CN1309706A - 源自粘膜炎莫拉氏菌的化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了BASB020多肽以及编码BASB020多肽的多核苷酸以及通过重组技术生产这样的多肽的方法。还提供了诊断,预防以及治疗的用途。
Description
发明领域
本发明涉及多核苷酸,(此处指“BASB020多核苷酸”),它们所编码的多肽(此处指“BASB020”多肽),重组物质以及它们的生产方法。在另一方面,本发明涉及使用这样的多肽和多核苷酸,包括疫苗,来抵抗微生物的感染。在进一步的方面,本发明涉及检测某些病原体感染的诊断分析。
发明背景
粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)(也名为Branhamellacatarrhalis)是经常从人类上呼吸道分离得到的革兰氏阴性细菌。它导致几种疾病,主要的是婴儿以及儿童的中耳炎以及老年人的肺炎。它还导致窦炎,医院感染以及不太经常的入侵性疾病。
不论在病例的数目上还是在潜在的后遗症上中耳炎都是一种重要的儿童疾病。在美国每年记录的疾病有350万。估计约有80%的儿童在3岁以前都经历过至少一次中耳炎(Klein,JO(1994)Clin.Inf.Dis 19:823)。如果不进行治疗或转成慢性的话这种疾病可能导致暂时(在中耳积水的情况下)或永远(如果听神经受到损伤)丧失听力。在婴儿中,这样的丧失听力可能导致学说话的推迟。
在中耳炎儿童的中耳中主要分离得到三种细菌:肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae),未分型的流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenza)(NTHi)粘膜炎莫拉氏菌。它们在60到90%的病例中存在。最近研究的一篇综述表明肺炎链球菌和NTHi在约30%的病例中存在,而粘膜炎莫拉氏菌在约15%的中耳炎病例中存在(Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)。从中耳中还能分离得到其它细菌,但几率要小得多(病例的2%或更小)。
流行病学数据表明,在中耳发现的病原体在上呼吸道的集群对于耳炎的发生而言是绝对的先决条件;但是导致该疾病还需要其它条件(Dickinson,DP et al.(1988)J.Infect.Dis.158:205,Faden,HL et al.(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100:612)。这些对于引起细菌通过咽鼓管向中耳迁移然后开始炎症过程是很重要的。这些因素目前还是未知的。有人猜测,例如,病毒感染后暂时的免疫系统异常可能导致对呼吸道集群的失控(Faden,HL et al(1994)J.Infect.Dis.169:1312)。一种替代的解释是暴露于环境因素使得一些儿童发展出更严重的集群,然后由于中耳病原体的持续存在这些儿童易得中耳炎(Murphy,TF(1996)Microbio.Rev.60:267)。
对粘膜炎莫拉氏菌的免疫应答的特征还很不清楚。对从0到2周岁婴儿的鼻咽先后分离得到的菌株的分析表明他们经常获得和消灭新的菌株。这表明被集群化的儿童产生了抵抗这些细菌的有效免疫应答(Faden,HL et al(1994)J.Infect.Dis.169:1312)。
在大多数被检测的成年人中鉴定到了杀菌抗体(Chapman,AJ etal.(1985)J.Infect.Dis.151:878)。粘膜炎莫拉氏菌的不同菌株呈现出的抵抗杀菌活性的能力存在差异:总的来说从生病个体分离得到的菌株的抵抗力比从仅仅集群化的个体分离得到的菌株的抵抗力更强(Hol,C et al.(1993)Lancet 341:1281,Jordan,KL etal.(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A):28S)。因此血清抗性可以被认为是该细菌的毒性因素。在从中耳炎恢复的儿童的血清中观察到了调理活性。
除了OMPB1(Sethi,S,et al(1995)Infect.Immun,63:1516)和UspA1以及UspA2(Chen D.et al.(1999),Infect.Immun.67:L1310)外这些不同的免疫应答所针对的免疫原还未被鉴定;OMPB1是一种84kDa的蛋白,其表达受到铁的调控,它能为肺炎病人的血清所识别。
通过生化方法描述了存在粘膜炎莫拉氏菌表面的一些其它膜蛋白的特征,或者描述了它们诱导保护性免疫力的潜在可能。(综述参见Murphy,TF(1996)Microbiol.Rev.60:267)。在小鼠肺炎模型中,抵抗其中一些蛋白(UspA,CopB)的抗体的存在有利于更快地清除肺部感染。另一种多肽(OMP CD)在粘膜炎莫拉氏菌菌株中是高度保守的,并且呈现出与绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的孔道蛋白具有同源性,这种多肽已经被证明能在动物模型中有效地抵抗这种细菌。
在过去的几十年中粘膜炎莫拉氏菌感染的频率升高了很多。这归结于多抗生素抗性菌株的出现以及免疫系统减弱的人口的增加。分离出能抵抗一些或所有常见抗生素的粘膜炎莫拉氏菌菌株不再是不同寻常的事了。这种现象产生了一种未满足的医药需求,并且需要新的抗微生物制剂、疫苗、药物筛选方法和检测这种生物体的诊断检测方法。
发明概述
本发明涉及BASB020,尤其是BASB020多肽和BASB020多核苷酸、重组物质以及它们的生产方法。在另一方面,本发明涉及这样的多肽和多核苷酸的使用方法,包括防止和治疗微生物疾病,及其他。在进一步的方面,本发明涉及检测和微生物感染相关的疾病以及与这些感染相关的病症的诊断测试,例如检测BASB020多核苷酸或多肽的表达或活性的测试方法。
通过阅读随后的描述以及通过阅读本公布的其他部分,在公布的本发明的精神和范围之内的各种变化和修正对于本领域的技术熟练人员将是显而易见的。发明详述
如下文详细描述,本发明涉及BASB020多肽和多核苷酸。尤其是,本发明涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB020的多肽和多核苷酸,它在氨基酸序列上和猪痢疾小蛇菌(Serpulina hyodysenteriae)的TlyC溶血球素(hemolysin)蛋白具有同源性。本发明尤其涉及核苷酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:1,3,5或7和SEQ ID NO:2,4,6或8列出的BASB020。应当理解在以下的序列表中列为“DNA”的序列代表本发明的一个实施方案的例子,因为具有普通技术的人员将认识到这些序列总体上可用于多核苷酸,包括多聚核糖核酸。多肽
在本发明的一个方面提供了此处称为“BASB020”和“BASB020多肽”的粘膜炎莫拉氏菌多肽,以及它们具有生物学用途、诊断用途、临床应用以及治疗用途的变体,以及含有上述多肽或其变体的组合物。
本发明进而提供了:(a)一种分离的多肽,该多肽含有的氨基酸序列和SEQ ID NO:2,4,6,或8至少85%相同,优选地至少90%相同,更优选地至少95%相同,最为优选地至少97-99%相同或完全相同。(b)由一种分离的多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸含有的多核苷酸序列和SEQ ID NO:1,3,5,或7在SEQ ID NO:1,3,5,或7的全长至少85%相同,优选地至少90%相同,更优选地至少95%相同,最为优选地至少97-99%相同或完全相同。(c)由一种分离的多核苷酸编码的多肽,该多核苷酸含有的多核苷酸序列编码的多肽和SEQ ID NO:2,4,6,或8至少85%相同,优选地至少90%相同,更优选地至少95%相同,最为优选地至少97-99%相同或完全相同。
在SEQ ID NO:2,4,6,或8中提供的BASB020多肽是源自粘膜炎莫拉氏菌菌株MC2931(ATCC43617),MC2912,MC2913和MC2969的BASB020多肽。
本发明还提供了BASB020多肽的免疫原性片段,即,BASB020多肽的一个连续部分,该部分和含有SEQ ID NO:2,4,6,或8中氨基酸序列的多肽具有相同或基本上相同的免疫原活性;这就是说,该片段(如果需要的话交联到载体上)能产生识别BASB020多肽的免疫应答。这样的免疫源性可以包括,例如,缺少BASB020 N末端引导序列和/或缺少一个跨膜结构域/或缺少C末端锚定结构域的多肽。在一个优选的方面根据本发明的BASB020免疫原性片段含有基本上所有的多肽膜外结构域,上述多肽和SEQ ID NO:2,4,6,或8在SEQ ID NO:2,4,6,或8的全长上至少85%相同,优选地至少90%相同,更优选地至少95%相同,最为优选地至少97-99%相同或完全相同。
片段是指氨基酸序列和本发明的任何多肽的任何氨基酸序列部分而不是全部完全相同的多肽。对于BASB020多肽,片段可以是“自由存在”的或包含在较大的多肽中,它们形成较大多肽的一部分或一个区域,最为优选地,它们在单一的较大多肽中是作为单一连续的区域。
优选的片段包括,例如,具有SEQ ID NO:2,4,6,或8或其变体的一部分氨基酸序列的截短多肽,如包括了氨基端或羧基端氨基酸序列的一个连续系列的残基。由宿主细胞产生或在宿主细胞中产生的降解多肽也是优选的。进而优选的是具有结构或功能特征的片段,例如含有α螺旋和α螺旋形成区域、β片层和β片层形成区域、转角和转角形成区域、卷曲和卷曲形成区域、亲水区域、疏水区域、α两亲性区域、β两亲性区域、柔性区域、表面形成区域、底物结合区域和高抗原性指数区。
进而优选的片段包括一种分离的多肽,该多肽含有源自SEQ IDNO:2,4,6,或8的氨基酸序列中至少15,20,30,40,50或100个连续的氨基酸,或者包括包含一种多肽,该多肽包含一段氨基酸序列,该序列从SEQ ID NO:2,4,6,或8的氨基酸序列中截短或删去至少15,20,30,40,50或100个连续的氨基酸。
通过多肽合成,本发明的多肽片段可被用于生产相应的全长多肽;因此这些片段可被用作生产本发明的多肽的中间物。
特别优选的是一些变体,在这些变体中5-10,1-5,1-3,1-2或1个氨基酸被以任何组合方式取代、删除或添加。
本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟蛋白”的形式,或可以是较大的蛋白如前体蛋白或融合蛋白的一部分。将含有分泌或引导序列、前序列、帮助纯化的序列如多组氨酸残基、或增加重组生产过程中的稳定性的序列的另加序列包括在内经常是有利的。进而,还考虑了添加外源多肽或脂类尾巴或多核苷酸序列以提高最终分子的潜在免疫原性。
在一个方面本发明涉及经遗传工程改造的可溶性融合蛋白,该融合蛋白含有本发明的多肽或其片段以及各种亚型(IgG,IgM,IgA,IgE)的免疫球蛋白的重链或轻链的恒定区的各个部分。优选的免疫球蛋白是人IgG,尤其是IgG1,重链的恒定部分,其中融合在铰链区进行。在一个特定的实施方案中,通过整合入可以被凝血因子Xa切除的序列可以简单地将Fc部分除去。
进而,本发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白的方法,以及它们在药物筛选、诊断及治疗中的应用。本发明进一步的方面还包括编码这样的融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白激素的例子可以在国际专利申请Nos.WO94/29458和WO94/22914中找到。
蛋白可以是化学交联的,或是以重组融合蛋白的形式表达,以便和非融合蛋白相比提高在表达系统中的表达水平。融合伙伴可以帮助提供T辅助细胞表位(免疫融合伙伴),优选地提供为人所识别的T辅助细胞表位;或和天然的重组蛋白相比帮助提高该蛋白的表达产量(表达增强伙伴)。优选地,上述融合伙伴同时是免疫融合伙伴和表达增强伙伴。
融合伙伴包括源自流感嗜血杆菌的蛋白D以及源自感冒病毒的非结构蛋白,NS1(红血球凝集素)。另一种融合伙伴是被称为LytA的蛋白。优选地,使用的是该分子的C末端部分。Lyta源自Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌),它合成一种N-乙酰基-L丙氨酸酰胺酶LytA(由lytA基因编码{Gene,43(1986)265-272页}),一种特异性地降解肽多糖骨架的某些键的自溶素。LytA蛋白的C末端部分负责对胆碱或某些胆碱类似物如DEAE的亲和性。这种特性已经被用于发展用来表达融合蛋白的大肠杆菌(E.coli)C-LytA表达质粒。在N末端含有C-LytA片段的杂交蛋白的纯化已有描述{Biotechnology:10,(1992)page 795-798}。也可以使用在LytA分子C末端的从178开始的重复部分,例如残基188-305。
本发明还包括了上述多肽的变体,即参考多肽通过保守氨基酸替换得到的多肽,在保守氨基酸替换中一个残基被具有类似特性的另一个残基替换。这种替换的典型例子如Ala,leu和Ile之间的替换;Ser和Thr之间的替换;酸性残基Asp和Glu之间的替换;Asn和Gln之间的替换;碱性残基Lys和Arg之间的替换;或芳香残基Phe和Tyr之间的替换。
最为优选地,本发明的多肽是源自粘膜炎莫拉氏菌,但是它也可以优选地选自同一分类属的其它微生物。例如,本发明的多肽可以从同一科或同一目的微生物体中得到。多核苷酸
本发明的一个目的是提供编码BASB020多肽的多核苷酸,特别是编码此处被命名为BASB020的多肽的多核苷酸。
在本发明的一个特别优选的实施例中上述多核苷酸含有一个编码BASB020多肽的区域,上述BASB020多肽包括SEQ ID NO:1,3,5或7中列出的包括全长基因的序列,或它们的变体。
SEQ ID NO:1,3,5或7中提供的BASB020多核苷酸是源自粘膜炎莫拉氏菌菌株MC2931(ATCC43617),MC2912,MC2913和MC2969的BASB020多核苷酸。
本发明的一个进一步的方面还提供了分离的核酸分子,该核酸分子编码和/或表达BASB020多肽和多核苷酸,尤其是粘膜炎莫拉氏菌BASB020多肽和多核苷酸,包括,例如,未加工的RNA,mRNA,cDNA,基因组DNA,B和Z-DNA。本发明进一步的实施方案包括具有生物学、诊断、预防、临床或治疗用途的多核苷酸和多肽以及它们的变体,以及含有它们的组合物。
本发明的另一方面涉及分离的多核苷酸,包括至少一种编码BASB多肽的全长基因,它们编码的多肽推测具有SEQ ID NO:2,4,6,或8中的氨基酸序列,或上述多核苷酸的紧密相关的多核苷酸或它们的变体。
在本发明的另一个特别优选的实施方案中有一源自粘膜炎莫拉氏菌的BASB020多肽,该多肽含有SEQ ID NO:2,4,6,或8中的氨基酸序列或它们的变体,或由上述氨基酸序列或变体组成。
根据此处提供的信息,例如SEQ ID NO:1,3,5或7中提供的多核苷酸序列,可以通过常规的克隆和筛选方法,例如用粘膜炎莫拉氏菌细胞作为起始材料从细菌中克隆和测序染色体DNA片段,然后得到全长克隆,获得本发明的编码BASB020多肽的多核苷酸。例如,为了得到本发明的多核苷酸序列,如SEQ ID NO:1,3,5或7中给出的多核苷酸序列,通常用源自部分序列的放射性标记的寡聚核苷酸探针,长度优选地为17碱基或更长,探测E.coli中或其他合适的宿主中的粘膜炎莫拉氏菌染色体DNA克隆文库。然后用严紧杂交条件区别含有的DNA和探针完全相同的克隆。利用根据初始的多肽或多核苷酸序列设计得到的测序探针对通过杂交鉴定的克隆进行测序,从而能够在两个方向延伸多核苷酸序列以确定基因的全长序列。这样的测序可以方便地利用,例如,从质粒克隆制备得到的双链变性质粒DNA进行。合适的技术在Maniatis,T.,Fritsch,E.F.and Sambrook etal MOLECULAR CLONNING,A LABORATORY MANUAL,2ndEd.;ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork(1989)中有所描述(具体见Screening By Hybridization1.90(杂交筛选)和Sequencing Denatured Double-Stranded DNATemplates 13.70(变性双链DNA模板的测序))。也可进行基因组DNA的直接测序以得到基因的全长序列。例如在本发明中SEQ ID NO:1,3,5或7的每个序列都设在源自粘膜炎莫拉氏菌的DNA文库中发现的。
进而,SEQ ID NO:1,3,5或7列出的每个DNA序列都含有一个开放阅读框,编码的蛋白大约具有SEQ ID NO:2,4,6,或8中给出的氨基酸残基数,可以根据本领域的技术熟练人员众所周知的氨基酸残基分子量推测出蛋白的分子量。
SEQ ID NO:1中的多核苷酸在核苷酸1开始的起始密码子和核苷酸841开始的终止密码子之间编码SEQ ID NO:2中的多肽。
SEQ ID NO:3中的多核苷酸在核苷酸1开始的起始密码子和核苷酸841开始的终止密码子之间编码SEQ ID NO:4中的多肽。
SEQ ID NO:5中的多核苷酸在核苷酸1开始的起始密码子和核苷酸841开始的终止密码子之间编码SEQ ID NO:6中的多肽。
SEQ ID NO:7中的多核苷酸在核苷酸1开始的起始密码子和核苷酸841开始的终止密码子之间编码SEQ ID NO:8中的多肽。
在本发明的一个进一步的方面提供了一种分离的多核苷酸,它包括以下核苷酸序列或由它们组成:
(a),一种多核苷酸,其的多核苷酸序列分别和SEQ ID NO:1,3,5,或7在SEQ ID NO:1,3,5,或7的全长至少85%相同,优选地至少90%相同,更优选地至少95%相同,最为优选地至少97-99%相同或完全相同。
(b)一种多核苷酸,它编码的多肽含有的氨基酸序列分别和SEQID NO:2,4,6,或8在SEQ ID NO:2,4,6,或8的全长上至少85%相同,优选地至少90%相同,更优选地至少95%相同,最为优选地至少97-99%相同或完全相同。
编码本发明多肽的多核苷酸,包括源自粘膜炎莫拉氏菌以外种属的同源物和直线同源物(ortholog),他们可由包括以下步骤的方法得到:在严紧的杂交条件(例如用使用45-65℃之间的温度和0.1-1%的SDS浓度)下用标记的或可探测的探针筛选合适的文库,然后分离含有上述多核苷酸序列的全长基因和/或基因组克隆;上述探针含有SEQ ID NO:1,3,5,或7的序列或它们的片段,或由SEQ ID NO:1,3,5,或7的序列或它们的片段组成。
本发明提供了在全长上和SEQ ID NO:1,3,5,或7的编码序列(开放阅读框)相同的多核苷酸序列。本发明还提供了独立存在的成熟多肽或其片段的编码序列,以及存在于其它编码序列,例如编码前导序列或分泌序列,前蛋白,或前体蛋白,或前前体蛋白序列的序列,的阅读框中的成熟多肽或其片段。本发明的多肽还含有至少一种非编码序列,包括,例如但不限于,至少一个非编码的5’和3’序列,如转录但不翻译的序列,终止信号(如rho依赖的和rho不依赖的终止信号),核糖体结合位点,Kozak序列,稳定mRNA的序列,内含子和多聚腺苷酸信号。多核苷酸还可以含有编码另加氨基酸的另加编码序列。例如,可以编码便于融合蛋白纯化的标记序列。在本发明的某些实施方案中该标记序列是由pQE载体提供(Qiagen.Inc.)并在Gentz et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 86:821-824(1989)中有所描述的六组氨酸肽,或者是HA肽标记(Wilson et al.,Cell37:767(1984)),两种标记都可用于纯化和它们融合的序列。本发明的多核苷酸还包括,但不限于,含有结构基因的多核苷酸及其天然相连的控制基因表达的序列。
编码SEQ ID NO:2,4,6,或8中的BASB020多肽的核苷酸序列可以分别等同于SEQ ID NO:1,3,5,或7中核苷酸1到840之间的多肽编码序列。替代地,它也可以是编码SEQ ID NO:2,4,6,或8中多肽的,由于遗传密码的重复性(简并性)造成的序列。
此处所使用的术语“编码多肽的多核苷酸”包括含有本发明多肽编码序列的多核苷酸,本发明的多肽尤其是细菌多肽,更具体地说是具有SEQ ID NO:2,4,6,或8中列出的氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多肽。该术语还包括了含有编码多肽的单一连续区域或不连续区域(例如,多核苷酸被整合噬菌体、整合插入序列、整合载体序列、整合转座子序列中断或由于RNA编辑或基因组DNA重排而被中断)以及其他可能含有编码和/或非编码序列的另加区域的多核苷酸。
本发明还进而涉及此处描述的多核苷酸,该多核苷酸编码一种多肽的变体,上述多肽具有SEQ ID NO:2,4,6,或8中列出的氨基酸序列。可以使用,例如,本发明多核苷酸的片段合成本发明的全长多核苷酸。
进而特别优选的实施方案为编码BASB020变体的多核苷酸,上述变体具有SEQ ID NO:2,4,6,或8中列出的BASB020多肽的氨基酸序列,但其中几个或一些,或5到10个,或1到5个,或1到3个,或2个或1个或没有氨基酸残基被以任何组合方式替换,修饰,缺失和/或添加。其中特别优选的是静息替换、添加和缺失,即并不改变BASB020多肽的特性和活性。
本发明进一步优选的实施方案为和编码BASB020多肽的多核苷酸在全部长度上至少85%相同的多核苷酸,以及与这样的多核苷酸互补的多核苷酸,其中上述BASB020多肽具有SEQ ID NO:2,4,6,或8中列出的氨基酸序列。替代地,最为优选的是和编码BASB020多肽的多核苷酸在全部长度上至少90%相同的多核苷酸,以及与这样的多核苷酸互补的多核苷酸。从这方面考虑,和上述编码BASB020多肽的多核苷酸在全部长度上至少90%相同的多核苷酸是特别优选的。进而,在这些至少95%的多核苷酸中至少97%的是高度优选的,这些至少97%的多核苷酸中至少98%和至少99%的是特别高度优选的,而99%的是更为优选的。
优选的实施方案为编码的多肽基本上保留了SEQ ID NO:1,3,5或7中的DNA所编码的成熟多肽的相同生物学功能或活性的多核苷酸。
根据本发明的一些优选实施方案提供了,尤其是在严紧的条件下,与BASB020多核苷酸序列,例如SEQ ID NO:1,3,5或7中的多核苷酸序列,杂交的多核苷酸。
本发明进而涉及能和此处提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。在这一点上本发明尤其是涉及在严紧条件下与此处描述的多核苷酸杂交的多核苷酸。如此处所用,术语“严紧条件”和“严紧杂交条件”的意思为仅仅当序列之间的同一性至少为95%,优选地至少为97%时才发生杂交。严紧杂交条件的一个具体例子为在含有50%甲酰胺,5×SSC(150mM NaCl,15mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH7.6),5×Denhard’s溶液,10%硫酸右旋糖苷和20微克/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中42℃温育过夜,然后在约65℃在0.1×SSC中洗涤杂交支持物。杂交和洗涤条件是众所周知的,例子见Sambrook,et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Second Edition,ColdSpring Harbor,N.Y.,(1989),特别是该书中的第11章。本发明提供的多核苷酸还可以用溶液杂交。
本发明还提供了一种多核苷酸,该多核苷酸含有一种多核苷酸序列或有该序列组成,上述多核苷酸序列是通过在严紧条件下筛选适当文库并分离多核苷酸序列得到的,上述文库含有SEQ ID NO:1,3,5或7中列出的序列的完全基因;上述筛选用的探针具有SEQ ID NO:1,3,5或7中列出的多核苷酸序列或其片段。可用于获得这样的多核苷酸的片段包括,例如,本文其他地方所详细描述的探针和引物。
如本文其它地方关于本发明的多核苷酸检测的描述,例如,本发明的多核苷酸可以被用作RNA,cDNA和基因组DNA的探针来分离编码BASB020的全长cDNA和基因组克隆以及分离具有高度同源性,尤其是高序列同源性,的其它基因的基因组克隆和cDNA。这样的探针通常含有至少15个核苷酸或者碱基对。优选地,这样的探针至少具有30个核苷酸残基或者碱基对,并可以具有50个核苷酸残基或碱基对。特别优选的探针将具有至少20个核苷酸残基或碱基对并将少于30个核苷酸残基或者碱基对。
可通过用SEQ ID NO:1,3,5或7中提供的DNA序列合成探针进行筛选,从而分离BASB020基因的编码区。然后用标记的,具有和本发明的基因互补的序列的寡聚核苷酸探针筛选cDNA文库、基因组DNA或mRNA以确定该探针和文库中的哪个成员杂交。
已知有几种方法可以用来获得全长DNA或延伸短DNA,这些方法对于本领域中的技术熟练人员是众所周知的,例如基于cDNA末端快速扩增(Rapid Amplication of cDNA ends,RACE)的方法(参见,例如,Frohman,et al.,PNAS USA 85:8998-9002,1988)。最近技术上的改进,例如MarathonTM技术(Clontech LaboratoriesInc.),大大地简化了对较长cDNA的搜索。在MarathonTM技术中从选定的组织中提取mRNA并制备cDNA,然后在每个末端连接上“转接”序列。然后联合使用用基因特异的和转接序列特异的寡聚核苷酸进行核酸扩增(PCR)以扩增DNA“丢失的”5’端。然后用“嵌套”引物重复进行PCR反应,嵌套引物即是设计用来与扩增的产物退火的引物(通常为进而与转接序列3’端退火的转接序列特异引物以及与选定基因序列5’端退火的基因特异引物)。此反应的产物可以通过DNA测序进行分析,并且通过将该产物直接和存在的DNA连接以给出全长序列,或用新的序列信息设计5’引物另外进行全长PCR可以构建全长DNA。
本发明的多核苷酸和多肽可以用作,例如,发现疾病,尤其是人类疾病的治疗和诊断方法的研究试剂和材料,如本文所进一步讨论,上述治疗和诊断涉及多核苷酸检测。
作为源自SEQ ID NO:1-8的序列的寡聚核苷酸的本发明的多核苷酸可被用于此处所描述的方法,但优选地是PCR方法,以确定此处所鉴定的多核苷酸是否全部或部分地在感染组织的细菌中表达。应当认识到这样的序列还可以用于诊断病原体所达到的感染阶段和感染的类型。
本发明还提供了编码一种多肽的多核苷酸,上述多肽是成熟蛋白加上另加的氨基酸或羧基末端氨基酸,或位于成熟多肽内部的氨基酸(例如当成熟多肽具有一条以上肽链时)。这样的序列可能在将蛋白从前体向成熟形式加工时起作用,可能允许蛋白转运,可能延长或缩短蛋白的半衰期或者便于蛋白分析或生产时的操作,等等。通常在体内另加的氨基酸可能被细胞的酶从成熟蛋白加工除去。
对于每个和每一个本发明的多核苷酸提供了与它互补的多核苷酸。优选地这些互补的多核苷酸和它们各自互补的多核苷酸完全互补。
一种前体蛋白,含有和一种或多种前体序列融合的成熟多肽,可能是该多肽的无活性形式。当前体序列被除去时这样的无活性前体通常被激活。可以在激活前除去一些或所有的前体序列。通常这样的前体被称为前体蛋白。
除了用常规的A,G,T/U来表示核苷酸,术语“N”也可以用来描述本发明的一些多核苷酸。“N”的意思为四种DNA或RNA核苷酸中的任何一种都可以出现在DNA或RNA中的这样一个既定位置,但是当和邻近的核苷酸位置一起考虑时,当在正确的阅读框中阅读时将在这样的阅读框中产生提前终止密码子的核酸除外。
根据本发明的一个方面提供了将本发明的多核苷酸用于治疗或预防的用途,特别适用于基因免疫。
将本发明的多核苷酸用于基因免疫将由选地使用适当的运送方法,如直接将质粒DNA注射到肌肉中(Wolff et al.,Hum Mol Genet(1992)1:363,Manthorpe et al.,Hum Gene Ther.(1983)4:419),用特殊的蛋白载体运送DNA复合物(Wu et al.,J Biol Chem.(1989)264:16985),DNA和磷酸钙共沉淀(Benvenisty&Reshef.PNAS USA.(1986)83:9551),将DNA包在各种形式的脂质体中(Kaneda et al.,Science(1989)243:375),颗粒轰炸(Tang et al.,Nature(1992)356:152,Eisenbraun et al.,DNA Cell Biol(1993)12:791)和用克隆的反转录载体体内感染(Seeger et al.,PNAS USA(1984)81:5849)。载体,宿主细胞,表达系统
本发明还涉及含有一种或几种本发明的多核苷酸的载体,用本发明的载体进行基因工程改造的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明的多肽。用源自本发明的DNA构建物的RNA也可以通过无细胞翻译系统生产这样的蛋白。
可以用本领域的技术熟练人员众所周知的方法从含有表达系统的基因工程改造的宿主细胞制备本发明的重组多肽。因此,在进一步的方面中本发明涉及含有一种或几种本发明的多核苷酸的表达系统,涉及用这样的表达系统进行了基因工程改造的宿主细胞,并涉及通过重组技术生产本发明的多肽。
对于本发明多肽的重组生产,宿主细胞可以被进行基因工程改造以整合入表达系统或表达系统的一部分,或整合入本发明的多核苷酸。向宿主细胞引入多核苷酸的方法可通过许多常规的实验室手册中描述的方法进行,例如Dayis,et al BASIC METHODS IN MOLECULARBIOLOGY,(1986)和Sambrook,et al.,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Lboratory Press,Cold Spring Hatbor,N.Y.(1989),例如磷酸钙转染,DEAE-dextran介导的转染,转载体(transvection),微量注射,阳离子磷脂介导的转染,电穿孔,转导,刮伤载入(scrape loading),弹射引入(ballistic introduction)和感染。
适当宿主的代表例子包括细菌细胞,例如链球菌(streptococci),葡萄球菌(staphylococci),肠球菌(enterococci),大肠杆菌(E.coli),链霉菌(streptomyces),蓝细菌(cyanobacteria),枯草杆菌(Bacillus subtilis),脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)和粘膜炎莫拉氏菌的细胞;真菌细胞,例如酵母细胞,克鲁纸氏酵母(Kluveromyces),糖酵母(Saccharomyces),担子菌(basidiomycete),白色假丝酵母(Cadida albicans),曲霉(Aspergillus);昆虫细胞例如Drosophila S2(果蝇细胞S2)和Spodoptera Sf9细胞;动物细胞如CHO,COS,Hela,C127,C127,3T3,BHK,293,CV-1和Bowes黑色素瘤细胞;植物细胞,如裸子植物细胞或被子植物细胞。
许多表达系统可被用于生产本发明的多肽。如载体,包括染色体载体,游离基因载体和源自病毒的载体,例如,源自细菌质粒、源自噬菌体、源自转位子、源自酵母附加体,源自插入元件,源自病毒如杆状病毒、乳多空病毒如SV40病毒,牛痘病毒,腺病毒,禽痘病毒,假狂犬病病毒,小核糖核酸病毒和α病毒的载体,以及源自质粒和噬菌体基因元件的载体,如粘粒载体和噬菌体载体。表达系统构建物可以含有调节以及产生表达的控制区域。在这一点上通常任何适合用于维持、增殖或表达多核苷酸和/或在宿主中表达多肽的系统或载体都可以用于表达。可以通过许多众所周知的常规技术中的任何一种将适当的DNA序列插入到表达系统中,例如,通过Sambrook et al.,MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL,(supra)中列出的技术。
在真核重组表达系统中,为了将翻译的蛋白分泌到内质网腔,到质周空间或分泌到细胞外环境,可以在表达的多肽中整合入适当的分泌信号。这些信号多肽的内源信号或外源信号。
可以通过众所周知的方法从重组细胞的培养基中回收和纯化本发明的多肽,包括硫酸铵或乙醇沉淀,酸抽提,阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最为优选地,金属离子亲和层析(IMAC)被用于纯化。当多肽在细胞内合成,分离和纯化中被变性时众所周知的蛋白质重新折叠技术可被用于再生活性构象。
表达系统也可以是活的重组微生物,如病毒或细菌。感兴趣的基因被插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。这种活载体的接种和体内表达将导致该抗原的体内表达并诱导免疫应答。用于此目的的病毒和细菌的例子如:乳多空病毒(例如牛痘病毒,禽痘病毒,金黄痘病毒)α病毒(如Sindbis病毒,Semiiki Forest病毒,委内瑞拉马脑炎病毒),腺病毒,腺相关病毒,小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒,鼻病毒),疱疹病毒(带状水痘病毒等等),Listeria(里斯特氏菌),Salmonella(沙门氏菌),Shigella,Neisseria,BCG(卡介苗)。这些病毒和细菌可能是有毒性的,或通过各种途径弱化以得到活疫苗。这样的或疫苗也构成本发明的一部分。诊断检测,预防监测,血清型检测和突变检测
本发明还涉及本发明的BASB020多核苷酸和多肽作为诊断试剂的应用。在真核生物,尤其是在哺乳动物中,对BASB020多核苷酸和/或多肽检测将提供对疾病诊断,疾病阶段诊断以及感染生物体对药物的反应的诊断的方法。可以通过许多众所周知的技术以及此处所提供的方法在核酸或氨基酸水平上对真核生物,尤其是哺乳动物,特别是人类,特别是感染了或怀疑感染了含有BASB020基因或蛋白的生物体的人类,进行检测。
可以从可能被感染的或已经被感染的个体的身体物质里得到用于预测,诊断或其它分析用的多肽或多核苷酸。来自任何这些来源的多核苷酸,尤其是DNA或RNA,可以被直接用于检测,或者可以在分析之前用PCR或任何其他扩增技术进行酶促扩增。RNA,尤其是mRNA,cDNA和基因组DNA也可以以相同的方式使用。利用扩增可以通过对生物体的选定多核苷酸基因型的分析而对个体中存在的感染或常驻种属和菌株进行描述。通过比较扩增产物和选自相关生物体,的参考序列可以根据扩增产物大小的改变而检测到缺失或插入;上述参考生物体优选地为相同属的不同种或相同种的不同菌株。通过将扩增的DNA和标记的BASB020多核苷酸序列杂交而鉴定点突变。通过DNA酶或RNA酶消化,或通过检测熔解温度或复性动力学可以分别将完全或明显配对的DNA或RNA序列和不完全或不明显配对的二体区分开。多核苷酸序列之间的差别还可以通过多核苷酸片段在凝胶中的电泳迁移率相对于参考序列的改变来检测。中可用在含有或不含有变性试剂的条件下进行。多核苷酸之间的差别还可以通过直接的DNA或RNA测序来检测。参见,例如,Myers et al.,Science,230:1242(1985)。特定部位的序列改变还可以通过核酸酶保护试验,例如RNA酶,V1和S1保护试验或化学裂解方法来揭示。参见,例如,Cotton et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:4397-4401(1985)。
在另一个实施方案中可以构建含有BASB020核苷酸序列或其片段的寡聚核苷酸阵列(array)以进行对,例如,基因突变、血清型、分类学分类或鉴定,的高效筛选。阵列技术是众所周知的并且具有广泛的用途,并且可以用来研究许多分子遗传学问题,包括基因表达、遗传相关(genetic linkage)和以及遗传可变性(geneticvariability)(参见,例如,Chee et al.,Science 274:610(1996))。
因此在另一方面本发明涉及一种诊断试剂盒,该试剂盒含有:
(a)本发明的多核苷酸,优选地为SEQ ID NO:1,3,5或7中的核苷酸序列,或其片段;
(b)和(a)中的序列互补的核苷酸序列
(c)本发明的一种多肽,优选地为SEQ ID NO:2,4,6或8中的多肽,或其片段;或
(d)针对本发明的多肽的抗体,上述多肽优选地为SEQ ID NO:2,4,6或8中的多肽。
应当理解在在这样的任何一个试剂盒中(a),(b),(c)或(d)可能包含一种实质性的组分。这样的试剂盒可能在诊断疾病或诊断对疾病易感性等等中有用。
本发明还涉及本发明的多核苷酸作为诊断试剂的应用。本发明的多核苷酸,优选地,SEQ ID NO:1,3,5或7中的多核苷酸,的与疾病或病原性相关的突变形式的检测可能提供一种诊断工具,其可能增加了,或定义了对疾病的诊断方法,或对疾病进程的预测方法,或确定疾病阶段的方法,或确定对疾病的易感性的方法,上述疾病可能是由于该多核苷酸的表达不足或过量表达或表达发生改变而造成的。可以通过许多技术,例如本文其他地方所描述的技术,在多核苷酸的水平上检测在这样的多核苷酸上带有突变的生物体,尤其是感染性生物体。
也可以通过许多技术在多核苷酸和/或多肽的水平上检测在本发明的多核苷酸和/或多肽上带有突变或多形性(等位变化)的细胞,以进行,例如,血清型分析。例如,RT-PCR可以被用于检测RNA上的突变。有其优选的是;联合使用RT-PCR和自动化检测系统,例如,GeneScan。RNA,cDNA或基因组DNA可以被用于同样的目的,PCR。例如,和编码BASB020多肽的多核苷酸互补的PCR引物可以被用于鉴定和分析突变。
本发明进而提供了从5’和/或3’除去1,2,3或4个核苷酸的引物。这些引物可以被用于扩增BASB020DNA和/或RNA,上述BASB020DNA和/或RNA是从源自一个个体的,例如身体物质,的样品分离得到的。上述引物可以被用于扩增从一个感染个体分离得到的多核苷酸,以便该多核苷酸可以被用于多种技术以便阐明该核苷酸的序列。通过这种方法多核苷酸序列中的突变可以被检测到并被用于诊断和/或预测感染或感染的阶段或进程,或用于进行血清型分析和/或感染源的分类。
本发明进而提供了一种诊断疾病的方法,上述疾病优选地为细菌感染,更为优选地为由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染,该方法包括确定源自个体的样品,例如身体物质,中具有SEQ ID NO:1,3,5或7序列的多核苷酸水平的不断升高。BASB020多肽表达的升高或降低可以用本领域中众所周知的任何多核苷酸定量方法进行,例如扩增、PCR、RT-PCR、RNA酶保护、Northern印迹法、分光光度法和其它杂交方法。
此外通过和正常的对照组织样品相比较检测BASB020多肽的过量表达的根据本发明的诊断检测可以被用来检测,例如,感染的存在。可以被用来确定源自宿主的样品,例如身体样品中BASB020多肽水平的检测技术对于本领域的技术熟练人员是众所周知的。这样的检测技术包括放射性免疫检测,竞争结合检测,Western印迹分析,抗体夹心法检测,抗体检测和ELISA检测。
本发明的多核苷酸可以被用作多核苷酸阵列,优选地高密度阵列或格子(grid)的组分。这些阵列在诊断或预测目的中尤其有用。例如,一套点,每个点含有不同的基因并进而包括本发明的本发明的一种或多种多核苷酸,可以被用于探测,例如通过杂交或核酸扩增,通过源自身体样品或从身体样品得到的探针来确定一个个体中特定核苷酸序列或相关序列的存在。这样的存在可能意味着病原体的存在,尤其是粘膜炎莫拉氏菌的存在,并且可以用于检测或预测疾病和/或疾病的进程。含有许多SEQ ID NO:1,3,5或7中多核苷酸序列的变体的格子是优选的。含有许多SEQ ID NO:2,4,6或8中多肽序列的变体的格子也优选的。抗体
本发明的多肽和多核苷酸或其变体或表达它们的细胞可以被用作免疫原来分别产生对这样的多肽或多核苷酸具有免疫特异性的抗体。
在本发明的某些优秀的实施方案中提供了抗BASB020多肽或多核苷酸的抗体。
抗本发明的多肽或多核苷酸的抗体可以这样得到:对动物,优选地非人类动物,通过常规方法施用本发明的多肽和/或多核苷酸,或它们之一或两者的带有表位的片段,它们之一或两者的类似物,或表达它们之一或两者的细胞。单克隆抗体的制备可以用本领域中已知的由连续细胞系提供抗体任何技术。例子包括各种技术,例如Kohler,G.and Milstein,C.Nature 256:495-497(1975);Kozbor et al.,Immunology Today 4:72(1983);Cole et al.,pg.77-96 inMONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY,Alan R.Liss,Inc.(1985)中的技术。
用于生产单链抗体的技术可以被改造来生产针对本发明的多肽或多核苷酸的单链抗体。同时,转基因小鼠,或其他生物体或动物,如其他哺乳动物,可以被用来表达对本发明的多肽或多核苷酸具有免疫特异性的人化抗体。
替代地,根据对本发明多肽的结合活性,噬菌体呈现技术(phagedisplay technology)可以被用来从淋巴细胞PCR扩增V-基因库中或从天然文库中选择抗体基因;上述淋巴细胞来自用来筛选抗BASB020的人群(McCafferty,et al.,(1990),Nature 348,552-554;Marks,et al.,(1992)Biotechnology 10,779-783)。通过,例如,chain shuffling(Clackson et al.,(1991)Nature 352:628)可以提高这些抗体的亲和性。
以上描述的抗体可以被用来分离或鉴定表达本发明的的多肽或多核苷酸的颗粒,用来通过,例如亲和层析,纯化该多肽或多核苷酸。
因此,抗BASB020多肽或BASB020多核苷酸的抗体可以被用来治疗感染尤其是细菌感染,等等。
多肽的变体,包括抗原性上,表位上或免疫学上对等的变体构成了本发明的一个特殊的方面。
优选地,可以修饰上述抗体或其变体使其对个体的免疫原性降低。例如,如果上述个体是人那么该抗体可以被最为优选地“人化”,在人化抗体中杂交瘤抗体的互补性决定区或其它区域被移植到人单克隆抗体,例如Jones et al.(1986).Nature 321,522-525中所描述或Tempest et al.,(1991)Biotechnology 9,266-273中所描述。拮抗剂和激动剂-检测与分子
本发明的多核苷酸和多肽也可以用于在细胞,无细胞制备物,化学文库和天然产物混合物中评估小分子底物和配基的结合。这些底物和配基可以是天然底物和配基或者是结构或功能上的模拟物。参见,例如,Coligan et al.,Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5(1991)。
筛选方法可能仅仅是通过直接或间接与候选化合物相关的标记测量候选化合物和上述多肽或多核苷酸的结合,和或带有该多肽或多核苷酸的细胞或膜,或和该多肽的融合蛋白的结合。替代地,筛选方法可能涉及和标记竞争剂的的竞争。进而,利用针对含有该多肽或多核苷酸的细胞的适当检测系统,这些筛选方法可能测量候选化合物是否能导致一种由于激活或抑制上述多肽或多核苷酸而产生的信号。激活的抑制剂通常是在已知激动剂存在的情况下检测,并且观察候选化合物的存在对激动剂所导致的激活的影响。组成型激活的多肽和/或组成型表达的多肽或多核苷酸可以被应用于逆转激动剂或抑制剂的筛选方法,这可以通过在没有激动剂或抑制剂存在的情况下,根据具体情况,检测候选化合物是否导致对该多肽或多核苷酸引起的激活的抑制。进而,该筛选方法可能仅仅包括以下步骤:将候选化合物与含有本发明的一种多肽或多核苷酸的溶液混合以形成混合物,测量混合物中BASB020多肽和/或多核苷酸的活性并将混合物中BASB020多肽和/或多核苷酸的活性与标准进行比较。融合蛋白,例如由BASB020多肽和Fc部分形成的融合蛋白,如此前所描述,也可以被用于高通量筛选检测以鉴定本发明的多肽的拮抗剂以及系统发生和/或功能上相关的多肽(参见D.Bennett et al.,J Mol Recognition,8:52-58(1995);和K.Johanson et al.,J Biol Chem,270(16):9459-9471(1995))。
与本发明的多肽结合和/或相互作用的多核苷酸、多肽和抗体可以被用来设置一些筛选方法,上述筛选方法是用来探测加入的化合物对细胞产生mRNA和/或多肽的影响。例如可以构建一种ELISA测试以测量分泌水平的或细胞相连的多肽水平,这种方法是利用单克隆和多克隆抗体通过本领域中已知的常规方法进行的。这可以被用来寻找可能抑制或增强多肽在适当的经过操作的细胞或组织中的表达的制剂(也分别称为拮抗剂或激动剂)。
本发明还提供了筛选化合物以鉴定增强(激动剂)或阻止(拮抗剂)BASB020多肽或多核苷酸的作用的化合物,尤其是这些抑菌和/或杀菌的化合物,的方法。筛选方法可能需要高通量技术。例如,为了筛选激动剂或拮抗剂,在存在或不存在可能是激动剂或拮抗剂的化合物的情况下将合成的反应混合物、含有BASB020多肽的细胞分隔(cell compartment),如膜,细胞包膜或细胞壁、或其任何制备物以及这样多肽的标记底物或配基一起温育。候选分子激活或拮抗BASB020多肽的能力反映在标记配基结合的下降或标记底物的产物的产生减少。无效结合的分子,即,结合而不诱导BASB020多肽的效果的分子非常可能是很好的拮抗剂。结合得很好,并且,根据具体情况,增加从底物产生产物的速率、增加信号传导或或增加化学通道活性的分子是激动剂。可以通过报告系统探测可能被增强的从底物产生产物,信号传导或化学通道活性的速率或水平,根据具体情况。在这一点上有用的报告系统包括但不限于本领域中已知的比色系统,被转化成产物的标记底物,能反映BASB020多核苷酸或多肽活性的改变的报告基因以及结合测试。
另一个检测BASB020多肽激动剂的例子为竞争性测试,在上述竞争性测试中在适于进行竞争性抑制测试的条件下将BASB020和潜在的激动剂与BASB020结合分子,重组BASB020结合分子,天然底物或配基,或底物或配基模拟物混合在一起。BASB020可以被标记,例如用放射性和比色化合物标记,使得与结合分子结合的BASB020分子数或被转化的产物可以被精确地测定以评估潜在拮抗剂的效力。
潜在拮抗剂包括有机小分子,肽,多肽以及能够结合本发明的的多核苷酸和/或多肽从而抑制其活性或表达的抗体,等等。潜在的拮抗剂也可以是有机小分子,肽,多肽,如结合位点与结合分子相同的紧密相关的蛋白或抗体,如结合后不会诱导BASB020诱导的活性从而通过防止BASB020多肽和/或多核苷酸的结合而阻止了BASB020多肽/或多核苷酸的表达或作用的结合分子。
潜在的拮抗剂包括结合并占据上述多肽的结合位点从而阻止其和细胞结合分子的结合以至于阻止了其正常生物学活性的小分子。这一小分子的例子包括但不限于有机小分子、肽或类肽分子。其他潜在的拮抗剂包括反义分子(参见Okano,J.Neurochem.56:560(1991);OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSE INHIBITORS OF GENEEXPRESSION,CRC Press,Boca Raton,FL(1988)中对这些分子的描述)。优选的潜在拮抗剂包括BASB020的变体以及与之相关的化合物。
在进一步的方面中,本发明涉及遗传工程改造的融合蛋白,上述融合蛋白含有本发明多肽或其片段以及各种亚型的免疫球蛋白(IgG,IgM,IgA,IgE)重链或轻链的恒定区。优选的免疫球蛋白是人IgG,特别是IgG1的重链恒定区,其中融合位点位于铰链区。在一个特定的实施方案中Fc部分可以通过引入切除序列而被简单地除去,上述切除序列可以被凝血因子Xa切开。进而,本发明通过基因工程制备这些融合蛋白的方法,以及涉及这些融合蛋白在药物筛选、诊断以及治疗中的应用。本发明进一步的方面还涉及编码这样的融合蛋白的多核苷酸。融合蛋白技术的例子可以在国际专利申请No:WO94/29459和WO94/22914中找到。
此处提供的每个多核苷酸序列都可以被用于寻找和开发抗菌化合物。这些多核苷酸编码的蛋白表达后可以被用作筛选抗菌药物的靶。进而,在各自的mRNA上编码上述蛋白的氨基末端或Shine-Delgarno或其它翻译促进序列的多核苷酸序列可以被用来构建反义序列以控制感兴趣的编码序列的表达。
本发明还提供了本发明的多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂在干扰病原体和真核宿主,优选地为哺乳动物宿主,之间的最初相互作用上的应用,上述病原体和和宿主之间的最初相互作用导致了感染。特别是,本发明的分子可以用于:防止细菌,特别是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌粘附在真核生物的,优选地为哺乳动物的,留置装置上的细胞外基质蛋白,或粘附在伤口的细胞外基质蛋白上;阻止真核生物,优选地为哺乳动物,细胞外基质蛋白和细菌BASB020蛋白之间细菌粘附,上述细菌粘附导致组织损伤;和/或阻止感染中疾病发生的进程,上述感染是由于植入留置装置或其他外科技术以外的原因引起的。
根据本发明的另一个方面提供了BASB020激动剂以及拮抗剂优选地为抑菌或杀菌的激动剂和拮抗剂。
本发明的激动剂和拮抗剂可以被用于,例如,防止抑制和/或治疗疾病。
在进一步的方面中本发明涉及本发明多肽的拟表位。拟表位是和天然肽足够相似的肽序列(序列上或结构上),它能够被识别天然肽的抗体所识别;当它和适当的载体偶联时能够产生识别天然肽的抗体。
可以通过添加、缺失或替代选出的氨基酸为特定的目的设计拟表位。因此,上述肽可以进行修饰以便于和蛋白载体交联。例如,对于一些交联方法而言含有末端半胱氨酸是有利的。此外对于和蛋白载体交联的多肽在远离交联端的一端含有疏水末端时合乎需要的,这样多肽未交联的一端可以保持和载体蛋白的表面相联。这样肽呈现出的构象非常近似于该肽在天然完全分子中的构象。例如,可以改造肽使之具有N末端的半胱氨酸和C末端的疏水酰胺化的尾巴。替代地,可以替换一个或多个氨基酸的D-立体异构体以产生有利的衍生物,例如,以增强肽的稳定性。
替代地,可以通过,如,噬菌体呈现技术(EP 0 552 267 B1)用抗体鉴定肽拟表位,上述抗体自身能结合本发明的多肽。这种技术产生大量的模拟天然肽结构的肽序列,因此上述肽序列能够结合抗天然肽的抗体,但是它们自身和天然多肽不一定有显著的序列同源性。疫苗
本发明的另一个方面涉及在一个个体,尤其是哺乳动物,优选地是人,诱导免疫应答的方法,该方法包括为上述个体接种BASB020多核苷酸和/或多肽,或它们的片段或变体,上述接种足以产生抗体和/或T细胞免疫应答以保护上述个体不受感染,特别是不受细菌感染,尤其特别是不受粘膜炎莫拉氏菌感染。还提供了通过免疫应答减缓细菌复制的方法。本发明的另一个方面还涉及在个体中诱导免疫应答的方法,该方法包括对这样的个体体内输送核酸载体,序列或核酶以直接表达BASB020多核苷酸和/或多肽,或它们的片段或变体,以诱导免疫应答,如,产生抗体和/或T细胞免疫应答包括,例如,产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞,以保护个体,优选地为人类,免得疾病,不管该疾病是否已经在个体内产生。施用基因的一个例子为将基因涂覆在颗粒或其它东西的表面以加速它进入所需要的细胞。这样的核酸载体可以含有DNA、RNA、核酶和修饰的核酸,DNA/RNA杂交体、DNA蛋白复合物或RNA蛋白复合物。
本发明进一步的一个方面涉及一种免疫组合物,当它被引入到个体,优选地人类中时能在上述个体中诱导免疫应答,在这样的个体中诱导针对BASB020多核苷酸和/或其编码的多肽的免疫应答,其中上述组合物含有重组BASB020多核苷酸和或其编码的多肽,并且/或者含有DNA和/或RNA,上述DNA和/或RNA编码本发明的BASB020多核苷酸、该多核苷酸编码的多肽或其它多肽。免疫应答可以被用作治疗或预防的目的,并且可以是抗体免疫或细胞免疫的形式,如由于CTL或CD4+T细胞产生的免疫。
BASB020多肽或其片段可以与辅蛋白或化学组成部份融合,辅蛋白和化学组成部份自身可以产生或不产生抗体,但它们能稳定第一个蛋白并产生具有抗原性和/或免疫原性,以及优选地保护特性,的融合或修饰蛋白。因此融合重组蛋白优选地进而含有一种抗原性辅蛋白,如源自流感嗜血杆菌的脂蛋白D、谷胱氨肽-S-转移酶(GST)或β-糖苷酶,或任何其它稳定该蛋白并有利于其生产和纯化的较大的辅蛋白。进而,该辅蛋白可能在接受上述蛋白的生物体中提供对其免疫系统的一般刺激,在这个意义上该辅蛋白可能作为一种佐剂。上述辅蛋白可以连接到上述第一蛋白的氨基端或羧基端。
本发明还提供了组合物,尤其是疫苗组合物,以及含有本发明的多肽和/或多核苷酸以及免疫刺激DNA序列的方法,如Sato,Y.et al.Science 273:352(1996)中所描述。
本发明还提供了在多核苷酸构建体中利用以上描述的多核苷酸或其特定片段的方法,上述片段编码细菌细胞表面蛋白的不变区,上述构建体被用于感染了粘膜炎莫拉氏菌的动物模型的基因免疫试验中。这样的试验在鉴定能够引起预防性或治疗性免疫应答的蛋白表位上尤其有用。有人相信通过这种方法将能够随后制备具有特别价值的单克隆抗体,上述单克隆抗体源自成功地抵抗了或清除了感染的动物的器官,上述单克隆抗体可以被用于开发哺乳动物中,有其事人类中,细菌感染,尤其是粘膜炎莫拉氏菌感染的预防性制剂或治疗方法。
本发明还提供了一种疫苗配方,该配方含有免疫原性的本发明的重组多肽和/或多核苷酸以及适当的载体,如制药上可接受的载体。由于多肽和多核苷酸中胃中可能被分解,因此优选地是通过肠道外途径施用,包括,例如,皮下、肌肉内、静脉或皮内施用。适用于肠遗外施用的配方包括水溶解的或非水溶解的无菌注射溶液,可能含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌化合物以及使配方与个体的体液,优选地为血液,等渗的溶质;还包括含有悬浮剂或增稠剂的无菌水悬液或非水悬液。上述配方可以存在于单一剂量或多剂量容器中,例如密闭的安瓿和瓶子中并储存于冻干条件下,只需要在使用前加入无菌液体载体。
本发明的疫苗配方还可以包括佐剂系统以增强该配方的免疫原性。优选的佐剂系统优选地产生TH1类型的应答。
一种免疫应答可以被广泛地区分成为两种极端的类型,即体液或细胞介导的免疫应答(通常它们的保护机制的特征分别为抗体或细胞效应器)。应答的这些分类被命名为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。
极端TH1型免疫应答的特征在于产生抗原特异性的,单元型限制(haplotype restricted)的细胞毒性T细胞和天然杀伤细胞应答。在小鼠的TH1型应答中的特征经常为产生IgG2a亚型的抗体,而在人类中这相应于IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征为产生广泛的免疫球蛋白亚型包括小鼠IgG1,IgA,和IgM。
可以认为这两种亚型的应答的发展背后的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子倾向于诱导针对既定抗原的细胞介导的免疫应答,而高水平的TH2型细胞因子倾向于诱导针对既定抗原的体液免疫应答。
TH1型和TH2型免疫应答的区分并不是绝对的。事实上一个个体将支持的免疫应答被描述为主要TH1或主要TH2。然而,根据Mosmann和Coffman在鼠CD4+veT细胞克隆中的描述来考虑细胞因子家族经常是方便的(Mosmann,T.R.and Coffman,R.L.(1989)TH1和TH2细胞:不同的淋巴因子类型分泌导致不同的功能特征,AnnualReview of Immunology,7,p145-173)。通常,TH1类型的应答是与T淋巴细胞产生INFγ和IL2细胞因子相关的。其它经常与TH1类型免疫应答的诱导直接相关的细胞因子,如IL-12,不是由T细胞产生的。相反,TH2类型的应答经常与IL-4,IL-5,IL-6和IL-13的分泌相关。
已知某些疫苗佐剂特别适合诱导TH1或TH2型细胞因子应答。通常接种或感染后免疫应答的TH1∶TH2平衡的最好指示包括用抗原重新刺激后直接测量T淋巴细胞体外产生的TH1或TH2细胞因子,和/或测量抗原特异性抗体应答的IgG1∶IgG2比率。
因此TH1型佐剂是指用抗原体外刺激时优先刺激分离的T细胞群产生高水平TH1型细胞因子,并促进CD8+细胞毒性T细胞以及与TH1型亚型相关的抗原特异性免疫球蛋白应答的发展的佐剂。
能优先刺激TH1型应答的在国际专利申请No.WO94/00153和WO95/17209中有所描述。
3 De-O-脂酰化单磷酰基脂A(3 De-O-acylatedmonophosphoryl lipid A,3D-MPL)是一种这样的佐剂。这是从GB2220211(Ribi)中得知的。在化学上它是带有4,5或6脂酰链的3De-O-脂酰化单磷酰基脂A,由Ribi Immunochem,Montana生产。一种优选形式的3 De-O-脂酰化单磷酰基脂A公布于欧洲专利0689 454中(Smith Kline Beecham Biologicals SA)。
优选地,3D-MPL的颗粒足够小,以便可以过滤通过0.22微米的膜除菌(欧洲专利号0 689 454)。
每剂量中存在的3D-MPL的量可以在10μg-100μg的范围内,优选地在25μg-50μg内,其中存在的上述抗原的量通常在2-50μg每剂量的范围内。
另一种优选的佐剂包括QS21,一种源自Quilaja SaponariaMolia树皮的,经过HPLC纯化的无毒组分。供选地,这种佐剂可以被混合到3 De-O-脂酰化单磷酰基脂A中,供选地与载体一起混合。
生产QS21的方法在美国专利No.5,057,540中公布。
含有QS21的非反应原性佐剂的配方先前已有描述(WO96/33739)。这样的含有QS21和胆固醇的配方和一种抗原配制在一起时已经被证明是成功的TH1刺激佐剂。
作为TH1细胞应答的优先刺激剂的佐剂进而包括免疫调节寡聚核苷酸,例如未甲基化的CpG序列,如WO 96/02555中所公布。
不同TH1刺激佐剂,如先前所描述,的组合也被认为是提供了TH1细胞应答的优先刺激剂的佐剂。例如,QS21可以和3D-MPL配制在一起。QS21∶3D-MPL的比例通常为1∶10到10∶1这个级别;优选地为1∶5到5∶1,并且经常是1∶1。最佳协同作用的优选范围是2.5∶1到1∶2 3D-MPL∶QS21。
优选地,载体也存在与根据本发明的疫苗组合物中。该载体可以是水包油乳剂或铵盐,如磷酸铵或氢氧化铵。
优选的水包油乳剂含有可代谢的油,如鲨烯、α生育酚和土温80。在一个特别优选的方面根据本发明的疫苗组合物的抗原和QS21以及3D-MPL共同存在于这样的乳剂中。此外,水包油乳剂可以含有span85和/或卵磷脂和/或三辛酸(tricaprylin)。
通常对于人类施用而言QS21和3D-MPL在疫苗中存在的范围为1μg-200μg,如10-100μg,优选地10μg-50μg每剂量。通常水包油将含有2到10%的鲨烯;2到10%的α生育酚以及0.3到3%的土温80。优选地鲨烯:α生育酚的比例等于或小于1以提供更稳定的乳剂。Span85可以以1%的水平存在。在一些情况下本发明的疫苗进而含有稳定剂可能是有利的。
无毒水包油乳剂进而在水载体中。含有无毒的油,例如鲨烷或鲨烯,乳化剂,例如土温80。上述水载体可以是,例如,磷酸盐缓冲液。
在WO95/17210中描述了在水包油中含有QS21、3D-MPL和生育酚的特别强劲的佐剂配方。
本发明还提供了含有本发明的疫苗配方以及其他抗原,特别是可以用于治疗癌症、自体免疫疾病和相关病情的抗原,的多价疫苗组合物。这样的多价疫苗组合物可以含有TH1诱导佐剂,如此前所描述。
尽管本发明是关于某些BASB020多肽和多核苷酸的,但是应当理解它覆盖了天然存在的多肽和多核苷酸的片段,还覆盖了类似的多肽和多核苷酸,在上述的类似多肽和多核苷酸中进行了添加、缺失或替代而不会实质性的影响重组多肽或多核苷酸的免疫原性特性。组合物,试剂盒和施用
在本发明的一个进一步的方面中提供了含有BASB020多核苷酸和/或BASB020多肽的组合物以施用到细胞或多细胞生物体中。
本发明还涉及含有此处所讨论的多核苷酸和/或多肽或它们的激动剂或拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多核苷酸还可以和无菌的或非无菌的载体,例如适用于对一个个体施用的制药载体,联合使用于细胞、组织或生物体。这样的组合物含有,例如,介质添加剂(mediaadditive)或药用上有效剂量的本发明的多肽和/或多核苷酸以及制药上可接受的载体或赋形剂。这样的载体可以包括,但是不限于,盐溶液,缓冲的盐溶液,右旋糖,水,甘油,乙醇和它们的组合。上述配方应当适合于施用方式。本发明进而涉及诊断和制药包和试剂盒,它们含有一个或多个充满了上述本发明组合物的成分的容器。本发明的多肽,多核苷酸和其它化合物可以单独使用或和其它化合物一起使用,如治疗用的化合物。
上述药用组合物可以以任何有效的方便的方式施用,例如,通过局部、口服、阴道、静脉、腹膜内、肌肉内、皮下、鼻腔内或皮内途径等等途径施用。
在治疗或预防时活性制剂可以作为可注射的组合物对个体施用,例如作为无菌液体分散物,优选地是等渗的。
在进一步的方面中本发明提供了药用组合物,该组合物中含有治疗上有效剂量的多肽和/或多核苷酸,如可溶形式的本发明的多肽和/或多核苷酸激动剂或拮抗剂肽或小分子化合物,以及药用上可接受的载体或赋形剂。这样的载体可以包括,但是不限于,盐溶液,缓冲的盐溶液,右旋糖,水,甘油,乙醇和它们的组合。上述配方应当适合于施用方式。本发明进而涉及诊断和制药包和试剂盒,它们含有一个或多个充满了上述本发明组合物的成分的容器。本发明的多肽,多核苷酸和其它化合物可以单独使用或和其它化合物一起使用,如治疗用的化合物。
组合物将被改造得适用于施用途径,例如全身途径或口服途径。优选的全身施用形式包括注射,通常为通过静脉注射。也可以使用其它注射途径,如皮下注射、肌肉内注射或腹膜内注射。替代的全身施用方法包括透过黏膜和透过皮肤的施用,以胆酸盐或梭链孢酸或其它去污剂作为渗透剂。此外,本发明的多肽或其它化合物可以被配制成肠道配方或胶囊形式,口服施用也是可能的。通过药膏、软膏、凝胶、溶液、粉末等等形式,这些化合物的施用也可以是局部的和/或定位的。
对于哺乳动物,特别是人类,的施用而言,预期活性制剂每天的剂量水平为0.01mg/kg到10mg/kg,通常大约为1mg/kg。医生在任何情况下都将确定最适合于一个个体的真正剂量,上述剂量将根据年龄、体重和特定个体的反应而定。以上剂量是普通情况的示范。当较高或较低的范围是有利时当然可能存在个别情况,这样的情况处于本发明的范围之内。
所需要的剂量范围依赖于所选择的肽,施用的途径,配方的性质,对象病情的性质,以及参与的实践者的判断。但是适当的剂量在0.1-100μg/kg对象的体重的范围内。
可注射形式疫苗组合物时很方便的、可以用传统的佐剂来增强免疫应答。适当的单位接种剂量为0.5-5微克抗原/kg,优选地以这样的剂量施用1-3次,间隔为1-3星期。在所注明的剂量范围内没有观察到本发明化合物的不利的毒性效应,如果存在上述毒性效应那么它们对适当个体的施用将被禁止。
考虑到可得到的化合物的多样性以及各种施用途径的不同效率,可以预期所需要的剂量有很大的变化。例如,与静脉注射相比预期口服施用将需要更高的剂量。可以通过常规的优化经验规律调节这些剂量水平上的变化,这在本领域中是众所周知的。序列数据库,有形介质中的序列和运算法则
多核苷酸和多肽的序列形成了一个宝贵的资源,用它们可以确定它们的2-和3-维结构以及鉴定具有相似同源性的进一步的序列。通过将这些序列处存在计算机的可读介质中然后在已知的大分子结构程序中应用上述储存的数据,或用广为人知的搜索工具,如GCG程序包搜索序列数据库很容易使以上方法变得简便。
本发明还提供了特征序列(character sequence)或特征链,特别是基因序列或编码蛋白的序列,的序列分析方法。优选的序列分析方法包括,例如,序列同源性分析的方法,如同一性和相似性分析、DNA、RNA和蛋白结构分析、序列装配、进化树分析、序列域(sequencemotif)分析、开放阅读框的确定、核酸碱基召集(nucleic acid basecalling)、密码子使用分析、核酸碱基整理和序列色谱峰分析。
提供了基于计算机的同源性鉴定方法。这种方法包括以下步骤:在计算机可读介质中提供含有本发明的多核苷酸序列的第一多核苷酸序列;并将上述第一多核苷酸序列和至少一种第二多核苷酸序列或多肽序列进行比较以确定同源性。
还提供了基于计算机的同源性鉴定方法。这种方法包括以下步骤:在计算机可读介质中提供含有本发明的多肽序列的第一多肽序列;并将上述第一多肽序列和至少一种第二多核苷酸序列或多肽序列进行比较以确定同源性。
所有在本说明书中引用的发表物和参考文献,包括但不限于专利和专利申请,都在此全文引入作为参考,就象每个单独的发表物或参考文献都被特地和单独标明在此全文引入作为参考。按照上文描述的发表物和参考文献的引用方式,本申请要求具有优先性的任何专利申请也在此全文引入作为参考。定义
“同一性”,如本领域中所众所周知,是指,根据具体情况,通过序列对比所确定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间关系。在本领域中“同一性”还表示,根据具体情况,两个多肽序列或多核苷酸序列之间的相关性,如这两个序列的链之间的匹配性所决定。通过已知的方法很容易计算“同一性”,这些方法包括但不限于(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing;Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,AcademicPress,New York,1993;Computer Analysis,New Jersey,1994;Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and Devereux,J.,eds.,M Stockton Press,New York,1991;and Carillo,H.,andLipman,.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988).)中所描述的方法。确定同一性的方法被设计得使被测试的序列之间的匹配最大。进而,确定同一性的方法被编成了共享的计算机程序。确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括,但不限于,GCG程序包中的GAP程序(Altschul,S.F.et al.,J.Molec.Biol.215:403-410(1990))和FASTA(Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444-2448(1988))。BLAST家族的程序在NCBI和其它来源上是共享的(BLAST Manual,Altschul,S.,et al.,NCBINLM NIH Bethesda,MD 20894;Altschul,S.,et al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。众所周知的Smith Waerman运算法则也可以被用来确定同一性。
多肽序列比较的参数如下:
运算法则:Needleman and Wunsch,J.Mol Biol.48:443-453(1970)
比较基质(comparison matrix):BLOSSUM62,来自Henikoff andHenikoff
Proc.Natll.Acad.Sci.USA.8910915-10919(1992)
间隙补偿(gap penalty):8
间隙长度补偿(gap length penalty):2
可以用这些参数的是Genetics Computer Group,Madison WI的名为“gap”的共享程序。前述的参数是肽段比较的默认参数(以及对末端间隙没有惩罚)。
多核苷酸比较的参数如下:
运算法则:Needleman and Wunsch,J.Mol Biol.48:443-453(1970)
比较基质:匹配=+10,不匹配=0
间隙补偿(gap penalty):50
间隙长度补偿(gap length penalty):3
可以从Genetics Computer Group,Madison WI的“gap”程序得到。这些是核酸比较的默认参数。
多核苷酸和多肽,根据具体情况,的“同一性”的优选的含义由以下的(1)和(2)提供。
(1)多核苷酸实施方案进而包括一种分离的多核苷酸,该多核苷酸含有的序列和SEQ ID NO:1中的参考序列的同一性至少为50、60、70、80、90、95、97或100%,其中所述的多核苷酸序列可能和SEQ ID NO:1中参考序列完全相同或可能和参考序列相比至少有某个整数的核苷酸发生改变,其中所述的改变选自一组由至少一个核苷酸缺失、替换包括转换和颠换、或插入组成的一组改变,并且其中所述的改变可能在参考序列的5’或3’端或这两端之间的任何位置发生,上述改变或者独立地分布在参考序列的核苷酸中,或者在参考序列中以一个或多个相邻的组的形式分布,其中所述的核苷酸改变的数目是这样得到的:将SEQ ID NO:1中的核苷酸总数乘以表示百分之同一性的整数再除以100,然后从上述SEQ ID NO:1中的核苷酸总数中减去上述计算的得数,或者
nn≤xn-(xn·y),其中nn是变化的核苷酸数,xn是SEQ ID NO:1中的总核苷酸数,y对于50%是0.50,60%是0.60,70%是0.70,80%是0.80,85%是0.85,90%是0.90,95%是0.95,97%是0.97或对于100%是1.0,·是乘号的标志,其中任何xn和y的任何非整数得数都先取整为最相近的整数然后再从xn中减去。编码SEQ ID NO:2中多肽的多核苷酸序列的改变可能在编码序列中产生无义、错义或框架偏移突变,从而在这样的改变之后变化该多核苷酸所编码的多肽序列。
举个例子,本发明的多核苷酸序列可以和SEQ ID NO:1中的参考序列相同,即可能是100%相同,或者和参考序列相比可能有整数个核酸发生改变,即同一性百分比小于100%。其中所述的改变选自一组由至少一个核苷酸缺失、替换包括转换和颠换、或插入组成的一组改变,并且其中所述的改变可能在参考序列的5’或3’端或这两端之间的任何位置发生,上述改变或者独立地分布在参考序列的核苷酸中,或者在参考序列中以一个或多个相邻的组的形式分布。其中所述的核苷酸改变的数目是这样得到的:将SEQ ID NO:1中的核苷酸总数乘以表示百分之同一性的整数再除以100,然后从上述SEQ IDNO:1中的核苷酸总数中减去上述计算的得数,或者
nn≤xn-(xn·y),其中nn是变化的核苷酸数,xn是SEQ ID NO:1中的总核苷酸数,y对于50%是0.50,60%是0.60,70%是0.70,80%是0.80,85%是0.85,等等,·是乘号的标志,其中任何xn和y的任何非整数得数都先取整为最相近的整数然后再从xn中减去。
(2)多肽实施方案进而包括一种分离的多肽,该多肽含有的序列和SEQ ID NO:2中的参考序列的同一性至少为50、60、70、80、90、95、97或100%,其中所述的多肽序列可能和SEQ ID NO:1中参考序列完全相同或可能和参考序列相比至少有某个整数的氨基酸发生改变,其中所述的改变选自一组由至少一个氨基酸缺失、替换包括保守和非保守的替换、或插入组成的一组改变,并且其中所述的改变可能在参考序列的氨基端或羧基端或这两端之间的任何位置发生,上述改变或者独立地分布在参考序列的氨基酸中,或者在参考序列中以一个或多个相邻的组的形式分布,其中所述的氨基酸改变的数目是这样得到的:将SEQ ID NO:2中的氨基酸总数乘以表示百分之同一性的整数再除以100,然后从上述SEQ ID NO:2中的氨基酸总数中减去上述计算的得数,或者
na≤xa-(xa·y),其中na是变化的氨基酸数,xa是SEQ ID NO:2中的总氨基酸数,y对于50%是0.50,60%是0.60,70%是0.70,80%是0.80,85%是0.85,90%是0.90,95%是0.95,97%是0.97或对于100%是1.0,·是乘号的标志,其中任何xa和y的任何非整数得数都先取整为最相近的整数然后再从xa中减去。
举个例子,本发明的多肽序列可以和SEQ ID NO:2中的参考序列相同,即可能是100%相同,或者和参考序列相比可能有整数个氨基酸发生改变,即同一性百分比小于100%。其中所述的改变选自一组由至少一个氨基酸缺失、替换包括保守或非保守替换、或插入组成的一组改变,并且其中所述的改变可能在参考序列的氨基端或羧基端或这两端之间的任何位置发生,上述改变或者独立地分布在参考序列的氨基酸中,或者在参考序列中以一个或多个相邻的组的形式分布。其中所述的氨基酸改变的数目是这样得到的:将SEQ ID NO:2中的氨基酸总数乘以表示百分之同一性的整数再除以100,然后从上述SEQID NO:2中的氨基酸总数中减去上述计算的得数,或者
na≤xa-(xa·y),其中na是变化的氨基酸数,xa是SEQ ID NO:2中的总氨基酸数,y对于50%是0.50,60%是0.60,70%是0.70,80%是0.80,85%是0.85,等等,·是乘号的标志,其中任何xa和y的任何非整数得数都先取整为最相近的整数然后再从xa中减去。
此处所用的“个体”是关于一种生物体的,意思为多细胞真核生物,包括但不限于,多细胞生物(metazonan),ovid,牛科动物,猿,灵长类和人。
“分离”的意思为“通过人的手”将其从其天然状态改变,即,如果它是天然存在的,那么它被从其初始环境改变或移开,或两者。例如,天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽不是“分离”的,但是从其天然状态共存的物质中分开的多核苷酸和多肽就是“分离”的,如此术语在此所使用进而,通过转化、基因操作或通过任何其它重组方法被引入到一个生物体中的多核苷酸或多肽就是分离的,尽管它仍然存在于上述生物体中,上述生物体可以是活的或死的。
“多核苷酸”通常指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸,可以是未修饰的RNA或DNA,或修饰的RNA或DNA,包括单链和多链区域。
“变体”指和参考多核苷酸或多肽不同的多核苷酸或多肽。一个多核苷酸典型的变体和另一个参考的多核苷酸在核苷酸序列上有所不同。上述变体核苷酸序列的改变可能也可能不改变上述参考序列所编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸的改变可能导致参考序列所编码的多肽的氨基酸替换、添加、缺失、融合和截短,如下文所讨论。一个多肽典型的变体和另一个参考的多肽在氨基酸序列上有所不同。通常,这些不同是有限的,以便参考多肽和变体的序列整体上足够相似,并且在许多区域是相同的。变体和参考多肽在在氨基酸序列上的差别可能为一个或多个替换、添加、缺失或它们的任何组合。插入或替换的氨基酸残基可能是也可能不是由遗传密码编码的。多核苷酸的变体可能是天然存在的,例如等位变体,或可能是天然中未发现的变体。多核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通过突变技术或通过直接合成制备。
“疾病”的意思为由细菌感染引起的或涉及细菌感染的疾病,包括,例如,婴儿和儿童的中耳炎,老人的肺炎,窦炎,医院感染和侵入性疾病,丧失听力的慢性中耳炎,液体在中耳中聚集,听神经损伤,学语迟缓,上呼吸道感染和中耳炎症。
实施例1:源自粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617的BASB020基因的发现和DNA测序确认
SEQ ID NO:1中的BASB020基因首先发现于含有粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617(也成为菌株Mc2931)未完成基因组DNA序列的Incyte PathoSeq数据库。BASB020多核苷酸序列的翻译产物,如SEQID NO:2所示,和猪痢疾小蛇菌的TlyC溶血素蛋白表现出显著的同一性(227个氨基酸重叠中具有36%的同一性)。
进而通过实验手段确认了BASB020基因的序列。为了这个目的利用QIAGEN的基因组DNA提取试剂盒(Qiagen Gmbn)从1010个粘膜炎莫拉氏菌(ATCC43617菌株)细胞中提取了基因组DNA,用引物E475781a(5’-ACT TGA ATA AAA CCG G-3’)(SEQ ID NO:9)和E475782a(5’-GAC ATT GGC CGC AAC ATG C-3’)(SEQ ID NO:10)将1μg的这种物质进行了聚合酶链式反应。利用Biorobot9600(Qiagen Gmbh)仪器纯化了该PCR产物并用Big Dye CycleSequenching kit(Perkin-Elmer)和ABI377/PRISM DNA测序仪进行测序。在两条链上进行测序,冗余度(redundancy)为2,并用SequencherTM(Applied Biosystem)软件组装了全序列。得到的序列表明和SEQ ID NO:1的同一性为100%。
实施例2几个粘膜炎莫拉氏菌菌株的BASB020基因之间的可变性分析2A:限制性长度多态性分析(RFLP)
如下文所描述,从16个粘膜炎莫拉氏菌菌株(在表1中列出)中提取了基因组DNA。将粘膜炎莫拉氏菌在BHI琼脂平板上划线并在37℃培养过夜以得到单菌落。挑取3到4个单菌落用来接种~1.5mlBHI(Brain-heart infusion,脑-心灌输液)种子肉汤培养基并在摇床中培养过夜,~300rpm,37℃。用种子培养基接种锥形瓶中的~150mlBHI肉汤培养基并在摇床中37℃培养~12-16小时,175rpm以得到大量的细胞进行DNA分离。在Sorval GSA转头上~2000×g室温离心15分钟以收集细胞。倒去上清并用~5.0ml无菌水悬浮细胞沉淀。加入等体积的裂解缓冲液(200mM NaCl,20mM EDTA,40mMTris-HCl,pH8.0,0.5%(w/v)SDS,0.5%(v/v)2-巯基乙醇,和250μg/ml蛋白酶K)并温和地搅动和研磨以悬浮细胞。然后将悬浮液在50℃温育~12小时以裂解细胞和释放染色体DNA。加入5.0ml饱和NaCl(~6.0M,溶于无菌水中)并在Sorval SS34转头室温5,500×g离心以沉淀蛋白物质。通过加入两倍体积的100%乙醇以从上清中沉淀染色体DNA。搜集聚集的DNA并用小体积的70%乙醇溶液温柔地搅动以进行洗涤。用无菌水悬浮纯化的DNA并在4℃稳和摇动过夜以溶解/分配DNA。根据1.00.D.单位~50μg/ml的消光系数通过分光光度法在260nm处测量溶解的DNA的浓度。
然后利用MC-Hly3-BamF(5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GGATCC ATG CGT GGT AGG CGT TGG TTA TCC ACC G-3’)(SEQ ID NO:11)和MC-Hl y3-Sal RC(5’-AAG GGC CCA ATT ACG CAG AGG GTC GAC TTATTA TTC AGC ATT CTC AAG CTG TGG TAT CAG-3’)(SEQ ID NO:12)寡聚核苷酸将上述物质进行PCR扩增。用限制性内切酶(AciI,AluI,HphI,MseI,NlaIII,TspS09I)将BASB020基因相应的扩增产物独立进行水解,限制性产物用常规的分子生物学方法,如“MolecularCloning,a Laboratory Manual,Second Edition,Eds:Sambrook,Fritch&Maniatis,Cold Spring Harbor press 1989”中所描述,通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离。得到的电泳凝胶的照片在图1中出示。对每个菌株相应于6个限制性内切酶的RFLP样式进行评分和综合。然后定义具有共有相同的综合RFLP样式的菌株组。通过这种方法,在本研究中测试的菌株被分成6个基因组类型(组1:Mc2904,Mc2905,Mc2906,Mc2969;组2:Mc2907,Mc291 3;组3:Mc2908,Mc2909,Mc2931,Mc2975;组4:Mc2910,Mc2912,Mc2956,组5:Mc2911;组6:Mc2926)。这些数据支持了在本研究中使用的粘膜炎莫拉氏菌群在BASB020基因上表现出一些核苷酸序列多样性这一现象。2B:其它菌株中的DNA测序
用来确定BASB020序列的ATCC43617菌株(Mc2931)通过RFLP被归类到组3。通过实施例1中所描述的实验方法还确定了其它3个RFLP基因组类型的粘膜炎莫拉氏菌代表菌株(组1(Mc2969),组2(Mc2913)组4(Mc2912))。菌株Mc2912,Mc2913,Mc2969的BASB020基因的多核苷酸序列分别示明于SEQ ID NO:3,5和7。这些多核苷酸序列被翻译成的氨基酸序列分别示明于SEQ ID NO:4,6和8。用DNASTAR Lasergene程序包的MegAlign程序对SEQ ID NO:1,3,5和7中的多核苷酸序列进行了多序列对比,结果示明于图2。成对序列的同一性比较总结于表2,表明4个BASB020核苷酸基因序列的同一性都类似地为99%或更高。用同一程序对SEQ ID NO:2,4,6和8中的多肽序列进行了序列对比,结果示明于图3。成对序列的同一性比较总结于表3,表明4个BASB020蛋白序列的同一性都类似地为99%或更高。
表1:用于本研究的粘膜炎莫拉氏菌菌株的特征
菌株 | 分离于 | 源自 |
Mc2904 | 美国 | 鼓膜穿刺术 |
Mc2905 | 美国 | 鼓膜穿刺术 |
Mc2906 | 美国 | 鼓膜穿刺术 |
Mc2907 | 美国 | 鼓膜穿刺术 |
Mc2908 | 美国 | 急性耳炎鼓膜穿刺术 |
Mc2909 | 美国 | 鼓膜穿刺术 |
Mc2910 | 美国 | 鼓膜穿刺术 |
Mc2911 | 美国 | 急性耳炎鼓膜穿刺术 |
Mc2912 | 美国 | 急性耳炎鼓膜穿刺术 |
Mc2913 | 美国 | 急性耳炎鼓膜穿刺术 |
Mc2926 | 美国 | 鼓膜穿刺术 |
Mc2931/ATCC | 美国 | 气管穿刺吸出物 |
Mc2956 | 芬兰 | 中耳液体 |
Mc2960 | 芬兰 | 中耳液体 |
Mc2969 | 挪威 | 鼻咽(鼻咽炎) |
Mc2975 | 挪威 | 鼻咽(鼻炎) |
表2:BASB020多核苷酸序列的成对序列同一性(%)
Seq ID No:3 | Seq ID No:5 | Seq ID No:7 | |
Seq ID No:1 | 99.5 | 99.2 | 99.3 |
Seq ID No:3 | 99.6 | 99.3 | |
Seq ID No:5 | 99.4 |
表3:BASB020多肽序列的成对序列同一性(%)
实施例3:表达重组BASB020的质粒的构建A:BASB020的克隆
Seq ID No:4 | Seq ID No:6 | Seq ID No:8 | |
Seq ID No:2 | 99.6 | 99.6 | 100 |
Seq ID No:4 | 100 | 99.6 | |
Seq ID No:6 | 99.6 |
分别在正向(SEQ ID NO:11)和反向(SEQ ID NO:12)扩增引物上设计了BamHⅠ和SalⅠ限制性位点,以允许将504bp的PCR产物定向连接到可由商业途径获得的E.coli表达质粒pQE30(QiaGen,氨苄抗性),以便成熟BASB020蛋白可以作为在N末端含有(His)6亲和层析标记的融合蛋白表达。BASB020 PCR产物是根据制造商的说明利用基于硅胶的离心柱(QiaGen)从PCR反应体系中纯化得到的。为了产生克隆所需要的BamHⅠ和SalⅠ末端,按照制造商的说明(LifeTechnologies)随后将纯化的PCR产物用限制性酶BamHⅠ和SalⅠ消化完全。第一次限制性消化后将PCR产物用上述的离心柱纯化以除去盐,并在进行第二次酶消化之前用无菌水洗脱。和pQE30质粒连接之前将消化的DNA片段再一次用基于硅胶的离心柱纯化。B:表达载体的产生
为了制备连接所用的pQE30,类似地用BamHⅠ和SalⅠ进行了完全消化,然后按照制造商的指导用小牛肠磷酸酶(CI[P,~0.02单位/pmole 5’端,Life Technologies)消化以防止自连接。加入与制备的载体相比大约5倍摩尔过量的消化片段进行连接反应。在常规的~20μl的连接反应体系(~16℃,~16小时)中用本领域中众所周知的方法通过T4 DNA连接酶(~2.0单位/反应,LifeTechnologies)进行连接。根据本领域中众所周知的方法用一小份连接体系(~5μl)转化M15(pREP4)电转化感受态细胞。在~1.0ml LV肉汤培养基中37℃培养~2-3小时后涂布在含有卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(100μg/ml)的LB平板上。在选择培养基中同时含两种抗生素是为了保证所有的转化细胞同时带有pREP4质粒(KnR)和pQE30-BASB020(ApR)质粒,在pREP4质粒中带有lacIq基因,该基因对于在pQE30上抑制可由IPTG诱导的蛋白的表达是必需的。平板在37℃过夜培养~16小时。用无菌牙签挑取单个的KnR/ApR菌落并用于对新鲜的KnR/ApR平板以及~1.0ml LB KnR/ApR肉汤培养基进行“斑点”接种。在常规的培养箱(平板)或水浴摇床中37℃过夜培养斑点平板和肉汤培养基。
用全细胞PCR分析确认转化子含有BASB020 DNA插入序列。将1.0ml LB Kn/Ap肉汤过夜培养物转移到1.5ml聚丙烯管中,用Beckmann微量离心机(~3min,室温,~1,2000×g)收集细胞。细胞沉淀用~200μl无菌水悬浮,然后将10μl的一小份用于进行总体积~50μl的PCR反应体系,在该反应体系中含有BASB020正向和反向扩增引物。PCR反应组分的终浓度基本上和实施例2中所说明的一样,但使用了~5.0单位的Taq聚合酶。最初的95℃变性步骤增加到3分钟以确保对细菌细胞的热破坏并释放质粒DNA。用的是ABI Model9700热循环仪,32个循环,3步热扩增方式,即,95℃,45秒;55-58℃,45秒;72℃,1分钟,来扩增裂解的转化子细胞的MC-P6 PCR片段。热扩增后将~20μl的反应体系进行琼脂糖凝胶电泳分析(0.8%琼脂糖熔于Tris-乙酸-EDTA(TAE)缓冲液)。凝胶电泳后DNA片段用溴乙锭染色和紫外线照射来显示。和测试样品平行电泳DNA分子量标准(1kb阶梯,Life Technologies)以便估计PCR产物的大小。产生预期的504bpPCR产物的转化子被鉴定为含有BASB020表达构建物的转化子。对含有表达质粒的菌株进行重组BASB020可诱导表达的分析。C:PCR-阳性转化子的表达分析
对于以上鉴定的每个PCR阳性转化子从斑点平板上接种到含有卡那霉素(50μg/ml)和氨苄青霉素(50μg/ml)~5.0ml LB肉汤中并在摇床中(~250rpm)37℃培养过夜。过夜种子培养物的一个小份(~1.0ml)被接种到含有25ml LB Kn/Ap肉汤培养基125ml锥形瓶中并在37℃摇晃培养(~250rpm)直至培养基的混浊度达到O.D.600~0.5,即,对数生长中期(通常为约1.5-2.0小时)。在这一时间大约一半的培养基(约12.5ml)被转移到第二个125ml的烧瓶中并将IPTG(1.0M用无菌水制备的储存液,Sigma)加到终浓度1.0mM以诱导重组BASB020蛋白的表达。将IPTG诱导的和未诱导的培养物在37℃继续摇晃培养~4小时。诱导后取出诱导的和未诱导的培养物的样品并且在室温微量离心以收集菌体。然后每份沉淀用~50μl无菌水悬浮,然后和等体积的含有2-巯基乙醇2×Laemelli SDS-PAGE上样缓冲液混合并沸水浴~3分钟以变性蛋白。将等体积(~15μl)的IPTG诱导的和未诱导的粗细胞裂解液上样到两块12%Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(1mm厚的微型凝胶,Novex)。将诱导的和未诱导的样品以及预染色的分子量标准(SeeBlue,Novex)在传统的条件下用常规的SDS/Tris/甘氨酸电泳缓冲液(BioRad)一起电泳。电泳后一块凝胶用考马斯亮蓝R250(BioRad)染色,然后脱色以观察IPTG诱导的新BASB020蛋白。第二块凝胶用BioRad Mini-Protein Ⅱ印迹装置和Towbin’s甲醇(20%)转移缓冲液电转移到PVDF膜(0.45微米孔径,Novex)上。膜的封闭和抗体的温育按照本领域中众所周知的方法进行。首先用单克隆抗-RGS(His)3抗体,然后用交联了HRP的兔抗鼠二抗(QiaGen)来确认BASB020重组蛋白的表达和身份。用ABT不溶底物或Hyperfilm以及Amersham ECL的化学发光系统来显示抗His抗体的反应样式。D:序列的确认
为了进一步确认IPTG诱导表达的重组BASB020是正确的开放阅读框并且不是克隆假象(例如阅读框移动)造成的假分子,确认了克隆插入物的DNA序列。用传统的不对称PCR循环测序方法(ABI PrismDye-Terminator Cycle Sequencing,Perkin-Elmer)从一条链得到了粘膜炎莫拉氏菌BASB020基因的DNA序列。用未消化的表达质粒DNA(~0.5μg/rxn)作为模板和适当的pQE30载体特异性的ORF特异测序引物(~3.5pmol/rxn)设计了测序反应。除了莫饱和测序引物外每个测序反应体系(~20μl)还含有4种不同的dNTP(即,A,G,C,T)和4种相应的ddNTP(即,ddA,ddG,ddC,ddT)终止核苷酸;每个终止核苷酸和四种荧光染料,Joe,Tam,Rox,或Fam中的一种交联。由于染料标记的ddNTP终止核苷酸的掺入单链测序延伸产物沿着模板在随机位置终止。用微量离心分子排阻层析柱(PrincetonGenetics)纯化了荧光管染料标记的终止产物,真空干燥,按照制造商的说明用模板悬浮缓冲液悬浮(Perkin-Elmer)以进行毛细管电泳,或用去离子甲酰胺悬浮以进行PAGE(ABI 377 Automated DNAsequenator)。收集每个反应得到的DNA测序数据并用ABI SequenceAnalysis Software(Perkin-Elmer)在PowerMAC计算机上自动分析荧光峰的相对强度。在用AutoAssembler软件(Perkin-Elmer)合并成单链序列“串”之前单独地将自动分析的DNA序列进行手工编辑以保证准确性。测序表明表达质粒含有正确的开放阅读框的正确序列。实施例4:重组BASB020的生产细菌菌株
含有编码源自粘膜炎莫拉氏菌的BASB020的质粒(pQE30)的E.coli M15(pREP4)重组表达菌株被用来产生用于纯化重组蛋白的大量细胞。在含有50μg/ml卡那霉素(“Kn”)和100μg/ml氨苄青霉素(“Ap”)的LB琼脂平板上培养表达菌株以保证同时维持pREP4 lacIq调控质粒和pQE30-BASB020表达构建物。为了在-80℃冻存,将菌株在含有同样浓度的LB肉汤中扩增,然后与含有30%(w/v)甘油的LB肉汤等体积混合。培养基
用于生产重组蛋白的发酵培养基由含有50μg/ml Kn和100μg/ml氨苄青霉素Ap的2×YT肉汤(Difco)组成。在发酵罐中加入0.25ml/L抗泡沫剂Antifoam(Antifoam 204,Sigma)。为了诱导BASB020重组蛋白的表达,在发酵罐中加入IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷)(终浓度1mM)。发酵
用0.3ml快速溶解的冷冻培养物,或者选择性平板上的几个菌落,接种含有50ml工作体积的500ml的种子锥形瓶,并在摇晃平台(Innova 2100,New Brunswick Scientific)上150rpm,376℃培养大约12小时。然后用此种子培养物接种工作体积为5L的,含有2×YT肉汤以及Kn和Ap抗生素发酵罐。该发酵罐( )在3761℃,空气喷射0.2-0.4VVM,Rushton叶轮250rpm的条件下工作。在扫频种子培养物中和发酵罐中都不控制pH值。在发酵过程中,发酵罐中的pH值在6.5到7.3之间。当培养物达到对数生长中期(~0.7 0.D.600单位)时往发酵罐中加入IPTG(1.0M储存液,用无菌水制备)。细胞诱导2-4小时然后用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速离心机(Sorvall Instruments)离心收集细胞。细胞沉淀储存于-20℃直至进一步处理。纯化化学试剂和材料
生物技术级或更高的咪唑、盐酸胍、Tris(羟甲基)和EDTA(乙二胺四乙酸),购自Ameresco Chemical,Solon,Ohio。TritonX-100(t-辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇)磷酸钠、单价碱和脲为试剂级或更高级,购自Sigma Chemical Company,St.Louis,Missori。冰醋酸和盐酸购自Mallincrodt Baker Inc.,Phillipsburg,NewJersey。甲醇购自Fisher Scientific,Fairlawn,New Jersey。PefablocSC(4-(2-氨基乙烷基)-苯磺酰氟),全蛋白酶抑制剂混合物药片和PMSF(苯甲磺酰氟)购自Roche Diagnostics Corporation,Indianapols,Indiana。Bestatin,Pepstatin A,和E-64蛋白酶抑制剂购自Calbiochem,LaJolla,Califonia。Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(1×PBS)购自Quality Biological,Inc.,Gaithersburg,Maryland。Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(10×PBS)购自BioWhittaker,Walkersville,Maryland。无BSA Penta-His Antibody,购自QiaGen,Valencia,California。过氧化物酶标记的AffiniPure羊抗鼠IgG购自Jackson Immuno Research,West Grove,Penn。AECsingle solution购自Zymed,South San Francisco,California。所有的其它化学试剂都是试剂级或更高级的。
Ni-NTA Superflow凝胶购自QiaGen,Inc.,Valencia,California。预灌注的Tris-甘氨酸4-20%和10-20%聚丙烯酰胺凝胶、所有的电泳缓冲液和溶液、SeeBlue染色分子量标准、MultiMarkMulti-Colored Standards和PVDF转移膜购自Novex,SanDiego,Clifornia。SDS-PAGE银染试剂盒购自Daiichi Pure ChemicalsCompany Limited,Tokoyo,Japan。考马斯亮蓝染色液购自BioRadLaboratories,Hercules,California。AcrodiscPF 0.2μm注射滤器购自Pall Gelman Sciences,Ann Arbor,Michigan。GD/X25mm抛弃型注射滤器购自Whatman Inc.Od New York,Carmal New York,BCA定蛋白试剂和Snake Skin透析管,3,500MWCO购自PierceChemaical Co..Rockford,Illinois。提取方法
细胞沉淀在室温融化30到60分钟。将5到6克的物质称到50ml抛弃型离心管中。加入5ml/克盐酸胍(GuHCl)缓冲液(6M盐酸胍,100mM磷酸钠,单价碱,10mM Tris和0.05%Triton X-100,pH8.0)。细胞沉淀用PRO300D proscientific匀浆器悬浮,3/4功率(3/4power)匀浆1分钟。然后将提取混合物置于室温温和地搅拌60-90分钟。60到90分钟后提取缓冲液在15,800×g离心15分钟(SorvallRC5C离心机,11,500rpm)。倒出上清(S1)以进-步纯化。保留沉淀进行分析。BASB020和镍NTA凝胶的结合
往S1中加入3到4毫升的Ni-NTA凝胶。在室温温和搅拌一小时。一小时后S1/Ni-NTA被装到XK16 Pharmacia层析柱中。然后用1MGu-HCl缓冲液(1M盐酸胍,100mM磷酸钠,单价碱,10mM Tris和0.05%Triton-X100,pH8.0)洗涤上述层析柱。然后用磷酸缓冲液洗涤(100mM磷酸钠,单价碱,10mM Tris和0.05%Triton-X100,pH6.3)。然后用250mM咪唑缓冲液(250mM咪唑、100mM磷酸钠,单价碱,10mM Tris和0.05%Triton-X100,pH5.9)从层析柱上洗脱蛋白。最终配方
最后将BASB020对0.1%Triton X100,1×PBS,pH7.4进行透析,透析中换3次缓冲液,以除去Gu-HCl和咪唑。纯化的蛋白进行特性研究并用于产生以下描述的抗体。生化特性研究SDS-PAGE和Western印迹分析
纯化的重组蛋白在4-20%聚丙烯酰胺凝胶上进行分辨并如先前所描述100V,1小时电转移到PVDF膜上(Thebaine et al.1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354)。然后PVDF膜用含有5%脱脂奶粉的25ml Dulbecco’s磷酸盐缓冲液预处理。所有随后的操作都用此预处理缓冲液进行。
PVDF膜和25ml稀释的预免疫血清或兔抗-His免疫血清室温温育1小时。然后用洗涤缓冲液(20mM Tris缓冲液,pH7.5,含有150mM氯化钠和0.05%吐温-20)洗涤PVDF膜两次。然后PVDF膜用25ml 1∶5000稀释的过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)抗体室温温育30分钟,然后PVDF膜用洗涤缓冲液洗涤4次,然后用Zymed(San Francisco)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和过氧化脲分别显色10分钟。
SDS-PAGE(图4)的结果表明32-35KDa的蛋白被纯化到大于90%的纯度,并且SDS-PAGE的Western印迹表明它和抗RGS(His)抗体能够反应(图5)。蛋白测序
用已经很好地确立的方法在Hewlett-Pakard model G1000A测序仪的模型1090LC Hewlett-Pakard model241测序仪的模型1100LC上进行纯化蛋白的氨基末端氨基酸测序以确认重组蛋白是正确的。实施例5:重组BASB020抗血清的生产
抗BASB020蛋白的多价抗血清是通过用纯化的重组BASB020蛋白免疫两只兔子得到的。每只动物总共肌肉注射三次(开始时用完全Ffeud佐剂,然后用不完全Freud佐剂),每次约20μgBASB020蛋白,时间间隔为约21天。在首次免疫之前(“预放血”)和第35和57天将动物放血。
抗BASB020蛋白的滴定用纯化的重组BASB020蛋白通过ELISA进行(0.5μg/孔)。滴定度定义为按照如下公式计算时得数等于或大于0.1时的最高稀释倍数:两个抗血清测试样品的平均OD-两个缓冲液测试样品的平均OD。3次免疫后的滴定度在3000和8000之间。
按照以上实施例4描述的Western印迹法鉴定该蛋白时上述抗血清被用作第一抗体。Western印迹表明在免疫的动物的血清中存在抗BASB020抗体。
实施例6.免疫学特性Western印迹分析
将几种粘膜炎莫拉氏菌菌株,包括ATCC49143和ATCC43617,以及临床上从不同的地区分离的菌株在巧克力琼脂平板上在35℃,5%CO2的条件下培养48小时。几个菌落被用于接种250ml烧瓶中的25mlMuller Hinton肉汤培养基。培养过夜并离心收集。在150μlPAGE上样缓冲液(360mM Tris缓冲液、pH8.8,含有4%SDS和20%甘油)中悬浮30μg细胞然后将悬浮液在100℃温育5分钟以便裂解细胞。裂解的细胞用4-20%聚丙烯酰胺凝胶分开并将分开的蛋白100V电转移1小时转移到PVDF膜上,如先前所描述(Thebaine et al.1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76:4350-4354)。然后PVDF膜用含有5%脱脂奶粉的25ml Dulbecco’s磷酸盐缓冲液预处理。所有随后的操作都用此预处理缓冲液进行。
PVDF膜和25ml稀释的预免疫血清或兔免疫血清室温温育1小时。然后用洗涤缓冲液(20mM Tris缓冲液,pH7.5,含有150mM氯化钠和0.05%吐温-20)洗涤PVDF膜两次。然后PVDF膜用25ml 1∶5000稀释的过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(Jackson ImmunoResearchLaboratories,West Grove,PA)抗体室温温育30分钟,然后PVDF膜用洗涤缓冲液洗涤4次,然后用Zymed(San Francisco)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和过氧化脲分别显色10分钟。
在所有的Moraxella菌株中都探测到了和上述抗血清反应的大约32-35KDa的蛋白(相应于BASB020预期的分子量)。实施例7.在逐渐康复的人类的血清中存在BASB020抗体
纯化的重组BASB020的Western印迹分析按照以上的实施例4和6所描述的进行,但是来自感染粘膜炎莫拉氏菌的儿童的人类血清被用作第一抗体。结果表明源自天然感染个体的抗血清和纯化的重组蛋白反应,如图6所示。实施例8.BASB020疫苗的效力:在小鼠中增强了肺部粘膜炎莫拉氏菌的清除。
在小鼠模型中测试了重组BASB020蛋白的保护能力。这种小鼠模型基于受免疫小鼠的常规鼻内对于妇女和或男子不育攻击(challenge)后对小鼠的粘膜炎莫拉氏菌肺部侵入分析的之上。用相应于10μg剂量的100μl疫苗皮下免疫6 BALB/c小鼠(雌性,6星期大)实验组,并在两星期后强化(boost)。强化后1个星期在麻醉的条件下(小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉剂麻醉,0.24mg甲苯噻嗪(Rompun)和0.8mg氯胺酮(Imalgene)/100μl)往小鼠的左鼻孔内灌输50μl细菌悬浮液(+/-CFU/50μl)进行攻击。攻击后4小时杀死小鼠并在无菌条件下取出肺部并单独匀浆。将20μl 5次顺序稀释的匀浆涂布于Mueller-Hinton琼脂平板上并计算菌落数,确定每个肺的平均CFU的Log10对数。计算每个肺的平均CFU的Log10对数的算术平均值和标准偏差。
假设变异(variance)(通过Brown and Forsythe’s test进行检验)和常态(normality)(用Shapiro-Wilk test检验)相等后用单向ANOVA对结果统计学分析。用Dunnet test、Tukey’sstudentised range test(HSD)和Student-Newman-Keuls test对各组之间的差异进行分析。在本实验中小鼠试验组用吸附到AlPO4(10μg BASB020吸附到100μg AlPO4)上的BASB020或吸附到AlPO4(5×108细胞吸附到100μg AlPO4上)上的粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617的杀死的全细胞(kwc)或无抗原的100μgAlPO4进行免疫。小鼠用106CFU的活粘膜炎莫拉氏菌菌株ATCC43617细菌攻击。
计算攻击4小时后每组的平均CFU/肺的Log10对数和标准偏差。攻击后4小时假免疫的小鼠有5.5(+/-0.023)log10 CFU/肺。
和对照组相比kwc制备物能诱导显著的肺部清除(1.74log的差异)。和对照组相比BASB020疫苗诱导出0.62log的肺部清除,和对照有显著的区别。
用纯化的重组BASB020蛋白和攻击前从用BASB020蛋白免疫的小鼠中收集的血清进行的Western印迹表明存在抗BASB020蛋白的抗体(图7)。实施例9:BASB020多肽、抗血清的生产和它们的活性
在实验室中通过众所周知的方法生产了序列为CNEEAWSQNRRAELSY(SEQ ID NO:13)和YTGVAPLVDNDETV(SEQ ID NO:14)的两个短氨基酸序列的特异性BASB020肽。这些多肽和KLH偶联并用于在12个星期大的无病源体新西兰雌性兔子中生产抗体。兔子接受4次注射,间隔大约3星期,每次注射在完全(第一次)或不完全(第二,三,四次)Freund’s佐剂中的200μg肽-KLH。动物在第一次免疫后以及第四次注射后一个月放血。
用自由多肽通过ELISA测量了抗多肽的中点滴定度。第四次免疫后一个月的抗多肽中点滴定度大于41000。按照实施例4和6中的描述准备了纯化重组BASB020的Western印迹,用抗多肽抗体作为第一抗体。结果见图8。保藏的材料
1997年6月21含有粘膜炎莫拉氏菌菌株的保藏物被保藏于美国典型培养物保藏中心(本文中“ATCC”),保藏号为43617。该保藏物被描述为Branhamela catarrhalis(Frosch and Kolle)并被冻干。从患慢性支气管炎的煤矿工的气管呼吸道得到的粘膜炎莫拉氏菌分离物构建了1.5-2.9kb插入序列的文库。该保藏物在Antimicrob.Agents Chemother.21:506-598(1982)中有所描述。
上述粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物在此称为“保藏的菌株”或“保藏菌株的DNA”。
该保藏菌株含有全长的BASB020基因。
由含有粘膜炎莫拉氏菌DNA插入序列的pQE30组成的pWC-Hly3载体的保藏物1999年2月12日被保藏于美国典型培养物保存中心(ATCC),保藏号为207106。
在保藏的菌株/克隆中含有的多核苷酸序列以及它们编码的任何氨基酸序列如果和此处所描述的序列有任何冲突的话都是受控制的。
保藏菌株的保藏是根据用于专利程序目的的微生物保藏的国际条约-布达佩斯条约进行的。在专利授权时保藏的菌株将不可取消地,并且不受限制地和无条件地向公众发放。储存的菌株仅仅是为了本领域中的技术熟练人员的方便而提供的,并不等于承认保藏物是实施(enablement)所必需的,如35 U.SC§112所要求的那样。
序列表
<110>SmithKline Seecham Biologicals S,A,
<120>新化合物
<130>BM45320
<160>14
<170>在Windows环境中的FastSEQ第三版
<210>1
<211>843
<212>DNA
<213>细菌
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<210> 2
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<212>蛋白质
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<212>蛋白质
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NO:3菌株Mcat2912的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多聚核苷酸序列ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAGACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTGCTTGATCTGCCAGCAACCCAAGTGCGTGAGATTATGACACCACGCCCCGAGGTGCATGCGATTGCCAGCGATGATGATTTATCTGATATTTTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCTCGCTATCCTGTTTTTGACAGTTTGGATGATGATGCTGTGGTTGGGATTTTGCTGATTAAGGACTTAATACCATACCTAAAAGCCAAAGCTGACGGTAAAGAGCAGCCGCTCAAATTGGCTGATATTGTACGAAAGCCGTTGTATATTAGCGAGACGGCACGCTCAGATACACTGCTACGCTCACTTCAAAAACCCCAAGTACATATGGCGATTGTTGTTGATGAATTTGGCTCGGTCTCTGGTGTGGCGACAATGGAGGATTTGCTTGAGGAGATTGTCGGTGATATTGTTGATGAACATGATGATATTGACGAGGACAGCGACATTAATAACATCATTCCACACCCTGATAAATCAGGCGTTTGGTTGGTGCAAGCTTCCACACTCATCAGTGATTGCAATGAGATTTTAGGCAGTCATTTTGATGATACAGATGTTGATACAATGGGCGGTTTGGTCATGCAAGCATTGGGCTTTGTTAGCCATCTTCAAGGTGCGGTTGTTCAAATCGATGAATGGCAAATTACCGTGGTTGATGTTGAGGCACGATTTATTCATCTGTTGGAGCTTGTGCTGATACCACAGCTTGAGAATGCTGAATAASEQ ID NO:4菌株Mcat 2912的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多肽序列MRGLRRWLSTAPETRDDLLKLVQDSRQFLEPDTVDMLECVLDLPATQVREIMTPRPQVHAIASDDDLSDILSVVLETEHSRYPVFDSLDDDAVVGILLIKDLIPYLKAKADGKEQPLKLADIVRKPLYISETARSDTLLRSLQKAQVHMAIVVDEPGSVSGVATMEDLLEEIVGDIVDEHDDIDEDSDINNIIPHPDKSGVWLVQASTLISDCNEILGSHFDDTDVDTMGGLVMQALGFVSHLQGAVVQIDEWQITVVDVEARFIHLLELVLIPQLENAESEQ ID NO:5菌株Mcat 2913的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多聚核苷酸序列ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAGACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTGCTTGATCTGCCAGCAACCCAAGTGCGTGAGATTATGACACCACGCCCACAGGTGCATGCGATTGCCAGCGATGATGATTTATCTGATATTTTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCTCGCTATCCTGTTTTTGACAGTTTGGATGATGATGCTGTGGTTGGGATTTTGCTGATTAAGGACTTAATACCATACCTAAAAGCCAAAGCTGACGGTAAAGAGCAGCCGCTCAAATTGGCTGATATTGTACGAAAGCCGTTGTATATTAGCGAGACGGCACGCTCAGATACACTGCTACGCTCACTTCAAAAAGCCCAAGTACATATGGCGATTGTTGTTGATGAATTTGGCTCGGTCTCTGGTGTGGCGACAATGGAGGATTTGCTTGAGGAGATTGTCGGCGATATTGTTGATGAACATGATGATATTGACGAGGACAGCGACATTAATAACATCATTCCACATCCTGATAAATCAGGCGTTTGGTTGGTGCAAGCTTCCACACTCATCAGTGATTGCAATGAGATTTTAGGCAGTCATTTTGATGATACAGATGTTGATACAATGGGCGGTTTGGTCATGCAAGCATTGGGCTTTGTTAGCCATCTTCAAGGTGCGGTTGTTCAAATCGATGAATGGCAAATTACCGTGGTTGATGTTGAGGCACGATTTATTCATCTGTTGGAGCTTGTGCTGATACCACAGCTTGAGAATGCTGAATAASEQ ID NO:6菌株Mcat 2913的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多肽序列MRGLRRWLSTAPETRDDLLKLVQDSRQFLEPDTVDMLEGVLDLPATQVREIMTPRPQVHAIASDDDLSDILSVVLETEHSRYPVFDSLDDDAVVGILLIKDLIPYLKAKADGKEQPLKLADIVRKPLYISETARSDTLLRSLQKAQVHMAIVVDEFGSVSGVATMEDLLEEIVGDIVDEHDDIDEDSDINNIIPHPDKSGVWLVQASTLISDCNEILGSHFDDTDVDTMGGLVMQALGFVSHLQAWQIDEWQITVVDVEARFIHLLELVLIPQLENAESEQ ID NO:7菌株Mcat 2969的粘膜炎莫拉氏菌BASB020多聚核苷酸序列ATGCGTGGTCTTAGGCGTTGGTTATCCACCGCACCTGAAACTCGAGATGATTTATTAAAGCTGGTTCAAGACTCTCGCCAGTTTTTAGAGCCTGATACGGTTGATATGCTTGAAGGGGTGCTTGATCTGCCAGCAACCCAAGTGCGTGAGATTATGACACCACGCCCACAGGTGCATGCGATTGCCAGCGATGATGATTTGTCTGATATTTTATCGGTGGTGCTTGAAACAGAGCATTCTCGCTATCCTGTTTTTGACAGTTTGGATGATGATGCTGTGGTTGGGATTTTGCTGATTAAGGACTTAATACCATACCTAAAAGCCAAAGCTGACGGTAAAGAGCAGCCGCTCAAATTGGCTGATATTGTACGAAAGCCGTTGTATATTAGCGAGACGGCACGCTCAGATACACTGCTACGCTCACTTCAAAAAGCCCAAGTGCATATGGCGATTGTTGTTGATGAATTTGGCTCGGTCTCTGGTGTGGTGACAATGGAGGATTTGCTTGAGGAGATTGTCGGCGATATTGTTGATGAACATGATGATATTGACGAGGACAGCGACATTAATAACATCATTCCACACCCTGATAAATCAGGCGTTTGGTTGGTGCAAGCTTCCACACTCATCAGTGATTGCAATGAGATTTTAGGCAGTCATTTTGATGATACAGATGTTGATACAATGGGCGGTTTGGTCATGCAAGCATTAGGCTTTGTTAGCCATCTTCAAGGTGCGGTTGTTCAAATCGATGAATGGCAAATTACCGTGGTTGATGTTGAGGCACGATTTATTCATCTGTTGGAGCTTGTGCTGATACCACAGCTTGAGAATGCTGAATAASEQ ID NO:8菌株Mcat 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Claims (24)
1.一种分离的多肽,该多肽含有的氨基酸序列和选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少有85%的同一性。
2.权利要求1中所要求的分离多肽,该多肽含有的氨基酸序列和选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少有95%的同一性。
3.权利要求1中所要求的分离多肽,含有选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的氨基酸序列。
4.SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的分离多肽。
5.权利要求1到4中任何一项中所要求的多肽的免疫原性片段,其中该免疫原性片段的免疫原活性基本上和SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8中的多肽相同。
6.一种分离的多核苷酸序列,该多核苷酸序列所编码的多肽和SEQ ID NO:2,4,6或8中的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:2,4,6或8的全长上至少有85%的同一性;或者与上述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
7.一种分离的多核苷酸序列,该多核苷酸序列在整个编码区和编码SEQ ID NO:2,4,6或8的多肽的核苷酸序列至少有85%的同一性,或者与上述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
8.一种分离的多核苷酸,该多核苷酸含有的核苷酸序列和SEQ IDNO:1,3,5或7中的核苷酸序列分别在SEQ ID NO:1,3,5或7的全长上至少有85%的同一性;或者与上述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
9.权利要求6到8中的任何一项所要求的分离的多核苷酸,它们和SEQ ID NO:1,3,5或7的同一性至少为95%。
10.一种分离的多核苷酸,该多核苷酸含有编码SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中的多肽的核苷酸序列。
11.一种分离的多核苷酸,该多核苷酸含有SEQ ID NO:1,SEQID NO:3,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7中的多核苷酸。
12.一种分离的多核苷酸,该多核苷酸含有编码SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8中的多肽的核苷酸序列,该多核苷酸可以通过在严紧的杂交条件下用标记探针筛选适当的文库得到,上述标记探针具有SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:7中的多核苷酸序列或它们的片段。
13.含有权利要求6-12中任何一项所要求的分离多核苷酸的表达载体或重组活微生物。
14.含有权利要求13的表达载体的宿主细胞或上述表达分离多肽的宿主细胞的膜,上述表达载体表达一种分离的多肽,上述分离的多肽含有的氨基酸序列和选自SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少有85%的同一性。
15.一种生产多肽的方法,上述多肽含有的氨基酸序列和选自SEQID NO:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8的氨基酸序列至少有85%的同一性,上述方法包括在足以生产上述多肽的条件下培养权利要求14中的宿主细胞并从培养基中回收该多肽。
16.表达权利要求6-12中任何一项所要求的多核苷酸的方法,该方法包括用表达载体转化宿主细胞,上述表达载体含有至少一种上述多核苷酸,并且在足以表达任何一种述核苷酸的条件下培养上述宿主细胞。
17.一种疫苗组合物,该组合物含有有效剂量的权利要求1到5中任何一项所要求的多肽以及药学上可接受的载体。
18.一种疫苗组合物,该组合物含有有效剂量的权利要求6到12中任何一项所要求的多核苷酸以及药学上可接受的载体。
19.根据权利要求17或18中的一项所要求的疫苗组合物,其中所述的疫苗组合物含有至少一种其它粘膜炎莫拉氏菌抗原。
20.对权利要求1到5中任何一项所要求的多肽或免疫原性片段具有免疫特异性的抗体。
21.诊断粘膜炎莫拉氏菌感染的方法,该方法包括鉴定权利要求1到5中任何一项所要求的多肽,或鉴定对上述多肽具有免疫特异性的抗体在生物样品中的存在,上述生物样品来自被怀疑具有这样的感染的动物。
22.包含免疫有效量的权利要求1-5任一项的多肽的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的应用。
23.包含免疫有效量的权利要求6-12任一项的多核苷酸的组合物在制备用于在动物中产生免疫应答的药物中的应用。
24.一种治疗用的组合物,该组合物可以用于治疗人类的粘膜炎莫拉氏菌疾病,该组合物含有至少一种针对权利要求1-5中任何一项所要求的多肽的抗体以及适当的药用载体。
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