérica bovina (BSA) o caseína, que es conocida como antigénicamente neutra con respecto a la muestra de prueba. Esto permite el bloqueo de los sitios de adsorción no específicos sobre la superficie de inmovilización, y de este modo reduce el ruido o antecedente provocado por losdenlaces no específicos de los antisueros sobre la superficie. La superficie de inmovilización es luego puesta en contacto con una muestra, tal como materiales clínicos o biológicos, para ser probada de una manera que conduce a la formación del complejo inmunitario (antígeno/anticuerpo) . Este procedimiento puede incluir la dilución de la muestra con diluyentes, tales como BSA, gamma-globulina bovina (BGG) y/o solución salina amortiguada con fosfato (PBS) /Tween. La muestra se deja luego incubar por aproximadamente 2 a 4 horas, a temperaturas tales como de aproximadamente 252 a 372C. Después de la incubación, la superficie puesta en contacto con la muestra es lavada para eliminar el material que no formó el inmunocomplejo. El procedimiento de lavado puede incluir el lavado con una solución tal como PBS/Tween o un amortiguador de borato. Después de la formación de los inmunocomplejos específicos entre la muestra de prueba y la proteína receptora de lactoferrina enlazada, análogos y/o fragmentos de la misma, y el lavado subsecuente, la P660 aparición e incluso la cantidad de la formación de inmunocomplejo, pueden ser ^determinados al someter el inmunocomplejo a un segundo anticuerpo que tiene especificidad para el primer anticuerpo. Si la muestra de prueba es de origen humano, el segundo anticuerpo es un anticuerpo que tiene especificidad para las inmunoglobulinas humanas y en general IgG. Para proporcionar los medios de detección, el segundo anticuerpo puede tener una actividad asociada tal como una actividad enzimática que generará, por ejemplo, un desarrollo de color después de la incubación con un substrato cromogénico apropiado. La cuantificación puede ser luego lograda mediante la medición del grado de generación de color utilizando, por ejemplo, un espectrofotómetro. 3. Uso de secuencias como sondas de hibridación Las secuencias nucleotídicas de la presente invención que comprenden la secuencia del gen del receptor de la lactoferrina, permiten ahora la identificación y la clonación de los genes receptores de la lactoferrina a partir de cualquier especie de Moraxella . Las secuencias nucleotídicas que comprenden _ la secuencia de los genes receptores de la lactoferrina de la presente invención, son útiles por su habilidad para formar selectivamente moléculas dúplex o parejas con tramos P660 complementarios de otros genes LfR . Dependiendo de la aplicación, puede ser empleada una variedad de condiciones de hibridación para lograr los diversos grados de selectividad de la sonda hacia los otros genes LfR . Para un alto grado de selectividad, se utilizan condiciones relativamente estrictas para formar los dúplex o parejas, tal como baja concentración d.e sal y/o alta temperatura, tal __ como es proporcionada por cloruro de sodio 0.02 M a 0.15 M a temperatura de entre" aproximadamente 502C a 70aC. Para algunas aplicaciones, se requieren condiciones de hibridación menos estrictas tales como sal 0.15 M a 0.9 M, a temperaturas en el intervalo de entre aproximadamente 202C a 55 aC. Las condiciones de hibridación pueden también hacerse más estrictas mediante la adición de cantidades cada vez mayores de formamida, para desestabilizar la pareja híbrida. De este modo, las condiciones de hibridación particulares pueden ser fácilmente manipuladas, y será en general un método de elección dependiendo de los resultados deseados. En general, las temperaturas de hibridación convenientes en presencia de 50% de formamida sond 422C para una sonda que es 95 a 100% homologa al fragmento blanco, 372C para 90 a 95% de homología y 322C para 85 a 90% de homología. Estas condiciones de hibridación pueden emplearse para determinar secuencias de ADN que codifican para un P660 receptor de lactoferrina funcional de Moraxella y que se híbrida bajo condiciones estrictas con cualquiera de las secuencias de ADN (a) o (b) que se describieron antes. En una modalidad diagnóstica clínica, las secuencias de ácido nucleico de los genes LfR de la presente invención pueden ser .utilizados en combinación con un medio apropiado, tal como un marcador, para la determinación de la hibridación. Son conocidos una amplia variedad de indicadores apropiados en la técnica, incluyendo ligandos radioactivos, enzimáticos o de otro tipo, tales como avidina/biotina y marcación con digoxigenina, los cuales son" capaces de proporcionar una señal detectable. En algunas modalidades de diagnóstico, puede ser utilizada una etdqueta enzimática tal como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en vez de un marcador radiactivo . En el caso de los marcadores enzimáticos, se sabe que los substratos indicadores colorimétricos pueden emplearse para proporcionar un medio visible al ojo humano o visible espectrofoto étricamente, para identificar la hibridación específica con muestras que contienen las secuencias del gen LfR . Las secuencias de ácido nucleico de los genes LfR de da presente invención son útiles como sondas de hibridación en hibridaciones en solución y en las modalidades que emplean los procedimientos en fase sólida.

P660 _ En "las modalidades que involucran los procedimientos en fase sólida, el ADN de prueba (o ARN) proveniente de las muestras, tales como muestras clínicas, incluyendo exudados, fluidos corporales (por ejemplo, suero, fluido amniótico, efusión del oído medio, esputo, fluido de lavado broncoalveolar) o incluso tejidos, es adsorbido o de otro modo fijado a una matriz o superficie seleccionada. El ácido nucleico de hebra simple, fijado, es luego, sujeto a hibridación específica con sondas selectas que comprenden las secuencias de ácido nucleico de los genes LfR o fragmentos de los mismos de la presente invención, bajo condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares que se basan en -criterios particulares requeridos, dependiendo, por ejemplo del contenido G+C, el tipo de ácido nucleico blanco, la fuente del ácido nucleico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc. Después del lavado de la superficie de hibridación para eliminar las moléculas de la sonda, no específicamente enlazadas, "se detecta la hibridación específica, o incluso se cuantifica, por medio del marcador. Se prefieren seleccionar las porciones de la secuencia de ácido nucleico -que están conservadas entre especies de Moraxella . La sonda seleccionada puede ser de al menos 18 pares de bases y puede estar en el intervalo de aproximadamente 30 a 90 pb.

P660 4. Expresión de los genes receptores de Lactoferrina Los vectores plasmídicos que contienen el replicón y las secuencias control que son derivadas de especies compatibles con la célula hospedero, pueden ser utilizados para la expresión de los genes receptores de la lactoferrina en los sistemas de expresión. El vector posee ordinariamente un sitio de replicación, así como las secuencias de marcación las cuales son capaces de proporcionar la selección fenotípica de las células transformadas. Por ejemplo, E. coli puede ser transformada utilizando pBR322 que contiene los genes para la resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina y de este modo proporciona los medios fáciles para identificar las células transformadas. El plásmido pBR322 , u otro plásmido o fago microbiano, debe también contener, o ser modificado para contener, los promotores que puedan ser utilizados por la célula hospedero para la expresión de sus propias proteínas . Además, los vectores fago que contienen las secuencias replicón y control que son compatibles con el hospedero, pueden ser utilizadas como el vector de transformación en conexión con estos hospederos. Por ejemplo, el fago en Lambda GEM^-ll puede ser utilizado en la elaboración de los vectores fágicos recombinantes, los cuales pueden ser utilizados para transformar las células P660 hospedero, tales como E. coli LE392. Los promotores comúnmente utilizados en la construcción de ADN recombinante incluyen ß-lactamasa (peñicilinasa) y sistemas promotores de lactosa, y otros promotores microbianos, tales como el sistema promotor T7 corno" se describe en la Patente Norteamericana No. 4,952,496. Los detalles respecto a la secuencia nucleotídica de los promotores, son conocidos, haciendo posible que alguien de experiencia en la técnica los ligue funcionalmente con los genes. El promotor particular utilizado será en general un asunto de elección dependiendo de los resultados deseados. Los hospederos que son apropiados para la expresión de los genes receptores de la lactToferrina, fragmentos, análogos o variantes de los mismos, pueden incluir especies de E. coli , Bacillus, Haemophilus, _ hongos, levaduras, Moraxella, Bordetella o pueden ser utilizados los sistemas de expresión de baculovirus . De acuerdo con la presente invención, se prefiere elaborar la proteína receptora de lactoferrina, el fragmento o el análogo de _ la misma, mediante métodos recombinantes, particularmente ya que la proteína LfR de origen natural tal como se purifica a partir de un cultivo de una especie de Moraxella, puede incluir cantidades traza de materiales tóxicos u otros contaminantes. Este problema P660 puede ser evitado mediante el uso de la proteína LfR producida por técnicas recombinantes, en sistemas heterólogos que pueden ser aislados a partir del hospedero, a fin de reducir al mínimo los contaminantes, incluyendo otras proteínas de las cepa Moraxella , en el material purificado. Los hospederos particularmente deseables para la expresión a este respecto incluyen bacterias Gram positivas que no tienen LPS y están, por lo tanto, libres de endotoxina. Tales hospederos incluyen especies de Bacillus y pueden ser particularmente útiles para la producción de proteínas receptoras de lactoferrina no pirogénicas, fragmentos o análogos de las mismas. Además, los métodos recombinantes de producción permiten la fabricación de Lbpl o Lbp2 o ORF 3 o análogos o fragmentos respectivos de las mismas, separados uno del otro, lo cual es distinto de las proteínas combinadas normales, presentes en Moraxella .

Alineación de Secuencia y Análisis Las alineaciones de secuencias se efectuaron utilizando los programas de computadora ALIGN (marca comercial) o GENALIGN (marca comercial) (Inteligenetics Suite 5.4, Oxford Molecular. ALIGN™ utiliza el algoritmo Needleman-Wunsch (ref. 35) y sus modificaciones posteriores para localizar las regiones de similitud entre las dos P660 secuencias. El hallazgo de las regiones de máxima similitud entre dos secuencias puede resolverse en una forma rigurosa utilizando el cálculo de la matriz iterativa del algoritmo de Needleman y Wunsch de 1997. El análisis se restringe a regiones sin deleciones o inserciones internas, unidas por un número mínimo de bucles hacia afuera o deleciones. Sellers (ref. 36) desarrollo una medición métrica verdadera de la "distancia" entre las secuencias y Waterman (ref. 37) extendió este algoritmo para incluir inserciones y deleciones de longitud arbitraria. Smith (ref. _38) mejoró los algoritmos tempranos para encontrar las subsecuencias de máxima similitud. El algoritmo ha sido utilizado para analizar secuencias de hasta 5000 bases de largo dividiendo estas secuencias en segmentos de 200 a 400 bases, y después reensamblándolas en un acoplamiento final mejor. Este método de dividir la secuencias y reensamblarlas a probado ser bastante resistente. El algoritmo permite que se especifique el tamaño del segmento donde el programa busca las similitudes. Posteriormente el programa ensambla los segmentos después de verificar traslapes de subsecuencias adyacentes. La ponderación de las deleciones y el tamaño relativo de los traslapes puede controlarse. El programa expone los resultados para mostrar las diferencias en secuencias estrechamente relacionadas P660 GENALIGN™ es un programa de alineación múltiple. Hasta 99 secuencias utilizan el método Martínez /Regions (ref 39) o Needleman-Wunsch (ref. 35) que puede analizarse para el alineamiento. GENALIGN coloca las secuencias en un orden que pone a los pares de secuencia más estrechamente alineados en forma adyacente entre sí. Una secuencia en consenso es expuesta bajo múltiples alineaciones de secuencia. Las secuencias utilizadas para desarrollar el archivo de la secuencia en consenso se utiliza en otros programas. GENALIGN permite que los parámetros de la búsqueda cambien de manera que puedan formarse alineamientos alternos de las secuencias. Estos programas se utilizan empleando sus ajustes por "omisión. Los ajustes por omisión son los siguientes: Fas ± DB AMINO-Res-length = 2 DELetion-weight = 5.00 Length-factor = 0 Matching-weigth = 1.00 NUCLEIC-Res-length = 4 Spread-factor = 50 Findseq Parámetros de búsqueda : Matriz de similitud Unitario K-tupie 4 P660 Penalidad de no coincidencia 1 Penalidad de unión 30 Longitud del grupo de aleatorización 0 Calificación de discriminación 5 Parámetros de alineación: Tamaño de ventana 32 Penalidad de espacio libre 1.00 Penalidad de tamaño de espacio libre 0.33 Estos procedimientos pueden utilizarse para determinar las secuencias de_ ADN que codifican para aun receptor funcional de lactoferrina de Moraxella y que puede tener por lo menos 90% de identidad de secuencia con una de las secuencias de ADN (a) o (b) , descritas en lo que antecede.

Depósitos Biológicos Ciertos vectores que contienen al menos una porción que codifica para una proteína receptora de la lactoferrina a partir de cepas de Moraxella catarrhalis cepa 4223 y Q8 y una cepa de M. Catarrhalis RH408, que se describen y a las que se hace referencia en la presente, han sido depositadas con _ la American Type Culture Collection (ATCC) localizada en 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Estados Unidos de América, de P660 conformidad al Tratado de ~ Budapest, y antes de la presentación de esta solicitud. Las muestras de los vectores depositados y la cepa bacteriana se volverán disponibles al público, y las restricciones impuestas al acceso de los depósitos serán retiradas después del otorgamiento de una patente basada en esta solicitud de Patente Norteamericana. Además, el depósito será reemplazado si no pueden ser surtidas muestras viables por la Agencia Depositaría. La invención descrita y reclamada en la presente no está limitada en alcance por los materiales biológicos depositados, ya que la modalidad depositada se pretende únicamente como una ilustración de la invención. Cualesquiera vectores equivalentes o similares, o cepas que codifiquen para antígenós similares y equivalentes, como se describe en esta solicitud, están dentro del alcance de la presente invención.

Resumen del Depósito P6"60 EJEMPLOS La descripción anterior describe en general la presente invención. Puede ser obtenido un entendimiento más completo por referencia a los siguientes ejemplos específicos. Estos ejemplos se describen solamente para fines de ilustración, y no se pretende que limiten el alcance de la invención. Los cambios en la forma y sustitución de equivalentes, son contemplados como circunstancias que pueden ser sugeridos o para hacerlos expeditos. Aunque han sido empleados términos específicos en la presente, se pretende que tales términos sean en un sentido descriptivo y no para fines de limitación. Los métodos de genética molecular, de bioquímica de proteínas y de inmunología utilizados pero no explícitamente descritos en esta descripción y en estos Ejemplos, están ampliamente reportados en la literatura científica y están dentro de la habilidad de aquéllos de experiencia en la técnica.

Ejemplo 1 Este Ejemplo ilustra la generación de cebadores de oligonuclótido para la amplificación PCR de IbpA de M. catarrhalis . El Lpbl nativo se purificó por cromatografía de afinidad utilizando condiciones muy severas como las que se P660 describen en la Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 08/552,232, cedida a la" cesionaria de la presente y cuya exposición se incorpora aquí como referencia en ref. 40. La proteína purificada Lbpl se digirió por toda la noche con bromuro de cianógeno, después se separaron fragmentos mediante PAGE SDS y se sometieron a análisis de secuencia en un aparato modelo ABl 411 A . Se encontró que un fragmento de proteína de 13kDa tenía la secuencia N-terminal MVQYTYRKGKENKAH (SEQ ID No : 22) . Se preparó un cebador de oligonucleótido degenerado (4393. RD) con base en esta secuencia: CAA TAT ACI CGT AAA GGT GAA AAT AAA. GC ÍSSQ IB tfat 23) CAA TAT ACI CGT AAA CGC «AA A&C AAA GC (SEQ XD JJ»j 30} CAA TAT AC! CST AAA QGT CAÁ MC AAA OC (SEQ JP Nos 31} CAA TAT A£X CST AAA 3¡3C ßAA AAT AAA GC {SEQ I?t ?í?tj 32) CAÁ TAT ACI CGC AM ¡3GC GAA ftAC AAA GC (SE -ID #?-• 33) CAÁ TAS ACI COC AAA QHC 3£A AME- SAA *K SEQ ID Vos 34") CAA. TAT ACI CGC AAA GST =AA AAT AAA GC (SEQ ID «Oí SS) CS*. TA.T &CX CsC AAA S?T -SAA AAC AAA OC (SBQ ID HOI 3É*} Los residuos Y6 y K1 se omitieron del reporte de análisis de secuencias y los oligonucleótidos utilizados para amplificar por PCR al fragmento de 2.2 kb fueron los incorrectos, sin embargo resultó exitoso. Hay un pentapétido C-terminal conservado que se P660 encuentra en todas las secuencias de proteína Lbpl y Tbpl : LEMKF (SEQ. ID No . 26) . Un cebador de oligonucleótido (4572. RD) se preparó con base en la secuencia de ADN complementaria que codifica para este petapéptido : I E K 3? * S* CTT «AA ATG AAG TTT TAA 3 ' (SSQ ID »<•>» 3'J 3* QAA C?T TAC TTC AAA ATT 5 ' 457*. JUJ Í3BQ. 10 Nos 3&J Ej emplo 2 Este ejemplo ilustra la preparación del ADN cromosómico de las cepas 4223 y Q8 de M. catarrhalis . " El aislado de 4223 de M. catarrhalis fue inoculado en 100 ml de caldo BHI, y se incubó por 18 horas a 372C con agitación. Las células se recolectaron mediante centrifugación a 10,000 x g por 20 minutos. El aglomerado se utilizó para la extracción del ADN cromosómico de M. catarrhalis 4223. El aglomerado celular fue resuspendido en 20 ml de Tris-HCl de 10 mM (pH 7.5)-EDTA 1.0 mM (TE). Se agregaron pronasa y SDS a concentraciones finales de 500 µg/ml y 1% respectivamente, y la suspensión se incubó a 372C por 2 horas. Después de varias extracciones secuenciales con fenol, fenol : cloroformo (1:1), y cloroformo : alcohol isoamílico (24:1), el extracto acuoso se dializó, a 42C, contra cloruro de sodio 1.0 M por 4 horas, P660 y contra __TE__ (pH 7.5) por 48" horas adicionales con tres cambios de amortiguador. Se agregaron dos volúmenes de etanol al dializado, y el ADN se enrolló sobre una varilla de vidrio. El ADN se dejó secar al aire y se disolvió en 3.0 ml de agua. Se estimó que la concentración, mediante espectofotometría UV, era de aproximadamente 290 µg/ml. M. catarrhalis cepa Q8 fue cultivada en caldo BHI como se describe en el ejemplo 1. Las células fueron centrifugadas a partir de 50 ml de cultivo, mediante centrifugación a 5000 rpm por 20 minutos, a 42C. El aglomerado celular fue resuspendido en 10 ml de TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7.5) y se agregaron proteinasa K y SDS a concentraciones finales de 500 µg/ml y 1%, respectivamente. La muestra se incubó a 37 aC por 4 horas hasta que se obtuvo un lisado claro. El lisado fue extraído dos "veces con fenol/cloroformó (1:1), saturado con Tris, y dos veces con cloroformo. La fase acuosa final se dializó por 24 horas contra 2 x 1000 _ml de cloruro de sodio 1 M a 42C,> cambiando el amortiguador una vez, y por 24 horas contra 2 x 1000 ml de TE a 42C, cambiando el amortiguador una vez. El dializado final fue precipitado con dos volúmenes de 100% de etanol. El ADN fue enrollado, secado y r suspendido en 5 a 10 ml de amortiguador TE.

P660 Ejemplo 3 Este Ejemplo ilustra la amplificación PCR de un fragmento de lbpA de M. Catarrhalis y la generación de sondas de genotecas de clasificación. " La amplificación >CR se efectúa sobre ADN cromosómico aislado en el _ Ejemplo 2 utilizando los cebadores 4393. RD y 4572. RD bajo las siguientes condiciones de ciclado: 25 ciclos de 94°C por 1 minuto, 47°C por 30 segundos y 72 °C por 1 minuto. PCR4 es la amplificación del fragmento IbpA y PCR5 es la amplificación del fragmento lbpA Q8. Una banda específica de aproximadamente 2.2 kb se amplificó y se efectúo el análisis de secuencia parcial para asegurar que el producto del gen se relaciona con lbpA y no con tbpA . La secuencia de aminoácidos derivada se muestra en la Figura 1 y se ha alineado con las secuencia Lbpl 4223 completa para mostrar su colocación y la secuencia Tbpl 4223 (UsanZ 08/613 para indicar su característica única. El fragmento del gen 2.2 kb de longitud completa se marcó aleatoriamente con 32P y se utilizó para sondas de bibliotecas genómicas.

Ejemplo 4 Este ejemplo ilustra la generación y selección de genotecas de EMBL3.

P660 El ADN cromosómico de preparó como se describe en el Ejemplo 2. Se llevaron a cabo una serie de digestiones de restricción con Sau3AI del ADN cromosómico, en volúmenes finales de 10 µl cada uno, con el fin de optimizar las condiciones necesarias para generar cantidades máximas de fragmentos de restricción dentro de un intervalo de 15 a 23 kb . Utilizando las condiciones de digestión optimizada, se estableció una digestión a gran escala en un volumen de 100 µl conteniendo lo siguiente: 50 µl de ADN cromosómico (290 µg/ml) , 33 µl de agua, 10 µl de amortiguador 10X Sau3A (New England Biolabs), 1.0 µl de BSA (10 mg/ml, New England Biolabs), y 6.3 µl de Sau3A (0.04 U/µl) . Después de una incubación de 15 minutos a 372C, la digestión se terminó mediante la adición de 10 µl de Tris-HCl 100 mM (pH 8.0)-EDTA 10 mM-azul de bromofenol al 0.1%-glicerol al 50% (amortiguador de carga) . El ADN digerido fue sometido a electroforesis a través de un gel de agarosa al 0.5% en acetato de Tris 40 mM-Na2EDTA.2H20 2 mM (pH 8.5) (amortiguador TAE) a 50 V~ por 6 horas. La región «que contenía los fragmentos de restricción dentro de un intervalo de tamaño molecular de 15 a 23 kb fue cortada del gel y colocada en tubería de liálisis que contenía 3.0 ml de amortiguador TAE . El ADN fue electroeluido a partir del fragmento de gel mediante la aplicación de una fuerza de campo de 1.0 V/cm por 18 horas. El ADN electroeluido se P660 extrajo una vez con cada uno de fenol y fenol : cloroformo (1:1), y se precipitó con etanol. El ADN seco se disolvió en 5.0 µl de agua . EL ADN cromosómics^ fraccionado por tamaño fue ligado con los brazos de EMBL3 digeridos con BamHl (Prómega) , utilizando la ADN-ligasa T4 en un volumen final de 9 µl . La mezcla de ligadura completa fue empaquetada en el "fago lambda utilizando un equipo de empaquetamiento comercial (Amersham) , siguiendo las instrucciones del fabricante . La genoteca de ADN empaquetada fue amplificada sobré medio sólido. Se incubaron alícuotas de 0.1 ml de Escherichia coli cepa NM539 en sulfato de magnesio 10 mM (DO, = 0.5) a 372C por 15 minutos, con 15 a 25 µl de la genoteca de ADN empaquetada. Las muestras se mezclaron con 3 ml de agarosa al 0.6% que contenía 1.0% de peptona tripticasa BBL-0.5% de NaCl (agarosa BBL), y las mezclas se colocaron en placas, sobre placas de agar al 1.5% que contenían 1.0% de peptona tripticasa BBL-0.5% de cloruro de sodio, y se incubaron a 372C por 18 horas. Se agregaron Cantidades de 3 ml de Tris-HCl 50 mM (pH 7.5) -sulfato " de magnesio heptahidratado 8 mM-cloruro de sodio 100 mM-gelatina 0.01% (p/v) (amortiguador SM) a cada placa, y las placas se dejaron a 42C por 7 horas. El amortiguador SM que contenía el fago fue recolectado de las placas, y se combinaron, se almacenaron en un tubo con tapa roscada a 42C, con cloroformo. ~ Alícuotas de diez µl de la solución stock del fago se combinaron, cada una, con 100 c de 1 acepa E. coli LE392 en lOmM de MgSO, (DO,,n = 0.5) (células de siembra en placa) y se incubaron a 372C por 15 minutos. Las muestras se mezclaron con 3 ml, cada una, de agarosa superior BBL y las mezclas se vertieron sobre 1.5% de placas de agarosa que contenían 1% de triptona bacto -0.5% de extracto de levadura bacto - 0.5% de NaCl (agarosa LB, Difco) y se suplementaron con 200 µM de EDDA. Las placas se incubaron a 37 aC por 18 horas. Las placas se levantaron sobre filtros de nitroceluldsa (Amersham Hybond-C Extra) que =se hibridaron con el fragmento PCR de 2,2 kb marcado con 32P. Se obtuvieron varias clonas de fagos putativas a partir de cada genoteca y se seleccionaron las clonas 4223LÍR.Í7 y QBLfR.13 para mayor análisis.

Ejemplo 5 Este ejemplo ilustra la subclonación de clonas de fago que contienen los genes lfr de M. Catarrhalis . El análisis de enzima de restricción y la transferencia Southern utilizando las sondas de clasificación, indicó que por lo menos una porción de IbpA se localizó en aproximadamente el fragmento Hind III de 9 P660 kb de cada clona de fago. El fragmento Hind III de aproximadamente 9 kb proveniente de 4223LÍR.17 se subclonó en pUC 18, generando la clona pLDl-8. El fragmento Hind III de aproximadamente 9 kb proveniente de Q8LfR.13 se subclonó en pBluescript, generando el plásmido pLDWl . Los fragmentos EcoR V de aproximadamente 5.5 kB se subclonaron generando plásmido pLD3 y pLDW3 para los genes 4223 y Q8, respectivamente .

Ejemplo 6 Este Ejemplo ilustra la secuencia de análisis de las clonas que contienen los genes lfr de M. Catarrhalis a partir de las cepas 4223 y Q8. El análisis de secuencia de los fragmentos EcoR V de 5.5 kb a partir de pLD3 y pLDW3 , revelaron que cada uno contenía el extremo 3' de lbpB, el gen lbpA completo, y un tercer gen completo designado orf3 . El resto de los genes IbpB se encontró en los fragmentos Hind III de aproximadamente 9 kb a partir de pLDl- 8 y pLDWl . El análisis parcial de la enzima de restricción de los genes IbpB, IbpA, y orf3 de 4223 con base en la secuencia de nucleótido se muestra en la Figura 3. El análisis parcial con enzima de restricción de los genes IjpA, lbpB y orf3 de Q8, con base en las secuencias de nucleótidos se muestra en la Figura 5. Las secuencias completas de los genes lbpA, IbpB y orf3 que comprenden al locus lfr putativo de M. Catarrhalis 4223 y Q8, se muestran en las Figuras 2 y_ 4, respectivamente. La distancia intergénica entre los genes lbpB y " IbpA es de 184 nucleótidos, mientras que un solo nucleótido separa a los genes IbpA y orf3 . El sitio de unión de ribosoma y el promotor putativo se indican por el subrayado corriente arriba del lbpB y el IbpA . Un cuarto gen potencial se clonó en dos fragmentos Hind III de aproximadamente 9 kb . La secuencia N-terminal de la proteina nativa Lbpl es desconocida. El Jexamen de la secuencia de aminoácidos deducida del gen IbpA indica que hay dos codones de inicio ATG posibles en las posiciones 1 y 16. La primera posición está corriente abajo de los elementos del- promotor fuerte encontrados en la región intergénica IbpB-lbpA y la segunda posición está seguida de una secuencia de señal putativa. Las proteínas Lbpl de M. Catarrhalis 4223 y Q8 (desde el primer ATG) tienen valores de masa molecular de aproximadamente 110 kDa y son 99% idénticas. Las secuencias de proteína ' Lbpl deducidas de las cepas 4223 y Q8 de M. Catarrhalis se comparan en la Figura 6. También se comparan con el gen roA/lbpA proveniente de la cepa N. Meñingi tidis B?CV (ref. 24) y el gen lbpA proveniente de la cepa N. gonorrhoeae FA19 (ref. 25) . Se encuentra que las proteínas de M. Catarrhalis con P660 aproximadamente 32% idénticas y aproximadamente 50% similares a las proteínas de Neisseria . Como se muestra en la Figura 1, existe una homología de secuencia muy limitada entre las secuencias T l y Lbpl de M. Catarrhalis . Las secuencias de proteína Lbp2 reducidas de las cepas M. Catarrhalis 4223 y Q8 se coparan en la Figura 1. Las proteínas Lpb2 de 4223 y Q8 tienen masas moleculares de aproximadamente 99 kDa y son 2% idénticas y 95% similares entre sí. Una comparación con las proteínas Tbp2 de M. Catarrhalis muestra muy poca homología excepto en el epitome LEGGFY (SEQ ID No: 27) previamente identificado en las proteínas Tbp2 de H. Influenzae y N. Meningi tidis (Figura 8) . Un residuo de cisteína en la posición 32 está prec"*edido por una secuencia consenso del lipoproteínas sugiriendo que bp2 , al igual que Tbp2 , es una lipoproteína. Una característica inusual de las proteínas Lbp2 es el alto contenido de ácido aspártico y asparagina que es casi del 20%. Además, la composición de aminoácidos de Lbp2 de 4223 a partir de los residuos 698 a 751 es de aproximadamente 52% de ácido aspártico. Los genes Ifr orf 3 de 4223 y Q8 codifican para proteínas de masa molecular de aproximadamente 60 kDa, respectivamente. Una característica notorio de la proteína ORF3 es una secuencia de señal potencial, una fenilalanina terminal que normalmente está asociada con las proteínas ancladas a la P660 membrana, una secuencia de repetición interna del DGLG (SEQ ID No: 39) y un alto contenido de leucina de 15%. Las secuencias de proteína Lbp3 _se comparan en la Figura 9. Estas proteínas son 98% idénticas y 99% similares.

Ejemplo 7 — Este Ejemplo ilustra la construcción de vectores para expresar Lbpl de M. Catarrhalis a partir de la primera metionina en E. coli . Hay dos codones de inicio posibles al inicio del gen IbpA y por lo tanto se elaboran dos construcciones de expresión. El esquema de construcción para lbpA de 4223 y Q8 expresado a partir de la primera metionina se muestra en la Figura 10. Un fragmento de aproximadamente 200 pares de base del extremo 5 ' de lbpA a partir de ATG hacia un sitio BstE II se amplificó por PCR utilizando los cebadores 5405. RD y 5407. RD. Un sitio Nde I fue manipulado genéticamente en el extremo 5' para facilitar la clonación en el vector pT7-7. _ Mdel M S K B I T ÍSSß ID JJ? t 40} ' GGAATTCCAT ATG TCA AAA TCT AtC ACs A&, 3 ' S405 . KD (SSQ ID »O t 41) B A ? T - A A. ÍSEG Itt So i 427 S ' T TTA GAT GCC ATC ACG GTA ACC GCC GCC CC 3 ' <SEQ ID No » 43 ) P660 A AAT £?A CGSff TAG TCC CAT GG CGG CGß GG 5 ' S407 . KD (SEQ ID Ko i 44) Con objeto de subclonar el gen IbpA en pT7- 7, un fragmento de aproximadamente 515 pares de base del extremo 3 ' del gen proveniente de un sitio Sph I hacia el codón de paro se amplificó por PCR utilizando cebadores 5281. RD y 5282. RD y un sitio BamHl fue manipulado genéticamente en el extremo 3 ' . sph I G K £J D 1, H A M ?- = {SEQ XD Nos 45) GGC AAA CTG GAT TTG CAT QCC ATG ACA TCA 3' 52.41.RD (SEO ID Hot 46) = L E M K F * ÍSEQ ID NO* 4-?) AGT CTT GAA. ATG AAG TTT TAA 3' (SEQ SS H?; 46) TCA GAA CTT TAC TTC AAA ATT GCC CTA GGG C S» 5282.SD Para la subclona Q8, el plásmido pLDW3 , preparado como se describe en el Ejemplo 5, se digirió con BstE II y Sph I generando un fragmento de 2.3 kb de IbpA que se ligó con los fragmentos PCR de Nde^ I-BstE II y Sphl-BamH I y se clonó en el pT7- 7 digerido con Ndel y BamH I. El plásmido resultante pQWlA contiene pordo tanto al gen lbpA de Q8 de longitud completa proveniente de la primera metionina, bajo el control del promotor T7. El ADN de pQWlA se purificó y transformó por _ electroporación dentro de las células de electrocomponente BL2Í (DE3) para generar la cepa QWlA que se cultivó y se indujo utilizando IPTG. Las proteínas expresadas se resolvieron por SDS-PAGE y la proteína Lbpl inducida se visualizó con teñido de azul de Coomassie (Figura 11) . Para la subclona: 4223, el plásmido pLD3 , preparado como se describe en;_el Ejemplo 5, se digirió con BstEII y Sphl, generando un fragmento de 2.3 kb de lbpA, que_se ligó con los fragmentos PCR de Nde X-BstE XX y Sphl-BamH I y se clonó hacia el pT7- 7 digerido con Ndel y BamH I. El plásmido resultante pRDlA contuvo por lo tanto al gen--l£>pA 4223 de longitud completa proveniente de la primera metionina posible bajo el control del promotor T7. El _ ADN de pRDlA se purificó y transformó por electroporación dentro de las"" células de electrocomponente BL21 (DE3) para generar la cepa RDlA que se cultivó y se indujo utilizando IPTG. - Las proteínas expresadas se resolvieron por SDS-PAGE y la proteína Lbpl inducida se visualizó por tinción de azul de Coomassie (Figura 11) . La proteína Lbpl de Q8 se expresó a niveles muy altos pero la proteína Lbpl de 4223 se expresó a niveles substancialmente más bajos.

P660 Ejemplo 8 Este ejemplo ilustra la extracción y purificación de rLbpl a partir de E. coli . El procedimiento se ilustra en general en la Figura 14. Las células de E. coli provenientes de 500 ml de cultivo, preparadas como se describe en el Ejemplo 7, se resuspendieron en 40 ml de _Tris-HCl 50 mM, pH 8.0 que contenía 5 mM de AEBSF (inhibidor de proteasa) y NaCl 0.1 M, y se disgregaron por sonicación (3 x 10 min., 70% de ciclo de trabajo) . El extracto se centrifugó a 20,000 x g por 30 min. y el sobrenadante resultante, que contuvo más del 95% de las proteínas solubles provenientes de E. coli , se desechó. El aglomerado remanente (Figura 14, PPTl) se extrajo adicionalmente en 40 ml de Tris 50 mM, pH 8.0 que contenía Tritón X-100 al 0.5% y EDTA 10 mM. La mezcla se agitó a 4°C por al menos 1 hora y después se centrifugó a 20,000 x g por 30 min. y el sobrenadante que contenía las proteínas solubles residuales y la mayoría de las proteínas de membrana se desecho. El aglomerado resultante (Figura 14, PPT2) se extrajo adicionalmente en 40 ml de Tris 50 mM, pH 8.0 que contenía 1% de octilglucósido . La mezcla se agitó a 4°C durante por lo menos 1 hora y después se centrifugó a 20,000 x g por 30 min. El sobrenadante que contenía las proteínas contaminantes residuales se desecho. El aglomerado resultante (Figura 14, PPT3 ) obtenido después de las extracciones anteriores contuvo la proteína Lbpl como cuerpos de inclusión. La proteína rLbpl se solubilizó a partir de los cuerpos de inclusión en Tris "50 mM, pH 8.0, que contenía ß-guañidina 6 M y DTT 5 mM. Después de la centrifugación, el sobrenadante resultante se purificó adicionalmente en una columna de filtración de gel' Superdex 200 equilibrada en Tris-HCl 50mM, pH 8.0, que contenía guanidina 2 M y DTT 5 mM. Las fracciones se analizaron por SDS-PAGE y las que contenían rLbpl purificado se agruparon. Tritón X-100 se añadió a la fracción rLbpl combinada con una concentración final de 0.1%. La fracción se dializo por toda la noche a 4°C contra PBS y después se centrifugó a 20,00 x g por 30.

El rLbpl purificado se almacenó al menos 20°C. Las muestras de la purificación se analizaron por SDS-PAGE (Figura 15) .

Ejemplo 9 Este ejemplo ilustra la construcción de los vectores para expresar Lbpl de M. Catarrhalis a partir de la segunda metionina E. coli . El esquema de construcción para lbpA de 4223 o Q8 expresada a partir de la segunda metionina se muestra en la Figura 10. Un fragmento de aproximadamente 200 pares de bases del extremo 5 ' de lbpA proveniente de ATG hacia un P660 sitio BstE II se amplificó por PCR utilizando los cebadores 5406. RD y 5407. RD. Se manipuló genéticamente un sitio Nde I en el extremo 5 ' para facilitar la clonación en el vector pT7-7. ü ei M T H Si t, (SKO ID NO: SD) ' GQAATTCCAT ?! ACC ACG CAC CGC TTA AA 3' 540«,SD (SEQ ID NO ; SI) BfctE IX I» E> A I ? V T A A *S < T TTA GAT GCC ATC ACQ GTA ACC QCC GCC CC 3 ' 3 « A AAT CTA CGS TAG TGC CAT TGG CGG C6G GG 5 ' S 07.?5D El extremo 3 ' del gen lbpA se amplificó por PCR a partir del sitio de restricción Sph I hacia el codón de paro utilizando los cebadores 5281. RD y 5282. RD como se describe en el Ejemplo 8. Los fragmentos BstE II-Sph I de 2.3 kb descritos en el Ejemplo 8. Se ligaron a Nde I-BstE II y Sph I-Bamh I, que son fragmentos de PCR, y se clonaron en el pT7-7 que se había digerido con Ndel y BamH I. El plásmido pQWlB contuvo en esta forma un gen lbpA de Q8 de longitud completa proveniente de la segunda metionina y un plásmido pRDlB que contuvo un gen IbpA de 4223 de longitud completa proveniente de la segunda metionina bajo la dirección del promotor T7. El ADN se purificó y transformó por electroporación en células de electrocomponente BL21 P660 (DE3) para generar cepas recombinantes «que se cultivaron e indujeron utilizando IPTG. Las proteínas expresadas se resolvieron por SDS-PAGE y las proteínas Lbpl inducidas fueron visibles por tinción de azul de Coomassie (Figura 11) ."" Como puede observarse para la proteína más larga en el Ejemplo 8, la Lbpl más corta de Q8 se expresó a niveles mucho más altos que la proteína correspondiente de 4223.

Ejemplo 10 Este ejemplo ilustra la construcción de los vectores para expresar Lbp2 _ de M. Catarrhalis con una sec encia igual proveniente de E. coli . El esquema de construcción se ilustra en la Figura 12. Hay dos sitios de BspH I dentro de los genes lbpB de las cepas 4223 y Q8. JEl extremo 5' del gen lbpB se amplificó por PCR a partir del codón de inicio ATG a través del primer sitio BspH I -.generando un fragmento de aproximadamente 201 pares de base. Un sitio Ndel se manipuló genéticamente en _zel ATG para facilitar la clonación en el vector de expresión pT7-7. Los oligonucleótidos utilizados para la amplificación se ilustran abaj o : P660 _- M S T V * T ' P » {SS ID Mea-, Sí) ' OGAATTCCAT ATS AGT ACTOTC AAA ACC CCC CAC A 3' 5.533. RD (SEO ID Not 53) BapH I I P N T G H D N T N (SBQ ID Noi S4) ' A ATA CCG AAC ACA GGT ?&T G?fC AAC ?CC AAr 3' T TA!P GGC TTG TGT CCA GTA CTG TTG TGß TTA 5' El extremo 3 ' del gen lbpB se amplificó por PCR a partir del segundo sitio BspH I hacia el codón de paro TAA generando fragmento de 381 pares de bases. Un sitio BamH I se introdujo después del codón de paro para fines de clonación. Los oligonucleótidos utilizados para la amplificación se ilustran a continuación: S' AAT'GAG CCT ACT CAT GAA AAA ACC TT? GCC 3' SS35.HD {SEQ 'ID WOi »> K {SBC- ID Kor 5») S» GG GCT QTG TTT SßG GCT GTT AAA GAT AAA ?AA 3' CC CGA CAG AAA CCC CGA CAA TTT CTA TET ÁTT £££AJ3jSßC S* 5S3€ »«D BamH I (SEQ ID So. SI) Los plásmidos pLDl-8 o pLDWl, preparados como se P660 describe en el Ejemplo 4, se digirieron con BspH I para liberar un fragmento interno de 2.1 kb del gen lbpB que se ligó con los fragmentos PCR 5 ' y 3 ' y se clonó en el pT7-7 que se había digerido con Ndel y BamH I . Los plásmidos resu'ltantes , pLD2A y pLDW2A, contenían los genes IbpB de longitud completa de 4223 y Q8 bajo el control del promotor T7, respectivamente .

Ejemplo 11 Este Ejemplo ilustra la construcción de vectores para expresar las proteínas maduras de Lbp2 de M. catarrhalis a partir de E. coli . El esguema de construcción se ' ilustra en la Figura 12. Las lipoproteínas Lbp2 maduras putativas inician en el residuo Cys32. Un esquema similar al descrito en el Ejemplo 10 puede utilizarse para generar clonas de expresión. Para amplificar el extremo 5' del gen lbpB, se designa un cebador PCR homosentido que incluye un sitio Ndel para la clonación subsecuente y un codón de inicio ATG para la iniciación de la traducción, seguido inmediatamente por el residuo Cys32. El cebador antisentido es el mismo que se describe en el Ejemplo 9 (5534.RD) e incluye al sitio de clonación BspH I. El fragmento amplificado es de -112 pares de bases. Los oligonucleótidos se ilustran a continuación: P660 Ndel M C R S D -D I S V N (SEQ ID No: 62) 5 ' GGAATTCCAT ATG TGC CGC TCT GAT GAC ATC AGC GTC AAT 3 ' " . RD (SEQ ID No: 63) BspH I \ I P N T G H D N T N (SEQ ID No : 54) ' A ATA CCG AAC ACA GGT CAT GAC AAC ACC AAT .3 ' (SEQ ID No: 55) 3' T TAT GGC TTG TGT CCA GTA CTG TTG TGG TTA 5' 5534.RD (SEQ ID No: 56) El extremo 3 ' BspH I-BamH I del gen IbpB se amplifica por PCR como en el" Ejemplo 9 y el plásmido que expresa la Lbp2 madura se construye ligando los fragmentos PCR 5 ' y 3 ' con el fragmento BspH I de 2.1 kb y el vector pT7-7 digerido con Ndel y BamH I. Los plásmidos resultantes, pLD2B y pLDW2B, contienen al gen IbpB que codifica las proteínas Lbp2 maduras a partir de las cepas 4223 y Q8 bajo la dirección del promotor T7 , respectivamente .

Ejemplo 12 Este Ejemplo ilustra la construcción de un vector P660 para expresar Lbp3 de lfr de M. catarrhalis a partir de E. coli . El esquema de construcción se ilustra en la Figura 13. Los oligonucleótidos se utilizaron para generar el extremo 5 ' del gen orf 3 a partir del codón de inicio ATG hacia un sitio AlwN I. Un sitio Ndel se manipuló genéticamente en el extremo 5 ' para la clonación subsecuente en el pT7-7. Los oligonucleótidos se muestran abajo : Ndel M T C L P K T N P A L K V K H R 5 ' T ATG ACC TGT TTA CCA AAG ACC AAC CCT GCT TTA AAA GTC AAG CAC AGA 3 ' AC TGG ACA AAT GGT TTC TGG TTG GGA CGA AAT TTT CAG TTC GTG TCT AlwN I "" F L K Q V (SEQ ID No 64) TTT TTA AAG CAG GTG 3' 5532. RD (SEQ ID No 65) AAA AAT TTC GTC 5' 5457. RD (SEQ ID No 66) El plásmido pLDl-8 o pLDWl, preparado como describe en el Ejemplo 5, se digirió con BstE II generando un fragmento de 4.6 kb que se llenó con polimerasa Klenow antes de digerirse con AlwNI . El fragmento resultante de 1.8 kb se ligó con los oligonucleótidos empalmados Ndel-AlwN I y se clonó en el pT7-7 que se había digerido con P660 Ndel y Smal. Los plásmidos resultantes, pLRD3 y pLQW3 , contienen a los genes orf3 de longitud completa de las cepas 4223 y Q8 bajo la dirección del promotor T7 , respectivamente .

Ejemplo 13 Este Ejemplo describe la clonación y secuenciación del gen IbpB a partir de la cepa VH19 de M. catafrhalis . El ADN cromosómico se preparó a partir de la cepa VH19 de M. catarrhalis como se describió previamente en el Ejemplo 2. Los cebadores de oligonucleótido se diseñaron con base en la secuencia de flanqueo del gen IbpB de 4223. El cebador homosentido fue 5~ AAGCTTAGCATGATGGCATCGGCT 3 ' (SEQ ID No: 67) y el debador antisentido fue 5' TTAGCCCAAGGCAAATCTGGTGCA 3' (SEQ ID No : 68). El PCR se efectuó en amortiguador que _ contenía Tris-HCl lOmM (pH 8.3), cloruro de potasio 50 mM y cloruro de magnesio 2.5 mM. Cada mezcla de reacción de 100 µl contuvo 1 µg de ADN cromosómico, 0.1 µg de cada "cebador, 2.5 unidades de ADN polimerasa amplitaq (Perkin Elmer Cetus, Foster City, California) y 10 mM de cada dNTP (perkin Elmer Cetus) . Las condiciones de ciclado fueron 24 ciclos de 94°C por 1 minuto, 47 °C por 30 segundos y 72°C por 1 minuto. Los fragmentos específicos de 2.9 kb se amplificaron a partir P660 de dos reacciones independientes y se subclonaron en pCR II (Invitrogen, Carlsbad, California) , generando los plásmidos pVH19pcrl y pVHl9pcr2 a partir del análisis de secuencia. Una tercera amplificación PCR se efectuó sin la subclonación del ADN resultante. El ADN plásmido de pVH19pcrl y pVHl9pcr2 se preparó a partir de 50 ml de cultivos de toda la noche utilizando el equipo Qiagen Plasmid Midi (Qiagen Ine, Chatsworth, California) . El ADN amplificado por PCR se purificó para la secuenciación directa utilizando un equipo de purificación Qiagen PCR. Las muestras de ADN se secuenciaron en un secuenciador de ADN , ABl modelo 373A utilizando química de terminador con colorante. Los cebadores de oligonucleótido con una longitud de 17 a 25 bases se utilizaron para secuenciar ambas cadenas del ADN. La secuencia de nucleótidos (SEQ ID No: 69) del gen lbpB de VH19 y la secuencia de aminoácidos deducida de la proteína Lbp2 correspondiente (SEQ ID No: 70) se muestran en la Figura 16. La proteína Lbp2 de VH19 codificada es de 906 aminoácidos y es 77% idéntica y 84% similar a las proteínas Lbp2 de 4223 y Q8. Existe una secuencia de señal de lipoproteína putativa que es muy similar a las secuencias de señal 4223 y Q8. El alto contenido de Asp y Asn encontrado en las proteínas Lbp2 de 4223 y Q8 también está presente en la proteína LbpB de P660 VH19, al igual que la secuencia RGD. Un mapa de restricción parcial del gen lbpB de VH19 se muestra en la Figura 17. Una alineación de las proteínas Lbp2 provenientes de las cepas 4223, Q8 y VH19 de M. catarrhalis se muestra en la Figura 7. Las proteínas Lbp2 de M. catarrhalis también se comparan con las secuencias Lbp2 parciales de N. meningi tis cepa BNCV (ref. 3~1) y H44/76 (ref. 24) y N. gonorrhoeae cepa FA19 (ref. 25) . Existen pequeñas regiones dispersadas de homología de secuencia con las proteínas Tbp2 bacterianas conocidas (ref. 32) . Los residuos que se conservan entre las proteínas Tbp2 y las proteínas Lbp2 de M. catarrhalis están subrayados en la Figura 7 e incluyen al motivo LEGGFYG (SEQ ID No : 71) .

Ejemplo 14 Este ejemplo describe una construcción de vectores para la expresión de la proteína Lbp2 de M. catarrhalis . Por analogía con las proteínas Tbp2 , las proteínas Lbp2 se asumen como lipoproteínas y las construcciones se designan para la expresión de Lbp2 con o sin una secuencia de señal de lipopéptido. Existe un sitio Bgl I único en lbpb . Para expresar la proteína Lbp2 de longitud completa con secuencia guía (construcción a) , se P660 amplifico por PCR un fragmento 5 ' de aproximadamente 429 pares de bases a partir del codón de inicio Met1 hacia el sitio Bgl I y para expresar la proteína madura (construcción B) , un fragmento 5' de aproximadamente 329 pares de bases a partir del inicio Cys32 putativo hacia el sitio Bgl I fue amplificado por PCR. Los cebadores homosentido siguientes fueron los que se utilizaron: Nde I M S T V K T P H (SEQ ID No: 52) 5' GGAATTCCAT ATG AGT ACT GTC AAA ACC CCC CAC A 3' (SEQ ID No: 53) para construcción A o Nde I M C R S D D I S V N (SEQ ID No: 62) 5 ' GGAATTCCAT ATG TGC CGC TCT GAT GAC ATC AGC GTC AAT 3 ' (SEQ ID No: 63) para construcción B y el cebador antisentido fue: G K N L R G P I (SEQ ID No: 72) ' GGT AAA AAC TTG CGT CAG CCC ATC 3' (SEQ ID No: 73) 3' CCA TTT TTG AAC GCA GTC GGG TAG 5' (SEQ ID No: 74) Bgl I El plásmido que contiene lfr de Q8, pLDWl (Ejemplo 5), se digirió con Bgl I y EcoR I para liberar un fragmento IbpB de 2.3 kb que se ligó con los fragmentos PCR P660 Nde I - Bgl I y se clonó en el pT7-7 que se había digerido con Nde I y EcoR I. Los plásmidos resultantes pQW2A y pQW2B, contenían entonces al gen IbpB de Q8 que codifica para las proteínas Lbp2 maduras o de longitud completa bajo la dirección del promotor T7." Los plásmidos que expresan las proteínas Lbp2 maduras o de longitud completa de 4223 se construyeron en forma similar y se designaron pRD2A y pRD2B. No hubo expresión medible de rLbp2 a partir de construcciones que contenían_ la secuencia de señal, sin embargo las proteínas maduras rLbp2 se expresaron de 5 a 10% de las proteínas totales como cuerpos de inclusión y se purificaron por el mismo proceso que se describe para rLbpl en el Ejemplo 8. Las muestras a partir de la purificación se analizaron por SDS-PAGE (Figura 18) .

Ejemplo 15 Este Ejemplo describe la caracterización fusional de las proteínas de unión a lactoferrina recombinantes. La lactoferrina humana (Sigma) se conjugó con peroxidasa de rábano utilizando un estuche de peroxidasa de rábano (HRP) activada con maleimida EZ-Link (Pierce, Rockford, Illinois) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La actividad de unión a lactoferrina de rLbpl o rLbp2 se valoró modificando el procedimiento descrito para proteínas de unión a transferrina (referencia 17) . En P660 resumen, rLbpl o rLbp2 purificadas se sometieron a electroforesis discontinua a través de un gel SDS-PAGE al 12.5%. Las proteínas se transfirieron electroforéticamente a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Bedford, Massachusetts) y se incubaron con perqxidasa de rábano conjugada con lactoferrina humana (dilución 1:20) a 4°C por toda la noche. El substrato LumiGLO (Kirkegaard and Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, Maryland) se utilizó para la detección quimioluminiscente de la actividad de HRP de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La proteína rLbpl de Q8 no se unió a lactoferrina humana bajo estas condiciones, pero las "proteínas rLbp2 de 4223 _y rLbp2 de Q8 si se unieron (Figura 19) .

Ejemplo 16 Este Ejemplo describe la inmunización de animales y los inmunoensayos. Grupos de cobayos (Hartley outbred, Charles River, Quebec) se inmunizaron -intramuscularmente (i.m.) con dosis de 5 µg de proteína rLbpl o rLbp2 purificada emulsificada en CFA o IFA. Se determinaron los títulos de anticuerpo anti-Lbp en sueros" inmunológicos de los cobayos mediante ELISA antígeno específico. Se recubrieron cavidades de microtitulación (Nunc-MAXISORB, Nunc, Denmark) P660 con 50 µl de proteína (0.5 µg ml"1) . El título reactivo de un antisuero se definió como la inversa de la dilución más alta que muestra consistentemente un aumento al doble en la absórbancia a 450 nm respecto a aquella obtenida con las muestras de suero pre-inmunológico . Las proteínas recombinantes provocaron altos títulos de anticuerpos como se muestra en las Tablas 1 y 2.

Ejemplo 17 Este Ejemplo describe la conservación antigénica de Lbpl y Lbp2 en cepas de M. catarrhalis . Para demostrar la expresión dependiente del hierro de los genes lbpA y lbpB, se cultivaron cepas representativas de M. catarrhalis en BHI ± 25 mM EDDA. Los lisa.dos de célula completa se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron electroforéticamente a membrana de nitrocelulosa. Se utilizaron antisueros de cobayo anti-rLbpl de Q8, anti-rLbp2 de Q8 y anti-rLbp2 de 4223 como primeros anticuerpos y la proteína G del conjugado de peroxidasa de rábano (ZYMED) se utilizó como anticuerpo secundario. Para valorar la conservación antigénica, aproximadamente 90 cepas de 'M. catarrhalis , obtenidas de Norte América o Finlandia, se cultivaron en BHI + 25 mM EDDA y se efectuaron inmuno- transferencias (inmunoblots) con anticuerpo anti-rLbp2 de_4223 de cobayo, en la forma P660 anterior. Todas las cepas mostraron una banda de proteína reactiva con el anticuerpo anti-rLbp2. Hubo muy poca heterogenicidad de tamaño para las proteínas Lbp2 provenientes de las 90 cepas de M. catarrhalis, variando de aproximadamente 100 kDa hasta 105 kDa. Los inmunoblots representativos se ilustran en la Figura 19.

Ejemplo 18 Este Ejemplo describe la valoración utilizada para determinar la actividad de anticuerpo bactericida de los anticuerpos anti-Lbp. Los ensayos se efectuaron como se describe en la referencia 33. En resumen, las cepas de M. catarrhalis se cultivaron hasta una D0578 de 0.5 en medio BHI que contiene 25 mM de EDDA. Las bacterias se diluyeron de manera que las placas de control pre-sangrado contuvieron 100 a 300 unidades formadoras de colonia. Los antisueros anti-rLbpl o anti-rLbp2 de cobayo y los controles pre-sangrado se calentaron a 56°C por 30 minutos para inactivar el complemento endógeno y se diluyeron 1:64 con amortiguador veronal que contiene 0.1% BSA (VBS) . El complemento de cobayo (Biowhittaker, Waikersville, Maryland) se diluyó 1:10 en VBS. Veinticinco µl de cada antisuero diluido, las bacterias y complementos se añadieron a cavidades por duplicado de una placa de microtitulación en 96 cavidades P660 (Nur?c) . Las placas se incubaron a 37°C por 60 minutos, se agitaron suavemente a 70 rpm en una plataforma giratoria. Cincuenta y cinco µl de cada mezcla de reacción se colocaron sobre placas de agar Mueller Hinton (Becton-Dickinson, Cockeysville, Maryland) «que se incubaron a 37°C por 24 horas, después a temperatura ambiente por 24 horas, antes «que se contaran las bacterias . Se determinó que los antisueros eran bactericidas si > 50% de las bacterias se exterminaban en comparación con los controles negativos . Seis cepas de diferentes orígenes geográficos y anatómicos se probaron. Los_ datos del Cuadro 3 ilustran que el anticuerpo anti-rLbp2 4223 era bactericida para la cepadhomóloga y tres a cinco cepas heterólogas.

SUMARIO DE Lfl. DESCRIPCIÓN En el sumario de esta descripción, la presente invención proporciona moléculas de ADN purificadas y aisladas que contienen los genes del receptor de lactoferrina de Moraxella catarrhalis, las secuencias de estos genes del receptor de lactoferrina, y las secuencias de aminoácidos derivadas de los mismos. Los genes y las secuencias de ADN son útiles para el diagnóstico, inmunización, y la generación Jde reactivos de diagnóstico e inmunológicos. Las composiciones inmunogénicas incluyen vacunas, en base a Lbpl y l Lbp2 y/o ORF3 recombinantes, P660 _i expresados, porciones de los mismos, o análogos de los mismos, se pueden preparar para la prevención de enfermedades provocadas por~ Moraxella .' " Son posibles modificaciones dentro del alcance de esta invención.

TABLA 1 Títulos de anticuerpos bactericidas para anti- l nativo Los títulos bactericidas son expresados como la dilución reciproca de antisuero capaz de exterminar 50% de células M: Catarrhalis .

TABLA 2 Los "Títulos ELISA para anticuerpos anti-Lbp de cobayos cultivados contra proteínas " recombinantes de unión a lactoferrina P660 TABLA 3 Actividad de anticuerpo bactericida de anticuerpos anti- rLbp2 de cobayo área geográfica donde se aisló la cepa 2 fuente anatómica de aislado clínico. MEF es fluido de oído medio de pacientes con otitis media 3 exterminación por antisuerq_ diluido 1:64, en comparación con controles negativos: - indica 0-25% exterminación; ± indica 26-49% de exterminación; + indica 50-75% de exterminación; ++ indica 76-100% de exterminación. NT- no probado _ P660 REFERENCIAS Brorson, J-E., A. Axelsson, and S. E. Holm. i976. Studies on Branhamella catarrhalis (Neisseria catarrhalis) with special reference to maxillary sinusitis. Sean. J. Infect. Dis. 8: 151-155. Catlin, B. W. , 1990. Branhamella catarrhalis: an organism gaining respect as a pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 3: 293-320. Hager, H., A. Verghese, S. Alvarez, and S. L. Berk. 1987. Branhamella catarrhalis respiratory infections. Rev. Infect. Dis. 9: 1140-Í199. JVEcLeod, D. T., F. Ah ad, M. J. Croughan, and M. A. ,Calder . 1986. Bronchopulmonary infection due to M. Catarrhalis . Clinical _ features and therapeutic response. Drugs 31 (Suppl. 3): 109-112. Nicotra, B., M. Rivera, J." I. Luman, and R. J. Wallace. .1986. Branhamella catarrhalis as a lower respiratory tract pathogen in patients with chronic lung disease. Arch. Intern. Med. 146:890-893. Ninane, G. , J. Joly, and M. Kraytman. 1978. Bronchopulmonary infection due to Branhamella catarrhalis 11 cases assessed by transtracheal puncture. Br. Med. Jr. 1:276-278. Srinivasan, G., M.J. Raff, W.C. Templeton, S.J. Givens, R.C. Graves, and J.C. Mel. 1981. Branhamella _ catarrhalis pneumonía. Report of two cases and review of the literature. Am. Rev. Respir. Dis. 123:553-555. 8. West, M. , S.L. Berk, and J.K. Smith. 1982. Branhamella catarrhalis pneumonía. South. Med. J. 75: 1021-1023. 9. Christensen, J. J. , and B. Bruun. 1985. Bacteremia caused by a beta-lactamase producing strain of Branhamella catarrhalis. Acta. Pathol. Microbiol. Immunol. Scand. Sect. B 93:273-275. 10. Craig, D.B., and P.A. Wehrle. 1983. Branhamella catarrhalis septic arthritis. J. Rheumatol. 10:985-986. 11. Guthrie, R. , K. Bakenhaster, R. Nelson, and R. Woskobnick. 1988. Branhamella catarrhalis sepsis: a case report and review of the literature. J. Infect. Dis. 158:907-908. 12. Hiroshi, S., E.J. Anaissie, N. Khardori , and G.P. Bodey. 1988. Branhamella catarrhalis septicemia in patients with leukemia. Cáncer 61:2315-2317. 13. O'Neill, J.H., and P.W. Mathieson. 1987. Meningitis due to Branhamella catarrhalis. Aust. N. Z. J. Med. 17:241- 242. 14. Murphy, T.F. 1989. The surface of Branhamella catarrhalis: a systematic approach to the surface antigens of an emerging pathogen. Pediatr. Infect. Dis. J. 8: S75-S77. 15. Van Haré, G. F., P. A. Shurin, C. D. Marchant, N. A.

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Claims (25)

1. REIVINDICACIONES 1. Una molécula de ácido nucleico, purificada y aislada, que codifica para una proteína del receptor de lactoferrina de una cepa de Moraxella o un fragmento o un análogo de la proteína del receptor de lactoferrina.
2. 2. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada en que la proteína del receptor de lactoferrina es la proteína 1 de unión del receptor de lactoferrina (Lbpl) de la cepa Moraxella . ^
3. 3. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada en que la proteína del receptor de lactoferrina es la proteína 2 de unión del receptor de lactoferrina (Lbp2) de la cepa de Moraxella .
4. 4. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 1, caracterizada en que la proteína del receptor de lactoferrina es la proteína 3 de cuadro de lectura abierto (0RF3) de la cepa de Moraxella .
5. 5. La molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la cepa de Moraxella es una cepa de Moraxella catarrhalis .
6. 6. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 5, caracterizada en que la cepa de Moraxella catarrhalis es Moraxella catarrhalis 4223, Q8 ó VH16.
7. 7. La molécula de ácido nucleico según P660 cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, que tiene un mapa, de restricción como el que se muestra en la figura 5 para M. catarrhalis 4223, en la figura 5 para M. catarrhalis Q8 o en la figura 17 para M. catarrhalis VH19 o el mapa equivalente para otra cepa de M. catarrhalis .
8. 8. La molécula "de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 7, que tiene una secuencia de ADN seleccionada a partir del grupo que consiste de: (a) una secuencia de ADN como se expone en las Figuras 2 ó 4 (SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 69) ó la secuencia de ADN complementaria de la misma; (b) una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos como se expone enda Figura 2 ó 4 (SEQ ID NOS: 11, '12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 70) ó la secuencia de ADN complementaria de la misma; y_ (c) una secuencia de ADN que codifica para una proteína funcional del receptor de lactoferrina de Moraxel 1 a .
9. 9. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, caracterizada en que la secuencia de ADN definida en (c) se híbrida con cualquiera de las secuencias definidas en (a) ó (b) , bajo condiciones severas.
10. 10. La molécula de ácido nucleico según la reivindicación 8, caracterizada en que la secuencia de ADN P660 definida en (c) es la que_codifica a la proteína del receptor de lactoferrina de otra cepa de Moraxella .
11. 11. Un vector adaptado para la transformación de un hospedero que contiene la molécula de ácido nucleico reivindicada según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10.
12. 12. El vector según la reivindicación 11, que codifica para un fragmento de una proteína del receptor de lactoferrina y que tiene las características de un plásmido seleccionado a partir del grupo que consiste de pLD3 , pLDW3, pLDl-8 (ATCC 97,997), pLDWl (ATCC 97,998) pVH19pcrl y pVH19pcr2.
13. 13. El vector según la reivindicación 11, que comprende además el medio de expresión acoplado operativamente a la molécula de ácido nucleico para que el hospedero que contiene al vector exprese la proteína del receptor de lactoferrina de una cepa de Moraxella o el fragmento o el análogo de la proteína del receptor de lactoferrina .
14. 14. El vector según la reivindicación 13, que tiene las características de un plásmido pRDIA, pRDIB, pQWlA, pQWlB, pRD2B, pQW2B, pLRD3 y pLQW3.
15. 15. Un hospedero transformado que contiene un vector de expresión según la reivindicación 13 ó 14.
16. 16. Un método para formar una proteína P660 recombinante del receptor de lactoferrina substancialmente pura, caracterizado por: cultivar el hospedero transformado de la reivindicación 15 para expresar una proteína del receptor de lactoferrina como cuerpos de inclusión, purificar los cuerpos de inclusión libres de material celular y proteínas solubles, solubilizar la proteína del receptor de lactoferrina a partir de los cuerpos de inclusión purificados, y purificar la proteína del receptor de lactoferrina a un fragmento inmunogénico o un análogo del mismo libre de otros materiales solubilizados.
17. 17. El método según la reivindicación 16, caracterizado en que la proteína del receptor de lactoferrina es Lbpl sola, Lbp2 sola o una mezcla de Lbpl y Lbp2.
18. 18. El método según la reivindicación 16 ó 17, caracterizado en que la proteína del receptor de lactoferrina es al menos 70 % pura.
19. 19. El método según la reivindicación 18, caracterizado en que la _proteína del receptor de lactoferrina es al menos 90 % pura.
20. 20. Una proteína recombinante del receptor de lactoferrina, o un fragmento o. un análogo de la misma, que P660 se puede producir por el hospedero transformado reivindicado en la reivindicación 15.
21. 21. La proteína según la reivindicación 20, que es la proteína 1 de unión del receptor de lactoferrina (Lbpl) de la cepa de Moraxella libre de otras proteínas de la cepa de Moraxella; o la proteína 2 de unión del receptor de lactoferrina (Lbp2) de la cepa de Moraxella libre de otras proteínas de la cepa de Moraxella .
22. 22. La proteína según la reivindicación 20 ó 21, en donde la cepa de Moraxella es una cepa de Moraxella catarrhalis .
23. 23. Una composición inmunogénica, caracterizada por al menos un componente activo seleccionado a partir del grupo que consiste de: (A) una molécula de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que codifica para una proteína del receptor de lactoferrina de una cepa de Moraxella o un fragmento o un análogo de la proteína del receptor de lactoferrina; (B) una proteína recombinante de receptor de lactoferrina o un fragmento o análogo de la misma, según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22; y un portador farmacéuticamente aceptable para la misma, el por lo menso un componente activo produce una respuesta inmunitaria cuando se administra a un hospedero. P660
24. 24. Un método para determinar la presencia, en una muestra, del ácido nucleico que codifica para una proteína del receptor de lactoferrina de una cepa de Moraxella, caracterizado por los pasos de: (a) poner en contacto la muestra con la molécula de ácido nucleico reivindicada en cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10, para producir duplas que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquier molécula de ácido nucleico que codifica para la proteína del receptor de lactoferrina de una cepa de Moraxella presente en la muestra e hibridable específicamente con ésta; y (b) determinar la producción de las duplas.
25. 25. Un equipo de diagnóstico para determinar la presencia, en una muestra, de ácido nucleico que codifica para una proteína de receptor de lactoferrina de una cepa de Moraxella, que comprende: (a) la molécula de__ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 10; (b) un medio para poner en contacto la molécula de ácido nucleico con la muestra para producir duplas que comprenden la molécula de ácido nucleico y cualquier ácido nucleico presente en la muestra e hibridable con la molécula de ácido nucleico; y (c) un medio para determinar la producción de las duplas . _ P660 -