DE69927017T2

DE69927017T2 - Verbindungen aus moraxella catarrhalis

Info

Publication number: DE69927017T2
Application number: DE69927017T
Authority: DE
Inventors: Joelle Thonnard
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; SmithKline Beecham Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2019-05-08
Also published as: ZA200006522B; NZ508322A; WO1999058684A3; EP1078064A2; NO20005697L; IL139612A; IL139612A0; TR200003345T2; US7122197B1; CN1876679A; PL344792A1; JP2002514425A; EP1078064B1; HUP0102853A3; BR9911773A; JP4503175B2; DK1078064T3; CA2328502A1; KR20010043573A; DE69927017D1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft Polynukleotide (hier als "BASB020-Polynukleotid(e)" bezeichnet), durch sie codierte Polypeptide (hier als "BASB020" oder "BASB020-Polypeptid(e)" bezeichnet), rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, einschließlich Impfstoffe gegen bakterielle Infektionen. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung diganostische Tests (Assays) zum Nachweis einer Infektion mit bestimmten Pathogenen.
Hintergrund der Erfindung
Moraxella catarrhalis (ebenfalls Branhamella catarrhalis genannt) ist ein Gram-negatives Bakterium, das häufig aus den humanen oberen Atemwegen isoliert wird. Es ist verantwortlich für verschiedene Pathologien, deren hauptsächliche Mittelohrentzündung bei Kleinkindern und Kindern und Lungenentzündung bei älteren Menschen sind. Es ist ebenfalls verantwortlich für Sinusitis, Krankenhausinfektionen und, weniger häufig, invasive Krankheiten.
Mittelohrentzündung ist eine wichtige Kinderkrankheit, sowohl nach Anzahl der Fälle als auch nach ihren potentiellen Folgeerscheinungen. Mehr als 3,5 Millionen Fälle werden jedes Jahr in den Vereinigten Staaten aufgezeichnet, und es wird geschätzt, daß 80 % der Kinder wenigstens einen Mittelohrentzündungsfall erfahren haben, bevor sie das Alter von 3 erreichen (J.O. Klein, (1994) Clin. Inf. Dis. 19:823). Unbehandelt oder chronisch kann diese Krankheit zu Gehörverlusten führen, die temporär (im Fall von Flüssigkeitsansammlung im Mittelohr) oder permanent (falls der Hörnerv beschädigt wird) sein können. Bei Kleinkindern können solche Gehörverluste für eine verzögerte Spracherlernung verantwortlich sein.
Drei Bakterienarten werden primär aus dem Mittelohr von Kindern mit Mittelohrentzündung isoliert: Streptococcus pneumoniae, nicht-typifizierbares Haemophilus influenza (NTHi) und M. catarrhalis. Sie sind in 60 bis 90 % der Fälle vorhanden. Eine Übersicht über kürzliche Untersuchungen zeigt, daß S. pneumoniae und NTHi beide ca. 30 % und M. catarrhalis ca. 15 % der Mittelohrentzündungsfälle darstellen (T.F. Murphy (1996) Microbiol. Rev. 60:267). Andere Bakterien konnten aus dem Mittelohr isoliert werden (H. influenzae Typ B, S. pyogenes etc.), aber mit einer viel geringeren Häufigkeit (2 % der Fälle oder weniger).
Epidemiologische Daten weisen darauf hin, daß für die Pathogene, die im Mittelohr gefundenen werden, die Besiedlung der oberen Atemwege eine absolute Vorbedingung für die Entwicklung einer Ohrentzündung ist; jedoch sind auch andere ebenso erforderlich, um zur Krankheit zu führen (D.P. Dickinson et al., (1988) J. Infect. Dis. 158:205; H.L. Faden et al., (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612). Diese sind wichtig zur Auslösung der Wanderung der Bakterien in das Mittelohr über die eustachischen Röhren, gefolgt von der Einleitung eines Entzündungsprozesses. Diese Faktoren sind bis heute unbekannt. Es wurde postuliert, daß eine vorübergehende Anomalie des Immunsystems, z.B. im Anschluß an eine Virusinfektion, eine Unfähigkeit zur Bekämpfung der Besiedlung der Atemwege verursachen könnte (H.L. Faden et al., (1994) J. Infect. Dis. 169:1312). Eine alternative Erklärung besteht darin, daß der Kontakt mit Umweltfaktoren eine bedeutendere Besiedlung einiger Kinder erlaubt, die anschließend anfällig für die Entwicklung von Mittelohrentzündung wegen der anhaltenden Gegenwart von Mittelohr-Pathogenen werden (T.F. Murphy (1996) Microbiol. Rev. 60:267).
Die Immunreaktion gegen M. catarrhalis ist schlecht charakterisiert. Die Analyse von Stämmen, die sequentiell aus dem Nasen-Rachenraum von Babys isoliert wurden, die über das Alter von 0 bis 2 Jahren verfolgt wurden, weist darauf hin, daß sie häufig neue Stämme erlangen und eliminieren. Dies weist darauf hin, daß eine wirksame Immunreaktion gegen diese Bakterien durch die besiedelten Kinder aufgebaut wird (H.L. Faden et al., (1994) J. Infect. Dis. 169:1312).
In den meisten untersuchten Erwachsenen wurden bakterizide Antikörper identifiziert (A.J. Chapman et al., (1985) J. Infect. Dis. 151:878). Stämme von M. catarrhalis stellen Variationen in ihrer Fähigkeit dar, Serumbakterizider Aktivität zu widerstehen: allgemein sind Isolate aus erkrankten Individuen resistenter als diejenigen, die nur besiedelt sind (C. Hol et al., (1993) Lancet 341:1281, K.L. Jordan et al., (1990) Am. J. Med. 88 (Suppl. 5A):285). Serumresistenz könnte deshalb als ein Virulenzfaktor der Bakterien betrachtet werden. Eine opsonisierende Aktivität wurde in den Seren von Kindern beobachtet, die sich von einer Mittelohrentzündung erholen.
Die Antigene, auf die durch diese unterschiedlichen Immunreaktionen in Menschen abgezielt wird, wurden nicht identifiziert, mit der Ausnahme von OMP B1, einem 84 kDa Protein, dessen Expression durch Eisen reguliert wird und das durch die Seren von Patienten mit Lungenentzündung erkannt wird (S. Sethi et al., (1995) Infect. Immun. 63:1516), und von UspA1 und UspA2 (D. Chen et al., (1999) Infect. Immun. 67:1310).
Einige andere Membranproteine, die auf der Oberfläche von M. catarrhalis vorhanden sind, wurden unter Verwendung eines biochemischen Verfahrens oder wegen ihrer potentiellen Beteiligung an der Induzierung einer Schutzimmunität charakterisiert (für eine Übersicht siehe T.F. Murphy, (1996) Microbiol. Rev. 60:267). In einem Lungenentzündungsmodell der Maus begünstigt die Gegenwart von Antikörpern, die gegen einige von ihnen entwickelt wurden (UspA, CopB), eine schnellere Klärung der Lungeninfektion. Ein anderes Polypeptid (OMP CD) ist unter den M. catarrhalis-Stämmen hoch konserviert und stellt Homologien mit einem Porin von Pseudomonas aeruginosa dar, das sich als wirksam gegen dieses Bakterium in Tiermodellen erwiesen hat.
Die Häufigkeit von Infektionen mit Moraxella catarrhalis hat in den vergangenen Jahrzehnten dramatisch zugenommen. Dies wurde dem Auftreten von mehrfach Antibiotika-resistenten Stämmen und einer zunehmenden Bevölkerung von Menschen mit geschwächten Immunsystemen zugeschrieben. Es ist nicht mehr ungewöhnlich, Moraxella catarrhalis-Stämme zu isolieren, die gegen einige oder alle der Standardantibiotika resistent sind. Dieses Phänomen hat einen nicht erfüllten medizinischen Bedarf und eine Nachfrage nach neuen antimikrobiellen Mitteln, Impfstoffen, Wirkstoffdurchmusterungsverfahren und diagnostischen Tests für diesen Organismus geschaffen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft BASB020, insbesondere BASB020-Polypeptide und BASB020-POlynukleotide, rekombinante Materialien und Verfahren zu ihrer Herstellung. In einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung Verfahren zur Verwendung solcher Polypeptide und Polynukleotide, unter anderem einschließlich der Prävention und Behandlung von mikrobiellen Krankheiten. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung diagnostische Tests zum Nachweis von Krankheiten, die mit mikrobiellen Infektionen verbunden sind, und von Zuständen, die mit solchen Infektionen verbunden sind, wie z.B. Tests zum Nachweis der Expression oder Aktivität von BASB020-Polynukleotiden oder -Polypeptiden.
Verschiedene Veränderungen und Modifikationen innerhalb des Geistes und Umfangs der offenbarten Erfindung werden den Fachleuten durch das Lesen der folgenden Beschreibung und durch das Lesen der anderen Teile der vorliegenden Offenbarung leicht ersichtlich werden.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft BASB020-Polypeptide und -Polynukleotide, wie sie in größerem Detail nachfolgend beschrieben werden, Insbesondere betrifft die Erfindung Polypeptide und Polynukleotide von BASB020 von Moraxella catarrhalis, das durch Aminosäure-Sequenzhomologie mit dem TlyC-Hämolysinprotein von Serpulina hyodysenteriae verwandt ist. Die Erfindung betrifft spezielle BASB020 mit den in SEQ ID NO:3 oder 5 und SEQ ID NO:4 oder 6 dargestellten Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen. Es versteht sich, daß die im nachfolgenden Sequenzprotokoll als "DNA" aufgeführten Sequenzen eine exemplarische Darstellung einer Ausführungsform der Erfindung sind, da die Durchschnittsfachleute erkennen werden, daß solche Sequenzen nützlich in Polynukleotiden allgemein, einschießlich Ribopolynukleotiden, eingesetzt werden können.
Polypeptide
In einem Aspekt der Erfindung werden Polypeptide von Moraxella catarrhalis, die hier als "BASB020" und "BASB020-Polypeptide" bezeichnet werden, sowie biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Varianten davon und dieselben umfassende Zusammensetzungen bereitgestellt.
Die vorliegende Erfindung sieht ferner vor:

(a) ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die wenigstens 85 g Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97–99 % oder eine genaue Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:4 oder 6 hat;
(b) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97–99 % oder eine exakte Identität mit SEQ ID NO:3 oder 5 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:3 bzw. 5 hat; oder
(c) ein Polypeptid, das durch ein isoliertes Polynukleotid codiert wird, das eine Polynukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97–99 % oder ein exakte Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 hat.

Die in SEQ ID NO:2, 4, 6 oder 8 bereitgestellten BASB020-Polypeptide sind die BASB020-Polypeptide aus den Moraxelle catarrhalis-Stämmen MC2931 (ATCC 43617), MC2912, MC2913 und MC2969.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein immunogenes Fragment eines BASB020-Polypeptids bereit, das heißt einen zusammenhängenden Teil des BASB020-Polypeptids, der die gleiche oder im wesentlichen die gleiche immunogene Aktivität wie das Polypeptid hat, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 umfaßt. Das heißt, das Fragment (falls erforderlich bei Kupplung an einen Träger) kann eine Immunreaktion hervorrufen, die das BASB020-Polypeptid erkennt. Ein solches immunogenes Fragment kann zum Beispiel das BASB020-Polypeptid einschließen, dem eine N-terminale Leitsequenz und/oder eine Transmembrandomäne und/oder eine C-terminale Ankerdomäne fehlt. In einem bevorzugten Aspekt umfaßt das erfindungsgemäße immunogene Fragment von BASB020 im wesentlichen die gesamte extrazelluläre Domäne eines Polypeptids, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, am meisten bevorzugt wenigstens 97–99 % Identität mit demjenigen von SEQ ID NO:4 oder 6 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:2 hat.
Ein Fragment ist ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die völlig die gleiche wie ein Teil, aber nicht die gesamte Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung ist. Wie bei BASB020-Polypeptiden können Fragmente "freistehend" sein oder innerhalb eines größeren Polypeptids umfaßt sein, von dem sie einen Teil oder eine Region bilden, am meisten bevorzugt als eine einzelne zusammenhänge Region in einem einzelnen größeren Polypeptid.
Bevorzugte Fragmente schließen z.B. Trunkierungspolypeptide mit einem Teil einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 oder von Varianten davon ein, wie eine kontinuierliche Reihe von Resten, die eine Amino- und/oder Carboxy-terminale Aminosäuresequenz einschließt. Abbauformen der Polypeptide der Erfindung, die durch oder in einer Wirtszelle erzeugt werden, sind ebenfalls bevorzugt. Weiter bevorzugt sind Fragmente, die durch strukturelle oder funktionelle Eigenschaften gekennzeichnet sind, wie Fragmente, die alpha-Helix- und alpha-Helix-bildende Regionen, beta-Faltblatt- und beta-Faltblatt-bildende Regionen, Turn- und Turn-bildende Regionen, Knäuel- und Knäuel-bildende Regionen, hydrophile Regionen, hydrophobe Regionen, alpha-amphipathische Regionen, beta-amphipathische Regionen, flexible Regionen, Oberflächen-bildende Regionen, Substrat-bindende Regionen und Regionen mit hohem antigenen Index umfassen.
Weiter bevorzugte Fragmente schließen ein isoliertes Polypeptid ein, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 umfaßt, oder ein isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 15, 20, 30, 40, 50 oder 100 zusammenhängenden Aminosäuren trunkiert oder deletiert aus der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 umfaßt.
Fragmente der Polypeptide der Erfindung können zur Erzeugung des entsprechenden Polypeptids voller Länge durch Peptidsynthese eingesetzt werden; deshalb können diese Fragmente als Zwischenstufen zur Erzeugung der Polypeptide der Erfindung voller Länge eingesetzt werden.
Besonders bevorzugt sind Varianten, in denen mehrere, 5–10, 1–5, 1–3, 1–2 oder 1 Aminosäuren substituiert, deletiert oder addiert sind, in jeder Kombination.
Die Polypeptide oder immunogenen Fragmente der Erfindung können in Form des "reifen" Proteins sein oder können ein Teil eines größeren Proteins sein, wie ein Vorläufer- oder Fusionsprotein. Es ist häufig vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschließen, die sekretorische oder Leitsequenzen, Prosequenzen, Sequenzen, die bei der Reinigung helfen, wie multiple Histidinreste, oder eine zusätzliche Sequenz zur Stabilität während der rekombinanten Erzeugung enthält. Außerdem wird ebenfalls die Addition von exogenem Polypeptid oder Lipidschwanz oder Polynukleotidsequenzen zur Erhöhung des immunogenen Potentials des fertigen Moleküls erwogen.
In einem Aspekt betrifft die Erfindung genetisch veränderte lösliche Fusionsproteine, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon und verschiedene Portionen der konstanten Regionen der schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere IgGl, wobei die Fusion an der Gelenkregion stattfindet. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Einfügen einer Spaltsequenz entfernt werden, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann.
Außerdem betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch Gentechnik und deren Verwendung zur Wirkstoffdurch musterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für die Fusionsproteintechnik können in WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Die Proteine können chemisch konjugiert oder als rekombinante Fusionsproteine exprimiert werden, was die Erzeugung erhöhter Mengen in einem Expressionssystem im Vergleich mit dem nicht-fusionierten Protein erlaubt. Der Fusionspartner kann bei der Bereitstellung von T-Helferepitopen (immunologischer Fusionspartner), bevorzugt T-Helferepitopen, die durch Menschen erkannt werden, oder bei der Expression des Proteins (Expressionsverstärker) mit höheren Erträgen als das native rekombinante Protein beitragen. Bevorzugt wird der Fusionspartner sowohl ein immunologischer Fusionspartner als auch ein Expressionsverstärkerpartner sein.
Fusionspartner schließen Protein D aus Haemophilus influenzae und das Nichtstrukturprotein aus dem Grippevirus, NSl (Hämagglutinin), ein. Ein anderer Fusionspartner ist das als LytA bekannte Protein. Bevorzugt wird der C-terminale Teil des Moleküls verwendet. Lyta stammt aus Streptococcus pneumoniae, die ein N-Acetyl-L-Alanin-Amidase-LytA synthetisieren (codiert durch das lytA-Gen {Gene, 43 (1986) Seite 265–272}), ein Autolysin, das spezifisch bestimmte Bindungen im Peptidoglycangerüst abbaut. Die C-terminale Domäne des LytA-Proteins ist verantwortlich für die Affinität zum Cholin oder gewissen Cholin-Analoga, wie DEAE. Diese Eigenschaft wurde für die Entwicklung von E. coli C-LytA-exprimierenden Plasmiden ausgenutzt, die nützlich zur Expression von Fusionsproteinen sind. Die Reinigung von Hybridproteinen, die das C-LytA-Fragment an ihrem Aminoterminus enthalten, wurde beschrieben {Biotechnology: 10 (1992), Seite 795–798}. Es ist möglich, den Repeat-Teil des LytA-Moleküls zu verwenden, der im C-terminalen Ende beginnend bei Rest 178 gefunden wird, z.B. die Reste 188-305.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls Varianten der zuvor genannten Polypeptide ein, d.h. Polypeptide, die sich von den bezeichneten durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei ein Rest durch einen anderen mit ähnlichen Eigenschaften substituiert ist. Solche typischen Substitutionen sind zwischen Ala, Val, Leu und Ile; zwischen Ser und Thr; zwischen den sauren Resten Asp und Glu; zwischen Asn und Gln; und zwischen den basischen Resten Lys und Arg; oder zwischen den aromatischen Resten Phe und Tyr.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in jeder geeigneten Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide schließen isolierte natürlich vorkommende Polypeptide, rekombinant erzeugte Polypeptide, synthetisch erzeugte Polypeptide oder Polypeptide ein, die durch eine Kombination dieser Verfahren hergestellt werden. Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide sind allgemein fachbekannt.
Es ist am meisten bevorzugt, daß ein Polypeptid der Erfindung aus Moraxella catarrhalis stammt, jedoch kann es bevorzugt aus anderen Organismen der gleichen taxonomischen Gattung erhalten werden. Ein Polypeptid der Erfindung kann ebenfalls z.B. aus Organismen der gleichen taxonomischen Familie oder Ordnung erhalten werden.
Polynukleotide
Es ist eine Aufgabe der Erfindung, Polynukleotide bereitzustellen, die BASB020-Polypeptide codieren, insbesondere Polynukleotide, die das hier mit BASB020 bezeichnete Polypeptid codieren.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfaßt das Polynukleotid eine Region, die BASB020-Polypeptide codiert, umfassend eine in SEQ ID NO:3 oder 5 dargestellte Sequenz, die ein Gen voller Länge einschließt, oder eine Variante davon.
Die in SEQ ID NO:3 oder 5 bereitgestellten BASB020-Polynukleotide sind die BASB020-Polynukleotide aus den Moraxella catarrhalis-Stämmen MC2931 (ATCC 43617), MC2912, MC2913 und MC2969.
Als ein weiterer Aspekt der Erfindung werden isolierte Nukleinsäuremoleküle bereitgestellt, die BASB020-Polypeptide und -Polynukleotide codieren und/oder exprimieren, insbesondere Moraxella catarrhalis-BASB020-Polypeptide und -Polynukleotide, einschließlich z.B. ungereifter RNAs, Ribozym-RNAs, mRNAs, cDNAs, genomischer DNAs, B- und Z-DNAs. Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen biologisch, diagnostisch, prophylaktisch, klinisch oder therapeutisch nützliche Polynukleotide und Polypeptide und Varianten davon sowie dieselben umfassende Zusammensetzungen ein.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Polynukleotide, die wenigstens ein Gen voller Länge einschließen, das ein BASB020-Polypeptid mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 codiert, und eng damit verwandte Polynukleotide und Varianten davon.
In einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein BASB020-Polypeptid von Moraxella catarrhalis bereitgestellt, das eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 oder eine Variante davon umfaßt oder daraus besteht.
Unter Verwendung der hier bereitgestellten Informationen, wie z.B. eine in SEQ ID NO:3 oder 5 aufgeführte Polynukleotidsequenz, kann ein Polynukleotid der Erfindung, das BASB020-Polypeptid codiert, unter Verwendung von standardmäßigen Klonierungs- und Durchmusterungsverfahren erhalten werden, wie durch diejenigen zur Klonierung und Sequenzierung chromosomaler DNA-Fragmente aus Bakterien unter Verwendung von Moraxella catarrhalis Catlin-Zellen als Ausgangsmaterial, gefolgt vom Erhalt eines Klons voller Länge. Zum Beispiel wird zum Erhalt einer Polynukleotidsequenz der Erfindung, wie eine in SEQ ID NO:3 oder 5 angegebene Nukleotidsequenz, typischerweise eine Bibliothek von Klonen von chromosomaler DNA von Moraxella catarrhalis Catlin in E. coli oder einem anderen geeigneten Wirt mit einem radiomarkierten Oligonukleotid sondiert, bevorzugt mit einem 17-mer oder länger, das aus einer Teilsequenz abgeleitet ist. Klone, die DNA tragen, die identisch mit derjenigen der Sonde ist, können dann unter Verwendung stringenter Hybridisierungsbedingungen unterschieden werden. Durch Sequenzierung der so identifizierten individuellen Klone durch Hybridisierung mit Sequenzierungsprimern, die aus der ursprünglichen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenz geschaffen wurden, ist es dann möglich, die Polynukleotidsequenz in beide Richtungen zur Bestimmung einer Gensequenz voller Länge zu verlängern. Zweckmäßig wird eine solche Sequenzierung z.B. unter Verwendung denaturierter doppelsträngiger DNA durchgeführt, die aus einem Plasmidklon hergestellt wird. Geeignete Techniken werden beschrieben von T. Maniatis, E.F. Frisch und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989). (Siehe insbesondere "Screening By Hybridization 1.90" und "Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70".) Eine direkte genomische DNA-Sequenzierung kann ebenfalls zum Erhalt einer Gensequenz voller Länge durchgeführt werden. Illustrativ für die Erfindung wurde das in SEQ ID NO:3 oder 5 dargestellte Polynukleotid in einer aus Moraxella catarrhalis stammenden DNA-Bibliothek gefunden.
Außerdem enthält die in SEQ ID NO:3 oder 5 dargestellte DNA-Sequenz ein offenes Leseraster, das ein Protein mit etwa der Anzahl von Aminosäureresten, die in SEQ ID NO:4 oder 6 dargestellt sind, mit einem abgeleiteten Molekulargewicht codiert, das unter Verwendung von Molekulargewichtswerten von Aminosäureresten berechnet werden kann, die den Fachleuten allgemein bekannt sind.
Das Referenz-Polynukleotid von SEQ ID NO:1 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nummer 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nummer 841 von SEQ ID NO:1 beginnt, codiert das Polypeptid von Referenz SEQ ID NO:2.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:3 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nummer 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nummer 841 von SEQ ID NO:3 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:4.
Das Polynukleotid von SEQ ID NO:5 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nummer 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nummer 841 von SEQ ID NO:5 beginnt, codiert das Polypeptid von SEQ ID NO:6.
Das Referenz-Polynukleotid von SEQ ID NO:7 zwischen dem Startcodon bei Nukleotid Nummer 1 und dem Stoppcodon, das bei Nukleotid Nummer 841 von SEQ ID NO:7 beginnt, codiert das Referenz-Polypeptid von SEQ ID NO:8.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein isoliertes Polynukleotid vor, umfassend oder bestehend aus:

(a) eine(r) Polynukleotidsequenz, die wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97–99 % oder eine exakte Identität mit SEQ ID NO:3 bzw. 5 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:3 bzw. 5 hat; oder
(b) eine r) Polynukleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert, das wenigstens 85 % Identität, bevorzugt wenigstens 90 % Identität, besonders bevorzugt wenigstens 95 % Identität, noch mehr bevorzugt wenigstens 97–99 % oder 100 % exakte Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4 bzw. 6 hat.

Ein Polynukleotid, das ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung codiert, einschließlich Homologen und Orthologen aus anderen Arten als Moraxella catarrhalis, kann durch ein Verfahren erhalten werden, das die Schritte der Durchmusterung einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (z.B. unter Verwendung einer Temperatur im Bereich von 45–65°C und einer SDS-Konzentration von 0,1–1 %) mit einer markierten oder detektierbaren Sonde, bestehend aus der oder umfassend die Sequenz von SEQ ID NO:3 oder 5 oder ein Fragment davon; und der Isolierung eines Gens voller Länge und/oder genomischer Klone, die die Polynukleotidsequenz enthalten, umfaßt.
Die Erfindung stellt eine Polynukleotidsequenz bereit, die über ihre gesamte Länge mit einer codierenden Sequenz (offenes Leseraster) in SEQ ID NO:3 oder 5 identisch ist. Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung wird eine codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder ein Fragment davon, als solche sowie als codierende Sequenz für ein reifes Polypeptid oder ein Fragment im Leseraster mit einer anderen codierenden Sequenz, wie einer Sequenz, die eine Leit- oder sekretorische Sequenz, eine Prä- oder Pro- oder Präpro-Proteinsequenz codiert. Das Polynukleotid in der Erfindung kann ebenfalls wenigstens eine nicht-codierende Sequenz enthalten, einschließlich z.B., aber nicht beschränkt auf wenigstens eine nichtcodierende 5'- und 3'-Sequenz, wie die transkribierten, aber nicht-translatierten Sequenzen, Terminationssignale (wie Rho-abhängige und Rho-unabhängige Terminationssignale), Ribosom-Bindungsorte, Kozak-Sequenzen, Sequenzen, die mRNA stabilisieren, Introns und Polyadenylierungssignale. Die Polynukleotidsequenz kann ebenfalls eine zusätzliche codierende Sequenz umfassen, die zusätzliche Aminosäuren codiert. Zum Beispiel kann eine Markersequenz codiert werden, die die Reinigung des fusionierten Polypeptids erleichtert. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist die Markersequenz ein Hexahistidinpeptid, wie im pQE-Vektor (Qiagen, Inc.) bereitgestellt und in Gentz et al. beschrieben, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86. 821–824 (1989), oder ein HA-Peptid-Tag (Wilson et al., Cell 37: 767 (1984)), die beide nützlich in der Reinigung von an sie fusionierter Polypeptidsequenz sein können. Polynukleotide der Erfindung schließen ebenfalls ein, sind aber nicht beschränkt auf Polynukleotide, die ein Strukturgen und seine natürlich assoziierten Sequenzen umfassen, die die Genexpression kontrollieren.
Die Nukleotidsequenz, die BASB020-Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder 6 codiert, kann identisch mit der Polypeptid-codierenden Sequenz sein, die in den Nukleotiden 1 bis 840 von SEQ ID NO:3 bzw. 5 enthalten ist. Alternativ kann sie eine Sequenz sein, die als Ergebnis der Redundanz (Degeneriertheit) des genetischen Codes auch das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder 6 codiert.
Der Begriff "Polynukleotid, das ein Polypeptid codiert", wie er hier verwendet wird, umfaßt Polynukleotide, die eine Sequenz einschließen, die ein Polypeptid der Erfindung codiert, insbesondere ein bakterielles Polypeptid und ganz besonders ein Polypeptid des Moraxella catarrhalis-BASB020 mit einer in SEQ ID NO:4 oder 6 dargestellten Aminosäuresequenz. Der Begriff umfaßt ebenfalls Polynukleotide, die eine einzelne zusammenhängende Region oder diskontinuierliche Regionen einschließen, die das Polypeptid codieren (z.B. Polynukleotide, die durch einen integrierten Phagen, eine integrierte Insertionssequenz, eine integrierte Vektorsequenz, eine integrierte Transposonsequenz oder aufgrund von RNA-Editing oder genomischer DNA-Reorganisation unterbrochen sind), zusammen mit zusätzlichen Regionen, die ebenfalls codierende und/oder nicht-codierende Sequenzen enthalten können.
Die Erfindung betrifft ferner Varianten der hier beschriebenen Polynukleotide, die Varianten eines Polypeptids mit einer abgeleiteten Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 codieren. Fragmente von Polynukleotiden der Erfindung können z.B. zur Synthese von Polynukleotiden voller Länge der Erfindung verwendet werden.
Weitere besonders bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die BASB020-Varianten codieren, die die Aminosäuresequenz von BASB020-Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder 6 aufweisen, worin mehrere, einige, 5 bis 10, 1 bis 5, 1 bis 3, 2, 1 oder keine Aminosäurereste substituiert, modifiziert, deletiert und/oder addiert sind, in jeder Kombination. Speziell bevorzugt unter diesen sind stumme Substitutionen, Additionen und Deletionen, die nicht die Eigenschaften und Aktivitäten von BASB020-Polypeptid verändern.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind Polynukleotide, die wenigstens 85 % identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid sind, das BASB020-Polypeptid mit einer in SEQ ID NO:4 oder 6 dargestellten Aminosäuresequenz codiert, und Polynukleotide, die komplementär zu solchen Polynukleotiden sind. Alternativ sind höchst bevorzugt Polynukleotide, die eine Region umfassen, die wenigstens 90 % identisch über ihre gesamte Länge mit einem Polynukleotid ist, das BASB020-Polypeptid codiert, und dazu komplementäre Polynukleotide. In dieser Hinsicht sind Polynukleotide, die wenigstens 95 % identisch über ihre gesamte Länge mit demselben sind, besonders bevorzugt. Ferner sind diejenigen mit wenigstens 97 % hoch bevorzugt unter denjenigen mit wenigstens 95 %, und unter diesen sind diejenigen mit wenigstens 98 % und wenigstens 99 % besonders hoch bevorzugt, wobei wenigstens 99 % die besonders bevorzugten sind.
Bevorzugte Ausführungsformen sind Polynukleotide, die Polypeptide codieren, die im wesentlichen die gleiche biologische Funktion oder Aktivität wie das reife Polypeptid beibehalten, das durch eine DNA von SEQ ID NO:3 oder 5 codiert wird.
Gemäß bestimmten bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung werden Polynukleotide bereitgestellt, die, insbesondere unter stringenten Bedingungen, mit BASB020-Polynukleotidsequenzen hybridisieren, wie die Polynukleotide in SEQ ID NO:3 oder 5.
Die Erfindung betrifft ferner Polynukleotide, die mit den hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen hybridisieren. In dieser Hinsicht betrifft die Erfindung speziell Polynukleotide, die unter stringenten Bedingungen mit den hier beschriebenen Polynukleotiden hybridisieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "stringente Bedingungen" und "stringente Hybridisierungsbedingungen" eine Hybridisierung, die nur auftritt, falls es wenigstens 95 % und bevorzugt wenigstens 97 % Identität zwischen den Sequenzen gibt. Ein spezifisches Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine Inkubation über Nacht bei 42°C in einer Lösung, die 50 % Formamid, 5 × SSC (150 mM NaCl, 15 mM Trinatriumcitrat), 50 mM Natriumphosphat (pH 7,6), 5 × Denhardt-Lösung, 10 % Dextransulfat und 20 μg/ml von denaturierter, gescherter Lachssperma-DNA umfaßt, gefolgt von Waschen des Hybridisierungsträgers in 0,1 × SSC bei ca. 65°C. Hybridisierungs- und Waschbedingungen sind allgemein bekannt und werden exemplarisch angegeben in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), insbesondere Kapitel 11. Lösungshybridisierung kann ebenfalls mit den durch die Erfindung bereitgestellten Polynukleotidsequenzen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Polynukleotid bereit, bestehend aus oder umfassend eine Polynukleotidsequenz, die erhalten wird durch Durchmustern einer geeigneten Bibliothek, die das komplette Gen für eine in SEQ ID NO:3 oder 5 dargestellte Polynukleotidsequenz enthält, unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer Sonde mit der Sequenz der in SEQ ID NO:3 oder 5 dargestellten Polynukleotidsequenz oder einem Fragment davon; und Isolieren der Polynukleotidsequenz. Zum Erhalt eines solchen Polynukleotids nützliche Fragmente schließen z.B. Sonden und Primer ein, die hier an anderer Stelle vollständig beschrieben werden.
Wie hier an anderer Stelle in Bezug auf Polynukleotidtests der Erfindung erörtert wird, können z.B. die Polynukleotide der Erfindung als Hybridisierungssonde für RNA, cDNA und genomische DNA verwendet werden, um cDNAs voller Länge und genomische Klone zu isolieren, die BASB020 codieren, und um cDNA und genomische Klone anderer Gene zu isolieren, die eine hohe Identität, insbesondere eine hohe Sequenzidentität, mit dem BASB020-Gen haben. Solche Sonden werden allgemein wenigstens 15 Nukleotidreste oder Basenpaare umfassen. Bevorzugt werden solche Sonden wenigstens 30 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen und können wenigstens 50 Nukleotidreste oder Basenpaare aufweisen. Besonders bevorzugte Sonden werden wenigstens 20 Nukleotidreste oder Basenpaare haben und werden weniger als 30 Nukleotidreste oder Basenpaare haben.
Eine codierende Region eines BASB020-Gens kann durch Durchmustern unter Verwendung einer in SEQ ID NO:3 oder 5 bereitgestellten DNA-Sequenz zur Synthese einer Oligonukleotidsonde isoliert werden. Ein markiertes Oligonukleotid mit einer Sequenz, die komplementär zu derjenigen eines Gens der Erfindung ist, wird dann zur Durchmusterung einer Bibliothek von cDNA, genomischer DNA oder mRNA zur Bestimmung verwendet, mit welchen Elementen der Bibliothek die Sonde hybridisiert.
Es sind verschiedene Verfahren vorhanden und den Fachleuten allgemein bekannt, um DNAs voller Länge zu erhalten oder kurze DNAs zu verlängern, z.B. diejenigen auf Basis des Verfahrens der Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) (siehe z.B. Frohman et al., PNAS USA 85: 8998–9002, 1988). Kürzliche Modifikationen der Technik, exemplarisch dargestellt durch die Marathon^TM-Technik (Clontech Laboratories Inc.), haben die Suche nach längeren cDNAs signifikant vereinfacht. Bei der Marathon^TM-Technik werden cDNAs aus mRNA, die aus einem gewählten Gewebe extrahiert wurde, hergestellt und eine "Adapter"-Sequenz an jedes Ende ligiert. Nukleinsäure-Amplifikation (PCR) wird dann durchgeführt, um das "fehlende" 5'-Ende der DNA unter Verwendung einer Kombination aus genspezifischen und adapterspezifischen Oligonukleotidprimern zu amplifizieren. Die PCR-Reaktion wird dann unter Verwendung "verschachtelter" Primer wiederholt, d.h. mit Primern, die geschaffen sind, um innerhalb des amplifizierten Produkt zu reassoziieren (typischerweise ein adaptertypischer Primer, der weiter 3' in der Adaptersequenz reassoziiert, und ein genspezifischer Primer, der weiter 5' in der ausgewählten Gensequenz reassoziiert). Die Produkte dieser Reaktion können dann durch DNA-Sequenzierung analysiert und eine DNA voller Länge entweder durch Verbinden des Produkts direkt mit der bestehenden DNA zum Erhalt einer vollständigen Sequenz oder durch Durchführen einer getrennten PCR voller Länge unter Verwendung der neuen Sequenzinformation zur Schaffung des 5'-Primers konstruiert werden.
Die Polynukleotide und Polypeptide der Erfindung können z.B. als Forschungsreagenzien und Materialien für die Entdeckung von Behandlungen von und Diagnostika für Krankheiten, insbesondere menschliche Krankheiten, eingesetzt werden, wie hier weiter in bezug auf Polynukleotidtests erörtert wird.
Die Polynukleotide der Erfindung, die Oligonukleotide sind, die aus einer Sequenz der SEQ ID NOS:3 bis 6 stammen, können in den Verfahren wie hier beschrieben verwendet werden, aber bevorzugt zur PCR, zur Bestimmung, ob die hier identifizierten Polynukleotide ganz oder teilweise in Bakterien in infiziertem Gewebe transkribiert werden oder nicht. Es wird anerkannt, daß solche Sequenzen ebenfalls einen Nutzen in der Diagnose des Stadiums der Infektion und des Typs der Infektion, die das Pathogen erreicht hat, besitzen werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls Polynukleotide bereit, die ein Polypeptid codieren, das das reife Protein plus zusätzliche Amino- oder Carboxyl-terminale Aminosäuren oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids ist (z.B. wenn die reife Form mehr als eine Polypeptidkette hat). Solche Sequenzen können u.a. eine Rolle in der Reifung eines Proteins aus einem Vorläufer zu einer reifen Form spielen, können den Proteintransport erlauben, können die Proteinhalbwertszeit verlängern oder verkürzen oder können die Manipulation eines Proteins zum Test oder zur Herstellung erleichtern. Wie es allgemein der Fall in vivo ist, können die zusätzlichen Aminosäuren vom reifen Protein durch zelluläre Enzyme entfernt werden.
Für jedes einzelne Polynukleotid der Erfindung wird dazu komplementäres Polynukleotid bereitgestellt. Es ist bevorzugt, daß diese komplementären Polynukleotide vollständig komplementär zu jedem Polynukleotid sind, zu dem sie komplementär sind.
Ein Vorläuferprotein, das eine reife Form des Polypeptids an eine oder mehrere Prosequenzen fusioniert aufweist, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Wenn Prosequenzen entfernt werden, werden solche inaktiven Vorläufer allgemein aktiviert. Einige oder alle der Prosequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Allgemein werden solche Vorläufer Proproteine genannt.
Zusätzlich zu den standardmäßigen Darstellungen A, G, C, T/U für Nukleotide kann ebenfalls der Begriff "N" bei der Beschreibung bestimmter Polynukleotide der Erfindung verwendet werden. "N" bedeutet, daß jedes der vier DNA- oder RNA-Nukleotide an einer so bezeichneten Position in der DNA- oder RNA-Sequenz erscheinen kann, ausgenommen es ist bevorzugt, daß N keine Nukleinsäure ist, die bei Kombination mit benachbarten Nukleotidpositionen, beim Lesen im korrekten Leseraster, die Wirkung der Erzeugung eines verfrühten Terminationscodons in einem solchen Leseraster haben würde.
In der Summe kann ein Polynukleotid der Erfindung ein reifes Protein, eine reifes Protein plus eine Leitsequenz (was, als ein Präprotein bezeichnet werden kann), einen Vorläufer eines reifen Proteins mit einer oder mehreren Prosequenzen, die nicht die Leitsequenzen eine Präproteins sind, oder ein Präpro-Protein codieren, das ein Vorläufer für ein Proprotein ist, mit einer Leitsequenz und einer oder mehreren Prosequenzen, die allgemein während der Reifungsschritte entfernt werden, die aktive und reife Formen des Polypeptids erzeugen.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung für therapeutische oder prophylaktische Zwecke bereitgestellt, insbesondere zur genetischen Immunisierung.
Die Verwendung eines Polynukleotids der Erfindung in der genetischen Immunisierung wird bevorzugt ein geeignetes Übertragungsverfahren einsetzen, wie die Direktinjektion von Plasmid-DNA in Muskeln (Wolff et al., Hum. Mol. Genet. (1992) 1. 363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419), die Übertragung von mit spezifischen Proteinträgern komplexierter DNA (Wu et al., J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985), die Kopräzipitation von DNA mit Calciumphosphat (Benvenisty & Reshef, PNAS USA (1986) 83: 9551), die Verkapselung von DNA in verschiedenen Formen von Liposomen (Kaneda et al., Science (1989) 243: 375), Teilchenbeschuß (Tang et al., Nature (1992) 356: 152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol. (1993) 12: 791) und In-vivo-Infektion unter Verwendung klonierter retroviraler Vektoren (Seeger et al., PNAS USA (1984), 81: 5849).
Vektoren, Wirtszellen, Expressionssyteme
Die Erfindung betrifft ebenfalls Vektoren, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, Wirtszellen, die gentechnisch mit Vektoren der Erfindung verändert sind, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls zur Erzeugung solcher Proteine unter Verwendung von RNAs eingesetzt werden, die aus den DNA-Konstrukten der Erfindung stammen.
Rekombinante Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch den Fachleuten allgemein bekannte Verfahren aus gentechnisch veränderten Wirtszellen hergestellt werden, die Expressionssyteme umfassen. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Expressionssysteme, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide der vorliegenden Erfindung umfassen, Wirtszellen, die gentechnisch mit solchen Expressionssystemen verändert sind, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken.
Zur rekombinanten Erzeugung der Polypeptide der Erfindung können Wirtszellen gentechnisch verändert werden, um Expressionssysteme oder Teile davon oder Polynukleotide der Erfindung aufzunehmen. Die Einführung eines Polynukleotids in die Wirtszelle kann durch in vielen Standardlabor handbüchern beschriebene Verfahren bewirkt werden, wie Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) und Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), wie Calciumphosphat-Transfektion, DEAE-Dextranvermittelte Transfektion, Transvektion, Mikroinjektion, mit kationischem Lipid vermittelte Transfektion, Elektroporation, Transduktion, Scrape Loading, ballistische Einführung und Infektion.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte schließen bakterielle Zellen ein, wie Zellen von Streptococci, Staphylococci, Enterococci, E. coli, Streptomyces, Cyanobakterien, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis und Moraxella catarrhalis; Pilzzellen, wie Zellen einer Hefe, Kluveromyces, Saccharomyces, eine Basidiomycete, Candida albicans und Aspergillus; Insektenzellen, wie Zellen von Drosophila S2 und Spodoptera Sf9; Tierzellen, wie CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 und Bowes-Melanomzellen; und Pflanzenzellen, wie Zellen eines Nacktsamers oder Bedecktsamers.
Eine große Vielzahl von Expressionssystemen kann zur Erzeugung der Polypeptide der Erfindung verwendet werden. Solche Vektoren schließen u.a. chromosomal, episomal und Virus-abgeleitete Vektoren ein, z.B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, aus Bakteriophagen, aus Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen, aus chromosomalen Hefeelementen, aus Viren, wie Baculoviren, Papovaviren wie SV40, Vakzinia-Viren, Adenoviren, Geflügelpockenviren, Pseudorabies-Viren, Picornavieren, Retroviren und Alphaviren, stammen, und aus Kombinationen daraus stammende Vektoren, wie diejenigen, die aus genetischen Plasmid- und Bakteriophagenelementen stammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssystemkonstrukte können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren sowie hervorrufen. Allgemein kann jedes System oder jeder Vektor, das/der zur Aufrechterhaltung, Vermehrung oder Expression von Polynukleotiden und/oder zur Expression eines Polypeptids in einem Wirt geeignet ist, zur Expression in dieser Hinsicht verwendet werden. Die entsprechende DNA-Sequenz kann in das Expressionssystem durch jedes einer Vielzahl allgemein bekannter und routinemäßiger Techniken insertiert werden, wie z.B. durch diejenigen, die dargestellt werden in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (siehe oben).
In rekombinanten Expressionssystemen in Eukaryonten können zur Sezernierung eines translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, in den periplasmatischen Raum oder in die extrazelluläre Umgebung entsprechende Sekretionssignale in das exprimierte Polypeptid eingefügt werden. Diese Signale können für das Polypeptid endogen sein oder sie können heterologe Signale sein.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus rekombinanten Zellkulturen durch allgemein bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschließlich Ammoniumsulfat- oder Ethanolfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauscherchromatographie, Phosphocellulose-Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungschromatographie, Affinitätschromatographie, Hydroxylapatit-Chromatographie und Lectin-Chromatographie. Am meisten bevorzugt wird Ionenmetall-Affinitätschromatographie (IMAC) zur Reinigung eingesetzt. Allgemein bekannte Techniken zur Neufaltung von Proteinen können eingesetzt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der intrazellulären Synthese, Isolation und/oder Reinigung denaturiert wird.
Das Expressionssystem kann ebenfalls ein rekombinanter lebender Mikroorganismus sein, wie ein Virus oder Bakterium. Das interessierende Gen kann in das Genom eines lebenden rekombinanten Virus oder Bakteriums inseriert werden. Die Impfung und In-vivo-Infektion mit diesem Lebendvektor wird zur In-vivo-Expression des Antigens und zur Induzierung von Immunreaktionen führen. Viren und Bakterien, die für diesen Zweck verwendet werden, sind z.B.: Pockenviren (z.B. Vakzinia, Geflügelpocken, Kanarienpocken), Alphavieren (Sindbis-Virus, Semliki-Forest-Virus, venezolanisches Pferdeenzephalitis-Virus), Adenoviren, Adeno-assoziiertes Virus, Pocornaviren (Poliovirus, Rhinovirus), Herpesviren (Varicella zoster-Virus etc.), Listeria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Diese Viren und Bakterien können virulent oder abgeschwächt in verschiedenen Weisen sein, um Lebendimpfstoffe zu erhalten. Solche Lebendimpfstoffe bilden ebenfalls einen Teil der Erfindung.
Diagnostische, prognostische, serotypisierende und Mutationstests Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von BASB020-Polynukleotiden und -Polypeptiden der Erfindung zur Verwendung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion von BASB020-Polynukleotiden und/oder -Polypeptiden in einem Eukaryonten, insbesondere in einem Säugetier und speziell in einem Menschen, wird ein diagnostisches Verfahren zur Diagnose einer Krankheit, des Stadiums der Krankheit oder der Reaktion eines infektiösen Organismus auf Wirkstoffe bereitstellen. Eukaryonten, insbesondere Säugetiere und speziell Menschen, insbesondere diejenigen, die mit einem Organismus infiziert oder einer Infektion mit einem Organismus verdächtig sind, der das BASB020-Gen oder -Protein umfaßt, können auf der Nukleinsäure- oder Aminosäureebene durch eine Vielzahl allgemein bekannter Techniken sowie durch hier bereitgestellte Verfahren detektiert werden.
Polypeptide und Polynukleotide zur Prognose, Diagnose oder anderweitigen Analyse können aus mutmaßlich infizierten und/oder infizierten Körpermaterialien des Individuums erhalten werden. Polynukleotide aus jeder dieser Quellen, insbesondere DNA oder RNA, können direkt zur Detektion verwendet werden oder können enzymatisch unter Verwendung von PCR oder jeder anderen Amplifikationstechnik vor der Analyse enzymatisch amplifiziert werden. RNA, insbesondere mRNA, cDNA und genomische DNA, kann ebenfalls in der gleichen Weise verwendet werden. Unter Verwendung der Amplifikation kann eine Charakterisierung der Art und des Stammes des infektiösen oder residenten Organismus, der in einem Individuum vorhanden ist, durch eine Analyse des Genotyps eines ausgewählten Polynukleotids des Organismus vorgenommen werden. Deletionen und Insertionen können durch eine Veränderung der Größe des amplifizierten Produkts im Vergleich mit einem Genotyp einer Referenzsequenz nachgewiesen werden, die aus einem verwandten Organismus ausgewählt ist, bevorzugt aus einer unterschiedlichen Art der gleichen Gattung oder eines unterschiedlichen Stammes der gleichen Art. Punktmutationen können durch Hybridisieren vom amplifizierter DNA mit markierten BASB020-Polynukleotidsequenzen identifiziert werden. Perfekt oder signifikant übereinstimmende Sequenzen können von unperfekt oder stärker signifikant fehlübereinstimmenden Duplizes durch DNase- oder RNase-Verdauung für DNA bzw. RNA oder durch Nachweisen von Unterschieden in den Schmelztemperaturen oder der Renaturierungskinetik unterschieden werden. Polynukleotidsequenzunterschiede können ebenfalls durch Veränderungen in der elektrophoretischen Beweglichkeit von Polynukleotidfragmenten in Gelen im Vergleich mit einer Referenzsequenz nachgewiesen werden. Dies kann mit oder ohne Denaturierungsmittel durchgeführt werden. Polynukleotidunterschiede können ebenfalls durch direkte DNA- oder RNA-Sequenzierung nachgewiesen werden. Siehe z.B. Myers et al., Science 230: 1242 (1985). Sequenzveränderungen an spezifischen Orten können ebenfalls durch Nukleaseschutztests aufgezeigt werden, wie RNase-, Vl- und S1-Schutztests, oder durch ein chemisches Spaltungsverfahren. Siehe z.B. Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85: 4397–4401 (1985).
In einer anderen Ausführungsform kann ein Array von Oligonukleotidsonden, die BASB020-Nukleotidsequenzen oder Fragmente davon umfassen, zur Durchführung einer effizienten Durchmusterung von z.B. genetischen Muta tionen, Serotyp, taxonomischer Klassifikation oder Identifizierung konstruiert werden. Array-Technologieverfahren sind allgemein bekannt und besitzen allgemeine Anwendbarkeit und können verwendet werden, um eine Vielzahl von Fragen der molekularen Genetik anzugehen, einschließlich Genexpression, genetische Verbindung und genetische Variabilität (siehe z.B. Chee et al., Science, 274:610 (1996)).
So betrifft die vorliegende Erfindung in einem anderen Aspekt ein diagnostisches Kit, welches folgendes umfaßt:

(a) ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt die Nukleotidsequenz von SEQ ID NO:3 oder 5, oder ein Fragment davon;
(b) eine zu der von (a) komplementäre Nukleotidsequenz;
(c) ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder 6, oder ein Fragment davon; oder
(d) einen Antikörper für ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, bevorzugt für das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder 6.

Man wird einsehen, daß in einem jeden solchen Kit (a), (b), (c) oder (d) eine substantielle Komponente umfassen kann. Ein solches Kit wird u.a. von Nutzen in der Diagnose einer Krankheit oder Anfälligkeit für eine Krankheit sein.
Diese Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung von Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung als diagnostische Reagenzien. Die Detektion einer mutierten Form eines Polynukleotids der Erfindung, bevorzugt von SEQ ID NO:3 oder 5, das mit einer Krankheit oder einem pathogenen Zustand verbunden ist, wird ein diagnostisches Werkzeug bereitstellen, das zu einer Diagnose einer Krankheit, einer Prognose eines Krankheitsverlaufs, einer Bestimmung eines Krankheitsstadiums oder einer Anfälligkeit für eine Krankheit beitragen oder diese definieren kann, die aus einer Unterexpression, Überexpression oder veränderten Expression des Polynukleotids resultiert. Organismen, insbesondere infektiöse Organismen, die Mutationen in einem solchen Polynukleotid tragen, können auf der Polynukleotidebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, wie durch diejenigen, die hier an anderer Stelle beschrieben werden.
Zellen aus einem Organismus, der Mutationen oder Polymorphismen (allelische Variationen) in einem Polynukleotid und/oder Polypeptid der Erfindung trägt, können ebenfalls auf der Polynukleotid- oder Polypeptidebene durch eine Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden, um z.B. die Serotypisierung zu erlauben. Zum Beispiel kann RT-PCR zum Nachweis von Mutationen in der RNA verwendet werden. Es ist besonders bevorzugt, RT-PCR in Verbindung mit automatisierten Detektionssystemen zu verwenden, wie z.B. GeneScan. RNA, cDNA oder genomische DNA kann ebenfalls für den gleichen Zweck, PCR, verwendet werden. Als ein Beispiel können PCR-Primer, die komplementär zu einem Polynukleotid sind, das BASB020-Polypeptid codiert, zur Identifizierung und Analyse von Mutationen verwendet werden.
Die Erfindung stellt ferner Primer mit 1, 2, 3 oder 4 aus dem 5'- und/oder dem 3'-Ende entfernten Nukleotiden bereit. Diese Primer können u.a. zur Amplifikation von BASB020-DNA und/oder -RNA verwendet werden, die aus einer aus einem Individuum stammenden Probe isoliert wurde, wie z.B. Körpermaterial. Die Primer können zur Amplifikation eines aus einem infiziertert Individuum isolierten Polynukleotids verwendet werden, so daß das Polynukleotid dann verschiedenen Techniken zur Aufklärung der Polynukleotidsequenz unterworfen werden kann. Auf diese Weise können Mutationen in der Polynukleotidsequenz nachgewiesen und verwendet werden, um die Infektion oder ihr Stadium oder ihren Verlauf zu diagnostizieren und/oder zu prognostizieren, oder um den Infektionserreger zu serotypisieren und/oder zu klassifizieren.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Diagnose einer Krankheit bereit, bevorzugt von bakteriellen Infektionen, besonders bevorzugt Infektionen, die durch Moraxella catarrhalis verursacht werden, umfassend das Bestimmen eines erhöhten Expressionsgrades von Polynukleotid mit einer Sequenz von SEQ ID NO:1, 3, 5 oder 7 aus einer aus einem Individuum stammenden Probe, wie z.B. aus einem Körpermaterial. Eine erhöhte oder verringerte Expression eines BASB020-Polynukleotids kann unter Verwendung jedes der Verfahren gemessen werden, die allgemein fachbekannt zur Quantifizierung von Polynukleotiden sind, wie z.B. Amplifikation, PCR, RT-PCR, RNase-Schutz, Northern-Blotting, Spektrometrie und andere Hybridisierungsverfahren.
Zusätzlich kann ein erfindungsgemäßer diagnostischer Test zum Nachweis einer Überexpression von BASB020-Polypeptid im Vergleich zu normalen Kontrollgewebeproben verwendet werden, um die Gegenwart z.B. einer Infektion nachzuweisen. Testtechniken, die zur Bestimmung der Stärke eines BASB020-Polypeptids in einer aus einem Wirt stammenden Probe, wie aus einem Körpermaterial, verwendet werden können, sind den Fachleuten allgemein bekannt. Solche Testverfahren schließen Radioimmunassays, kompetitive Bindungstest, Western-Blot-Analyse, Antikörper-Sandwich-Tests, Antikörpernachweis und ELISA-Tests ein.
Die Polynukleotide der Erfindung können als Komponenten von Polynukleotid-Arrays verwendet werden, bevorzugt von hochdichten Arrays oder Gittern. Diese hochdichten Arrays sind besonders nützlich für diagnostische und prognostische Zwecke. Zum Beispiel kann ein Satz von Tüpfeln, die jeweils ein unterschiedliches Gen umfassen und ferner ein Polynukleotid oder Polynukleotide der Erfindung umfassen, zur Sondierung, wie z.B. unter Verwendung von Hybridisierungs- oder Nukleinsäureamplifikation, unter Verwendung einer Sonde verwendet werden, die aus einer Körperprobe erhalten wurde oder daraus stammt, um die Gegenwart einer besonderen Polynukleotidsequenz oder einer verwandten Sequenz in einem Individuum zu bestimmen. Eine solche Gegenwart kann die Gegenwart einer Pathogens, insbesondere von Moraxella catarrhalis, anzeigen und kann nützlich in der Diagnose und/oder Prognose einer Krankheit oder eines Krankheitsverlaufs sein. Ein Gitter, das eine Anzahl der Varianten der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO:3 oder 5 umfaßt, ist bevorzugt. Ebenfalls bevorzugt ist ein Gitter, das eine Anzahl von Varianten einer Polynukleotidsequenz umfaßt, die die Polypeptidsequenz von SEQ ID NO:4 oder 6 codiert.
Antikörper
Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung oder Varianten davon oder Zellen, die dieselben exprimieren, können als Immunogene zur Erzeugung von Antikörpern verwendet werden, die immunspezifisch für solche Polypeptide bzw. Polynukleotide sind.
In bestimmten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung werden Antikörper gegen BASB020-Polypeptide oder -Polynukleotide bereitgestellt. Gegen die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung erzeugte Antikörper können durch Verabreichen der Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung oder von Epitop-tragenden Fragmenten von einem oder beiden davon, von Analoga von einem oder beiden davon oder von Zellen, die eines oder beide exprimieren, an ein Tier, bevorzugt ein nicht-menschliches Tier, unter Verwendung von Routineprotokollen erhalten werden. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper kann jede fachbekannte Technik verwendet werden, die durch kontinuierliche Zellinienkulturen erzeugte Antikörper bereitstellt. Beispiele schließen verschiedene Techniken ein, wie diejenigen in G. Kohler und C. Milstein, Nature 256: 495–497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., S. 77–96, MONOCOLNAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).
Techniken zur Herstellung von einkettigen Antikörpern (US-PS 4 946 778) können angepaßt werden, um einkettige Antikörper gegen Polypeptide oder Polynukleotide dieser Erfindung zu erzeugen. Ebenfalls können transgene Mäuse oder andere Organismen oder Tiere, wie andere Säugetiere, zur Expression humanisierter Antikörper verwendet werden, die immunspezifisch für die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung sind.
Alternativ kann die Phagen-Display-Technik verwendet werden, um Antikörpergene mit Bindungsaktivitäten für ein Polypeptid der Erfindung auszuwählen, entweder aus Sammlungen von PCR-amplifizierten v-Genen von Lymphozyten aus Menschen, die auf Besitz von Anti-BASB020 durchmustert wurden, oder aus naiven Bibliotheken (McCafferty et al., (1990) Nature 348, 552–554; Marks et al., (1992) Biotechnology 10, 779–783). Die Affinität dieser Antikörper kann ebenfalls durch z.B. Chain Shuffling verbessert werden (Clackson et al., (1991) Nature 352: 628).
Die oben beschriebenen Antikörper können eingesetzt werden, um Klone zu isolieren oder zu identifizieren, die die Polypeptide oder Polynukleotide der Erfindung exprimieren, um die Polypeptide oder Polynukleotide durch z.B. Affinitätschromatographie zu reinigen.
So können u.a. Antikörper gegen BASB020-Polypeptid oder BASB020-Polynukleotid zur Behandlung von Infektionen eingesetzt werden, insbesondere von bakteriellen Infektionen.
Polypeptidvarianten, die antigenisch, epitopisch oder immunologisch äquivalente Varianten einschließen, bilden einen besonderen Aspekt dieser Erfindung.
Bevorzugt wird der Antikörper oder die Variante davon modifiziert, um ihn/sie weniger immunogen im Individuum zu machen. Falls das Individuum ein Mensch ist, kann der Antikörper z.B. höchst vorzugsweise "humanisiert" werden, wobei die die Komplementarität bestimmende Region oder Regionen des Hybridom-abgeleiteten Antikörpers in einen humanen monoklonalen Antikörper transplantiert wurden, z.B. wie beschrieben in Jones et al., (1986), Nature 321, 522–525, oder Tempest et al. (1991) Biotechnology 9, 266–273.
Antagonisten und Agonisten – Tests und Moleküle Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können ebenfalls zur Bewertung der Bindung von kleinen Molekülsubstraten und Liganden in z.B. Zellen, zellfreien Zubereitungen, chemischen Bibliotheken und natürlichen Produktmischungen verwendet werden. Diese Substrate und Liganden können natürliche Substrate und Liganden sein oder können strukturelle oder funktionelle Mimetika sein. Siehe z.B. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Kapitel 5 (1991).
Die Durchmusterungsverfahren können einfach die Bindung einer Testverbindung an das Polypeptid oder Polynukleotid oder an Zellen oder Membranen, die das Polypeptid oder Polynukleotid tragen, oder ein Fusionsprotein des Polypeptids mittels eines Markers, der direkt oder indirekt mit der Testverbindung assoziiert, messen. Alternativ kann das Durchmusterungsverfahren die Konkurrenz mit einem markierten Konkurrenten beinhalten. Ferner können diese Durchmusterungsverfahren testen, ob die Testverbindung zu einem Signal führt, das durch Aktivierung oder Inhibierung des Polypeptids oder Polynukleotids erzeugt wird, wobei Detektionssysteme verwendet werden, die für die Zellen angemessen sind, die das Polypeptid oder Polynukleotid umfassen. Inhibitoren der Aktivierung werden allgemein in Gegenwart eines bekannten Agonisten getestet, und die Wirkung von Aktivierung durch den Agonisten durch die Gegenwart der Testverbindung wird beobachtet. Konstitutiv aktives Polypeptid und/oder konstitutiv exprimierte Polypeptide und Polynukleotide können in Durchmusterungsverfahren für inverse Agonisten oder Inhibitoren in Abwesenheit eines Agonisten oder Inhibitors eingesetzt durch Testen werden, ob die Testverbindung zu einer Inhibierung der Aktivierung des Polypeptids oder Polynukleotids je nach Fall führt. Ferner können die Durchmusterungsverfahren einfach die Schritte aus Vermischen einer Testverbindung mit einer Lösung, die ein Polypeptid oder Polynukleotid der vorliegenden Erfindung enthält, zur Bildung einer Mischung, Messen von BASB020-Polypeptid- und/oder -Polynukleotid-Aktivität in der Mischung und Vergleichen der BASB020-Polypeptid- und/oder -Polynukleotid-Aktivität der Mischung mit einem Standard umfassen. Fusionsproteine, wie die aus dem Fc-Teil und BASB020-Polypeptid hergestellten, wie hier zuvor beschrieben, können ebenfalls für Hochdurchsatz-Durchmusterungstests verwendet werden, um Antagonisten des Polypeptids der vorliegenden Erfindung sowie von phylogenetisch und/oder funktionell verwandten Polypeptiden zu identifizieren (siehe D. Bennett et al., J. Mol. Recognition, 8:52–58 (1995); und K. Johanson et al., J. Biol. Chem., 270 (16):9459–9471 (1995)).
Die Polynukleotide, Polypeptide und Antikörper, die an ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung binden und/oder damit Wechselwirken, können ebenfalls zur Konfiguration von Durchmusterungsverfahren zum Nachweisen der Wirkung von hinzugegebenen Verbindungen auf die Erzeugung von mRNA und/oder Polypeptid in Zellen verwendet werden. Z.B. kann ein ELISA-Test zur Messung von sezernierten oder zellassoziierten Mengen von Polypeptid unter Ver wendung monoklonaler und polyklonaler Antikörper durch fachbekannte Standardverfahren konstruiert werden. Dieser kann zum Auffinden von Mitteln, die die Produktion von Polypeptid inhibieren bzw. steigern können (ebenfalls Antagonist bzw. Agonist genannt), aus geeignet manipulierten Zellen oder Geweben verwendet werden.
Die Erfindung stellt ebenfalls ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen bereit, um diejenigen zu identifizieren, die die Wirkung von BASB020-Polypeptiden oder -Polynukleotiden steigern (Agonist) oder blockieren (Antagonist), insbesondere diejenigen Verbindungen, die bakteriostatisch und/oder bakterizid sind. Das Durchmusterungsverfahren kann Hochdurchsatztechniken beinhalten. Zum Beispiel wird zur Durchmusterung auf Agonisten oder Antagonisten eine synthetische Reaktionsmischung, ein zelluläres Kompartiment, wie eine Membran, eine Zellhülle oder Zellwand oder eine Zubereitung von jedem daraus, die BASB020-Polypeptid und ein markiertes Substrat oder einen markierten Liganden eines solchen Polypeptids umfaßt, in Abwesenheit oder Gegenwart eines Testmoleküls inkubiert, das ein BASB020-Agonist oder -Antagonist sein kann. Die Fähigkeit des Testmoleküls, agonistisch oder antagonistisch mit dem BASB020-Polypeptid zu wirken, wird in der abnehmenden Bindung des markierten Liganden oder in der abnehmenden Erzeugung von Produkt aus einem solchen Substrat widergespiegelt. Moleküle, die unverlangt binden, d.h. ohne Induzierung der Wirkungen von BASB020-Polypeptid, sind höchstwahrscheinlich gute Antagonisten. Moleküle, die gut binden und je nach Fall die Geschwindigkeit der Produkterzeugung aus Substrat erhöhen, die Signalleitung erhöhen oder die chemische Kanalaktivität erhöhen, sind Agonisten. Die Detektion der Geschwindigkeit oder Menge, je nach Fall, der Erzeugung von Produkt aus Substrat, der Signalleitung oder der chemischen Kanalaktivität kann unter Verwendung eines Reportersystems gesteigert werden. Reportersysteme, die in dieser Hinsicht nützlich sein können, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf kolorimetrische, markiertes Substrat, das zu Produkt umgewandelt wird, ein Reportergen, das auf Veränderungen der BASB020-Polynukleotid- oder -Polypeptid-Aktivität reagiert, und fachbekannte Bindungstests.
Ein anderes Beispiel für einen Test auf BASB020-Agonisten ist ein kompetitiver Test, der BASB020 und einen potentiellen Agonisten mit BASB020-bindenden Molekülen, rekombinanten BASB020-bindenden Molekülen, natürlichen Substraten oder Liganden oder Substrat- oder Ligandmimetika unter geeigneten Bedingungen für einen kompetitiven Inhibierungstest kombiniert. BASB020 kann markiert werden, wie durch Radioaktivität oder eine kolorimetrische Verbindung, so daß die Anzahl von BASB020-Molekülen, die an ein Bindungsmolekül gebunden werden oder zu Produkt umgewandelt werden, genau bestimmt werden kann, um die Effektivität des potentiellen Antagonisten zu bewerten.
Potentielle Antagonisten schließen u.a. kleine organische Moleküle, Peptide, Polypeptide und Antikörper ein, die an ein Polynukleotid und/oder Polypeptid der Erfindung binden und dadurch seine Aktivität oder Expression hemmen oder auslöschen. Potentielle Antagonisten können ebenfalls kleine organische Moleküle, ein Peptid, ein Polypeptid, wie ein eng verwandtes Protein, oder ein Antikörper sein, der die gleiche Stelle auf einem Bindungsmolekül bindet, wie ein Bindungsmolekül, ohne BASB020-induzierte Aktivitäten zu induzieren, wodurch die Wirkung oder Expression von BASB020-Polypeptiden und/oder -Polynukleotiden verhindert wird, indem BASB020-Polypeptide und/oder -Polynukleotide von der Bindung ausgeschlossen werden.
Potentielle Antagonisten schließen ein kleines Molekül ein, das an die Bindungsstelle des Polypeptids bindet oder diese besetzt, wodurch die Bindung an zelluläre Bindungsmoleküle verhindert wird, so daß eine normale biologische Aktivität verhindert wird. Beispiele für kleine Moleküle schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf kleine organische Moleküle, Peptide oder peptidartige Moleküle. Andere potentielle Antagonisten schließen antisense-Moleküle ein (siehe Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) für eine Beschreibung dieser Moleküle). Bevorzugte potentielle Antagonisten schließen Verbindungen ein, die mit BASB020 verwandt sind, sowie Varianten von BASB020.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung gentechnisch veränderte lösliche Fusionsproteine, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder ein Fragment davon und verschiedene Teile der konstanten Regionen von schweren oder leichten Ketten von Immunglobulinen verschiedener Unterklassen (IgG, IgM, IgA, IgE) umfassen. Bevorzugt als Immunglobulin ist der konstante Teil der schweren Kette von humanem IgG, insbesondere Igel, wobei die Fusion an der Gelenkregion stattfindet. In einer besonderen Ausführungsform kann der Fc-Teil einfach durch Einfügen einer Spaltsequenz entfernt werden, die mit Blutgerinnungsfaktor Xa gespalten werden kann. Ferner betrifft diese Erfindung Verfahren zur Herstellung dieser Fusionsproteine durch die Gentechnik und deren Verwendung zur Wirkstoffdurchmusterung, Diagnose und Therapie. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ebenfalls Polynukleotide, die solche Fusionsproteine codieren. Beispiele für die Fusionsproteintechnik können in WO 94/29458 und WO 94/22914 gefunden werden.
Jede der hier bereitgestellten Polynukleotidsequenzen kann im Auffinden und in der Entwicklung antibakterieller Verbindungen verwendet werden. Das codierte Protein kann bei Expression als Ziel für die Durchmusterung antibakterieller Wirkstoffe verwendet werden. Zusätzlich können die Polynukleotidsequenzen, die die Amino-terminalen Regionen des codierten Proteins oder Shine-Delgarno-Sequenzen oder andere die Translation erleichternde Sequenzen der jeweiligen mRNA codieren, zur Konstruktion von antisense-Sequenzen verwendet werden, um die Expression der interessierenden codieren Sequenz zu steuern.
Die Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung des Polypeptids, Polynukleotids, Agonisten oder Antagonisten der Erfindung zum Eingriff in die ursprüngliche physikalische Wechselwirkung zwischen einem Pathogen oder Pathogenen und einem eukaryontischen Wirt, vorzugsweise Säugetier, bereit, die für die Folgen der Infektion verantwortlich ist. Insbesondere können die Moleküle der Erfindung verwendet werden: In der Prävention der Adhäsion von Bakterien, insbesondere von Gram-positiven und/oder Gram-negativen Bakterien, an eukaryontische extrazelluläre Matrixproteine, vorzugsweise von Säugetieren, auf Verweilvorrichtungen oder an extrazellulären Matrixproteinen in Wunden; zur Blockierung der bakterielle Adhäsion zwischen eukaryontischen extrazellulären Matrixproteinen, vorzugsweise von Säugetieren, und bakteriellen BASB020-Proteinen, die Gewebeschädigung vermitteln; und/oder zur Blockierung des normalen Fortschreitens der Pathogenese bei Infektionen, die anders als durch die Implantation von Verweilvorrichtungen oder durch andere chirurgische Techniken eingeleitet werden.
Gemäß noch einem anderen Aspekt der Erfindung werden BASB020-Agonisten und -Antagonisten bereitgestellt, bevorzugt bakteriostatische oder bakterizide Agonisten und Antagonisten.
Die Antagonisten und Agonisten der Erfindung können z.B. zur Prävention, Inhibierung und/oder Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Mimotope des Polypeptids der Erfindung. Ein Mimotop ist eine Peptidsequenz, die ausreichend ähnlich dem nativen Peptid ist (sequenziell oder strukturell), und die durch Antikörper erkannt werden kann, die das native Peptid erkennen; oder die Antikörper hervorrufen kann, die das native Peptid bei Kupplung an einen geeigneten Träger erkennen.
Peptidmimotope können für einen besonderen Zweck durch Addition, Deletion oder Substitution ausgewählter Aminosäuren geschaffen werden. So können die Peptide für die Zwecke der Erleichterung der Konjugation an einen Proteinträger modifiziert werden. Zum Beispiel kann es für einige chemische Konjugationsverfahren wünschenswert sein, ein terminales Cystein einzuschließen. Zusätzlich kann es für Peptide, die an einen Proteinträger konjugiert werden, wünschenswert sein, ein hydrophobes Ende einzuschließen, das distal vom konjugierten Ende des Peptids liegt, so daß das freie unkonjugierte Ende des Peptids mit der Oberfläche des Trägerproteins assoziiert bleibt, wodurch das Peptid in einer Konformation angeboten wird, die derjenigen des Peptids am stärksten ähnelt, wie es im Zusammenhang des ganzen nativen Moleküls gefunden wird. Zum Beispiel können die Peptide verändert werden, so daß sie ein N-terminales Cystein und einen C-terminalen hydrophoben amidierten Schwanz aufweisen. Alternativ kann die Addition oder Substitution einer D-Stereoisomerform einer oder mehrerer der Aminosäuren durchgeführt werden, um ein vorteilhaftes Derivat zu erzeugen, z.B. zur Steigerung der Stabilität des Peptids.
Alternativ können Peptidmimotope unter Verwendung von Antikörpern identifiziert werden, die selbst an die Polypeptide der vorliegenden Erfindung binden können, unter Verwendung von Techniken wie der Phagen-Display-Technik ( EP 0 552 267 B1 ). Diese Technik erzeugt eine große Anzahl von Peptidsequenzen, die die Struktur der nativen Peptide nachahmen und deshalb an anti-native Peptid-Antikörper binden können, aber nicht notwendigerweise selbst eine signifikante Sequenzhomologie mit dem nativen Polypeptid teilen.
Impfstoffe
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, insbesondere einem Säugetier, vorzugsweise Menschen, welches das Impfen des Individuums mit BASB020-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon umfaßt, ausreichend zu Erzeugung von Antikörper und/oder T-Zell-Immunreaktion, um das Individuum vor Infektion zu schützen, insbesondere vor bakterieller Infektion und ganz besonders vor Infektion mit Moraxella catarrhalis. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren, durch die eine solche immunologische Reaktion die bakterielle Vermehrung verlangsamt. Noch ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Induzierung einer immunologischen Reaktion in einem Individuum, welches das Übertragen eines Nukleinsäurevektors, einer Sequenz oder eines Ribozyms auf ein solches Individuum umfaßt, um die Expression von BASB020-Polynukleotid und/oder -Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon auszurichten, zur Expression von BASB020-Polynukleotid und/oder Polypeptid oder einem Fragment oder einer Variante davon in vivo, um eine immunologische Reaktion zu induzieren, wie zur Erzeugung von Antikörper und/oder T-Zell-Immunreaktion, einschließlich z.B. Cytokin-erzeugender T-Zellen oder cytotoxischer T-Zellen, um das Individuum, bevorzugt einen Menschen, vor Krankheit zu schützen, unabhängig davon, ob diese Krankheit bereits im Individuum etabliert ist oder nicht. Ein Beispiel für die Verabreichung des Gens ist durch seine Beschleunigung in die gewünschten Zellen als Überzug auf Partikeln oder in anderer Weise. Ein solcher Nukleinsäurevektor kann DNA, RNA, ein Ribozym, eine modifizierte Nukleinsäure, ein DNR/RNA-Hybrid, einen DNA-Protein-Komplex oder einen RNA-Protein-Komplex umfassen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine immunologische Zusammensetzung, die bei Einführung in ein Individuum, bevorzugt einen Menschen, in dem eine immunologische Reaktion induziert werden kann, eine immunologische Reaktion in einem solchen Individuum gegen ein BASB020-Polynukleotid und/oder ein daraus codiertes Polypeptid induziert, worin die Zusammensetzung ein rekombinantes BASB020-Polynukleotid und/oder daraus codiertes Polypeptid umfaßt und/oder DNA und/oder RNA umfaßt, die ein Antigen des BASB020-Polynukleotids, daraus codierten Polypeptids oder eines anderen Polypeptids der Erfindung codiert und exprimiert. Die immunologische Reaktion kann therapeutisch oder prophylaktisch verwendet werden und kann die Form von Antikörperimmunität und/oder zellulärer Immunität annehmen, wie zelluläre Immunität, die aus CTL oder CD4+ T-Zellen entstammt.
Ein BASB020-Polypeptid oder ein Fragment davon kann mit Coprotein oder einer chemischen Einheit fusioniert werden, die selbst Antikörper erzeugen kann oder nicht, aber das erste Protein stabilisieren kann und ein fusioniertes oder modifiziertes Protein erzeugen kann, das antigene und/oder immunogene Eigenschaften und bevorzugt Schutzeigenschaften aufweisen wird. Daher umfaßt fusioniertes rekombinantes Protein bevorzugt zusätzlich ein antigenes Coprotein, wie Lipoprotein D aus Haemophilus influenzae, Glutathion-S-Transferase (GST) oder beta-Galactosidase, oder jedes andere relativ große Coprotein, das das Protein solubilisiert und seine Erzeugung und Reinigung erleichtert. Außerdem kann das Coprotein als Hilfsstoff im Sinne der Bereitstellung einer allgemeinen Stimulierung des Immunsystems des Organismus wirken, der das Protein empfängt. Das Coprotein kann entweder an den Amino- oder Carboxy-Terminus des ersten Proteins gebunden werden.
Bereitgestellt durch diese Erfindung werden Zusammensetzungen, insbesondere Impfstoffzusammensetzungen, und Verfahren, die die Polypeptide und/oder Polynukleotide der Erfindung und immunstimulierende DNA-Sequenzen umfassen, wie die in Y. Sato et al. beschriebenen, Science 273: 352 (1996).
Ebenfalls bereitgestellt durch diese Erfindung werden Verfahren unter Verwendung des beschriebenen Polynukleotids oder besonderer Fragmente davon, von denen gezeigt wurde, daß sie nicht-variable Regionen von bakteriellen Zelloberflächenproteinen codieren, in Polynukleotidkonstrukten, die in solchen genetischen Immunisierungsexperimenten in Tiermodellen der Infektion mit Moraxella catarrhalis verwendet werden. Solche Experimente werden besonders nützlich zur Identifizierung von Proteinepitopen sein, die eine prophylaktische oder therapeutische Immunreaktion hervorrufen können. Es wird angenommen, daß dieser Ansatz die anschließende Herstellung monoklonaler Antikörper von besonderem Wert erlauben wird, die aus dem notwendigen Organ des Tieres stammen, das erfolgreich einer Infektion widersteht oder diese klärt, zur Entwicklung von prophylaktischen Mitteln oder therapeutischen Behandlungen bakterieller Infektionen, insbesondere Infektionen mit Moraxella catarrhalis, in Säugetieren, insbesondere Menschen.
Die Erfindung schließt ebenfalls eine Impfstofformulierung ein, die ein immunogenes rekombinantes Polypeptid und/oder Polynukleotid der Erfindung zusammen mit einem geeigneten Träger, wie mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger, umfaßt. Da die Polypeptide und Polynukleotide im Magen abgebaut werden können, wird jedes bevorzugt parenteral verabreicht, einschließlich z.B. einer Verabreichung, die subkutan, intramuskulär, intravenös oder intradermal ist. Zur parenteralen Verabreichung geeignete Formulierungen schließen wäßrige und nicht-wäßrige sterile Injektionslösungen ein, die Antioxidantien, Puffer, bakteriostatische Verbindungen und gelöste Stoffe enthalten können, die die Formulierung isotonisch zur Körperflüssigkeit, bevorzugt dem Blut, des Individums machen; und wäßrige und nicht-wäßrige sterile Suspensionen, die Suspendiermittel oder Verdickungsmittel einschließen können. Die Formulierungen können in Einheitsdosis- oder Mehrfachdosisbehältern angeboten werden, z.B. versiegelten Ampullen und Fläschchen, und können in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert werden, der nur die Zugabe des sterilen flüssigen Trägers unmittelbar vor der Verwendung erfordert.
Die Impfstofformulierung der Erfindung kann ebenfalls Hilfsstoffsysteme zur Steigerung der Immunogenität der Formulierung einschließen. Bevorzugt ruft das Hilfsstoffsystem vorzugsweise eine Reaktion vom TH1-Typ hervor.
Eine Immunreaktion kann allgemein in zwei extreme Kategorien unterteilt werden, die eine humorale oder eine zellvermittelte Immunreaktion sind (traditionell durch Antikörper- bzw. zelluläre Effektormechanismen des Schutzes gekennzeichnet). Diese Kategorien der Reaktion werden als Reaktionen vom TH1-Typ (zellvermittelte Reaktion) und Immunreaktion vom TH2-Typ (humorale Reaktion) bezeichnet.
Extreme Immunreaktionen vom TH1-Typ können durch die Erzeugung von antigenspezifischen, Haplotyp-beschränkten cytotoxischen T-Lymphozyten und natürliche Killerzell-Reaktionen gekennzeichnet sein. In Mäusen sind Reaktionen vom TH1-Typ häufig durch die Erzeugung von Antikörpern vom IgG2a-Untertyp gekennzeichnet, während diese im Menschen Antikörpern vom IgGl-Typ entsprechen. Immunreaktionen vom TH2-Typ sind durch die Erzeugung einer großen Reihe von Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet, in Mäusen einschließlich Ige1, IgA und IgM.
Man kann annehmen, daß die treibende Kraft hinter der Entwicklung dieser zwei Typen von Immunreaktionen Cytokine sind. Hohe Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ neigen dazu, die Induzierung von zellvermittelten Immunreaktionen auf ein gegebenes Antigen zu begünstigen, während hohe Mengen von Cytokinen vom TH2-Typ dazu neigen, die Induzierung humoraler Immunreaktionen gegen das Antigen zu begünstigen.
Die Unterscheidung von Immunreaktionen vom TH1- und TH2-Typ ist nicht absolut. In der Realität wird ein Individuum eine Immunreaktion unterstützen, die als vorherrschend TH1 oder vorherrschend TH2 beschrieben wird. Jedoch ist es häufig zweckmäßig, die Familien von Cytokinen in bezug auf das zu betrachten, was in murinen CD4 +ve T-Zell-Klonen von Mosmann und Coffman beschrieben wurde (T.R. Mosmann und R.L. Coffman (1989), TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, S. 145–173). Traditionell sind Reaktionen vom TH1-Typ mit der Erzeugung der INF-γ- und IL-2-Cytokinen durch T-Lymphozyten verbunden. Andere Cytokine, die häufig direkt mit der Induzierung von Immunreaktionen vom TH1-Typ verbunden sind, werden nicht durch T-Zellen erzeugt, wie IL-12. Im Gegensatz sind Reak tionen vom TH2-Typ mit der Sekretion von IL-4, IL-5, IL-6 und IL-13 verbunden.
Es ist bekannt, daß bestimmte Impfstoffhilfsstoffe besonders geeignet zur Stimulation von Cytokinreaktionen vom entweder TH1- oder TH2-Typ sind. Traditionell schließen die besten Indikatoren des TH1:TH2-Gleichgewichts der Immunreaktion nach einer Impfung oder Infektion die direkte Messung der Erzeugung von TH1- oder TH2-Cytokinen durch T-Lymphozyten in vitro nach Restimulation mit Antigen und/oder die Messung des IgG1:IgG2a-Verhältnisses von antigenspezifischen Antikörperreaktionen ein.
So ist ein Hilfsstoff vom TH1-Typ ein solcher, der vorzugsweise isolierte T-Zell-Populationen stimuliert, um hohe Mengen von Cytokinen vom TH1-Typ bei Restimulation mit Antigen in vitro zu erzeugen, und die Entwicklung von sowohl CD8+ cytotoxischen T-Lymphozyten als auch antigenspezifischen Immunglobulinreaktionen fördert, die mit dem Isotyp vom TH1-Typ verbunden sind.
Hilfsstoffe, die vorzugsweise die TH1-Zellreaktion stimulieren können, werden in den WO 94/00153 und WO 95/17209 beschrieben.
3-Des-O-acyliertes Monophosphoryllipd A (3D-MPL) ist ein solcher Hilfsstoff. Dies ist aus GB 2220211 (Bibi) bekannt. Chemisch ist es eine Mischung aus 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten und wird von Ribi Immunochem, Montana, hergestellt. Eine bevorzugte Form von 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A wird in EP 0 689 454 B1 (SmithKline Beecham Biologicals SA) offenbart.
Bevorzugt sind die Partikel von 3D-MPL klein genug, um durch eine 0,22 μm-Membran sterilfiltriert zu werden ( EP 0 689 454 ).
3D-MPL wird im Bereich von 10 bis 100 μg, bevorzugt 25 bis 50 μg pro Dosis vorhanden sein, worin das Antigen typischerweise in einem Bereich von 2 bis 50 μg pro Dosis vorhanden sein wird.
Ein anderer bevorzugter Hilfsstoff umfaßt QS21, eine HPLC-gereinigte nicht-toxische Fraktion, die aus der Rinde von Quillaja Saponaria Molina stammt. Gegebenenfalls kann dies mit 3-des-O-acyliertem Monophosphoryllipid A (3D-MPL) vermischt werden, gegebenenfalls zusammen mit einem Träger.
Das Verfahren zur Herstellung von QS21 wird in US-PS 5 057 540 offenbart.
Nicht-reaktogene Hilfsstofformulierungen, die QS21 enthalten, wurden zuvor beschrieben (WO 96/33739). Es wurde gezeigt, daß solche Formulierungen, die QS21 und Cholesterin umfassen, erfolgreiche TH1-stimu lierende Hilfsstoffe sind, wenn sie zusammen mit einem Antigen formuliert werden.
Weitere Hilfsstoffe, die bevorzugte Stimulatoren der TH1-Zellreaktion sind, schließen immunmodulatorische Oligonukleotide ein, z.B. unmethylierte CpG-Sequenzen, wie in WO 96/02555 offenbart.
Kombinationen unterschiedlicher TH1-stimulierender Hilfsstoffe, wie die hier oben genannten, werden ebenfalls als Bereitstellung eines Hilfsstoffs erwogen, der ein vorzugsweiser Stimulator der TH1-Zellreaktion ist. Z.B. kann QS21 zusammen mit 3D-MPL formuliert werden. Das Verhältnis von QS21:3D-MPL wird typischerweise in der Größenordnung von 1:10 bis 10:1 sein, bevorzugt 1:5 bis 5:1 und häufig im wesentlichen 1:1. Der bevorzugte Bereich für einen optimalen Synergismus ist 2,5:1 bis 1:1 3D-MPL:QS21.
Bevorzugt ist ebenfalls ein Träger in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung vorhanden. Der Träger kann eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder ein Aluminiumsalz sein, wie Aluminiumphosphat oder Aluminiumhydroxid.
Eine bevorzugte Öl-in-Wasser-Emulsion umfaßt ein metabolisierbares Öl, wie Squalen, alpha-Tocopherol und Tween 80. In einem besonders bevorzugten Aspekt werden die Antigene in der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung mit QS21 und 3D-MPL in einer solchen Emulsion kombiniert. Zusätzlich kann die Öl-in-Wasser-Emulsion Span 85 und/oder Lecithin und/oder Tricaprylin enthalten.
Typischerweise werden QS21 und 3D-MPL für die menschliche Verabreichung in einem Impfstoff im Bereich von 1 bis 200 μg, wie 10 bis 100 μg, bevorzugt 10 bis 50 μg pro Dosis vorhanden sein. Typischerweise wird die Öl-in-Wasser-Emulsion 2 bis 10 % Squalen, 2 bis 10 % alpha-Tocopherol und 0,3 bis 3 % Tween 80 umfassen. Bevorzugt ist das Verhältnis von Squalen:alpha-Tocopherol gleich oder weniger als 1, da dies eine stabilere Emulsion liefert. Span 85 kann ebenfalls in einer Menge von 1 % vorhanden sein. In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, daß die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung ferner einen Stabilisator enthalten.
Nicht-toxische Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten bevorzugt ein nicht-toxisches Öl, z.B. Squalan oder Squalen, einen Emulgator, z.B. Tween 80, in einem wäßrigen Träger. Der wäßrige Träger kann z.B. phosphatgepufferte Kochsalzlösung sein.
Eine besonders wirksame Hilfsstofformulierung, die QS21, 3D-MPL und Tocopherol in einer Öl-in-Wasser-Emulsion beinhaltet, wird in WO 95/17210 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine polyvalente Impfstoffzusammensetzung bereit, die eine Impfstofformulierung der Erfindung in Kombination mit anderen Antigenen umfaßt, insbesondere Antigenen, die zur Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten und verwandten Zuständen nützlich sind. Eine solche polyvalente Impfstoffzusammensetzung kann einen TH-1-induzierenden Hilfsstoff wie hier zuvor beschrieben einschließen.
Obwohl die Erfindung unter Bezugnahme auf bestimmte BASB020-Polypeptide und -Polynukleotide beschrieben wurde, versteht es sich, daß dies Fragmente der natürlich vorkommenden Polypeptide und Polynukleotide und ähnliche Polypeptide und Polynukleotide mit Additionen, Deletionen oder Subsitutionen umfaßt, die nicht substantiell die immunogenen Eigenschaften der rekombinanten Polypeptide oder Polynukleotide beeinträchtigen.
Zusammensetzungen, Kits und Verabreichung
In einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Zusammensetzungen bereitgestellt, die ein BASB020-Polynukleotid und/oder ein BASB020-Polypeptid zur Verabreichung an eine Zelle oder an einen mehrzelligen Organismus umfassen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls Zusammensetzungen, die ein Polynukleotid und/oder ein Polypeptid wie hier erörtert oder deren Agonisten oder Antagonisten umfassen. Die Polypeptide und Polynukleotide der Erfindung können in Kombination mit (einem) nicht-sterilen oder sterilen Träger(n) zur Verwendung mit Zellen, Geweben oder Organismen eingesetzt werden, wie mit einem pharmazeutischen Träger, der zur Verabreichung an ein Individuum geeignet ist. Solche Zusammensetzungen umfassen z.B. ein Medienadditiv oder eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der Erfindung und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten. Solche Träger können einschließen, aber sind nicht beschränkt auf: Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol oder Kombinationen daraus. Die Formulierung sollte für den Verabreichungsmodus passen. Die Erfindung betrifft ferner diagnostische und pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvorgenannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind.
Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie mit therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können in jeder effektiven, zweckmäßigen Weise verabreicht werden, einschließlich z.B. Verabreichung durch u.a. topische, orale, anale, vaginale, intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, intranasale oder intradermale Wege.
In der Therapie oder als Prophylaktikum kann der Wirkstoff an ein Individuum als injizierbare Zusammensetzung verabreicht werden, z.B. als sterile wäßrige Dispersion, bevorzugt isotonisch.
In einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen vor, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Polypeptids und/oder Polynukleotids, wie die lösliche Form eines Polypeptids und/oder Polynukleotids der vorliegenden Erfindung, eines agonistischen oder antagonistischen Peptids oder einer kleinen Molekülverbindung in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Exzipienten umfassen. Solche Träger schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen daraus. Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Packungen und Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Polypeptide, Polynukleotide und andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung können allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen, wie mit therapeutischen Verbindungen, eingesetzt werden.
Die Zusammensetzung wird dem Verabreichungsweg angepaßt werden, z.B. auf einem systemischen oder oralen Weg. Bevorzugte Formen der systemischen Verabreichung schließen die Injektion ein, typischerweise durch intravenöse Injektion. Andere Injektionswege, wie die subkutane, intramuskuläre oder intraperitoneale, können verwendet werden. Alternative Mittel zur systemischen Verabreichung schließen die transmukosale und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Durchdringungsmitteln ein, wie Gallensalzen oder Fusidinsäure oder anderen Detergenzien. Falls ein Polypeptid oder andere Verbindungen der vorliegenden Erfindung in einer enterischen oder einer verkapselten Formulierung formuliert werden können, kann zusätzlich ebenfalls die orale Verabreichung möglich sein. Die Verabreichung dieser Verbindungen kann ebenfalls topisch und/oder lokalisiert sein, in Form von Salben, Pasten, Gelen, Lösungen, Pulvern und dgl.
Zur Verabreichung an Säugetiere und insbesondere Menschen wird erwartet, daß die tägliche Dosierungsmenge des aktiven Mittels 0,01 bis 10 mg/kg sein wird, typischerweise ca. 1 mg/kg. Der Arzt wird in jedem Fall die tatsächliche Dosierung bestimmen, die für ein Individuum am besten geeignet ist und mit dem Alter, Gewicht und der Reaktion des besonderen Individuums variieren wird. Die obigen Dosierungen sind exemplarisch für den durchschnittlichen Fall. Daher kann es natürlich individuelle Fälle geben, in denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche angezeigt sind, und solche sind im Umfang dieser Erfindung.
Der erforderliche Dosierungsbereich hängt von der Wahl des Peptids, dem Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, der Natur des Zustands des Patienten und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Geeignete Dosierungen sind jedoch im Bereich von 0,1–100 μg/kg Patient.
Eine Impfstoffzusammensetzung ist zweckmäßig in injizierbarer Form. Zweckmäßige Hilfsstoffe können eingesetzt werden, um die Immunreaktion zu steigern. Eine geeignete Einheitsdosis zur Impfung beträgt 0,5–5 μg/kg von Antigen, und eine solche Dosis wird bevorzugt 1- bis 3-mal und mit einem Intervall von 1 bis 3 Wochen verabreicht. Mit dem angegebenen Dosisbereich werden keine nachteiligen toxikologischen Wirkungen für die Verbindungen der Erfindung beobachtet werden, die ihre Verabreichung an geeignete Individuen ausschließen würden.
Weite Variationen der erforderlichen Dosierung werden jedoch im Hinblick auf die Variabilität der verfügbaren Verbindungen und die unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Verabreichungswege erwartet. Zum Beispiel würde erwartet, daß die orale Verabreichung höhere Dosierungen als die Verabreichung durch intravenöse Injektion erfordern würde. Variationen dieser Dosierungsmengen können unter Verwendung empirischer Standardroutinen zur Optimierung eingestellt werden, wie es allgemein fachbekannt ist.
Sequenzdatenbanken, Sequenzen in einem faßbaren Medium und Algorithmen
Polynukleotid- und Polypeptidsequenzen bilden eine wertvolle Informationsquelle, mit der ihre 2- und 3-dimensionalen Strukturen bestimmt sowie weitere Sequenzen ähnlicher Homologie identifiziert werden können. Diese Ansätze werden am leichtesten durch Speicherung der Sequenz in einem computerlesbaren Medium und anschließende Verwendung der gespeicherten Daten in einem bekannten makromolekularen Strukturprogramm oder zur Recherche in einer Sequenzdatenbank unter Verwendung allgemein bekannter Recherchenwerkzeuge, wie mit dem GCG-Programmpaket, erleichtert.
Ebenfalls bereitgestellt durch die Erfindung werden Verfahren zur Analyse von Merkmalssequenzen oder -ketten, insbesondere genetischen Sequenzen oder codierten Proteinsequenzen. Bevorzugte Verfahren der Sequenzanalyse schließen z.B. Verfahren der Sequenzhomologieanalyse ein, wie Identitäts- und Ähnlichkeitsanalyse, DNA-, RNA- und Proteinstrukturanalyse, Sequenzaufbau, kladistische Analyse, Sequenzmotivanalyse, Bestimmung des offenen Leserasters, Nukleinsäure-Basenzählung, Analyse der Codonenverwendung, Zurechtstutzen der Nukleinsäurebasen und sequenzierende Chromatogrammpeakanalyse.
Ein computerbasiertes Verfahren wird zur Durchführung der Homologieidentifzierung bereitgestellt. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte aus: Bereitstellen einer ersten Polynukleotidsequenz, die die Sequenz eines Polynukleotids der Erfindung umfaßt, in einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polynukleotidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie.
Ein computerbasiertes Verfahren wird ebenfalls zur Durchführung der Homologieidentifikation bereitgestellt, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt aus: Bereitstellen einer ersten Polypeptidsequenz, die die Sequenz eines Polypeptids der Erfindung umfaßt, in einem computerlesbaren Medium; und Vergleichen der ersten Polypeptidsequenz mit wenigstens einer zweiten Polynukleotid- oder Polypeptidsequenz zur Identifizierung von Homologie.
Alle Veröffentlichungen und Literaturstellen, einschließlich von (aber nicht beschränkt auf) Patenten und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung zitiert werden, werden hier durch Verweis in ihrer Gesamtheit eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung oder Literaturstelle spezifisch und individuell als durch Verweis hier vollständig eingeführt angegeben wäre. Jede Patentanmeldung, deren Priorität diese Anmeldung beansprucht, wird ebenfalls durch Verweis in ihrer Gesamtheit in der oben für Publikationen und Literaturstellen beschrieben Weise eingeführt.
Definitionen
"Identität", wie es fachbekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, wie sie durch Vergleich der Sequenzen bestimmt wird. Auf diesem Gebiet bezeichnet "Identität" ebenfalls den Grad der Sequenzverwandtheit zwischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, wie es durch die Übereinstimmung zwischen Ketten solcher Sequenzen bestimmt wird. "Identität" kann leicht durch bekannte Verfahren berechnet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf diejenigen, die beschrieben werden in "Computational Molecular Biology", A.M. Lesk, Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D.W. Smith, Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, A.M. Griffin und H.G. Griffin, Hrsg., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, G. von Heine, Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, M. Gribskov und J. Devereux, Hrsg., M. Stockton Press, New York, 1991; und H. Carillo und D. Lipman, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Verfahren zur Identitätsbestimmung werden geschaffen, um die größte Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu ergeben. Außerdem sind Verfahren zur Identitätsbestimmung in öffentlich verfügbaren Computerprogrammen codifiziert. Computerprogrammverfahren zu Identitätsbestimmung zwischen zwei Sequenzen schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf das GAP-Programm im GCG-Programmpaket (J. Devereux et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387(1984)), BLASTP, BLASTN (S.F. Altschul et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)) und FASTA (Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444–2448 (1988)). Die BLAST-Familie von Programmen ist öffentlich erhältlich von NCBI und aus anderen Quellen (BLAST Manual, S. Altschul et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; S. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)). Der allgemein bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls zur Identitätsbestimmung verwendet werden.
Parameter für den Polypeptid-Sequenzvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443–453 (1970)
Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Henikoff und Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915–10919 (1992)
Lücken-Strafpunkte: 8
Lückenlänge-Strafpunkte: 2
Ein für diese Parameter nützliches Programm ist öffentlich verfügbar als "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison WI. Die zuvorgenannten Parameter sind die Standardparameter für Peptidvergleiche (neben keinem Strafpunkt für Endlücken).
Parameter für den Polynukleotidvergleich schließen die folgenden ein:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443–453 (1970)
Vergleichsmatrix: Übereinstimmungen = +10, Fehlübereinstimmung = 0
Lücken-Strafpunkte: 50
Lückenlänge-Strafpunkte: 3
Verfügbar als "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison WI. Dies sind die Standardparameter für Nukleinsäurevergleiche.
Eine bevorzugte Bedeutung von "Identität" für Polynukleotide und Polypeptide, je nach Fall, wird nachfolgend unter den Ziffern (1) und (2) bereitgestellt.
(1) Polynukleotid-Ausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polynukleotid ein, das eine Polynukleotidsequenz mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100 % Identität mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 umfaßt, worin die Polynukleotidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 sein kann oder bis zu einer bestimmten ganzzahligen Anzahl von Nukleotidveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Nukleotiddeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenznukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleotiden in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl von Nukleotidveränderungen durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtanzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 bestimmt wird, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl von Nukleotidveränderungen ist, x_n die Gesamtzahl von Nukleotiden in SEQ ID NO:1 ist, y 0,50 für 50 %, 0,60 für 60 %, 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 %, 0,97 für 97 % oder 1,00 für 100 % ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_n abgerundet wird. Veränderungen einer Polynukleotidsequenz, die das Polypeptid mit SEQ ID NO:2 codiert, können Unsinn-, Fehlsinn- oder Rasterverschiebungsmutationen in dieser codierenden Sequenz erzeugen und dadurch das Polypeptid verändern, das durch das Polynukleotid im Anschluß an solche Veränderungen codiert wird.
Als Beispiel kann eine Polynukleotidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:1 sein, d.h. sie kann zu 100 % identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzzahligen Anzahl von Nukleinsäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100 % Identität ist. Solcher Veränderungen sind aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Nukleinsäuredeletion, -substitution, einschließlich Transition und Transversion, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den 5'- oder 3'-terminalen Positionen der Referenz-Polynukleotidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Nukleinsäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Nuklein-säuren in SEQ ID NO:1 bestimmt, oder: nn ≤ xn – (xn·y),worin n_n die Anzahl von Nukleinsäureveränderungen ist, x_n die Gesamtzahl von Nukleinsäuren in SEQ ID NO:1 ist, y z.B. 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % etc. ist, · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_n und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_n abgerundet wird.
(2) Polypeptidausführungsformen schließen ferner ein isoliertes Polypeptid ein, das ein Polypeptid mit wenigstens 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 oder 100 % Identität mit einer Polypeptid-Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 umfaßt, worin die Polypeptidsequenz identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 sein kann oder bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen kann, worin die Veränderungen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativen und nicht-konservativen Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Polypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz, und worin die Anzahl von Aminosäureveränderungen durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 bestimmt wird, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y 0,50 für 50 %, 0,60 für 60 %, 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 %, 0,90 für 90 %, 0,95 für 95 %, 0,97 für 97 % oder 1,00 für 100 % ist und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_a abgerundet wird.
Als Beispiel kann eine Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung identisch mit der Referenzsequenz von SEQ ID NO:2 sein, d.h. sie kann zu 100 % identisch sein, oder sie kann bis zu einer bestimmten ganzen Anzahl von Aminosäureveränderungen im Vergleich mit der Referenzsequenz einschließen, so daß die prozentuale Identität weniger als 100 % Identität ist. Solche Veränderungen werden aus der Gruppe ausgewählt, die aus wenigstens einer Aminosäuredeletion, -substitution, einschließlich konservativen und nicht-konservativen Substitution, oder -insertion besteht, und worin die Veränderungen an den Amino- oder Carboxy-terminalen Positionen der Referenz-Polypeptidsequenz oder an beliebiger Stelle zwischen diesen terminalen Positionen auftreten können, eingestreut entweder individuell unter den Aminosäuren in der Referenzsequenz oder in einer oder mehreren zusammenhängenden Gruppen innerhalb der Referenzsequenz. Die Anzahl von Aminosäureveränderungen für eine gegebene prozentuale Identität wird durch Multiplizieren der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 mit der ganzen Zahl, die die prozentuale Identität geteilt durch 100 definiert, und anschließendes Subtrahieren des Produkts von der Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 bestimmt, oder: na ≤ xa – (xa·y),worin n_a die Anzahl von Aminosäureveränderungen ist, x_a die Gesamtzahl von Aminosäuren in SEQ ID NO:2 ist, y z.B. 0,70 für 70 %, 0,80 für 80 %, 0,85 für 85 % etc. ist, und · das Symbol für den Multiplikationsoperator ist, und worin jedes nicht-ganzzahlige Produkt von x_a und y zur nächsten ganzen Zahl vor der Subtraktion von x_a abgerundet wird.
"Individuum"/"Individuen", wenn hier mit Bezug auf einen Organismus verwendet, bezeichnet einen multizellulären Eukaryonten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf ein Metazoon, ein Säugetier, ein Rind, Ziege/Schaf, einen Affen, einen Primaten und einen Menschen.
"Isoliert" bedeutet "mit menschlicher Hand" aus seinem natürlichen Zustand verändert, d.h. falls es in der Natur vorkommt, wurde es aus seiner natürlichen Umgebung verändert oder entfernt oder beides. Z.B. ist ein in einem lebenden Organismus natürlich vorhandenes Polynukleotid oder Polypeptid nicht "isoliert", aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, das von den koexistierenden Materialien seines natürlichen Zustands getrennt wird, ist "isoliert", wie der Begriff hier eingesetzt wird. Außerdem ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das in einen Organismus durch Transformation, genetische Manipulation oder durch jedes andere rekombinante Verfahren eingeführt wird, "isoliert", selbst wenn es noch in dem Organismus vorhanden ist, wobei der Organismus lebend oder nicht-lebend sein kann.
"Polynukleotid(e)" bezeichnet allgemein jedes Polyribonukleotid oder Polydesoxyribonukleotid, das unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann, einschließlich ein- und doppelsträngiger Regionen.
"Variante" bezeichnet ein Polynukleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenz-Polynukleotid oder -Polypeptid unterscheidet, aber wesentliche Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich von einem anderen Referenz-Polynukleotid in der Nukleotidsequenz. Veränderungen in der Nukleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch das Referenz-Polynukleotid codiert wird, verändern oder nicht. Nukleotidveränderungen können zu Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen, -fusionen und trunkierungen im Polypeptid führen, das durch die Referenzsequenz codiert wird, wie nachfolgend erörtert. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich von einem anderen Referenz-Polypeptid in der Aminosäuresequenz. Allgemein sind Unterschiede beschränkt, so daß die Sequenzen des Referenz-Polypeptids und der Variante sehr ähnlich insgesamt und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Referenz-Polypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen in jeder Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder insertierter Aminosäurerest kann ein solcher sein, der durch den genetischen Code codiert wird oder nicht. Eine Variante eines Polynukleotids oder Polypeptids kann eine natürlich vorkommende sein, wie eine Allelvariante, oder sie kann eine Variante sein, von der nicht bekannt ist, daß sie natürlich auftritt. Nicht-natürlich auftretende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
"Krankheit(en)" bezeichnet jede Krankheit, die durch Infektion mit einem Bakterium verursacht wird oder damit verbunden ist, einschließlich z.B. Mittelohrentzündung bei Kleinkindern und Kindern, Lungenentzündung bei älteren Menschen, Sinusitis, Krankenhausinfektionen und invasive Krankheiten, chronische Mittelohrentzündung mit Gehörverlust, Flüssigkeitsansammlung im Mittelohr, Hörnervschädigung, Verzögerung des Spracherlernens, Infektion der oberen Atemwege und Entzündung des Mittelohrs.
Beispiele
Die nachfolgenden Beispiele werden unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt, die für die Fachleute allgemein bekannt und Routine sind, außer wenn im Detail anders beschrieben. Die Beispiele sind illustrativ, aber beschränken nicht die Erfindung.
Beispiel 1:
Auffinden und bestätigende DNA-Sequenzierung des BASB020-Gens aus Moraxella catarrhalis Stamm ATCC 43617
Das BASB020-Gen von Referenz-SEQ ID NO:1 wurde zuerst in der Incyte PathoSeq-Datenbank gefunden, die unvollständige genomische DNA-Sequenzen des Moraxella catarrhalis-Stammes ATCC 43617 (ebenfalls als Stamm Mc2931 bezeichnet) enthält. Die Translation der BASB020-Polynukleotidsequenz, gezeigt in Referenz-SEQ ID NO:2, zeigte eine signifikante Ähnlichkeit (36 % Identität in einer Überlappung mit 227 Aminosäuren) mit dem TlyC-Hämolysinprotein von Serpulina hyodysenteriae.
Die Sequenz des BASB020-Gens wurde weiter experimentell bestätigt. Für diesen Zweck wurde genomische DNA aus 10¹⁰ Zellen der M. catarrhalis-Zellen (Stamm ATCC 43617) unter Verwendung des genomischen DNA-Extraktions-Kits von QIAGEN (Qiagen GmbH) extrahiert, und 1 μg dieses Materials wurde der Polymerasekettenreaktion-DNA-Amplifikation unter Verwendung der Primer E475781a (5'-ACT TGA ATA AAA CCG AGT G-3') (SEQ ID NO:9] und E475782a (5'-GAC ATT GGC CGC AAC ATG C-3') (SEQ ID NO:10) unterworfen. Dieses PCR-Produkt wurde an einer Vorrichtung Biorobot 9600 (Qiagen GmbH) gereinigt und der DNA-Sequenzierung unter Verwendung des Big Dye Cycle Sequencing Kit (Perkin-Elmer) und eines DNA-Sequenzierers ABI 377/PRISM unterworfen. Die DNA-Sequenzierung wurde an beiden Strängen mit einer Redundanz von 2 durchgeführt, und die Sequenz voller Länge wurde unter Verwendung der Sequencher^TM-Software (Applied Biosystems) zusammengesetzt. Die resultierende DNA-Sequenz erwies sich als 100 % identisch mit Referenz-SEQ ID NO:1.
Beispiel 2:
Variabilitätsanalyse des BASB020-Gens zwischen mehreren Moraxella catarrhalis-Stämmen
2A: Restriktionsfragmentlängenanalyse (RFLP)
Genomische DNA wurde aus 16 M, catarrhalis-Stämmen (dargestellt in Tabelle 1) wie nachfolgend beschrieben extrahiert. M. catarrhalis wurde auf einzelne Kolonien auf BHI-Agarplatten ausgestrichen und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Drei oder vier einzelne Kolonien wurden gepickt und zur Impfung einer ~1,5 ml BHI-(Hirn-Herz-Infusion)-Bouillon-Impfkultur verwendet, die über Nacht in einem Schüttelinkubator mit ~300 U/min bei 37°C gezüchtet wurde. Ein 500 ml-Erlenmeyer-Kolben, der ~150 ml BHI-Bouillon enthielt, wurde mit der Impfkultur geimpft und für ~12 bis 16 Stunden bei 37°C in einem Schüttelinkubator mit ~175 U/min gezüchtet, um Zellmasse zur DNA-Isolierung zu erzeugen. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren in einem Sorvall GSA-Rotor mit ~2000 X g für 15 Minuten bei Raumtemperatur aufgefangen. Der Überstand wurde entfernt und das Zellpellet in ~5,0 ml sterilem Wasser suspendiert. Ein gleiches Volumen von Lysepuffer (200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5 % (G/V) SDS, 0,5 % (V/V) 2-Mercaptoethanol und 250 μg/ml Proteinase K) wurde hinzugegeben und die Zellen durch vorsichtiges Bewegen und Verreiben suspendiert. Die Zellsuspension wurde dann ~12 Stunden bei 50°C inkubiert, um die Bakterien zu lysieren und chromosomale DNA freizusetzen. Proteinhaltiges Material wurde durch Zugabe von 5,0 ml gesättigtem NaCl (~6,0 M in sterilem Wasser) und Zentrifugieren mit ~5 500 × g in einem Sorvall SS34-Rotor bei Raumtemperatur ausgefällt. Chromosomale DNA wurde aus dem geklärten Überstand durch Zugabe von 2 Volumina 100 % Ethanol ausgefällt. Aggregierte DNA wurde aufgefangen und unter vorsichtigem Bewegen in einem kleinen Volumen einer 70%igen Ethanol-Lösung gewaschen. Gereinigte chromosomale DNA wurde in sterilem Wasser suspendiert und über Nacht bei 4°C durch vorsichtiges Schaukeln gelöst/dispergiert. Die Konzentration von gelöster DNA wurden spektrophotometrisch bei 260 nm unter Verwendung eines Extinktionskoeffizienten von 1,0 O.D.-Einheiten ~50 μg/ml bestimmt.
Dieses Material wurde als nächstes der PCR-Amplifikation unterworfen, wobei die MC-Hly3-BamF-Oligonukleotide (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT AGG CGT TGG TTA TCC ACC G-3') [SEQ ID NO:11] und MC-Hly3-SalRC (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG-3') [SEQ ID NO:12] verwendet wurden. Die entsprechenden BASB020-Gen-Amplicons wurden dann unabhängig unter Verwendung von Restriktionsenzymen (AciI, AluI, HphI, MseI, NlaIII, Tsp5091) der Hydrolyse unterworfen, und die Restriktionsprodukte wurden durch Agarose- oder Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Verwendung von Standardverfahren der Molekularbiologie getrennt, wie beschrieben in "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", zweite Auflage, Hrsg.: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor Press 1989. Die Photographien der resultierenden Elektrophoresegele sind in 1 dargestellt. Für jeden Stamm wurden RFLP-Muster, die den 6 Restriktionsenzymen entsprechen, bewertet und kombiniert. Gruppen von Stämmen, die eine identische Kombination von RFLP-Mustern teilen, wurden dann definiert. Unter Verwendung dieser Methodik fielen die in dieser Untersuchung getesteten Stämme in sechs genomische Gruppen (Gruppe 1: Mc2904, Mc2905, Mc2906, MC2969; Gruppe 2: MC2907, MC2913; Gruppe 3: Mc2908, Mc2909, Mc2931, Mc2975; Gruppe 4: Mc2910, Mc2912, Mc2956; Gruppe 5: Mc2911; Gruppe 6: Mc2926). Diese Daten stützen, daß die in dieser Untersuchung verwendete Population von Moraxella catarrhalis eine gewisse Nukleotidsequenz-Diversität für das BASB020-Gen zeigt.
2B: DNA-Sequenzzierung in anderen Stämmen
Der zur Bestimmung der BASB020-Sequenz verwendete Stamm ATCC 43617 (Mc2931) wurde durch RFLP in die Gruppe Nr. 3 klassifiziert. Unter Verwendung des wie in Beispiel 1 beschriebenen experimentellen Verfahrens wurde die Sequenz des BASB020-Gens auch für Moraxella catarrhalis-Stämme bestimmt, die repräsentativ für drei andere genomische RFLP-Gruppen sind (Gr.1 (Mc2969), Gr.2 (Mc2913) und Gr.4 (Mc2912)). Die Polynukleotidsequenzen des BASB020-Gens der Stämme Mc2912, Mc2913 und Mc2969 sin in SEQ ID NO:3, 5 bzw. Referenz 7 gezeigt. Diese Polynukleotidsequenzen wurden zu Aminosäuresequenzen translatiert, die in SEQ ID NO:4, 6 bzw. Referenz 8 gezeigt sind. Unter Verwendung des MegAlign-Programms aus dem DNASTAR Lasergene-Paket wurde eine multiple Angleichung der Polynukleotidsequenzen von SEQ ID NO: Referenz 1, 3, 5 und Referenz 7 durchgeführt und ist in 2 gezeigt. Ein paarweiser Vergleich der Identitäten ist in Tabelle 2 zusammengefaßt, die zeigt, daß die vier Gensequenzen der BASB020-Nukleotide alle ähnlich auf einer Identitätsebene von gleich oder größer als 99 % sind. Unter Verwendung des gleichen Programms wurde eine multiple Angleichung der Polypeptidsequenzen von SEQ ID NO: Referenz 2, 4, 6 und Referenz 8 durchgeführt und ist in 3 gezeigt. Ein paarweiser Vergleich der Identitäten ist in Tabelle 3 zusammengefaßt, die zeigt, daß die vier BASB020-Proteinsequenzen alle ähnlich auf einer Identitätsebene von gleich oder größer als 99 % sind.
Tabelle 1: Merkmale der in dieser Untersuchung verwendeten Moraxella catarrhalis-Stämme
Tabelle 2: Paarweise Identitäten der BASB020-Polynukleotidsequenzen (in %)
Tabelle 3: Paarweise Identitäten der BASB020-Polypeptidsequenzen (in %)
Beispiel 3: Konstruktion von Plasmid zur Expression von rekombinantem BASB020
A: Klonierung von BASB020
Die BamHI- und SalI-Restriktionsorte, konstruiert in die vorwärts ([SEQ ID NO:11]) bzw. reversen ([SEQ ID NO:12]) Amplifikationsprimer, erlaubten eine direktionale Reaktion unter Verwendung von Spin-Säulen auf Kieselgelbasis (QiaGen) gemäß Herstelleranweisungen. Zur Erzeugung der erforderlichen BamHI- und SalI-Enden, die zur Klonierung notwendig sind, wurde gereinigtes PCR-Produkt sequenziell zur Vollständigkeit mit BamHI- und Sall-Restriktionsenzymen gemäß Empfehlung des Herstellers (Life Technologies) verdaut. Nach dem ersten Restriktionsverdau wurde das PCR-Produkt über eine Spin-Säule wie oben gereinigt, um Salze zu entfernen, und in sterilem Wasser vor dem zweiten Enzymverdau eluiert. Das verdaute DNA-Fragment wurden erneut unter Verwendung von Spin-Säulen auf Kieselgelbasis vor der Ligation mit dem pQE30-Plasmid gereinigt..
B: Erzeugung von Expressionsvektor
Zur Herstellung des Expressionsplasmids pQE30 zur Ligation wurde es in ähnlicher Weise zur Vollständigkeit mit sowohl BamHI als auch SalI verdaut und dann mit Kälberdarmphosphatase (CIP, –0,02 Einheiten/pmol des 5'-Endes, Life Technologies) gemäß Herstelleranweisung behandelt, um eine Selbstligation zu verhindern. Ein etwa 5-facher molarer Überschuß des verdauten Fragments zum hergestellten Vektor wurde zur Programmierung der Ligationsreaktion verwendet. Eine standardmäßige Ligationsreaktion mit –20 μl (–16°C, ~16 Stunden) unter Verwendung von fachbekannten Verfahren wurde unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (–2,0 Einheiten/Reaktion, Life Technologies) durchgeführt. Eine Teilmenge der Ligation (–5 μl) wurde zur Transformation von elektrokompetenten M15(pREP4)-Zellen gemäß allgemein fachbekannten Verfahren verwendet. Nach einem -2- bis 3-stündigigen Auswachszeitraum bei 37°C in –1,0 ml LB-Bouillon wurden transformierte Zellen auf LB-Agarplatten ausplattiert, die Kanamycin (50 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) enthielten. Beide Antibiotika wurden in den Selektionsmedien eingeschlossen um sicherzustellen, daß alle transformierten Zellen sowohl das pREP4-Plasmid (KnR), das das lacIq-Gen trägt, das zur Unterdrückung der Expression zur IPTG-induzierbaren Expression der Proteine an pQE30 erforderlich ist, als auch das pQE30-BASB020-Plasmid (ApR) trugen. Platten wurden über Nacht bei 37°C für ~16 Stunden inkubiert. Individuelle KnR/ApR-Kolonien wurden mit sterilen Zahnstochern gepickt und zum "Patch"-Überimpfen von frischen LB KnR/ApR-Platten sowie einer ~1,0 ml LB KnR/ApR-Bouillonkultur verwendet. Sowohl die Patch-Platten als auch die Bouillonkultur wurden über Nacht bei 37°C in entweder einem Standardinkubator (Platten) oder einem Schüttel-Wasserbad inkubiert.
Eine PCR-Analyse auf Vollzellbasis wurde zur Verifizierung eingesetzt, das die Transformanten das BASB020-DNA-Insert enthielten. Hier wurden die ~1,0 ml Übernacht-LB KN/Ap-Bouillonkultur in ein 1,5 ml-Polypropylenröhrchen überführt und die Zellen durch Zentrifugieren in einer Beckmann-Mikrozentrifuge aufgefangen (–3 min, Raumtemperatur, –12 000 × g). Das Zellpellet wurde in ~200 μl sterilem Wasser suspendiert und eine ~10 μl Teilemenge verwendet, um eine PCR-Reaktion mit 50 μl End^volumen ^zu programmieren, die sowohl BASB020-Vorwärts- als auch -Rückwärts-Amplifikationsprimer enthielt. Die Endkonzentrationen der PCR-Reaktionskomponenten waren im wesentlichen die gleichen wie die in Beispiel 2 angegebenen, außer daß –5,0 Einheiten Taq-Polymerase verwendet wurden. Der anfängliche Denaturierungsschritt mit 95°C wurde auf 3 Minuten erhöht, um eine thermische Zerstörung der bakteriellen Zellen und Freisetzung von Plasmid-DNA sicherzustellen. Ein Thermocycler ABI Modell 9700 und 32 Durchläufe eines dreistufigen thermischen Amplifikationsprofils, d.h. 95°C, 45 s; 55–58°C, 45 s, 72°C, 1 min, wurden zur Amplifikation des MC-P6 PCR-Fragments aus den lysierten Transformantenproben verwendet. Nach der thermischen Amplifikation wurde eine Teilmenge von –20 μl der Reaktion durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert (0,8 % Agarose in einem Tris-Acetat-EDTA-(TAE)-Puffer). DNA-Fragmente wurden durch UV-Beleuchtung nach der Gelelektrophorese und Ethidiumbromid-Anfärbung sichtbar gemacht. Ein DNA-Molekülgrößenstandard (1 Kb-Stufe, Life Technologies) wurde parallel zu den Testproben elektrophoretisch behandelt und verwendet, um die Größe der PCR-Produkte abzuschätzen. Transformanten, die das erwartete 504 by PCR-Produkt erzeugten, wurden als Stämme idendifiziert, die ein BASB020-Expressionskonstrukt enthalten. Expressionsplasmid enthaltende Stämme wurden dann auf die induzierbare Expression von rekombinantem BA5B020 analysiert.
C: Expressionsanalyse von PCR-positiven Transformanten
Für jede oben identifizierte PCR-positive Transformante wurden ~5,0 ml von LB-Bouillon, die Kanamycin (50 μg/ml) und Ampicillin (100 μg/ml) enthielt, mit Zellen aus der Patch-Platte geimpft und über Nacht bei 37°C unter Schütteln (~250 U/min) gezüchtet. Eine Teilmenge der Übernacht-Impfkultur (~1,0 ml) wurde in einen 125 ml-Erlenmeyerkolben übergeimpft, der –25 ml LB Kn/Ap-Bouillon enthielt, und bei 37°C unter Schütteln (~250 U/min) gezüchtet, bis die Kulturturbidität einen OD 600-Wert von ~0,5 erreichte, das heißt die mittlere Log-Phase (gewöhnlich ca. 1,5–2,0 Stunden). Zu diesem Zeitpunkt wurde etwa die Hälfte der Kultur (–12,5 ml) in einen zweiten 125 ml-Kolben überführt und die Expression von rekombinantem BA5B020-Protein durch Zugabe von IPTG (1,0 M Vorrat, hergestellt in sterilem Wasser, Sigma) auf eine Endkonzentration von 1,0 mM induziert. Die Inkubation sowohl der IPTG-induzierten als auch nicht-induzierten Kulturen setzte sich für weitere ~4 Stunden bei 37°C unter Schütteln fort. Proben (~1,0 ml) von sowohl induzierten als auch nicht-induzierten Kulturen wurden nach dem Induktionszeitraum entfernt und die Zellen durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei Raumtemperatur für ~3 Minuten aufgefangen. Individuelle Zellpellets wurden in ~50 ml sterilem Wasser suspendiert, dann mit einem gleichen Volumen von 2X Laemelli SDS-PAGE-Probenpuffer vermischt, der 2-Mercaptoethanol enthielt, und in ein siedendes Wasserbad für –3 min zur Denaturierung des Proteins gehalten. Gleiche Volumina (–15 μl) sowohl des rohen IPTG-induzierten als auch des nicht-induzierten Zelllysats wurden auf 12 % Tris/Glycin-Polyacrylamidgel (1 mm dicke Mini-Gele, Novex) in zweifacher Ausführung aufgetragen. Die induzierten und nicht-induzierten Lysatproben wurden zusammen mit vorangefärbten Molekulargewichtsmarkern (SeeBlue, Novex) unter herkömmlichen Bedingungen unter Verwendung eines standardmäßigen SDS/Tris/Glycin-Laufpuffers (BioRad) elektrophoretisch behandelt. Nach der Elektrophorese wurde ein Gel mit Commassie Brilliant Blue R250 (BioRad) angefärbt und dann entfärbt, um neue(s) BASB020 IPTG-induzierbare(s) Protein(e) zu visualisieren. Das zweite Gel wurde auf eine PVDF-Membran (0,45 μm Porengröße, Novex) für ~2 h bei 4°C unter Verwendung einer BioRad Mini-Protean II-Blotting-Vorrichtung und Towbin-Methanol (20 %) Transferpuffer elektrogeblottet. Die Blockierung der Membran und Antikörperinkubationen wurden gemäß allgemein fachbekannten Verfahren durchgeführt. Ein monoklonaler Anti-RGS(His)3-Antikörper, gefolgt von einem zweiten Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper, konjugiert mit HRP (QiaGen), wurde zur Bestätigung der Expression und Identifizierung des rekombinanten BASB020-Proteins verwendet. Visualisierung des Anti-His-Antikörper-reaktiven Musters wurde unter Verwendung entweder eines ABT-unlöslichen Substrats oder unter Verwendung von Hyperfilm mit dem Amersham ECL-Chemilumineszenzsystem erreicht.
D: Sequenzbestätigung
Zur weiteren Verifizierung, daß das IPTG-induzierbare rekombinante BASB020-Protein, das exprimiert wird, im richtigen offenen Leseraster und nicht ein falsches Molekül ist, das aus einem Klonierungsartefakt herrührt (d.h. eine Rasterverschiebung), wurde die DNA-Sequenz des klonierten Inserts bestimmt. Die DNA-Sequenz für das M. catarrhalis-BASB020-Gen wurde aus einem Strang unter Verwendung herkömmlicher asymmetrischer PCR-Umlaufsequenzierungsmethodiken erhalten (ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer). Sequenzierungsreaktionen wurden mit unverdauter Expressionsplasmid-DNA (–0,5 μg/rxn) als Matrize und angemessenen pQE30-Vektor-spezifischen und ORF-spezifischen Sequenzierungsprimern (~3,5 pmol/rxn) programmiert. Zusätzlich zur Matrize und Sequenzierungsprimer enthielt jede Sequenzierungsreaktion (~20 μl) die vier unterschiedlichen dNTPs (d.h. A, G, C und T) und die vier entsprechenden ddNTPs (d.h. ddA, ddG, ddC und ddT) Terminatornukleotide; wobei jeder Terminator an einen der vier Fluoreszenzfarbstoffe Joe, Tam, Rox oder Fam konjugiert war. Einsträngige Sequenzierungsverlängerungsprodukte wurden an zufälligen Positionen entlang der Matrize durch Einbau der Farbstoff-markierten ddNTP-Terminatoren beendet. Fluoreszenzfarbstoff-markierte Terminationsprodukte wurden unter Verwendung von Mikrozentrifugen-Größenausschlußchromatographiesäulen (Princeton Genetics) gereinigt, im Vakuum getrocknet, in einem Template Resuspensions Buffer (Perkin-Elmer) zur Kapillarelektrophorese suspendiert oder für PAGE entionisiert, bei 95°C für ~5 min denaturiert und durch hochauflösende Kapillarelektrophorese (ABI 310 Automated DNA Sequenator, Perkin-Elmer) oder hochauflösendes PAGE (ABI 377 Automated DNA Sequenator) gemäß Herstellerempfehlungen analysiert. Die aus den individuellen Reaktionen erzeugten DNA-Sequenzdaten wurden gesammelt und die relativen Fluoreszenzpeakintensitäten automatisch an einem PowerMAC-Computer unter Verwendung von ABI Sequence Analysis Software (Perkin-Elmer) analysiert. Individuell autoanalysierte DNA-Sequenzen wurden manuell auf Genauigkeit editiert, bevor sie in eine Consensus-Einzelstrangsequenz ("string") unter Verwendung von AutoAssambler-Software (Perkin-Elmer) zusammengefügt wurden. Die Sequenzierung bestimmte, daß das Expressionsplasmid die korrekte Sequenz im korrekten offenen Leseraster enthielt.
Beispiel 4: Erzeugung von rekombinantem BASB020
Bakterieller Stamm
Ein rekombinanter Expressionsstamm von E. coli M15 (pREP4), der ein Plasmid enthielt (pQE30), das BASB020 aus M. catarrhalis codiert, wurde zur Erzeugung von Zellmasse zur Reinigung von rekombinantem Protein verwendet. Der Expressionsstamm wurde an LB-Agarplatten kultiviert, die 50 μg/ml Kanamycin ("Kn") und 100 μg/ml Ampicillin ("Ap") enthielten, um die Aufrechterhaltung sowohl des pREP4 lacIq-Kontrollplasmids als auch des pQE30-BASB020-Expressionskonstrukts sicherzustellen. Zur Gefrierkonservierung bei –80°C wurde der Stamm in LB-Bouillon vermehrt, die die gleiche Konzentra tion von Antibiotika enthielt, und dann mit einem gleichen Volumen von LB-Bouillon vermischt, die 30 % (G/V) Glycerin enthielt.
Medien
Das zur Erzeugung des rekombinaten Proteins verwendete Fermentationsmedium bestand aus 2X YT-Bouillon (Difco), die 50 μg/ml Kn und 100 μg/ml Ap enthielt. Antischaummittel wurde zum Medium für den Fermenter mit 0,25 ml/l hinzugegeben (Antifoam 204, Sigma). Zur Induzierung der Expression des rekombinanten BASB020-Proteins wurde IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) zum Fermenter hinzugegeben (1 mM Endkonzentration).
Fermentation
Ein 500 ml-Erlenmeyer-Impfkolben, der 50 ml Arbeitsvolumen enthielt, wurde mit 0,3 ml der schnell aufgetauten gefrorenen Kultur oder mehreren Kolonien aus einer selektiven Agarplattenkultur geimpft und für ca. 12 Stunden bei 37 ± 1°C auf einem Schütteltisch mit 150 U/min (Innova 2100, New Brunswick Scientific) inkubiert. Diese Impfkultur wurde dann zur Impfung eines Fermenters mit 5 l Arbeitsvolumen verwendet, der 2X YT-Bouillon und sowohl Kn- als auch Ap-Antibiotika enthielt. Der Fermenter (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) wurde bei 37 ± 1°C, 0,2–0,4 WM Lufteinblasung, 250 U/min in Rushton-Flügelrädern betrieben. Der pH wurde weder in der Kolben-Impfkultur noch im Fermenter kontrolliert. Während der Fermentation lag der pH im Bereich von 6,5 bis 7,3 im Fermenter. IPTG (1,0 M Vorrat, hergestellt in sterilem Wasser) wurde zum Fermenter hinzugegeben, als die Kultur die mittlere logarithmische Wachstumsphase erreichte (~0,7 O.D.600-Einheiten). Die Zellen wurden für 2–4 Stunden induziert und dann durch Zentrifugieren unter Verwendung entweder einer 28RS Heraeus- (Sepatech) oder RC5C-Superspeed-Zentrifuge (Sorvall Instruments) geerntet. Zellpaste wurde bei ~20°C bis zur Verarbeitung gelagert.
Reinigung
Chemikalien und Materialien
Imidazol, Guanidinhydrochlorid, Tris (Hydroxymethyl) und EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) von Biotechnologiequalität oder besser wurden alle von Ameresco Chemical, Solon, Ohio erhalten. Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol), einbasiges Natriumphosphat und Harnstoff waren von Analysenqualität oder besser und wurden von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri erhalten. Eisessig und Salzsäure wurden von Mallinckrodt Baker Inc., Phillipsburg, New Jersey erhalten. Methanol wurde von Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey erhalten. Pefabloc^®SC (4-(2- Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid), komplette Proteaseinhibitor-Cocktail-Tabletten und PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) wurden von Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana erhalten. Bestatin, Pepstatin A und E-64-Proteaseinhibitor wurden von Calbiochem, LaJolla, California, erhalten. Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) wurde von Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland erhalten. Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x PBS) wurde von BioWhittaker, Walkersville, Maryland erhalten. Penta-His-Antikörper, BSA-frei, wurde von QiaGen, Valencia, California erhalten. Peroxidasekonjugiertes AffiniPure Ziege-Anti-Maus-IgG wurde von Jackson Immuno Research, West Grove, Penn. erhalten. AEC-Einfachlösung wurde von Zymed, South San Francisco, California erhalten. Alle andere Chemikalien waren von Analysenqualität oder besser.
Ni-NTA-Superflow-Harz wurde von QiaGen Inc., Valencia, California erhalten. Vorgegossene Tris-Glycin 4–20 % und 10–20 % Polyacrylamidgele, alle Laufpuffer und Lösungen, SeeBlue vorangefärbte Standards, MultiMark mehrfarbige Standards und PVDF-Transfermembranen wurden von Novex, San Diego, California erhalten. SDS-PAGE Silver Stain-Kits wurden von Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japan erhalten. Coomassie-Anfärbungslösung wurde von Bio-Rad Laboratories, Hercules, California erhalten. Acrodisc^® PF 0,2 μm-Spritzenfilter wurden von Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan erhalten. GD/X 25 mm-Einwegspritzenfilter wurden von Whatman Inc., Clifton, New Jersey erhalten. Dialyseschläuche 8000 MWCO wurden von BioDesign Inc. Od New York, Carmal New York erhalten. BCA-Proteintestreagenzien und Snake Skin-Dialyseschläuche 3500 MWCO wurde von Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois erhalten.
Extraktionsprotokoll
Zellpaste wurde bei Raumtemperatur für 30–60 Minuten aufgetaut. 5 bis 6 g des Materials wurden in einen 50 ml-Einwegzentrifugenschlauch eingewogen. Dazu wurden 5 ml/g von Guanidinhydrochlorid-(Gu-HCl)-Puffer gegeben (6 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05 % Triton X-100, pH 8,0). Zellpaste wurde unter Verwendung eines PR0300D-Proscientific-Homogenisators mit 3/4 der Leistung der für eine Minute resuspendiert. Die Extraktionsmischung wurde dann unter vorsichtigem Rühren für 60 bis 90 Minuten auf Raumtemperatur gebracht. Nach 60 bis 90 Minuten wurde die Extraktionsmischung mit 15 800 × g für 15 Minuten zentrifugiert (Sorvall RCSC-Zentrifuge, 11 500 U/min). Der Überstand (S1) wurde abdekantiert und für eine zusätzliche Reinigung aufbewahrt. Das Pellet (P1) wurde zur Analyse aufbewahrt.
Bindung von BASB020 an Nickel-NTA-Harz
Zu dem S1 werden 3 bis 4 ml Ni-NTA-Harz gegeben. Dies wird dann unter vorsichtigem Rühren für eine Stunde auf Raumtemperatur gebracht. Nach einer Stunde wird das S1/Ni-NTA in eine XK16-Pharmacia-Säule gepackt. Die Säule wird dann mit 1 M Gu-HCl-Puffer gewaschen (1 M Guanidinhydrochlorid, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05 % Triton X-100, pH 8,0). Diesem schließt sich eine Spülung mit Phosphatpuffer an (100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05 % Triton X-100, pH 6,3). Das Protein wird dann aus der Säule mit 250 mM Imidazolpuffer eluiert (250 mM Imidazol, 100 mM einbasiges Natriumphosphat, 10 mM Tris und 0,05 % Triton X-100, pH 5,9).
Endformulierung
BASB020 wurde durch Dialyse über Nacht gegen drei Wechsel von 0,1 % Triton X-100 und 1x PBS, pH 7,4 formuliert, um verbleibendes Gu-HCl und Imidazol zu entfernen. Das gereinigte Protein wurde charakterisiert und zur Erzeugung von Antikörpern wie nachfolgend beschrieben verwendet.
Biochemische Charakterisierungen
SDS-PAGE und Western Blot-Analyse
Das rekombinante gereinigte Protein wurde an 4–20 % Polyacrylamidgelen aufgetrennt und elektrophoretisch auf PVDF-Membranen mit 100 V für 1 Stunde wie zuvor beschrieben übertragen (Thebaine et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350–4354). Die PVDF-Membranen wurden dann mit 25 ml von Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 5 % Trockenmagermilch enthielt, vorbehandelt. Alle anschließenden Inkubationen wurden unter Verwendung dieses Vorbehandlungspuffers durchgeführt.
PVDF-Membranen wurden mit 25 ml einer 1:500-Verdünnung von Vorimmunserum oder Kaninchen-Anti-His-Immunserum für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. PVDF-Membranen wurden dann zweimal mit Waschpuffer gewaschen (20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 150 mM Natriumchlorid und 0,05 % Tweert-20 enthielt). PVDF-Membranen wurden mit 25 ml einer 1:5000-Verdünnung von Peroxidase-markiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. PVDF-Membranen wurden dann 4-mal mit Waschpuffer gewaschen und mit 3-Amino-9-ethylcarbazol und Harnstoffperoxid wie von Zymed (San Francisco, CA) geliefert für jeweils 10 Minuten entwickelt.
Die Ergebnisse eines SDS-PAGE (4) zeigen ein Protein von ca. 32–35 kDa, gereinigt auf mehr als 90 %, das reaktiv gegenüber einem Anti-RGS(His)-Antikörper durch Western Blots (5) des SDS-PAGE ist.
Proteinsequenzierung
Eine Amino-terminale Aminosäuresequenzierung des gereinigten Proteins wurde zur Bestätigung der Erzeugung des korrekten rekombinanten Proteins unter Verwendung wohldefinierter chemischer Protokolle an einem Hewlett-Packard Modell G1000A Sequenzer mit einem Modell 1090 LC und einem Hewlett-Packard Modell 241 Sequenzer mit einem Modell 1100 LC durchgeführt.
Beispiel 5: Erzeugung von Antiseren gegen rekombinantes BASB020
Polyvalente, gegen das BASB020-Protein gerichtete Antiseren wurden durch Impfung von zwei Kaninchen mit dem gereinigten rekombinanten BASB020-Protein erzeugt. Jedem Tier werden insgesamt drei Immunisierungen intramuskulär (i.m.) von ca. 20 μg BASB020-Protein durch Injektion (beginnend mit komplettem Freund-Adjuvans und gefolgt von unvollständigem Freund-Adjuvans) in etwa 21-tägigen Intervallen gegeben. Den Tieren wurde Blut vor der ersten Immunisierung ("Vorblutung") und an den Tagen 35 und 57 entnommen.
Anti-BASB020-Proteintiter wurden durch ELISA unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem BASB020-Protein (0,5 μg/Vertiefung) gemessen. Der Titer wird als die die höchste Verdünnung gleich oder größer als 0,1 definiert, gemäß Berechnung mit der folgenden Gleichung: Durchschnitts-OD von zwei Testproben der Antiseren – Durchschnitts-OD von zwei Testproben von Puffer. Die Titer nach drei Immunisierungen waren zwischen 3000 und 8000.
Die Antiseren wurden als erster Antikörper zur Identifizierung des Proteins in einem Western Blot wie in Beispiel 4 oben beschrieben verwendet. Der Western Blot zeigte die Gegenwart von Anti-BASB020-Antikörper in den Seren von immunisierten Tieren.
Beispiel 6: Immunologische Charakterisierung
Western Blot-Analyse
Mehrere Stämme von M. catarrhalis, einschließlich ATCC 49143 und ATCC 43617, sowie klinische Isolate aus verschiedenen geographischen Regionen wurden auf Schokoladenagarplatten für 48 Stunden bei 35°C in 5 % CO₂ gezüchtet. Mehrere Kolonien wurden zur Impfung von 25 ml Muller-Hinton-Bouillon in einem 250 ml-Kolben verwendet. Die Kulturen wurden über Nacht gezüchtet und durch Zentrifugieren aufgefangen. Die Zellen wurden dann durch Suspendieren von 30 μg Zellen in 150 μl PAGE-Probenpuffer (360 mM Tris-Puffer, pH 8,8, der 4 % Natriumdodecylsulfat und 20 % Glycerin enthält) und Inkubieren der Suspension bei 100°C für 5 Minuten solubilisiert. Die solubilisierten Zellen wurden an 4–20 % Polyacrylamidgelen getrennt, und die getrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf PVDF-Membranen bei 100 V für 1 Stunde wie zuvor beschrieben übertragen (Thebaine et al. 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350–4354). Die PVDF-Membranen wurden dann mit 25 ml von Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 5 % Trockenmagermilch enthielt, vorbehandelt. Alle anschließenden Inkubationen wurden unter Verwendung dieses Vorbehandlungspuffers durchgeführt.
PVDF-Membranen wurden mit 25 ml einer 1:500-Verdünnung von Vorimmunserum oder Kaninchen-Immunserum für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. PVDF-Membranen wurden dann zweimal mit Waschpuffer (20 mM Tris-Puffer, pH 7,5, der 150 mM Natriumchlorid und 0,05 % Tween-20 enthält) gewaschen. PVDF-Membranen wurden mit 25 ml einer 1:5000-Verdünnung von Peroxidasemarkiertem Ziege-Anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA) für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. PVDF-Membranen wurden dann 4-mal mit Waschpuffer gewaschen und mit 3-Amino-9-ethylcarbazol und Harnstoffperoxid wie von Zymed (San Francisco, CA) geliefert für jeweils 10 Minuten entwickelt.
Ein Protein mit ca. 32–35 kDa (entsprechend dem für BASB020 erwarteten Molekulargewicht), das reaktiv gegenüber den Antiseren ist, wird in allen Moraxella-Stämmen detektiert.
Beispiel 7: Gegenwart von Antikörper gegen BASB020 in humanen konvaleszenten Seren
Western-Blot-Analysen von gereinigtem rekombinantem BASB020 wurden wie in den obigen Beispielen 4 und 6 beschrieben durchgeführt, außer daß eine Ansammlung von Humanseren aus mit M. catarrhalis infizierten Kindern als erste Antikörperzubereitung verwendet wird. Die Ergebnisse zeigen, daß Antiseren aus natürlich infizierten Individuen auf das gereinigte rekombinante Protein reagieren, wie in 6 gezeigt.
Beispiel 8: Wirksamkeit von BASB020-Impfstoff: Steigerung der Lungen-Clearance von M. catarrhalis in Mäusen
Die Schutzkapazität von gereinigtem rekombinantem BASB020-Protein wurde in einem Mäusemodell untersucht. Dieses Mäusemodell beruht auf der Analyse des Lungenbefalls durch M. catarrhalis nach einer standardmäßigen intranasalen Exposition von geimpften Mäusen.
Gruppen von 6 BALB/c-Mäusen (weiblich, 6 Wochen alt) werden subkutan mit 100 μl Impfstoff immunisiert, was einer 10 μg-Dosis entspricht, und 2 Wochen später aufgefrischt. Eine Woche nach der Auffrischung werden die Mäuse durch Einträufeln von 50 μl bakterieller Suspension (± 10⁶ KBE/50 μl) in das linke Nasenloch unter Anästhesie exponiert (die Mäuse werden mit einer Kombination aus Ketamin- und Xylazin-Anästhetika anästhesiert, 0,24 mg Xylazin (Rompun) und 0,8 mg Ketamin (Imalgene)/100 μl). Die Mäuse werden 4 Stunden nach der Exposition getötet, und die Lungen werden aseptisch entfernt und individuell homogenisiert. Die log 10-gewichtete mittlere Anzahl von KBE/Lunge wird durch Zählen der Kolonien bestimmt, die auf Mueller-Hinton-Agarplatten nach Plattieren von 20 μl von 5 Reihenverdünnungen des Homogenats wachsen. Der arithmetische Mittelwert der log10-gewichteten mittleren Anzahl von KBE/Lunge und die Standardabweichungen werden für jede Gruppe berechnet.
Die Ergebnisse werden statistisch analysiert, indem ein einseitiger ANOVA-Test nach Annahme der Gleichheit von Varianz (überprüft durch den Test von Brown und Forsythe) und Normalität (überprüft unter Verwendung des Shapiro-Wilk-Tests) angewendet wird. Unterschiede zwischen den Gruppen werden unter Verwendung von Dunnet-Test, Tukey-Test mit studentisiertem Bereich (HSD) und Student-Newman-Keuls-Test analysiert.
In diesem Experiment wurden Gruppen von Mäusen entweder mit an AlPO₄ adsorbiertem BASB020 immunisiert (10 μg BASB020 auf 100 μg AlPO₄) oder mit einer Zubereitung aus abgetöteten Vollzellen (kwc) des M. catarrhalis-Stammes ATCC 43617, adsorbiert an AlPO₄ (5 × 10⁸ Zellen auf 100 μg AlPO₄) oder mit 100 μg AlPO₄ ohne Antigen. Die Mäuse wurden mit 10⁶ KBE von lebenden Bakterien des M. catarrhalis-Stammes ATCC 43617 in Kontakt gebracht.
Die log 10-gewichtete mittlere Anzahl von KBE/Lunge und die Standardabweichung 4 Stunden nach der Exposition wurden für jede Gruppe berechnet. Zum Schein immunisierte Mäuse besaßen 5,5 (+/- 0,23) log 10 KBE/Lunge 4 Stunden nach der Exposition.
Die kwc-Zubereitung induzierte eine signifikante Lugen-Clearance im Vergleich zur Kontrollgruppe (1,74 log Unterschied). Der BASB020-Impfstoff induzierte einen 0,62 log Unterschied in der Lungen-Clearance im Vergleich zur Kontrollgruppe, was sich signifikant von der Kontrolle unterschied.
Ein Western-Blot unter Verwendung von gereinigtem rekombinantem BASB020-Protein und gesammelte Seren aus Mäusen, die mit BASB020-Protein immunisiert wurden, aufgefangen vor der Exposition, zeigen die Gegenwart von Antikörper gegen BASB020-Protein (7).
Beispiel 9: Erzeugung von BASB020-Peptiden, Antiseren und deren Reaktivität
Zwei kurze BASB020-spezifische Peptide mit den Sequenzen CNEEAWSQNRRAELSY (SEQ ID NO:13) und YTGVAPLVDNDETV (SEQ ID NO:14) wurden im Labor unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren hergestellt. Diese Peptide, gekuppelt an KLH, wurden zur Erzeugung von Antikörpern in 12 Wochen alten weiblichen Kaninchen "Specific Pathogen Free New-Zealand" verwendet. Die Kaninchen erhielten 4 Injektionen in ca. 3-wöchigen Intervallen von 200 μg Peptid-KLH in komplettem (1. Injektion) oder unvollständigem (2., 3. und 4. Injektion) Freund-Adjuvans. Den Tieren wurde Blut vor der ersten Immunisierung und einen Monat nach der 4. Injektion abgenommen.
Anti-Peptid-Mittelpunkttiter wurden durch ELISA unter Verwendung von freien Peptiden gemessen. Die Anti-Peptid-Mittelpunkttiter einen Monat nach der 4. Immunisierung waren oberhalb 41 000. Western Blots des gereinigten rekombinanten BASB020 unter Verwendung von Anti-Peptid-Antikörpern als erster Antikörper wurden wie in den Beispielen 4 und 6 beschrieben hergestellt. Die Ergebnisse sind in 8 dargestellt.
Hinterlegte Materialien
Eine Hinterlegung, die einen Moraxella catarrhalis Catlin-Stamm enthält, wurde bei der American Type Culture Collection (nachfolgend "ATCC") am 21. Juni 1997 hinterlegt und der Hinterlegungsnummer 43617 zugewiesen. Die Hinterlegung wurde als Branhamella catarrhalis (Frosch und Kolle) beschrieben und ist eine gefriergetrocknete 1,5–2,9 kb Insert-Bibliothek, konstruiert aus M. catarrhalis-Isolat, erhalten aus einem transtrachealen Aspirat eines Kohlengrubenarbeiters mit chronischer Bronchitis. Die Hinterlegung wird in Antimicrob. Agents Chemother. 21:506-508 (1982) beschrieben.
Die Hinterlegung des Moraxella catarrhalis-Stammes wird hier als "der hinterlegte Stamm" oder als "die DNA des hinterlegten Stammes" bezeichnet. Der hinterlegte Stamm enthält ein BASB020-Gen voller Länge.
Eine Hinterlegung des Vektors pMC-Hly3, der aus Moraxella catarrhalis-DNA besteht, inseriert in pQE30, wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 12. Februar 1999 hinterlegt und der Hinterlegungsnummer 207106 zugewiesen.
Die Sequenz der in diesem hinterlegten Stamm/Klon enthaltenen Polynukleotide sowie die Aminosäuresequenz von jedem dadurch codierten Polypeptid bestimmen in jedem Fall jeden Konflikt mit jeder vorliegenden Beschreibung von Sequenzen.
Die Hinterlegung der hinterlegten Stämme wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung über die Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren vorgenommen. Die hinterlegten Stämme werden unwiderruflich und ohne Beschränkung oder Bedingung für die Öffentlichkeit bei Patenterteilung freigegeben. Die hinterlegten Stämme werden bloß als Erleichterung für die Fachleute bereitgestellt und sind kein Zugeständnis, daß eine Hinterlegung für die Ausführbarkeit erforderlich ist, wie dies gemäß 35 U.S.C. §112 erforderlich ist.
SEQUENZPROTOKOLL
Sequenzangaben BASB020-Polynukleotid- und -Polypeptidsequenzen SEQ ID NO:1 Moraxella catarrhalis BASB020-Polynukleotidsequenz aus Stamm MC2931
SEQ ID NO:2 Moraxella catarrhalis BASB020-Polypeptidsequenz aus Stamm MC2931
SEQ ID NO:3 Moraxella catarrhalis BASB020-Polynukleotidsequenz aus Stamm Mcat 2912
SEQ ID NO:4 Moraxella catarrhalis BASB020-Polypeptidsequenz aus Stamm Mcat 2912
SEQ ID NO:5 Moraxella catarrhalis BASB020-Polynukleotidsequenz aus Stamm Mcat 2913 Moraxella catarrhalis BASB020 polynucleotide sequence from strain Mcat 2913
SEQ ID NO:6 Moraxella catarrhalis BASB020-Polypeptidsequenz aus Stamm Mcat 2913
SEQ ID NO:7 Moraxella catarrhalis BASB020-Polynukleotidsequenz aus Stamm Mcat 2969
SEQ ID NO:8 Moraxella catarrhalis BASB020-Polypeptidsequenz aus Stamm Mcat 2969
SEQ ID NO:9

ACT TGA ATA AAA CCG AGT G

SEQ ID NO:10

GAC ATT GGC CGC AAC ATG C

SEQ ID NO:11

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT AGG CGT TGG TTA TCC ACC G

SEQ ID NO:12

AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG

SEQ ID NO:13

CNEEAWSQNRRAELSY

SEQ ID NO:14

YTGVAPLVDNDETV

Claims

Isoliertes Polypeptid, das nützlich in einer Impfung gegen Moraxella catarrhalis-Infektion ist, umfassend eine Aminosäuresequenz, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:6 hat.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, worin die Aminosäuresequenz wenigstens 95 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO: 4 und SEQ ID NO: 6 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:6 hat.
Isoliertes Polypeptid gemäß Anspruch 1, umfassend die Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht.
Isoliertes Polypeptid, das nützlich in einem Impfstoff gegen Moraxella catarrhalis-Infektion ist, bestehend aus der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht.
Isoliertes immunogenes Fragment des Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, worin das immunogene Fragment eine Immunreaktion hervorrufen kann, falls notwendig bei Kopplung an einen Träger, die das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 erkennt.
Polypeptid oder immunogenes Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, worin das Polypeptid oder das immunogene Fragment Teil eines größeren Fusionsproteins ist.
Isoliertes Polynukleotid, das ein Polypeptid oder ein immunogenes Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die ein Polypeptid codiert, das nützlich in einem Impfstoff gegen Moraxella catarrhalis-Infektion ist und das wenigstens 85 $ Identität mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:6 hat, oder eine zum isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit einer Nukleotidsequenz, die ein Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 codiert, das nützlich in einem Impfstoff gegen Moraxella catarrhalis-Infektion ist, über die gesamte codierende Region hat; oder eine zum isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die wenigstens 85 % Identität mit derjenigen von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 über die gesamte Länge von SEQ ID NO:3 bzw. SEQ ID NO:5 hat; oder eine zum isolierten Polynukleotid komplementäre Nukleotidsequenz.
Isoliertes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 10, worin die Identität wenigstens 95 % mit SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 ist.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 oder das immunogene Fragment von Anspruch 5 oder 6 codiert.
Isoliertes Polynukleotid, das das Polynukleotid von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 umfaßt.
Isoliertes Polynukleotid, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, die das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 codiert, das nützlich in einem Impfstoff gegen Moraxella catarrhalis-Infektion ist, erhältlich durch Durchmusterung einer geeigneten Bibliothek unter stringenten Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten Sonde mit der Sequenz von SEQ ID NO:3 oder SEQ ID NO:5 oder einem Fragment davon.
Expressionsvektor, der ein isoliertes Polynukleotid gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 umfaßt.
Expressionsvektor gemäß Anspruch 15 in Form eines rekombinanten lebenden Mikroorganismus.
Wirtszelle, die den Expressionsvektor von Anspruch 15 umfaßt, oder eine Membran der Wirtszelle, die das exprimierte Polypeptid enthält.
Verfahren zur Erzeugung eines Polypeptids oder eines immunogenen Fragments gemäß Ansprüchen 1 bis 6, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 17 unter Bedingungen, die ausreichend zur Erzeugung des Polypeptids oder des immunogenen Fragments sind, und Gewinnen des Polypeptids oder des immunogenen Fragments aus dem Kulturmedium.
Verfahren zur Expression eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14, umfassend das Transformieren einer Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der wenigstens eines der Polynukleotide umfaßt, und Kultivieren des Wirtszelle unter Bedingungen, die ausreichend zur Expression eines der Polynukleotide sind.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge des Polypeptids oder des immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung, die eine wirksame Menge des Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
Impfstoffzusammensetzung gemäß Anspruch 20 oder 21, worin die Zusammensetzung wenigstens ein anderes Moraxella catarrhalis-Antigen umfaßt.
Antikörper, der immunspezifisch für ein Polypeptid, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die wenigstens 85 % Identität mit der Aminosäuresequenz, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 besteht, über die gesamte Länge von SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:6 hat, oder für ein immunogenes Fragment davon ist, worin das immunogene Fragment eine Immunreaktion hervorrufen kann, falls notwendig bei Kopplung an einen Träger, die das Polypeptid von SEQ ID NO:4 oder SEQ ID NO:6 erkennt.
Antikörper gemäß Anspruch 23, worin das Polypeptid oder das immunogene Fragment Teil eines größeren Fusionsproteins ist.
Verfahren zum Diagnostizieren einer Moraxella catarrhalis-Infektion, umfassend das Identifizieren eines Polypeptids oder eines immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines Antikörpers, der immunspezifisch für das Polypeptid ist, vorhanden innerhalb einer biologischen Probe aus einem Tier, das einer solchen Infektion verdächtig ist.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polypeptids oder eines immunogenen Fragments gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 umfaßt, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine immunologisch wirksame Menge eines Polynukleotids gemäß einem der Ansprüche 7 bis 14 umfaßt, in der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung in der Erzeugung einer Immunreaktion in einem Tier.
Therapeutische Zusammensetzung, die nützlich in der Behandlung von Menschen mit Moraxella catarrhalis-Krankheit ist, umfassend wenigstens einen Antikörper gemäß Anspruch 23 oder 24 und einen geeigneten pharmazeutischen Träger.