NO330169B1

NO330169B1 - Isolert polypeptid, immunogent fragment, fusjonsprotein fra Moraxella catarrhalis, fremgangsmate for fremstilling, ekspresjonsvektor, ekspresjonssystem, rekombinant organsime, vertscelle, vaksinesammensetning, antistoff mot polypeptidet og anvendelse av polypeptidet

Info

Publication number: NO330169B1
Application number: NO20005697A
Authority: NO
Inventors: Joelle Thonnard
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 1998-05-13
Filing date: 2000-11-10
Publication date: 2011-02-28
Also published as: EP1078064B1; NO20005697D0; DE69927017T2; AU4142199A; NO20005697L; CN1210401C; NZ508322A; WO1999058684A2; TR200003345T2; HUP0102853A3; US7122197B1; PL344792A1; CN100484956C; DE69927017D1; ATE303442T1; BR9911773A; KR100610448B1; AU737196B2; WO1999058684A3; KR20010043573A

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører polynukleotider, (heri betegnet som "BASB020 polynukleoitd(er)"), polypeptider som kodes for av disse (heri betegnet som "BASB020" eller "BASB020 polypeptid(er)"), rekombinante materialer og fremgangsmåter for deres produksjon. I et annet aspekt, vedrører oppfinnelsen fremgangsmåter til anvendelse av slike polypeptider og polynukleotider, inklusive vaksiner mot bakterieinfeksjoner. I et ytterligere aspekt, vedrører oppfinnelsen diagnostiske assays for påvisning av infeksjon fra visse patogener.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Moraxella catarrhalis (også kalt Branhamella catarrhalis) er en Gram-negativ bakterie som hyppig isoleres fra den humane øvre luftvei. Den er ansvarlig for flere sykdommer hvorav de viktigste er otitis media hos spedbarn og barn, og lungebetennelse hos eldre. Den er også ansvarlig for sinusitt, nosocomiale infeksjoner og mindre hyppig for invasive sykdommer.

Otitis media er en viktig barnesykdom både i og med antallet tilfeller og dens potensielle følgetilstander. Mer enn 3.5 millioner tilfeller registreres hvert år i de forente stater, og det anslås at 80% av barna har gjennomgått i det minste en episode med otitis før de når 3-års alderen. (Klein. JO (1994) Clin.Inf.Dis 19:823). Hvis den får bli ubehandlet, eller blir kronisk, kan denne sykdom føre til hørselstap som kan være midlertidige (i tilfellet med væskeansamling i mellomøret) eller permanent (dersom hørselsnerven er skadet). Hos spedbarn, kan slike hørselstap være ansvarlige for en forsinket taleinnlæ-ring.

Tre bakteriearter blir primært isolert fra mellomøret hos barn med otitis media: Streptococcus pneumoniae, ikke artsbestemt Haemophilus influenzae (NTHi) og M. Catarrhalis. De foreligger i 60 til 90% av tilfellene. Et gjennomsyn av nylige studier viser at S. Pneumoniae og NTHi begge representerer cirka 30%, og M. Catarrhalis cirka 15% av tilfellene med otitis media (Murphy, TF (1996) MicrobioLRev. 60:267). Andre bakterier kunne eventuelt isoleres fra mellomøret ( H. Influenzae type B, S. pyogenes etc) men ved en meget lavere frekvens (2% av tilfellene eller mindre).

For de patogener som finnes i mellomøret, indikerer epidemiologiske data at kolonise-ringen av de øvre luftveier er en absolutt betingelse for utviklingen av otitis; andre er imidlertid også påkrevet for å føre til sykdommen (Dickinson, DP et al. (1988) J.Infect.Dis. 158:205, Faden, HL. et al. (1991) Ann.Otorhinol.Laryngol. 100:612). Disse er viktige for å utløse migreringen av bakteriene inn i mellomøret via øretrompetene, fulgt av initieringen av en infiammatorisk prosess. Disse faktorer er i dag ukjente. Det har vært postulert at en forbigående anomalitet ved immunsystemet som følger etter eksempelvis en virusinfeksjon, kunne bevirke en manglende evne til å styre kolonise-ringen av luftveien (Faden, HL et al. (1994) J.Infect.Dis. 169:1312). En alternativ for-klaring er at eksponeringen ovenfor miljømessige faktorer tillater en mer betydelig ko-lonisering av noen barn, som deretter blir sårbare ovenfor utviklingen av otitis media på grunn av den vedholdende tilstedeværelse av mellomøre-patogener (Murphy, TF (1996) MicrobioLRev. 60:267).

Immun responsen ovenfor M. catarrhalis er dårlig beskrevet. Analysen av stammer som er sekvensielt isolert fra nasofarynx hos babyer som følges fra alderen 0 til 2 år, viser at de ofte får og eliminerer nye stammer. Dette indikerer at en effektiv immun respons reises ovenfor denne bakterie av koloniserte barn (Faden, HL et al. (1994) J.Infect.Dis. 169:1312).

Hos de fleste voksne som er testet, har det blitt identifisert baktericide antistoffer (Chapman, AJ et al. (1985) J.Infect.Dis. 151:878). Stammer avM catarrhalis fremviser variasjoner i sin kapasitet til å motstå baktericid serumsaktivitet: generelt er isolatet fra sykdomsrammede individer mer resistente enn de som ganske enkelt er kolonisert (Hol, C et al. (1993) Lancet 341:1281, Jordan KL et al. (1990) AmJ.Med. 88 (suppl. 5A):28S). Serum resistens kunne derfor betraktes som en virulens faktor for bakterien. En opsoniserende aktivitet har vært observert i sera for barn som har frisknet til fra otitis media.

De antigener som er siktet inn ved hjelp av disse ulike immunresponser hos mennesker har ikke vært identifisert, med unntak av OMP Bl, et 84 kDa protein viss ekspresjon styres av jern, og som gjenkjennes av sera hos pasienter med lungebetennelse (Sethi, S et al. (1995) mfect.Immun. 63:1516), og for UspAl og UspA2 (Chen D. et al. (1999) Infect.Immun. 67:1310).

Noen få andre membran proteiner som foreligger på overflaten av M. catarrhalis har vært beskrevet ved anvendelse av biokjemisk metode, eller ut fra deres potensielle inn-blanding i induksjonen av en beskyttende immunitet (for gjennomsyn, se Murphy, TF

(1996) MicrobioLRev. 60:267). I en muse-lungebetennelses modell, favoriserer tilstedeværelsen av antistoffer som heves mot noen av dem (UspA, CopB) en fastere klare-ring av den pulmonære infeksjon. Et annet polypeptid (OMP CD) blir i høy grad bevart blant M. catarrhalis stammer, og fremviser homologier med et porin fra Pseudomonas aeruginosa, hvilket har fremvist effektivitet ovenfor denne bakterie i dyremodeller.

Wo 9509025 Al og Murphy et al.;"Surface-exposed and antigenically conserved deter-minants of outer membrane proteins of Branhamella catarrhalis", Infection an hnmu-nity ,1989, vol 57, nr 10, side 2938-2941 diskuterer begge overflateantigener og ytter-membranproteiner fra Branhamella catarrhalis og bskriver noen kjente, karakteriserte proteiner. Imidlertid beskriver ingen av disse et polypeptid som BASB020.

Hyppigheten av infeksjoner med Moraxella catarrhalis har økt dramatisk i de siste få tiår. Dette har vært forklart med opptredenen av stammer med multippel antibiotisk resistens og en økende populasjon av folk med svekkede immunsystemer. Det er ikke lenger uvanlig å isolere Moraxella catarrhalis stammer som er resistente ovenfor noen av eller alle de vanlige antibiotika. Dette fenomen har skapt et utilfredsstilt medisinsk behov og etterspørsel etter nye antimikrobielle agenser, vaksiner, fremgangsmåter for å lete etter virkestoffer og diagnostiske tester med hensyn til denne organisme.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører BASB020, nærmere bestemt BASB020 polypeptider og BASB020 polynukleotider, rekombinante materialer og fremgangsmåter for deres produksjon. I et annet aspekt, vedrører oppfinnelsen blant annet fremgangsmåter til anvendelse av slike polypeptider og polynukleotider, inklusive forebyggelse og behandling av mikrobielle sykdommer. I et ytterligere aspekt, vedrører oppfinnelsen diagnostiske assays for påvisning av sykdommer som har sammenheng med mikrobielle infeksjoner og tilstander som henger sammen med slike infeksjoner, i likhet med assays for å påvise ekspresjon eller aktivitet av BASB020 polynukleotider eller polypeptider.

Ulike endringer og modifikasjoner innen ideen og rekkevidden av den beskrevne oppfinnelse vil hurtig komme til syne for fagfolk ut fra lesing av de følgende beskrivelser og ut fra lesning av andre deler av den foreliggende beskrivelse.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører BASB020 polypeptider og polynukleotider som beskrevet mer detaljert i det følgende. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen polypeptider og polynukleotider tilhørende BASB020 fra Moraxella catarrhalis, hvilke når det gjelder aminosyre-sekvens homologi er beslektet med TlyC hemolysin-protein fra Serpulina hyodysenteriae. Oppfinnelsen vedrører spesielt BASB020 med de nukleotid- og aminosyre sekvenser som er fremlagt i henholdsvis SEQ ID NO: 3,4, 5 eller 6. Dette skal oppfattes dithen at sekvenser som er gjengitt i sekvensopplistingen i det følgende som "DNA" representerer en eksemlifisering av en utførelsesform av oppfinnelsen, siden fagfolk vil erkjenne at slike sekvenser med nytte kan benyttes i polynukleotider generelt, inklusive ribonukleotider.

Foreliggende oppfinnelse omfatter Isolert polypeptid som kan benyttes i en vaksine mot Moraxella catarrhalis- mfeksjon, kjennetegnet ved at det omfatter en aminosyresekvens som har i det minste 85% identitet til den aminosyresekvens som er utvalgt fra den gruppe som består av: SEQ ID NO:4 og SEQ ID NO:6 over den samlede lengde av henholdsvis SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6, respektivt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også immunogent fragment av polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 4, hvori det immunogene fragment, om nødvendig når det er koblet til en bærer, er i stand til å vekke en immunrespons som gjenkjenner polypeptidet i følge SEQ ID NO:4 og SEQ ID NO:6.

Også fusjonsprotein, er omfattet av oppfinnelsen, kjennetegnet ved at det omfatter et polypeptid eller et immunogent fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6.

Videre omfattes ekspresjonsvektor, som tilveiebringer et isolert rekombinant polynukleotid i følge et av kravene 8 til 11.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også rekombinant levende mikroorganisme, kjennetegnet ved at den omfatter en ekspresjonsvektor ifølge krav 12, og rekombinant ekspresjonssystem, som tilveiebringer et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 11.

Videre omfattes den foreliggende oppfinnelse vertscelle, som omfatter ekspre-sjonsvektoren i følge krav 12 som uttrykker et isolert polypeptid, immunogent fragment eller fusjonsprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller en membran fra vertscellen, der nevnte membran omfatter det uttrykte polypeptid, immunogene fragment eller fusjonsprotein.

Også en fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid, immunogent fragment eller fusjonsprotein i følge krav 1 til 7 er omfattet av oppfinnelsen, denne er kjenntegnet ved at den omfatter dyrking av en vertscelle ifølge krav 15 under betingelser som er tilstrek kelige for produksjon av nevnte polypeptid, immunogene fragment eller fusjonsprotein, og gjenvinning av polypeptidet, det immunogene fragmentet eller fusjonsproteinet fira kulturmediet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også fremgangsmåte for å uttrykke minst ett polynukleotid i følge et hvilket som helst av kravene 8 til 11, kjennetegnet ved at den omfatter transformasjon av vertscellen med en ekspresjonsvektor omfattende nevnte polynukleotid og dyrking av vertscellen under betingelser tilstrekkelige for ekspresjon av nevnte polynukleotid.

Videre er en vaksmesammensetning omfattet av oppfinnelsen, denne er kjennetegnet ved at den omfatter en effektiv mengde av polypeptidet, det immunogene fragmentet eller fusjonsproteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Antistoff generert mot polypeptidet, det immunogene fragment eller fusjonsprotein iføl-ge ethvert av kravene 1 til 7, er en del av den foreliggende oppfinnelse, kjenntegnet ved at nevnte polypeptid, immunogene fragment eller fusjonsprotein eventuelt er koblet til en bærer, og der antistoffet er immunspesifikt for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 4 eller SEQ ID NO: 6.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for å diagnostisere en Moraxella catarrhalis infeksjon, kjennetegnet ved at den omfatter identifisering av et polypeptid eller immunogent fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, eller et antistoff ifølge krav 20 foreligger i en biologisk prøve fra et dyr som mistenkes å ha en slik infeksjon.

Til slutt omfatter foreliggende oppfinnelse anvendelse av en sammensetning som omfatter en immunologisk effektiv mengde av et polypeptid, immunogent fragment eller fusjonsprotein ifølge et av kravene 1 til 7, for fremstilling av et medikament til anvendelse ved generering av en immunrespons hos et dyr.

Polypeptider

I et aspekt av oppfinnelsen er det frembragt polypeptider av Moraxella catarrhalis hvilke heri er betegnet som "BASB020" og "BASB020 polypeptider" så vel som biologisk, diagnostisk, profylaktisk, klinisk eller terapeutisk nyttige varianter derav, og preparater som omfatter det samme.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer videre:

(a) et isolert polypeptid som omfatter en aminosyre sekvens som i det minste har 85% identitet, eller minst 90% identitet, enda heller minst 95% identitet, allerhelst minst 97-99% eller eksakt identitet med tilsvarende for SEQ ID NO:2,4,6 eller 8; (b) et polypeptid som kodes for av et isolert polynukleotid som omfatter en polynukleotid sekvens som har minst 85% identitet, fortrinnsvis minst 90% identitet, heller minst 95% identitet, enda heller minst 97-99% eller eksakt identitet med SEQ ID NO:3 eller Sover den samlede lengde av henholdsvis SEQ ID NO:3 eller 5 ;

eller

(c) et polypeptid som kodes for av et isolert polynukleotid som omfatter en polynukleotid sekvens som koder for et polypeptid som har minst 85% identitet, fortrinnsvis minst 90% identitet, heller minst 95% identitet, enda heller minst 97-99% eller eksakt identitet med aminosyre sekvensen for SEQ ID NO:4 eller 6.

De BASB020 polypeptider som er frembragt i SEQ ID NO:4 eller 6 er BASB020 polypeptidene fra Moraxella catarrhalis- stømmene MC2931 (ATCC 43617), MC2912, MC2913 ogMC2969.

Oppfinnelsen frembringer også et immunogent fragment av et BASB020 polypeptid, det vil si et sammenhengende parti av polypeptidet BASB020 som har den samme eller i det vesentlige den samme immunogene aktivitet som det polypeptid som omfatter aminosyre sekvensen fra SEQ ID NO:4 eller 6; det vil si fragmentet (om nødvendig når det er koblet til en bærer) er i stand til å vekke en immun respons som gjenkjenner polypeptidet BASB020. Et slikt immunogent fragment kan eksempelvis inkludere det BASB020 polypeptid som mangler en N-terminal ledersekvens, og/eller et transmembran domene og/eller et C-terminalt anker domene. Et immunogent fragment fra BASB020 omfatter hovedsakelig hele det ekstracellulære domene fra et polypeptid som kan ha i det minst 85% identitet, fortrinnsvis minst 90% identitet, heller minst 95% identitet, allerhelst minst 97-99% identitet, med tilsvarende for SEQ ID NO:2,4,6 eller 8 over den samlede lengde av SEQ ID NO:2.

Et fragment er et polypeptid med en aminosyre sekvens som fulgt og helt er den samme som en del av men ikke det hele av en aminosyre sekvens fra ethvert polypeptid i følge oppfinnelsen. Som med BASB020 polypeptidene, kan fragmenter være "frittstående", eller omfattes innen et større polypeptid av hvilke de danner en del eller region, allerhelst i form av en enkelt sammenhengende region i et enkeltstående større polypeptid.

Foretrukne fragmenter inkluderer eksempelvis trunkerings-polypeptider med et parti av en aminosyre sekvens fra SEQ ID NO:4 eller 6 eller av varianter derav, i likhet med en sammenhengende serie av rester som inkluderer en amino- og/eller karboksyl- terminal aminosyre sekvens. Degraderingsformer av polypeptidene i følge oppfinnelsen som er produsert av eller i en vertscelle, foretrekkes også. Ytterligere foretrukket er fragmenter som kjennetegnes av strukturelle eller funksjonelle attributter slik som fragmenter hvilke omfatter alfaheliks- eller alfaheliks-dannende regioner, betaflak- og betaflak-dannende regioner, dreinings- og dreiningsformende regioner, kveil- og kveilformende regioner, hydrofile regioner, hydrofobe regioner, alfa-amfipatiske regioner, beta-amfipatiske regioner, fleksible regioner, overflate-dannende regioner, substratbindende region, og regioner med høy antigen indeks.

Ytterligere foretrukne fragmenter inkluderer et isolert polypeptid som omfatter en aminosyre sekvens med minst 15,20,30,40,50 eller 100 sammenhengende aminosyrer fra aminosyre sekvensen i følge SEQ ID NO:4 eller 6, eller et isolert polypeptid som omfatter en aminosyre sekvens med minst 15,20, 30,40, 50 eller 100 sammenhengende aminosyre sekvenser som er trunkert eller slettet fra aminosyre sekvensen i følge SEQ ID NO:4 eller 6.

Fragmenter av polypeptidene i følge oppfinnelsen kan benyttes til å produsere det tilsvarende full lengde polypeptid ved hjelp av peptid syntese; derfor kan disse fragmenter benyttes som mellomprodukter for å frembringe de fulle lengdes polypeptider i følge oppfinnelsen.

Særskilt foretrukne er varianter hvori flere, 5-10,1-5,1-3,1-2 eller 1 aminosyre erstat-tes, slettes eller legges til i enhver kombinasjon.

Polypeptidene, eller de immunogene fragmenter, i følge oppfinnelsen kan foreligge i form av det "modne" protein eller kan være en del av et større protein i likhet med en forløper eller et fusjonsprotien. Det er ofte fordelaktig å inkludere en ytterligere aminosyre sekvens som inneholder sekretoriske eller leder sekvenser, pro-sekvenser, sekvenser som hjelper til i rensing slik som multiple histidin rester, eller en ytterligere sekvens for stabilitet i løpet av rekombinant produksjon. Videre siktes også mot tillegg av ekso- gent polypeptid eller lipid hale eller polynukleotid sekvenser for å øke det endelige mo-lekyls immunogene potensial.

I et aspekt vedrører oppfinnelsen genetisk konstruerte løselige fusjons proteiner som omfatter et polypeptid i følge den foreliggende oppfinnelse, eller et fragment derav, og ulike partier av de konstante regioner med tunge eller lette kjeder av immunoglobuliner av ulike underklasser (IgG, IgM, IgA, IgE). Foretrukket som et immunoglobulin er den konstante del av den tunge kjede i humant IgG, særskilt IgGl, hvor fusjonen finner sted i hengsel-regionen. I en særskilt utførelsesform, kan Fc-delen ganske enkelt fjernes ved inkorporering av en kløvnings sekvens som kan kløves med blodkoagulerings faktor Xa.

Videre vedrører den foreliggende oppfinnelse prosesser for fremstilling av disse fusjons proteiner ved genetisk konstruksjon, og anvendelsen derav for virkestoff-screening, diagnose og terapi. Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen vedrører også polynukleotider som koder for slike fusjons proteiner. Eksempler på fusjons protein-teknologi kan finnes i internationale patent søknader W094/29458 og W094/22914.

Proteinene kan være kjemisk konjugerte, eller uttrykt som rekombinante fusjons proteiner som tillater økede nivåer og frembringes i et ekspresjonssystem sammenlignet med ikke-fusjonert protein. Fusjonspartneren kan hjelpe til i å frembringe T-hjelper epitoper (immunologisk fusjons partner), fortrinnsvis de T-hjelper epitoper som gjenkjennes av mennesker, eller hjelpe til i å uttrykke proteinet (ekspresjons-forbedrer) i høyere utbyt-ter enn det naturlige rekombinante protein. Fortrinnsvis er fusjonspartneren både en immunologisk fusjons partner og en ekspresjons-forbedrende partner.

Fusjons partnere inkluderer protin D fra Haemophilus influenzae og det ikke-strukturelle protein fra influenzae virus, NS1 (hemagglutinin). En annen fusjons partner er det protin hvilket er kjent som LytA. Fortrinnsvis benyttes molekylets C-terminale parti. Lyta avledes fra Streptococcus pneumoniae som syntetiserer en N-acetyl.L-alanin amidase LytA, (som kodes for av lytA-genet {Gene, 43 (1986) side 265-272}) et auto-lysin som spesifikt degraderer visse bindinger i peptidoglykan-ryggraden. Det C-tenninale domenet i LytA-proteinet er ansvarlig for affiniteten ovenfor kolin eller noen kolin analoger slik som DEAE. Denne egenskap har vært utnyttet til utvikling av E- coli C-LytA ekspresjons plasmider som er nyttige for ekspresjonen av fusjons proteiner. Rensing av hybrid proteiner som inneholder C-LytA-rfagmentet ved dens amino terminus har vært beskrevet {Biotechnology: 10, (1992) side 795-798}. Det er mulig åbenyt- te gjentagelses partiet av det LytA-molekyl som finnes i den C-terminale ende som begynner ved rest 178, eksempelvis restene 188-305.

Den foreliggende oppfinnelse inkluderer også varianter av de før nevnte polypeptider, det vil si polypeptider som ved konservative aminosyre-substitusjoner varierer fra refe-renten, hvorved en rest er erstattet med en annen som har lignende karakteristisk. Typisk skjer slike substitusjoner blant Ala, Val, Leu og He; blant Ser og Thr; blant de sure rester Asp og Glu; blant Asn og Gin; og blant de basiske rester Lys og Arg; eller aroma-tiske rester Phe og Tyr.

Polypeptider i følge den foreliggende oppfinnelse kan frembringes på enhver egnet måte. Slike polypeptider inkluderer isolerte naturlig forekommende polypeptider, rekombinant produserte polypeptider, syntetisk produserte polypeptider, eller polypeptider som frembringes ved en kombinasjon av disse metoder. Midler for å frembringe slike polypeptider er vel forstått innen faget.

Det foretrekkes særskilt at et polypeptid i følge oppfinnelsen avledes fra Moraxella catarrhalis, imidlertid kan det med fordel oppnås fra andre organismer av samme taksio-nomiske slekt. Et polypeptid i følge oppfinnelsen kan også eksempelvis oppnås fra organismer av samme taksionimiske familie eller orden.

Pol<y>nukleotider

Det er et mål i følge oppfinnelsen å frembringe polynukleotider som koder for BASB020-polypeptider, særskilt polynukleotider som koder for det polypeptid som heri er betegnet BASB020.

I en særskilt foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen omfatter polynukleotidet en region som koder for BASB020 polypeptider hvilke omfatter en sekvens som er fremlagt i SEQ JD NO: 3 eller 5 og som inkluderer et full lengdes gen, eller en variant derav.

BASB020 nukleotidene som er frembragt i SEQ ID NO:3 eller 5 er BASB020 polynukleotidene fra Moraxella catarrhalis- stammene MC2931 (ATCC 43617), MC2912, MC2913 og MC2969.

Som et ytterligere aspekt i følge oppfinnelsen er det frembragt isolerte nukleotin syre molekyler som koder for og/eller uttrykker BASB020 polypeptider og polynukleotider, særskilt Moraxella catarrhalis BASB020 polypeptider og polynukleotider, inklusive

eksempelvis ubearbeidede RNA-er, ribozym RNA-er, mRNA-er, cDNA-er, genomiske DNA-er, B- og Z-DNA-er. Ytterligere utførelsesformer av oppfinnelsen inkluderer biologisk, diagnostisk, profylaktisk, klinisk eller terapeutisk velegnede polynukleotider og polypeptider, og varianter derav, samt preparater som benytter det samme.

Et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører isolerte polynukleotider, inklusive i det minst et full lengdes gen, som koder for et BASB020 polypeptid med en dedusert aminosyre sekvens i følge SEQ ID NO:4 eller 6 og polynukleotider som er nært beslektet dertil og varianter derav.

I en annen særskilt foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen foreligger det et BASB020 polypeptid fra Moraxella catarrhalis som omfatter eller består av en aminosyre sekvens i følge SEQ JD NO:4 eller 6 8 eller en variant derav.

Ved anvendelse av den informasjon som er frembragt heri, i likhet med en polynukleotid sekvens som er fremlagt i SEQ ID NO: 1,3,5 eller 7, kan et polynukleotid i følge oppfinnelsen som koder for BASB020 polypeptidet oppnås ved anvendelse av vanlige klonings- og screenings metoder, i likhet med tilsvarende for kloning og sekvensering av kromosomale DNA fragmenter fra bakterier ved anvendelse av Moraxella catarrhalis Catlin celler som utgangsmateriale, fulgt av oppnåelse av et full lengdes klon. Eksempelvis for å oppnå en polynukleotid sekvens kan det anvendes en polynukleotid sekvens som oppgitt i SEQ ID NO:l, 3, 5 eller 7, probes typisk et bibliotek av kloner av kromosomalt DNA fra Moraxella catarrhalis Catlin i Kcoli eller en annen egnet vert med et radioaktivt merket oligonukleotid, fortrinnsvis en 17-mer eller lenger, som stammer fra en delvis sekvens. Kloner som bærer DNA identisk med tilsvarende for proben kan deretter oppdages ved anvendelse av stringente hybridiserings betingelser. Ved sekvensering av de således identifiserte individuelle kloner ved hybridisering med sekvenserings primere som er utpekt fra det opprinnelige polypeptid eller fra polynukleotid sekvensen er det så mulig å forlenge polynukleotid sekvensen i begge ret-ninger for å bestemme en full lengdes gen sekvens. På en bekvem måte kan slik sekvensering eksempelvis gjennomføres ved anvendelse av denaturert dobbelt trådet DNA som fremstilt fra en plasmid klon. Egnede teknikker er beskrevet av Maniatis, T., Fritsch, E.F. og Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2M Ed.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989).

(se særskilt Screening By Hybridization 1.90 og Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70). Direkte genomisk DNA sekvensering kan også utfø-

res til oppnåelse av en full lengdes gen sekvens. Det er illustrerende for oppfinnelsen at hvert polynukleotid som er fremlagt i SEQ ID NO: 3 eller 5 ble oppdaget i et DNA bibliotek som stammer fra Moraxella catarrhalis.

Videre inneholder hver DNA sekvens som er fremlagt i SEQ ID NO:l, 3, 5 eller 7 en åpen leseramme som koder for et protein med cirka det antall aminosyre rester som er fremlagt i SEQ ID NO:2,4, 6 eller 8 med en dedusert molekylvekt som kan beregnes ved anvendelse av verdier for aminosyre rest-molekylvekter slik det er velkjent for fagfolk.

Polynukleotidet i følge SEQ ID NO:l koder, mellom start kodonet ved nukleotid nummer 1 og stopp kodonet som begynner ved nukleotid nummer 841, for polypeptidet i følge SEQ ID NO:2.

Polynukleotidet i følge SEQ ID NO:3 koder, mellom start kodonet ved nukleotid nummer 1 og stopp kodonet som begynner ved nuklotid nummer 841 fra SEQ ID NO:3, for polypeptid sekvensen til SEQ ID NO:4.

Polynukleotidet i følge SEQ ID NO:5 koder, mellom start kodonet ved nukleotid nummer 1 og stopp kodonet som begynner ved nukleotid nummer 841 fra SEQ ID NO:5, for polypeptidet i følge SEQ ID NO:6.

Polynukleotidet i følge SEQ ID NO:7 koder, mellom start kodonet ved nukleotid nummer 1 og stopp kodonet som begynner ved nuklotid nummer 841 fra SEQ ID NO:7, for polypeptidet i følge SEQ ID NO:8.

I et ytterligere aspekt, frembringer den foreliggende oppfinnelse et isolert polynulkeotid som omfatter eller består av: (a) en polynukleotid sekvens som har minst 85% identitet, fortrinnsvis minst 90% identitet, heller minst 95% identitet, eller enda heller minst 97-99% eller eksakt identitet med SEQ ID NO:3 eller 5 over den samlede lengde av henholdsvis SEQ ID NO:3

eller 5; eller

(b) en polynukleotid sekvens som koder for et polypeptid som har minst 85% identitet,

fortrinnsvis minst 90% identitet, heller minst 95% identitet, enda heller minst 97-99% eller 100% eksakt, med aminosyre sekvensen for SEQ ID NO: 4 eller 6 eller, over den samlede lengde av henholdsvis SEQ ID NO: 4 eller 6.

Et polynukleotid som koder for et polypeptid i følge den foreliggende oppfinnelse, inklusive homologer og ortologer fra arter utover Moraxella catarrhalis, kan oppnås ved en prosess som omfatter trinnene å screene et egnet bibliotek under stringente hybridiserings betingelser (eksempelvis ved anvendelse av en temperatur innen området 45-65°C og en SDS konsentrasjon fra 0.1-1%) med en etikettert eller påvisbar probe som består av eller omfatter sekvensen SEQ ID NO:3 eller 5 eller et fragment derav; og isolere et full lengdes gen og/eller genomiske kloner som inneholder polynukleotid sekvensen.

Oppfinnelsen frembringer en polynukleotid sekvens som over dens samlede lengde er identisk med en kodende sekvens (eller åpen leseramme) i SEQ ID NO:3 eller 5. Ved oppfinnelsen er det også frembragt en kodende sekvens for et modent polypeptid eller et fragment derav, i seg selv så vel som en kodende sekvens for et modent polypeptid eller et fragment i leseramme med en annen kodende sekvens, i likhet med en kodende sekvens som koder for en leder- eller sekretorisk sekvens, en pre-, eller pro- eller prepro-protein sekvens. Polynukleotidet i følge oppfinnelsen kan også inneholde minst en ikke-kodende sekvens, eksempelvis en ikke-kodende 5' og 3' sekvens, slik som de transkri-berte men ikke translaterte sekvenser, termineringssignaler (slik som rho-avhengige og rho-uavhengige termineringssignaler), ribosom-bindingspunkter, Kozak-sekvenser, sekvenser som stabiliserer mRNA, introner, og polyadenylerings signaler. Polynukleotid sekvensen kan også omfatte ytterligere kodende sekvens som koder for ytterligere aminosyrer. Eksempel kan en markør sekvens som letter rensing av det sammensmeltede polypeptid kodes for. I visse utførelsesformer av oppfinnelsen, er markørsekvensen et heksa-histidin peptid, som frembragt i vektoren pQE (Qiagen, Inc.) og beskrevet i Gentz et al, ProcNatLAcadSci., USA 86:821-824 (1989), eller en HA peptid etikett (Wilsom et al, Cell 37:767 (1984), som begge kan være egnet til å rense polypeptid sekvens som er smeltet sammen med dem. Polynukleotider i følge oppfinnelsen inkluderer også, men er ikke begrenset til, polynukleotider som omfatter et strukturelt gen og dets naturlig

assosierte sekvenser som styrer gen ekspresjon.

Den nukleotid sekvens som koder for BASB020 polypeptidet fra SEQ ID NO:2,4, 6 eller 8 kan være identisk med den polypeptid-kodende sekvens som rommes i nukleotidene 1 til 840 i følge henholdsvis SEQ ID NO:l, 3,5 eller 7. Alternativt kan den være en sekvens, hvilken som et resultat av redundansen (degenereringsgraden) av den genetiske kode, også koder for polypeptidet i følge SEQ ID NO:2,4, 6 eller 8.

Betegnelsen "polynukleotid som koder for et polypeptid" omfatter slik det anvendes heri polynukleotider som inkluderer en sekvens hvilken koder for et polypeptid i følge oppfinnelsen, særskilt et bakterielt polypeptid og nærmere bestemt et polypeptid fra Moraxella catarrhalis BASB020 med en aminosyre sekvens som fremlagt i SEQ ID NO:2,4,6 eller 8.

Betegnelsen omfatter også polynukleotider som inkluderer en enkelststående kontinuer-lig region eller diskontinuerlige regioner som koder for polypeptidet (eksempelvis polynukleotider som er avbrutt av integrert fag, en integrert innskudds sekvens, en integrert vektor sekvens, en integrert transposon sekvens, eller på grunn av RNA-redigering eller genomisk DNA-reorganisering) sammen med ytterligere regioner, som også kan inneholde kodende og/eller ikke-kodende sekvenser.

Oppfinnelsen vedrører videre varianter av de heri beskrevne polynukleotider som koder for varianter av et polypeptid med en dedusert aminosyre sekvens i følge SEQ ID NO: 4 eller 6. Fragmenter av polynukleotider i følge oppfinnelsen kan eksempelvis benyttes for å syntetisere full lengdes polynukleotider i følge oppfinnelsen.

Ytterligere særskilt foretrukne utførelsesformer er polynukleotider som koder for BASB020 varianter, som har aminosyre sekvensen til polypeptidet BASB020 i følge SEQ ID NO:4 eller 6, hvori flere, noen fa, 5 til 10,1 til 5,1 til 3,2,1 eller ingen aminosyre rester er substituert, modifisert, slettet og/eller tillagt, i enhver kombinasjon. Særskilt foretrukne blant disse er stille substitusjoner, tillegg og strykninger, som ikke end-rer BASB020 polypeptidet egenskaper og aktiviteter.

Ytterligere foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen er polynukleotider som over deres samlede lengde er i det minste 85% identiske med et polynukleotid som koder for BASB020 polypeptid med en aminosyre sekvens som fremlagt i SEQ ID NO:4 eller 6 og polynukleotider som er komplimentære til slike polynukleotider. Alternativt er de i høyest grad foretrukne de polynukleotider som omfatter en region som er i det minste 90% identisk i sin samlede lengde med et polynukleotid som koder for BASB020 polypeptid og polynukleotider som er komplimentære dertil. I dette henseende, er polynukleotider i det minste 95% identiske i sin samlede lengde med det samme særskilt foretrukne. Videre er disse med i det minste 97% i høy grad foretrukne blant de med minst 95%, og blant disse er de med minst 98% og de med minst 99% i særskilt høy grad foretrukne, i det minst 99% er mest foretrukket.

Foretrukne utførelsesformer er polynukleotider som koder for polypeptider som beholder i det vesentlige den samme biologiske funksjon eller aktivitet som det modne polypeptid hvilket koder for et DNA fra SEQ ID NO:3 eller 5.

I overensstemmelse med visse foretrukne utførelsesformer av denne oppfinnelse er det frembragt polynukleotider som hybridiserer, særskilt under stringente betingelser, til BASB020 polynukleotid sekvenser, slik som vedkommende polynukleotider i SEQ ID NO:3eller5.

Oppfinnelsen vedrører videre polynukleotider som hybridiserer til de polynukleotid sekvenser som er frembragt heri. I dette henseende, vedrører oppfinnelsen særskilt polynukleotider som under stringente betingelser hybridiserer til de polynukleotider som er beskrevet heri. Som benyttet heri, betyr termene "stringente betingelser" og "stringente hybridiserings betingelser" hybridisering som opptrer utelukkende dersom det foreligger minst 95% og fortrinnsvis minst 97% identitet mellom sekvensene. Et spesifikt eksempel på stringente hybridiserings betingelser er inkubering over natten ved 42°C i en løsning som omfatter: 50% formamid, 5xSSC (150 mM NaCl, 15 mM trinatrium citrat), 50 mM natrium fosfat (pH7.6), 5xDenhardt's løsning, 10% dekstran sulfat og 20 u.g/ml denaturert, avskåret DNA fra laksespermier, fulgt av vasking av hybridiserings underlaget i O.lxSSC ved cirka 65°C. Hybridiserings- og vaskebetingelser er velkjente og er eksemplifisert i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2<1*1>Ed. Cold Spring Harbor, NY., (1989), særskilt kapittel 11 deri. I^smngshybrimsering kan også benyttes med de polynukleotid sekvenser som er frembragt av oppfinnelsen. ;Oppfinnelsen frembringer også et polynukleotid som består av eller omfatter en polynukleotid sekvens som oppnås ved screening av et egnet bibliotek som inneholder det fullstendige gen for en polynukleotid sekvens som fremlagt i SEQ ID NO:3 eller 5 under stringente hybridiserings betingelser med en probe som har sekvensen for nevnte polynukleotid sekvens som er fremlagt i SEQ ID NO:3 eller 5 eller et fragment derav; og isolere polynukleotid sekvensen. Fragmenter som er egnet til oppnåelse av et slikt polynukleotid inkluderer eksempelvis prober og primere som fullt ut er beskrevet annensteds heri. ;Som diskutert annetsteds heri vedrørende polynukleotid-assays i følge oppfinnelsen, kan eksempelvis polynukleotidene i følge oppfinnelsen benyttes som en hybridiserings probe for RNA, cDNA og genomisk DNA for å isolere full lengdes cDNA-er og genomiske kloner som koder for BASB020 og å isolere cDNA og genomiske kloner av and re gener som vil ha en høy identitet særskilt høy sekvens identitet, med BASB020 genet Slike prober vil generelt omfatte minst 15 nukleotid rester eller basepar. Fortrinnsvis vil slike prober ha minst 30 nukleotid rester eller basepar og kan ha minst 50 nukleotid rester eller basepar. Særskilt foretrukne prober vil ha minst 20 nukleotid rester eller basepar og vil ha mindre enn 30 nukleotid rester eller basepar. ;En kodende region fra BASB020 genet, kan isoleres ved screening ved anvendelse av en DNA sekvens som er frembragt i SEQ ID NO:3 eller 5, for å syntetisere en oligonukleotid probe. Et etikettert oligonukleotid med en sekvens som er komplimentær til den for et gen i følge oppfinnelsen benyttes da til å screene et bibliotek av cDNA, genomisk DNA eller mRNA for å bestemme hvilke medlemmer av biblioteket proben hybridiserer til. ;Det foreligger flere fremgangsmåter som er tilgjengelige og velkjente for fagfolk til ;oppnåelse av full lengdes DNA-er, eller forlenge korte DNA-er, eksempelvis de som er basert på fremgangsmåten Rapid Amplification of cDNA-ender (RACE) (se eksempelvis Frohman, et al, PNAS USA 85:8998-9002,1988). Nylige modifikasjoner av teknik-ken, som eksemplifisert av Marathon™ technology (Clontech Laboratories Inc.), for eksempel, har signifikant forenklet søkingen etter lengre cDNA-er. I Marathon™-teknologien har cDNA-er blitt preparert fra mRNA som er ekstrahert fra et valgt vev og en "adaptor" sekvens som er ligert til hver ende. Nukleinsyre forlengelse (nucleic acid amplification - PCR) blir deretter utført for å forlenge den "manglende" 5 '-ende på DNA ved anvendelse av en kombinasjon av gen spesifikke og adaptor spesifikke oligonukleotid primere. PCR reaksjonen blir deretter gjentatt ved anvendelse av "nestede" primere, det vil si primere som er utformet for å feste seg innen det forlengede produkt (typisk en adaptor spesifikk primer som fester seg videre 3' i adaptor sekvensen og en gen spesifikk primer som fester seg videre 5' i den valgte gen sekvens). Produktene av denne reaksjon kan deretter analyseres ved DNA sekvensering og et full lengdes DNA som er konstruert enten ved å sammenslutte produktet direkte til det eksisterende DNA for å gi en fullstendig sekvens, eller ved å utføre en separat full lengdes PCR ved anvendelse av den nye sekvens informasjonen for utformingen av 5' primeren. ;Polynukleotidene og polypeptidene i følge oppfinnelsen kan eksempelvis benyttes som forskingsreagenser og materialer til oppdagelse av behandlinger av og diagnose for sykdommer, særskilt humane sykdommer, noe som er ytterligere diskutert heri vedrørende polynukleotid-assays. ;De polynukleotider i følge oppfinnelsen som er oligonukleotider som stammer fra en sekvens i følge SEQ ID NO: 3,4,5 eller 6, kan benyttes i prosessen heri som beskrevet, men fortrinnsvis for PCR, for å bestemme hvorvidt eller ikke de polynukleotider som er identifisert heri i det hele eller delvis transkriberes i bakterier i infektert vev. Det er-kjennes at slike sekvenser også vil ha nytte i diagnose av infeksjonstrinnet og typen infeksjon patogenet har oppnådd. ;Oppfinnelsen frembringer også polynukleotider som koder for et polypeptid som er det modne protein pluss ytterligere arnino- eller karboksylterminale aminosyrer, eller aminosyrer som befinner seg inne i det modne polypeptid (eksempelvis når den modne form har meer enn en polypeptid kjede). Slike sekvenser kan spille en rolle i bearbeiding av et protein fra forløper til en moden form, kan tillate protein transport, kan forlenge eller forkorte proteinets halveringstid eller kan lette manipulering av et protein for assay eller produksjon, blant andre ting. Slik det generelt er tilfellet in vivo, kan de ytterligere aminosyrer bearbeides borte fra det modne protein ved cellulære enzymer. ;For hver og en av polynukleotidene i følge oppfinnelsen er det frembragt et polynukleotid som er komplimentært til dette. Det foretrekkes at disse komplimentære polynukleotider er fullt ut komplimentære til hvert polynukleotid ovenfor hvilket de er komplimentære. ;Et forløper protein, som har en moden form av polypeptidet sammensmeltet med en eller flere prosekvenser kan være en inaktiv form av polypeptidet. Når prosekvenser fjernes blir slike inaktive forløpere generelt aktivert. Noen eller samtlige prosekvenser kan fjernes før aktivering. Generelt kalles slike forløpere for proproteiner. ;I tillegg til de vanlige betegnelser A, G, C, T/U for nukleotider, kan termen "N" også benyttes for å beskrive visse polynukleotider i følge oppfinnelsen. "N" betyr at ethvert av de fire DNA eller RNA nukleotider kan fremkomme som sådanne i en utvalgt posi-sjon i DNA eller RNA sekvensen, bortsett fra at det foretrekkes at N er en nukleinsyre som når den sees i kombinasjon med tilstøtende nukleotid posisjoner, under lesning i den korrekte leseramme, ville ha den effekt å generere et prematurt termineirngskodon i leserammen. ;I sum kan et polynukleotid i følge oppfinnelsen kode for et modent protein, et modent protein pluss en leder sekvens (som kan betegnes som er prepiotein), en forløper til et modent protein med en eller flere prosekvenser som ikke er leder sekvenser for et pre protein, eller et preprotein, som er en forløper for et proprotein, med en leder sekvens og en eller flere prosekvenser, som generelt fjernes i løpet av bearbddmgstrinn som frembringer aktive og modne former av polypeptid. ;I overensstemmelse med et aspekt av oppfinnelsen, forutsees anvendelsen av et polynukleotid i følge oppfinnelsen til terapeutiske eller profylaktiske formål, særskilt genetisk immunisering. ;Anvendelsen av et polynukleotid i følge oppfinnelsen i genetisk immunisering vil fortrinnsvis benytte en egnet tilførselsmetode slik som en direkte injeksjon av plasmid DNA inn i muskler (Wolff et al, Hum Mol Genet (1992) 1:363, Manthorpe et al, Hum. Gene Ther. (1983) 4:419), tilførsel av DNA kompleksert med spesifikke proteinbærere (Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264:16985), samutfellmg av DNA med kalsium fosfat (Benvenisty & Reshef. PNAS USA. (1986) 83:9551), innkapsling av DNA i ulike former av liposomer (Kaneda et al., Science (1989) 243:375), partikkel bombardement (Tang et al., Nature (1992) 356:152, Eisenbraun et al, DNA Cell Biol (1993) 12:791) og in vivo infeksjon ved anvendelse av klonede retrovirale vektorer (Seeger et al, PNAS USA ;(1984)81:5849). ;Vektorer, vertsceller, ekspresjons systemer ;Oppfinnelsen vedrører også vektorer som omfatter et polynukleotid eller polynukleotider i følge oppfinnelsen, vertsceller som er genetisk konstruert med vektorer i følge oppfinnelsen og produksjon av polypeptider i følge oppfinnelsen ved rekombinant teknikker. Celle frie translasjons systemer kan også benyttes for å produsere slike proteiner ved anvendelse av RNA-er som stammer fra DNA konstruksjoner i følge oppfinnelsen. ;Rekombinante polypeptider i følge den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved prosesser som er velkjente for fagfolk fra genetisk konstruerte vertsceller som omfatter ekspresjons systemer. Dermed, i et ytterligere aspekt, vedrører den foreliggende oppfinnelse ekspresjons systemer som omfatter et polynukleotid eller polynukleotider i følge den foreliggende oppfinnelse, til vertsceller som er genetisk omkonstruert med slike ekspresjons systemer, og produksjonen av polypeptider i følge oppfinnelsen ved rekombinant teknikker. ;For rekombinant produksjon av polypeptidene i følge oppfinnelsen, kan vertsceller generelt omkonstrueres for å inkorporere ekspresjons systemer eller partier derav eller polynukleotider i følge oppfinnelsen. Introduksjon av et polynukleotid inn i vertscellen kan effektueres ved hjelp av fremgangsmåter som er beskrevet i mange vanlige labora-toriemanualer, slik som Davis, et al, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, ;(1986) og Sambrook, et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORYMANUAL, 2M ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), slik som ;kalsium fosfat transfeksjon, DEAE-dekstran formidlet transfeksjon, transveksjon, mik-roinjeksjon, kanonisk lipidformidlet transfeksjon, elektroporering, transduksjon, skrape-innlasting, ballistisk induksjon og infeksjon. ;Representative eksempler på egnede verter inkluderer bakterieceller, slik som celler av streptococci, staphylococci, enterococci, E. coli, streptomyces, cyanobacteria, Bacillus subtilis, Neisseria meningitidis og Moraxella catarrhalis, ' fungale celler slik som celler av engjær. Kluveromyces, Saccharomyces, enbasidiomycet, Candida albicans og As-pergillus; insekt-celler slik som celler av Drosophila S2 og Spodoptera Sf9; dyre-celler slik som CHO, COS, HeLa, C127,3T3, BHK, 293, CV-1 og Bowes melanom-celler; og plante-celler slik som celler av et gymnosperm eller angiosperm. ;Et stort utvalg ekspresjons systemer kan benyttes for å produsere polypeptidene i følge oppfinnelsen. Slike vektorer inkluderer blant annet kromosomale, episomale og virus-avledede vektorer, eksempelvis vektorer som stammer fra bakterie plasmider, fra bakte-riofag, fra transposomer, fra gjær-episomer, fra innskuddselementer, fra gjærkromoso-male elementer, fra vimser slik som baculoviruser, papova vimser, slik som SV40, vaccinia vimser, adenovimser, fjærkrekoppe vimser, pseudorabies vimser, picorna vimser, retro vimser, og alfavimser samt vektorer som stammer fra kombinasjoner derav, i likhet med de som stammer fra plasmids og bakteriofags genetiske elementer, slik som kosmider og fagemider. Ekspresjons systemets konstruksjoner kan inneholde stryings-regioner som regulerer så vel som å foreta ekspresjon. Generelt kan ethvert system eller enhver vektor som er egnet til å opprettholde, formere eller uttrykket polynukleotider og/eller å uttrykke et polypeptid i en vert benyttes for ekspresjon i dette henseende. Den egnede DNA sekvens kan skytes inn i ekspresjons systemet ved hjelp av enhver av et utvalg av velkjente og mtinemessige teknikker, slik som eksempelvis de hvilke er fremlagt hos Samhrook et al, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, (supra). ;I rekombinante ekspresjonssystemer hos eukaryoter, for sekresjon av et translatert protein inn i det endoplasmiske reticulums lumen, inn i det periplasmiske rom eller inn i de ekstracellulære omgivelser, kan egnede sekresjons signaler inkorporeres i det uttrykte polypeptid. Disse signaler kan være endogene i forhold til polypeptidet eller de kan være heterologe signaler. ;Polypeptider i følge den foreliggende oppfinnelse kan utvinnes og renses fra rekombinante cellekulturer ved velkjente fremgangsmåter som inkluderer ammonium sulfat-elier etanol-utfelling, syre ekstraksjon, anionisk eller kationisk bytte kromatografi, fos-focelmlose kromatografi, hydrofob interaksjons kromatografi, affinitets kromatografi, hydroksylapatit-kromatografi og lectin kromatografi. Aller helt benyttes ione metall-affinitets kromatografi (IMAC) for rensing. Velkjente teknikker for å refolde proteiner kan benyttes for å generere aktiv konformasjon når polypeptidet denatureres under in-tracellulær syntese, isolasjon og rensing. ;Ekspresjonssystemet kan også være en rekombinant levende mikroorganisme, slik som et virus eller en bakterie. Genet av interesse kan skytes inn i genomet hos en levende rekombinant virus eller bakterie. Inokulering og in vivo infeksjon med denne levende vektor vil føre til in vivo ekspresjon av antigenet og induksjon av immun responser. Viruser og bakterier som benyttes til dette formål er for eksempel: koppeviruser (eksempelvis vaccinia, fjerfekopper, kanarifuglkopper), alfaviruser (Sindbis virus, Semliki Forest Virus, Venezuelansk heste encefalit-virus), adenoviruser, adeno-assosiert virus, picxDmaviruser (poliovirus, rhinovirus), herpesviruser (varicella zoster virus, etc), Liste-ria, Salmonella, Shigella, Neisseria, BCG. Disse viruser og bakterier kan være virulen-te, eller dempet på ulike måter med sikte på å oppnå levende vaksiner. Slike levende vaksiner kan også utgjøre en del av oppfinnelsen. ;Diagnostisk, prognostisk, serotypende og mutas jons- assays ;Denne oppfinnelse er også relatert til anvendelsen av BASB020 polynukleotider og polypeptider i følge oppfinnelsen til anvendelse som diagnostiske reagenser. Påvisning av BASB020 polynukleotider og/eller polypeptider i en eukaryote, særskilt et pattedyr, og særskilt et menneske, vil frembringe en diagnostisk metode for diagnose av sykdom, stadium av sykdom eller en infektøs organismes respons ovenfor virkestoffer. Eukaryoter, særskilt pattedyr, og særskilt mennesker, særskilt de som er infektert eller mistenkes å være infektert med en organisme som omfatter BASB020 genet eller proteinet, kan påvises ved nukleinsyre- eller aminosyre-nivået ved et utvalg velkjente teknikker så vel som ved hjelp av fremgangsmåter som frembragt heri. ;Polypeptider og polynukleotider for prognose, diagnose eller annen analyse kan tilveie-bringes fra putativt infekterte og/eller infekterte individers kroppslige materialer. Polynukleotider fra enhver av disse kilder, særskilt DNA eller RNA, kan benyttes direkte for påvisning eller kan amplifiseres enzymatisk ved anvendelse av PCR eller enhver annen amplifiseirngsteknikk forut for analyse. RNA, særskilt mRNA, cDNA og genomisk DNA kan også benyttes på de samme måter. Ved anvendelse av amplifisering, kan karakterisering av artene og stammen for infektøs eller resident organisme som foreligger i et individ utføres ved en analyse av genotypen av et utvalgt polynukleotid fra organismen. Slettinger og innskudd kan påvises ved en endring i størrelsen av det amplifiserte produkt sammenlignet med en genotype for en referanse sekvens som utvelges fra en relatert organisme, fortrinnsvis en annerledes art av den samme genus eller en annerledes stamme av den samme art. Punkt mutasjoner kan identifiseres ved hybridisering av amplifisert DNA til etiketterte BASB020 polynukleotid sekvenser. Perfekte eller signifikant matchede sekvenser kan skilles ut fra uperfekte eller mer signifikant ikke-matchende duplekser ved DNase- eller RNase-digerering, for henholdsvis DNA eller RNA, eller ved å påvise forskjeller i smeltetemperaturer eller renaturerings kinetik. Polynukleotid sekvens-forskjeller kan også påvises ved endringer i den elektroforetiske mobilitet av polynukleotid fragmenter i geler sammenlignet med en referanse sekvens. Dette kan utføres med eller uten denaturerings agenser. Polynukleotid forskjeller kan også påvises ved direkte DNA- eller RNA- sekvensering. Se eksempelvis Myers et al, Science, 230:1242 (1985). Sekvens endringer i spesifikke lokaliseringer kan også avslø-res ved nuklease beskyttelse-assays, slik som RNase, VI og Sl beskyttelses assay eller en kjemisk kløvingsmetode. Se eksempelvis, Cotton et al, Proe. Nati. Åcad. Sei. USA, 85:4397-4401 (1985). ;I en annen utførelsesform kan en rekke oligonukleotid prober som omfatter BASB020 nukleotid sekvens eller fragmenter derav konstrueres til gjennomføring av effektiv screening av eksempelvis genetisk mutasjoner, serotype, taksinomisk klassifisering eller identifisering. En rekke teknologimetoder er velkjente og har generell anvendbarhet og kan benyttes for å ta opp et utvalg spørsmål innen molekylær genetikk, inklusive gen ekspresjon, genetisk sammenkjeding, og genetisk variabilitet (se eksempelvis, Chee et al, Science, 274:610 (1996)). ;Således, i et annet aspekt, vedrører den foreliggende oppfinnelse et diagnostisk kit som omfatter: (a) et polynukleotid i følge den foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis en nukleotid sekvens i følge SEQ ID NO:3 eller 5, eller et fragment derav; (b) en nukleotid sekvens som er komplimenter til den fra (a); (c) et polypeptid i følge den foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis et polypeptid fra ;SEQ ID NO:4 eller 6 eller et fragment derav; eller ;(d) et antistoff til et polypeptid i følge den foreliggende oppfinnelse, fortrinnsvis til polypeptidet i følge SEQ ID NO:4 eller 6. ;Det skal bemerkes at i ethvert slik kan, kan (a), (b), (c) eller (d) omfatte en betydelig komponent. Et slikt kit vil være til nytte i diagnostisering av blant annet en sykdom eller sårbarhet ovenfor en sykdom. ;Denne oppfinnelse vedrører også anvendelsen av polynukleotidene i følge den foreliggende oppfinnelse som diagnostiske reagenser. Påvisning av en mutert form av et polynukleotid i følge oppfinnelsen fortrinnsvis SEQ ID NO:3 eller 5, som henger sammen med en sykdom eller patogenisitet vil frembringe et diagnostisk verktøy som kommer i tillegg til, eller definerer, en diagnose for en sykdom, en prognose for et sykdomsforløp, en bestemmelse av et sykdomsstadium, eller en sårbarhet ovenfor en sykdom, noe som resulterer fra underekspresjon, overekspresjon eller endret ekspresjon av polynukleotidet. Organismer, særskilt infektøse organismer, som bærer mutasjoner i sådant polynukleotid kan påvises på polynukleotid nivå ved hjelp av et utvalg av teknikker i likhet med de som er beskrevet annensteds heri. ;Celler fra en organisme som bærer mutasjoner eller polymorfismer (alleliske variasjoner) i et polynukleotid og/eller polypeptid i følge oppfinnelsen kan også påvises på polynukleotid- eller polypeptid nivå ved et utvalg teknikker, for å eksempelvis muliggjøre serotyping. Eksempelvis kan RT-PCR benyttes for å påvise mutasjoner i RNA. Det foretrekkes særskilt å benytte RT-PCR i samband med automatiserte påvisningssystemer, slik som eksempelvis GeneScan. RNA, cDNA eller genomisk DNA kan også benyttes til det samme formål, PCR. Som et eksempel kan PCR primere som er komplimentære med et polynukleotid som koder for BASB020 polypeptid benyttes for å identifisere og analysere mutasjoner. ;Oppfinnelsen frembringer videre primere med 1,2,3 eller 4 nukleotider som er fjernet fra enden 5<*>og/eller 3'. Disse primere kan blant annet, benyttes til å amplifisere BASB020 DNA og/eller RNA som er isolert fra en prøve som stammer fra et individ, slik som et kroppslig materiale. Primer ene kan benyttes for å amplifisere et polynukleotid som er isolert fra et infektert individ, slik at polynukleotidet deretter kan underlegges ulike teknikker for å kaste lys over polynukleotid sekvensen. På denne måte kan muta sjoner i polynukleotid sekvensen påvises og benyttes for å diagnostisere og/eller gi prognose for infeksjonen eller dens stadium eller forløp, eller for å serotype og/eller klassifisere det infektøse agens.

Oppfinnelsen frembringer videre en prosess for å diagnostisere sykdom, fortrinnsvis bakterieinfeksjoner, helst infeksjoner som bevirkes av Moraxella catarrhalis, som omfatter at det fra en prøve som stammer fra et individ, slik som et kroppslig materiale, fastsettes et øket nivå av ekspresjonen av polynukleotid med en sekvens i følge SEQ ID NO:3 eller 5. Øket eller minsket ekspresjon av et BASB020 polynukleotid kan måles ved anvendelse av en av de fremgangsmåter som er velkjent innen faget for kvantifise-ring av polynukleotider, i likhet med eksempelvis amplifikasjon, PCR, RT-PCR, RNase beskyttelse, Northern blotting, spektrometri og andre hybridiserings metoder.

Dessuten kan et diagnostisk assay i samsvar med oppfinnelsen for påvisning av overekspresjon av BASB020 polypeptid sammenlignet med normale prøver av kon-trollvev benyttes for å påvise eksempelvis tilstedeværelsen av en infeksjon. Assay teknikker som kan benyttes for å bestemme nivåer av et BASB020 polypeptid, i en prøve som stammer fra en vert, slik som et kroppslig materiale, er velkjente for fagfolk. Slike assay metoder inkluderer radioaktive immunoassays, konkurrerende-bindings assays, Western blot analyse, antistoff-sandwich assays, antistoff påvisning og ELISA assays.

Polynukleotidene i følge oppfinnelsen kan benyttes som komponenter i polynukleotid rekker, fortrinnsvis høy-tetthets rekker eller rutenett. Disse høy-tetthets rekker er særskilt egnet til diagnostiske og prognostiske formål. Eksempelvis kan et sett av punkter som hver omfatter et ulikt gen, og videre omfatter et polynukleotid eller polynukleotider i følge oppfinnelsen, benyttes for probing, slik som anvendelse av hybridiserings- eller nukleinsyre- amplifisering, anvendelse av en probe som er tilveiebragt eller stammer fra en kroppslig prøve, for å bestemme tilstedeværelsen av en bestemt polynukleotid sekvens eller relatert sekvens i et individ. En slik tilstedeværelse kan indikere tilstedeværelsen av et patogen, særskilt Moraxella catarrhalis, og kan være nyttig i diagnostisering og/eller prognostisering av sykdommen eller et forløp for en sykdom. Et rutenett som omfatter et antall varianter av polynukleotid sekvensen i følge SEQ ID NO: 3 eller 5 foretrekkes. Det foretrekkes også at det medtas et antall varianter av en polynukleotid sekvens som koder for polypeptid sekvensen i følge SEQ ID NO:4 eller 6.

Antistoffer

Polypeptidene og polynukleotidene i følge oppfinnelsen eller varianter derav, eller celler som uttrykker det samme kan benyttes som immunogener for å produsere antistoffer som er immunospesifikke for slike henholdsvis polypeptider eller polynukleotider.

I bestemte foretrukne utførelsesformer i følge oppfinnelsen er det frembragt antistoffer mot BASB020 polypeptider eller polynukleotider.

Antistoffer som er generert mot polypeptidene eller polynukleotidene i følge oppfinnelsen kan oppnås ved administrering av polypeptidene og/eller polynukleotidene i følge oppfinnelsen, eller epitop-bærende fragmenter av den ene eller begge, analoger av den ene eller begge, eller celler som uttrykker den ene eller begge, til et dyr, fortrinnsvis et ikke-human, ved anvendelse av rutinemessige protokoller. For preparering av monoklonale antistoffer, kan enhver teknikk som er kjent innen faget og som frembringer antistoffer som produsert av kontinuerlige cellelinje kulturer benyttes. Eksempler inkluderer diverse teknikker, slik som de i Kohler, G.og Milstein, C, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al, Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al, s. 77-96 i MONOCLONAL ANTIBOD1ESAND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985).

Teknikker for produksjonen av enkeltkjede-antistoffer (US patent nr. 4,946,778) kan benyttes for å produsere enkeltkjede-antistoffer til polypeptider eller polynukleotider i følge denne oppfinnelse. Videre kan transgeniske mus, eller andre organismer eller dyr, slik som andre pattedyr, benyttes for å uttrykke humaniserte antistoffer som er immunospesifikke ovenfor polypeptidene eller polynukleotidene i følge oppfinnelsen.

Alternativt kan fagvisnings-teknologi benyttes for å utvelge antistoff gener med bindende aktiviteter ovenfor et polypeptid i følge oppfinnelsen enten fra repertoirer av PCR amplifiserte v-gener tilhørende lymfocytter fra mennesker som er screenet med hensyn til å inneha anti-BASB020 eller fra opprinnelige biblioteker (McCafferty, et al, (1990), Nature 348:552-554; Marks, et al, (1992) Biotechnology 10,779-783). Disse antistof-fers affinitet kan også forbedres eksempelvis ved kjedeombytting (chain shuffling)

(Clackson et al, (1991) Nature 352:628).

De i det foregående beskrevne antistoffer kan benyttes for å isolere eller identifisere kloner som uttrykker polypeptidene eller polynukleotidene i følge oppfinnelsen for å rense polypeptidene eller polynukleotidene ved eksempelvis affinitets kromatografi. Således kan blant annet antistoffer mot BASB020 polypeptid eller BASB020 polynukleotid benyttes for å behandle infeksjoner, særskilt bakterieinfeksjoner.

Polypeptid varianter inkluderer antigen, epitopisk eller immunologisk ekvivalente varianter som danner et særskilt aspekt av den foreliggende oppfinnelse.

Fortrinnsvis er antistoffet eller varianten derav modifisert for å gjøre den mindre immu-nogen i individet. Eksempelvis dersom individet er humant, bør antistoffet allerhelst være "humanisert", hvor den komplimentaritetsbestemmende region eller regionene av det hybridom-avledede antistoff har blitt transplantert inn i et humant monoklonalt antistoff", eksempelvis som beskrevet i Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 eller Tem-pest et al., (1991) Biotechnology 9,266-273.

Antagonister og agonister - assays og molekyler

Polypeptider og polynukleotider i følge oppfinnelsen kan også benyttes for å fastsette styrken av bindingen av små molekylsubstrater og ligander eksempelvis i celler, celle-frie preparater, kjemiske biblioteker og naturlige produktblandinger. Disse substrater og ligander kan være naturlige substrater og ligander eller kan være strukturelle eller funksjonelle etterapninger. Se eksempelvis Coligan et al, Current Protocols in Immunology if2).Chapter5(1991).

Screeningsmetodene kan ganske enkelt måle bindingen av en kandidatforbindelse til polypeptidet eller polynukleotidet, eller til celler eller membraner som bærer polypeptidet eller polynukleotidet, eller et fusjonsprotein av polypeptidet ved hjelp av en merke etikett ("labell") som direkte eller mdirekte er assosiert med kandidatforbindelsen. Alternativt kan screeningmetoden involvere konkurrering med en merket konkurrent. Videre kan disse screeningsmetoder teste hvorvidt kandidatforbindelsen resulterer i et signal som genereres ved aktivering eller inhibering av polypeptidet eller polynukleotidet, ved anvendelse av påvisningssystemer som er egnet for de celler som omfatter polypeptidet eller polynukleotidet. Inhibitorer for aktivering måles generelt i nærvær av en kjent agonist og effekten på aktivering av agonisten ved tilstedeværelsen av kandidatforbindelsen observeres. Grunnleggende aktivt polypeptid og/eller aktivt uttrykte polypeptider og polynukleotider kan benyttes i screeningsmetoder for inverse agonister eller inhibitorer, i fravær av en agonist eller inhibitor, ved testing av hvorvidt kandidatforbindelsen resulterer i inhibering av aktivering av polypeptidet eller polynukleotidet, avhengig av det enkelte tilfellet. Videre kan screeningsmeto dene ganske enkelt omfatte trinnene å blande en kandidatforbindelse med en løsning som inneholder et polypeptid eller polynukleotid i følge den foreliggende opprinnelse, til dannelse av en blanding, måling av BASB020 polypeptid- og/eller polynukleotid-aktiviteten i blandingen, og sammenligning mellom blandingens B ASB020 polypeptid- og/eller polynukleotid aktivitet med en standard. Fusjonsproteiner, i likhet med de som er fremstilt fra Fc parti og BASB020 polypeptid, som beskrevet i det foregående heri, kan også benyttes for høy gjennom-strømnings screening assays for å identifisere antagonister til polypeptidet i følge den foreliggende oppfinnelse, så vel som for fylogenetiske og/eller funksjonelt relaterte polypeptider (se D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58 (1995); og K. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)).

Polynukleotidene, polypeptidene og antistoffene som bindes til og/eller interagerer med et polypeptid i følge den foreliggende oppfinnelse kan også benyttes for å konfigurere screeningsmetoder til påvisning av effekten av tilsatte forbindelser på produksjonen av mRNA og/eller polypeptid i celler. Eksempelvis kan en ELISA assay konstrueres for å måle utskilte eller celle-assosierte nivåer av polypeptid ved anvendelse av monoklonale og polyklonale antistoffer ved metoder som er vanlig kjent innen faget. Dette kan benyttes for å oppdage agenser som kan inhibere eller forbedre produksjonen av polypeptid (også kalt henholdsvis antagonist eller agonist) på egnet måte manipulerte celler eller vev.

Oppfinnelsen frembringer også en fremgangsmåte for screening av forbindelser for å identifisere de som forbedrer (agonist) eller blokkerer (antagonist) virkningen av BASB020 polypeptider eller polynukleotider, særskilt de forbindelser som er bakteriostatiske og/eller baktericide. Fremgangsmåten for screening kan involvere teknikker med høy gjennomstrømning. Eksempelvis for å screene med hensyn til agonister eller antagonister, inkuberes en syntetisk reaksjonsblanding, en cellulær inndeling, slik som et membran, cellekappe eller cellevegg, eller et preparat av en av disse, som omfatter BASB020 polypeptid og et etikettert substrat eller en ligand av et slikt polypeptid i fravær eller nærvær av et kandidatmolekyl som kan være en BASB020 agonist eller antagonist. Kandidatmolekylets evne til å agonisere eller antagonisere BASB020 polypeptidet reflekteres i minsket binding av den etiketterte ligand eller minsket produksjon av produkt fra substratet. Molekyler som binder med letthet, det vil si uten å indusere ef-fektene til BASB020 polypeptidet er mest sannsynlig gode antagonister. Molekyler som bindes godt og, avhengig av tilfellet, øker hastigheten for produktproduksjon fra substratet, øker signal transduksjon, eller øker kjemisk kanalaktivitet er agonister. Påvisning av hastigheten eller nivået, avhengig av tilfellet, av produksjon av produkt fra substrat, signal transduksjon eller kjemisk kanalaktivitet kan forbedres ved anvendelse av et rap-portørsystem. Rapportørsystemer som kan være nyttige i dette henseende inkluderer men er ikke begrenset til colorimetrisk, etikettert substrat som er konvertert til produkt, et rapportørgen som gir gjensvar til endringer i BASB020 polynukleotid- eller polypeptid aktivitet, og bindings assays som er kjent innen faget.

Et annet eksempel på et assay for BASB020 agonister er et konkurrerende assay som kombinerer BASB020 og en potensiell agonist med BASB020-bindende molekyler, rekombinante BASB020 bindende molekyler, naturlige substrater eller ligander, eller substrat- eller ligand- etterapninger under passende betingelser for en konkurrerende inhiberings assay. BASB020 kan etiketteres som ved radioaktivitet eller en colorimetrisk forbindelse, slik at antallet BASB020 molekyler som bindes til et bindingsmolekyl eller konverteres til produkt kan bestemmes nøyaktig til fastsettelse av den potensielle antagonists effektivitet.

Potensielle antagonister inkluderer blant annet små organiske molekyler, peptider, polypeptider og antistoffer som bindes til et polynukleotid og/eller polypeptid i følge oppfinnelsen og derved inhiberer eller slukker dets aktivitet eller ekspresjon. Potensielle antagonister kan også være små organiske molekyler, et peptid, et polypeptid slik som et nært beslektet protein eller antistoff som bindes til de samme pumkter på et bindingsmolekyl, slik som et bindingsmolekyl, uten å indusere BASB020-induserte aktiviteter, noe som forebygger virkningen eller ekspresjonen av BASB020 polypeptider og/eller polynukleotider ved å ekskludere BASB020 polypeptider og/eller polynukleotider fra å bindes.

Potensielle antagonister inkluderer et lite molekyl som bindes til og okkuperer polypep-tidets bmdingspunkt noe som forhindrer binding til cellulære bindingsmolekyler, slik at normal biologisk aktivitet forebygges. Eksempler på små molekyler inkluderer men er ikke begrenset til små organiske molekyler, peptider eller peptid-lignende molekyler. Andre potensielle antagonister inkluderer antiretnings-molekyler (se Okano, J. Neuro-chem. 56:560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), for en beskrivelse av disse molekyler). Foretrukne potensielle antagonister inkluderer forbindelser som er beslektet med og varianter av BASB020.

I et ytterligere aspekt vedrører den foreliggende oppfinnelse genetisk konstruerte løseli-ge fusjonsproteiner som omfatter et polypeptid i følge den foreliggende oppfinnelse, eller et fragment derav, og varierende partier av de konstante regioner av tunge og lette kjeder av immunoglobuliner fra varierende delklasser (IgG, IgM, IgA, IgE). Foretrukket som et immunoglobulin er den konstante del av den tunge kjede fra humant IgG, særskilt IgGl, hvor fusjon finner sted ved hengsel regionen. I en særskilt utførelsesform kan Fc delen ganske enkelt fjernes ved inkorporering av en kløvnings sekvens som kan kløves med blod levrings faktor Xa. Videre er den foreliggende oppfinnelse beslektet med prosesser for fremstilling av disse fusjonsproteiner ved genetisk konstruksjon, og med anvendelsen derav til virkestoff screening, diagnose og terapi. Et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen vedrører også polynukleotider som koder for slike fusjonsproteiner. Eksempler på fusjonsprotein-teknologi kan finnes i internasjonale patentsøknader W094/29458 og W094/22914.

Hver av de polynukleotid sekvenser som er frembragt heri kan benyttes i oppdagelsen og utviklingen av antibakterielle forbindelser. Det kodede protein kan, ved ekspresjon, benyttes som et mål for siktingen av antibakterielle virkestoffer. Dessuten kan de polynukleotid sekvenser som koder for de amino terminale regioner i det kodede protein eller Shine-Delgarno eller andre translasjons-lettende sekvenser for det respektive mRNA benyttes for å konstruere antiretnings sekvenser for å styre ekspresjonen av kodings sekvensen av interesse.

Oppfinnelsen tilbyr også anvendelsen av polypeptidet, polynukleotidet, agonisten eller antagonisten i følge oppfinnelsen for å interferere med den innledningsvise fysiske in-teraksjon mellom et patogen eller patogener og en eukaryotisk vert, foilrinnsvis et pattedyr som er ansvarlig for sekvestrering av infeksjon. Nærmere bestemt kan molekylene i følge oppfinnelsen benyttes: i forebyggelse av adhesjon av bakterier, særskilt gram positive og/eller gram negative bakterier, til eukaryotiske, fortrinnsvis pattedyrs, ekstracellulære matrise proteiner på iboende inmetninger eller til ekstracellulære matrise pro-tiener i sår; for å blokkere bakteriell adhesjon mellom eukaryotiske, fortrinnsvis pattedyrs, ekstracellulære matrise proteiner og bakterielle BASB020 proteiner som formidler vevsskade og/eller; å blokkere den normale progresjon av patogenese i infeksjoner som er initiert utover ved implantasjon av iboende innretninger eller ved andre kirurgiske teknikker.

I samsvar med nok et annet aspekt ved oppfinnelsen, er det frembragt BASB020 agonister og antagonister, fortrinnsvis bakteriostatiske eller bakteriocide agonister og antagonister.

Antagonistene og agonistene i følge oppfinnelsen kan eksempelvis benyttes til å forebygge, inhibere og/eller behandle sykdommer.

I et ytterligere aspekt vedrører den foreliggende oppfinnelse mimotoper til polypeptidet i følge oppfinnelsen. En mimotop er en peptid sekvens som i tilstrekkelig grad ligner det opprinnelige peptid (sekvensielt eller strukturelt), som er i stand til å kunne gjenkjennes av antistoffer som gjenkjenner det opprinnelige peptid; eller er i stand til å reise opp antistoffer som gjenkjenner det opprinnelige peptid under kobling til en egnet bærer.

Peptid mimotoper kan være utformet for et bestemt formål ved addisjon, sletting eller substitusjon av utvalgte aminosyrer. Således kan peptidene modifiseres med det formål å lette konjugering til en protienbærer. Eksempelvis kan det være ønskelig for noen kjemiske konjugeringsmetoder å inkludere et terminalt cystein. Dessuten kan det være ønskelig for peptider som er konjugert til en proteinbærer å inkludere en hydrofob terminus distalt fra peptidets konjugerte terminus, slik at den frie ukonjugerte ende av peptidet forblir assosiert med bæreproteinets overflate. Derved presenteres peptidet i en konformasjon som nærmest ligner på den for peptidet slik det finnes i sammenhengen for det hele opprinnelige molekyl. Eksempelvis kan peptidene bli endret til å ha et N-terminalt cystein og en C-terminal hydrofob amidert hale. Alternativt kan addisjonen eller substitusjonen av en D-stereoisomer form av en eller flere av aminosyrene utføres for å danne et velgjørende derivat, eksempelvis for å forbedre peptidets stabilitet.

Alternativt kan peptid mimotoper identifiseres ved anvendelse av antistoffer som selv er i stand til å bindes til polypeptidene i følge den foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av slike teknikker som fagvisnings-teknologi (phage display technology) (EP 0 552 267 Bl). Denne teknikk genererer et stort antall peptid sekvenser som etteraper de opprinnelige peptiders struktur og de er derfor i stand til å bindes til ikke-otjprinnelige peptid antistoffer, men behøver ikke nødvendigvis i seg selv å dele signifikant sekvens homologi med det opprinnelige polypeptid.

Vaksiner

Et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å indusere en immunologisk respons i et individ, særskilt et pattedyr, fortrinnsvis mennesker, som omfatter inokkulering av individet med BASB020 polynukleotid og/eller polypeptid, eller et fragment eller en variant derav, som er adekvat til å produsere antistoff og/eller T celle-immunrespons for å beskytte individet mot infeksjon, særskilt bakterieinfeksjon og aller mest infeksjon Gra Moraxella catarrhalis. Det er også frembragt fremgangsmåter hvorved slik immunologisk respons sinker bakterie replikasjon. Nok et annet aspekt ved oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å indusere immunologisk respons i et individ som omfatter at det til individet tilføres en nukleinsyre vektor, -sekvens eller- ribozym for å rette ekspresjon av BASB020 polynukleotid og/eller polypeptid, eller et fragment eller en variant derav, for å uttrykke BASB020 polynukleotid og/eller polypeptid, eller et fragment eller en variant derav in vivo med sikte på å indusere en immunologisk respons, slik som å produsere antistoff og/eller T celle-immunrespons, inklusiv eksempelvis cytokin produserende T celler eller cytotoksiske T celler, for å beskytte individet, fortrinnsvis et human, fra sykdom, enten sykdom allerede er etablert innen individet eller ikke. Et eksempel på administrering av genet er ved å akselerere det inn i de ønskede celler i form av et belegg på partikler eller på annen måte. Slik nukleinsyre vektor kan omfatte DNA, RNA, et ribozym, en modifisert nukleinsyre, et DNA/RNA-hybrid, et DNA-protein kompleks eller et RNA-protein kompleks. Et videre aspekt ved oppfinnelsen vedrører et immunologisk preparat som når det introduseres inn i et individ, fortrinnsvis et human, som er i stand til å få indusert inn i seg en immunologisk respons, induserer en immunologisk respons i individet ovenfor et BASB020 polynukleotid og/eller polypeptid som kodes for derfra, hvori preparatet omfatter et rekombinant BASB020 polynukleotid og/eller polypeptid som kodes for derfra og/eller omfatter DNA og/eller RNA som koder for og uttrykker et antigen til BASB020 polynukleotidet, polypeptidet som kodes for derfra, eller annet polypeptid i følge oppfinnelsen. Den immunologiske respons kan benyttes terapeutisk eller profylaktisk og kan ta form av antistoff immunitet og/eller cellulær immunitet, slik som cellulær immunitet hvilken oppstår fra CTL eller CD4+ T celler.

Et BASB020 polypeptid eller et fragment derav kan sammensmeltes med ko-protein eller kjemisk enhet som kan eller i seg selv ikke kan produsere antistoffer, men som er stand til å stabilisere det første protein og produsere et sammensmeltet eller modifisert protein som vil ha antigene og/eller immunogene egenskaper, og fortrinnsvis beskyttende egenskaper. En således sammensmeltede rekombinante protein omfatter fortrinnsvis videre et antigent ko-protein, slik som lipoprotein D fra Haemophilus influenzae, Glu-tathion-S-transferase (GST) eller beta-galaktosidase, eller et annet relativt stort ko-protein som solubriserer proteinet og letter produksjon og rensing derav. Videre kan ko-proteinet fungere som et adjuvans i den betydning av at det frembringer en generalisert stimulering av immunsystemet til den organisme som mottar proteinet. Ko-proteinet kan være festet til det første proteins amino- eller karboksy-terminus.

Ved denne oppfinnelse er det frembragt preparater, særskilt vaksinepreparater, og fremgangsmåter som omfatter polypeptidene og/eller polynukleotidene i følge oppfinnelsen og immunostimulerende DNA sekvenser, i likhet med de som er beskrevet i Sato, Y et al, Science 273:352 (1996).

Ved den foreliggende oppfinnelse er det også frembragt fremgangsmåter som benytter det beskrevne polynukleotid eller særskilte fragmenter derav, som har vært vist å kode for ikke-variable regioner av bakteriecellers overflate proteiner, i polynukleotid konstruksjoner som benyttes i slike immuniserings eksperimenter i dyremodeller for infeksjon med Moraxella catarrhalis. Slike eksperimenter vil være særskilt nyttige for å identifisere protein epitoper som er i stand til å produsere en profylaktisk eller terapeutisk immunrespons. Det antas at denne tilnærmelse vil muliggjøre den påfølgende fremstilling av monoklonale antistoffer av særskilt verdi, som stammer fra det påkrevede organ fra det dyr som med fremgang motstår eller klarerer infeksjon, til utvikling av profylaktiske agenser eller terapeutiske behandlinger av bakteriell infeksjon, særskilt infeksjon med Moraxella catarrhalis, i pattedyr, særskilt mennesker.

Oppfinnelsen inkluderer også en vaksineformulering som omfatter et immunogent rekombinant polypeptid og/eller polynukleotid i følge oppfinnelsen sammen med en egnet bærer, slik som en farmasøytisk akseptabel bærer. Siden polypeptidene og polynukleotidene kan brytes ned i magen, administreres hver av dem fortrinnsvis parenteralt, inklusive eksempelvis administrering som er subkutan, mtrainuskulær, intravenøs eller intra-dermal. Formuleringer som er egnet til parenteral administrering inkluderer vandige eller ikke-vandige sterile mjeksjonsløsninger som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatiske forbindelser og oppløste stoffer som gjør formuleringen isotonisk i forhold til individets kroppsvæske, fortrinnsvis blodet; og vandige og ikke-vandige sterile suspensjoner som kan inkludere suspenderingsmidler eller tykningsmidler. Formule-ringene kan foreligge i enhetsdose- eller multidose-beholdere, eksempelvis forseglede ampuller og hetteglass og kan lagres i frysetørket tilstand som bare krever tilsats av den sterile flytende bærer umiddelbart forut for anvendelse.

Vaksineformuleringen i følge oppfinnelsen kan også inkludere adjuvans systemer for å forbedre formuleringens immunogenitet. Fortrinnsvis vekker adjuvans systemet helst en respons av typen TH1.

En immunrespons kan bredt atskilles i to ekstreme katagorier, som er en humoral eller celleformidlet immunrespons (tradisjonelt kjennetegnet ved henholdsvis antistoff- og cellulære effektor mekanismer for beskyttelse). Disse kategorier av respons har blitt betegnet som responser av typen TH1 (celleformidlet respons), og immunresponser av typen TH2 (humoral respons).

Ekstreme immunresponser av typen TH1 kan kjennetegnes ved genereringen av antigen spesifikke, haplotype begrensede cytotoksiske T lymfocytter, og naturlige drapscelle responser. I mus er responser av typen TH1 ofte kjennetegnet av genereringen av antistoffer av deltypen IgG2a, mens i mennesket svarer disse til antistoffer av typen IgGl. TH2-typen immunresponser kjennetegnes ved genereringen av et bredt utvalg immunoglobulin-isotyper som i mus inkluderer IgGl, IgA og IgM.

Det kan antas at drivkraften bak utviklingen av disse to typer immunresponser er cytokiner. Høye nivåer av cytokiner av typen TH1 tenderer til å favorisere induksjonen av celleformidlede immunresponser for å gi antigenet, mens høye nivåer av cytokiner av typen TH2 tenderer til å favorisere induksjonen av humorale immunresponser mot antigenet.

Skillet mellom immunresponser av typen TH1 og TH2 er ikke absolutt. I realiteten vil et individ støtte en immunrespons hvilken beskrives som å være hovedsakelig TH1 eller hovedsakelig TH2. Imidlertid er det ofte bekvemt å betrakte cytokin familiene ut fra det som er beskrevet i murine CD4 +ve T celle kloner av Mosmann og Coffman (Mosmann, T.R. og Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: differentpatterns oflymphokine secretion lead to different functional properties. Annual review oflmmunology, 7, s. 145-173). Tradisjonelt er responser av typen TH1 knyttet sammen med produksjonen av INF-Y og IL-2 cytokiner ved T-lymfocytter. Andre cytokiner som ofte er direkte assosiert med induksjonen av immunresponser av typen TH1 produseres ikke av T-celler, slik som IL-12. Derimot henger responser av typen TH2 sammen med utskillelsen av IL-4,IL-5, IL-6 ogIL-13.

Det er kjent at visse vaksine adjuvanser er særskilt velegnet for stimuleringen av cytokin responser av typen enten TH1 eller TH2. Tradisjonelt inkluderer de beste indikato-rer for balansen TH1 :TH2 for immunresponsen etter en vaksinasjon eller infeksjon direkte måling av produksjonen av TH1 eller TH2 cytokiner ved T lymfocytter in vitro etter restimulering med antigen, og/eller målingen av forholdet IgGl :IgG2a for antigen spesifikke antistoff responser.

Således er en adjuvans av typen TH1 en som fortrinnsvis stimulerer isolerte T-celle po-pulasjoner til å produsere høye nivåer av cytokiner av TH1 typen under restimulering med antigen in vitro, og fremmer utvikling av både CD8+ cytotoksiske T lymfocytter og antigen spesifikke irrimunoglobulin responser som henger sammen med TH 1-type isotype.

Adjuvanser som er i stand til fortrinnsvis stimulering av TH1 celleresponsen er beskrevet i international patent søknat WO94/00153 og WO95/17209. 3 De-O-acylert monofosforyl lipid A (3D-MPL) er et slikt adk\juvans. Dette er kjent fra GB 2220211 (Ribi). Kjemisk er dette en blanding av 3 De-O-acylert monofosforyl lipid A med 4,5 eller 6 acylerte kjeder og det er fremstilt av Ribi Immunochem, Montana, USA. En foretråkken form av 3 De-O-acylert monofosofryl lipid A er beskrevet i europeisk patent 0 689 454 Bl (SmithKline Beecham Biologicals SA).

Fortrinnsvis er 3D-MPL-partiklene små nok til å steril filtreres gjennom et 0.22 pm membran (Europeisk patent nummer 0 689 454).

3D-MPL vil foreligge i området 10jj,g-100pg, fortrinnsvis 25-50jxg per dose hvori antigenet typisk vil foreligge innen området 2-50jag per dose.

Et annet foretrukket adjuvans omfatter QS21, en Hplc renset ikke-toksisk fraksjon som stammer fra barken av Quillaja Saponaria Molina. Valgfritt kan denne blandes sammen med 3 De-O-acylert monofosforyl lipid A (3D-MPL), valgfritt sammen med en bærer.

Fremgangsmåten til produksjon av QS21 er beskrevet i US patent nr. 5,057,540.

Ikke-reaksjons genererende adjuvans formuleringer som inneholder QS21 har vært beskrevet tidligere (W096/33739). Slike formuleringer som omfatter QS21 og koleste- roi har vært vist å være vellykkede TH1 stimulerende adjuvanser når de formuleres sammen med et antigen.

Ytterligere adjuvanser som er preferensielle simulatorer for TH1 cellerespons inkluderer immunomodulerende oligonukleotider, eksempelvis umetylerte CpG sekvenser som beskrevet i WO96/02555.

Kombinasjoner av ulike TH1 stimulerende adjuvanser, i likhet med de som er nevnt i det foregående, tilsiktes også i det de frembringer et adjuvans som er en preferensiell simulator for TH1 cellerespons. Eksempelvis kan QS21 formuleres sammen med 3D-MPL. Forholdet QS21:3D-MPL vil typisk være i størrelsesorden 1:10 til 10:1, fortrinnsvis 1:5 til 5:1 og ofte i det vesentlige 1:1. Det foretrukne området for optimal sy-nergi er 2:1 til 1:1 3D-MPL:QS21.

Fortrinnsvis er det også tilstede en bærer i vaksine preparatet i følge oppfinnelsen. Bæ-reren kan være en olje i vann emulsjon, eller et aluminium salt, slik som aluminium fosfat eller aluminium hydroksid.

En foretrukken olje i vann emulsjon omfatter en metaboliserbar olje, slik som squalene, alfa-tokoferol og Tween 80.1 et særskilt foretrukket aspekt blir antigenene i vaksine-preparatene i følge oppfinnelsen kombinert med QS21 og 3D-MPL i en slik emulsjon. Tradisjonelt kan emulsjonen olje i vann inneholde Span 85 og/eller lecitin og/eller tri-kaprylin.

Typisk for human administrering vil QS21 og 3D-MPL i en vaksine foreligge i området 1 iig-200p,g, slik som 10-lOOug, fortrinnsvis 10p.g-50u.gper dose. Typisk vil olje i vann omfatte fra 2 til 10% squalene, fra 2 til 10% alfa-tokoferol og fra 0.3 til 3% Tween 80. Fortrinnsvis er forholdet squalene:alfa-tokoferol lik med eller mindre enn 1 i det dette frembringer en mer stabil emulsjon. Span 85 kan også foreligge i et nivå på 1%. I noen tilfeller kan det være fordelaktig at vaksinene i følge den foreliggende oppfinnelse dessuten inneholder en stabilisator.

Ikke-giftige emulsjoner av olje i vann inneholder fortrinnsvis en ikke-giftig olje, eksempelvis squalane eller squalene, en emulgator, eksempelvis Tween 80, i en vandig bærer. Den vandige bærer kan eksempelvis være fosfat bufferet salin.

En særskilt potent adjuvans formulering som involverer QS21,3D-MPL og tokoferol i enulsjon olje i vann er beskrevet i W095/17210.

Den foreliggende oppfinnelse frembringer også et polyvalent vaksine preparat som omfatter en vaksine formulering i følge oppfinnelsen i kombinasjon med andre antigener, særskilt antigener som er egnet til behandling av kreft, autoimmun sykdommer og be-slektede tilstander. Et slikt polyvalent vaksine preparat kan inkludere et TH-1 induse-rende adjuvans som beskrevet i det foregående.

Selv om oppfinnelsen har vært beskrevet under henvisning til visse BASB020 polypeptider og polynukleotider, skal dette oppfattes dithen at dette dekker fragmenter av de naturlig forekommende polypeptider og polynukleotider, og lignende polypeptider og poynukleotider med addisjoner, strykninger eller substitusjoner som ikke i det vesentlige påvirker de immunogene egenskaper til de rekombinante polypeptider eller polynukleotider.

Preparater, kit og administrering

I et ytterligere aspekt av oppfinnelsen er det frembragt preparater som omfatter et BASB020 polynukleotid og/eller et BASB020 polypeptid for administrering til en celle eller til en multicellulær organisme.

Oppfinnelsen vedrører også preparater som omfatter et polynukleotid og/eller et polypeptid som diskutert heri eller deres agonister eller antagonister. Polypeptidene og polynukleotidene i følge oppfinnelsen kan benyttes i kombinasjon med en ikke-steril eller steril bærer eller bærere til anvendelse sammen med celler, vev eller organismer, slik som en farmasøytisk bærer som er egnet for administrering til et individ. Slike preparater omfatter eksempelvis et media additiv eller en terapeutisk virksom mengde av et polypeptid og/eller polynukleotid i følge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens. Slike bærere kan inkludere, men er ikke begrenset til, salin, buffret salin, dekstrose, vann, glyserol, etanol og kombinasjoner derav. Formuleringen burde passe til administreringsmodusen. Oppfinnelsen vedrører videre diagnostiske og farmasøytiske pakninger og kit som omfatter en eller flere beholdere hvilke er fylt med en eller flere av bestanddelene for de før nevnte preparater i følge oppfinnelsen.

Polypeptider, polynukleotider og andre forbindelser i følge oppfinnelsen kan benyttes alene eller i samband med andre forbindelser, slik som terapeutiske forbindelser.

De farmasøytiske preparater kan administreres på en effektiv, bekvem måte som eksempelvis inkluderer administrering ved topiske, orale, anale, vaginale, intravenøse, interaperitoniale, intramuskulære, subkutane, intranasale eller intradermale ruter blant annet.

I terapi eller som et profylaktikum, kan det virksomme agens administreres til et individ i form av et injiserbart preparat, eksempelvis som en steril vandig dispersjon, fortrinnsvis isotonisk.

I et ytterligere aspekt frembringer den foreliggende oppfinnelse farmasøytiske preparater som omfatter en terapeutisk virksom mengde av et polypeptid og/eller polynukleotid, slik som den løselige form av et polypeptid og/eller polynukleotid i følge den foreliggende oppfinnelse, agonist- eller antagonist- peptid eller småmolekyl-forbindelse, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipiens. Stike bærere inkluderer, men er ikke begrenset til, salin, buffret salin, dekstrose, vann, glyserol, etanol og kombinasjoner derav. Oppfinnelsen vedrører videre farmasøytiske pakninger og kit som omfatter en eller flere beholdere hvilke er fylt med en eller flere av bestanddelene til de før nevnte preparater i følge oppfinnelsen. Polypeptider, polynukleotider og andre forbindelser i følge den foreliggende oppfinnelse kan benyttes alene eller i samband med andre forbindelser, slik som terapeutiske forbindelser.

Preparatet vil være tilpasset til administreirngsruten, eksempelvis ved en systemisk eller en oral rute. Foretrukne former for systemisk administrering inkluderer injeksjon, typisk ved intravenøs injeksjon. Andre injeksjonsruter, slik som subkutan, intramuskulær eller intraperitonial, kan benyttes. Alternative anordninger for systemisk administrering inkluderer transmukosal og transdermal administrering ved anvendelse av penetranter slik som gallesyre salter eller fusidinsyrer eller andre detergenter. Dessuten, dersom et polypeptid eller andre forbindelser i følge den foreliggende oppfinnelse kan formuleres i en enterisk eller en inkapslet formulering, kan oral administrering også være mulig. Administrering av disse forbindelser kan også være topisk og/eller lokalisert, i form av salver, pastaer, geler, løsninger, pulvere og lignende.

For administrering til pattedyr, og særskilt mennesker, forventes det at det daglige dose-ringsnivå av det aktive agens vil være fra 0.01 mg/kg til 10 mg/kg, typisk rundt 1 mg/kg. Legen vil i ethvert tilfelle bestemme den faktiske dosering som vil være mest egnet for et individ og vil variere med alder, vekt og det bestemte individs respons. De ovenstående doseringer er eksempelvise for det gjennomsnittlige tilfellet. Det kan selv-følgelig forekomme individuelle tilfeller hvor høyere eller lavere doseringsområder er på sin plass, og slike befinner seg innenfor rekkevidden av den foreliggende oppfinnelse.

Det påkrevde doseringsområdet avhenger av valget av peptid, administreirngsruten, formuleringens type, subjektets type tilstand, og av den praktiserende lege. Egnede doseringer befinner seg imidlertid innen området 0.1-100 jig/kg for subjektet.

Et vaksinepreparat er bekvemt i injiserbar form. Konvensjonelle adjuvanser kan benyttes for å forbedre immunresponsen. En egnet enhetsdose for vaksinasjon er 0.5-5 ug/kg antigen, og en slik dose administreres fortrinnsvis 1-3 ganger og med et intervall på 1-3 uker. Med det indikerte doseområdet, vil ingen skadelige toksikologiske virkninger bli observert med forbindelsen i følge oppfinnelsen, noe som ville foregrepet deres administrering til egnede individer.

Brede variasjoner i den dosering det er behov for bør imidlertid forventes tatt i betrakt-ning utvalget av tilgjengelige forbindelser og de ulike effektiviteter av ulike administre-ringsruter. Eksempelvis vil oral administrering kunne forventes å kreve høyere doseringer enn admMstrering ved intravenøs injeksjon. Variasjoner i disse doseringsnivåer kan justeres ved anvendelse av vanlige empiriske rutiner for optimalisering, slik det er velkjent innen faget.

Sekvensdatabaser, sekvenser i et håndgripelig medium, og algoritmer

Polynukleotid og polypeptid sekenser danner en verdifull informasjonsressurs til bestemmelse av deres 2- og 3-dimensjonale strukturer så vel som for å identifisere ytterligere sekvenser av lignende homologi. Disse tilnærmelser lettes mest ved å lagre sekvensene i et datamaskin-lesbart medium og deretter benytte de lagrede data i et kjent mak-romolekylærstruktur-program eller å søke i en sekvens database ved anvendelse av velkjente søkeverktøy, slik som GCG-programpakken.

Fremgangsmåter for analyse av bokstav sekvenser eller strenger, særskilt genetiske sekvenser eller kodede protein sekvenser er viktig. Særlig fremgangsmåter for sekvens analyse inkluderer eksempelvis fremgangsmåter for sekvens homologi-analyse slik som identitets- og similaritets analyse, DNA-, RNA- og proteinstruktur analyse, sekvens sammensetning, kladistisk analyse, sekvens motivanalyse, åpen leseramme- bestemmelse, nukleinsyre-basepåkalling, kodon anvendelses-analyse, nukleinsyre-basetrimming, og toppanalyse av sekvenserings-kromatogram.

En datamaskinbasert fremgangsmåte for gjennomføring av homologi identifikasjon. Denne fremgangsmåte omfatter følgende trinn: frembring en første polynukleotid sekvens som omfatter sekvensen for et polynukleotid i følge oppfinnelsen i et datamaskin-lesbart medium; og sammenlign den første polynukleotid sekvens med i det minste en andre polynukleotid- eller polypeptid sekvens for å identifisere homologi.

En datamaskinbasert fremgangsmåte for gjennomføring av homologi identifikasjon, i det fremgangsmåten omfatter følgende trinn: frembring en første polypeptid sekvens som omfatter sekvensen for et polypeptid i følge oppfinnelsen i et datamaskin-lesbart medium; og sammenlign den første polypeptid sekvens med i det minste en andre polynukleotid- eller polypeptid sekvens for å identifisere homologi.

Definisjoner

"Identitet", er slik det er kjent i faget, en relasjon mellom to eller flere polypeptid sekvenser eller to eller flere polynukleotid sekvenser, avhengig av tilfellet, som bestemt ved sammenligning av sekvensene. Innen faget betyr "identitet" også den grad av sek-vensrelasjon mellom polypeptid og polynukleotid sekvenser, avhengig av tilfellet, som bestemt ved matchingen mellom strenger av slike sekvenser. "Identitet" kan med letthet beregnes ved kjente fremgangsmåter, inklusive men ikke begrenset til de som er beskrevet i { Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis ofSequence Data, Part L, Griffin, A.M., og Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press, 1987; og Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. og Devereux, J., red., M Stockton Press, New York, 1991; og Carillo, H., og Lipman, D., SIAM J. AppliedMath., 48: 1073 (1988). Fremgangsmåter til bestemmelse av identitet er utformet for å gi den største match mellom de testede sekvenser. Videre blir fremgangsmåter for å bestemme identitet kodet i offentlig tilgjengelige datamaskin programmer. Datamaskin programmetoder for å bestemme identitet mellom to sekvenser inkluderer, men er ikke begrenset til GAP-programmet i GCG-programpakken (Devereux, J., et al., NucleicAcids Research 12( 1) : 387 (1984)), BLASTP, BLASTN (Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215:403-410 (1990), og FASTA (Pearson og Lipman Proe. Nati. Acad. Sei. USA 85; 2444-2448 (1988). Pro-

gram familien BLAST er offentlig tilgjengelig fra NCBI og andre kilder ( BLASTManu-al, Altschul, S., et al, NCBINLM NTH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al, J. Mol Biol. 215: 403-410 (1990). Den velkjente Smith Waterman algoritme kan også benyttes for å bestemme identitet.

Parametere for sammenligning av polypeptid sekvens inkluderer det følgende: Algoritme: Needleman og Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)

Sammenhgnings matrise: BLOSSUM62 fra Henikoff og Henikoff,

Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:10915-10919 (1992)

Gap straff (gap penalty): 8

Gap lengde straff: 2

Et program som er egnet med disse parametre er offentlig tilgjengelig som "gap"-programmet fra Genetics Computer Group, Madison WL USA. De før nevnte parametere er normal parametrene for peptid sammenligninger (sammen med ingen straff for ende gap).

Parametere for polynukleotid sammenligning inkluderer de følgende:

Algoritme: Needleman og Wunsch, J. Mol Biol. 48:443-453 (1970)

Sammenlignings matrise: matcher = + 10, manglende match = 0

Gap straff (gap penalty): 50

Gap lengde straff: 3

Tilgjengelig som: "Gap"-programmet fra Genetics Computer Group, Madison WI, USA. Disse er normal parametrene for nukleinsyre sammenligninger.

En foretrukken betydning av "identitet" for polynukleotider og polypeptider, avhengig av tilfellet, er frembragt i (1) og (2) i det følgende.

(1) Polynukleotid inkluderer videre et isolert polynukleotid som omfatter en polynukleotid sekvens med minst 50,60,70,80, 85,90,95,97 eller 100% identitet med referanse sekvensen SEQ ID NO:l, hvori polynukleotid sekvensen kan være identisk med referanse sekvensen fra SEQ ID NO:l eller kan inkludere opp til et visst heltall av nukleotid endringer som sammenlignet med referanse sekvensen, hvori endringene utvelges fra den gruppe som består av minst en nukleotid sletting, substitusjon, inklusive transisjon og transversjon, eller innskudd, og hvori endringene kan opptre i de 5' eller 3' terminale posisjoner for referanse nukleotid sekvensen eller hvor som helst mellom disse terminale posisjoner, blandet inn enten individuelt blant nukleotidene i referanse sekvensen eller i en eller flere sammenhengende grupper innen referanse

sekvensen, og hvori antallet nukleotid endringer bestemmes ved å multiplisere totalan-tallet nukleotider i SEQ ID NO: 1 med det heltall som definerer den prosentvise identitet delt på 100 og deretter subtrahere vedkommende produkt fra det totale antall nukleotider i SEQ ID NO: 1, eller: hvori nn er antallet nukleotid endringer, xner det totale antall nukleotider i SEQ JD NO:l, y er 0.50 for 50%, 0.60 for 60%, 0.70 for 70%, 0.80 for 80%, 0.85 for 85%, 0.90 for 90%, 0.95 for 95%, 0.97 for 97% eller 1.00 for 100%, og • er symbolet for multiplikasjons operatoren, og hvori ethvert ikke-heltalls produkt av xnog y avrundes nedover til det nærmeste heltall forut for at det subtraheres fra xn. Endringer av en polynukleotid sekvens som koder for polypeptidet fra SEQ ID NO:2 kan danne meningsløse, feilaktige eller rammeskift-mutasjoner i denne kodings sekvens og derved endre det polypeptid som kodes for av polynukleotidet etter slike endringer. Som et eksempel, kan polynukleotid sekvensen i følge den foreliggende oppfinnelse være identisk med referanse sekvensen fra SEQ ID NO:l, det vil si den kan være 100% identisk, eller den kan inkludere opptil et visst heltall nukleinsyre endringer sammenlignet med referanse sekvensen slik at den prosentvise identitet er mindre enn 100% identitet. Slike endringer utvelges fra den gruppe som består av minst en nukleinsyre sletting, substitusjon, inklusive transisjon og transversjon, eller innskudd, og hvori endringer kan opptre i de 5' eller 3' terminale posisjoner av referanse-polynukleotid sekvensen eller hvor som helst mellom disse terminale posisjoner, blandet inn enten individuelt blant nukleinsyrene i referanse sekvensen eller i en eller flere sammenhengede grupper innen referanse sekvensen. Antallet nukleinsyre endringer for en gitt prosentandel identitet bestemmes ved å multiplisere det totale antall nukleinsyrer i SEQ ID NO: 1 med det heltall som definerer den prosentvise identitet delt på 100 og deretter subtrahere det produkt fra det totale antall nukleinsyrer i SEQ ID NO:l, eller: hvori nn er antallet nukleinsyre endringer, x„ er det totale antall nukleinsyrer i SEQ ID NO:l, y er eksempelvis 0.70 for 70%, 0.80 for 80%, 0.85 for 85% etc., • er symbolet for multiplikasjons operatoren, og hvori ethvert ikke-heltalls produkt av x„ og y avrundes nedover til det næreste heltall forut for at det subtraheres fra xn. (2) Polypeptid inkluderer videre et isolert polypeptid som omfatter et polypeptid med minst 50, 60,70, 80, 85,90,95,97 eller 100% identitet med enpoly-peptid-referanse sekvens i følge SEQ ID NO:2, hvori polypeptid sekvensen kan være identisk med referanse sekvensen for SEQ ID NO:2 eller kan inkludere opptil et visst heltall aminosyre endringer sammenlignet med referanse sekvensen, hvori endringene utvelges fra den gruppe som består av i det minst en aminosyre sletting, substitusjon, inklusive konservative og ikke-konservative subtitusjoner, eller innskudd, og hvori endringene kan opptre i de amino- eller l^boksy-terminale posisjoner på referanse-polypeptid sekvensen eller hvor som helst mellom disse terminale posisjoner, blandet inn enten individuelt blant aminosyrene i referanse sekvensen eller i en eller flere sammenhengende grupper innen referanse sekvensen, og hvori antallet aminosyre endringer bestemmes ved å multiplisere det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:2 med det heltall som definerer den prosentvise identitet delt på 100 og deretter subtrahere dette produkt fra det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:2, eller:

hvori na er antallet aminosyre endringer, xaer det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:2, y er 0.50 for 50%, 0.60 for 60%, 0.70 for 70%, 0.80 for 80%, 0.85 for 85%, 0.90 for 90%, 0.95 for 95%, 0.97 for 97% eller 1.00 for 100%, og • er symbolet for multiplikasjons operatoren, og hvori ethvert ikke-heltalls produkt avXaog y avrundes nedover til det nærmeste heltall før det subtraheres fra xa.

Som eksempel kan en polypeptid sekvens i følge den foreliggende oppfinnelse være identisk med referanse sekvens SEQ ID NO:2, det vil si den kan være 100% identisk, eller den kan inkludere opptil et bestemt heltall aminosyre endringer sammenlignet med referanse sekvensen slik at den prosentvise identitet er mindre enn 100% identitet. Slike endringer utvelges fra den gruppe som består av i det minste en aminosyre strykning, substitusjon, inklusive konservativ og ikke-konservativ substitusjon eller innskudd, og hvori endringene kan opptre i de amino- eller karboksy-terminale posisjoner hos referanse-polypeptid sekvensen eller hvor som helst mellom disse terminale posisjoner, blandet inn enten individuelt blant aminosyrene i referanse sekvensen eller i en eller flere sammenhengende grupper innen referanse sekvensen. Antallet aminosyre endringer for en gitt prosent identitet bestemmes ved å multiplisere det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:2 med det heltall som definerer den prosentvise identitet delt på 100 og deretter subtrahere dette produkt fra det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:2, eller: hvori Da er antallet aminosyre endringer, xaer det totale antall aminosyrer i SEQ ID NO:2, y er eksempelvis 0.70 for 70%, 0.80 for 80%, 0.85 for 85% etc,, og • er symbolet for multiplikasjons operatoren, og hvori ethvert ikke-heltalls produkt av xaog y avrundes nedover til det nærmeste heltall før det subtraheres fraXa.

"Individ(er)", betyr ved anvendelse heri under henvisning til en organisme, en flercellet eukaryote, inklusive, men ikke begrenset til en metazoe, et pattedyr, et ovid, et bovid, en ape, en primat, og et menneske.

"Isolert" betyr endret "ved menneskehånd" fra dets naturlige tilstand, det vil si dersom det opptrer i naturen, har det blitt endret eller fjernet fra dets opprinnelige miljø, eller begge deler. Eksempelvis er et polynukleotid eller et polypeptid som naturlig er tilstede i en levende organisme ikke "isolert", men det samme polynukleotid eller polypeptid som separert fra de ko-eksisterende materialer i dets naturlige tilstand er "isolert", slik

termen benyttes heri. Videre er et polynukleotid eller polypeptid som er introdusert inn i en organisme ved transformasjon, genetisk manipulasjon eller ved enhver annen rekombinant metode "isolert" selv om det fremdeles foreligger i organismen, i det organismen kan være levende eller ikke-levende.

"Polynukleotid(er)" viser generelt til et polyribonukleotid eller polydeoksyribonukleo-tid, som kan være umodifisert RNA eller DNA eller modifisert RNA eller DNA inklusive enkelt-trådede og dobbelt-trådede regioner.

"Variant" viser til et polynukleotid eller polypeptid som adskiller seg fra et referanse-polynukleotid eller -polypeptid, men beholder essensielle egenskaper. En typisk variant av et polynukleotid adskiller seg i nukleotid sekvens fra et annet, referanse polynukleotid. Endringer i variantens nukleotid sekvens kan eller kan ikke endre aminosyre sekvensen for et polypeptid som kodes for av referanse polynukleotidet. Nukleotid endringer kan resultere i aminosyre substitusjoner, addisjoner, strykninger, fusjoner og trunkeringer i det polypeptid skodes for av referanse sekvensen som diskutert i det føl-gende. En typisk variant av et polypeptid adskiller seg i aminosyre sekvens fra et annet, referanse polypeptid. Generelt er forskjeller begrenset slik at sekvensene for referanse polypeptidet og varianten er svært nær lignende samlet sett og, i mange regioner, identiske. En variant og et referanse polypeptid kan adskille seg i aminosyre sekvens med en eller flere substitusjoner, addisjoner, strykninger i enhver kombinasjon. En substituert

eller innskutt aminosyre rest kan eller kan ikke være en som kodes for av den genetiske kode. En variant av et polynukleotid eller polypeptid kan være et naturlig forekommende slik som en alletisk variant, eller den kan være en variant som er velkjent og opptrer naturlig. Dcke-naturlig forekommende varianter av polynukleotider og polypeptider kan frembringes ved mutagenese teknikker eller ved direkte syntese.

"Sykdom(er)" betyr enhver sykdom som forårsakes av eller er relatert til infeksjon av en bakterie, inklusive eksempelvis otitis media i spedbarn og barn, pneumoni hos eldre, sinusitt, nosocomiale infeksjoner og invasive sykdommer, kronisk otitis media med hør-selstap, va^keansamling i mellomøret, hørselsnerveskade, forsinket tdeinnlæring, infeksjon av øvre luftvei og inflammasjon av mellomøret.

EKSEMPLER:

Eksemplene i det følgende er utført ved anvendelse av vanlige teknikker, hvilke er velkjente og rutinemessige for fagfolk, bortsett fra der det på annen måte er beskrevet i detalj.

Eksempel 1:

Oppdagelse og bekreftende DNA sekvensering av BASB020 genet fra Moraxella catarrhalis stamme ATCC 43617.

BASB020 genet i følge SEQ ID NO:l ble først oppdaget i databasen Incyte PathoSeq som inneholder uferdige genomiske DNA sekvenser fra Moraxella catarrhalis stamme ATCC 43617 (også betegnet som stamme Mc2931). Translateringen av BASB020 polynukleotid sekvensen, som vist i SEQ ID NO:2, viste signifikant similaritet (36% identitet i en 227 aminosyrers overlapping) med TlyC hemolysin proteinet fra Serpulina hyodysenteriae.

Sekvensen fra BASB020 genet ble ytterligere bekreftet eksperimentelt. Til dette formål ble genomisk DNA ekstrahert fra IO<10>celler av M. catarrhalis celler (stamme ATCC 43617) ved anvendelse av QIAGEN genomisk DNA-ekstraksjons kit (Qiagen Gmbh), og 1 u-g av dette materialet ble underlagt polymerase kjede reaksjon DNA-amplifikasjon ved anvendelse av primere E475781a (5'- ACT TGA ATA AAA CCG AGT G-3')

[SEQIDNO:9] og E475782a (5'- GAC ATT GGC CGC AAC ATG C-3')

[SEQ1DNO:10]. Dette PCR produkt ble renset på et Biorobot 9600 (Qiagen Gmbh) ap-parat og underlagt DNA sekvensering ved anvendelse av Big Dye Cycle Sequencing kit

(Perkin-Elmer) og en ABI377/PRISM DNA-sequencer. DNA sekvensering ble utført på begge tråder med en redundans på 2 og full lengdes sekvens ble satt sammen ved anvendelse av Sequencher™ programvare (Applied Biosystems). Den resulterende DNA sekvens viste seg å være 100% identisk med SEQ ID NO: 1.

Eksempel 2:

Variabilitets analyse av BASB020 genet blant Uere Moraxella catarrhalis- stnmmer.

2A: Restriksjons fragment- lengde analyse fRFLP).

Genomisk DNA ble ekstrahert fra 16 M. catarrhalis stammer (presentert i tabell 1) som beskrevet i det følgende. M. catarrhalis ble strøket for enkeltstående kolonier på BHI agar skåler og dyrket over natten ved 37°C. Tre eller fire enkeltstående kolonier ble plukket ut og benyttet for å inokkulere en~1.5 ml BHI (Hjerne-hjerte infusjon) —kraft såkultur som ble dyrket over natten i en rysteinkubator,~300 omdrYmin., ved 37°C. En 500 ml erlenmeyer kolbe som inneholdt~150 ml BHI-kraft ble inokklulert med såkulturen og dyrket i~12-16 timer ved 37°C i en risteinkubator,~75 omdr./min./minutt, for å generere cellemasse for DNA isolasjon. Celler ble oppsamlet ved sentrifugering i en Sorvall GSA rotor ved~2000 X g i 15 minutter ved romtemperatur. Supernatanten ble fjernet og celle pelleten ble suspendert i~5.0 ml sterilt vann. Et tilsvarende volum av lyse buffer (200 mM NaCl, 20 mM EDTA, 40 mM Tris-Hcl, pH 8.0, 0.5% (w/v) SDS, 0.5% (v/v) 2-merkaptoetanol, og 250 u-g/rnl proteinase K) ble tilsatt og cellene ble suspendert ved forsiktig agitering og triturering. Celle suspensjonen ble deretter inkubert~12 timer ved 50°C for å lyse bakteriene og frigjøre kromosomalt DNA. Protein-holdig materiale ble utfelt ved tilsats av 5.0 ml mettet NaCl (~6.0 M, i sterile vann) og sentrifugering ved~5,500xg i en Sorvall SS34 rotor ved romtemperatur. Kromosomalt DNA ble utfelt fra den klarnede supernatant ved tilsats av to volumer 100% etanol. Aggregert DNA ble oppsamlet og vasket ved anvendelse av forsiktig agitering i et lite volum av 70% etanol-Iøsning. Resent kromosomalt DNA ble suspendert i sterilt vann og tillatt å oppløses/utfoldes over natten ved 4°C under forsiktig vugging. Konsentrasjonen av opp-løst DNA ble bestemt spektrofotometrisk ved 260 nm ved anvendelse av en utsluknings koffisientpå 1.0 O.D. enhet-50 pg/ml.

Dette materialet ble deretter underlagt PCR amplifisering ved anvendelse av MC-Hly3-BamF (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT

AGG CGT TGG TTA TCC ACC G-3') [SEQ ID NO:ll] og MC-Hly3-SalRC (5'-AAG

GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG

CTG TGG TAT CAG -3') [SEQ ID NO: 12] oligonukleotider. De tilsvarende BASB020 gene amplikoner ble deretter underlagt uavhengig hydrolyse ved anvendelse av restriksjons enzymer ( Acil, Ålul, HphI, Msel, Nlalll, Tsp5091) og restriksjonsprodukter ble adskilt ved agarose- eller polyakrylamid-gel elektroforese ved anvendelse av vanlige molekylære biologi prosedyrer som beskrevet i "Molekylær kloning, en laboratorie manual, andre utgave, redaktører, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989". Fotografiene av de resulterende elektroforese geler er vist frem i figur 1. For hver stamme ble RFLP-mønstre som svarer til de 6 restriksjons enzymer skåret og kombinert. Grupper av stammer som deler identisk kombinasjon av RFLP-mønstre ble deretter definert. Ved anvendelse av denne metodologi, falt de stammer som ble testet i denne studie i 6 genomiske grupper ( Gruppe 1: Mc2904, Mc2905, Mc2906, Mc2969; Gruppe 2: Mc2907, Mc2913; Gruppe 3: Mc2908, Mc2909, Mc2931, Mc2975; Gruppe 4: Mc2910, Mc2912, Mc2956; Gruppe 5: Mc2911; Gruppe 6: Mc2926). Disse data støt-ter at Moraxella catarrhalis- populasjonea som benyttet i denne studie fremviser noen grad av nukleotid sekvens-diversitet for BASB020 genet.

2B: DNA sekvensering i andre stammer.

Stammen ATCC 43617 (Mc2931) som ble benyttet for å bestemme BASB020 sekvensen ble klassifisert ved RFLP i gruppe nummer 3. Ved anvendelse av eksperimentell prosedyre som beskrevet i eksempel 1, ble sekvensen for BASB020 genet også bestemt for Moraxella catarrhalis stammer som er representative for de tre andre RFLP genomiske grupper ( Gr. l (Mc2969), Gi\2 (Mc2913) og Gl4 (Mc2912)). Polynukleotid sekvensene til BASB020 genet for stammene Mc2912, Mc2913 og Mc2969 er vist i SEQ ID NO: henholdsvis 3,5 og 7. Disse polynukleotid sekvenser ble translatert over i aminosyre sekvenser, noe som er vist i SEQ ID NO: henholdsvis 4,6 og 8. Ved anvendelse av MegAlign-programmet fra DNASTAR Lasergene pakken, ble en multipel innretning av polynukleotid sekvensene fra SEQ ID NO: 1,3, 5 og 7 utført, og er vist i figur 2. En parvis sammenligning av identiteter er oppsummert i tabell 2, noe som viser at de fire BASB020 nukleotid gen sekvenser alle er lignende ved identitetsnivå som svarer til eller er større enn 99%. Ved anvendelse av det samme program, ble en multipel innret-ting av polypeptid sekvensene fra SEQ ID NO:2,4,6 og 8 utført, og er fremvist i figur 3. En parvis sammenligning av identiteter er oppsummert i tabell 3, noe som viser at de fire BASB020 protein sekvenser alle ligner på hverandre ved et identitetsnivå som svarer til eller er større enn 99%.

Eksempel 3: Konstruksjon av plasmid for å uttrykke rekombinant BASB020

A: Kloning av BASB020,

BamHl og Sali restriksjonssetene som ble manipulert inn i de fremoverrettede ([SEQ ID NO:ll]) og reverserte ([SEQ ID NO: 12]) amplifikasjons primere, tillot retningsmessig kloning av det 504 bp PCR produkt inn i det kommersielt tilgjengelige E. coli ekspresjons plasmid pQE30 (QiaGen, ampicilllin resistent) slik at et modent BASB020 protein kunne uttrykkes som et fusjonsprotein som inneholdt en (His)6 affinitets kromatografi-etikett ved N-terrninus. BASB020 PCR produktet ble renset fra amplikasjons-reaksjonen ved anvendelse av silika gel-baserte spinn kolonner (QiaGen) i følge produ-sentens instruksjoner. For å produsere de påkrevde BarnHI og Sali termini som var nød-vendige for kloning, ble renset PCR produkt sekvensielt digerert til fuUførelse med BamHI og Sali restriksjons enzymer som anbefalt av produsenten (Life Technologies). Etter den første restriksjons kuttingen, ble PCR produktet renset via spinn kolonne som i det foregående til fjerning av salter og eluert i sterilt vann forut for den andre enzym kuttingen. Det kuttede DNA fragment ble igjen renset ved anvendelse av silika gel-baserte spinn kolonner forut for ligering med pQE30 plasmidet.

B: Produksjon av ekspresjons vektor.

For å preparere ekspresjonsplasmidet pQE30 for ligering, ble det på lignende måte digerert til fullførelse med både BamRl og Sali og deretter behandlet med kalvs innholds fosfatase (CIP, -0.02 enheter / pmol fra 5' ende, Life Technologies) som vist av produsenten for å forebygge selv ligering. Et cirka 5-ganger molart overskudd av det kuttede fragment i forhold til den preparerte vektor ble benyttet for å programmere ligeringsre-aksjonen. En vanlig -20 pl ligeringsreaksjon (~16°C, -16 timer), ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente innen faget, ble utført ved anvendelse av T4 DNA liganse (—2.0 enheter / reaksjon, Life Technologies). En alikvot fra ligeringen (-5 ml) ble benyttet for å overføre elektrokompetente M15(pREP4) celler i følge fremgangsmåter som er velkjent innen faget. Etter en -2-3 timers fremvekstperiode ved 3 7°C i —1.0 ml LB kraft, ble transformerte celler platet ut på LB agar skåler som inneholdt kanamycin (50 ug/ml) og ampicillin (100 pg/ml). Begge antibiotika ble inkludert i seleksjons-mediet for å sikre at alle transformerte celler bar både pREP4 plasmidet (KnR), som bærer det laclq gen som er nødvendig for undertrykkelse av ekspresjon for IPTG-induserbar ekspresjon av proteiner på pQE30, og pQE30-BASB020 plasmid (ApR). Skåler ble inkubert over natten ved 37°C i -16 timer. Individuelle KnR/ApR kolonier ble plukket med sterile tannpirkere og benyttet for å "lappe" inokkulerte friske LB KnR/ApR skåler så vel som ~1.0 ml LB KnR/ApR kraft kultur.

Både lappeskålene og kraft kulturen ble inkubert over natten ved 37°C i enten en vanlig inkubator (skåler) eller et ristevannbad.

En helcelle-basert PCR analyse ble benyttet for å verifisere at transformanter inneholdt BASB020 DNA-innskuddet. Her ble~1.0 ml over natten LB Kn/Ap kraft kultur over-ført til et 1.5 ml polypropylen rør og cellene ble oppsamlet ved sentrifugering i en Beckman mikrosentrifuge (—3 minutter, romtemperatur, -12,000 X g). Celle pelleten ble suspendert i -200 ul sterilt vann og en -10 jul alikvot ble benyttet for å programmere en -50 ul sluttvolums PCR reaksjon som inneholdt både BASB020 fremoverrettede og reverse amplifikasjons primere. Endelige konsentrasjoner av PCR-reaksjonskomponentene var i det vesentlige de samme som de som er spesifisert i eksempel 2 bortsett fra at -5.0 enheter av 7/ag-polymerase ble benyttet. Det innledningsvise 95°C denamreringstrinnble økt til 3 minutter for å sikre termisk opprivning av bakte-riecellene og frigjøring av plasmid DNA. En ABI modell 9700 termisk cykler og en 32 cyklers, tre-trinns termisk amplifikasjons profil, det vil si 95°C, 45 sek.; 55-58°C, 45 sek.; 72°C, 1 min., ble benyttet for å amplifisere MC-P6 PCR fragmentet fra de lysede transformantprøver. Etter termisk amplifisering, ble en -20 ul alikvot fra reaksjons-blandingen analysert ved agarose-gel elektroforese (0.8% agarose i en Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer). DNA fragmenter ble visualisert ved opplysing etter gel elektroforese og etidium bromid-farging. En molekylær DNA størrelses standard (1 Kb stige, Life Technologies) ble elektroforert i parallell med testprøvene og ble benyttet for å estimere PCR produktenes størrelse. Transformanter som frembragte det forventede 504bp PCR produkt ble identifisert som stammer inneholdende et BASB020 ekspresjons konstrukt. Ekspresjons plasmid som inneholdt stammer ble deretter analysert med hensyn til induserbar ekspresjon av rekombinant BASB020.

C: Ekspresjons analyse av PCR- positive transformanter.

For hver PCR-positiv transformant som identifisert i det foregående, ble —5.0 ml LB kraft som inneholdt kanamycin (50 pg/ml) og ampicillin (100 |xg/ml) inokkulert sammen med celler fra lappeskålen og dyrket over natten ved 37°C under rysting (-250 omdrYmin.). En alikvot av såkulturen (-1.0 ml) fra over natten ble inokkulert over i en 125 ml erlenmeyer kolbe som inneholdt~25 ml LB Kn/Ap kraft og dyrket ved 37°C under rysting (-250 omdr./min.) inntil kulturens turbiditet nådde O.D.600 fra -0.5, det vil si midtre loggfase (vanligvis cirka 1.5 til 2 timer). På dette tidspunkt ble cirka halv-parten av kulturen (-12.5 ml) overført til en andre 125 ml kolbe og ekspresjon av rekombinant BASB020 protein ble indusert ved tilsats av ff TG (1.0 M ferdiglaget frem stilt i sterilt vann, Sigma) til en sluttkonsentrasjon på 1.0 mM. Inkubasjon av både de IPTG induserte og ikke-induserte kulturer fortsatte i ytterligere~4 timer ved 37°C under rysting. Prøver (~1.0 ml) av begge induserte og ikke-induserte kulturer ble fjernet etter inkubasjonsperioden og cellene ble oppsamlet ved sentrifugering i en mikro sentrifuge ved romtemperatur ~3 minutter. Individuelle celle pelleter ble suspendert i~50 ul sterilt vann, deretter blandet med et tilsvarende volum av 2X Laemelli SDS-PAGE prøvebuf-fer inneholdende 2-merkaptoetanol, og plassert i kokende vannbad i~3 minutter for å denaturere protein. Like store volumer (~15 ul) av både de ubearbeidede IPTG-induserte og ikke-induserte celle lysater ble lastet over på duplikat 12% Tris/glysin-polyakrylamid gel (1 mm tykke Mini-geler, Novex). De induserte og ikke-induserte Iysatprøver ble elektroforert sammen med forhåndsfargede molekylvekt markører (SeeBlue, Novex) under konvensjonelle betingelser ved anvendelse av en vanlig SDS<y>Tris/glysin løpende buffer (BioRad). Etter elektroforese, ble en gel farget med commassie brilliant blue R250 (BioRad) og deretter avfarget for å visualisere ny(e) BASB020 IPTG-induserbar(e) protein(er). Den andre gel ble elektroblottet på et PVDF membran (0.45 um porestørrelse, Novex) i~2 timer ved 4°C ved anvendelse av et Bio-Rad Mini-protean II blottingsapparat og Towbin's metanol (20%) overføringsbuffer. Blokkering av membranet og antistoff inkuberinger ble utført i følge fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Et monoklonalt anti-RGS (His)3 antistoff, fulgt av et andre kanins anti-mus antistoff som var konjugert med HRP (Qiagen), ble benyttet for å bekrefte ekspresjonen og identiteten av det B ASB020 rekombinante protein. Visualise-ringen av anti-His antistoffs reaktive mønster ble oppnådd ved anvendelse av enten et ABT uløselig substrat eller ved anvendelse av Hyperfilm med Amersham ECL kjemi-luminescens-system.

D: Sekvensbekreftelse.

For ytterligere å verifisere at det IPTG-induserbare rekombinante BASB020 protein som er uttrykt foreligger i den korrekte åpne leseramme og ikke et uønsket molekyl som stammer fra en klonings artifakt (det vil si et rammeskifte), ble det klonede innskudds DNA sekvens bestemt. DNA sekvensen for M. catarrhalis BASB020 genet ble tilveiebragt fra en tråd ved anvendelse av konvensjonelle asymmetriske PCR cyklisk sekvenserings-metodologi (ABI Prismefarge-terminator cyklus-sekvensering, Perkin-Elmer). Sekvenserings reaksjoner ble programmert med udigerert ekspresjons plasmid DNA (~ Q. 5 jxg/rxn) som mal og egnede pQE30 vektor-spesifikke og ORF-spesifikke sekvenserings primere (~3.5 pmol/rxn). I tillegg til malen og sekvenserings primeren, inneholdt hver sekvenserings reaksjon (~20 ul) de fire ulike dNTP-er (det vil si A, G, C og T) og de fire tilsvarende ddNTP-er (det vil si ddA, ddG, ddC, og ddT) terrninator nukleotider; i det hver terminator var konjugert til en av de fire fluoescerende fargestof-fer, Joe, Tam, Rox, eller Fam. Enkelt trådet sekvenserings forlengelsesprodukter ble terminert i tilfeldige posisjoner langs malen ved inkorporering av de fargestoff etiketterte ddNTP-terminatorer. Fluorescerende fargestoff etiketterte termineringsprodukter ble renset ved anvendelse av rnikrosentrifuge størrelses eksklusjons-kromatografi kolonner (Princeton Genetics), tørket under vakuum, suspendert i en Template Resuspension Buffer (Perkin-Elmer) for kapillær elektroforese eller deionisert foraiamid for PAGE, denaturert ved 95°C i~5 minutter, og analysert ved hjelp av høyresolusjons kapillær elektroforese (ABI310 Automated DNA Sequenator, Perkin-Elmer) eller høy-oppløsnings PAGE (ABI 377 Automated DNA Sequenator) som anbefalt av produsenten. DNA sekvenserings data som frembragt fra individuelle reaksjoner ble oppsamlet og de relative fluorescerende topp-intensiteter ble analysert automatisk på en Power-MAC datamaskin ved anvendelse av ABI Sequence Analysis Software (Perkin-Elmer). Individuelt autoanalyserte DNA sekvenser ble redigert manuelt med hensyn til nøyak-tighet før de ble sammensluttet i en samstemt enkelt trådet sekvens-"streng" ved anvendelse av AutoAssembler software (Perkin-Elmer). Sekvensering fastslo at ekspresjons plasmidet inneholdt den korrekte sekvens i den korrekte åpne leseramme.

Eksempel 4: Produksjon av rekombinant BASB020

Baklerieslamme

En rekombinant ekspresjons stamme av E.coli Ml 5 (pREP4) som inneholdt et plasmid (pQE30) som koder for BASB020 fra M. catarrhalis, ble benyttet for å produsere cellemasse til rensing av rekombinant protein. Ekspresjonsstammen ble dyrket på LB agar skåler som inneholdt 50 ug/ml kanamycin ("Kn") og 100 \ ig/ m\ ampicillin ("Ap") for å sikre at både pREP4 laclq kontroll plasmidet og pQE30-BASB020 ekspresjons konst-ruktet begge ble holdt ved like. For cryokonservering ved -80°C, ble stammen dyrket i LB kraft som inneholdt den samme konsentrasjon av antibiotika og deretter blandet med et tilsvarende volum av LB kraft som inneholdt 30% glyserol (vekt/volum).

Media

Fermeterings mediet som ble benyttet til produksjonen av rekombinant protein bestod av 2X YT kraft (Difco) som inneholdt 50 pg/ml Kn og 100 pg/ml Ap. Antiskum ble tilsatt til mediet for fermentoren ved 0.25 ml/L (Antifoam 204, Sigma). For å indusere ekspresjon av det rekombinante BASB020 protein, ble JPTG (Isopropyl J3-D-Tiogalaktopyranosid) tilsatt til fermentoren (1 mM, avslutning).

Fermentering

En 500-ml erlenmeyer såflaske, som inneholdt 50 ml arbeidsvolum, ble inokkulert med 0.3 ml hurtig tinet frossen kultur, eller flere kolonier fra en selektiv agar skål kultur, og inkubert i cirka 12 timer ved 37 + 1°C på en rystende plattform ved 150 omdr./min. (In-nova 2100, New Brunswick Scientific). Denne såkultur ble deretter benyttet for å inokkulere en 5-liters arbeidsvolums fermentor som inneholdt 2X YT kraft og både Kn og Ap antibiotika. Fermentoren (Bioflo 3000, New Brunswick Scientific) ble drevet ved 37 + 1°C, 0.2 - 0.4 WM luft spredning, 250 omdr./min. i Rushtom impellere. PH ble ikke kontrollert verken i kolbens såkultur eller i fermentoren. Under fermetering, varierte pH fra 6.5 til 7.3 i fermentoren. IPTG (1.0 M ferdiglaget, preparert i sterilt vann) ble tilsatt til fermentoren når kulturen nådde midtre loggaritmiske vekstområde (~0.7 O.D.600 enheter). Celler ble inkubert i 2-4 timer deretter høstet ved sentrifugering ved anvendelse av enten en 28RS Heraeus (Sepatech) eller RC5C superhastighets sentrifuge (Sorvall Instruments). Celle pasta ble lagret ved -20°C frem til bearbeiding.

Rensing

Kjernikalier og materialer

Imidazol, guanidin hydroklorid, Tris(hydroksymetyl), og EDTA (etylendiamin-tetraeddiksyre) av bioteknologi kvalitet eller bedre ble alle tilveiebragt fra Ameresco Chemical, Solon, Ohio, USA. TritonX-100 (tert-octylfenoksypolyetoksy-etanol), natrium fosfat, enbasisk, og urea var av reagens grad eller bedre og tilveiebragt fra Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, USA. Iseddik og saltsyre ble tilveiebragt fra Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, New Jersey, USA. Metanol ble tilveiebragt fra Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey. Pefabloc®SC (4-(2-aminoetyl)-benzensulfonylfluorid), Complete protease inhibitor cocktail-tabletter, og PMSF (fe-nylmetyl-sulfonylfluorid) ble tilveiebragt fra Roche Diagnostics Corporation, Indiana-polis, Indiana, USA. Bestatin, pepstatin A, og E-64 protease inhibitor ble tilveiebra<g>t fra Calbiochem, LaJolla, California, USA. Dulbecco's fosfat buffret salin (lx PBS) ble tilveiebragt fra Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland, USA. Dulbecco's fosfat buffret salin (10x PBS) ble tilveiebragt fra BioWhittaker, Walkersville, Maryland, USA. Penta-His antistoff, BSA fritt ble tilveiebragt fra QiaGen, Valencia, California, USA. Peroksidase-konjugert affinitetsren geits anti-mus IgG ble tilveiebragt fra Jackson Immuno Research, West Grove, Penn., USA. AEC enkeltstående løsning ble tilveiebragt fra Zymed, South San Francisco, California, USA. Alle andre kjemikalier var av reagens kvalitet eller bedre.

Ni-NTA Superflow plast ble tilveiebragt fra QiaGen Inc., Valencia, California, USA. Forhåndsstøpt Tris-glysin 4-20% og 10-20% polyakrylamid geler, alle fortløpende buffere og løsninger, SeeBlue forhåndsfargede standarder, MultiMark Multi-colored standarder og PVDF overføringsmembraner ble tilveiebragt fra Novex, San Diego, California, USA. SDS-PAGE Silver Stain kiter ble tilveiebragt fra Daiichi Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japan. Coomassie Stain løsning ble tilveiebragt fra Bio-Rad Laboratories, Hercules, California, USA. Acrodisc® PF 0.2 um sprøytefiltere ble tilveiebragt fra Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan, USA. GD/X 25 mm engangs injeksjons sprøytefiltere ble tilveiebragt fra Whatman Inc., Clifton, New Jersey, USA. Dialyse rør 8,000 MWCO ble tilveiebragt fra BioDesign Inc., Od New York, Carmal New York, USA. BCA Protein Assay Reagents og Snake Skin dialyse rør 3,500 MWCO ble tilveiebragt fra Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA.

Ekstraksions protokoll

Celle pasta ble tinet ved romtemperatur i 30 til 60 minutter. Fem til seks gram materiale ble veiet ut i et 50 ml engangs sentrifugerør. Til disse ble 5 ml/gram guanidin hydroklorid (Gu-HCl) buffer tilsatt (6 M guanidin hydroklorid, 100 mM natrium fosfat, enbasisk, 10 mM Tris og 0.05% Triton X-100, pH 8.0). Celle pasta ble resuspendert ved anvendelse av en PRO300D provitenskapelig homogenisator, ved % effekt i et minutt. Ekstraksjonsblandingen ble deretter plassert i romtemperatur under forsiktig agitering i 60 til 90 minutter. Etter 60 til 90 minutter ble ekstraksjonsblandingen sentrifugert ved 15,800 x g i 15 minutter (Sorvall RC5C sentrifuge 11,500 omdrVmin.). Supernatanten (Sl) ble dekantert og satt tilside for ytterligere rensing. Pelleten (Pl) ble satt til side for analyse.

Binding av BASB020 til nikkel- NTA- plast

Til Sl tilsettes tre til fire ml Ni-NTA-plast. Dette blir deretter plassert ved romtemperatur under forsiktig agitering i en time. Etter en time pakkes Sl /Ni-NTA inn i en XK16 Pharmacia-kolonne. Kolonnen blir deretter vasket med 1 M Gu-HCl buffer (IM guanidin hydroklorid, 100 mM natrium fosfat, enbasisk, 10 mM Tris og 0.05% Triton X-100, pH 8.0). Dette følges deretter av en vasking med fosfat buffer (100 mM natrium fosfat, enbasisk, 10 mM Tris og 0.05% Triton X-100, pH 6.3). Proteinet ble deretter eluert fra kolonnen med en 250 mM imidazol buffer (250 mM imidazol, 100 mM natrium fosfat, enbasisk, 10 mM Tris og 0.05% Triton X-100, pH 5.9).

Endelig formulering

BASB020 ble formulert ved dialyse over natten mot tre skiftinger av 0.1 % Triton X-100 og lx PBS, pH 7.4, for å fjerne resterende Gu-HCl og imidazol. Det rensede protein ble undersøkt og benyttet for å produsere antistoffer som beskrevet i det følgende.

Biokjemiske karakteriseringer

SDS- PAGE og Western Blot analyse

Det rekombinante rensede protein ble gjenoppløst på 4-20% polyakrylamid geler og elektroforetisk overført til PVDF membraner ved 100 V i løpet av 1 time som tidligere beskrevet (Thebaine et al. 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:4350-4354). PVDF-membranene ble deretter forbehandlet med 25 ml Dulbecco's fosfafbuffret salin som inneholdt 5% fettfri tørrmelk. Alle påfølgende inkubasjoner ble utført ved anvendelse av denne forbehandlingsbuffer.

PVDF-membraner ble inkubert med 25 ml av en 1:500 fortynning av preimmunt serum eller kanins anti-His immun serum i løpet av 1 time ved romtemperatur. PVDF-membraner ble deretter vasket to ganger med vaskebuffer (20 mM Tris buffer, pH 7.5, som inneholdt 150 mM natrium klorid og 0.05% Tween-20). PVDF-membraner ble inkubert med 25 ml av en 1:5000 fortynning av peroksidase etikettert geits anti-kanin IgG (Jackson LnmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) i 30 minutter ved romtemperatur. PVDF-membraner ble deretter vasket 4 ganger med vaskebuffer, og ble fremkalt med 3-amino-9-etylkarbazol og urea peroksid som levert av Zymed (San Francisco, CA, USA) i 10 minutter hver.

Resultatene av en SDS-PAGE (figur 4) viser et protein på cirka 32-35 kDa som renset i større grad enn 90% og som er reaktivt ovenfor et anti-RGS(His) antistoff ved western blots (figur 5) fra SDS-PAGE.

Protein sekvensering

Amino terminal aminosyre sekvensering av det rensede protein ble utført for å bekrefte produksjonen av det korrekte rekombinante protein ved anvendelse av veldefinerte kjemiske protokoller på Hewlett-Packard modell G1000A sekvenseringsmaskin med en modell 1090 LC og en Hewlett-Packard modell 241 sekvenseringsmaskin med en modell 1100 LC.

Eksempel 5: Produksjon av antisera til rekombinant BASBQ20

Polyvalente antisera som er rettet mot BASB020 proteinet ble generert ved vaksinering av to kaniner med det rensede rekombinante BASB020 protein. Hvert dyr gis samlet tre inmiuniseringer intramuskulært (i.m.) av cirka 20 pg BASB020 protein per injeksjon (begynner med komplett Freund's adjuvans og følges opp med ufullstendig Freund's adjuvans) med cirka 21 dagers intervaller. Dyr ble blodtappet forut for den første immunisering ("for-blodtappet") og på dagene 35 og 57.

Anti-BASB020 protein-titere ble målt ved en ELISA som benyttet renset rekombinant BASB020 protein (0.5 ug/fordypning). Titeren er definert som den høyeste fortynning som svarer til eller er større enn 0.1 som beregnet med den følgende ligning: gjennomsnittlig OD for to testprøver av antisera - gjennomsnittlig OD for to testprøver av buffer. Titerene etter tre immuniseringer var mellom 3000 og 8000.

Antiseraene ble benyttet som det første antistoff for å identifisere proteinet i en western blot som beskrevet i eksempel 4 i det foregående. Dette western blot viste tilstedeværelsen av anti-BASB020 antistoff i immunisert dyrs sera.

Eksempel 6: Immunologisk karakterisering

Western Blot analyse

Flere stammer av M catarrhalis inklusive ATCC 49143, og ATCC 43617, så vel som

kliniske isolater fra varierende geografiske regioner, ble dyrket på sjokolade-agar skåler i 48 timer ved 35°C i 5% CO2. Flere kolonier ble benyttet for å inokkulere 25 ml Muller Hinton kraft i en 250 ml kolbe. Kulturer ble dyrket over natten og oppsamlet ved sentrifugering. Celler ble deretter solubrisert ved suspendering av 30 jxg celler i 150 pl PAGE-prøvebuffer (360 mM Tris buffer, pH 8.8, som inneholdt 4% natrium dodecyl-sulfat og 20% glyserol), og inkubering av suspensjonen ved 100°C i 5 minutter. De so-Iubriserte celler ble gjenoppløst på 4-20% polyakrylamid geler og de separerte proteiner ble elektroforetisk overført til PVDF-membraner ved 100 V i 1 time som tidligere beskrevet (Thebaine et al. 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:4350-4354). PVDF-membranene ble deretter forbehandlet med 25 ml Dulbecco's fosfatbuffret salin som inneholdt 5% fettfri tørrmelk. Alle påfølgende inkubasjoner ble utført ved anvendelse av denne forbehandlings buffer.

PVDF-membraner ble inkubert med 25 ml av en 1:500 fortynning av preimmun serum eller kanins immun serum i 1 time ved romtemperatur. PVDF-membraner ble deretter vasket to ganger med vaskebuffer (20 mM Tris buffer, pH 7.5, inneholdende 150 mM natrium klorid og 0.05% Tween-20). PVDF-membraner ble inkubert med 25 ml av en 1:5000 fortynning av peroksidase-etikettert geits anti-kanin IgG (Jackson ImmunoRe-search Laboratories, West Grove, PA, USA) i 30 minutter ved romtemperatur. PVDF-membraner ble deretter vasket 4 ganger med vaskebuffer, og ble fremkalt med 3-amino-9-etylkarbazol og urea peroksid som levert av Zymed (San Francisco, CA, USA) i 10 minutter hver.

Et protein på cirka 32-35 kDa (som svarer til forventet molekylvekt for BASB020) som er reaktivt med antiseraet påvises i alle Moraxella stammer.

Eksempel 7: Tilstedeværelse av antistoff mot BASB020 i humane rekonvalesent-sera

Western blot analyse av renset rekombinant BASB020 ble utført som beskrevet i eksempel 4 og 6 i det foregående, bortsett fra at en pulje av humant sera fra barn som var infektert med M. catarrhalis benyttes som det første antistoff preparat. Resultater viser at antisera fra naturlig infekterte individer reagerer med et renset rekombinant protein, som vist i figur 6.

Eksempel 8: Effektivitet av BASB020- vaksine: forbedring av lungeklarering for M . catarrhalis i mus.

Den beskyttende kapasitet for renset rekombinant BASB020 protein ble testet i en musemodell. Denne musemodell er basert på analysen av lunge invasjon av M. catarrhalis etter et vanlig intranasalt angrep mot vaksinerte mus. Grupper av 6 BALB/c mus (hun-ner, 6 uker gamle) immuniseres subkutant med 100 ul vaksine som svarer til en 10 pg dose og forsterkes to uker senere. En uke etter forsterkingen, angripes musene ved drå-pevis tilførsel av 50 pl bakterie suspensjon (+/- IO<6>CFU/50 pl) inn i venstre nesebor under bedøvelse (musene bedøves med en kombinasjon av ketamin og xylazin-bedøvelse, 0.24 mg xylazin (Rompun) og 0.8 mg katamin (hnalgene)/100 pl). Mus av-lives 4 timer etter angrep og lungene fjernes aseptisk og homogeniseres individuelt. Det IoglO veide gjennomsnittlige antall CFU/lunge bestemmes ved å telle kolonier som dyrkes på Muller-Hinton agar skåler etter utplating av 20 pl av 5 serielle fortynninger av homogenatet. Det aritmetiske middel av det loglO veide middelantall CFU/lunge og standard avvikene ble beregnet for hver gruppe.

Resultatene er analysert statistisk ved anvendelse av 1-way ANOVA etter å ha antatt likhet i varians (sjekket ved Brown og Forsythe's test) og normalitet (sjekket ved anvendelse av Shapiro-Wilk test). Forskjeller mellom grupper ble analysert ved anvendelse av Dunnet test, Tukey's studentiserte områdetest (HSD) og Student-Newman-Keuls test. I disse ble eksperiment grupper av mus immunisert enten med BASB020 som adsorbert på A1P04(10 pg BASB020 på 100 pg A1P04) eller med avlivede hele celler (kwc) preparat fra M. catarrhalis stammen ATCC 43617 som adsorbert på AIPO4( 5 10<8>celler på 100 pg AIPO4) eller med 100 pg AIPO4uten antigen. Musene ble angrepet med IO<6>CFU levende M. catarrhalis stamme ATCC 43617 bakterier.

Det log 10 veide gjennomsnittstall av CFU/lunge og standard avviket 4 timer etter angrep ble beregnet for hver gruppe. Falskt immuniserte mus hadde 5.5 (+/- 0.23) log 10 CFU/lunger 4 timer etter angrep.

Preparatet med kwc induserte signifikant lunge klarning som sammenlignet med kontrollgruppen (1.74 log forskjell). BASB020 vaksine induserte en 0.62 log forskjell i lunge klarning sammenlignet med kontrollgruppen, noe som var signifikant forskjellig fra kontrollen.

En western blot ved anvendelse av renset rekombinant BASB020 protein og puljede sera fra mus som innumisert med B ASB020 protein og oppsamlet før angrep viser tilstedeværelsen av antistoff mot BASB020 protein (figur 7).

Eksempel 9: Produksjon av BASBQ20 peptider, antisera og reaktivitet derav

To korte aminosyre BASB020 spesifikke peptider, med sekvensene CNEEA WSQNRRAELSY (SEQ ID NO: 13) og YTGVAPLVDNDETV (SEQ ID NO: 14) ble produsert i laboratoriet ved anvendelse av generelt velkjente metoder. Disse peptider koblet til KLH ble benyttet for å produsere antistoffer i 12 uker gamle Specific Patho-gen Free New-Zealand hunn-kaniner. Kaninene mottok 4 injeksjoner med cirka 3 ukers intervaller av 200 pgpeptid-KLH i fullstendig (første injeksjon) eller ufullstendig (andre, tredje og fjerde injeksjoner) Freund's adjuvans. Dyrene ble blodtappet forut for den første irmnunisering og en måned etter den fjerde injeksjon.

Anti-peptid midtpunkts titere ble målt ved en ELISA ved anvendelse av frie peptider. Anti-peptid midtpunkts titre en måned etter fjerde immunisering var på over 41000. Western blots av renset rekombinant BASB020, ved anvendelse av snti-peptid antistoffer som det første antistoff, ble preparert som beskrevet i eksempel 4 og 6. Resultatene er presentert i figur 8.

Deponerte materialer

Et depositum som inneholder en Moraxella catarrhalis Catlin stamme har blitt deponert hos American Type Culture Collection (heri "ATCC") 21. Juni 1997 og tildelt deponerings nummer 43617. Depositumet ble beskrevet som Branhamella catarrhalis (Frosch og Kolle) og er et frysetørket, 1.5-2.9 kb innskuddsbibliotek som er konstruert fra M. catarrhalis-isolat som er tilveiebragt fra et transtrakealt aspirat fra en kullgruve arbeider med kronisk bronkitt. Depositumet er beskrevet i Antimicrob. Agents Chemother, 21: 506-508 (1982).

Depositumet med Moraxella catarrhalis stammen er heri betegnet som "den deponerte stamme" eller som "DNA fra den deponerte stamme".

Den deponerte stamme inneholder et full lengdes BASB020 gen.

Et depositum av vektoren pMC-HJ.y3 som består av Moraxella catarrhalis DNA som innskutt i pQE30 har vært deponert hos the American Type Company Collection (ATCC) 12. Februar 1999 og tildelt deponerings nummer 207106.

Sekvensen for de polynukleotider som rommes i den deponerte stamme/klon, så vel som aminosyre sekvensen for ethvert polypeptid som derved kodes for, er kontrollerende i tilfellet av eventuell konflikt med enhver beskrivelse av sekvenser heri.

Depositumet av de deponerte stammer har vært utført under betingelsene for Budapest traktaten angående internasjonal anerkjennelse av deponering av mikroorganismer til formål for patentprosedyre. De deponerte stammer vil ugjenkallelig og uten begrensing eller betingelse frigjøres til publikum når det utgis en patent. De deponerte stammer er frembragt utelukkende til tjeneste for fagfolk og er ikke en imirømmelse om at et depositum er påkrevet for iverksettelse, i likhet med det som kreves under 35 U.S.C. §112.

Claims

1. Isolert polypeptid som kan benyttes i en vaksine mot Moraxella catarrhalis- in£éks} ori,karakterisert vedat det omfatter en aminosyresekvens som har i det minste 85% identitet til den aminosyresekvens som er utvalgt fra den gruppe som består av: SEQ ED NO:4 og SEQ ED NO:6 over den samlede lengde av henholdsvis SEQ ID NO:4 eller SEQ ID NO:6, respektivt.

2. Isolert polypeptid ifølge krav 1,karakterisert vedat aminosyre sekvensen har i det minste 95% identitet med aminosyresekvensen utvalgt fra den gruppen som består av SEQ ID NO:4 og SEQ ED NO:6, over den samlede lengde av henholdsvis SEQ ID NO:4 eller SEQ ED NO:6, respektivt.

3. Polypeptid i følge krav 1,karakterisert vedat det omfatter den aminosyresekvens som er utvalgt fra den gruppe som består av: SEQ ED NO:4 og SEQ ED NO:6.

4. Isolert polypeptid ifølge krav 1,karakterisert vedat polypeptidet har aminosyresekvensen utvalgt fra den gruppe som består av SEQ ID NO:4 og SEQ ED NO:6.

5. Immunogent fragment av polypeptidet ifølge ethvert av kravene 1 til 4, hvori det immunogene fragment, om nødvendig når det er koblet til en bærer, er i stand til å vekke en irmmmrespons som gjenkjenner polypeptidet i følge SEQ ED NO:4 og SEQ ID NO:6.

6. Isolert polypeptid,karakterisert vedat det omfatter det immunogene fragment ifølge krav 5.

7. Fusjonsprotein,karakterisert vedat det omfatter et polypeptid eller et immunogent fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1-6.

8. Isolert polynukleotid,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid, immunogent fragment eller fusjonsprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller en nukleotidsekvens komple-mentær med nevnte isolerte nukleotid.

9. Isolert polynukleotid i følge krav 8,karakterisert vedat nevnte nukleotidsekvens har minst 95% identitet med SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO:5 i hele SEQ ID NO:3s eller SEQ ID NO:5s respektive lengder.

10. Isolert polynukleotid ifølge krav 8,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens som koder for polypeptidet i følge SEQ ED NO:4 eller SEQ ED NO:6.

11. Isolert polynukleotid ifølge krav 8,karakterisert vedat det omfatter en nukleotidsekvens ifølge SEQ ID NO:3 eller SEQ ID NO:5.

12. Ekspresjonsvektor,karakterisert vedat den omfatter et isolert rekombinant polynukleotid i følge et av kravene 8 til 11.

13. Rekombinant levende mikroorganisme,karakterisertv e d at den omfatter en ekspresjonsvektor ifølge krav 12.

14. Rekombinant ekspresjonssystem,karakterisert vedat det omfatter et polynukleotid ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 11.

15. Vertscelle,karakterisert vedat den omfatter ekspre-sjonsvektoren i følge krav 12 som uttrykker et isolert polypeptid, immunogent fragment eller fusjonsprotein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7, eller en membran fra vertscellen, der nevnte membran omfatter det uttrykte polypeptid, immunogene fragment eller fusjonsprotein.

16. Fremgangsmåte for å fremstille et polypeptid, immunogent fragment eller fusjonsprotein i følge krav 1 til 7,karakterisert vedat den omfatter dyrking av en vertscelle ifølge krav 15 under betingelser som er tilstrekkelige for produksjon av nevnte polypeptid, immunogene fragment eller fusjonsprotein, og gjenvinning av polypeptidet, det immunogene fragmentet eller fusjonsproteinet fra kulturmediet.

17. Fremgangsmåte for å uttrykke minst ett polynukleotid i følge et hvilket som helst av kravene 8 til 11,karakterisert vedat den omfatter transformasjon av vertscellen med en ekspresjonsvektor omfattende nevnte polynukleotid og dyrking av vertscellen under betingelser tilstrekkelige for ekspresjon av nevnte polynukleotid.

18. Vaksinesammensetning,karakterisert vedat det omfatter en effektiv mengde av polypeptidet, det immunogene fragmentet eller fusjonsproteinet ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 7 og en farmasøytisk akseptabel bærer.

19. Vaksinesammensetning ifølge 18,karakterisert vedat nevnte sammensetning omfatter minst et annet Moraxella catørr/ia/ij-antigen.

20. Antistoff generert mot polypeptidet, det immunogene fragment eller fusjonsprotein iføl-ge ethvert av kravene 1 til 7,karakterisert vedat nevnte polypeptid, immunogene fragment eller fusjonsprotein eventuelt er koblet til en bærer, og der antistoffet er immunspesifikt for polypeptidet ifølge SEQ ID NO: 4 eller SEQ ID NO: 6.

21. Fremgangsmåte for å diagnostisere en Moraxella catarrhalis infeksjon,karakterisert vedat den omfatter identifisering av et polypeptid eller immunogent fragment ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, eller et antistoff ifølge krav 20 foreligger i en biologisk prøve fra et dyr som mistenkes å ha en slik infeksjon.

22. Anvendelse av en sammensetning som omfatter en immunologisk effektiv mengde av et polypeptid, immunogent fragment eller fusjonsprotein ifølge et av kravene 1 til 7, for fremstilling av et medikament til anvendelse ved generering av en immunrespons hos et dyr.

23. Anvendelse av en sammensetning som omfatter en immunologisk effektiv mengde av et polynukleotid ifølge ethvert av kravene 8 til 11, for fremstilling av et medikament til anvendelse ved generering av en immunrespons hos et dyr.