KR100610448B1 - 모락셀라 카탈리스로부터의 화합물 - Google Patents

모락셀라 카탈리스로부터의 화합물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 BASB020 폴리펩티드 및 BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 및 재조합 기술에 의해 상기 폴리펩티드를 생성하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 본 발명의 화합물의 진단적, 예방적 및 치료적 용도에 관한 것이다.

Description

모락셀라 카탈리스로부터의 화합물{COMPOUNDS FROM MORAXELLA CATARRHALIS}
본 발명은 폴리누클레오티드(이하 "BASB020 폴리누클레오티드(들)"이라 칭함), 이들에 의해서 엔코딩된 폴리펩티드(이하 "BASB020" 또는 "BASB020 폴리펩티드(들)"이라 칭함), 이들의 재조합 물질 및 이들의 생산 방법에 관한 것이다. 또 다른 관점으로, 본 발명은 세균 감염증에 대한 백신을 포함한 이들 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 추가의 관점으로, 본 발명은 특정 병원체의 감염을 검출하는 진단 검정에 관한 것이다.
모락셀라 카탈리스(또한, 브란하멜라 카탈리스(Branhamella catarrhalis)라 일컬어짐)는 사람의 상부 기도로부터 종종 분리되는 그람 음성 세균이다. 이러한 세균은 몇 가지 병인이 되고 있는데, 그 중 주된 병은 유아 및 어린이의 중이염이며, 나이가 좀 든 사람에 있어서의 폐렴이다. 또한 이러한 세균은 정맥동염, 병원감염증 및 덜 빈번하게 발생되는 침습성 질환의 원인이 되고 있다.
중이염은 이의 발병회수 및 가능한 후유증 둘 모두를 고려하면 심각한 어린이 질환이다. 미국에서는 매년 3.5백만 이상의 발병이 기록되고 있으며, 80%의 어린이가 연령이 3세가 되기 전에 중이염의 적어도 한 증상을 나타내는 것으로 추정되고 있다[참조 : Klein, JO(1994), Clin.Inf.Dis 19:823]. 이러한 질환은 치료 없이 방치되거나 만성이 되면, 일시적(중이 내에 체액이 축적되는 경우)으로나 영구적(청각신경이 손상되는 경우)으로 청력을 잃게 될 수 있다. 유아에 있어서, 이러한 청력의 손실은 말을 늦게 배우는 원인이 될 수 있다.
세 가지의 세균 종이 중이염을 앓고 있는 어린이의 중이염으로부터 일차적으로 분리된다: 스트렙토콕쿠스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 비전형적 헤모필러스 인플루엔자(non typeable Haemophilus influenzae: NTHi) 및 모락셀라 카탈리스. 이들은 중이염의 경우에 60 내지 90%로 존재한다. 최근의 연구를 검토하여 보면, 중이염의 경우에 스트렙토콕쿠스 뉴모니애 및 NTHi는 둘 모두가 약 30%로 존재하며, 모락셀라 카탈리스는 약 15%로 존재한다는 것을 알 수 있다[참조 : Murphy, TF (1996) Microbiol.Rev. 60:267]. 그 밖의 세균(헤모필러스 인플루엔자 타입 B, 에스. 파이오진스(S. pyogenes) 등)가 중이로부터 분리될 수 있지만, 빈도는 아주 낮다(발병 중 약 2% 이하).
전염병학적 데이터에 의하면, 중이에서 발견된 병원체의 경우에, 상부 기도의 콜로니화가 중이염의 발병에 절대적인 선결요건이지만; 다른 사항이 질환이 유도되는데 요구되고 있음을 나타내고 있다[참조 : Dickinson, DP et al. (1988) J.Infect.Dis. 158:205, Faden, HL et al. (1991) Ann. Otorhinol. Laryngol. 100:612]. 이러한 사항들은 세균이 유스타키오관을 통해서 중이로 이동하게 한 후에, 염증과정을 개시시키는데 중요하다. 이들 인자는 현재 공지되어 있지 않다. 바이러스 감염후의 면역 시스템의 일시적인 변형이, 예를 들어, 기도의 콜로니화의 조절을 불가능하게 할 수 있음이 가정되고 있다[참조 : Faden, HL et al (1994) J.Infect.Dis. 169:1312]. 이와 다른 설명은 환경 요인에 대한 노출로 인하여 일부 어린이에서 보다 중요한 콜로니화가 가능하게 되고, 이러한 어린이는 후속하여 중이 병원체의 지속된 존재로 인해서 중이염의 발병에 민감하게 된다는 설명이다[참조 : Murphy, TF (1996) Microbiol. Rev. 60:267].
모락셀라 카탈리스에 대한 면역반응은 특성이 거의 규명되지 않고 있다. 연령 0 내지 2세의 아기의 비인강으로부터 연속적으로 분리된 균주의 분석은 이들 아기가 새로운 균주를 빈번하게 수용하고 제거하고 있음을 나타내고 있다. 이러한 결과는 상기 세균에 대한 효능적인 면역반응이 콜로니화된 어린이에 의해서 나타나고 있음을 나타낸다[참조 : Faden, HL et al(1994) J.Infect.Dis. 169:1312].
시험된 대부분의 성인에 있어서는, 살균 항체가 동정된 바 있다[참조 : Chapman, AJ et al. (1985) J.Infect.Dis. 151:878]. 모락셀라 카탈리스의 균주는 혈청 살균 활성에 저항하는 이들의 능력에 있어서 다양성을 나타내는데; 일반적으로, 질환을 앓고 있는 환자로부터 분리되는 균주가 단지 콜로니화된 환자로부터의 균주 보다 더 내성이 있다[참조 : Hol, C et al. (1993) Lancet 341:1281, Jordan, KL et al. (1990) Am.J.Med. 88 (suppl. 5A):28S]. 혈청 내성은 따라서 세균의 독성인자인 것으로 사료될 수 있다. 옵소닌화 활성은 중이염으로부터 수거된 어린이의 혈청에서 관찰되고 있다.
인체에서의 이러한 상이한 면역반응에 의해서 표적된 항원은, 발현이 철에 의해서 조절되며 폐렴을 앓고 있는 환자의 혈청에 의해 인식되는 OMP B1, 84kDa의 단백질[참조 : Sethi, S. et al. (1995) Infect.Immun. 63:1516] 및 UspA1 및 UspA2[참조 : Chen D. et al.(1999), Infect.Immun. 67:1310]를 제외하고는 확인되지 않고 있다.
모락셀라 카탈리스의 표면에 존재하는 몇 가지의 다른 막 단백질은 생화학적인 방법에 의하여 특성화되거나 보호 면역성을 유도하는데 대한 이들의 잠재적 관련성에 대해 특성화되었다[참조 : Murphy, TF(1996) Microbiol. Rev. 60:267]. 마우스 폐렴 모델에서, 이들 단백질중의 일부(UspA, CopB)에 대해서 생성된 항체의 존재는 폐의 감염을 보다 빠르게 없어지게 한다. 또 다른 폴리펩티드(OMP CD)는 모락셀라 카탈리스 균주 간에 잘 보존되며, 동물모델에서 이들 세균에 대해서 효능적인 것으로 입증된 슈도모나스 에어루기노사(Pseudomonas aeruginosa)의 포린과 동족성을 나타낸다.
모락셀라 카탈리스 감염증의 빈도는 과거 수십 년에 걸쳐서 상당히 증가하고 있다. 이는 다중 항생제 내성 균주의 출현 및 면역 시스템이 약한 인구의 증가로 인한 것이다. 표준 항생제의 일부 또는 모두에 내성이 있는 모락셀라 카탈리스 균주를 분리하는 것은 더 이상 보기 힘든 일이 아니다. 이러한 현상은 상기 유기체에 대한 새로운 항생제, 백신, 약물 스크리닝 방법, 및 진단 시험에 대한 의학적 필요 및 요구를 유발시키고 있다.
발명의 요약
본 발명은 BASB020, 특히 BASB020 폴리펩티드 및 BASB020 폴리누클레오티드, 이들의 재조합 물질 및 이들의 생산 방법에 관한 것이다. 또 다른 관점으로, 본 발명은 특히 미생물에 의한 질환의 예방 및 치료를 포함하여 상기 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 사용하는 방법에 관한 것이다. 추가의 관점으로, 본 발명은, BASB020 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 발현 또는 활성을 검출하는 검정과 같은, 미생물에 의한 감염증과 연관된 질환 및 그러한 감염증과 관련된 상태를 검출하는 진단 검정에 관한 것이다.
본 발명의 범위 및 사상 내에서 다양한 변화 및 변형은 본 기술분야의 전문가라면 이하 설명되는 상세한 설명 및 본원의 그 밖의 부분으로부터 용이하게 알 수 있을 것이다.
본 발명은 이하 상세히 기재되고 있는 BASB020 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 아미노산 서열 상동성에 의해서 세르풀리나 히오디센테리아(Serpulina hyodysenteriae)의 TlyC 헤몰리신 단백질과 관련성이 있는 모락셀라 카탈리스의 BASB020의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7 및 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8로 기재된 누클레오티드 및 아미노산 서열을 지니는 BASB020에 관한 것이다. 이하 "DNA"로 나타낸 서열 목록에 열거된 서열이 본 발명의 한 구체예를 나타내고 있음을 이해할 수 있을 것인데, 그 이유는 당업자라면 이러한 서열이 일반적으로 리보폴리누클레오티드를 포함한 폴리누클레오티드에 유용하게 사용될 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이기 때문이다.
폴리펩티드
본 발명의 한 가지 관점으로, 본 발명은 본원에서 "BASB020" 및 "BASB020 폴 리펩티드"라 일컬어지는 모락셀라 카탈리스의 폴리펩티드 뿐만 아니라, 이의 생물학적, 진단학적, 예방학적, 임상학적 또는 치료학적으로 유용한 변이체 및 이를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 서열과 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97 내지 99% 이상의 동일성 또는 정확한 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드; (b) 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 전장 서열에 대해 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7과 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 97 내지 99% 이상 또는 정확한 동일성을 나타내는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드에 의해서 엔코딩된 폴리펩티드; 또는 (c) SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 97 내지 99%이상의 동일성 또는 정확한 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 분리된 폴리누클레오티드에 의해서 엔코딩된 폴리펩티드를 제공한다.
SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8에서 제공된 BASB020 폴리펩티드는 모락셀라 카탈리스 균주 MC2931(ATCC43617), MC2912, MC2913 및 MC2969로부터의 BASB020 폴리펩티드이다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드와 동일하거나 실질적으로 동일한 면역원성 활성을 지니는 BASB020 폴리펩티드의 인접 부분인 BASB020 폴리펩티드의 면역원성 단편을 제공한다; 즉, 단편(필요하다면 담체에 결합되는 경우)은 BASB020 폴리펩티드를 인식하는 면역반응을 유도할 수 있다. 이러한 면역원성 단편은, 예를 들어, N-말단 리더 서열, 및/또는 경막 도메인, 및/또는 C-말단 앵커 도메인이 결여된 BASB020 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 바람직한 관점으로, 본 발명에 따른 BASB020의 면역원성 단편은 SEQ ID NO: 2의 전장 서열에 대하여 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 도메인과 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97 내지 99% 이상의 동일성을 나타내는 폴리펩티드의 세포외 도메인의 모두를 실질적으로 포함한다.
단편은 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 전체는 아니지만 일부와 완전히 동일한 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드이다. BASB020 폴리펩티드에 의한 바에 따르면, 단편은 "프리-스탠딩(free-standing)"이거나 이들이 일부 또는 영역을 형성하는 보다 큰 폴리펩티드내에 포함될 수 있으며, 가장 바람직하게는 단일의 보다 큰 폴리펩티드에 단일의 연속 영역으로 포함될 수 있다.
바람직한 단편은, 예를 들어, SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체의 일부를 지니는 절단 폴리펩티드, 예컨대, 아미노- 및/또는 카복실-말단 아미노산 서열를 포함하는 연속적인 일련의 잔기를 포함한다. 숙주 세포에 의해서 또는 숙주 세포 내에서 생성된 본 발명의 폴리펩티드의 분해 형태가 또한 바람직하다. 알파 나선 및 알파 나선 형성 영역, 베타 시이트 및 베타 시이트 형성 영역, 터언(trun) 및 터언 형성 영역, 코일 및 코일 형성 영역, 친수성 영역, 소수성 영역, 알파 양친매성 영역, 베타 양친매성 영역, 가요성 영역, 표면 형성 영역, 기질 결합 영역, 및 고 항원성 인덱스 영역을 포함하는 단편과 같은 구조적 또는 기능적인 속성에 의해서 특성화된 단편이 또한 바람직하다.
또 다른 바람직한 단편은 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열로부터의 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개 이상의 연속 아미노산을 지니는 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드, 또는 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열로부터 트렁케이션되거나 결실된 15, 20, 30, 40, 50 또는 100개 이상의 연속 아미노산을 지닌 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 폴리펩티드의 단편은 펩티드 합성법에 의해서 상응하는 전장 폴리펩티드를 생성시키는데 사용될 수 있다: 따라서, 이들 단편은 본 발명의 전장 폴리펩티드를 생성시키는 중간체로 사용될 수 있다.
수 개, 5 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 1 내지 2 또는 1개의 아미노산이 임의의 조합으로 치환되거나, 결실되거나, 첨가된 변이체가 특히 바람직하다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 면역원성 단편은 "성숙한(mature)" 단백질의 형태이거나, 전구체 또는 융합 단백질과 같은 보다 큰 단백질의 일부일 수 있다. 분비 서열 또는 리더 서열, 프로-서열, 다중 히스티딘 잔기와 같은 정제에 도움이 되는 서열, 또는 재조합체 생산 동안의 안정성을 위한 추가의 서열을 함유하는 추가의 아미노산 서열을 포함하는 것이 종종 유리할 수 있다. 또한, 최종 분자의 면역원성 효능을 증가시키기 위한 외생성 폴리펩티드 또는 지질 테일 또는 폴리누클레오티드 서열을 추가하는 것이 또한 바람직하다.
한 가지 바람직한 관점으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드, 또는 이의 단편, 및 다양한 아류(IgG, IgM, IgA, IgE)의 면역글로블린의 중쇄 또는 경쇄의 불변영역의 다양한 부분을 포함하는 유전적으로 조작된 가용성 융합 단백질에 관한 것이다. 힌지 영역에서 융합이 수행된 사람 IgG, 특히 IgG1의 중쇄의 불변 부분이 면역글로블린으로 바람직하다. 특정의 구체예에서, Fc 부분은 혈액 응고 인자 Xa에 의해 절단될 수 있는 절단 서열을 혼입시킴으로써 간단하게 제거될 수 있다.
또한, 본 발명은 유전 조작에 의해서 이들 융합 단백질을 제조하는 방법, 및 약물 스크리닝, 진단 및 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 추가의 관점은 또한 이러한 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 융합 단백질 기술의 예는 국제특허출원 WO94/29458호 및 WO94/22914호를 참조할 수 있다.
이러한 단백질은 화학적으로 컨쥬게이션되거나, 발현 시스템에서 비융합된 단백질에 비해서 증가된 수준으로 생성될 수 있는 재조합 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 융합 파트너는 T 헬퍼 에피토프(면역원성 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해서 인식된 T 헬퍼 에피토프를 제공하는데 보조하거나, 본래의 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질(발현 인핸서)을 발현시키는 것을 보조할 수 있다. 바람직하게는 융합 파트너는 면역원성 융합 파트너 및 발현 증강 파트너 둘 모두 일 수 있다.
융합 파트너는 헤모필러스 인플루엔자로부터의 단백질 D 및 인플루엔자 바이러스, NS1으로부터의 비구조 단백질(헤마글루티닌(hemagglutinin))을 포함한다. 또 다른 융합 파트너는 LytA로 공지된 단백질이다. 바람직하게는 분자의 C 말단 부분이 사용된다. Lyta는 N-아세틸-L-알라닌 아미다제 LytA(LytA 유전자에 의해서 암호됨[참조 : Gene, 43 (1986) page 265-272]), 펩티도글리칸 골격내의 특정의 결합을 특이적으로 분해하는 오토라이신(autolysin)을 합성하는 스트렙토콕쿠스 뉴모니애로부터 유래된다. LytA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE와 같은 일부 콜린 유사체에 대한 친화성의 원인이 된다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 대장균(E. coli) C-LytA 발현 플라스미드의 개발에 이용되고 있다. 아미노 말단에서 C-LytA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제방법이 문헌[Biotechnology; 10, (1992) page 795-798]에 기재되어 있다. 잔기 178번에서 출발하는 C 말단, 예를 들어, 잔기 188-305에서 발견된 LytA 분자의 반복 부분을 사용하는 것이 가능하다.
본 발명은 또한 상기된 폴리펩티드의 변이체, 즉, 보존성 아미노산 치환에 의해, 잔기가 유사한 특성을 지닌 잔기로 치환됨으로써 상기된 폴리펩티드로부터 변이된 폴리펩티드를 포함한다. 전형적인 그러한 치환에는 Ala, Val, Leu 및 Ile간의 치환; Ser 및 Thr 간의 치환; 산성 잔기 Asp 및 Glu 간의 치환; Asn 및 Gln 간의 치환; 염기성 잔기 Lys 및 Arg 간의 치환; 또는 방향족 잔기 Phe 및 Tyr 간의 치환이다.
본 발명의 폴리펩티드는 적합한 모든 방법으로 제조될 수 있다. 그러한 폴리펩티드에는 분리된 천연 폴리펩티드, 재조합적으로 생산된 폴리펩티드, 합성 생성된 폴리펩티드, 또는 이들 방법의 조합에 의해서 생성된 폴리펩티드가 포함된다. 이러한 폴리펩티드를 제조하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다.
본 발명의 폴리펩티드가 모락셀라 카탈리스로부터 유래되는 것이 가장 바람직하지만, 동일한 분류학상의 속(屬)의 다른 유기체로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어, 동일한 분류학상 과(科) 또는 목(目)의 유기체로부터 얻을 수 있다.
폴리누클레오티드
본 발명의 목적은 BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드, 특히 본원에서 BASB020으로 명명된 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공하는 것이다.
특히 바람직한 본 발명의 구체예에서, 폴리누클레오티드는 전장 유전자 또는 이의 변이체를 포함하는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7에 기재된 서열를 포함하는 BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 영역을 포함한다.
SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7에 제공된 BASB020 폴리누클레오티드는 모락셀라 카탈리스 균주 MC2931(ATCC43617), MC2912, MC2913 및 MC2969로부터의 BASB020 폴리누클레오티드이다.
본 발명은 또 다른 관점으로, 예를 들어, 프로세싱되지 않은 RNA, 리보자임 RNA, mRNA, cDNA, 게놈 DNA, B-DNA 및 Z-DNA를 포함하는, BASB020 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드, 특히 모락셀라 카탈리스 BASB020 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 엔코딩하고/거나 발현하는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 발명의 추가의 구체예에는 생물학적, 진단학적, 예방학적, 임상학적 또는 치료학적으로 유용한 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드, 및 이의 변이체, 및 이를 포함하는 조성물이 포함된다.
본 발명의 또 다른 관점은 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 추정된 아미노산 서열을 지닌 BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하며 하나 이상의 전장 유전자를 포함하는 분리된 폴리누클레오티드, 및 이와 밀접하게 관련된 폴리누클레오티드 및 이의 변이체에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명은 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열 또는 이의 변이체를 포함하거나 이로 구성된 모락셀라 카탈리스로부터의 BASB020 폴리펩티드를 제공한다.
SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7로 기재된 폴리누클레오티드 서열과 같은 본원에 제공된 정보를 이용하면, BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드가 표준 클로닝 및 스크리닝 방법, 예컨대, 출발물질로서 모락셀라 카탈리스 카틀린(Catlin) 세포를 사용하여 세균로부터 염색체 DNA 단편을 클로닝 및 서열분석한 후에 전장 클론을 얻는 방법을 이용함으로써 얻을 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리누클레오티드 서열, 예컨대, SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7에 주어진 폴리누클레오티드 서열을 얻기 위해서는, 전형적으로는 대장균 또는 일부의 다른 적합한 숙주의 모락셀라 카탈리스 카틀린의 염색체 DNA의 클론 라이브러리는 부분서열로부터 유래된 방사성 표지된 올리고누클레오티드, 바람직하게는 17-량체 이상의 올리고누클레오티드로 프로빙된다. 프로브의 DNA와 동일한 DNA를 지니는 클론은 엄격한(stringent) 하이브리드화 조건을 이용함으로써 구분될 수 있다. 본래의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열로부터 디자인된 서열분석 프라이머로 하이브리드화시켜 동정된 각각의 클론을 서열분석함으로써, 양 방향으로 폴리누클레오티드 서열을 연장시켜서 전장 유전자 서열을 결정하는 것이 가능할 수 있다. 용이하게는, 이러한 서열분석는, 예를 들어, 플라스미드 클론으로부터 제조된 변성된 이중 가닥 DNA를 사용함으로써 수행된다. 적합한 기술은 문헌[참조 : Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed.,; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)](특히, Screening By Hybridization 1.90 and Sequencing Denatured Double-Stranded DNA Templates 13.70 참조)에 기재되어 있다. 직접적인 게놈 DNA 서열분석이 수행되어 전장 유전자 서열을 얻을 수 있다. 본 발명을 예시하자면, SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7에 기재된 각각의 폴리누클레오티드는 모락셀라 카탈리스로부터 유래된 DNA 라이브러리에서 발견되었다.
또한, SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7에 기재된 각각의 DNA 서열은 본 기술분야의 전문가에게는 공지된 아미노산 잔기 분자량을 이용함으로써 계산될 수 있는 추정 분자량을 지닌 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8에 기재된 아미노산 잔기의 수를 지니는 단백질을 엔코딩하는 오픈 리딩 프레임을 함유한다.
누클레오티드 번호 1에서의 개시 코돈과 SEQ ID NO: 1의 누클레오티드 번호 841에서 시작되는 정지 코돈 사이의 SEQ ID NO: 1의 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO: 2의 폴리펩티드를 엔코딩한다.
누클레오티드 번호 1에서의 개시 코돈과 SEQ ID NO: 3의 누클레오티드 번호 841에서 시작되는 정지 코돈 사이의 SEQ ID NO: 3의 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO: 4의 폴리펩티드를 엔코딩한다.
누클레오티드 번호 1에서의 개시 코돈과 SEQ ID NO: 5의 누클레오티드 번호 841에서 시작되는 정지 코돈 사이의 SEQ ID NO: 5의 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO: 6의 폴리펩티드를 엔코딩한다.
누클레오티드 번호 1에서의 개시 코돈과 SEQ ID NO: 7의 누클레오티드 번호 841에서 시작되는 정지 코돈 사이의 SEQ ID NO: 7의 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO: 8의 폴리펩티드를 엔코딩한다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 (a) 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 전장 서열에 대하여 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7과 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 97 내지 99% 이상 또는 정확한 동일성을 나타내는 폴리누클레오티드 서열; 또는 (b) 각각 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 전장 서열에 대하여 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 아미노산 서열과 85% 이상의 동일성, 바람직하게는 90% 이상의 동일성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성, 더욱 더 바람직하게는 97 내지 99% 이상의 동일성 또는 100% 정확한 동일성을 나타내는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열을 포함하거나 이러한 서열로 구성되는 분리된 폴리누클레오티드를 제공한다.
모락셀라 카탈리스 이외의 종으로부터의 동족체 및 오르쏘로그(ortholog)를 포함한 본 발명의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드는 적절한 라이브러리를 엄격한 하이브리드화 조건(예를 들어, 45 내지 65℃ 범위의 온도 및 0.1 내지 1%의 SDS 농도를 이용)하에서 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 서열 또는 이의 단편으로 구성되거나 이를 포함하는 표지되거나 검출 가능한 프로브로 스크리닝하고; 상기 폴리누클레오티드 서열을 함유하는 전장 유전자 및/또는 게놈성 클론을 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻을 수 있다.
본 발명은 전장 서열에 대하여 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7내의 코딩 서열(개방 해독 구조)와 동일한 폴리누클레오티드를 제공한다. 본 발명은 또한 성숙한 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 코딩 서열 그 자체를 제공할 뿐만 아니라, 다른 코딩 서열, 예컨대, 리더 또는 분비성 서열, 프리-, 또는 프로- 또는 프리프로-단백질 서열을 엔코딩하는 서열을 지닌 해독 프레임내의 성숙한 폴리펩티드 또는 이의 단편에 대한 코딩서열을 제공한다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 또한, 예를 들어, 이로 한정되는 것은 아니지만, 하나 이상의 비-코딩 5' 및 3' 서열, 예컨대, 전사되었지만 비번역된 서열, 종결 시그날(예컨대, rho-의존성 및 rho-독립성 종결 시그날), 리보좀 결합 부위, 코작 서열(Kozak sequence), mRNA를 안정화하는 서열, 인트론, 및 폴리아데닐화 시그날을 포함한 하나 이상의 비-코딩 서열을 함유할 수 있다. 폴리누클레오티드 서열은 또한 추가의 아미노산을 엔코딩하는 추가의 코딩서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 융합된 폴리펩티드의 정제를 촉진하는 마커 서열이 엔코딩될 수 있다. 본 발명의 특정의 구체예에서, 마커 서열은 pQE 벡터(Qiagen, Inc.)에 제공되고 문헌[Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 86:821-824(1989)]에 기재된 바와 같은 헥사-히스티딘 펩티드, 또는 HA 펩티드 tag[참조 : Wilson et al., Cell 37:767 (1984)]이며, 이들 둘 모두는 이들에 융합된 폴리펩티드 서열을 정제하는데 유용할 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 이로 한정되는 것은 아니지만 유전자 발현을 조절하는 구조 유전자 및 이의 천연적으로 관련된 서열을 포함한 폴리누클레오티드를 포함한다.
SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열은 각각 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 누클레오티드 1 내지 840번에 함유된 폴리펩티드 엔코딩 서열과 동일할 수 있다. 이와 달리 이러한 서열은 유전자 코드의 중복성(축퇴)의 결과로 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드를 암호화하는 폴리누클레오티드는 본 발명의 폴리펩티드, 특히 세균성 폴리펩티드, 더욱 특히, 서열 2, 4, 6 또는 8에 기재된 아미노산 서열을 지닌 모락셀라 카탈리스 BASB020의 폴리펩티드를 엔코딩하는 서열을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
상기 용어는 또한, 코딩 및/또는 비-코딩 서열을 함유할 수 있는 추가의 영역과 함께, 폴리펩티드를 엔코딩하는 단일의 연속성 영역 또는 불연속성 영역(예를 들어, 인테그레이션된 파아지, 즉, 인테그레이션된 삽입 서열, 인테그레이션된 벡터 서열, 삽입된 트랜스포손 서열에 의해서, 또는 RNA 교정 또는 게놈 DNA 재형성에 의해 중단된 폴리누클레오티드)을 포함하는 폴리누클레오티드를 포함한다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 추정된 아미노산 서열을 지닌 폴리펩티드의 변이체를 엔코딩하는 본원에 기재된 폴리누클레오티드의 변이체에 관한 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드의 단편은 예를 들어 본 발명의 전장 폴리누클레오티드를 합성하는데 사용될 수 있다.
또 다른 특히 바람직한 구체예는 몇 개, 수 개, 5 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2, 1 또는 0 개의 아미노산 잔기가 어떠한 조합으로 치환되고/거나, 개질되고/거나, 결실되고/거나 첨가되는 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 BASB020 폴리펩티드의 아미노산 서열을 지니는 BASB020 변이체를 엔코딩하는 폴리누클레오티드이다. 이들 중에 BASB020 폴리펩티드의 특성 및 활성을 변화시키지 않는 침묵 치환, 첨가 및 결실이 특히 바람직하다.
발명의 또 다른 바람직한 구체예는 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8에 기재된 아미노산 서열을 지니는 BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 전장 서열에 대하여 85% 이상 동일한 폴리누클레오티드, 및 그러한 폴리누클레오티드에 상보적인 폴리누클레오티드이다. 또한, BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 전장 서열에 대하여 90% 이상 동일한 영역을 포함하는 폴리누클레오티드 및 이에 상보적인 폴리누클레오티드가 가장 바람직하다. 이와 관련하여, BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드와 전장 서열에 대하여 95% 이상 동일한 폴리누클레오티드가 특히 바람직하다. 또한, 97% 이상 동일한 폴리누클레오티드는 95% 이상 동일한 폴리누클레오티드 보다 더 바람직하며, 98% 이상 및 99% 이상 동일한 폴리누클레오티드가 특히 바람직하며, 99% 이상 동일한 폴리누클레오티드가 더욱 더 바람직하다.
바람직한 구체예는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 DNA에 의해 엔코딩된 성숙한 폴리펩티드와 실질적으로 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드이다.
본 발명의 특정의 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명은 특히 엄격한 조건하에서 BASB020 폴리누클레오티드 서열, 예컨대, SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7중의 폴리누클레오티드에 하이브리드화되는 폴리누클레오티드를 제공한다.
본 발명은 또한 본원에 제공된 폴리누클레오티드 서열에 하이브리드화되는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 이와 관련하여, 본 발명은 특히 엄격한 조건하에서 본원에 기재된 폴리누클레오티드에 하이브리드화되는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 본원에 사용된 용어 "엄격한 조건" 및 "엄격한 하이브리드화 조건"은 서열 사이에 95% 이상, 바람직하게는 97% 이상의 동일성이 있는 경우만이 발생되는 하이브리드화를 의미한다. 엄격한 하이브리드화 조건의 구체적 예는 50%의 포름아미드, 5x SSC(150mM NaCl, 15mM 트리소듐 시트레이트), 50mM 인산나트륨(pH7.6), 5x 덴하트 용액(Denhardt's solution), 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 마이크로그램/ml의 변성되고 전단된 연어 정액 DNA를 포함하는 용액 중에서 45℃로 밤새 인큐베이션한 후에, 약 65℃의 0.1 x SSC중에서 하이브리드화 지지체를 세척하는 것이다. 하이브리드화 및 세척 조건은 공지되어 있으며 문헌[Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)](특히, 상기 문헌의 제 11장 참조)에 예시되어 있다. 용액 하이브리드화는 또한 본 발명에 의해 제공된 폴리누클레오티드 서열과 함께 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7에 기재된 폴리누클레오티드 서열에 대한 완전한 유전자를 함유하는 적절한 라이브러리를 엄격한 조건하에서 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7에 기재된 폴리누클레오티드 서열 또는 이의 단편의 서열을 지닌 프로브로 스크리닝하고; 상기 폴리누클레오티드 서열을 분리함으로써 얻은 폴리누클레오티드 서열로 구성되거나 이를 포함하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리누클레오티드를 얻는데 유용한 단편은, 예를 들어, 본원에서 상세하게 기재되고 있는 프로브 및 프라이머를 포함한다.
본 발명의 폴리누클레오티드 검정과 관련하여 본원에서 기재되고 있는 바와 같이, 예를 들어, 본 발명의 폴리누클레오티드는 RNA, cDNA 및 게놈성 DNA에 대한 하이브리드화 프로브로 사용되어 BASB020을 엔코딩하는 게놈 클론 및 전장 cDNA를 분리시키고, BASB020 유전자와 높은 동일성, 특히 높은 서열 동일성을 지니는 그 밖의 유전자의 cDNA 및 게놈 클론을 분리시킬 수 있다. 이러한 프로브는 일반적으로 15개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 포함할 것이다. 바람직하게는, 이러한 프로브는 30개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 지닐 것이며, 50개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 지닐 수 있다. 특히 바람직한 프로브는 20개 이상의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 지닐 것이며, 30개 미만의 누클레오티드 잔기 또는 염기쌍을 지닐 것이다.
BASB020 유전자의 코딩 영역은 올리고누클레오티드 프로브를 합성하도록 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7에 제공된 DNA 서열을 사용하여 스크리닝함으로써 분리될 수 있다. 본 발명의 유전자의 서열과 상보적인 서열을 지니는 표지된 올리고누클레오티드는 프로브가 하이브리드화되는 라이브러리의 구성원을 측정하기 위하여 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된다.
전장 DNA를 얻거나 짧은 DNA를 연장시키기 위한 본 기술분야의 전문가에게는 공지되어 있고 이들이 이용할 수 있는 몇 가지 방법, 예를 들어, cDNA 말단의 신속한 증폭 방법(Rapid Amplication of cDNA ends: RACE)[참조 : Frohman, et al., PNAS USA 85: 8998-9002, 1988]을 기본으로 하는 방법이 있다. 마라톤TM(MarathonTM) 기술(Clontech Laboratories Inc.)로 예시된 이러한 기술의 최신 변형 기술은, 예를 들어, 보다 긴 cDNA에 대한 조사를 상당히 간소화시키고 있다. 마라톤TM 기술에서, cDNA는 선택된 조직으로부터 추출된 mRNA 및 각각의 말단상에 라이게이션된 "어댑터(adaptor)" 서열로부터 제조되고 있다. 핵산 증폭(PCR)은 유전자 특이적 및 어댑터 특이적 올리고누클레오티드 프라이머의 조합을 이용함으로써 DNA의 "미싱(missing)" 5' 말단을 증폭시키기 위해서 수행된다. PCR 반응은 "네스티드(nested)" 프라이머, 즉, 증폭된 생성물내에서 어닐링되도록 설계된 프라이머(전형적으로는 또 다른 어댑터 서열내의 3'를 어닐링하는 어댑터 특이적 프라이머 및 선택된 유전자 서열내의 또 다른 5'를 어닐링하는 유전자 특이적 프라이머)를 사용함으로써 반복된다. 이러한 반응의 생성물은 DNA 서열 분석에 의해 분석될 수 있고, 전장 DNA는 생성물을 직접적으로 기존의 DNA에 결합시켜 완전한 서열을 얻거나 또는 5' 프라이머의 설계를 위한 새로운 서열 정보를 이용하여 별도의 전장 PCR을 수행함으로써 제작될 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드는, 예를 들어, 폴리누클레오티드 검정과 관련되어 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 질환, 특히 사람의 질환에 대한 치료제 및 진단제의 발견을 위한 물질 및 조사 시약으로 사용될 수 있다.
SEQ ID NO: 1 내지 8의 서열로부터 유래된 올리고누클레오티드인 본 발명의 폴리누클레오티드는 본원에 기재된 방법, 바람직하게는 본원에 전체적으로 또는 부분적으로 동정된 폴리누클레오티드가 감염된 조직내의 세균에서 전사되는지 그렇지 않은지를 측정하는 PCR을 위한 방법에 사용될 수 있다. 이러한 서열이 병원체가 얻어지는 감염 단계 및 감염 형태의 진단에 이용성이 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
본 발명은 또한 성숙한 단백질과 추가의 아미노 말단 아미노산 또는 카르복시 말단 아미노산, 또는 성숙한 폴리펩티드(성숙한 형태가, 예를 들어, 하나 이상의 폴리펩티드 쇄를 지니는 경우)내의 아미노산인 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리노클레오티드를 제공한다. 이러한 서열은 전구체로부터 성숙한 형태로의 단백질의 프로세싱에서 역할을 하거나, 단백질 수송을 가능하게 하거나, 단백질 반감기를 길게 또는 짧게 하거나, 특히 검정 또는 생산을 위한 단백질의 조작을 용이하게 할 수 있다. 일반적으로 생체내 경우에서와 같이, 추가의 아미노산이 세포성 효소에 의해서 성숙한 단백질로부터 프로세싱되어 제거될 수 있다.
본 발명의 각각의 폴리누클레오티드 및 모든 폴리누클레오티드에 있어서, 본 발명은 이에 상보적인 폴리누클레오티드를 제공한다. 이들 상보적인 폴리누클레오티드가 이들이 상보적인 각각의 폴리누클레오티드에 완전히 상보적인 것이 바람직하다.
폴리펩티드의 성숙한 형태가 하나 이상의 프로서열에 융합된 전구체 단백질은 폴리펩티드의 불활성 형태일 수 있다. 프로서열이 제거되는 경우에 각각의 불활성 전구체는 일반적으로 활성화된다. 일부 또는 모든 프로서열이 활성화 전에 제거될 수 있다. 일반적으로는, 이러한 전구체는 프로단백질이라 일컬어진다.
누클레오티드에 대한 표준 A, G, C, T/U 표기에 추가로, 용어 "N"이 또한 본 발명의 특정 폴리누클레오티드를 기술하는데 사용될 수 있다. "N"은 4개의 DNA 또는 RNA 누클레오티드 중 어느 하나가 DNA 또는 RNA 서열 내의 지정된 위치에서 나타날 수 있음을 의미하지만, "N"은 인접한 누클레오티드 위치와 함께 주어지는 경우, 즉, 정확한 해독 프레임에서 해독되는 경우에 상기 해독 프레임 내에서 때이른 종결 코돈을 생성시키는 효과를 지니는 핵산이 아닌 것이 바람직하다.
요컨대, 본 발명의 폴리누클레오티드는 성숙한 단백질, 성숙한 단백질과 리더 서열(프리단백질로 일컬어질 수 있음), 프리단백질의 리더 서열이 아닌 하나 이상의 프로서열을 지닌 성숙한 단백질의 전구체, 또는 프로단백질에 대한 전구체이며, 활성을 가지는 성숙한 형태의 폴리펩티드를 생성하는 프로세싱 단계 동안에 일반적으로 제거되는 하나 이상의 프로서열 및 리더 서열을 지니는 프리프로단백질을 엔코딩할 수 있다.
본 발명의 한 가지 관점에 따르면, 본 발명은 치료 또는 예방, 특히 유전적 면역화를 위한 본 발명의 폴리누클레오티드의 용도를 제공한다.
유전자 면역화에서의 본 발명의 폴리누클레오티드의 용도는 바람직하게는 플라스미드 DNA를 근육내로 직접 주사[참조 : Wolff et al., Hum Mol Genet (1992) 1:363, Manthorpe et al., Hum. Gene Ther. (1983) 4: 419], 특이적 단백질 담체와 복합체를 형성한 DNA의 전달[참조 : Wu et al., J Biol Chem. (1989) 264: 16985], DNA의 인산칼슘과의 공동 침전[참조 : Benvenisty & Feshef. PNAS USA, (1986) 83: 9551], 다양한 리포좀의 형태내로의 DNA의 캡슐화[참조 : Kaneda et al., Science (1989) 243:375], 입자 충격[참조 : Tang et al., Narure (1992) 356: 152, Eisenbraun et al., DNA Cell Biol (1993) 12: 791] 및 클로닝된 레트로바이러스 벡터를 이용한 생체내 감염[참조 : Seeger et al., PNAS USA (1984) 81: 5849]과 같은 적합한 전달 방법을 이용할 것이다.
벡터, 숙주세포, 발현 시스템
본 발명은 또한 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드들을 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터로 유전자 조작되는 숙주 세포 및 재조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩티드의 생산 방법에 관한 것이다. 세포 비함유 번역 시스템이 또한 본 발명의 DNA 구성물로부터 유래된 RNA를 사용함으로써 단백질을 생성시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 재조합 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해서 발현 시스템을 포함하는 유전자 조작된 숙주 세포로부터 제조될 수 있다. 따라서, 또 다른 관점으로, 본 발명은 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드들을 포함하는 발현 시스템, 상기 발현 시스템으로 유전자 조작된 숙주 세포, 및 재조합 기술에 의해서 본 발명의 폴리펩티드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드의 재조합 생산방법에 있어서, 숙주 세포는 유전 조작되어 발현 시스템 또는 이의 일부 또는 본 발명의 폴리누클레오티드를 혼입할 수 있다. 폴리누클레오티드를 숙주 세포내로 도입하는 것은 문헌[Davis, et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, (1986) AND Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]와 같은 많은 표준 실험 매뉴얼에 기재된 방법, 예컨대, 인산칼슘 트랜스펙션, DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션, 형질접합(transvection), 미세주입, 양이온성 지질-매개 트랜스펙션, 전기 영동, 형질도입, 스크렙 부하, 발리스틱(ballistic) 도입 및 감염에 의해서 수행된다.
적절한 숙주의 대표적인 예에는 세균 숙주 세포, 예컨대, 스트렙토코싸이(streptococci), 스타필로코싸이(staphylococci), 엔테로코싸이 (enterococci), 대장균, 스트렙토마이세스(streptomyces), 시아노세균 (cyanobacteria), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 및 모락셀라 카탈리스의 세포; 진균 세포, 예컨대, 효모, 클루베로마이세스(Kluveromyces), 사카로마이세스(Saccharomyces), 담자균류, 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아스페르길루스(Aspergillus); 곤충 세포, 예를 들어 드로소필라 S2 및 스포로프테라 sf9 세포; 동물 세포, 예컨대, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, 293, CV-1 및 바우스 멜라노마 세포(Bowes melanoma cell); 식물 세포, 예컨대, 나자식물 또는 피자식물의 세포가 포함된다.
아주 다양한 발현 시스템이 본 발명의 폴리펩티드를 생성시키는데 사용될 수 있다. 그러한 벡터에는 다른 벡터들 중에서도 염색체-, 에피솜-, 및 바이러스-유도된 벡터, 예를 들어, 세균 플라스미드로부터 유래된 벡터, 박테리오파아지로부터 유래된 벡터, 트랜스포손으로부터 유래된 벡터, 효모 에피좀으로부터 유래된 벡터, 삽입 요소로부터 유래된 벡터, 효모 염색체 요소로부터 유래된 벡터, 바쿨로바이러스, 파포바 바이러스, 예컨대, SV40, 백시나 바이러스, 아데노바이러스, 파울 폭스 바이러스(fowl pox viruses), 수도라비에스 바이러스(pseudorabies viruses), 피코마바이러스, 레트로바이러스, 및 알파바이러스로부터 유래된 벡터, 및 이들의 조합으로부터 유래된 벡터, 예컨대, 플라스미드와 박테리오파아지 유전자 요소, 예컨대, 코스미드 및 파아지미드로부터 유래된 벡터가 포함된다. 발현 시스템 구성물은 발현이 발생되게 할 뿐만 아니라 조절하는 조절 영역을 함유할 수 있다. 일반적으로, 폴리누클레오티드를 유지시키거나, 전파시키거나, 발현시키고/거나 숙주내의 폴리펩티드를 발현시키기에 적합한 어떠한 시스템 또는 벡터가 이와 관련하여 발현에 사용될 수 있다. 적절한 DNA 서열은 다양한 공지된 및 통상의 기술, 예컨대, 상기 문헌[Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL]에 기재된 기술 중 어느 기술에 의해서 발현 시스템내로 삽입될 수 있다.
진핵세포내의 재조합 발현 시스템에서, 번역된 단백질을 소포체의 루멘내로, 외질(periplasm) 공간내로 또는 세포외 환경내로 분비시키는 경우에, 적절한 분비 시그날이 발현된 폴리펩티드내로 혼입될 수 있다. 이들 시그날은 폴리펩티드에 대해서 외생성이거나 이질성 시그날일 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로오즈 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 히드록시라파타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피를 포함한 공지된 방법에 의해서 재조합 세포 배양물로부터 수거 및 정제될 수 있다. 가장 바람직하게는, 철 금속 친화성 크로마토그래피(IMAC)가 정제에 이용되고 있다. 단백질을 리폴딩(refolding)하는 공지된 기술은 폴리펩티드가 세포내 합성, 분리 및/또는 정제 동안 변성되는 경우에 활성 형태를 재생시키는데 사용될 수 있다.
발현 시스템은 살아있는 재조합 미생물, 예컨대, 바이러스 또는 세균일 수 있다. 목적 유전자는 살아있는 재조합 바이러스 또는 세균의 게놈내로 삽입될 수 있다. 이러한 살아있는 벡터로의 접종 및 생체내 감염은 항원의 생체내 발현 및 면역반응의 유도를 유발할 것이다. 이러한 목적으로 사용되는 바이러스 및 세균은, 예를 들어, 폭스바이러스(예, 백시나, 파울폭스, 카나리폭스), 알파바이러스(신드비스 바이러스: Sindbis virus, 샘라이키 포리스트 바이러스: Semliki Forest Virus, 벤주엘리안 이퀸 엔세팔리티스 바이러스: Venezuelian Equine Encephalitis Virus), 아데노바이러스, 아데노-관련된 바이러스, 피코나 바이러스(폴리오바이러스, 리노바이러스), 헤르페스바이러스(바리셀라 조스터 바이러스, 등), 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella), 쉬겔라(Shigella), 네이세리아(Neisseria), BCG이다. 이들 바이러스 및 세균은 독성이 있거나, 살아있는 백신을 얻기 위해서 다양한 방법으로 약독화될 수 있다. 이러한 살아있는 백신이 또한 본 발명의 일부를 형성한다.
진단, 예후, 혈청형 분석 및 돌연변이 검정
본 발명은 또한 진단 시약으로 사용하기 위한 본 발명의 BASB020 폴리누클레오티드 및 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다. 진핵세포, 바람직하게는 포유동물, 및 특히 사람에서의 BASB020 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 검출은 질환의 진단, 질환의 단계화, 또는 약물에 대한 감염 유기체의 반응을 위한 진단방법을 제공한다. 진핵세포, 바람직하게는 포유동물 및 특히 사람, 특히 BASB020 유전자 또는 단백질을 포함하는 유기체로 감염되거나 감염된 것으로 의심되는 이들 개체는 본 원에 기개된 방법에 의할 뿐만 아니라 다양한 공지된 기술에 의해서 핵산 또는 아미노산 수준에서 검출될 수 있다.
예후, 진단 또는 그 밖의 분석을 위한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 추정적으로 감염되고/거나 감염된 개체의 신체의 물질로부터 얻을 수 있다. 이들 공급원, 특히 DNA 또는 RNA 중 임의의 것으로부터의 폴리누클레오티드는 검출에 직접 사용되거나 분석 전에 PCR 또는 다른 증폭 기술을 이용함으로써 효소적으로 증폭될 수 있다. RNA, 특히 mRNA, cDNA 및 게놈 DNA가 또한 동일한 방법으로 사용될 수 있다. 증폭을 이용하여 개체에 존재하는 감염 또는 내재 유기체의 종 및 스트레인을 특성화하는 것이 유기체의 소정의 폴리누클레오티드의 유전자형의 분석에 의해 수행될 수 있다. 결실 및 삽입은 관련된 유기체, 바람직하게는 동일한 속의 상이한 종 또는 동일한 종의 상이한 스트레인으로부터 선택된 참조 서열의 유전자형에 비교된 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해서 검출될 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 BASB020 폴리누클레오티드 서열에 하이브리드화시킴으로써 동정될 수 있다. 완벽하게 또는 현저하게 매치된 서열은 각각 DNA 또는 RNA의 경우에 DNase 또는 RNase 분해에 의해서, 또는 용융 온도 또는 복원(renaturation) 운동학에서의 차이를 검출함에 의해서 불완전하게 또는 더욱 현저하게 미스매치된 이중나선과는 구별될 수 있다. 폴리누클레오티드 서열의 차이는 참조 서열에 비한 겔에서의 폴리누클레오티드 단편의 전기영동 이동성의 차이에 의해서 검출될 수 있다. 이러한 시험은 변성화제와 함께 또는 이러한 변성화제 없이 수행될 수 있다. 폴리누클레오티드 차이가 또한 직접적인 DNA 또는 RNA 서열분석에 의해서 검출될 수 있다[참조 : Myers et al., Science, 230: 1242(1985)]. 특이적 위치에서의 서열 변화가 또한 누클레아제 보호 검정, 예컨대, RNase, V1 및 S1 보호 검정 또는 화학적 절단 방법에 의해서 밝혀질 수 있다[참조 : Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:4397-4401 (1985)].
또 다른 구체예에서, BASB020 누클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 올리고누클레오티드 프로브의 어레이가, 예를 들어, 유전자 돌연변이, 혈청형 분석, 분류학상의 분류 또는 동정의 효율적인 스크리닝을 수행하기 위해서 구성될 수 있다. 어레이 방법은 공지되어 있으며, 일반적인 적용성이 있고, 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 다양성을 포함한 분자 유전자제에서의 다양한 문제를 해결하는데 이용될 수 있다[참조 : Chee et al., Science, 274: 610 (1996)].
따라서, 또 다른 구체예에서, 본 발명은 (a) 본 발명의 폴리누클레오티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 누클레오티드 서열 또는 이의 단편; (b) (a)에 상보적인 누클레오티드 서열; (c) 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 폴리펩티드 또는 이의 단편; 또는 본 발명의 폴리펩티드, 바람직하게는 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 폴리펩티드에 대한 항체를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다.
어떠한 상기 키트에서, (a), (b), (c) 또는 (d)는 실질적인 성분을 포함할 수 있다. 이러한 키트는 특히 질환 및 질환에 대한 감수성을 진단하는데 유용할 것이다.
본 발명은 또한 진단 시약으로서의 본 발명의 폴리누클레오티드의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드, 바람직하게는, 질환 또는 병원성과 관련되는 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 돌연 변이된 형태의 검출은 질환의 진단, 질환과정의 예후, 질환 단계의 측정, 또는 폴리누클레오티드의 소발현(underexpression), 과발현(overexpression) 또는 변화된 발현을 유도하는 질환에 대한 민감성을 측정하기 위해서 첨가될 수 있는 진단 도구를 제공한다. 폴리누클레오티드의 돌연변이체를 지니는 유기체, 바람직하게는 감염성 유기체가 본원에서 기재되고 있는 기술과 같은 다양한 기술에 의해서 폴리누클레오티드 수준으로 검출될 수 있다.
본 발명의 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드의 돌연변이 또는 다형체(대립유전자 변이체)를 지니는 유기체로부터의 세포는 다양한 기술에 의해서 혈청형 분석을 가능하게 하는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 수준으로 검출될 수 있다. 예를 들어, RT-PCR은 RNA에서의 돌연변이를 검출하는데 사용될 수 있다. RT-PCR을 자동화된 검출 시스템, 예를 들어, 진스캔(GeneScan)과 함께 사용하는 것이 특히 바람직하다. RNA, cDNA 또는 게놈성 DNA가 또한 동일한 목적, 즉, PCR을 위해서 사용될 수 있다. 예를 들어, BASB020 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 상보적인 PCR 프라이머가 돌연변이체를 동정하고 분석하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 1, 2, 3 또는 4개 누클레오티드가 5' 및/또는 3' 말단으로부터 제거된 프라이머를 제공한다. 이들 프라이머는 특히 개체로부터 유래된 샘플, 예컨대, 신체로부터 얻은 물질로부터 분리된 BASB020 DNA 및/또는 RNA를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 이러한 프라이머는 감염된 개체로부터 분리된 폴리누클레오티드를 증폭시키는데 사용되어, 폴리누클레오티드가 폴리누클레오티드 서열을 밝혀내기 위한 다양한 기술에 주어질 수 있다. 이러한 방법에서, 폴리누클레오티드에서의 돌연변이가 검출될 수 있으며, 감염 또는 이의 단계 또는 과정을 진단하고/거나 예후하는데 사용되거나, 감염 제제를 혈청형 분석하고/거나 분류하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 개체로부터 유래된 샘플, 예컨대, 신체에서 얻은 물질로부터 SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 서열을 지니는 폴리누클레오티드의 증가된 발현 수준을 측정하는 것을 포함하여, 질환, 바람직하게는 세균 감염증, 더욱 바람직하게는 모락셀라 카탈리스에 의해서 유발된 감염증을 진단하는 방법을 제공한다. BASB020 폴리누클레오티드의 증가되거나 감소된 발현은 폴리누클레오티드의 정량화를 위한 본 기술분야에 공지된 방법 중의 어느 한 방법, 예컨대, 증폭, PCR, RT-PCR, RNase 보호, 노던 블로팅(Northern blotting), 분광분석 및 그 밖의 하이브리드화 방법을 이용함으로써 측정될 수 있다.
또한, 정상의 조절 조직 샘플과 비교하여 BASB020 폴리펩티드의 과발현을 검출하는 본 발명에 따른 진단 검정이 예를 들어 감염의 존재를 검출하는데 사용될 수 있다. 숙주로부터 유래된 샘플, 예컨대, 신체로부터의 물질에서 BASB020 폴리펩티드의 수준을 측정하는데 이용될 수 있는 검정 기술은 본 기술분야의 당업자에게 공지되어 있다. 이러한 검정 방법에는 방사성면역검정, 경쟁 결합 검정, 웨스턴 블롯 분석(Western Blot analysis), 항체 샌드위치 검정, 항체 검출 및 ELISA 검정이 포함된다.
본 발명의 폴리누클레오티드는 폴리누클레오티드 어레이, 바람직하게는 고밀도 어레이 또는 그리드(grid)의 성분으로 사용될 수 있다. 이들 고밀도 어레이는 진단 및 예후 목적에 특히 유용하다. 예를 들어, 상이한 유전자를 포함하며, 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 폴리누클레오티드들을 추가로 포함하는 한 세트의 스팟은, 예컨대, 신체로부터 얻은 샘플로부터 얻거나 유래된 프로브를 사용하여 프로빙, 예를 들어 하이브리드화 또는 핵산 증폭을 이용하여 프로빙함으로써, 개체중의 특정의 폴리누클레오티드 서열 또는 관련 서열의 존재를 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 존재는 병원체의 존재, 특히, 모락셀라 카탈리스의 존재를 나타낼 수 있으며, 질환 또는 질환의 과정을 진단하고/거나 예후하는데 유용할 수 있다. SEQ ID NO: 1, 3, 5 또는 7의 폴리누클레오티드 서열의 많은 변이체를 포함하는 그리드가 바람직하다. 또한 SEQ ID NO: 2, 4, 6 또는 8의 폴리펩티드 서열을 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열의 많은 변이체를 포함하는 것이 바람직하다.
항체
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드 또는 이의 변이체, 또는 이들을 발현하는 세포가 면역원으로 사용되어 각각 그러한 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 면역 특이적인 항체를 생산하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 특정의 바람직한 구체예에서, 본 발명은 BASB020 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대한 항체를 제공한다.
본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대해서 생성된 항체는 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 또는 이들 중 하나 또는 둘 모두의 에피토프 함유 단편, 이들 중 하나 또는 둘 모두의 유사체, 또는 이들 중 하나 또는 둘 모두를 발현하는 세포를 통상의 프로토콜을 이용하여 동물, 바람직하게는 비-사람에게 투여함으로써 얻을 수 있다. 단클론 항체를 제조하는 경우에, 연속 세포주 배양물에 의해서 생성된 항체를 제공하는 본 기술 분야에 공지된 기술이 이용될 수 있다. 이러한 기술의 예로는 문헌[Kohler, G. and Milstein, C., Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pg. 77-96, MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc. (1985)]에 기재된 바와 같은 기술이 포함된다.
단일쇄 항체의 생산을 위한 기술(미국특허 제4,946,778호)이 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 대한 단일쇄 항체를 생성하도록 조절될 수 있다. 또한, 유전자 이식 마우스 또는 다른 유기체 또는 동물, 예컨대, 다른 포유동물이 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에 면역 특이적인 인간화된 항체를 발현시키는데 사용될 수 있다.
대안적으로, 파아지 디스플레이 기술은 항-BASB020을 가지는 지에 대해 스크리닝된 사람으로부터의 PCR 증폭된 v-유전자의 레퍼토리로부터 또는 미경험(naive) 라이브러리로부터 본 발명의 폴리펩티드에 대한 결합 활성을 지닌 항체 유전자를 선택하는데 사용될 수 있다[참조 : McCafferty, et al., (1990), Nature 348, 552-554; Marks et al., (1992) Biotechnology 10, 779-783]. 이들 항체의 친화성은 예를 들어 쇄 셔플링(chain shuffling)에 의해서 증강될 수 있다[참조 : Clackson et al., (1991) Nature 352: 628].
상기된 항체는 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 발현하는 클론을 분리하고 동정하여, 예를 들어, 친화성 크로마토그래피에 의해서 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 정제하는데 사용될 수 있다.
따라서, 특히, BASB020 폴리펩티드 또는 BASB020 폴리누클레오티드에 대한 항체가 감염증, 특히 세균 감염증을 치료하는데 사용될 수 있다.
폴리펩티드 변이체에는 본 발명의 특정 관점을 형성하는 항원적, 에피토프적 또는 면역학적으로 등가인 변이체가 포함된다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 변이체는 개체에서 면역원성을 보다 덜 갖도록 개질된다. 예를 들어, 개체가 사람인 경우, 항체는 가장 바람직하게는 "인간화"되며, 하이브리도마 유도된 항체의 상보성 결정 영역 또는 영역(들)이, 예를 들어, 문헌[Jones et al. (1986), Nature 321, 522-525 or Tempest et al., (1991) Biotechnology 9, 266-273]에 기재된 바와 같이, 사람 단클론 항체내로 이식된다.
길항제 및 작용제 - 검정 및 분자
본 발명의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 또한, 예를 들어, 세포, 세포 비함유 제제, 화학적 라이브러리, 및 천연 생성 혼합물에서 작은 분자 기질 및 리간드의 결합을 검정하는데 사용될 수 있다. 이들 기질 및 리간드는 천연의 기질 및 리간드이거나 구조 또는 기능적 의태체일 수 있다[참조 : Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2): Chapter 5 (1991)].
스크리닝 방법은 시험 화합물과 직접 또는 간접적으로 관련된 표지 수단에 의해서 시험 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드에, 또는 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 지니는 세포 또는 막, 또는 폴리펩티드의 융합 단백질에 결합하는 것을 간단하게 측정할 수 있다. 대안적으로, 스크리닝 방법은 표지된 경쟁자와의 경쟁반응을 포함할 수 있다. 또한, 이들 스크리닝 방법은 시험 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 활성화 또는 억제에 의해서 생성된 시그날을 생성하는지를 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 포함하는 세포에 적절한 검출 시스템을 사용함으로써 시험할 수 있다. 활성화의 억제제는 일반적으로 공지된 작용제의 존재하에 검정되며, 시험 화합물의 존재에 의한 작용제에 의한 활성화에 대한 효과가 관찰되고 있다. 구성적으로 활성인 폴리펩티드 및/또는 구성적으로 발현된 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는, 가능하다면 작용제 또는 억제제의 부재하에, 시험 화합물이 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 활성화를 억제하는지를 시험함으로써, 역 작용제 또는 억제제에 대한 스크리닝 방법에 사용될 수 있다. 또한, 스크리닝 방법은 간단하게는 시험 화합물을 본 발명의 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드를 함유하는 용액과 혼합하여 혼합물을 형성시키고, 혼합물중의 BASB020 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 활성을 측정하고, 혼합물의 BASB020 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 활성을 표준과 비교하는 단계를 포함한다. 융합 단백질, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같이, Fc 부분 및 BASB020 폴리펩티드로부터 제조된 단백질이 또한 고출력 스크리닝 검정에 사용되어, 본 발명의 폴리펩티드 뿐만 아니라, 계통 발생적 및/또는 기능적으로 관련된 폴리펩티드의 길항제를 동정할 수 있다[참조 : D. Bennett et al., J Mol Recognition, 8:52-58(1995); and K. Johanson et al., J Biol Chem, 270(16):9459-9471 (1995)].
폴리누클레오티드, 폴리펩티드 및 본 발명의 폴리펩티드와 결합되고/거나 상호 작용하는 항체는 또한 세포에서의 mRNA 및/또는 폴리펩티드의 생산에 대한 첨가된 화합물의 효과를 검출하는 스크리닝 방법을 형성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, ELISA 검정은 본 기술분야에 공지된 표준 방법에 의해서 단클론 및 다클론 항체를 사용하여 폴리펩티드의 분비된 또는 세포 관련된 수준을 측정하기 위해서 구성될 수 있다. 이러한 검정은 적합하게 조작된 세포 또는 조직으로부터의 폴리펩티드의 생성을 억제하거나 증강시킬 수 있는 제제(또한, 각각 길항제 또는 작용제라 일컬러짐)를 발견하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 BASB020 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드, 특히 정균성 및/또는 살균성인 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 작용을 증진(작용제) 또는 차단(길항제)하는 화합물을 동정하기 위해서 화합물을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 스크리닝 방법은 고출력 기술을 포함할 수 있다. 예를 들어, 작용제 또는 길항제를 스크리닝하기 위해서, BASB020 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드의 표지된 기질 또는 리간드를 포함하는 합성 반응 혼합물, 세포 칸막이, 예컨대, 막, 세포 엔벨로프 또는 세포벽, 또는 이의 제제가 BASB020 작용제 또는 길항제일 수 있는 시험 분자의 부재 또는 존재하에 인큐베이션된다. 시험 분자가 BASB020 폴리펩티드를 증진시키고 억제하는 능력은 표지된 리간드의 감소된 결합 또는 그러한 기질로부터의 생성물의 감소된 생성을 반영한다. 무상으로, 즉, BASB020 폴리펩티드의 효과를 유도하지 않으면서 결합하는 분자는 대부분 양호한 길항제인 듯하다. 잘 결합하며, 가능한 경우에는 기질로부터의 생성물 생산율을 증가시키거나, 시그날 트랜스덕션을 증가시키거나, 화학적 채널 활성을 증가시키는 분자는 작용제이다. 가능한 경우, 기질로부터의 생성물의 생성, 시그날 트랜스덕션, 또는 화학적 채널 활성의 속도 또는 수준의 검출은 리포터 시스템을 사용함으로써 증진될 수 있다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 리포터 시스템에는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 생성물로 전환되는 비색적 표지된 기질, BASB020 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 활성의 변화에 반응하는 리포터 유전자, 당분야에 공지된 결합 검정이 포함된다.
BASB020 작용제에 대한 검정의 또 다른 예로는 경쟁 억제 검정을 위한 적절한 조건하에 BASB020 및 잠재적 작용제를 BASB020 결합 분자, 재조합 BASB020 결합 분자, 천연 기질 또는 리간드, 또는 기질 또는 리간드 의태체와 혼합하는 경쟁 검정이 있다. BASB020은 예컨대 방사성 활성 또는 비색성 화합물에 의해서 표지되어, 결합 분자에 결합되거나 생성물로 전환된 BASB020 분자의 수가 정확하게 측정되어서 잠재적인 길항제의 효능을 검정하게 한다.
잠재적인 길항제는 특히 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 및 본 발명의 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드에 결합하는 항체을 포함하며, 그로 인해서, 이의 활성 또는 발현을 억제하거나 소멸시킨다. 효능성 길항제는 또한 BASB020 유도된 활성을 유도하지 않으면서 결합분자상의 동일한 부위와 결합하는 작은 유기 분자, 펩티드, 폴리펩티드, 예컨대, 밀접하게 관련된 단백질 또는 항체이어서, BASB020 폴리펩티드 및/또는 결합으로부터의 폴리누클레오티드를 배제함으로써 BASB020 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드의 작용 또는 발현을 억제할 수 있다.
잠재적인 길항제는 폴리펩티드의 결합부위에 결합되거나 이를 차지하는 작은 분자를 포함함으로써 세포 결합 분자에 대한 결합을 방지하여 정상적인 생물학적 활성이 억제된다. 작은 분자의 예에는 이로 한정되는 것은 아니지만 작은 유기 분자, 펩티드 또는 펩티드 유사 분자가 포함된다. 그 밖의 효능성 길항제에는 안티센스 분자가 포함된다[참조 : Okano, J. Neurochem, 56:560(1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, Boca Raton, FL (1988), for a description of these molecules]. 바람직한 잠재적인 길항제에는 BASB020의 변이체 및 이와 관련된 화합물이 포함된다.
본 발명의 또 다른 관점으로, 본 발명은 다양한 서브타입(IgG, IgM, IgA, IgE)의 면역글로블린의 중쇄 또는 경쇄의 불변영역의 가변 부분, 및 본 발명의 폴리펩티드 또는 이의 단편을 포함하는 유전자 조작된 가용성 융합 단백질에 관한 것이다. 면역글로블린으로는 힌지 영역에서 융합이 수행되는 사람 IgG, 특히 IgG1의 중쇄의 불변부분이 바람직하다. 특정의 구체예에서, Fc 부분은 혈액 응고 인자 Xa에 의해서 절단될 수 있는 절단 서열의 혼입에 의해서 간단하게 제거될 수 있다. 또한, 본 발명은 유전 공학에 의해서 이들 융합 단백질을 제조하는 방법, 및 약물 스크리닝, 진단 및 치료를 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 또 다른 관점은 또한 이러한 융합 단백질을 엔코딩하는 폴리누클레오티드에 관한 것이다. 융합 단백질 기술의 예는 국제특허출원 WO94/29458호 및 WO94/22914호를 참조할 수 있다.
본원에 제공된 폴리누클레오티드 서열 각각은 항균성 화합물의 발견 및 개발에 사용될 수 있다. 발현시에 엔코딩된 단백질은 항균성 약물의 스크리닝을 위한 표적으로 사용될 수 있다. 또한, 엔코딩된 단백질 또는 샤인-델가르노(Shine-Delgarno)의 아미노 말단 영역을 암호하는 폴리누클레오티드 서열 또는 각각의 mRNA의 번역 촉진 서열이 안티센스를 구성시키는데 사용되어 목적하는 코딩 서열의 발현을 조절할 수 있다.
본 발명은 또한 감염증의 후유증의 원인이 되는, 병원체 또는 병원체(들)와 진핵 세포 숙주, 바람직하게는 포유동물 숙주 사이의 초기 물리적인 상호작용을 방해하는 본 발명의 폴리펩티드, 폴리누클레오티드, 작용제 또는 길항제의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명의 분자는 내재 장치상의 진핵 세포, 바람직하게는 포유동물의, 세포외 매트릭스 단백질에 대한 세균, 특히, 그람 음성 양성 및/또는 그람 음성 세균의 부착을 차단하는데 사용되고/거나; 진핵 세포 숙주, 바람직하게는 포유동물, 세포외 매트릭스 단백질과 조직 손상을 매개하는 세균성 BASB020 단백질 사이의 세균성 유착을 차단하고/거나; 내재 장치의 삽입 또는 다른 수술 기술 이외의 것에 의해 개시된 감염증에서의 정상적인 발병의 진행을 차단하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에 따르면, 본 발명은 BASB020 작용제 및 길항제, 바람직하게는 정균성 또는 살균성 작용제 및 길항제를 제공한다.
본 발명의 길항제 및 작용제는 예를 들어 질환을 예방, 억제 및/또는 치료하 는데 사용될 수 있다.
또 다른 관점으로, 본 발명은 본 발명의 폴리펩티드의 미모토프(mimotope)에 관한 것이다. 미모토프는 천연 펩티드를 인식하는 항체에 의해서 인식될 수 있거나, 적합한 담체와 결합되는 경우에 본래의 펩티드를 인식하는 항체를 생성시킬 수 있는 본래의 펩티드와 충분히 유사한(서열적으로 또는 구조적으로) 펩티드 서열이다.
펩티드 미모토프는 선택된 아미노산의 첨가, 결실 또는 치환에 의해서 특정의 목적을 위해 디자인될 수 있다. 따라서, 펩티드는 단백질 담체에 대한 컨주게이션을 용이하게 하기 위해서 변형될 수 있다. 예를 들어, 어떠한 화학적 컨주게이션 방법은 말단 시스테인을 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 단백질 담체에 컨쥬게이션된 펩티드가 펩티드의 컨쥬게이션된 말단으로부터 먼 소수성 말단을 포함하여서 펩티드의 유리 비컨쥬게이션된 말단이 담체 단백질의 표면과 결합된 채 존재하도록 함으로써, 그로 인해서, 전체의 천연 분자의 구성에서 발견되는 바와 같은 펩티드의 형태와 아주 밀접하게 유사한 형태로 펩티드가 존재하게 한다. 예를 들어, 펩티드는 N-말단 시스테인 및 C-말단 소수성 아미드화된 테일을 지니도록 변경될 수 있다. 또한, 하나 이상의 아미노산의 D-입체이성체의 첨가 또는 치환이 수행되어, 예를 들어, 펩티드의 안정성을 증진시키기에 유익한 유도체를 생성시킬 수 있다.
대안적으로, 펩티드 미모토프는 자체가 파아지 디스플레이 기술(EP 0 552 267 B1)과 같은 기술을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체를 사용하여 동정될 수 있다. 이러한 기술은 천연의 펩티드의 구조를 의태하고, 그로 인해서, 항 천연 펩티드 항체에 결합할 수 있지만, 이들 자체가 반드시 천연의 폴리펩티드에 상당한 서열 상동성을 가지지는 않는 대량의 펩티드 서열을 생성시킨다.
백신
본 발명의 또 다른 관점은, 감염, 특히 세균성 감염 및 가장 특히 모락셀라 카탈리스 감염으로부터 개체를 보호하기 위하여 항체 및/또는 T 세포 면역반응을 생성시키기에 적합한, BASB020 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체로 개체를 접종하는 것을 포함하여, 개체, 특히 포유동물, 바람직하게는 인체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 또한 면역 반응이 세균 복제를 지연시키는 방법이 제공된다. 본 발명의 또 다른 관점은 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법으로서, 질환이 개체내에서 이미 발병되었든지 그렇지 않던지 간에, 질환으로부터 개체, 바람직하게는 사람을 보호하도록, 항체 및/또는 예를 들어, 시토카인-생성 T 세포 또는 세포 독성 T 세포를 포함하는 T 세포 면역반응과 같이, 면역 반응을 유도하기 위해서, BASB020 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 생체내 발현시키기 위한, BASB020 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드, 또는 이의 단편 또는 변이체를 직접적으로 발현시키는데 필요한 핵산 벡터, 서열 또는 리보좀을 개체에 전달하는 것을 포함하는 개체에서 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 유전자를 투여하는 한가지 예는 입자 등에 대한 코팅으로서 요구되는 세포내로 유전자를 가속시키는 것이다. 이러한 핵산 벡터는 DNA, RNA, 리보자임, 개질된 핵산, DNA/RNA 하이브리드, DNA-단백질 복합체 또는 RNA-단백질 복합체를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점은, 면역학적 조성물로서, 체내에서 면역 반응이 유발될 수 있는 개체, 바람직하게는 사람내로 도입된 경우에, 이들 개체 내에서 BASB020 폴리누클레오티드 및/또는 이로부터 엔코딩된 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 유도하는, 재조합 BASB020 폴리누클레오티드 및/또는 그로부터 엔코딩된 폴리펩티드를 포함하고/거나, 본 발명의 상기 BASB020 폴리누클레오티드, 이로부터 엔코딩된 폴리펩티드, 또는 그 밖의 폴리펩티드의 항원을 엔코딩하고 발현하는 DNA 및/또는 RNA를 포함하는 면역학적 조성물에 관한 것이다. 면역 반응은 치료 또는 예방 목적으로 이용될 수 있으며 CTL 또는 CD4+ T 세포로부터 일어나고 세포성 면역과 같은 세포성 면역 및/또는 항체 면역의 형태를 취할 수 있다.
BASB020 폴리펩티드 또는 이의 단편은 스스로 항체를 생성시킬 수도 생성시키지 않을 수 있지만, 제 1 단백질을 안정화시키고 항원성 및/또는 면역원성, 및 바람직하게는 보호 특성을 지닐 수 있는 융합된 단백질 또는 개질된 단백질을 생성시킬 수 있는 보조-단백질 또는 화학적 잔기와 융합될 수 있다. 따라서, 융합된 재조합 단백질은, 바람직하게는, 헤모필러스 인플루엔자, 글루타티온-S-트랜스페라제(GST) 또는 베타-칼락토시다제로부터의 리포단백질 D와 같은 항원 보조-단백질, 또는 단백질을 안정화시키고 이의 생성 및 정제를 용이하게 하는 어떠한 그 밖의 비교적 큰 보조-단백질을 추가로 포함한다. 또한, 보조-단백질은 이 단백질을 수용하는 유기체의 면역 시스템을 전체적으로 자극한다는 점에서 애쥬번트로서 작용할 수 있다. 이러한 보조-단백질은 제 1 단백질의 아미노- 또는 카르복시-말단 중 하나에 부착될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드, 및 문헌[Sato, Y. et al., Science 273:352 (1996)]에 기재된 바와 같은 면역 자극성 DNA 서열를 포함하는 조성물, 바람직하게는 백신 조성물, 및 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 모락셀라 카탈리스와 함께 동물 감염 모델에서 유전자 면역화 실험에 사용된 폴리누클레오티드 구성물 내에서, 세균 세포 표면 단백질의 비-가변성 영역을 엔코딩하는 것으로 알려진 상기된 폴리누클레오티드 또는 이이 특정 단편을 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 실험은 예방 또는 치료 면역 반응을 유발시킬 수 있는 단백질 에피토프를 동정하는데 특히 유용할 것이다. 이러한 연구는 포유동물, 특히 인체에서의 세균 감염, 특히 모락셀라 카탈리스 감염의 예방제 또는 치료제의 개발을 위하여, 감염에 내성이 있거나 감염을 제거한 동물의 필수 기관으로부터 유래된 특정의 목적를 위한 단클론 항체의 제조를 가능하게 할 것이다.
본 발명은 또한 적합한 담체, 예컨대, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 본 발명의 면역원성 재조합 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드를 포함하는 백신 제형을 포함한다. 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 위에서 파괴될 수 있기 때문에, 이들 각각은 바람직하게는, 예를 들어, 피하, 근육내, 정맥내 또는 피부내의 투여를 포함하여 비경구적으로 투여된다. 비경구 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 정균성 화합물, 및 제형이 개체의 체액, 바람직하게는 혈액과 등장이 되게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 주사 용액; 및 현탁제 또는 농후화제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 현탁액을 포함한다. 이러한 제형은 단위 용량 또는 다용량 용기, 예를 들어, 밀봉 앰플 및 바이얼에 존재할 수 있으며, 단지 사용 직전에 멸균의 액체 담체를 첨가하면 되는 동결 건조 상태로 저장될 수 있다.
본 발명의 백신 제형은 또한 제형의 면역원성을 증진시키는 애쥬번트 시스템을 포함할 수 있다. 바람직하게는 애쥬번트 시스템은 TH1 타입의 반응을 우선적으로 증가시킨다.
면역 반응은 크게 호르몬성 면역반응 또는 세포 매개된 면역 반응(통상적으로는 각각 항체와 세포 이펙터 메카니즘에 의해서 특성화됨)인 두 가지의 극단적인 종류로 분류될 수 있다. 이러한 반응의 종류는 TH1-타입 반응(세포-매개된 반응), 및 TH2-타입 면역반응(호르몬성 반응)이라 일컬어지고 있다.
극단적인 TH1-타입 면역반응은 항원 특이적, 하플로타입(haplotype) 제한된 세포독성 T 임파구, 및 천연 킬러 세포 반응의 생성에 의해서 특성화될 수 있다. 마우스에서, TH1-타입 반응은 종종 IgG2a 서브타입의 항체의 생성에 의해서 특성화되지만, 인체에서는 이러한 반응이 IgG1 타입 항체에 상응한다. TH2-타입 면역 반응은 마우스에서 IgG1, IgA, 및 IgM을 포함한 광범위한 범위의 면역글로블린 이소타입의 생성에 의해서 특성화된다.
이들 두 가지 타입의 면역 반응의 진전에 이어진 추진력은 시토카인이라는 것이 이해될 수 있을 것이다. 높은 수준의 TH1-타입 시토카인은 소정의 항체에 대한 세포 매개된 면역 반응의 유도를 선호하는 경향을 보이지만, 높은 수준의 TH2-타입 시토카인은 항원에 대한 호르몬성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향을 보인다.
TH1 및 TH2-타입 면역 반응의 구분이 절대적인 것은 아니다. 사실, 개체는 지배적으로 TH1 또는 지배적으로 TH2인 것으로 설명되는 면역반응을 지지할 수 있다. 그러나, 문헌[Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns fo lymphokine secretion lead to different functional properties, Annual review of Immunology, 7, p145-173]의 쥐 CD4+ve T 세포 클론에 기술된 것의 점에서 시토카인의 패밀리를 고려하는 것이 종종 용이하다. 통상적으로는, TH1-타입 반응은 T-임파구에 의한 INF-γ및 IL-2 시토카인과 관련된다. TH1-타입 면역 반응의 유도와 종종 직접 연관된 다른 시토카인은 IL-12와 같이 T-세포에 의해서 생성되지 않는다. 반면, TH2-타입 반응은 IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-13의 분비와 관련이 있다.
특정의 백신 애쥬번트가 TH1 또는 TH2-타입 시토카인 반응의 자극에 특히 적합하다는 것이 공지되어 있다. 통상적으로는, 백신접종 또는 감염후의 면역반응의 TH1:TH2 균형의 최상의 지표는 항원으로 재자극시킨 후의 시험관내 T 임파구에 의한 TH1 또는 TH2 시토카인의 생성에 대한 직접적인 측정, 및/또는 항원 특이적 항체 반응의 IgG1:IgG2a 비의 측정을 포함한다.
이와 같이, TH1-타입 애쥬번트는 시험관내 항원으로 재자극되는 경우에 분리된 T-세포군을 자극하여 높은 수준의 TH1-타입 시토카인을 생성시키고, TH1-타입 이소타입과 연관된 항원 특이적 면역글로블린 반응과 CD8+ 세포독성 T 임파구 둘 모두의 발생을 촉진하는 애쥬번트이다.
TH1 세포 반응을 우선적으로 자극할 수 있는 애쥬번트는 국제특허출원 WO94/00153호 및 WO95/17209호에 기재되어 있다.
3 디(De)-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A (3D-MPL)은 이러한 애쥬번트중의 하나이다. 이러한 애쥬번트는 GB 2220211(Ribi)로부터 공지되어 있다. 화학적으로는, 이러한 애쥬번트는 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 4, 5 또는 6 아실화된 쇄와의 혼합물이며, 몬타나(Montana) 소재의 리비 이뮤노켐(Bibi Immunochem)에 의해서 제조된다. De-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A의 바람직한 형태는 유럽특허 제 0 689 454 B1호(SmithKline Beecham Biologicals SA)에 개시되어 있다.
바람직하게는, 3D-MPL의 입자는 0.22 마이크론 막을 통해 멸균 여과되기에 충분히 작다(유럽특허 제 0 689 454호).
3D-MPL은 용량 당 10㎍ 내지 100㎍의 범위로 존재하고, 바람직하게는 25 내지 50㎍의 범위로 존재하며, 여기서, 항원은 전형적으로 용량 당 2 내지 50㎍으로 존재한다.
또 다른 바람직한 애쥬번트는 QS21, 퀼라자 사포나리아 몰리나(Quillaja Saponaria Molina)의 껍질로부터 유래된 Hplc 정제된 비독성 분획을 포함한다. 선택적으로, 이는 담체와 함께 또는 담체 없이 3-디-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)과 혼합될 수 있다.
QS21의 생산 방법은 미국특허 제 5,057,540호에 개시되어 있다.
QS21을 함유하는 비-반응유발성(reactogenic) 애쥬번트 제형은 상기 기재되어 있다(WO 96/33739). QS21 및 콜레스테롤을 포함하는 그러한 제형은 항원과 함께 제형되는 경우에 성공적인 TH1 자극 애쥬번트인 것으로 밝혀졌다.
TH1 세포 반응의 우선적인 자극제인 또 다른 애쥬번트에는 면역조절 올리고누클레오티드, 예를 들어, WO 96/02555호에 개시된 바와 같은 비메틸화된 CpG 서열이 포함된다.
상기된 애쥬번트와 같은 상이한 TH1 자극 애쥬번트의 조합물이 또한 TH1 세포 반응의 우선적인 자극제인 애쥬번트를 제공하는 것으로 사료되고 있다. 예를 들어, QS21은 3D-MPL과 함께 제형화될 수 있다. QS21:3D-MPL의 비율은 전형적으로는 1:10 내지 10:1; 바람직하게는 1:5 내지 5:1; 가장 실질적으로는 1:1일 것이다. 최적의 상승작용을 위한 바람직한 범위는 2.5:1 내지 1:1의 3D-MPL:QS21이다.
바람직하게는, 담체는 또한 본 발명에 따른 백신 조성물로 존재한다. 담체는 수중유 에멀션, 또는 알루미늄 염, 예컨대, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄일 수 있다.
바람직한 수중유 에멀션은 대사 가능한 오일, 예컨대, 스쿠알렌, 알파 토코페롤 및 트윈 80(Tween 80)을 포함한다. 특히 바람직한 관점으로 본 발명에 따른 백신 조성물중의 항원은 상기 에멀션중에서 QS21 및 3D-MPL과 혼합된다. 또한, 수중유 에멀션은 스판 85(span 85) 및/또는 레시틴 및/또는 트리카프릴린을 함유할 수 있다.
전형적으로는, 사람 투여의 경우에, QS21 및 3D-MPL은 백신 중에 용량 당 1㎍ 내지 200㎍, 예컨대, 10 내지 100㎍, 바람직하게는 10 내지 50㎍의 범위로 존재할 것이다. 전형적으로는, 수중유는 2 내지 10%의 스쿠알렌, 2 내지 10%의 알파 토코페롤, 및 0.3 내지 3%의 트윈 80을 포함할 것이다. 바람직하게는 스쿠알렌 : 알파 토코페롤의 비율은 1과 동일하거나 그 미만이고, 이러한 비율은 보다 안정한 에멀션을 제공한다. 스판 85는 또한 1%의 수준으로 존재할 수 있다. 일부의 경우에, 본 발명의 백신이 안정화제를 추가로 함유하는 것이 유리할 것이다.
비독성 수중유 에멀션은 바람직하게는 수성 담체중에 비독성 오일, 예를 들어, 스쿠알란 또는 스쿠알렌, 유화제, 예를 들어, 트윈 80을 함유한다. 수성 담체는, 예를 들어, 인산염 완충된 염수일 수 있다.
수중유 에멀션에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬번트 제형이 WO 95/17210호에 기재되어 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 백신 제형을 다른 항원, 특히, 암, 자가면역 질환 및 관련된 질환을 처리하는데 유용한 항원과 함께 포함하는 다가 백신 조성물을 제공한다. 이러한 다가 백신 조성물은 상기된 바와 같은 TH1 유도 애쥬번트를 포함할 수 있다.
본 발명은 특정의 BASB020 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드를 참조로 기재되고 있지만, 본 발명은 재조합 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드의 면역원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 첨가, 결실 또는 치환된 유사한 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드, 및 천연에 존재하는 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드의 단편을 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다.
조성물, 키트 및 투여
본 발명의 추가의 관점으로, 본 발명은 세포 또는 다세포 유기체에 투여하기 위한 BASB020 폴리누클레오티드 및/또는 BASB020 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본원에서 논의된 폴리누클레오티드 및/또는 폴리펩티드 또는 이들의 작용제 또는 길항제를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드 및 폴리누클레오티드는 세포, 조직 또는 유기체와 함께 사용하기 위한 비-멸균 또는 멸균의 담체, 예컨대, 개체에 투여하기에 적합한 약제학적 담체와 함께 사용될 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들어, 매질 첨가제 또는 치료학적 유효량의 본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는, 이로 한정되는 것은 아니지만, 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 조합물을 포함할 수 있다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다. 본 발명은 또한 상기된 본 발명의 조성물의 하나 이상의 성분으로 충전된 하나 이상의 용기를 포함하는 진단 및 약제학적 키트에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드, 폴리누클레오티드 및 다른 화합물은 단독으로 사용하거나 그 밖의 화합물, 예컨대, 치료 화합물과 함께 사용될 수 있다.
이를 테면, 국부, 구강, 항문, 질, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비강내, 또는 피부내 경로로의 투여를 포함하는 효과적이고 편리한 방식으로 약제 조성물을 투여할 수 있다.
치료법 또는 예방법으로, 활성제를 주사가능한 조성물, 예컨대 멸균수, 바람직하게는 등장액으로서 개인에게 투여할 수 있다.
추가적인 양상에서, 본 발명은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께, 치료적 유효량의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드(본 발명의 폴리펩티드 및/또는 폴리누클레오티드의 가용성 형태와 같은), 작용제나 길항제 펩티드 또는 저분자 화합물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 담체는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 또한 본 발명의 앞서 언급된 조성물 중 하나 이상의 성분이 충전되어 있는 하나 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 및 키트에 관한 것이다. 본 발명의 폴리펩티드, 폴리누클레오티드 및 다른 화합물들은 단독으로 사용되거나, 치료 화합물과 같은 다른 화합물과 함께 사용될 수 있다.
조성물은 이를 테면, 전신 또는 구강 경로와 같은 투여 경로에 맞게 사용할 수 있다. 전신 투여의 바람직한 형태에는 전형적으로 정맥내 주사에 의한 주입이 있다. 피하, 근육내, 또는 복강내와 같은 다른 주입 경로를 사용할 수 있다. 전신 투여를 위한 다른 방법에는 담즙염, 퓨지드산 또는 다른 세정제와 같은 침투제를 사용하는 경점막 및 경피성 투여가 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드 또는 다른 화합물을 장내 제형물 또는 캡슐화된 제형물로 제형할 수 있다면, 구강 투여도 가능하다. 또한, 이러한 화합물의 투여는 연고, 이고, 겔, 용액, 분말 등의 형태로 국부적 및/또는 국소적일 수 있다.
포유 동물, 특히 인간에게 투여하기 위해서, 활성제의 일일 용량은 0.01㎎/㎏ 내지 10㎎/㎏, 전형적으로 약 1㎎/㎏인 것으로 예측된다. 어쨌든 간에, 의사는 개인에게 가장 적합하고, 특정 개인의 연령, 체중 및 반응에 따라 다른 실용량을 결정할 것이다. 상기 복용량은 평균적인 경우에 대한 예시이다. 물론, 개인에 따라 더 높거나 낮은 용량 범위가 장점이 되는 예가 있을 수 있으며, 이것은 본 발명의 범위 내에 속한다.
필수 용량 범위는 펩티드의 선택, 투여 경로, 제형의 성질, 피검자 상태의 성향 및 주치의의 판단에 의존한다. 그러나, 적합한 용량은 피검자의 체중(kg) 당 0.1 내지 100㎍의 범위이다.
백신 조성물은 주사가능한 형태가 편리하다. 통상적인 애쥬번트를 사용하여 면역 반응을 향상시킬 수 있다. 백신을 위한 적합한 단위 용량은 항원의 kg당 0.5 내지 5 ㎍이고, 이만큼의 용량을 1주 내지 3주의 간격으로 1회 내지 3회 투여하는 것이 바람직하다. 상기 명시된 용량 범위는 적합한 개인에게 투여를 배제시켜야 하지만 본 발명의 화합물에 있어서는 어떠한 독소학적 부작용도 발견되지 않을 것이다.
그러나, 필수적인 용량의 다양한 변화는 이용되는 화합물의 다양성 및 다양한 투여 경로의 상이한 효능 면에서 예상될 수 있다. 예를들면, 구강 투여는 정맥내 주사에 의한 투여보다 높은 용량을 요구할 것으로 예상된다. 이러한 용량 정도의 변화는 본 기술 분야에서 널리 이해되고 있기 때문에, 최적화를 위한 표준 실험을 사용하여 조정될 수 있다.
서열 데이터베이스, 유형 매체에서의 서열 및 알고리즘
폴리누클레오티드 및 폴리펩티드 서열은 추가적인 유사한 상동 서열을 동정하기 위해서 뿐만 아니라 이들의 2 및 3차원 구조를 결정하기 위한 유용한 정보 공급원을 형성한다. 이러한 접근은 컴퓨터 판독가능한 매체에 서열을 저장한 후, 공지된 고분자 구조 프로그램에서 저장된 데이터를 사용하거나 GCG 프로그램 패키지와 같은 널리 공지된 검색 도구를 사용하여 서열 데이터베이스를 검색하기에 매우 용이하다.
또한, 본 발명은 문자 서열 또는 스트링, 특히 유전자 서열 또는 엔코딩된 단백질 서열을 분석하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 서열 분석의 바람직한 방법에는 동일성 및 유사성 분석, DNA, RNA 및 단백질 구조 분석, 서열 조립, 분기적 분석, 서열 모티프 분석, 오픈 리딩 프레임 결정, 핵산 염기 콜링, 코돈 사용 분석, 핵산 염기 트리밍, 및 서열 크로마토그래피 피크 분석과 같은 서열 상동 분석 방법이 있다.
컴퓨터를 이용한 방법은 상동성 동정을 수행하기 위해 사용한다. 이 방법은 컴퓨터 해독 가능한 매체에 본 발명의 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 제 1 폴리누클레오티드 서열을 제공하는 단계; 및 상기 제 1 폴리누클레오티드 서열을 적어도 하나의 제 2 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 상동성을 확인하는 단계를 포함한다.
또한 컴퓨터를 이용한 방법은 상동성 확인을 수행하기 위해 제공되고, 이 방법은 컴퓨터 해독 가능한 매체에 본 발명의 폴리펩티드의 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드 서열을 제공하는 단계 및 상기 제 1 폴리펩티드 서열을 적어도 하나의 제 2 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 비교하여 상동성을 동정하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 인용된 특허 및 특허출원을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 모든 간행물 및 참조문헌을 본 명세서에 각각의 간행물 또는 참조문헌이 완전히 발행된 것 같이 참조로서 인용되도록 상세하고 개별적으로 명시된 것 처럼 이들 전체를 참조로서 인용하였다. 또한, 본 출원이 우선권을 주장하는 모든 특허 출원을 간행물 및 참고문헌에 대해 상기에 기술하는 방식으로 전체로서 본 명세서에 참조로 인용하였다.
정의
"동일성(identity)"은, 당 분야에 알려진 바와 같이, 경우에 따라, 서열을 비교함으로써 결정되는 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상의 폴리누클레오티드 서열 사이의 관계이다. 당 분야에서, "동일성"은, 경우에 따라, 서열의 스트링 사이의 매치에 의해 결정되는 폴리펩티드 서열 또는 폴리누클레오티드 서열 사이의 서열 관련성의 정도를 또한 의미한다. "동일성"은 다음 문헌들에 기재된 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 공지된 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다 [참조: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press. New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heine, G., Academic Press. 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York; 1991; and Carillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)]. 동일성을 결정하는 방법은 시험되는 서열 사이의 최대 매치를 제공하도록 설계된다. 더욱이, 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 입수할 수 있는 컴퓨터 프로그램으로 성문화되어 있다. 2개의 서열 사이의 동일성을 결정하는 컴퓨터 프로그램으로는 GCG 프로그램 패키지 중의 GAP 프로그램(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN(Altschul, S.F. et al., J. Molec. Biol. 215: 403-410 (1990)), 및 FASTA(Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85; 2444-2448 (1988))가 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 프로그램 중 BLAST 군은 NCBI 및 그 밖의 입수처(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990))로부터 공개적으로 입수할 수 있다. 널리 공지된 스미스 워터만(Smith Waterman) 알고리즘이 동일성을 결정하는 데에 또한 이용될 수 있다.
폴리펩티드 서열 비교를 위한 파라미터로는 하기 사항들이 있다:
알고리즘: 니들만(Needlman)과 분쉬(Wunsch)[J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)]
비교 매트릭스: BLOSSUM62 (Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89:10915-10919 (1992))
갭 패널티(Gap Penalty): 8
갭 길이 패널티(Gap Length Penalty): 2
이러한 파라미터와 관련하여 유용한 프로그램은 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, Madison WI)의 "갭" 프로그램으로서 공개적으로 입수할 수 있다. 상기 언급된 파라미터는 펩티드 비교를 위한 디폴트 파라미터이다 (여기서, 말단 갭에 대한 패널티는 없다).
폴리누클레오티드 비교를 위한 파라미터로는 하기 사항들이 있다:
알고리즘: 니들만과 분쉬 [J. Mol Biol. 48: 443-453 (1970)]
비교 매트릭스: 매치 = +10, 미스매치 = 0
갭 패널티: 50
갭 길이 패널티: 3
입수가능한 프로그램: 제네틱스 컴퓨터 그룹(Madison WI)의 "갭" 프로그램. 이들 파라미터는 핵산 비교를 위한 디폴트 파라미터이다.
폴리누클레오티드와 폴리펩티드에 대한 "동일성"의 바람직한 의미는, 경우에 따라, 하기 (1)과 (2)로 규정된다.
(1) 폴리누클레오티드 구체예는 SEQ ID NO:1의 기준 서열과 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 이상 동일성을 가지는 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드를 추가로 포함하며, 상기 폴리누클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1의 기준 서열과 동일할 수 있거나, 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 누클레오티드 변화를 포함할 수 있고, 상기 변화는 하나 이상의 누클레오티드 결실, 트랜지션(transition)과 트랜스버젼(transversion)을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변화는 기준 서열의 누클레오티드 사이에 개별적으로 산재되거나 기준 서열내의 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된 형태로, 기준 누클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있고, 누클레오티드 변화의 갯수는, SEQ ID NO:1의 전체 누클레오티드 갯수와 퍼센트 동일성을 나타내는 정수를 곱하고 이를 100으로 나눈 후, SEQ ID NO:1의 전체 누클레오티드 갯수에서 이러한 적(積)을 뺌으로써 결정되거나; 하기 식에 의해 결정된다:
n n≤x n - (x n·y)
상기 식에서, n n은 누클레오티드 변화의 갯수이고, x n는 SEQ ID NO:1의 전체 누클레오티드 갯수이고, y는 50%의 경우 0.50, 60%의 경우 0.60, 70%의 경우 0.70, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85, 90%의 경우 0.90, 95%의 경우 0.95, 97%의 경우 0.97 또는 100%의 경우 1.00 이고, ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이며, x n과 y의 임의의 정수 이외의 적은 x n로부터 이를 빼기 전에 반올림하여 가장 가까운 정수가 되게 한다. SEQ ID NO:2의 폴리펩티드를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열의 변화는 이러한 코딩 서열에서 넌센스, 미스센스 또는 프레임시프트 돌연변이를 생성시켜서, 이러한 변화가 일어난 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 폴리펩티드를 변화시킬 수 있다.
예로서, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:1의 기준 서열과 동일할 수 있거나(즉, 100% 동일할 수 있다), 퍼센트 동일성이 100% 미만의 동일성이 되도록 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 핵산 변화를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 하나 이상의 핵산 결실, 트랜지션과 트랜스버젼을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되며, 상기 변화는 기준 서열의 누클레오티드 사이에 개별적으로 산재되거나 기준 서열내의 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된 형태로, 기준 폴리누클레오티드 서열의 5' 또는 3' 말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 핵산 변화의 갯수는, SEQ ID NO:1의 전체 핵산 갯수와 퍼센트 동일성을 나타내는 정수를 곱하고 이를 100으로 나눈 후, SEQ ID NO:1의 전체 핵산 갯수에서 이러한 적(積)을 뺌으로써 결정되거나; 하기 식에 의해 결정된다:
n n≤x n - (x n·y)
상기 식에서, n n은 핵산 변화의 갯수이고, x n는 SEQ ID NO:1의 전체 핵산 갯수이고, y는, 예를 들어 70%의 경우 0.70, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85 등이고, 곱셈 연산자에 대한 기호이며, x n과 y의 임의의 정수 이외의 적은 x n로부터 이를 빼기 전에 반올림하여 가장 가까운 정수가 되게 한다.
(2) 폴리펩티드 구체예는 SEQ ID NO:2의 폴리펩티드 기준 서열과 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95, 97 또는 100% 이상의 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 폴리펩티드를 추가로 포함하며, 상기 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:2의 기준 서열과 동일할 수 있거나, 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있고, 상기 변화는 하나 이상의 아미노산 결실, 보존적 및 비보존적 치환을 포함하는 치환, 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 변화는 기준 서열의 누클레오티드 사이에 개별적으로 산재되거나 기준 서열내의 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된 형태로, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 위치 또는 카르복시-말단 위치에서 일어날 수 있거나, 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있고, 아미노산 변화의 상기 갯수는 SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수와 퍼센트 동일성을 나타내는 정수를 곱하고 이를 100으로 나눈 후, SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수로부터 이러한 적을 뺌으로써 결정되거나; 하기 식에 의해 결정된다:
n a≤x a - (x a·y)
상기 식에서, n a는 아미노산 변화의 갯수이고, x a는 SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수이고, y는 50%의 경우 0.50, 60%의 경우 0.60, 70%의 경우 0.70, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85, 90%의 경우 0.90, 95%의 경우 0.95, 97%의 경우 0.97 또는 100%의 경우 1.00 이고, ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이며, x a과 y의 임의의 정수 이외의 적은 x a로부터 이를 빼기 전에 반올림하여 가장 가까운 정수가 되게 한다.
예로서, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:2의 기준 서열과 동일할 수 있거나(즉, 100% 동일할 수 있다), 퍼센트 동일성이 100% 미만의 동일성이 되도록 기준 서열과 비교하여 특정 정수 이하의 아미노산 변화를 포함할 수 있다. 이러한 변화는 하나 이상의 아미노산 결실, 보존적 치환 및 비보존적 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성된 군으로부터 선택되고, 상기 변화는 기준 서열의 아미노산 사이에 개별적으로 산재되거나 기준 서열내의 하나 이상의 연속된 그룹에 산재된 형태로, 기준 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 위치 또는 카르복시-말단 위치에서 일어날 수 있거나 이들 말단 위치 사이의 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 주어진 % 동일성에 대한 아미노산 변화의 갯수는 SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수와 퍼센트 동일성을 나타내는 정수를 곱하고 이를 100으로 나눈 후, SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수로부터 이러한 적을 뺌으로써 결정되거나; 하기 식에 의해 결정될 수 있다.
n a≤x a - (x a·y)
상기 식에서, n a는 아미노산 변화의 갯수이고, x a는 SEQ ID NO:2의 전체 아미노산 갯수이고, y는 예를 들어, 70%의 경우 0.70, 80%의 경우 0.80, 85%의 경우 0.85 등 이고, ·는 곱셈 연산자에 대한 기호이며, x a과 y의 임의의 정수 이외의 적은 x a로부터 이를 빼기 전에 반올림하여 가장 가까운 정수가 되게 한다.
"개체(들)"은, 생물체와 관련하여 본원에 사용되는 경우, 후생동물, 포유동물, 오비드(ovid), 소과동물, 유인원, 영장류 동물 및 사람을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다세포 진핵생물을 의미한다.
"단리된"이란 천연 상태로부터 "인간에 의해" 변화된 상태를 의미하며, 즉, 자연 발생된 경우, 변화되거나, 최초 환경으로부터 분리되거나, 이 둘 모두가 일어남을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 생물체에 본래 존재하는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 "단리된" 상태가 아니지만, 천연 상태의 공존 물질로부터 분리된 동일한 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 본원에 사용되는 바와 같이 "단리된" 상태이다. 더욱이, 형질전환, 유전자 조작 또는 임의의 다른 재조합 방법에 의해 생물체내로 도입되는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드는 이것이 살아있거나 살아있지 않을 수 있는 상기 생물체에 여전히 존재한다고 하더라도 "단리된" 상태이다.
"폴리누클레오티드(들)"은 일반적으로 임의의 폴리리보누클레오티드 또는 폴리데옥시리보누클레오티드를 의미하며, 단일 가닥 영역과 이중 가닥 영역을 포함하는, 개질되지 않은 RNA 또는 DNA일 수 있거나 개질된 RNA 또는 DNA일 수 있다.
"변이체"는 기준 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드와는 상이하지만 본질적인 특성은 보유하고 있는 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 폴리누클레오티드의 전형적인 변이체는 또 다른 기준 폴리누클레오티드와 누클레오티드 서열이 상이하다. 변이체의 누클레오티드의 변화는 기준 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시킬 수도 있고, 변화시키지 않을 수도 있다. 누클레오티드 변화는, 하기 논의되는 바와 같이, 기준 서열에 의해 엔코딩된 폴리펩티드의 아미노산 치환, 첨가, 결실, 융합 및 트렁케이션(truncation)을 일으킬 수 있다. 폴리펩티드의 전형적인 변이체는 또 다른 기준 폴리펩티드와 아미노산 서열이 상이하다. 일반적으로, 기준 폴리펩티드와 변이체의 서열이 전반적으로 매우 유사하고 다수의 영역에서 동일해 지도록 차이가 제한된다. 변이체와 기준 폴리펩티드는 임의로 조합된 하나 이상의 치환, 첨가, 결실에 의해 아미노산이 상이할 수 있다. 치환되거나 삽입된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 엔코딩된 잔기이거나 그렇지 않을 수 있다. 폴리누클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체와 같은 천연 변이체이거나, 자연 발생하는 것으로 알려져 있지 않은 변이체일 수 있다. 폴리누클레오티드와 폴리펩티드의 자연 발생하지 않는 변이체는 돌연변이유발 기법 또는 직접 합성법에 의해 제조될 수 있다.
"질병(들)"은 예를 들어, 유아와 어린이 중이염, 노인 폐렴, 정맥동염, 병원(病院)성 감염 및 침습성 질병, 청각 상실을 수반하는 만성 중이염, 중이에서의 유체 축적, 청각 신경 손상, 언어 습득 지연, 상기도의 감염 및 중이의 염증을 포함하는, 세균에 의한 감염에 의해 유발되거나 이와 관련된 임의의 질병을 의미한다.
하기 실시예들은 상세하게 기술된 것을 제외하고는 당업자들에게 널리 공지되어 일반적인 표준 기술을 사용하여 수행한 것이다. 이들 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1:
모락셀라 카탈리스( Moraxella catarrhalis ) 균주 ATCC 43617로부터 BASB020 유전자의 발견 및 확인된 DNA 서열분석
SEQ ID NO: 1의 BASB020 유전자를 먼저 모락셀라 카탈리스 균주 ATCC 43617(이는 또한 균주 Mc2931로 언급된다)의 완성되지 않은 게놈 DNA 서열을 함유하는 Incyte PathoSeq 데이타베이스에서 발견하였다. SEQ ID NO: 2로 제시된 BASB020 폴리누클레오티드 서열의 번역은 세르풀리나 히오디센테리애 (Serpulina hyodysenteriae)의 TlyC 헤모리신 단백질과의 상당한 유사성(227개의 아미노산 중첩에서 36% 동일성)을 나타냈다.
BASB020 유전자의 서열을 추가로 실험적으로 동정하였다. 이를 위해서, 게놈 DNA를 QIAGEN 게놈 DNA 추출 키트(Qiagen Gmbh)를 사용하여 모락셀라 카탈리스 세포(균주 ATCC 43617)의 1010개의 세포로부터 추출하고, 이 물질 1㎍을 프라이머 E475781a(5'-ACT TGA ATA AAA CCG AGT G-3')[SEQ ID NO: 9] 및 E475782a(5'-GAC ATT GGC CGC AAC ATG C-3')[SEQ ID NO: 10]를 사용하여 중합효소 연쇄 반응시켜 DNA를 증폭시켰다. 이러한 PCR 생성물을 Biorobot 9600(Qiagen Gmbh) 장치상에서 정제시키고 Big Dye Cycle Sequencing 키트(Perkin-Elmer) 및 ABI 377/PRISM DNA 서열분석기를 사용하여 DNA 서열분석하였다. DNA 서열분석을 2의 여분을 갖는 두 가닥 모두에서 수행하고 완전 길이 서열을 SequencherTM 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 어셈블링시켰다. 생성된 DNA 서열은 SEQ ID NO:1과 100% 동일한 것으로 판명되었다.
실시예 2:
수개의 모락셀라 카탈리스 균주 중에서 BASB020 유전자의 변이성 분석.
2A: 제한 단편 길이 분석 (RFLP: Restriction Fragment Length Analysis)
게놈 DNA를 하기에 기술되는 바와 같이 16개의 모락셀라 카탈리스(표 1에 주어짐)로부터 추출하였다. 모락셀라 카탈리스를 BHI 아가 플레이트상에 단일 콜로니를 형성시키기 위해 스트리킹(streaking)하고 37℃에서 밤새 성장시켰다. 3개 또는 4개의 단일 콜로니를 가려내어 약 1.5ml BHI(Brain-heart infusion) 브로쓰 시드 배양액에 접종하는 데 사용하였고 이를 37℃에서 약 300rpm 진탕 인큐베이터에서 밤새 성장시켰다. 약 150ml의 BHI 브로쓰가 들어있는 500ml 얼른마이어 플라스크에 시드 배양물을 접종하고 약 175rpm의 진탕 인큐베이터에서 37℃에서 약 12 내지 16시간 동안 성장시켜 DNA 단리를 위한 세포 덩어리를 생성시켰다. 세포를 실온에서 15분 동안 약 2000 X g으로 Sorvall GSA 로터로 원심분리시킴으로써 수집하였다. 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 약 5.0ml의 멸균수중에 현탁시켰다. 동량의 용해 완충액(200mM NaCl, 20mM EDTA, 40mM Tris-Hcl, pH 8.0, 0.5%(w/v) SDS, 0.5%(v/v) 2-머캡토에탄올 및 250㎍/ml의 프로테나아제 K)를 첨가하고 세포를 적당한 교반 및 균질화에 의해 현탁시켰다. 그후, 세포 현탁액을 50℃에서 약 12시간 동안 인큐베이팅시켜 세균을 용해시키고 염색체 DNA를 유리시켰다. 5.0ml의 NaCl(멸균수중의 약 6.0M)을 첨가하고 실온에서 Sorvall SS34 로터에서 약 5,500 X g로 원심분리시킴으로써 단백질분해성 물질을 침전시켰다. 염색체 DNA를 2배 부피의 100% 에탄올을 첨가함으로써 투명해진 상층액으로부터 침전시켰다. 응집된 DNA를 수집하고 소량의 70% 에탄올 용액중에서의 적당한 교반에 의해 세척하였다. 정제된 염색체 DNA를 멸균수중에 현탁시키고 가벼운 록킹(rocking)에 의해 4℃에서 밤새 용해/처리하였다. 용해된 DNA의 농도를 1.0 O.D. 유닛 내지 약 50㎍/ml의 흡광 계수를 사용하여 260nm에서 분광광도계로 측정하였다.
다음, 이 물질을 MC-Hly3-BamF (5'-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGA TCC ATG CGT GGT CTT AGG CGT TGG TTA TCC ACC G-3')[SEQ ID NO: 11] 및 MC-Hyl3-SalRC (5-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTA TTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG-3')[SEQ ID NO: 12] 올리고누클레오티드를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 DNA를 증폭시켰다. 그후, 상응하는 BASB020 유전자 앰플리콘을 제한 효소(Acil, Alul, HphI, MseI, NIaIII, Tsp509I)를 사용하여 독립적으로 가수분해시키고, 제한 생성물을 문헌["Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Second Edition, Eds: Sambrook, Fritsch & Maniatis, Cold Spring Harbor press 1989"]에 기술된 바와 같이 표준 분자 생물학 방법을 사용하여 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리시켰다. 생성된 전기영동 겔의 사진을 도 1에 도시하였다. 각각의 균주에 있어서, 6개의 제한 효소에 상응하는 RFLP 패턴을 스코어링(scoring)시키고 조합하였다. 그후, RFLP 패턴의 동일한 조합을 갖는 균주의 군을 정의하였다. 이러한 방법을 사용하여, 본 연구에서 시험된 균주를 6개의 게놈 군으로 분류하였다(제 1군: Mc2904, Mc2905, Mc2906; 제 2군: Mc2907, Mc2913; 제 3군: Mc2908, Mc2909, Mc2975; 제 4군: Mc2910, Mc2912, Mc2956; 제 5군: Mc2911; 제 6군: Mc2926). 이들 데이타는 본 연구에서 사용된 모락셀라 카탈리스 종이 BASB020 유전자에 대해 일부 누클레오티드 서열 다양성을 나타냄을 증명하는 것이다.
2B: 다른 균주에서의 DNA 서열분석
BASB020 서열을 결정하는데 사용된 ATCC 43617(Mc2931) 균주를 RFLP에 의해 3개의 군으로 분류하였다. 실시예 1에 기술된 실험 방법을 사용하여, BASB020 유전자의 서열을 또한 3개의 다른 RFLP 군(제 1군(Mc2969); 제 2군(Mc2913) 및 제 4군(Mc2912))을 대표하는 모락셀라 카탈리스 균주에 대해 결정하였다. 균주 Mc2912, Mc2913 및 Mc2969의 BASB020 유전자의 폴리누클레오티드 서열을 각각 SEQ ID NO:4, 6 및 8로 제시하였다. DNASTAR 레이저진 패키지로부터 MegAlign 프로그램을 사용하여, SEQ ID NO:1, 3, 5 및 7의 폴리누클레오티드 서열의 다수 정렬을 수행하고 도 2에 도시하였다. 동일성에 대한 서열 상호간의 비교를 표 3에 요약하였으며, 표 3은 4개의 BASB020 단백질 서열이 99% 이상의 동일성 수준으로 모두 유사함을 보여주였다.
표 1: 본 연구에 사용된 모락셀라 카탈리스 균주의 특성
균주 단리시킨 국가 공급원
Mc2904 미국 고실천자(Tympanocentesis)
Mc2905 미국 고실천자
Mc2906 미국 고실천자
Mc2907 미국 고실천자
Mc2908 미국 급성 이염 고실천자
Mc2909 미국 고실천자
Mc2910 미국 고실천자
Mc2911 미국 급성 이염 고실천자
Mc2912 미국 급성 이염 고실천자
Mc2913 미국 급성 이염 고실천자
Mc2926 미국 고실천자
Mc2931/ATCC 미국 경기관 흡입물
Mc2956 핀란드 중이 유체
Mc2960 핀란드 중이 유체
Mc2969 노르웨이 비인강(인두염-비염)
Mc2975 노르웨이 비인강(비염)
표 2: BASB020 폴리누클레오티드 서열 상호간의 동일성(%)
Figure 112000023879519-pct00001
표 3: BASB020 폴리펩티드 서열 상호간의 동일성(%)
Figure 112000023879519-pct00002
실시예 3 : 재조합 BASB020을 발현시키기 위한 플라스미드의 제조
A : BASB020의 클로닝
정방향([SEQ ID NO : 11]) 및 역방향([SEQ ID NO : 12]) 증폭 프라이머내에 각각 조작되어진 BamHI 및 SalI 제한 부위는 시판되는 E. coli 발현 플라스미드 pQE30 (QiaGen, 암피실린에 내성적)으로의 504 bp PCR 생성물의 방향성 클로닝을 허용하여 성숙한 BASB020 단백질이 N-말단에 (His)6 친화도 크로마토그래피 태그(tag)를 함유하는 융합 단백질로서 발현될 수 있게 하였다. 제조업자의 설명서에 따라 실리카겔을 기재로 한 스핀 컬럼(QiaGen)을 사용하여 BASB020 PCR 생성물을 증폭 반응으로부터 정제하였다. 클로닝에 필요한 BamHI 및 SalI 말단을 생성시키기 위해, 정제된 PCR 생성물을 제조업자(Life Technologies)가 추천하는 바와 같이 BamHI 및 SalI 제한 효소로 순차적으로 분해시켰다. 제 1 제한 분해를 수행한 후, PCR 생성물을 상기와 같이 스핀 컬럼을 사용하여 정제하여 염을 제거하고 제 2 효소 분해전에 멸균수에 용리시켰다. 분해된 DNA 단편을 pQE30 플라스미드에 의한 연결 전에 실리카겔을 기재로 한 스핀 컬럼을 사용하여 또 한번 정제하였다.
B : 발현 벡터의 제조
라이게이션용 발현 플라스미드 pQE30을 제조하기 위해, BamHI 및 SalI 둘 모두로 유사하게 분해시킨 후 제조업자의 설명서에 따라서 송아지 창자의 포스파타아제(CIP, 약 0.02유닛/5' 말단의 pmole, Life Technologies)로 처리하여 자가 라이게이션을 저지시켰다. 제조된 벡터의 약 5배 몰 과량의 분해된 단편을 사용하여 라이게이션 반응을 계획대로 진행시켰다. 당해 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하는 표준 약 20㎕ 라이게이션 반응(약 16℃, 약 16시간)을 T4 DNA 리가아제(약 2.0 유닛/반응, Life Technologies)를 사용하여 수행하였다. 라이게이션 분취액(약 5㎕)을 사용하여 전기형질전환용 컨피턴트 M15(pREP4) 세포를 당해 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라서 형질전환시켰다. LB 브로쓰 약 1.0ml중의 37℃에서 약 2-3시간 방치시킨 후, 형질전환된 세포를 카나마이신(50㎍/ml) 및 암피실린(100㎍/ml)을 함유하는 LB 아가(agar) 플레이트상에 플레이팅시켰다. 상기 항생물질 둘 모두를 선택 배지에 포함시켜 모든 형질전환된 세포가 pQE30에 단백질의 IPTG 유도 가능한 발현에 대한 발현의 억제에 필요한 lacIa 유전자를 운반하는 pREP4 플라스미드(KnR), 및 pQE30-BASB020 플라스미드(ApR) 둘 모두를 운반하고 있음을 확실케 하였다. 플레이트를 약 16시간 동안 37℃에서 밤새 배양시켰다. 각각의 KnR/ApR 클론을 살균 이쑤시게로 가려내고 이를 사용하여 약 1.0ml LB KnR/ApR 브로쓰 배양액 뿐만 아니라 새로운 LB KnR/ApR 플레이트에 "패치(patch)" 접종시켰다. 패치 플레이트와 브로쓰 배양액 둘 모두를 표준 배양기(플레이트) 또는 진동 수조중에서 37℃에서 밤새 배양시켰다.
전체 세포를 기본으로 한 PCR 분석을 사용하여 형질전환체가 BASB020 DNA 삽입물을 함유하는지를 입증하였다. 여기에서, 약 1.0ml의 밤새 배양시킨 LB Kn/Ap 브로쓰 배양액을 1:5ml의 폴리프로필렌 튜브로 옮기고 베크만(Beckmann) 마이크로원심분리기에서의 원심분리(약 3분, 실온, 약 12,000Xg)에 의해 세포를 수집하였다. 세포 펠릿을 약 200㎕의 멸균수에 현탁시키고 약 10㎍의 분취액을 사용하여 BASB020 정방향 및 역방향 증폭 프라이머 둘 모두를 함유하는 약 50㎕ 최종 용적의 PCR 반응을 계획대로 수행하였다. PCR 반응 성분의 최종 농도는 약 5.0유닛의 Taq 중합효소를 사용한 것을 제외하고는 실시예 2에 명시된 농도와 본질적으로 동일하였다. 초기의 95℃ 변성 단계를 3분까지 증가시켜 세균 세포의 열적 파괴 및 플라스미드 DNA의 라이게이션을 보장하였다. ABI 모델 9700 써멀 사이클러(thermal cycler : PCR 기계) 및 32사이클, 3단계 열 증폭 프로파일(즉 95℃에서 45초간; 55-58℃에서 45초간; 및 72℃에서 1분간)을 사용하여 용해된 형질전환체 샘플로부터 MC-P6 PCR 단편을 증폭시켰다. 열 증폭후, 반응물중의 약 20㎕의 분취액을 아가로스겔 전기영동법(트리스-아세테이트-EDTA(TAE) 완충액중의 0.8% 아가로스)에 의해 분석하였다. 겔 전기영동법 및 에티듐 브로마이드에 의한 착색 후, DNA 단편을 UV로 조명하여 가시화하였다. 표준 크기의 DNA 분자(1Kb의 사다리꼴 물질(ladder), Life Technologies)를 시험 샘플과 나란하게 전기영동시키고 이를 PCR 생성물의 크기를 평가하는데 사용하였다. 예기된 504bp PCR 생성물을 생성시킨 형질전환체는 BASB020 발현 구성물을 함유하는 균주로서 확인되었다. 그런 다음, 균주를 함유하는 발현 플라스미드를 재조합 BASB020의 유도 가능한 발현에 대하여 분석하였다.
C : PCR 포지티브 형질전환체의 발현 분석
상기에서 동정된 각각의 PCR 포지티드 형질전환체에 대해, 카나마이신(50㎍/ml) 및 암피실린(100㎍/ml)을 함유하는 약 5ml의 LB 브로쓰에 패치 플레이트로부터의 세포를 접종시키고, 이를 교반(약 250rpm)시키면서 37℃에서 밤새 배양시켰다. 밤새 배양한 시드 배양액의 분취액(약 1.0ml)을 약 25ml의 LB Kn/Ap 브로쓰를 함유하는 125ml 용량의 얼른마이어(erlenmeyer) 플라스크내로 접종시키고, 배양액의 혼탁도가 O.D.600에서 약 0.5에 이를 때까지, 즉, 중간 지수기(보통은 약 1.5 내지 2.0시간)까지 교반(약 250rpm)하면서 37℃에서 배양시켰다. 이때, 배양액의 거의 절반(약 12.5ml)을 125ml 용량의 플라스크에 옮기고, IPTG(멸균수에서 제조한 1.0M 스톡, Sigma)를 첨가하여 최종 농도가 1.0mM가 되게 함으로써 재조합 BASB020 단백질의 발현을 야기하였다. IPTG 유도된 배양액 및 비유도된 배양액 둘 모두의 배양을 교반시키면서 37℃에서 추가의 약 4시간 동안 지속시켰다. IPTG 유도된 배양액 및 비유도된 배양액 둘 모두를 함유하는 샘플(약 1.0ml)을 접종후 제거하고 약 3분 동안 실온에서 마이크로원심분리기에서의 원심분리에 의해 세포를 수집하였다. 개개의 세포 펠릿을 약 50㎕의 멸균수에 현탁시킨 후, 2-머캡토에탄올을 함유하는 동일한 용적의 2X 라에멜리(Laemelli) SDS-PAGE 샘플 완충액과 혼합시키고, 약 3분 동안 비등 수조중에 위치시켜 단백질을 변성시켰다. 동일 용적(약 15㎕)의 미정제 IPTG 유도된 세포 용해물과 비유도된 세포 용해물을 이중 12% 트리스/글리신 폴리아크릴아미드 겔(1mm 두께의 미니-겔(Mini-gel), Novex)상으로 로딩시켰다. 유도된 및 비유도된 용해물 샘플을 표준 SDS/트리스/글리신 유동 완충액(BioRad)을 사용하여 통상의 조건하에서 미리 착색시킨 분자량 마커(SeeBlue, Novex)와 함께 전기영동시켰다. 전기영동시킨 후, 하나의 겔을 쿠마쉬(commassie) 밝은 청색 R250(BioRad)로 착색시킨 후 탈색시켜 신규한 BASB020 IPTG 유도 가능한 단백질(들)을 가시화하였다. BioRad 미니(Mini)-프로테안 (Protean) II 블로팅 장치 및 투빈(Towbin) 메탄올(20%) 이송 완충액을 사용하여 4℃에서 약 2시간 동안 제 2 겔을 PVDF 막(구멍 크기 0.45미크론, Novex)에 전기블로팅(electroblotting)시켰다. 막의 차단 및 항체 배양을 당해 기술분야에 널리 공지된 방법에 따라서 수행하였다. 단클론 항RGS (HIS)3 항체, 이어서 HRP(QiaGen)에 컨쥬케이션된 제 2 토끼 항마우스 항체를 사용하여 BASB020 재조합 단백질의 발현 및 동일성을 확인하였다. ABT 불용성 기질을 사용하거나 아머샴 이씨엘(Amersham ECL)의 화학발광시스템을 갖는 하이퍼필름(Hyperfilm)을 사용하여 항His 항체 반응성 형태를 가시화시켰다.
D : 서열 확인
발현되는 IPTG 유도 가능한 재조합 BASB020 단백질이 정확한 오픈 리딩 프레임(open reading frame)에 있고 클로닝 인공물질로부터 발생하는 가 분자가 아님(즉, 프레임 시프트)을 추가로 입증하기 위해, 클로닝된 삽입물의 DNA 서열을 결정하였다. 통상의 비대칭 PCR 사이클 서열분석 방법(ABI Prism Dye-Terminator Cycle Sequencing, Perkin-Elmer)을 사용하여 하나의 가닥으로부터 M. catarrhalis BASB020 유전자에 대한 DNA 서열을 얻었다. 서열분석 반응을 주형으로서의 비분해된 발현 플라스미드 DNA (약 0.5㎍/rxn) 및 적합한 pQE30 벡터 특이적 및 ORF 특이적 서열분석 프라이머(약 3.5pmol/rxn)로 수행시켰다. 주형 및 서열분석 프라이머에 더하여, 각각의 서열분석 반응물(약 20㎕)은 4가지 상이한 dNTP(즉, A, G, C 및 T) 및 4개의 상응하는 ddNTP (즉, ddA, ddG, ddC 및 ddD) 종결인자 누클레오티드를 함유하였고; 각각의 말단기는 4가지 형광 염료, 즉, Joe, Tam, Rox 또는 Fam 중의 하나에 컨쥬게이션된다. 단일 가닥 서열분석 연장 생성물을, 염료 표지된 ddNTP 종결인자의 혼입에 의해 주형을 따라 임의의 위치에서 종결시켰다. 형광 염료 표지된 종결 생성물을 마이크로원심분리기 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(Princeton Genetics)을 사용하여 정제하고, 진공하에서 건조시키고, 모세관 전기영동을 위해 주형 재현탁 버퍼(Perkin-Elmer) 또는 PAGE를 위해 탈염된 포름아미드중에 용해시키고, 95℃에서 약 5분 동안 변성시키고, 고분리능 모세관 전기영동(ABI 310 자동화된 DNA 서열분석기, Perkin-Elmer) 또는 고분리능 PAGE(ABI 377 자동화된 DNA 서열분석기)를 제조업자가 추천하는 바에 따라 사용하여 분석하였다. 개개의 반응으로부터 생성된 DNA 서열 데이터를 수집하고 상대적인 형광 피크 강도를 ABI 서열 분석 소프트웨어(Perkin-Elmer)를 사용하여 파워MAC 컴퓨터에서 자동적으로 분석하였다. 개별적으로 자동 분석된 DNA 서열을 정확성을 기하고자 수작으로 편집한 후, 오토어셈블러 소프트웨어(Perkin-Elmer)를 사용하여 일치하는 단일 가닥 서열 "스트링"으로 합쳤다. 서열분석을 사용하여 발현 플라스미드가 정확한 오픈 리딩 프레임에 정확한 서열을 함유하고 있는지를 결정하였다.
실시예 4: 재조합 BASB020의 제조
세균 균주
M. catarralis 유래의 BASB020을 엔코딩하는 플라스미드(pQE30)를 함유한 대장균 M15(pREP4)의 재조합 발현 균주를 사용하여 재조합 단백질의 정제용 세포 덩어리를 제조하였다. 발현 균주를 카나마이신("Kn") 50㎍/ml 및 암피실린("Ap") 100㎍/ml를 함유한 LB 아가 플레이트상에서 배양시켜 pREP4 lacIq 대조 플라스미드 및 pQE30-BASB020 발현 제조물 모두가 유지되도록 하였다. -80℃에서 냉동저장시키기 위하여, 균주를 동일한 농도의 항생제를 함유한 LB 브로쓰에서 증식시킨 다음 30%(w/v) 글리세롤을 함유한 동일한 부피의 LB 브로쓰와 혼합하였다.
배지
50㎍/ml Kn 및 100㎍/ml Ap를 함유한 2X YT 브로쓰(Difco)로 구성된 발효 배지를 재조합 단백질의 제조에 사용하였다. 소포제를 발효기용 배지에 0.25ml/L 첨가하였다(안티포움 204, Sigma). BASB020 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여, IPTG(이소프로필 β-D-티오갈락토피라노사이드)를 발효기에 첨가하였다(1mM, 최종).
발효
50ml 작업 부피를 함유한 500-ml 삼각 시드 플라스크에 신속하게 녹인 동결된 배양물 0.3ml, 또는 선택적 아가 플레이트 배양액으로부터 수개의 콜로니로 접종시켰고, 150rpm으로 교반하는 플랫폼상에서 약 12시간 동안 37±1℃에서 배양하였다(Innova 2100, New Brunswick Scientific). 이러한 시드 배양액을 그 후 2X YT 브로쓰 및 항생제 Kn 및 Ap 모두를 함유한 5-L 작업 부피의 발효기에 접종시키기 위하여 사용하였다. 발효기(Bioflo 3000, New Brunswick Scientific)를 러쉬톤(Rushton) 임펠러에서 37±1℃, 0.2 내지 0.4VVM 공기 살포, 250rpm으로 작동시켰다. pH를 플라스크 시드 배양액 또는 발효기내에서 조절하지 않았다. 발효 동안, pH는 발효기내에서 6.5 내지 7.3이었다. IPTG(1.0M 스톡, 멸균수로 제조)를 배양이 중간 지수기(∼0.7 O.D.600 단위)에 도달하였을 때 발효기에 첨가하였다. 세포를 2 내지 4시간 동안 유도시킨 후에, 28RS Heraeus(Sepatech) 또는 RC5C 초고속 원심분리기를 사용하여 원심분리에 의해 수확하였다. 세포 페이스트를 가공할 때까지 -20℃에서 저장하였다.
정제
화학약품 및 재료
이미다졸, 구아니딘 하이드로클로라이드, 트리스(히드록시메틸), 및 EDTA(에틸렌디아민 테트라아세트산) 생명공학 이상의 등급을 아메레스코 케미컬사(Ameresco Chemical, Solon, Ohio)로부터 입수하였다. 트리톤 X-100 (t-옥틸페녹시폴리에톡시-에탄올), 인산 나트륨, 일염기성, 및 우레아는 시약 등급 이상이었고 시그마 케미컬사(Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri)로부터 입수하였다. 빙초산 및 염산은 말린크로드트 베이커사(Mallincrodt Baker Inc., Phillipsburg, New Jersey)로부터 입수하였다. 메탄올은 피셔 사이언티픽사 (Fisher Scientific, Fairlawn, New Jersey)로부터 입수하였다. 페파블록(Pefabloc)
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SC(4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐플루오라이드), 완전 프로테아제 저해제 칵테일 정제, 및 PMSF(페닐메틸-술포닐플루오라이드)를 로슈사(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, Indiana)로부터 입수하였다. 베스타틴, 펩스타틴 A, 및 E-64 프로테아제 저해제를 칼바이오켐사(Calbiochem, LaJolla, California)로부터 입수하였다. 둘베코 인산염 완충 식염수(1XPBS)는 퀄리티 바이올로지컬사(Quality Biological, Inc., Gaithersburg, Maryland)로부터 입수하였다. 둘베코 인산염 완충 식염수(10XPBS)는 바이오휘태커사(BioWhittaker, Walkersville, Maryland)로부터 입수하였다. BSA 무함유의 펜타-His 항체는 퀴아젠사(QiaGen, Valencia, California)로부터 입수하였다. 퍼옥시다제-컨쥬게이션된 AffiniPure 염소 항마우스 IgG는 잭슨 이무노 리서치사(Jackson Immuno Research, West Grove, Penn)으로부터 입수하였다. AEC 단일 용액은 지메드사(Zymed, South San Fransisco, California)로부터 입수하였다. 모든 다른 화학약품은 시약 등급 이상이었다.
Ni-NTA 초유동 수지는 퀴아젠사로부터 입수하였다. 미리 만든 트리스-글리신 4 내지 20% 및 10 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔, 모든 작업 완충액 및 용액, 씨블루 전염색 스탠다드(SeeBlue Pre-Stained Standard), 멀티마크 다색 스탠다드(MultiMark Multi-Colored Standard) 및 PVDF 이동 막을 노벡스사(Novex, San Diego, California)로부터 입수하였다. SDS-PAGE 실버 염색 키트는 다이찌 퓨어 케미칼즈사(Daiich Pure Chemicals Company Limited, Tokyo, Japan)로부터 입수하였다. 쿠마쉬 염색 용액은 바이오 래드사(Bio-Rad Laboratories, Hercules, California로부터 입수하였다. 아크로디스크(Acrodisc)
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PF 0.2㎛ 시린지 필터는 Pall Gelman Sciences, Ann Arbor, Michigan)로부터 입수하였다. GD/X 25mm 일회용 시린지 필터는 와트맨사(Whatman Inc., Clifton, New Jersey)로부터 입수하였다. 투석 튜빙 8,000 MWCO는 바이오디자인사(BioDesign Inc. Od New York, Carmal New York)로부터 입수하였다. BCA 단백질 검정 시약 및 스네이크 스킨 투석 튜빙 3,500 MWCO는 피어스 케미칼사(Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois)로부터 입수하였다.
추출 프로토콜
세포 페이스트를 실온에서 30 내지 60분 동안 녹였다. 5 내지 6g의 물질을 50ml 일회용 원심분리관내로 계량하였다. 이것에 5ml/g의 구아니딘 하이드로클로라이드(Gu-HCl) 완충액을 첨가하였다(6M 구아니딘 하이드로클로라이드, 10mM 인산 나트륨, 일염기성, 10mM 트리스 및 0.05% 트리톤 X-100, pH 8.0). 세포 페이스트를 PRO300D 프로사이언티픽 호모게나이저를 사용하여 1분 동안 3/4 동력으로 재현탁시켰다. 그 다음에, 추출된 혼합물을 실온에서 60 내지 90분 동안 느리게 교반하면서 방치하였다. 60 내지 90분 후에, 추출 혼합물을 15분 동안 15,800 x g로 원심분리시켰다(Sorvall RC5C 원심분리, 11,500rpm). 상층액(S1)을 따라내고 추가 정제를 위하여 저장하였다. 펠릿(P1)을 분석을 위하여 저장하였다.
BASB020의 니켈-NTA 수지와의 결합
S1에 Ni-NTA 수지 3 내지 4ml를 첨가하였다. 그 다음에 이를 1시간 동안 서서히 교반하면서 실온에서 방치하였다. 1시간 후에, S1/Ni-NTA를 XK16 파마시아 칼럼에 패킹하였다. 그 다음에 컬럼을 1M Gu-HCl 완충액(1M 구아니딘 하이드로클로라이드, 100mM 인산 나트륨, 일염기성, 10mM 트리스 및 0.05% 트리톤 X-100, pH 8.0)으로 세척하였다. 그 후, 이를 인산염 완충액(100mM 인산 나트륨, 일염기성, 10mM 트리스 및 0.05% 트리톤 X-100, pH 8.0)으로 세척하였다. 그 다음에 단백질을 250mM 이미다졸 완충액을 사용하여 칼럼으로부터 용리하였다(250mM 이미다졸, 100mM 인산 나트륨, 일염기성, 10mM 트리스 및 0.05% 트리톤 X-100, pH 5.9).
최종 제형화
BASB020을 잔류 Gu-HCl 및 이미다졸을 제거하기 위하여 0.1% 트리톤 X-100 및 1XPBS, pH 7.4를 3회 교환하여 하룻밤 동안 투석에 의해 제형화하였다. 정제된 단백질을 특성화하고 하기와 같은 항체를 제조하기 위해 사용하였다.
생화학적 특성화
SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
정제된 재조합 단백질을 4 내지 20% 폴리아크릴아미드 겔상에서 용해시키고 전술한 바와 같이 100V에서 1시간 동안 PVDF 막으로 전기영동시켰다[참조: Thebaine et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:4350-4354]. 그 다음에 PVDF 막을 5% 탈지분유를 함유한 둘베코 인산염 완충 식염수 25ml로 전처리하였다. 모든 후속 배양을 이러한 전처리 완충액을 사용하여 수행하였다.
PVDF 막을 면역전 혈청 또는 토끼 항His 면역 혈청 1:500 희석액 25ml으로 실온에서 1시간 동안 배양시켰다. 그 다음에, PVDF 막을 세척 완충액으로 2회 세척하였다(20mM 트리스 완충액, pH 7.5, 150mM 염화 나트륨 및 0.05% 트윈-20 함유). PVDF 막을 퍼옥시다제 표지된 염소 항토끼 IgG의 1:5000 희석액 25ml로 실온에서 30분간 배양시켰다(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). 그 다음에, PVDF 막을 세척 완충액으로 4회 세척하였고, Zymed(San Fransisco, CA)에 의해 공급된 3-아미노-9-에틸카바졸 및 과산화 요소로 각각 10분간 전개시켰다.
SDS-PAGE(도 4)의 결과는 90% 넘게 정제된 약 32 내지 35kDa 단백질을 도시하며 SDS-PAGE의 웨스턴 블롯에 의해 항RGS(His) 항체에 반응성인 것(도 5)으로 나타난다.
단백질 서열분석
모델 1090 LC를 가진 휴렛-팩커드 모델 G1000A 서열분석기 및 모델 1100 LC를 가진 휴렛-팩커드 모델 241 서열분석기상에서 명확하게 정의된 프로토콜을 사용하여 정제된 단백질의 아미노 말단 아미노산 서열분석를 수행하여 정확한 재조합 단백질의 제조를 확인하였다.
실시예 5: 재조합 BASB020에 대한 항혈청의 제조
BASB020 단백질에 대한 다가 항혈청을 2마리 토끼를 정제된 재조합 BASB020 단백질로 백신접종함으로써 생성시켰다. 각 동물에게 주사액당 약 20㎍ BASB020 단백질(완전 Freund의 애쥬번트로 시작한 다음 불완전 Freund의 애쥬번트 사용)을 약 21일 간격으로 총 3회 근육내(i.m.) 예방접종을 실시하였다. 최초 면역화 이전(채혈전) 및 35일 및 57일째에 동물로부터 채혈하였다.
항BASB020 단백질 역가를 정제된 재조합 BASB020 단백질(0.5㎍/웰)을 사용하여 ELISA에 의해 측정하였다. 역가는 하기 방정식으로 계산할 때, 0.1 이상인 최고 희석액으로서 정의된다: 2개의 시험 샘플 항혈청의 평균 OD - 2개의 시험 샘플 완충액의 평균 OD. 3회 예방접종 이후의 역가는 3000 내지 8000이었다.
항혈청을 상기 실시예 4에 기재된 웨스턴 블롯에서 단백질을 확인하기 위한 제 1의 항체로서 사용하였다. 웨스턴 블롯은 면역화시킨 동물의 혈청에서 항BASB020 항체의 존재를 증명하였다.
실시예 6. 면역학적 특성화
웨스턴 블롯 분석
ATCC49143, 및 ATCC43617, 및 다양한 지역으로부터의 임상적 단리체를 포함하는 모락셀라 카탈리스의 수개의 균주를 쵸콜렛 아가 플레이트에서 48시간동안 35℃에서 5% CO2중에 증식시켰다. 수개의 콜로니를 사용하여 250㎖ 플라스크중의 뮐러 힌톤 브로쓰의 25㎖에 접종시켰다. 배양물을 하룻밤 증식시키고, 원심분리시켜 수집하였다. 다음, 30㎍의 세포를 150㎍의 PAGE 샘플 완충액(4% 소듐 도데실 설페이트 및 20% 글리세롤을 함유하는 pH8.8,의 360mM의 트리스 완충액)중에 현탁하여 용해시키고, 현탁액을 100℃에서 5분간 배양했다. 상기 용해된 세포를 4-20% 폴리아크릴아미드겔상에 전기영동시키고, 분리된 단백질을 상기한 바와 같이 100V에서 1시간 동안 PVDF 막으로 전기영동적으로 이동시켰다(Thebaine et al. 1979, Proc.Natl. Acad.Sci.USA. 76:4350-4354). 다음 상기 PVDF 막을 5% 탈지분유를 함유하는 25ml의 둘베코(Dulbecco) 포스페이트 완충 염수로 예비처리시켰다. 모든 후속하는 배양은 상기 예비처리한 완충액을 사용하여 수행했다.
PVDF 막을 면역전 혈청 또는 토끼 면역 혈청의 1:500 희석액 25㎖와 함께 1시간 동안 실온에서 배양했다. 다음 PVDF 막을 세척 완충액(150의 염화나트륨 및 0.05% 트윈-20을 함유하는 pH 7.5의 20mM 트리스 완충액)으로 2회 세척했다. PVDF 막을 과산화물-표지 염소 항토끼 IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA)의 1:5000 희석액 25ml를 사용하여 실온에서 30분간 배양했다. 다음, PVDF 막을 세척 완충액으로 4회 세척하고, Zymed(San Francisco, CA)로부터 입수한 3-아미노-9-에틸카르바솔, 및 요소 과산화물을 사용하여 각각 10분간 전개시켰다.
항혈청과 반응성인 약 32-35kDa(BASB020 예측 분자량에 대응)의 단백질을 모든 모락셀라 균주에서 검출했다.
실시예 7: 사람 회복기 혈청에서의 BASB020에 대한 항체의 존재
정제 재조합 BASB020의 웨스턴 블롯 분석을, 모락셀라 카탈리스로 감염시킨 어린이로부터의 사람 혈청 풀(pool)을 제 1의 항체 제조물로서 사용된 것을 제외하고는, 상기 실시예 4 및 6과 동일하게 수행하였다. 그 결과는 자연 감염된 개체로부터의 항혈청이 도 6에서 제시된 바와 같이 정제된 재조합 단백질과 반응함을 보여주었다.
실시예 8: BASB020 백신의 효능: 마우스에서 모락셀라 카탈리스에 대한 폐 클리어런스의 개선
정제 재조합 BASB020 단백질의 방어능력을 마우스 모델에서 시험했다. 상기 마우스 모델은 백신접종시킨 마우스에 대한 표준 비내 적용에 이어지는 모락셀라 카탈리스에 의한 폐 침입의 분석에 기초했다.
6 BALB/c 마우스(암컷, 6주령) 그룹을 10㎍ 용량에 대응하는 100㎕의 백신으로 피하 면역화시키고, 2주후에 추가항원자극시켰다. 추가항원자극시킨지 1주일 후, 세균 현탁액(+/-106CFU/50) 50㎕를 마취(마우스를 케타민 및 자일리진의 결합물 즉, 자일리진 0.24mg(Rompun) 및 0.8mg 케타민(Imalgene)/100㎕를 사용하여 마취시킴)하의 마우스의 왼쪽 콧구멍안으로 적하시킴에 의해 항원투여시켰다. 항원투여시킨지 4시간후에 마우스를 죽이고, 폐를 멸균적으로 제거하여 균질화시켰다. CFU/폐의 로그10 중량 평균수를 균질화물의 5연속 희석액 20㎕를 도말한 후, 뮐러-힌톤 아가 플레이트에 증식한 콜로니를 계수하여 측정했다. CFU/폐의 로그10 중량 평균수의 산술평균 및 표준편차를 각 그룹에 대해 계산했다.
결과를 분산의 균일성(브라운(Brown) 및 포르시테(Forsythe)의 테스트로 점검) 및 정규분포 (샤피리-윌크(Shapiri-Wilk) 테스트로 점검)를 가정한 후, 1방향 ANOVA를 적용하여 통계적으로 분석했다. 그룹간의 차이는 둔넷(Dunnet) 테스트 투키(Tukey)의 표준 범위 테스트, 및 스튜던트-뉴맨-큘(Student-Newman-Keul) 테스트로 분석했다.
이들 마우스의 시험 그룹을 AlPO4(AlPO4 100㎍상의 BASB020 10㎍)상에 흡착된 BASB020 또는 AlPO4 상에 흡착된 모락셀라 카탈리스 균주 ATCC43617의 사멸된 총세포 (kwc) 제조물, 또는 항원 부재의 AlPO4 100㎍를 사용하여 면역화시켰다. 상기 마우스는 살아있는 모락셀라 카탈리스 균주 ATCC43617의 106 CFU를 사용하여 항원투여시켰다.
항원투여시킨지 4시간 후의 CFU/폐의 상기 로그10 중량 평균수 및 표준편차를 각 그룹에 대해 계산했다. 허위 면역화시킨 마우스는 항원투여시킨지 4시간 후에 5.5(+/-0.23) 로그10 CFU/폐를 가졌다.
상기 kwc 제조물은 대조구(1.74 로그 편차)와 비교하여 현저한 폐 클리어런스를 유도했다. BASB020 백신은 대조구와 비교하여, 대조구와는 현저히 다르게, 폐 클리어런스에서 0.62 로그 편차를 유도했다.
정제 재조합 BASB020 단백질, 및 BASB020을 사용하여 면역화시키고 항원투여전에 수집한 마우스로부터 풀링시킨 혈청을 사용한 웨스턴 블롯은 BASB020 단백질에 대한 항체의 존재를 보여주었다(도 7).
실시예 9: BASB020 펩티드, 항혈청, 및 이의 반응성
CNEEAWSQNRRAELSY(SEQ ID NO:13) 및 YTGVAPLVDNDETV(SEQ ID NO:14)를 갖는 두개의 짧은 아미노산 BASB020 특이성 펩티드를 일반적으로 알려진 방법을 사용하여 실험실에서 제조했다. KLH와 결합시킨 이들 펩티드를 12주령된 특이적 병독소 부재 뉴질랜드 암컷 토끼중에 항체의 제조를 위해 사용했다. 토끼에 대해 약 3주간격으로 완전프로인트 애쥬번트(제 1 주입), 또는 불완전 프로인트 애쥬번트(제 2, 제 3, 및 제 4 주입) 형태로 펩티드-KLH 200㎍을 4회 주입했다. 동물을 제 1 면역화 이전 및 제 4 면역화시킨지 1월 후에 채혈했다.
항펩티드 중간점 역가를 유리 펩티드를 사용하는 ELISA로 측정했다. 4회 면역화시킨지 1개월 후의 항펩티드 중간점 역가는 41000 초과로 우수했다. 제 1 항체로서 항펩티드 항체를 사용하는 정제 재조합 BASB020의 웨스턴 블롯을 상기 실시예 4 및 6에 따라 제조했다. 그 결과를 도 8에 나타냈다.
기탁 물질
모락셀라 카탈리스 캐틀린(Catlin) 균주를 포함하는 기탁을 미국 타입 컬쳐 콜렉션(이하, "ATCC")에 1997년 6월 21자로 수탁번호 제 43617호로서 기탁했다. 상기 기탁은 브란하멜라 카탈리스[Branhamella catarrhalis(Frosh and Kolle)]로서 기술되고, 만성 기관지염을 지닌 석탄 광부의 경기관 흡인물로부터 수득한 모락셀라 카탈리스 단리체로부터 구성시킨 동결건조된 1.5-2.9kb 크기의 삽입 라이브러리였다. 상기 기탁은 문헌[참조 : Antimicrob. Agents Chemother. 21:506-508(1982)]에 기술되어 있다.
상기 Moraxella catarrhalis 균주 기탁은 "기탁 균주" 또는 "기탁 균주의 DNA"로서 언급된다.
상기 기탁 균주는 완전한 길이의 BASB020 유전자를 함유한다.
pQE30중에 삽입된 Moraxella catarrhalis DNA로 구성된 벡터 pMC-HLY3는 미국 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)에 1999년 2월 12일자에 수탁번호 제 207106호로서 기탁되었다.
기탁 균주/클론중에 함유된 폴리누클레오티드의 서열, 및 이에 의해 엔코딩된 임의의 폴리누클레오티드의 아미노산 서열은 본원에 기술한 임의의 서열과의 상충을 조절한다.
기탁된 균주의 기탁은 특허절차상 미생물 기탁에 관한 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 요건에 따라 기탁되었다. 상기 기탁은 취소될 수 없으며, 특허출원 후 어떠한 제한이나 조건없이 공중에게 제공된다. 상기 기탁 균주는 단순히 당업자의 편의를 위한 것이며, 특허허여요건 예컨데 35 U.S.C. 112조에서 요구되는 것과 같은 것은 아니다.
서열 목록
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Claims (29)

  1. SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열을 가지는 모락셀라 카탈리스 감염에 대한 백신에 유용한 단리된 폴리펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 6의 아미노산 서열로 구성되는 단리된 폴리펩티드.
  5. SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6의 15개 이상의 연속적인 아미노산을 가지고 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6의 폴리펩티드를 인식하는 면역 반응을 일으킬 수 있는(필요한 경우 담체에 커플된 경우), 제 1항에 청구된 폴리펩티드의 면역원성 단편.
  6. 제 5항에 있어서, 면역원성 단편이 보다 큰 융합 단백질의 일부임을 특징으로 하는 면역원성 단편.
  7. 제 1항에 있어서, 폴리펩티드가 보다 큰 융합 단백질의 일부임을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  8. 제 5항의 면역원성 단편을 엔코딩하는 단리된 폴리누클레오티드.
  9. SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6의 폴리펩디드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 가지는 단리된 폴리누클레오티드, 또는 상기 단리된 폴리누클레오티드에 상보적인 누클레오티드 서열.
  10. SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 5의 누클레오티드 서열을 가지는 단리된 폴리누클레오티드, 또는 상기 단리된 폴리누클레오티드에 상보적인 누클레오티드 서열.
  11. SEQ ID NO: 3 또는 SEQ ID NO: 5의 서열 또는 이들의 단편을 가지는 표지된 프로브를 이용하여 엄격한 하이브리드화 조건 하에서 적합한 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있는 SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6의 폴리펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리누클레오티드.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 단리된 재조합 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  17. 아미노산 서열을 가지는 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 단리된 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 발현하는 제 16항의 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  18. 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 생성시키기에 충분한 조건 하에서 제 17항의 숙주 세포를 배양시키고 배양 배지로부터 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 회수하는 것을 포함하여 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 생성하는 방법.
  19. 하나 이상의 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키고, 상기 폴리누클레오티드 중 어느 하나를 발현시키기에 충분한 조건 하에서 상기 숙주 세포를 배양시키는 것을 포함하여 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 폴리누클레오티드를 발현시키는 방법.
  20. 유효량의 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 모락셀라 카탈리스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물.
  21. 유효량의 제 9항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 모락셀라 카탈리스 감염을 치료 또는 예방하기 위한 백신 조성물.
  22. 삭제
  23. 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 단편에 대해 면역특이적인 항체.
  24. 감염되었다고 생각되는 동물로부터의 생물학적 샘플내에 존재하는 제 23항에 따른 항체, 또는 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드, 또는 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 포함하는 모락셀라 카탈리스 감염을 진단하기 위한 진단 키트.
  25. 면역학적 유효량의 제 1항 및 제 4항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 또는 면역원성 단편를 포함하는, 동물에서 면역 반응을 일으키는 데에 사용하기 위한 모락셀라 카탈리스 감염의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  26. 면역학적 유효량의 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 폴리누클레오티드를 포함하는, 동물에서 면역 반응을 일으키는 데에 사용하기 위한 모락셀라 카탈리스 감염의 치료 또는 예방을 위한 약제학적 조성물.
  27. 하나 이상의 제 23항의 항체 및 적합한 약제학적 담체를 포함하는, 모락셀라 카탈리스 질병을 가진 인간을 치료하기에 유용한 치료적 조성물.
  28. 제 8항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 따른 단리된 재조합 폴리누클레오티드를 포함하는 살아있는 미생물.
  29. 발현된 폴리펩티드 또는 면역원성 단편을 함유하는 제 17항의 숙주 세포의 막.
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