CN1415013A - 源自脑膜炎奈瑟氏球菌的basb059多肽 - Google Patents

Abstract

本发明提供了BASB059多肽和编码BASB059多肽的多聚核苷酸以及通过重组技术产生这样的多肽的方法。本发明也提供了诊断，预防和治疗上的应用。

Description

源自脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB059多肽

发明领域

本发明涉及多聚核苷酸(这里指的是″BASB059多聚核苷酸″)，由该多聚核苷酸编码的多肽(这里指的是“BASB059”或“BASB059多肽”)，重组材料以及重组材料的生产方法。另一方面，本发明涉及上述多肽和多聚核苷酸的使用方法，包括防止细菌感染的疫苗。更进一步地，本发明涉及检测某些病原体感染的诊断方法。

发明背景

脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)(meningococcus，脑膜炎球菌)是一种经常分离自人上呼吸道的革兰氏阴性细菌。它有时引起入侵性细菌疾病如菌血症和脑膜炎。脑膜炎球菌疾病的发生率表现出地理性的、季节性的、和年度的差异(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.；临床微生物学综述(Clin.Microbiol.Rev.)2(增刊)，S18-S24，1989)。温带国家的多数疾病是由于血清组B菌株引起的，并且人口总数的发病率在1-10/100,000/年之间变化，有时达到更高的数值(Kaczmarski，E.B.(1997)，Commun.Dis.Rep.Rev.7：R55-9，1995；Scholten，R.J.P.M.，Bijlmer，H.A.，Poolman，J.T.等，临床感染疾病(Chin.Infect.Dis.)16：237-246，1993；Cruz，C.，Pavez，G.，Aguilar，E.，等，流行性感染(Epidemiol.Infect.)105：119-126，1990)。

由血清组A的脑膜炎球菌支配的流行病，大部分在中非，有时发病率高达1000/100,000/年(Schwartz，B.，Moore，P.S.，Broome，C.V.临床微生物学综述(Clin.Microbiol.Rev.)2(增刊)，S18-S24，1989)。几乎脑膜炎疾病的所有病例都是由血清组A，B，C，W-135和Y脑膜炎球菌引起的，并且已经有四价的A，C，W-135，Y多糖疫苗(Amand，J.，Arminjon，F.，Mayard，M.C.，Lafaix，C.，J.Biol.Stand.10：335-339，1982)。最近，通过和载体蛋白化学交联的方法，上述多糖疫苗得以改善(Lieberman，J.M.，Chiu，S.S.，Wong，V.K.，等JAMA 275：1499-1503，1996)。

没有血清组B疫苗，因为有人发现B荚膜多糖不具有免疫原性，很0可能是由于它和宿主的组分具有结构相似性(Wyle，F.A.，Artenstein，M.S.，Brandt，M.L.等传染病杂志(J.Infect.Dis.)126：514-522，1972；Finne，J.M.，Leinonen，M.，Makela，P.M.Lancet ii：355-357，1983)。

多年以前就开始并进行了发展基于脑膜炎球菌外膜的疫苗的努力(de Moraes，J.C.l，Perkins，B.，Camargo，M.C.等Lancet340：1074-1078，1992；Bjune，G.，Hoiby，E.A.Gronnesby，J.K.等338：1093-1096，1991)。它证明这样的疫苗在较大的儿童(＞4岁)和成人中表现出的效力为57％-85％。

在这些疫苗中存在许多细菌的外膜成份，如PorA，PorB，Rmp，Opc，Opa，FrpB，这些成份对于所观察到的保护效应的贡献还有待进一步阐明。通过使用动物的或人的抗体，其它细菌外膜成份，如TbpB和NspA，已经被认为可能与保护性免疫的诱导相关(Martin，D.，Cadieux，N.，Hamel，J.，Brodeux，B.R，实验药物杂志(J.Exp.Med.)185：1173-1183，1997；Lissolo，L.，Maitre-Wilmotte，C.，Dumas，p.等传染病免疫，(Inf.Immun.)63：884-890，1995)。保护性免疫的机制可能涉及抗体介导的杀菌活性和调理性噬菌活性(opsonophagocytosis)。

一种菌血症动物模型被用来结合所有的抗体介导的机制(Saukkonen，K.，Leinonen，M.，Abdillahi，H.Poolman，J.T.Vaccine 7：325-328，1989)。一般认为，后期补体成分介导的杀菌机制对于抗脑膜炎球菌疾病的免疫是至关重要的(Ross，S.C.，Rosenthal P.J.，Berberic，H.M.，Densen，P.传染病杂志(J.Infect.Dis.)155：1266-1275，1987)。

在过去的几十年中脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitiddis)感染的频率显著增加。这是由于出现了多抗生素抗性的菌株以及由于免疫系统减弱的人群的增加。分离出具有几种或所有常规抗生素抗性的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株不再是罕见的现象。这一现象产生了未满足的医疗需要，以及对新的抗微生物制剂、疫苗、药物筛选方法、以及对这种生物的诊断检测的需求。

发明概述

本发明涉及BASB059，特别是BASB059多肽和BASB059多聚核苷酸，重组材料和它们的生产方法。在另一方面，本发明涉及这样的多肽和多聚核苷酸在包括防止和治疗微生物疾病等方面的使用方法。更进一步地，本发明涉及检测与微生物感染相关的疾病和与这样的感染相关的病情的诊断分析，例如用于检测BASB059多聚核苷酸或多肽的表达或活性的分析方法。

通过阅读随后的说明书和通过阅读本公开内容的其它部分，对于本领域的技术熟练人员而言，在本公开的发明的精神和范围内的多种变化和修饰将是显而易见的。

本发明的描述

如下文所详细描述，本发明涉及BASB059多肽和多聚核苷酸。具体而言，本发明涉及脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB059多肽和多聚核苷酸，它和任何已知的蛋白没有明显的相似性。本发明尤其涉及核苷酸序列和氨基酸序列分别在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中列出的BASB059。应当理解，在以下的序列表中作为“DNA”列出序列代表了本发明的一个实施方案，因为普通技术人员将认识到这样的序列通常在多聚核苷酸，包括多聚核糖核苷酸，中非常有用。多肽

在本发明的一个方面中提供了此处称为″BASB059″和“BASB059多肽”的脑膜炎奈瑟氏球菌多肽，以及它们的可用于生物学的，诊断的，预防的，临床的或治疗用途的变体，以及含有上述多肽或其变体的组合物。

本发明进一步提供了

(a)一种分离的多肽，该多肽包括的氨基酸序列和SEQ IDNO：2的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或完全相同。

(b)由一种分离的多聚核苷酸编码的多肽，上述分离的多聚核苷酸包括的多聚核苷酸序列和SEQ ID NO：1在SEQ ID NO：1的全长上的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或完全相同。

(c)由一种分离的多聚核苷酸编码的多肽，上述分离的多聚核苷酸所编码的多肽和SEQ ID NO：2的氨基酸序列的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或完全相同。

在SEQ ID NO：2中提供的BASB059多肽是源自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的BASB059多肽。

本发明还提供了BASB059多肽的免疫原性片段，即，BASB059多肽的一个连续部分(contiguous portion)，该连续部分的免疫原性和含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽相同或基本上相同。这就是说，该片段(如果需要的话，与载体偶联时)能够引起识别BASB059多肽的免疫应答。这样的免疫原性片段包括，例如，缺少N-末端引导序列，和/或跨膜区域，和/或C-末端锚定区域的BASB059多肽。在一个优选的方面中，根据本发明的BASB059免疫原性片段含有基本上一个多肽的所有细胞外区域，上述多肽和SEQ ID NO：2在SEQ IDNO：2的全长上至少具有85％的同一性，更优选地至少90％的同一性，更优选地至少95％，最优选地至少97-99％的同一性。

一个片段是一种多肽，该多肽的氨基酸序列与本发明的任何多肽的任何氨基酸序列的一部分，但不是全部，完全相同。对于BASB059多肽而言，片段可以是“独立存在的(free-standing)”，或者是被包含在较大的多肽中，在较大的多肽中它们形成一个部分或区域，最优选地是在一个单一的较大多肽中作为单一的连续区域。

优选的片段包括，例如，具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其变体的一部分的、截短的多肽，例如包括氨基和/或羧基端氨基酸序列的一系列连续残基。在宿主细胞中产生的，或由宿主细胞产生的降解形式的多肽也是优选的。进一步优选的是具有结构或功能特征的片段，如含有α-螺旋和α-螺旋形成区域，β-平面和β-平面形成区域，转角和转角形成区域，卷曲或卷曲形成区域，亲水性区域，疏水性区域，α两亲性区域，β两亲性区域，柔性区域，表面形成区域，底物结合区域和高抗原性指数区域的片段。

进一步优选的片段包括一种分离的多肽，该多肽含有的氨基酸序列至少有15，20，30，40，50或100个源自SEQ ID NO：2氨基酸序列的连续氨基酸残基，或者一种分离的多肽，该多肽含有的氨基酸序列上至少有15，20，30，40，50或100个的从SEQ ID NO：2氨基酸序列上截短或缺失连续氨基酸残基。

通过肽段合成，本发明的多肽片段可以被用于生产相应的全长多肽；因此，这些片段可以被用作生产本发明的全长多肽的中间产物。

特别优选的是一些变体，在这些变体中几个5-10，1-5，1-3，1-2或1个氨基酸以任何组合形式被替换，缺失或添加。

本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白的形式，或较大蛋白如前体蛋白或融合蛋白的一部分。包含一个附加的氨基酸序列经常是有利的，上述序列含有分泌或引导序列，前序列，辅助纯化的序列例如多个组氨酸残基，或一个附加的用于增加重组生产中的稳定性的序列。此外，还考虑到添加外源多肽或脂类末端或多聚核苷酸序列以增加最终分子的免疫原性潜力。

在一方面，本发明一般涉及经基因工程改造的可溶融合蛋白，上述可溶融合蛋白含有本发明的多肽或其片段，以及免疫球蛋白的各种亚类(IgG，IgM，IgA，IgE)的重链或轻链的恒定区域的各个部分。优选的免疫球蛋白是人IgG，尤其是IgG1，的重链的恒定区，融合在铰链区进行。在一个特定的实施方案中，通过引入能被血凝因子Xa切割的切割序列，可以简单地将Fc部分除去。

此外，本发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白的方法，以及它们在药物筛选，诊断和治疗上的应用。本发明的一个更进一步的方面还涉及编码这样的融合蛋白的多聚核苷酸。融合蛋白技术的例子可以在国际专利申请号WO94/29458和WO94/22914中找到。

蛋白可以进行化学交联，或作为重组融合蛋白表达；重组融合蛋白使得其在表达系统中的生产水平比非-融合蛋白提高了。融合配偶体(fusion partner)可以帮助提供T辅助表位(免疫球蛋白融合配偶体)，优选地为被人类识别的T辅助表位；或帮助蛋白的表达(表达增强子)，使融合蛋白的表达产量比天然重组蛋白更高。优选的融合配偶体将既是免疫球蛋白融合配偶体也是表达增强配偶体。

融合配偶体包括源自Haemophilus influenzae(流感嗜血杆菌)的蛋白D和源自流感病毒的非-结构蛋白，NS1(血凝素)。另一种融合配偶体是被称为LytA的蛋白。优选的是使用该分子的C末端部分。LytA源自Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌)，它合成一种N-乙酰基-L-丙氨酸-酰胺酶，酰胺酶LytA，(由lytA基因编码{Gene，43(1986)265-272页})一种特异性降解肽聚糖主链上某些化学键的自溶素。LytA蛋白的C-末端区域负责对胆碱或一些胆碱类似物例如DEAE的亲和性。这个特性已被利用于发展大肠杆菌C-LytA表达质粒，该质粒可用来表达融合蛋白。在蛋白质的氨基末端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化已有描述{生物技术(Biotechnology)：(1992)795-798页}。可以使用在LytA分子的C末端从残基178开始的重复部分，例如残基188-305。

本发明也包括上述多肽的变体，即与参照多肽相比进行了氨基酸保守替代的多肽，在这样的多肽中一个残基被另一具有相似特征的残基所替代。通常这样的替代是在Ala，Val，Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；碱性残基Lys和Arg之间；或芳香族残基Phe和Tyr之间进行。

本发明的多肽可以用任何适当的方法制备。这样的多肽包括分离的天然存在的多肽，重组产生的多肽，合成产生的多肽，或通过这些方法的组合产生的多肽。制备这样的多肽的方法在本领域中已经众所周知。

本发明的多肽源自脑膜炎奈瑟氏球菌是最优选的，但是，它也可以优选地从相同分类学种属的其它生物得到。本发明的多肽也可能从，例如，从相同分类学科或目的生物得到。多聚核苷酸

本发明的一个目的是提供编码BASB059多肽的多聚核苷酸，尤其是编码本文指定的BASB059多肽的多聚核苷酸。在本发明的一个特定的优选实施方案中，多聚核苷酸包含一个编码BASB059多肽的区域，该区域含有在SEQ ID NO：1中列出的序列，该序列包括一个全长基因，或一个全长基因变体。

在SEQ ID NO：1中提供的BASB059多聚核苷酸是源自脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的BASB059多聚核苷酸。

作为本发明的进一步的方面，提供了编码和/或表达BASB059多肽和多聚核苷酸，尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌BASB059多肽和多聚核苷酸，的分离的核酸分子，包括，例如，为未加工的RNA，核酶RNA，mRNA，cDNA，基因组DNA，B-和Z-DNA。本发明的进一步的实施方案包括生物学上，诊断上，预防上，临床上或治疗上有用的多聚核苷酸和多肽，和它们的变体，以及包含上述多聚核苷酸，多肽或变体的组合物。

本发明的另一个方面涉及分离的多聚核苷酸，该多聚核苷酸包括至少一个全长基因，它编码推导的具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的BASB059多肽，它还编码与此紧密相关的多聚核苷酸及其变体。

在本发明的另一个特定的优选实施方案中，有源自脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB059多肽，它包含或由SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其变体组成。

利用本文提供的信息，例如在SEQ ID NO：1中列出的多聚核苷酸序列，可以通过常规的克隆和筛选方法得到本发明的编码BASB059多肽的多聚核苷酸，例如那些用脑膜炎奈瑟氏球菌细胞作为起始材料从细菌中克隆和测序染色体DNA片段，然后获得全长的克隆的方法。例如，为了获得本发明的多聚核苷酸序列，如在SEQ ID NO：1中给出的多聚核苷酸序列，通常用源自部分序列的，放射性标记的寡核苷酸，优选为17聚体或更长，探测在大肠杆菌(E.coli)或其它一些合适的宿主中的脑膜炎奈瑟氏球菌染色体DNA克隆文库。然后利用严紧的杂交条件可以区别出含有与探针DNA相同的DNA的克隆。根据原始的多肽或多聚核苷酸设计测序引物，用测序引物通过杂交鉴定出单独的克隆，然后就可能在两个方向上延伸多聚核苷酸序列以确定全长基因序列。这样的测序可以方便地进行，例如，使用从质粒克隆制备得到的变性双链DNA。适当的技术在Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，(MLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL)，2ndEd.(分子克隆实验手册，第二版)；冷泉港实验出版社(Cold SpringHarbor Laobratory Press)，冷泉港(Cold Spring Harbor)，纽约(1989)中有所描述(特别参见1.90的Screening By Hybridization(杂交筛选)和13.70的Sequencing Denatured Doubled-StrandedDNA Template(变性双链DNA模板的测序))。也可以进行直接的基因组DNA测序以得到全长的基因序列。本发明的示例，SEQ ID NO：1中列出的各个多聚核苷酸，是在源自脑膜炎奈瑟氏球菌的DNA文库中发现的。

并且，SEQ ID NO：1中列出的各个DMA序列含有一个编码蛋白的开放阅读框，上述蛋白大致具有SEQ ID NO：2中列出的氨基酸残基数，可以通过本领域中的技术熟练人员众所周知的氨基酸残基分子量计算得到其推算出的分子量。

SEQ ID NO：1中的多聚核苷酸在SEQ ID NO：1的核苷酸数1的起始密码子和在核苷酸数337开始的终止密码子之间编码了SEQ IDNO：2的多肽。

在一个进一步的方面中，本发明提供了一种分离的多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有以下部分或由以下部分组成：

(a)一种多聚核苷酸序列，上述多聚核苷酸序列和SEQ IDNO：1在SEQ ID NO：1的全长上的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或完全相同。

(b)一种多聚核苷酸序列，上述多聚核苷酸序列编码的多肽和SEQ ID NO：2中的氨基酸序列在SEQ ID NO：2的全长上的同一性至少为85％，更优选地至少为90％，更优选地至少为95％，最优选地至少为97-99％或100％完全相同。

可以通过一种方法得到编码本发明的多肽的多聚核苷酸，包括来自脑膜炎奈瑟氏球菌以外的种属的同源物或直向同源基因，该方法包括以下步骤：用含有SEQ ID NO：1的序列或其片段的，或由它们组成的标记的或可检测的探针，在严紧杂交条件下(例如，温度在45-65℃之间，SDS浓度在0.1％-1％之间)筛选适当的文库；并且分离出含有上述多聚核苷酸序列的全长的基因和/或基因组克隆。

本发明提供了一种多聚核苷酸序列，该序列在其全长上与SEQ IDNO：1的编码序列(开放阅读框)完全相同。本发明还提供了一种成熟多肽或其片段的编码序列自身，或者在阅读框中与另一编码序列，如编码引导或分泌序列，前蛋白序列，或前体蛋白序列，或前前体蛋白序列的序列，在一起的一种成熟多肽或其片段的编码序列。本发明的多聚核苷酸还可能含有至少一个非编码序列，包括，例如但不限于，至少一个非编码的5’和3’序列，如转录但不翻译的序列，终止信号(如rho依赖性和非rho依赖性的终止信号)，核糖体结合位点，Kozak序列，稳定mRNA的序列，内含子和多聚腺苷酸化信号。多聚核苷酸序列还可以含有编码附加的氨基酸的附加编码序列。例如，可以编码便于融合多肽的纯化的标记序列。在本发明的某些实施方案中上述标记序列是6组氨酸肽，上述6组氨酸肽由pQE(PQE)载体提供，并且在Gentz等美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)86：821-824(1989)中有所描述，或者是HA肽标记(Wilson等，Cell 37：767(1984))，两种序列都可以用来纯化与其融合的多肽序列。本发明的多聚核苷酸还包括，但不限于，含有结构基因的多聚核苷酸，以及调控基因表达的与基因天然相联系的序列。

编码SEQ ID NO：2的BASB059多肽的核苷酸序列可以与SEQ IDNO：1的核苷酸1到336包含的多肽编码序列相同。替代地，它也可以是一段由于遗传密码的冗余性(简并性)而同样编码SEQ ID NO：2的多肽的序列。

此处所用的术语“编码多肽的多聚核苷酸”包括一些多聚核苷酸，上述多聚核苷酸包括编码本发明的多肽的序列，上述多肽特别指细菌多肽，更特别地指具有SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列的脑膜炎奈瑟氏球菌BASB059多肽。该术语还包括含有编码上述多肽的单一连续区域或不连续区域(例如，多聚核苷酸被整合噬菌体，整合插入序列，整合载体序列，整合转位子序列所中断，或者由于RNA编辑或基因组DNA重排所中断)以及附加区域的多聚核苷酸，上述附加区域也可能含有编码和/或非编码序列。

本发明进而涉及此处描述的多聚核苷酸的变体，它编码具有SEQID NO：2的推导的氨基酸序列的多肽的变体。本发明的多聚核苷酸的片段可以被用来，例如，合成本发明的全长多聚核苷酸。

进一步特别优选的实施方案是编码BASB059变体的多聚核苷酸，上述变体具有SEQ ID NO：2的BASB059多肽的氨基酸序列，并且其中几个，一些，5到10个，1到5个，1到3个，2个，1个或无氨基酸残基以任何组合形式被替换、修饰、缺失、和/或添加。其中特别优选的是不改变BASB059多肽的特性和活性的沉默替换、添加和缺失。

本发明进一步优选的实施方案是在其全长上和编码BASB059多肽的多聚核苷酸具有至少85％的同一性的多聚核苷酸，以及与这样的多聚核苷酸互补的多聚核苷酸，上述BASB059多肽具有SEQ ID NO：2中列出的氨基酸序列。在这一点上，与同一多聚核苷酸在全长上具有至少90％同一性的多聚核苷酸是特别优选的，在这些特别优选的多聚核苷酸中，那些具有至少95％同一性的是尤其优选的。进而，在那些具有95％同一性的多聚核苷酸中，具有至少97％同一性的那些是高度优选的，其中那些至少98％和至少99％的是特别高度优选的，而具有至少99％的是更为优选的。

所编码的多肽基本上保留了与SEQ ID NO：1的DNA所编码的成熟多肽一样的生物学功能或活性的多聚核苷酸为优选的实施方案。

根据本发明的某些优选的实施方案，提供的多聚核苷酸和BASB059多聚核苷酸序列，如SEQ ID NO：1中的那些多聚核苷酸序列，杂交，尤其是在严紧的条件下杂交。

本发明进一步涉及与本文提供的多聚核苷酸序列杂交的多聚核苷酸。在这一点上，本发明尤其涉及在严紧条件下与本文描述的多聚核苷酸杂交的多聚核苷酸。本文使用的术语“严紧条件”和“严紧杂交条件”的意思为只有在序列间的同一性至少为95％，优选地至少为97％时才会发生的杂交。严紧杂交条件的特定例子为在含有50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt’s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml变性的，剪切的鲑精DNA的溶液中42℃温育过夜，然后在大约65℃在0.1×SSC中洗涤杂交支持物。杂交和洗涤的条件是众所周知的，并且在Sambrook，等，分子克隆：实验手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第二版，冷泉港，N.Y.，(1989)中有示例，尤其是其第11章。也可以用本发明提供的多聚核苷酸序列进行溶液杂交。

本发明还提供了一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有，或由一段多聚核苷酸序列组成，上述多聚核苷酸序列是通过筛选含有SEQ IDNO：1中列出的多聚核苷酸序列的完整基因的适当文库，并且分离上述多聚核苷酸序列而得到的，上述筛选是通过使用具有上述在SEQ IDNO：1中列出的多聚核苷酸序列或其片段的序列的探针，在严紧的杂交条件下进行的。可用于获得这样的多聚核苷酸的片段包括，例如，在本文其它处充分描述的探针和引物。

作为本文别处所讨论的关于本发明的多聚核苷酸的分析，例如，本发明的多聚核苷酸，可以被用作RNA，cDNA和基因组DNA的杂交探针以分离编码BASB059的全长cDNAs和基因组克隆，以及分离和BASB059基因有高同一性，特别是高序列同一性，的其它基因的cDNA和基因组克隆。这样的探针通常将含有至少15个核苷酸残基或碱基对。优选地，这样的探针将含有至少30个核苷酸残基或碱基对并且可以有至少50个核苷酸残基或碱基对。特别优选的探针将含有至少20并且少于30个核苷酸残基或碱基对。

通过用SEQ ID NO：1提供的DNA序列合成寡核苷酸探针进行筛选，可以分离BASB059基因的编码区域。然后用标记的具有与本发明的基因序列互补的序列的寡核苷酸筛选cDNA，基因组DNA或mRNA文库，从而确定探针与文库的哪些成员杂交。

有几种获得全长DNA，或延伸短DNA的，并且为本领域的技术熟练人员所共知的方法，例如那些基于快速扩增cDNA末端(RapidAmplicaition of cDNA ends，RACE)的方法(参见，例如，Rrohman，等，PNAS USA 85：8998-9002，1998)。最近的该技术的改造，例如，以Marathon^TM技术(Clontech Loboratories Inc.)作为例子，已经显著简化了较长的cDNA的搜索。在Marathon^TM技术中，从选定的组织中提取得到的mRNA被制备成cDNA，并且在两端被链接上’匹配’序列。然后用基因特异的和匹配特异的寡核苷酸引物共同进行核酸扩增(PCR)以扩增DNA“缺失”的5’末端。利用″嵌套″引物反复进行PCR反应，上述″嵌套″引物即被设计用来在扩增产物中退火的引物(通常匹配特异的引物进一步将匹配序列的3’端退火，基因特异的引物将所选定的基因序列的5’端退火)。然后可以通过DNA测序分析上述反应的产物，全长DNA的构建可以通过直接把产物与已存在的DNA连接以产生全长序列，或者利用新的序列信息设计5’引物单独进行全长的PCR。

如本文在涉及多聚核苷酸的分析中所进一步讨论的，本发明的多聚核苷酸和多肽可以被用作，例如，发现疾病，尤其是人类疾病，的治疗和诊断方法的研究试剂和材料。

作为源自序列SEQ ID NO：1-2的寡聚核苷酸的本发明的多聚核苷酸可以用于本文所描述的方法中，但优选地用于PCR，以确定本文所鉴定的多聚核苷酸是否在被感染组织的细菌中被部分或全部转录。已经认识到这样的序列也可用于诊断该病原体所达到的感染阶段和感染类型。

本发明也提供编码多肽的多聚核苷酸，该多肽是成熟蛋白加上附加的氨基或羧基-末端氨基酸，或成熟多肽内部的氨基酸(例如，当成熟形式具有一条以上的肽链时)。这样的序列可以在蛋白从前体到成熟形式的过程中起作用，可以允许蛋白运输，可以延长或缩短蛋白的半衰期，或可以便于蛋白在分析或生产中的操作，等等。通常在体内，附加的氨基酸可以被细胞的酶加工而离开成熟蛋白。

对于本发明的每个多聚核苷酸，本发明提供了与之互补的多聚核苷酸。优选地，这些互补的多聚核苷酸是完全与每个和它们互补的多聚核苷酸完全互补的。

由上述多肽的成熟形式与一个或多个前序列融合而成的前体蛋白可以是该多肽的无活性形式。当前序列被除去时，这种无活性的前体通常被激活。一些或全部的前序列可以在激活之前被除去。通常，这样的前体被称为前体蛋白。

在描述本发明的某些多聚核苷酸时除了常规的A，G，C，T/U核苷表示法外，也可以用术语“N”。“N”表示在DNA或RNA序列的该指定位置可以为四个DNA或RNA核苷中的任何一个，但是当以下情况是优选时除外：当某个核苷酸与相邻位置的核苷酸一起，在正确的阅读框中将导致在这样的阅读框中产生提前终止密码子效应时，N不是那个核苷酸。

总而言之，本发明的多聚核苷酸可以编码成熟蛋白，成熟蛋白加上引导序列(将被称为前蛋白)，成熟蛋白的前体，上述前体具有一个或多个并非前蛋白或前前体蛋白的引导序列的前体序列，前前体蛋白是前体蛋白的前体，它具有引导序列和一个或多个前体序列，上述前体序列和引导序列通常在加工步骤中被除去，产生上述多肽的活性成熟形式。

根据本发明的一个方面，提供了本发明的多聚核苷酸在治疗或预防上的应用，特别是在基因免疫上的应用。

本发明的多聚核苷酸在基因免疫上的应用将优选地使用适当的输送方法，例如直接将质粒DNA注射入肌肉(Wolff等，人类分子遗传学(Hum Mol Genet)(1992)1：363，Manthorpe等，人类基因治疗(Hum.Gene Ther)(1983)4：419)，输送DNA和特定蛋白载体的复合物(Wu等，生物化学杂志(J Biol Chem.)(1989)264：16985)，将DNA与磷酸钙共沉淀(Benvenisty & Reshef，PNAS USA，(1986)83：9551)，将DNA包入各种形式的脂质体中(Kaneda等，Science(1989)243：375)，颗粒轰击(Tang等，Nature(1992)356：152，Eisenbrau等，DNA细胞生物学(DNA Cell Biol)(1993)12：791)和用克隆的反转录病毒载体进行体内感染(Seeger等，PNAS USA(1984)81：5849)。载体，宿主细胞，表达系统

本发明还涉及含有本发明的一种或几种多聚核苷酸的载体，用本发明的载体经遗传工程得到的宿主细胞以及通过重组技术生产本发明的多肽。利用源自本发明的DNA构建体的RNA也可以通过无细胞翻译系统生产这样的蛋白质。

通过本领域中的技术熟练人员众所周知的方法可以从基因工程改造的含有表达系统的宿主细胞制备本发明的重组多肽。因此，在更进一步的一个方面中，本发明涉及含有本发明的一种或几种多聚核苷酸的表达系统，涉及用这样的表达系统进行基因工程改造的宿主细胞，并涉及通过重组技术生产本发明的多肽。

为了本发明的多肽的重组生产，可以对宿主细胞进行基因工程改造以使其整合表达系统或表达系统的组成部分，或本发明的多聚核苷酸。可以通过许多常规的实验室手册中描述的方法将多聚核苷酸导入到宿主细胞中，例如Davis等，分子生物学基本方法(BASIC METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY)，(1986)和Sambrook，等，分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLOINING：A LABORATORY MANUAL)，第二版，冷泉港实验出版社，冷泉港，N.Y.(1989)，例如磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，转位，显微注射，阳离子脂类介导的转染，电穿孔，转导，刮棒负载(scrape loading)，弹道法导入(ballisticIntroduction)和感染。

适当宿主的代表例子包括细菌细胞，如链球菌，葡萄球菌，肠球菌，大肠杆菌，链霉菌，蓝细菌，Bacillus subtiLIs(枯草杆菌)，Moraxella catarrhalis(狭鼻摩拉克氏菌)，Haemophilusinfluenzae(嗜血流感杆菌)和Neisseria meningitidis(脑膜炎奈瑟氏球菌)的细胞，真菌细胞如酵母，Kluveromyces(克鲁维酵母)，Saccharomyces(啤酒酵母)，basidiomycete(担子菌类)，Candidaalbicans(白色丝酵母)和Aspergillus(曲菌属)的细胞；昆虫细胞如果蝇S2和草地夜蛾Sf9细胞；动物细胞如CHO，COS，Hela，C127，3T3，BHK，293，CV-1和Bowes黑色素瘤细胞；植物细胞如裸子植物和被子植物的细胞。

许多种表达系统可以用于生产本发明的多肽。这样的载体其中包括源自染色体的，附加体的和病毒的载体，等等，例如，源自细菌质粒，噬菌体，转位子，酵母附加体，插入元件，酵母染色体元件的载体和源自病毒，如杆状病毒，乳多空病毒如SV40，牛痘病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病病毒，细小核糖核酸病毒，反转录病毒和α-病毒的载体以及来自它们的组合的载体，如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，如粘粒载体和噬菌体粒载体。表达系统构建体可以含有调节并导致表达的调控区域。通常，任何适于在宿主细胞中维持，扩增或表达多聚核苷酸和/或表达多肽的系统或载体都可以在这点上用于表达。可以通过多种众所周知的常规方法中的任何一种将适当的DNA序列插入到表达系统中，上述方法的例子如，例如，Sambrook等，分子克隆，实验手册(MOLECULAR CLONNING.A LABORATORY MANUAL)(上文)中所列出的方法。

为了将翻译的蛋白分泌到内质网腔，到周质间隙或到细胞外环境，在真核生物重组表达系统中可以将适当的分泌信号整合到表达的多肽中。这些信号可以是上述多肽的内源信号或外源信号。

可以用众所周知的方法从重组细胞培养物回收和纯化本发明的多肽，上述方法包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析，羟磷灰石层析和植物凝集素层析。最优选地，用金属离子亲和层析(Ion metalaffinity chromatograhpy，IMAC)进行纯化。当多肽在细胞内合成，分离和/或纯化过程中变性时，可以利用众所周知的蛋白质重折叠技术重新生成活性构象。

表达系统也可以是重组的活微生物，例如病毒或细菌。感兴趣的基因可以被插入到活的重组病毒或细菌的基因组中。上述活载体的接种和体内感染将导致抗原在体内的表达并诱导免疫应答。用于上述目的的病毒和细菌如：痘病毒，(例如牛痘病毒，禽痘病毒，金丝雀痘病毒)α-病毒(新培斯病毒，Semliki森林病毒，委内瑞拉马脑炎病毒)，腺病毒，腺相关病毒，小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒，鼻病毒)，疤疹病毒(带状水痘病毒，等等)，利斯特菌，沙门氏菌，志贺氏菌，奈瑟氏菌，卡介苗。这些病毒和细菌可以是毒性的，或者是经过多种方法弱化以得到活疫苗。这样的活疫苗也构成了本发明的一部分。诊断，预测，血清型和突变分析

本发明还涉及将本发明和BASB059的多肽多聚核苷酸用作诊断试剂的用途。对真核生物，特别是哺乳动物，尤其是人类，体内的BASB059多聚核苷酸和/或多肽的检测将提供诊断疾病，确定疾病的阶段或确定感染生物体对药物的反应的方法。可以通过多种众所周知的技术和本文提供的方法在核酸或氨基酸水平上检测真核生物，特别是对哺乳动物，尤其是人类，特别是那些感染了或易于被含有BASB059基因或蛋白的生物感染的人。

可以从被怀疑感染了和/或被感染的个体的身体物质获得用于预测，诊断或其它分析的多肽或多聚核苷酸。源自任何这些来源的多聚核苷酸，特别是DNA或RNA，可以被直接用来检测，或可以在分析之前通过PCR或任何其它扩增技术用酶进行扩增。RNA，特别是mRNA，cDNA和基因组DNA也可以以相同的方式被应用。利用扩增，可以通过分析个体体内存在的感染或驻留生物体的选定多聚核苷酸的基因型，对上述生物体的物种和菌株的特征进行鉴定。通过将扩增产物和选自相关生物体的参照序列的基因型进行比较而改变折增产物的大小，可以检测缺失和插入，上述相关生物体优选地为同一属的不同种或同一种的不同菌株。通过扩增DNA与标记的BASB059多聚核苷酸序列的杂交可以鉴定定点突变。可以通过DNA酶或RNA酶分别对DNA或RNA的水解，或通过检测融解温度或复性动力学的差异可以将完好匹配或明显匹配的序列和不完好匹配或更明显不匹配的双链体分开。也可以通过比较多聚核苷酸片段与参照序列在凝胶上的电泳迁移性质的改变而检测多聚核苷酸序列的差异。这可以在存在或不存在变性剂的条件下进行。也可以通过直接的DNA或RNA测序检测多聚核苷酸的差异。参见，例如，Myers等，Science，230：1242(1985)。也可以通过核酸酶保护分析，如RNase，V1和S1保护分析，或通过化学裂解的方法揭示特定部位的序列变化。参见，例如，Cotton等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)，85：4397-4401(1985)。

在另一个实施方案中，可以构建含有BASB059核苷酸序列或者其片段的寡聚核苷酸探针阵列，以便有效地筛选，例如，基因突变，血清型，分类学的分类或鉴定。阵列技术方法是众所周知的并且具有广泛的可应用性，并可以被用于解决分子遗传学中的许多问题，包括基因表达，遗传连锁和遗传变异性(参见，例如，Chee等，Science，274：610(1996))。

因此，在另一方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，该诊断试剂盒含有：

(a)本发明的多聚核苷酸，优选地为SEQ ID NO：1中的核苷酸序列，或其片段；

(b)与(a)中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；

(c)本发明的多肽，优选地为SEQ ID NO：2中的多肽或其片段；或

(d)针对本发明的多肽的抗体，优选地为针对SEQ ID NO：2中的多肽的抗体。

要明白在所有的这样的试剂盒中，(a)、(b)、(c)或(d)可以包括重要的成分。这样一种试剂盒在其中诊断一种疾病或情疑一种疾病中是有用途的。

本发明还涉及本发明的多聚核苷酸作为诊断试剂的应用。对与疾病或病原性相关的本发明的多聚核苷酸，优选地为SEQ ID NO：1，的突变形式的检测将提供一种诊断工具，这种诊断工具将增加，或定义，一种疾病的诊断，疾病进程的预测，疾病阶段的确定，或对一种疾病的易感性，上述疾病是由于该多聚核苷酸的表达不足，表达过量或表达改变造成的。可以通过各种技术，例如本文其它处所描述的技术，在多聚核苷酸水平上对在这样的多聚核苷酸上带有突变的生物，尤其是传染性的生物进行检测。

也可以用各种技术，例如，通过血清型分型，在多聚核苷酸或多肽水平上对源自一种生物体的细胞进行检测，上述生物体在本发明的多聚核苷酸和/或多肽上含有突变或多态性(等位基因变种)。例如，可以用RT-PCR检测RNA中的突变。尤其优选的是联合使用RT-PCR和自动化的检测系统，如，例如，GeneScan。RNA，cDNA或基因组DNA也可以被用于相同的目的，PCR。作为例子，与编码BASB059多肽的多聚核苷酸互补的PCR引物可以被用于鉴定和分析突变。

本发明进而提供了在5’和/或3’端除去1，2，3或4个核苷酸的引物。这些可以被用于扩增从源自个体的样品，如身体物质，分离得到的BASB059DNA和/或RNA。上述引物可以被用于扩增从被感染的个体分离得到的多聚核苷酸，以便该多聚核苷酸可以进行多种技术的分析以便阐明该多聚核苷酸的序列。通过这种方法可以检测多聚核苷酸上的突变并用于诊断和/或预测感染，或感染的阶段或进程，或对感染物质进行血清学分型和/或分类。

本发明进而提供了诊断疾病的方法，上述疾病优选地为细菌感染，更优选地为由脑膜炎奈瑟氏球菌导致的感染，上述方法包括确定源自个体的样品，如身体物质，中具有SEQ ID NO：1序列的多聚核苷酸的表达水平升高了。可以利用本领域中众所周知的多聚核苷酸定量方法的任何一种测量BASB059多聚核苷酸表达的升高或降低，上述多聚核苷酸定量方法如，例如，扩增，PCR，RT-PCR，RNase保护，Northern印迹法，分光光度法和其它杂交方法。

此外，通过检测BASB059多肽相对于正常对照组织样品过量的表达，根据本发明的诊断分析可以被用于，例如，检测感染的存在。可以用来确定源自宿主的样品，如身体物质，中BASB059多肽的水平的分析技术对于本领域中具有一定技术的人员是众所周知的。这样的分析方法包括放射性免疫分析，竞争结合分析，Western印迹分析，抗体夹心法分析，抗体检测和ELISA分析。

本发明的多聚核苷酸可以被用作多聚核苷酸阵列的组成成分，上述阵列优选地为高密度的阵列或网格。这样的高密度阵列对于诊断和预测目的而言是特别有用的。例如，一组点，每个含有不同的基因，并进而含有本发明的一种或几种多聚核苷酸；利用源自或从身体样品得到的探针，这样的一组点可以被用来探测个体中特定多聚核苷酸序列或相关序列的存在例如利用杂交或核酸扩增。这样的存在可能意味着存在病原体，特别是脑膜炎奈瑟氏球菌，并且可以用于诊断和/或预测疾病或疾病的进程。含有SEQ ID NO：1中的多聚核苷酸序列的许多变体的网格是优选的。含有编码SEQ ID NO：2中的多肽序列的多聚核苷酸序列的变体的网格也是优选的。抗体

本发明的多肽和多聚核苷酸或它们的变体，或表达它们的细胞，可以被用作免疫原以生产分别对这样的多肽或多聚核苷酸具有免疫特异性的抗体。

在本发明的某些优选的实施方案中，还提供了针对BASB059多肽或多聚核苷酸的抗体。

可以利用常规方法，通过对动物，优选地为非人类动物，施用本发明的多肽和/或多聚核苷酸，或两者之一或两者的带表位的片段，或两者之一或两者的类似物，或表达或两者之一或两者的细胞，来得到针对本发明的多肽或多聚核苷酸的抗体。对于单克隆抗体的制备，可以使用本领域中已知的任何通过连续细胞系培养物产生抗体的技术。例子包括各种技术，如Kohler，G.和Milstein，C.，Nature256：495-497(1975)；Kozbor等，今日免疫学(Immunology Today)4：72(1983)；Cole等，Pg.77-96 In单克隆抗体和癌症治疗(MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY)，Alan R.Liss，Inc.(1985)中的技术。

生产单链抗体的技术(美国专利第4，946，778号)可以被采用来生产针对本发明的多肽或多聚核苷酸的单链抗体。同时，转基因小鼠，或其它生物体或其它动物，如其它哺乳动物，可以被用来表达对本发明的多肽或多聚核苷酸具有免疫特异性的人源化抗体。

替代地，也可以用噬菌体展示技术选择对本发明的多肽具有结合活性的抗体基因，该抗体基因或者源自原始文库(naive library)或源自PCR扩增的淋巴细胞V-基因库，上述淋巴细胞源自经筛选具有抗-BASB059抗性的人类(McCafferty，et al.，(1990)，Nature348，552-554；Marks，等，(1992)生物技术(Biotechnology)10，779-783)。这些抗体的亲和性也可以通过，例如，链改组得以提高(Clackson等，(1991)Nature 352：628)。

以上描述的抗体也可以被用来分离或鉴定表达本发明的多肽或多聚核苷酸的克隆，用来通过，例如，亲和层析纯化上述多肽或多聚核苷酸。

因此，抗BASB059多肽或BASB059多聚核苷酸的抗体等等可以被用来治疗感染，特别是细菌感染。

多肽变体，包括抗原性的，表位的或免疫学上的等效变体构成了本发明的一个特定的方面。

优选地，抗体或其变体被修饰使其在个体中具有较少的免疫原性。例如，如果该个体是人，最优选地抗体可以被“人源化”，在人源化抗体中源自杂交瘤的抗体的一个或几个互补决定区被转移到人的单克隆抗体中，例如，如Jones等(1986)，Nature 321，522-525中，或Tempest等，(1991)生物技术(Biotechnology)9，266-273中所描述。拮抗剂与激动剂-分析和分子

本发明的多肽和多聚核苷酸可以被用于评测小分子底物与配基和，例如，细胞，无细胞制备物，化学文库和天然产物混合物的结合。这些底物和配基可以是天然底物和配基或可以是结构或功能类似物。参见，例如，Coligan等，免疫学中的通用方法(CurrentProtocols In Immunology)1(2)：第5章(1991)。

筛选方法可以是通过与待选化合物的相关的直接或间接标记简单地测量待选化合物与多肽或多聚核苷酸，或与带有该多肽或多聚核苷酸的膜或细胞，或与该多肽的融合蛋白的结合。替代地，该筛选方法可以与标记的竞争物竞争。进而，利用对于含有上述多肽或多聚核苷酸的细胞适当的检测系统，这些筛选方法可以测试待选化合物是否导致由于该多肽或多聚核苷酸的激活或抑制而产生的信号。通常在存在已知的激动剂的情况下检测激活的抑制剂，并观察在待选化合物存在的情况下激动剂的激活效应。具有组成型活性的多肽和/或组成型表达的多肽和多聚核苷酸可以被用于在无激动剂或抑制剂的情况下筛选反激动剂或抑制剂的方法中；上述筛选是通过，根据具体情况，测定待选化合物是否导致对上述多肽或多聚核苷酸的激活的抑制。进而，筛选方法可以简单地含有以下步骤：将待选化合物与含有本发明的多肽或多聚核苷酸的溶液混合以形成混合物，测量混合物中的BASB059多肽和/或多聚核苷酸的活性，并将混合物中的BASB059多肽和/或多聚核苷酸的活性与标准进行比较。融合蛋白，如本文先前所描述的Fc部分和BASB059多肽的融合蛋白，也可以被用于鉴定本发明的多肽的拮抗剂，以及鉴定系统发生和/或功能上相关的多肽的高通量筛选检测(参见D.Bennett等，分子识别杂志(J Mol.Recognition)，8：52--58(1995)；和K.Johanson等，生物化学杂志(J Biol Chem)，270(16)：9459-9471(1995))。

与本发明的多肽结合和/或相互作用的多聚核苷酸，多肽和抗体也可以被用于设计筛选方法，上述筛选方法用于检测加入的化合物对mRNA和/或多肽在细胞中的生成的影响。例如，通过本领域中众所周知的方法用单克隆或多克隆抗体建立ELISA方法，以测量分泌的或与细胞相关的多肽的水平。这可以用来在适当的处理过的细胞或组织中寻找可能抑制或增强多肽生成的物质(也分别称为拮抗剂或激动剂)。

本发明也提供了一种筛选化合物的方法，以鉴定那些增强(激动剂)或阻断(拮抗剂)BASB059多肽或多聚核苷酸的作用的化合物，特别是那些具有抑菌和/或杀菌作用的化合物。筛选的方法可能涉及高通量技术。例如，为了筛选激动剂或拮抗剂，将一种合成的反应混合物，一种含有BASB059多肽的细胞区室，例如膜，细胞外膜或细胞壁，或任何上述制备物与该多肽的标记底物或配基在有或无待选分子存在的情况下温育，上述待选分子可能是BASB059的激动剂或拮抗剂。待选分子激活或拮抗BASB059多肽的能力是通过标记配基的结合的下降，或通过从这样的底物生成的产物的量的降低来反映的。没有理由地(gratuitously)结合，即，不诱导BASB059多肽的效应，的分子很可能是很好的拮抗剂。结合得很好并且，根据具体情况，提高从底物生成产物的速率，增强信号转导或增强化学通道活性的分子是激动剂。可以通过使用报告系统增强对，根据具体情况，从底物生成产物的速率，或信号转导水平或化学通道活性水平的检测。在这方面有用的报告系统包括，但不限于，本领域中已知的比色系统，被转化为产物的标记底物，对BASB059多聚核苷酸或多肽活性的变化响应的报告基因以及结合分析。

另一个BASB059激动剂检测方法的例子是竞争检测法，该方法将BASB059和可能的激动剂与BASB059-结合分子，重组的BASB059结合分子，天然底物或配基，或底物或配基的类似物混合在一起，在适当的条件下检测竞争性抑制。BASB059可以被标记，例如通过放射性或比色化合物，以便精确地确定结合到结合分子的，或转化成产物的BASB059分子数，以便评价可能的拮抗剂的效价。

可能的拮抗剂其中包括有机小分子，肽，多肽和抗体，等等；上述抗体与本发明的多聚核苷酸和/或多肽结合，从而抑制或消除多聚核苷酸或多肽的活性或表达。可能的拮抗剂也可以是有机小分子，肽，多肽，如紧密相关蛋白，或在结合分子上结合相同位点的抗体；例如一个结合分子，它不诱导BASB059所诱导的活性，从而通过排斥BASB059多肽和/或多聚核苷酸的结合，阻止了BASB059多肽和/或多聚核苷酸的作用或表达。

可能的拮抗剂包括与多肽的结合位点结合并占据了结合位点的小分子，它阻止了细胞结合分子的结合，从而阻止了正常的生物学活性。小分子的例子包括但不限于有机小分子，肽或类似肽的分子。其它可能的拮抗剂包括反义分子(这些分子的描述参见Okano，神经化学杂志(J.Neurochem.)56：560(1991)；作为基因表达的反义抑制剂的寡脱氧核苷酸(OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTISENSEINHIBITORS OF GENE EXPRESSION)，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。优选的可能拮抗剂包括涉及BASB059变体的化合物。

在一个更进一步的方面，本发明涉及基因工程改造的可溶性融合蛋白，该融合蛋白包含本发明的多肽或其片段，以及各种亚类的免疫球蛋白(IgG，IgM，IgA，IgE)的重链和轻链的恒定区的各个部分。优选的免疫球蛋白是人类IgG，特别是IgG1的重链恒定区，其中融合在铰链区进行。在一个特定的实施方案中，通过引入可以被凝血因子Xa所切割的切割序列，可以简单地将Fc部分除去。进而，本发明涉及通过基因工程制备这些融合蛋白的方法，以及它们在药物筛选，诊断和治疗上的应用。本发明的一个更进一步的方面还涉及编码这样的融合蛋白的多聚核苷酸。融合蛋白技术的例子可以在国际专利申请号WO94/29458和WO94/22914中找到。

本文提供的各个多聚核苷酸序列可以被用于寻找和开发抗菌的化合物。它们所编码的蛋白表达后可以被用作筛选抗菌药物的靶。此外，编码所编码的蛋白的氨基末端区的多聚核苷酸序列，或相应mRNA的Shine-Delgarno序列或其它有利于翻译的序列都可以被用来构建反义序列以控制感兴趣的编码序列的表达。

本发明还提供了本发明的多肽，多聚核苷酸，激动剂或拮抗剂在干扰一种或几种病原体与真核宿主，优选地为哺乳动物宿主，间的初始物理相互作用上的应用，上述初始物理相互作用造成了感染的结果。具体而言，本发明的上述分子可以被用于：防止细菌，特别是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌，对真核生物，优选地为哺乳动物，埋藏装置上的或伤口的细胞外基质蛋白的粘附；阻断真核生物，优选地为哺乳动物，的细胞外基质蛋白和介导组织损伤的细菌BASB059蛋白之间的细菌粘附，和/或；阻断感染的疾病发生的正常进行，上述感染是由植入埋藏装置或其它外科技术以外的原因导致的。

根据本发明的另一方面，提供了BASB059激动剂和拮抗剂，优选地为抑菌或杀菌的激动剂或拮抗剂。

本发明的激动剂或拮抗剂可以被用于，例如，防止、抑制和/或治疗疾病。

在一个进一步的方面，本发明涉及本发明的多肽的拟表位(mimotopes)。拟表位是一段肽序列，它和天然肽足够类似(序列上或结构上)，从而能被识别该天然肽的抗体所识别；或者当它与适当的载体偶联时能引起识别天然肽的抗体。

可以通过添加、缺失或替换选定的氨基酸来设计用于特定目的的肽拟表位。因此，可以对多肽进行修饰以便于与蛋白载体偶联。例如，对于一些化学偶联方法而言包括一个末端半胱氨酸是合乎需要的。此外，对于与蛋白载体偶联的肽而言，含有一个远离肽的偶联末端的疏水末端，以便上述肽的自由未偶联末端保持与载体蛋白的表面相连，这可能是合乎需要的。这样该肽段呈现的构象最接近于当它处于整体天然蛋白环境时的构象。例如，可以改变肽段使其含有N-末端半胱氨酸和C-末端疏水酰胺化的尾部。替代地，可以添加或替代一个或多个氨基酸的D-立体化学异构体以得到有利的衍生物，例如，以增强上述肽的稳定性。

替代地，可以通过诸如噬菌体展示技术(EP 0 552 267 B1)这样的技术，利用自身能够结合本发明的多肽的抗体鉴定肽拟表位。该技术产生大量的模拟天然肽段结构的肽序列，并且因此能够结合抗-天然肽的抗体，但它们自身不一定和该天然肽具有明显的序列同源性。疫苗

本发明的另一方面涉及在个体中，特别是哺乳动物中，优选地为人类中，诱导免疫应答的方法，该方法包括用BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或变体，对个体接种，上述接种足以产生抗体和/或T细胞免疫应答以保护上述个体免受感染，特别是细菌感染，尤其特别是脑膜炎奈瑟氏球菌感染。还提供了一些方法，其中这样的免疫应答减慢了细菌的复制。本发明的另一方面涉及在个体中诱导免疫应答的方法，该方法包括为了诱导免疫应答而往上述个体输送直接表达BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或变体的核酸载体、序列或核酶，以便在体内直接表达BASB059多聚核苷酸和/或多肽，或其片段或变体，从而例如产生抗体和/或T细胞免疫应答，包括，例如，产生细胞因子的T细胞或细胞毒性T细胞，从而保护上述个体免受疾病，不论上述疾病是否已经在上述个体中发生。施用上述基因的一个例子是将其包被在颗粒或其它东西上，从而加速其进入所期望的细胞。这样的核酸载体可以包括DNA，RNA，核酶，修饰的核酸，DNA/RNA杂合体，DNA-蛋白复合物或RNA-蛋白复合物。本发明的一个进一步的方面涉及一种免疫组合物，当该组合物被引入到能够被诱导免疫应答的个体，优选地为人类，时在这样的个体中诱导针对BASB059多聚核苷酸和/或由其编码的多肽的免疫应答，其中上述组合物含有重组的BASB059多聚核苷酸和/或由其编码的多肽，和/或含有编码和表达上述BASB059多聚核苷酸，其编码的多肽，或其它本发明的多肽的抗原的DNA和/或RNA。上述免疫应答可以被用于治疗或预防用途，并且可以是抗体免疫和/或细胞免疫的形式，如CTL或CD4+T细胞引起的细胞免疫。

BASB059多肽或其片段可以与辅助蛋白或化学部分融合，上述辅助蛋白或化学部分自身可以产生也可以不产生抗体，但它们能稳定上述第一蛋白并且产生具有抗原性和/或免疫原性的，优选地具有保护特性的，融合的或修饰的蛋白。这样融合的重组蛋白优选地进一步含有一个免疫原性的辅助蛋白，如源自嗜血流感杆菌(HaemophilusInfluenzae)的脂蛋白D，谷胱氨肽-S-转移酶(GST)或β-糖苷酶，或任何其它相对较大的，能够稳定该蛋白并有利于其生产和纯化的辅助蛋白。此外，在对接受该蛋白的生物体的免疫系统提供一种普遍的刺激的意义上，该辅助蛋白可以作为一种佐剂。该辅助蛋白可以附接到第一蛋白的氨基或羧基一末端上。

在根据本发明的疫苗组合物中，BASB059多肽和/或多聚核苷酸、或片段、或拟表位、或其变体可以存在于一个载体中，如以上描述的活的重组载体，例如，活的细菌载体。BASB059多肽的非活载体，例如，细菌外膜囊泡或“小泡(blebs)”也是适合的。OM小泡是源自革兰氏阴性菌两层膜的外膜，并且有报道表明存在于许多革兰氏阴性细菌中(Zhou，L等，1998.微生物学快报(FEMS Microbiol.Lett.)163：223-228)，包括C.trachomatis和C.psittaci。报道表明能产生水泡的细菌病原体的不完全名单还包括：Bordetella pertussis(百日咳博德特氏菌)，Borrelia burgdorferi，Brucellamelitensis(马尔他布鲁氏菌)，Esherichia coli(大肠埃希氏菌)，(Brucella ovis)绵羊布鲁氏菌，haemophilus Influenza(嗜血流感杆菌)，Legionella pneumophila(嗜肺军团菌)，Neisseriagonorrhoeae(奈瑟氏淋病菌)，(Neisseria meningitidis)脑膜炎奈瑟氏球菌，Pseudomonas aeruginosa(绿色假单胞菌)和Yersiniaenterocolitica(小肠结肠炎叶尔森氏菌)。

小泡的优点是提供了天然构象的外膜蛋白，因此对于疫苗特别有用。可以对细菌进行改造，从而改变外膜上的一个或多个分子的表达，从而改善其疫苗用途。因此可以引入或上调(例如，通过改变启动子)外膜上合乎需要的免疫原性蛋白例如BASB059多肽的表达。替代地或另加地，可以下调不相关的(例如非保护性的抗原或免疫显性的但却可变的蛋白)或有害的(例如毒性分子如LPS，或自体免疫应答的可能的诱导剂)外膜分子的表达。这些方法将在下文详细描述。

BASB059基因的非编码侧翼区域含有对该基因的表达很重要的调控元件。这种调控同时在转录水平上和翻译水平进行。可以通过DNA测序获得处于该基因的开放阅读框的上游或下游的这些区域的序列。这些序列信息允许人们确定可能的调节基序，如不同的启动子元件，终止序列，可诱导序列元件，阻抑物，负责期变异(phasevariable)的元件，Shine-Dalgarno序列，可能具有参与调节的二级结构的序列，以及其它类型的调节基序或序列。这些序列是本发明的进一步的方面。

这些序列信息允许人们对BASB059基因天然表达调控。可以通过改变启动子，Shine-Dalgarno序列，可能的阻抑物或操纵子元件，或任何其它相关的元件来完成对基因表达的上调。类似地，可以通过类似的改变达到对表达的下调。替代地，通过对相变异序列的改变可以将该基因的表达处于位相变异的控制之下，或者可以将其表达与相变异的控制解偶联。在另一种方法中，可以将该基因置于一个或多个允许对表达进行调控的可诱导元件的控制之下。这样的调控的例子包括，但不限于，温度改变，添加诱导底物如选定的碳水化合物或它们的衍生物，痕量元素，维生素，辅因子，金属离子等的诱导。

可以通过几种不同的方法引入上文所描述的改造。可以通过随机诱变，然后筛选所需要的表型，从而在体内对涉及基因表达的序列进行改造。另一种方法包括分离感兴趣的区域，然后通过随机诱变或定点置换，插入或缺失突变进行改造。然后通过同源重组，改造后的区域被重新引入到细菌基因组中，接着测定对基因表达的影响。在另一种方法中，可以利用感兴趣的区域的序列知识来置换或缺失部分或所有的天然调节序列。在这种情况下，分离目的调节区域并进行改造，使其含有另一基因的调控元件，含有来自不同基因的调控元件的组合，含有合成的调控区域或含有任何其它调控区域，或者使野生型调控序列的选定部分被缺失。然后通过同源重组，这些改造后的序列可以被重新引入到细菌的基因组。可用于基因表达的上调的优选启动子的不完全清单包括源自脑膜炎奈瑟氏球菌或奈瑟氏淋病菌的启动子porA，proB，lbpB，tbpB，p110，1st，hpuAB；ompCD，copB，lbpB，ompE，UspA1；UspA2；源自M.catarrhalis的TbpB；源自嗜血流感杆菌的p1，p2，p4，p5，p6，lpD，tbpB，D15，Hia，Hmw1，Hmw2。

在一个实施例中，可以通过将基因的启动子换为较强的启动子(通过分离该基因的上游序列，体外改造该序列，并通过同源重组重新引入到基因组中)而调控基因的表达。可以在细菌和细菌释放(或产生)的外膜小泡中实现上调表达。

在其它实施例中，所描述的方法可以用于产生重组细菌菌株，在上述重组菌株中用于疫苗用途的特性得到了改善。上述菌株可以是但不限于，弱化的菌株，所选择的抗原的表达增强的菌株，干扰免疫应答的基因被敲除(或表达降低)的菌株，免疫显性蛋白的表达受调节的菌株，外膜小泡的释放受调节的菌株。

因此，本发明也提供了BASB059基因的改造后的上游区域，该改造后的上游区域含有异源调控元件，该异源调控元件改变位于外膜的BASB059蛋白的表达水平。根据本发明的这个方面的上游区域包括BASB059基因的上游序列。上述上游区域紧接着BASB059基因的上游开始，并且从起始密码子ATG算起，其延伸的位置通常不超过该基因上游大约1000bp。当基因位于多顺反子序列(操纵子)时，上游区域可以直接开始于感兴趣基因之前，或开始于操纵子中第一个基因之前。根据本发明的这个方面，优选地，改造的上游区域包含一个位于ATG上游500bp到700bp位之间的异源启动子。

因此，本发明在改造的细菌小泡中提供了BASB059多肽。本发明进一步提供了改造的宿主细胞，该宿主细胞产生无生命的基于膜的小泡载体。本发明进一步提供了含有BASB059基因的核酸载体，该BASB059基因具有改造的含有异源调控元件的上游区域。

本发明进一步提供了根据本发明的宿主细胞和细菌小泡的制备方法。

本发明也提供了组合物，尤其是疫苗组合物，和方法，上述组合物和方法含有本发明的多肽和/或多聚核苷酸，以及免疫刺激的DNA序列，例如在Sato，Y.等Science 273：352(1996)中所描述的序列。

本发明也提供了将所描述的多聚核苷酸或其特定的片段应用于多聚核苷酸构建体的方法，上述多聚核苷酸构建体用于在感染脑膜炎奈瑟氏球菌的动物模型中进行基因免疫实验，上述多聚核苷酸或其特定的片段编码细菌细胞表面蛋白的非-可变区域。这样的实验在鉴定可能引起预防或治疗免疫应答的蛋白表位上特别有用。有人认为上述方法为随后的特定用途的单克隆抗体的制备作了准备，该单克隆抗体源自成功地抵抗或清除感染的动物的必要器官，该单克隆抗体用于开发哺乳动物细菌感染的预防制剂或治疗方法，上述细菌感染尤其指脑膜炎奈瑟氏球菌感染，上述哺乳动物尤其指人类。

本发明也包括一种疫苗制剂，它包含本发明的免疫原性的重组多肽和/或多聚核苷酸和合适的载体，例如药用上可接受的载体。因为多肽和多聚核苷酸在胃中可以被分解，因此优选地，它们通过非肠道途径施用，包括，例如，皮下的、肌肉内的、静脉内的或皮内的施用途径。适用于非肠道施用的制剂包括水溶性的和非水溶性的无菌注射溶液，它们可以含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌化合物和使该制剂与个体的体液，优选地为血液，等渗的溶剂；还包括水悬浮的和非水悬浮的悬浮液，它们可以含有悬浮制剂或稠化剂。该制剂可以在单一剂量或多剂量的容器中提供，例如在密闭的安瓿和小瓶中，并且在冻干的条件下储存，只需要在使用之前加入无菌的液体载体。

本发明的疫苗制剂还可以包括佐剂系统以增强该制剂的免疫原性。优选地，该佐剂系统优先引起TH1型的免疫应答。

免疫应答可以被大致区分为两中极端的类型，体液或细胞介导的免疫应答(经典特征分别为受体和细胞效应器保护机制)。这些应答在分类学上分别被称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。

极端的TH1型免疫应答的特征为产生抗原特异的、单元型限制的细胞毒性T淋巴细胞和天然杀伤细胞应答。在小鼠中TH1型应答的特征经常为IgG2a亚型的抗体的产生，而在人类中这些相应于IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征为产生许多同种型的免疫球蛋白，在小鼠中包括IgG1，IgA和IgM。

有人认为产生这两种免疫应答背后的驱动力是细胞因子。高水平的TH1型细胞因子倾向于诱导针对既定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子倾向于诱导针对既定抗原的体液免疫应答。

TH1和TH2型免疫应答的区分不是绝对的。事实上，在一个个体中维持的免疫应答被描述为主要TH1型或主要TH2型。但是，按照Mosmann和Coffman在鼠类CD4+veT细胞克隆的描述来考虑细胞因子家族经常是便利的(Mosmann，T.R.and Coffman，R.L.(1989)TH1和TH2细胞：导致不同功能特性的淋巴因子分泌的不同模式。免疫学年鉴(TH1 and TH2 cells：different patterns of lymphokinesecretion lead to different functional properties.AnnualReview of Immunology)，7，p145-173)。通常来说，TH1型的应答是与T淋巴细胞产生的INF-γ和IL-2细胞因子的产生相关的。其它与TH1型免疫应答的诱导直接相关的细胞因子，如IL-12，不是由T细胞产生的。相反，TH2型的应答是与IL-4，IL-5，IL-6和IL-13的分泌相关的。

已知某些疫苗的佐剂特别适于刺激TH1或TH2型的细胞因子应答。疫苗接种后或感染后，通常免疫应答TH1∶TH2平衡的最好指示包括：在用抗原重复刺激后，直接测量T淋巴细胞在体外产生的TH1或TH2细胞因子；和/或测量对抗原特异的抗体应答的IgG1∶IgG2a比率。

因此TH1型的佐剂为用抗原体外重复刺激时，优先刺激分离的T细胞群产生高水平的TH1型细胞因子，并促进CD8+细胞毒性T淋巴细胞和与TH1型同种型相关的抗原特异性免疫球蛋白的发生的佐剂。

能够优先刺激TH1型细胞应答的佐剂在国际专利申请WO 94/00153和WO95/17209中有所描述。

3脱-O-酰基单磷酰基脂A(3De-O-acylated monophosphoryllipid A，3D-MPL)是一种这样的佐剂。这是从GB2220211(Ribi)中得知的。化学上它是具有4，5或6酰基链的3脱-O-酰基单磷酰基脂A的混合物，由Montana的Ribi Immunochem公司制造。优选的3脱-O-酰基单磷酰基脂A形式在欧洲专利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公开。

优选地，3D-MPL的颗粒小得足以通过0.22微米的膜(欧洲专利0 689 454)。每剂量提供的3D-MPL在10μg-100μg之间，优选地在25-50μg之间，其中提供的抗原的通常在2-50μg每剂量。

另一种优选的佐剂包括QS21，它是一种源自Quilla.ja SaponariaMolina的树皮的，经HPLC纯化的无毒成分。这种佐剂可以任选地与一种载体一起，任选地与3脱-O-酰基单磷酰基脂A(3D-MPL)混合。

生产QS21的方法在美国专利第5,057,540中有所描述。

含有QS21的非反应原性制剂先前已有描述(WO 96/33739)。当与抗原配制在一起时，这样的含有QS21和胆固醇的制剂已经被表明是成功的TH1刺激佐剂。

可能是TH1细胞应答的刺激因子的其它佐剂包括免疫调节的寡聚核苷酸，例如WO96/02555中所公开的未甲基化的CpG序列。

不同的TH1刺激佐剂，如上文所描述的那些佐剂，的组合物也被认为是提供了一种作为TH1细胞应答优先刺激物的佐剂。例如，QS21可以和3D-MPL配制在一起。QS21∶3D-MPL的比率通常在1∶10到10∶1之间，优选地在1∶5到5∶1之间，并且经常基本上是1∶1。3D-MPL∶QS21的最佳协同效应的优选范围是2.5∶1到1∶1。

优选地，在根据本发明的疫苗组合物中还存在一种载体。上述载体可以是水包油乳剂或铝盐，如磷酸铝或氢氧化铝。

优选的水包油乳剂含有可代谢的油，如鲨烯，α生育酚和吐温80。在一个特别优选的方面，根据本发明的疫苗组合物中的抗原和QS21与3D-MPL在这样的乳剂中混合在一起。此外，上述水包油乳剂可以含有span85和/或卵磷脂和/或三辛酰甘油酯。

通常对于人类施用而言，疫苗中存在的QS21和3D-MPL在1μg-200μg每剂量的范围内，例如在10-100μg，优选地在10μg-50μg。通常水包油乳剂含有2到10％的鲨烯，从2到10％的α-生育酚和从0.3到3％的吐温80。优选地，鲨烯：α生育酚的比率等于或小于1，因为这样的乳剂更为稳定。Span85也可以在1％的水平存在。在一些情况下本发明的疫苗进一步含有稳定剂是有利的。

无毒的水包油乳剂优选地在水性载体中含有无毒的油，例如鲨烷或鲨烯，乳化剂，例如吐温80。上述水性载体可以是，例如，磷酸盐缓冲液。

一种在水包油乳剂中含有QS21、3D-MPL和生育酚的特别强的佐剂制剂在WO 95/17210中有所描述。

本发明还提供了多价的疫苗组合物，它含有本发明的疫苗制剂以及其它抗原，特别是可用于治疗癌症、自身免疫疾病和相关病情的抗原。这样的多价疫苗组合物可以包括本文先前描述的TH1诱导佐剂。

虽然本发明的描述是关于某些BASB059多肽和多聚核苷酸，但是应当理解本发明覆盖了天然存在的多肽和多聚核苷酸的片段，以及进行了添加、缺失或替代而重组多肽或多聚核苷酸的免疫原性性质基本上不受影响的类似多肽和多聚核苷酸。

抗原可以以全细菌(活的或死的)的形式，或者以亚细胞组分的形式输送，这可能包括奈瑟氏脑膜炎球菌自身。组合物、试剂盒和施用

在本发明的一个进一步的方面提供了一种用于对细胞或多细胞生物施用的组合物，该组合物含有BASB059多聚核苷酸和/或BASB059多肽。

本发明还涉及含有本文讨论的多聚核苷酸和/或多肽或它们的激动剂或拮抗剂的组合物。本发明的多肽和多聚核苷酸可以和非无菌的或无菌的载体，或者用于细胞、组织或生物体的载体，如适用于对个体施用的载体，一起组成组合物。这样的组合物含有，例如，介质添加剂(media additive)或治疗上有效量的本发明的多肽和/或多聚核苷酸，以及药用上可接受的载体或赋形剂。这样的载体可以包括，但不限于，盐溶液、缓冲盐溶液、右旋糖(dextrose)、水、甘油、乙醇和它们的组合。制剂应该与施用的形式相符。本发明进而涉及诊断用的或药用的包和试剂盒，它们含有一个或多个容器，装有一种或多种上文所述的本发明的组合物的成分。

本发明的多肽、多聚核苷酸和其它化合物可以单独使用或者与其它化合物，如治疗用的化合物，联合使用。

药用组合物可以以任何有效的、方便的方式施用，包括，例如，通过局部施用、口服施用、肛门施用、阴道施用、静脉内施用、腹膜内施用、肌肉内施用、皮下施用、鼻腔内施用或皮内施用等等途径。

在治疗或预防中，上述活性制剂可以作为可注射的组合物对个体施用，例如，作为无菌的水分散物(aqueous dispersion)，它优选地为等渗的。

在一个进一步的方面，本发明提供的药用组合物含有治疗上有效量的多肽和/或多聚核苷酸，如可溶形式的本发明的多肽和/或多聚核苷酸，激活或拮抗的肽或小分子化合物，以及药用上可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但不限于，盐溶液、缓冲盐溶液、右旋糖(dextrose)、水、甘油、乙醇和它们的组合。本发明进而涉及药用的包和试剂盒，它们含有一个或多个容器，装有一种或多种上文所述的本发明的组合物的成分。本发明的多肽、多聚核苷酸和其它化合物可以单独使用或者与其它化合物，如治疗用的化合物，联合使用。

组合物应该和施用途径相适应，施用途径如通过全身施用途径或口服途径。优选形式的全身施用途径包括注射，通常通过静脉内注射。可以使用其它注射途径，如皮下的、肌肉内的或腹膜内的途径。全身施用的替代方法包括渗透剂，如利用胆汁盐或梭链孢酸或其它去污剂进行跨粘膜施用或经皮施用。并且，如果本发明的多肽或其它化合物能被配制成肠溶性的或装入胶囊的制剂，则口服施用也是可能的。这些化合物的施用也可以是局部的(topical)和/或定位的(localized)，其形式为药膏、糊膏剂、凝胶、溶液、粉末等等。

对于哺乳动物，尤其是人类，的施用而言，预计活性物质的每日剂量在0.01mg/kg到10mg/kg之间，通常在大约1mg/kg。在任何情况下医生将决定对于个体最适合的实际剂量，实际剂量将根据年龄、体重和特定个体的反应而有所不同。以上剂量是对通常情况的示例。当然，在个别情况下更高或更低的剂量范围是有利的，这也在本发明的范围之内。

所需要的剂量范围依赖于所选择的肽、施用途径、制剂的特性、对象病情的特性和参与的执业医生的判断。但是，适当的剂量在0.1-100μg每千克对象体重。

疫苗组合物可以方便地为可注射形式。可以利用常规的佐剂来增强免疫应答。疫苗的适当的单位剂量为0.5-5μg抗原/kg，这样的剂量优选地施用1-3次，每次的间隔为1-3星期。在以上给出的剂量范围内不会观察到本发明的化合物的有害的毒性作用，上述有害的毒性作用如果存在的话可能会妨碍它们对适当个体的施用。

考虑到存在许多化合物，并且各种施用途径的效率不同，应当预期所需要的剂量有很大的变化。例如，预期口服施用所需要的剂量比静脉内施用所需要的剂量大。可以利用常规的经验程序对这些剂量水平的变化进行调整，这在本领域中是众所周知的。序列数据库、有形介质中的序列和算法

多聚核苷酸和多肽序列形成重要的信息资源，该信息资源可用来确定多聚核苷酸和多肽序列的2维或3维结构以及进一步鉴定其它的类似同源性的序列。通过以下手段很容易将以上方法简化：将上述序列储存在计算机可读的介质中，然后将存储的数据应用于已知的大分子结构程序，或通过众所周知的搜索工具，例如GCG程序包，利用上述存储的数据搜索序列数据库。

本发明还提供了特征序列或链，尤其是基因序列或编码的蛋白序列，的分析方法。优选的序列分析方法包括，例如，序列同源性分析方法，如同一性和相似性分析，DNA，RNA和蛋白结构分析，序列组装，进化枝的分析，序列基序分析，开放阅读框的确定，核酸碱基呼叫(nucleic acid base calling)，密码子使用频率分析，核酸碱基修剪(nucleic acid base trimming)和测序色谱峰分析。

提供了基于计算机的方法以进行同源性鉴定。该方法包括以下步骤：在计算机可读的介质中提供含有本发明的多聚核苷酸序列的第一多聚核苷酸序列；将上述第一多聚核苷酸序列和至少一个第二多聚核苷酸序列或多肽序列比较以鉴定同源性。

提供了基于计算机的方法以进行同源性鉴定，所述方法包括以下步骤：在计算机可读介质中提供会有本发明的多肽序列的第一多肽序列；将上述第一多肽序列和至少一个第二多聚核苷酸或多肽序列比较以鉴定同源性。

在本说明书里应用的所有的出版物和参考文献，包括但不限于专利和专利申请，都在此全文引入作为参考，就象每一个单独的出版物或参考文献都被特地和单独地被注明在此引入作为参考那样。任何本申请要求优先权的专利申请也以上文描述的出版物和参考文献的方式在此全文引入作为参考。定义

“同一性”，如本领域中所知的那样是指，根据具体情况，两个或多个多肽序列或两个或多个多聚核苷酸序列之间的关系，这是通过序列的比较而确定的。在本领域中，“同一性”还表示多肽或多聚核苷酸序列之间的序列相关性的程序，这是通过这样的序列的链之间的匹配来确定的。很容易通过已知的方法来计算“同一性”，包括但不限于那些在以下文献中所描述的方法：计算机分子生物学(Computational Molecular Biology)，Lesk，A.M.，编著，牛津大学出版社，1988；生物计算机学：信息学和基因组主题(Biocomputing：Informatics and Genome Projects)，Smith，D.W.，编著，科学出版社，纽约，1993；序列数据的计算机分析，第I部分(Computer Analysis of Sequence Data，Part，I)，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，编著，Humana Press，New Jersey，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis In MolecularBiology)，von Heine，G.，Academic Press，1987；和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。确定同源性的方法的设计使得被测试的序列之间最好地匹配。进而，确定同一性的方法被编写成了向公众开放的计算机程序。确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，等，核酸研究(Nucleic Acid Research)12(1)：387(1984))，BLASTP，BLASTN(Altschul，S.F.等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410(1990))，和FASTA(Pearson和Lipman美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85；2444-2448(1988))。BLAST家族的程序在NCBI和其它来源上向公众开放(BLAST Manual，Altschul，S.，等，NCBI NLMNIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)215：403-410(1990))。众所周知的Smith Waterman算法也可以被用来确定同一性。

多肽序列比较的参数包括如下：

算法：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J.Mol Biol.)48：443-453(1970)

比较矩阵(comparison matrix)：来自Henikoff和Henikoff，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)89：10915-10919(1992)的BLOSSUM62

间隔补偿(Gap penalty)：8

间隔长度补偿(Gap length penalty)：2

可以使用这些参数的程序为Genetics Computer Group，Madison WI的向公众开放的“Gap”程序。以上描述的参数是肽段比较的默认参数(同时对末端间隔没有补偿)。

多聚核苷酸序列比较的参数包括如下：

算法：Needleman和Wunsch，分子生物学杂志(J.Mol Biol.)48：443-453(1970)

比较矩阵(comparison matrix)：匹配＝+10，不匹配＝0

间隔补偿(Gap penalty)：50

间隔长度补偿(Gap length penalty)：3

可以从Genetics Computer Group，Madison WI的“Gap”程序得到。这些为核酸比较的默认参数。

多聚核苷酸和多肽的“同一性”的优选的含义，根据具体情况，分别在下文的(1)和(2)中给出：

(1)多聚核苷酸实施方案进一步提供了一种分离的多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有的多聚核苷酸序列和SEQ ID NO：1中的参照序列至少有50，60，70，80，85，90，95，97或100％的同一性，其中所述的多聚核苷酸序列可以和SEQ ID NO：1中的参照序列完全相同，或者和参照序列相比具有某些整数的核苷酸变化，其中所述的变化可以选自至少一个核苷酸被缺失，替代，包括转换和颠换，或插入，其中所述的变化可以在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或在这两个末端位置之间的任何位置发生，或者独立地分布于参照序列的核苷酸之间，或者在参照序列中以一个或多个邻近的组分布，其中所述的变化的核苷酸数是这样确定的：将SEQ ID NO：1中的总核苷酸数乘以定义了同一性百分比的整数，除以100，然后将得数从以上所述的SEQ ID NO：1中的总核苷酸数中减去，或：

n_n≤x_n-(x_n·y)，

其中n_n是核苷酸变化数，x_n是SEQ ID NO：1中的总核苷酸数，y对于50％是0.50，对于60％是0.60，对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85，对于90％是0.90，对于95％是0.95，对于97％是0.97，对于100％是1.00，·是乘号的标志，在从x_n中减去之前，x_n和y的任何非整数得数被下舍入(rounded down to)为最接近的整数。编码SEQ ID NO：2的多肽的多聚核苷酸序列的变化可能在该编码序列中产生无义的，错义的或读码框移动的突变，从而在变化后改变由该多聚核苷酸编码的多肽。

作为例子，本发明的多聚核苷酸序列可以与SEQ ID NO：1中的参照序列相同，也就是说可以是100％相同，或者与上述参照序列相比可以含有某些整数的核苷酸变化，以便其同一性百分比小于100％同一性。这样的变化选自至少一个核苷酸被缺失，替代，包括转换和颠换，或插入，其中所述的变化可以在参照核苷酸序列的5’或3’末端位置或在这两个末端位置之间的任何位置发生，或者独立地分布于参照序列的核苷酸之间，或者在参照序列中以一个或多个邻近的组分布。对于给定的同一性百分比，其变化的核苷酸数是这样确定的：将SEQ ID NO：1中的总核苷酸数乘以定义了同一性百分比的整数，除以100，然后将得数从以上所述的SEQ ID NO：1中的总核苷酸数中减去，或：

n_n≤x_n-(x_n·y)，

其中n_n是核苷酸变化数，x_n是SEQ ID NO：1中的总核苷酸数，v是，例如对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85，等等，·是乘号的标志，其中x_n和y的任何非整数得数在从x_n中减去之前被下舍入(rounded down to)为最接近的整数。

(2)多肽实施方案进一步包括分离的多肽，该多肽含有的多肽和SEQ ID NO：2的多肽参照序列至少有50，60，70，80，85，90，95，97或100％的同一性，其中所述的多肽序列可以和SEQ ID NO：2中的参照序列相同，或者和参照序列相比具有某些整数的氨基酸变化，其中所述的变化可以选自至少一个氨基酸被缺失，替代，包括保守的替代和非保守的替代，或插入，其中所述的变化可以在参照多肽序列的氨基或羧基末端位置或在这两个末端位置之间的任何位置发生，或者独立地分布于参照序列的的氨基酸之间，或者在参照序列中以一个或多个邻近的组分布，其中所述的变化的氨基酸数是这样确定的：将SEQ ID NO：2中的总氨基酸数乘以定义了同一性百分比的整数，除以100，然后将得数从以上所述的SEQ ID NO：2中的总氨基酸数中减去，或：

n_a≤x_a-(x_a·y)，

其中n_a是氨基酸变化数，x_a是SEQ ID NO：2中的总氨基酸数，y对于50％是0.50，对于60％是0.60，对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85，对于90％是0.90，对于95％是0.95，对于97％是0.97，对于100％是1.00，·是乘号的标志，在从x_a中减去之前，x_a和y的任何非整数得数被下舍入(rounded down to)为最接近的整数。

作为例子，本发明的多肽序列可以与SEQ ID NO：2中的参照序列相同，也就是说可以是100％相同，或者与上述参照序列相比可以含有某些整数的氨基酸变化，以便其同一性百分比小于100％同一性，这样的变化可以选自至少一个氨基酸被缺失，替代，包括保守的替代和非保守的替代，或插入，其中所述的变化可以在参照多肽序列的氨基或羧基末端位置或在这两个末端位置之间的任何位置发生，或者独立地分布于参照序列的的氨基酸之间，或者在参照序列中以一个或多个邻近的组分布。对于给定同一性百分比，所述的变化的氨基酸数是这样确定的：将SEQ ID NO：2中的总氨基酸数乘以定义了同一性百分比的整数，除以100，然后将得数从以上所述的SEQ ID NO：2中的总氨基酸数中减去，或：

n_a≤x_a-(x_a·y)，

其中n_a是氨基酸变化数，x_a是SEQ ID NO：2中的总氨基酸数，y是，例如对于70％是0.70，对于80％是0.80，对于85％是0.85，等等，·是乘号的标志，其中x_n和y的任何非整数得数在从x_n中减去之前被下舍入(rounded down to)为最接近的整数。

在本文中，当“个体”是关于生物体时它的意思为多细胞真核生物，包括，但不限于，后生动物，哺乳动物，Ovid，牛科动物，猿猴，灵长类和人类。

“分离的”的意思为“通过人的手”从其天然状态被改变，也就是说，如果它天然存在，它被人从其初始环境移开或改变，或同时被移开并改变。例如，天然存在于活的生物体中的多聚核苷酸或多肽不是“分离的”，但是同一多肽或多聚核苷酸被从其天然状态共存的物质分开时，它们就是“分离的”，如该术语在本文中所使用的意思。并且，被通过转化、基因操作或通过任何其它重组方法被导入到生物体的多肽或多聚核苷酸是分离的，即使它仍然存在于上述生物体中，该生物体可以是活的或无生命的。

“多聚核苷酸”通常指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，它们可以是未修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA，包括单链和双链区域。

“变体”指和参照多聚核苷酸或多肽不同，但保留了本质特征的多聚核苷酸或多肽。一个多聚核苷酸的典型的变体和参照多聚核苷酸在核苷酸序列上不同。该变体的核苷酸序列的改变可能改变也可能不改变参照多聚核苷酸所编码的多肽的氨基酸序列。如下文所讨论，核苷酸的改变可能导致参照多聚核苷酸所编码的多肽发生氨基酸的替代、添加、缺失、融合和截短。一个多肽的典型的变体和参照多肽在氨基酸序列上不同。通常，不同之处是有限的，以便参照多肽和变体的序列整体上非常相似，并且，在许多区域是相同的。变体和参照多肽在氨基酸序列上的差别可以是一个或多个氨基酸以任何组合形式的替代，添加，缺失。替代的或插入的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码子编码的。多聚核苷酸或多肽的变体可以是天然存在的，例如等位基因变体，或不是已知的天然存在的变体。多聚核苷酸和多肽的非天然存在的变体可以通过诱变技术或通过直接合成产生。

“疾病”的意思为任何由细菌感染引起或与细菌感染相关的疾病，包括，例如，上呼吸道感染，侵入性细菌疾病，如菌血症和脑膜炎。

实施例

下面的实施例是通过常规技术进行的，上述常规技术对本领域的技术人员是众所周知的，并且是常规的，除了另外详细描述之处外。实施例是说明性的，但不限制本发明。实施例1：在脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株ATCC13090中的RASB059 序列

脑膜炎奈瑟氏球菌菌株ATCC13090的BASB059基因序列在SEQ IDNO：1中列出。在SEQ ID NO：2中列出的BASB059多聚核苷酸的翻译序列，没有表现出与任何已知蛋白的任何显著相似性。但是，BASB059多肽含有一个脂蛋白特征的信号序列。实施例2：表达重组BASB059的质粒的构建 A：BASB059的克隆

被分别设计入正向Lip15-Fm/p(5’-AGG CAG AGG CAT ATG AACACA CGC ATC ATC GTT TC-3’)(SEQ ID NO：3)和反向Lip15-RCf/p(5’-AGG CAG AGG CTC GAG GCA ACG GCC TGC CGC TTT AAG C-3’)(SEQ ID NO：4)扩增引物的NdeI和XhoI限制位点，允许BASB059的PCR产物被定向地克隆到低拷贝数的大肠杆菌表达质粒pET24b中，以便BASB059蛋白可以作为融合蛋白被表达，该融合蛋白在C-末端含有一个(His)6亲和性标记。用基于硅胶的离心柱(QiaGen)，按照厂商的建议，从扩增反应体系中纯化得到了BASB059 PCR产物。为了得到克隆所需要的NdeI和XhoI末端，按照厂商(LifeTechnologies)的建议，用NdeI和XhoI限制性内切酶依次将纯化得到的PCR产物完全消化。在第一次限制性消化后，如上文所述通过离心柱将盐除去来纯化PCR产物，并在第二次消化之前用无菌水洗脱。在与pET24b质粒连接之前再一次用基于硅胶的离心柱将消化过的DNA片段纯化。B：表达载体的产生

为了制备用于连接的pET24b表达载体，类似地将质粒用NdeI和XhoI消化完全，然后用小牛肠道磷酸酶(CIP，~0.02单位/pmole 5’端，Life Techologies)按照厂商的指示消化以防止自身连接。用来进行连接反应的消化片段的摩尔量大约为制备的质体的5倍摩尔过量。通过本领域中众所周知的技术，利用T4DNA连接酶(～2.0单位/反应，Life Technologies)进行常规的～20μl的连接反应(～16℃，～16小时)。根据本领域中众所周知的方法，将一小份连接反应的产物(～5μl)用来转化电感受态的BL21 DE3细胞。在～1.0ml LB肉汤中37℃生长～2-3小时后，将转化的细胞涂布到含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上。在选择培养基中加入了抗生素以便保证所有的转化细胞都含有pET24b质粒(KnR)。平板在37℃过夜培养～16小时。用无菌的牙签挑取单个KnR菌落，并用来对新鲜的LB KnR平板和～1.0ml LB KnR肉汤培养基进行“斑点(patch)”接种。将上述斑点平板和肉汤培养基在常规的培养箱(平板)或水浴摇床里37℃温育过夜。

通过基于全细胞的PCR分析以确认转化物含有BASB059DNA插入序列。将～1.0ml过夜培养的LB Kn肉汤培养基转移到1.5ml的聚丙烯管中，用Beckman微量离心机(～3分钟，室温，～12,000×g)收集细胞。用～200μl无菌水悬浮细胞沉淀，将～10μl的一小份用于进行终体积～50μl的，同时含有BASB059正向和反向扩增引物的PCR反应。PCR反应组分的最终浓度基本上和实施例2中标明的相同，但是使用的Taq聚合酶为～5.0个单位。第一步95℃变性步骤被延伸到3分钟以确保破坏细菌细胞并释放质粒DNA。为了从溶解的转化物细胞样品中扩增BASB059PCR片段，用ABI Model 9700热循环仪，32个循环，三步热扩增模式，即，95℃，45秒；55-58℃，45秒；72℃，1分钟进行扩增。在热扩增之后，通过琼脂糖凝胶电泳(0.8％的琼脂糖在Tris-醋酸盐-EDTA(TAE)缓冲溶液中)对上述反应体系的约20μl的小份进行分析。在凝胶电泳和溴乙锭染色后用UV照射显示DNA片段。将DNA分子量标准(1Kb的阶梯(Ladder)，Life Technologies)与待测样品同时电泳以估计PCR产物的分子量大小。产生预期的PCR产物的转化物被鉴定为含有BASB059表达构建体的菌株。然后分析含有表达质粒的菌株是否能进行BASB059的可诱导表达。C：PCR-阳性转化物的表达分析

对于以上鉴定的每个PCR阳性转化物，用斑点平板的细胞接种含有氨苄青霉素(～100μg/ml)～5.0ml的LB肉汤，并在37℃摇床培养(～250rpm)过夜。用一小份(～1.0ml)过夜种菌培养物接种到含有～25ml LB Kn肉汤的125ml锥形瓶中并在37℃摇床培养(～250rpm)，直到培养物的浑浊度达到O.D.600为～0.5，即对数生长中期(通常为大约1.5-2.0小时)。这时将大约一半培养物(～12.5ml)转移到第二个125ml的锥形瓶中并且加入终浓度1.0mM(用无菌水制备的1.0M的储存液，Sigma)的IPTG以诱导重组BASB059蛋白的表达。将IPTG诱导的和未诱导的培养物继续37℃摇床培养～4小时。诱导期后将诱导的和未诱导的培养物的样品(～1.0ml)取出，并通过微量离心管室温离心～3分钟收集细胞。将每种细胞沉淀用～50μl无菌水悬浮，然后与含有2-巯基乙醇的2×Laemmli SDS-PAGE上样缓冲液等体积混合，沸水浴～3分钟以使蛋白变性。将体积相等的(～15μl)IPTG诱导的和未诱导的细胞粗裂解液上样到相同的两块12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(1mm厚的小凝胶，Novex)。诱导的和未诱导的裂解样品和预染色的分子量标准(SeeBlue，Novex)在常规条件下用常规的SDS/Tris/甘氨酸电泳缓冲液(BioRad)一起电泳。电泳后，一块胶用考马斯亮蓝R250(BioRad)染色，然后脱色以显示新的BASB059可诱导蛋白。利用BioRad的Mini-Protean II印迹装置和Towbin’s甲醇(20％)转移缓冲液4℃～2小时，第二块胶被电印迹到PVDF膜上(0.45微米孔径，Novex)。根据本领域中已知的方法进行膜的封闭和抗体温育。先用单克隆的抗(His)5抗体，然后用交联了HRP的兔抗鼠二抗(QiaGen)确认BASB059重组蛋白的表达和身分。用ABT不溶底物或使用Hyperfilm以及Amersham ECL化学发光系统显示抗-His抗体的反应模式。实施例3：重组BASB059的生产 细菌菌株

含有pET24b质粒的大肠杆菌BL21DE3重组表达菌株被用来生产大量细胞，以用于重组蛋白的纯化，上述pET24b质粒编码源自脑膜炎奈瑟氏球菌的BASB059。表达菌株在含有100μg/ml卡那霉素(″Kn″)的LB琼脂平板上培养以保证质粒的保持。为了在-80℃冷冻保存，将菌株在含有相同浓度的抗生素的LB肉汤中增殖，然后与等体积的含有30％μg甘油LB肉汤混合。培养基

用于生产重组蛋白的发酵培养基由含有100μg/ml Kn的2×YT肉汤培养基(Difco)组成。在发酵罐的培养基中加入0.25ml/L的抗泡沫剂(Antifoam 204，Sigma)。为了诱导BASB059重组蛋白的表达，往发酵罐中加入IPTG(异丙基β-D硫代吡喃型半乳糖苷)(终浓度1mM)发酵

往含有50ml工作体积的一个500ml菌种锥形瓶中接种0.3ml融化后的冷冻培养物，或接种几个来自选择性琼脂平板培养物的菌落，然后在37±1℃的150rpm的摇床平台(Innova 2100，New BrunswickScientific)上温育Kn约12小时。然后该菌种培养物被用来接种5L工作体积的，内含有Kn抗生素的2×YT肉汤培养基的发酵罐。该发酵罐(Bioflo 3000，New Brunswick Scientific)在37±1℃，0.2-0.4VVM空气喷射，Rushon叶轮250rpm的条件下工作。在锥形瓶菌种培养物中或发酵罐中都不控制pH值。在发酵过程中，发酵罐内的pH值在6.5到7.3的范围内。当培养物达到对数生长中期时(~0.7O.D.600单位)往发酵罐中加入IPTG(1.0M储存液，无菌水配制)。细胞被诱导2-4个小时，然后用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速离心机(Sorvall Instruments)离心收集细胞。细胞糊状物储存于-20℃，直至进一步处理。纯化

咪唑和生物技术级或更好的试剂都购自Ameresco Chemical，Solon，Ohio。Triton X-100(t-辛基苯氧基聚乙氧基-乙醇)，Triton X-114，磷酸钠，一元碱和尿素为试剂级或更好的，并购自Sigma Chemical Company，St.Louis，Missouri。Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(1×PBS)购自Quality Biological，Inc.，Gaithersburg，Maryland。Dulbecco’s磷酸盐缓冲液(10×PBS)购自BioWhittaker，Walkersville，Maryland。无BSA的五-His抗体购自QiaGen，Valencia，California。过氧化物酶标记的Affini Pure羊抗鼠IgG购自Jackson Immuno Research，West Grove，Penn。所有的其它化学试剂都是试剂级的或更好的。

螯合Ni的Sepharose Fast Flow树脂购自Pharmacia，Sweden。预灌制的Tris-甘氨酸4-20％和10-20％聚丙烯酰胺凝胶，所有的电泳缓冲液和溶液，SeeBlue预染色分子量标准，MultMark多色标准和PVDF转移膜都购自Novex，San Diego，California。SDS-PAGE银染试剂盒购自Daiichi Pure Chemicals Company Limited，Tokyo，Jknan。考马斯染色溶液购自BioRad Laboratories，Hercules，California。ArcrodicPF 0.2m注射滤器购自Pall GelmanSciences，Ann Arbor，Michigan.GD/X25mm一次性注射滤器购自Whatman Inc.，Clifton，New Jersey。截留分子量8,000的透析管购自BioDesign Inc.，Od New York，Carmal New York。BCA蛋白检测试剂和蛇皮透析管，截留分子量3,500，购自Pierce ChemicalCo.，Rockford，Illinois。提取方法

细胞糊状物在室温融解30到60分钟。将细胞糊状物破碎后，上清用1.0％的Triton X114分配，将这个级分通过螯合Ni的SepharoseFast Flow树脂，上述树脂预先用含10％甘油和0.005％Triton X100的PBS(pH＝7.5)平衡。用含有200mM咪唑的同一缓冲液洗脱蛋白。将含有洗脱物质的级分用4体积的含2mM EDTA，10mM氯化钠和0.005％Triton X 100的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)稀释后通过DEAE-Sepharose FF树脂。收集流出部分并用截留分子量3KDa的搅拌池浓缩，然后对含0.1％Trion X100的PBS(pH 7.4)透析。最终制剂

通过对0.1％Triton X-100和1×PBS，pH 7.4，透析过夜，中间换3次透析液，配制BASB059。对纯化的蛋白进行特征鉴定，并用来产生抗体，如下文所述。SDS-PAGE的结果(图1A)表明大约10KDa的一条蛋白带被纯化到纯度大于90％，并且能够通过Western印迹与抗His抗体反应(图1B)。生物化学特征：SDS-PAGE和Western印迹分析

纯化的重组蛋白在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上解析后100V1小时电泳转移到PVDF膜上，如先前所描述(Thebaine等，1979，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76：4350-4354)。然后将PVDF膜用含有5％脱脂奶粉的25ml Dulbecco’s磷酸盐缓冲液预处理。所有的以下温育都是在该预处理缓冲液里进行的。

PVDF膜与抗His尾部抗体的稀释液在室温温育1小时。然后将PVDF膜用洗涤缓冲液(含有150mM氯化钠和0.05％Tween-20的20mMTris缓冲液，pH 7.5)洗涤两次。将PVDF膜与25ml 1∶5000稀释的过氧化物酶标记的物种特异的交联物室温温育30min。然后用洗涤缓冲液将PVDF膜洗涤4次，并用Zymed(SanFrancisco，CA)提供的3-氨基-9-乙基咔唑和尿素过氧化物分别显色10分钟。实施例4：用重组BASB059免疫小鼠

在0，14，28天向Balb/C小鼠三次注射在大肠杆菌中表达的，部分纯化的重组BASB059蛋白(10只动物/组)。通过皮下途径向动物注射两种不同配方形式的约5μg抗原：或者吸附在100μg AlPO₄上或者和SBAS2乳剂一起配制(每剂量含有5μg MPL和5μgQS21的SB62乳剂)。在实验中还添加了阴性对照组，阴性对照组由仅用SBAS2乳剂进行免疫的小鼠组成。小鼠在第28天(第二次注射后14天)和第35天(第三次注射后7天)被放血以检测抗BASB059的特异性抗体。通过ELISA测量从AlPO₄和SBAS2收集得到的血清(得自10只小鼠/组)中的特异性抗BASB059抗体(分别检测)，同时对从两种配方收集得到血清进行Western印迹分析(血清被混合在一起)。只利用第三次注射后的血清。图2中出示的结果清楚地表明，ELISA实验说明在两种配方中都有特异性的BASB059抗体应答，而没有检测到抗大肠杆菌抗体或抗大肠杆菌抗体很低。源自逐渐康复的病人的血清中存在抗BASB059抗体

在这个实验中通过Western印迹法检测了几个逐渐康复病人的血清对纯化的BASB059重组蛋白的识别。简言之，将6μg部分纯化的BASB059脑膜炎奈瑟氏球菌B蛋白在SDS-PAGE梯度凝胶(4-20％，Novex，编号n°EC6029)上进行电泳迁移。利用BioRad Trans-blot系统(编号n°170-3930)100伏1∶30小时将蛋白转移到硝酸纤维素片(0.45μm，BioRad编号n°162-0114)上。然后，在与人血清温育之前将滤膜用PBS-0.05％吐温20室温封闭过夜。检测了如下逐渐康复病人的血清：病人#262068，261732，262117，261659，261469，261979和261324。用PBS-0.05％吐温20将这些血清稀释100倍，利用mini-blotter系统(Miniprotean，BioRad编号n°170-4017)与硝酸纤维素片室温温育2小时，同时轻柔地摇晃。用PBS-0.05％吐温20重复洗涤3次，每次5分钟后，将硝酸纤维素片与用同一洗涤缓冲液1/500稀释的适当交联物(生物素化的抗人Ig抗体，源自绵羊，Amersham编号n°RPN1003)在轻柔摇晃的条件下室温温育1小时。如前一步，洗涤三次后，将膜与用洗涤缓冲液1/1000稀释的链亲和素-过氧化物酶复合物(Amersham编号n°1051)在搅拌的条件下温育30分钟。在最后的三次重复洗涤后，将膜与50ml含30mg 4-氯-萘酚(Sigma)，10ml甲醇，40ml超纯水和30μl H₂O₂的溶液温育20分钟进行显色。染色在用蒸馏水几次冲洗膜时被终止。在图3和4中出示的结果表明，在所有的7个逐渐康复的测试中都与10KDa的主带反应。这意味着BASB059蛋白可能在将来作为候选疫苗起作用。

序列信息BASB059多聚核苷酸和多肽序列SEQ ID NO：1源自菌株ATCC13090的脑膜炎奈瑟氏球菌BASB059多聚核苷酸序列ATGAACACACGCATCATCGTTTCGGCTGCGTTCGTTGCGTTGGCATTAGCAGGTTGCGGCTCAATCAATAATGTAACCGTTTCCGACCAGAAACTTCAGGAACGTGCCGCGTTTGCCTTGGGCGTCAGCCAAAATGCCGTAAAAATCAGCAACCGCAGCAATGAAAGCATACGCATCAACTTTACCGCAACTGTGGGTAAGCGCGTGAGCCAATGCTATGTTACCAGTGTAATCAGCACAATCGGCGTTACCACTTCCGATGCAATTTGTTTGGGAGGCGGAACGCACAAAGGCAAAAGTCAATGCAATGCTTTGCTTAAAGCGGCAGGCCGTTGCTAASEQ ID NO：2从SEQ ID NO：1的多聚核苷酸序列推导得到的脑膜炎奈瑟氏球菌BASB059多肽序列MNTRIIVSAAFVALALAGCGSINNVTVSDQKLQERAAFALGVSQNAVKISNRSNESIRINFTATVGKRVSQCYVTSVISTIGVTTSDAICLGGGTHKGKSQCNALLKAAGRCSEQ ID NO：3AGG CAG AGG CAT ATG AAC ACA CGC ATC ATC GTT TCSEQ ID NO：4AGG CAG AGG CTC GAG GCA ACG GCC TGC CGC TTT AAG C保藏的材料

含有脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株的保藏物在美国典型培养物保存中心(American Type Culture Collection)(本文中的“ATCC”)于1997年6月22日保藏，被指定的储藏号(deposit number)为13090。该保藏物被称为脑膜炎奈瑟氏球菌(Albrecht和Ghon)，它是冻干的，由脑膜炎奈瑟氏球菌分离物构建得到的1.5-2.9 kb的插入物文库。该保藏物在Int.Bull.Bacteriol.Nomencl.Taxon.8∶1-15(1958)中有所描述。

该脑膜炎奈瑟氏球菌菌株保藏物在本文中称为“该保藏菌株”或“该保藏菌株的DNA”。

该保藏菌株含有全长的BASB059基因。该保藏菌株中所含有的上述多聚核苷酸的序列，以及由其编码的任何多肽的氨基酸序列，如果和本文序列的任何描述有所冲突的话都得到核实(controlling)

该保藏菌株的保藏是根据关于为了专利目的的微生物保藏物的国际共识(International Recognition of the Deposit ofMicro-organisms for Purposes of Patent Procedure)的布达佩斯条约(Budapest treaty)的条款进行的。在专利公开后，该菌株将无限制，无条件地，不可撤销地向公众开放。该保藏菌株仅仅是为了本领域的技术人员的便利而提供的，并不等于承认保藏物对于启动(enablement)是必须的，如35 U.S.C.§112中所要求的那样。

                           序列表

                           序列表

<110>Smithkline Beecham Biologicals S.A.

<120>新化合物

<130>BM4S367

<160>4

<170>用于Windows的FastSEQ程序(3.0版)

<210>1

<211>339

<212>DNA

<213>(Neisseria Meningitidis)

<214>奈瑟氏脑膜炎球菌

<400>1atgaacacac gcatcatcgt ttcggctgcg ttcgttgcgt tggcattagc aggttgcggc     60tcaatcaata atgtaaccgt ttccgaccag aaacttcagg aacgtgccgc gtttgccttg    120ggcgtcagcc aaaatgccgt aaaaatcagc aaccgcagca atgaaagcat acgcatcaac    180tttaccgcaa ctgtgggtaa gcgcgtgagc caatgctatg ttaccagtgt aatcagcaca    240atcggcgtta ccacttccga tgcaatttgt ttgggaggcg gaacgcacaa aggcaaaagt    300caatgcaatg ctttgcttaa agcggcaggc cgttgctaa                           339

<210>2

<211>112

<212>PRT

<213>Neisseria meningitidis

<214>奈瑟氏脑膜炎球菌

<400>2Met Asn Thr Arg Ile Ile Val Ser Ala Ala Phe Val Ala Leu Ala Leu1               5                   10                  15Ala Gly Cys Gly Ser Ile Asn Asn Val Thr Val Ser Asp Gln Lys Leu

        20                  25                  30Gln Glu Arg Ala Ala Phe Ala Leu Gly Val Ser Gln Asn Ala Val Lys

    35                  40                  45Ile Ser Asn Arg Ser Asn Glu Ser Ile Arg Ile Asn Phe Thr Ala Thr

50                  55                  60Val Gly Lys Arg Val Ser Gln Cys Tyr Val Thr Ser Val  Ile Ser Thr65                  70                  75                   80Ile Gly Val Thr Thr Ser Asp Ala Ile Cys Leu Gly Gly Gly Thr His

            85                  90                  95Lys Gly Lys Ser Gln Cys Asn Ala Leu Leu Lys Ala Ala Gly Arg Cys

        100                 105                 110

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<214>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3aggcagaggc atatgaacac acgcatcatc gtttc                                 35

<210>4

<211>37

<212>DNA

<213>Artificial Sequence

<214>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4aggcagaggc tcgaggcaac ggcctgccgc tttaagc                               37

Claims (18)

1.一种分离的多肽，它包含的氨基酸序列和SEQ ID NO：2中的氨基酸序列至少有85％的同一性。

2.权利要求1中所要求的分离的多肽，其中的氨基酸序列和SEQID NO：2的氨基酸至少有95％的同一性。

3.权利要求1中所要求的多肽，其包含SEQ ID NO：2中的氨基酸。

4.一种SEQ ID NO：2的分离多肽。

5.权利要求1到4中任何一项所要求的多肽的免疫原性片段，其中上述免疫原性片段的免疫原活性基本上和SEQ ID NO：2的多肽的免疫原活性相同。

6.一种分离的多聚核苷酸，它包含编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列。

7.一种分离的多聚核苷酸，它包含SEQ ID NO：1中的多聚核苷酸。

8.一种含有编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列的，分离的多聚核苷酸，它可以通过用标记的探针在严紧的杂交条件下筛选适当的文库得到，上述探针具有SEQ ID NO：1或其片段的序列。

9.一种表达载体或活的重组微生物，它包含有根据权利要求6-8中任何一项的分离的多聚核苷酸。

10.根据权利要求6-8中任何一项的多聚核苷酸的表达方法，它包括用含有至少一种上述多聚核苷酸的表达载体转化宿主细胞，并在足以使任何一种上述多聚核苷酸表达的条件下培养上述宿主细胞。

11.一种疫苗组合物，它含有权利要求1到5任何一项中的有效量的多肽，以及药用上可接受的载体。

12.一种疫苗组合物，它含有权利要求6到8任何一项中的有效量的多聚核苷酸，以及药用上可接受的载体。

13.根据权利要求11或12中任何一项的疫苗组合物，其中所述的组合物含有至少一种其它脑膜炎奈瑟氏球菌抗原。

14.一种抗体，它对权利要求1到5任何一项中所要求的多肽或其免疫片段具有免疫特异性。

15.诊断脑膜炎奈瑟氏球菌感染的一种方法，该方法包括鉴定生物样品中存在的权利要求1到5任何一项中所要求的多肽，或者对上述多肽具有免疫特异性的抗体，上述生物样品源自怀疑患有这样感染的动物。

16.一种组合物在一种药物的制备中的应用，所述组合物含有免疫学上有效量的，权利要求1到5任何一项中所要求的多肽，所述药物用于在一种动物中产生免疫应答。

17.一种组合物在一种药物的制备中的应用，所述组合物含有免疫学上有效量的，权利要求6到8任何一项中所要求的多聚核苷酸，所述药物用于在一种动物中产生免疫应答。

18.一种用于治疗患有脑膜炎奈瑟氏球菌疾病的人的药用组合物，该组合物至少含有一种针对权利要求1到5任何一项中所要求的多肽的抗体，以及适当的药用载体。

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