CN1402785A - 新化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供BASB132多肽和编码BASB132多肽的多核苷酸，以及由重组技术产生这些多肽的方法。另外还提供诊断、预防及治疗性应用。

Description

新化合物
发明领域
本发明涉及多核苷酸(文中称为“BASB132多核苷酸”)、这些多核苷酸编码的多肽(文中称为“BASB132”或“BASB132多肽”)，以及用于其产生的重组材料和方法。另一方面，本发明涉及这些多肽和多核苷酸的使用方法，其中包括抗细菌感染的疫苗。再一方面，本发明涉及检测某些病原体感染的诊断测定方法。
发明背景
粘膜炎莫拉氏菌(也叫粘膜炎布兰汉氏球菌)是一种常分离自人类上呼吸道的革兰氏阴性菌。它可引起数种疾病，主要是幼儿及儿童中耳炎和老年肺炎。它还能引起鼻窦炎和院内感染，有时还可导致侵袭性疾病。
从发病数量和可能引发的后遗症来看，中耳炎是一种重要的儿童期疾病。在美国，每年记录在案的病例都在3,500,000例以上，估计有80％的儿童在3岁以前至少经历过一次耳炎发病(Klein，JO(1994)Clin.Inf.Dis19：823)。这种疾病若不经处理，或是转为慢性，将会导致暂时性(液体在中耳内累积时)或永久性(听神经损坏时)的听力丧失。在幼儿中，这种听力丧失可能会造成语言学习延迟。
从患有中耳炎的儿童的中耳内主要可分离出三种细菌：肺炎链球菌、未分类流感嗜血菌(NTHi)和粘膜炎莫拉氏菌。这些细菌存在于60-90％的病例中。关于近期研究的一篇综述显示，肺炎链球菌和NTHi各占中耳炎病例的约30％，粘膜炎莫拉氏菌约占15％(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60：267)。从中耳内还可分离出其他细菌(B型流感嗜血菌、酿脓链球菌等)，但出现率要低得多(占病例的2％或更低)。
流行病学的资料显示，对中耳内发现的病原体而言，在上呼吸道建群是耳炎产生的必需前提；但引起该疾病还需要其他因素(Dickinson，DPet al.(1988)J.Infect.Dis.158：205，Faden，HL et al.(1991)Ann.Otorhinol.Laryngol.100：612)。这些因素的重要性在于可引发细菌经咽鼓管迁移到中耳内，然后启动炎症过程。目前对这些因素还不甚了解。据推测，例如病毒性感染后的免疫系统暂时性异常可能会造成无法控制呼吸道建群(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.169：1312)。另一种解释是，暴露于环境因素会使一些儿童出现更重要的建群，所以这些儿童因中耳病原体的持续存在而变得容易患中耳炎(Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60：267)。
有关抗粘膜炎莫拉氏菌的免疫应答的特性还了解得很少。从0岁生长至2岁的幼儿的鼻咽中顺序分离出菌株并进行分析，其结果表明，他们经常会感染新菌株，然后再将其清除。这说明建群后的儿童能产生抗这种细菌的有效免疫应答(Faden，HL et al(1994)J.Infect.Dis.169：1312)。
在对成人的测试中，大多数都能鉴定出杀菌性抗体(Chapman，AJ etal.(1985)J.Infect.Dis.151：878)。粘膜炎莫拉氏菌菌株在抵抗血清杀菌活性的能力上存在差异：一般而言，患病个体的分离物要比只建群的个体的分离物更具有抗性(Hol，C et al.(1993)Lancet 341：1281，Jordan，KLet al.(1990)Am.J.Med.88(suppl.5A)：28S)。因此，可将血清抗性看作细菌的一种毒力因素。在中耳炎痊愈儿童的血清中发现了一种调理素活性。
OMP B1是一种84kDa的蛋白，其表达受铁元素调控，它可被肺炎患者的血清识别(Sethi，S，et al.(1995)Infect.Immun.63：1516)，除了该蛋白以及UspA1和UspA2(Chen D.et al.(1999)，Infect.Immun.67：1310)之外，在人类中还未发现这些不同的免疫应答所针对的其他抗原。
目前已利用生化方法对粘膜炎莫拉氏菌表面的其他一些膜蛋白进行了特性鉴定，或是对这些膜蛋白在诱导保护性免疫方面的潜在作用进行了研究(有关综述可参考Murphy，TF(1996)Microbiol.Rev.60：267)。在小鼠肺炎模型中，针对其中一些膜蛋白(UspA、CopB)的抗体的存在有利于更快清除肺部感染。铜绿假单胞菌的孔蛋白能够有效抵抗动物模型中的这种细菌，有一种在粘膜炎莫拉氏菌菌株中高度保守的多肽(OMPCD)与孔蛋白具有同源性。
在过去几十年中，粘膜炎莫拉氏菌感染的频率大幅度提高。其原因是多重抗生素抗性菌株的出现和免疫系统薄弱人群的增加。分离出对某些或所有普通抗生素具有抗性的粘膜炎莫拉氏菌菌株已不再困难。这种现象使我们必须用新型抗微生物剂、疫苗、药物筛选方法和诊断测试方法来满足对该生物的医疗需求。
发明概述
本发明涉及BASB132，特别是BASB132多肽和BASB132多核苷酸，以及用于其产生的重组材料和方法。另一方面，本发明涉及这些多肽和多核苷酸的使用方法，其中特别包括微生物性疾病的预防和治疗方法。再一方面，本发明涉及检测与微生物感染有关的疾病和病症的诊断测定方法，如检测BASB132多核苷酸或多肽的表达或活性的测定方法。
通过阅读下文以及本公开内容的其他部分，该领域的技术人员将很容易了解在本发明的精神和范围内的不同变化和改进。
发明详述
本发明涉及BASB132多肽和多核苷酸，下文将对此做更详细的描述。具体地说，本发明涉及粘膜炎莫拉氏菌的BASB132多肽和多核苷酸，其氨基酸序列与大肠杆菌假定外膜蛋白YtfN同源。本发明特别涉及分别具有序列编号：1或3的核苷酸序列以及序列编号：2或4的氨基酸序列的BASB132。应该了解的是，下文“序列表”中列举的“DNA”序列只代表本发明的一项实施方案的一个范例，因为该领域的技术人员都会承认，这些序列一般都能够在多核苷酸，包括多聚核糖核苷酸，中有效地使用。
多肽
一方面，本发明提供文中称为“BASB132”和“BASB132多肽”的粘膜炎莫拉氏菌多肽及其具有生物学、诊断、预防、临床或治疗作用的变异体，以及含有这些多肽的组合物。
本发明还提供：
(a)一种分离的多肽，该多肽含有一段氨基酸序列，该序列与序列编号：2或4的序列具有至少85％的同一性，优选的是至少90％的同一性，更优选的是至少95％的同一性，最优选的是至少97-99％的同一性或完全相同；
(b)一种由分离的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包含一段多核苷酸序列，该序列与序列编号：1或3的全长序列分别具有至少85％的同一性，优选的是至少90％的同一性，更优选的是至少95％的同一性，再更优选的是至少97-99％的同一性或完全相同；或
(c)一种由分离的多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸包含一段可编码一种多肽的多核苷酸序列，该多肽与序列编号：2或4的氨基酸序列具有至少85％的同一性，优选的是至少90％的同一性，更优选的是至少95％的同一性，再更优选的则至少97-99％的同一性或完全相同。
序列编号：2或4提供的BASB132多肽为粘膜炎莫拉氏菌Mc2931菌株(ATCC43617)的BASB132多肽。
本发明还提供BASB132多肽的一种免疫原性片段，即BASB132多肽中与含有序列编号：2或4所示氨基酸序列的多肽具有相同或基本相同的免疫原性的一段连续部分；也就是说，该片段(如果需要，可与一种载体相联接)可诱发一种能够识别BASB132多肽的免疫应答。这种免疫原性片段可包括，例如，缺少N端前导序列和(或)跨膜区和(或)C端锚定区的BASB132多肽。优选地，本发明所述BASB132的该免疫原性片段基本上包含一种多肽的所有细胞外区域，这种多肽与序列编号：2或4的全长序列分别具有至少85％的同一性，优选的是至少90％的同一性，更优选的是至少95％的同一性，最优选的是至少97-99％的同一性。
片段是指一种多肽，该多肽具有一段氨基酸序列，该序列与本发明的任何一种多肽的任意部分氨基酸序列完全相同，但不是与全部氨基酸序列都完全相同。与BASB132多肽一样，片段可以是“独立的”，也可以包含在一种较大的多肽中，从而构成这种较大多肽的一部分或一个区域，最优选的是构成单一较大多肽的一段单一的连续区域。
优选的片段包括，例如，具有序列编号：2或4的一部分氨基酸序列的截断多肽或其变异体，如含有氨基端和(或)羧基端氨基酸序列的连续残基链。优选的片段还包括在宿主细胞内或由宿主细胞产生的本发明所述多肽的降解形式。其他优选片段还包括用结构或功能特性表征的片段，如含有α-螺旋和α-螺旋形成区、β-折叠和β-折叠形成区、转角和转角形成区、卷曲和卷曲形成区、亲水区、疏水区、α两性区、β两性区、挠性区、表面形成区、底物结合区及高抗原指数区的片段。
优选的片段还包括一种分离的多肽，该多肽含有一段至少有15、20、30、40、50或100个连续氨基酸的氨基酸序列，这些连续氨基酸来自序列编号：2或4的氨基酸序列，优选的片段还包括另一种分离的多肽，该多肽含有一段至少有15、20、30、40、50或100个连续氨基酸的氨基酸序列，这些连续氨基酸是由序列编号：2或4的氨基酸序列截断或缺失而来。
本发明所述多肽的片段可通过肽合成方法用来产生相应的全长多肽；因此，这些片段可作为中间体来产生本发明的全长多肽。
特别优选的变异体是以任意组合方式取代、缺失或添加若干个、5-10个、1-5个、1-3个、1-2个或1个氨基酸的变异体。
本发明的多肽，或免疫原性片段，可以是“成熟”蛋白的形式，也可以是一种较大多肽的一部分，如前体或融合蛋白的一部分。通常可添加一种有益的额外氨基酸序列，该序列可含有分泌序列或前导序列、原序列、多组氨酸残基等有助于纯化的序列，或能够在重组生产过程中保持稳定的序列。此外，还可以考虑添加外源多肽，或脂类尾，或多核苷酸序列，以提高最终分子的免疫原性潜力。
一方面，本发明涉及可溶性基因工程融合蛋白，这些融合蛋白含有本发明的多肽或其片段，并含有不同亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链恒定区的不同部分。优选的免疫球蛋白是人类IgG的重链恒定区，特别是IgG1的重链恒定区，并且融合出现在铰链区。在一项特别实施方案中，去除Fc部分的方法只是简单地掺入一种能被凝血因子Xa剪切的酶切序列。
此外，本发明涉及利用基因工程方法制备这些融合蛋白的方法，以及这些融合蛋白在药物筛选、诊断和治疗中的应用。另一方面，本发明涉及编码这些融合蛋白的多核苷酸。有关融合蛋白的技术可参考，例如，国际专利申请WO94/29458和WO94/22914。
可以用化学方法使蛋白结合，也可以作为重组融合蛋白来进行表达，以使表达系统的产量与非融合蛋白相比有所提高。融合配体的作用可以是协助提供辅助T细胞表位(免疫融合配体)，优选的是能被人类识别的辅助T细胞表位，也可以是有助于以高于天然重组蛋白的产量来表达蛋白(表达增强子)。优选的是融合配体既具有免疫融合配体的作用，又具有表达增强配体的作用。
融合配体包括流感嗜血菌的蛋白D和流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。另一种融合配体是被称为LytA的蛋白。优选的是使用该分子的C端部分。Lyta来自肺炎链球菌，该细菌可合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，即LytA酰胺酶，(由lytA基因编码{Gene，43(1986)第265-272页})这是一种可特异性降解肽聚糖骨架中特定化学键的自溶素。LytA蛋白的C端区域与胆碱或DEAE等某些胆碱类似物具有亲和性。这种特性被用来产生可用于融合蛋白表达的大肠杆菌C-LytA表达质粒。氨基端含有C-LytA片段的杂合蛋白的纯化方法已有所描述{Biotechnology：10，(1992)第795-798页)。也可以使用LytA分子中从第178位残基开始的C端重复部分，例如第188-305位残基区域。
本发明还包括上述多肽的变异体，即通过保守氨基酸取代将参照多肽的一种残基取代成另一种性质类似的残基而获得的不同多肽。典型的保守取代是在Ala、Val、Leu和Ile之间；Ser和Thr之间；酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；以及碱性残基Lys和Arg之间；或芳香族残基Phe和Tyr之间进行。
本发明的多肽可采用任何适当的方式来制备。这些多肽包括，分离的天然多肽、重组产生的多肽、合成的多肽，或由这些方法的组合方法产生的多肽。制备这些多肽的方法已为该领域所熟知。
本发明最优选的多肽是来源于粘膜炎莫拉氏菌的多肽，但由分类上处于相同属的其他生物获得的多肽也是优选的。本发明的多肽还可以从，例如，分类上处于相同科或相同目的其他生物获得。
多核苷酸
本发明的目标是提供一种可编码BASB132多肽的多核苷酸，特别是可编码文中指定的BASB132的多核苷酸。
在一项特别优选实施方案中，本发明的多核苷酸含有一段BASB132多肽编码区，该编码区含有序列编号：1或3的一段全长基因序列，或其变异体。
序列编号：1或3的BASB132多核苷酸是来源于粘膜炎莫拉氏菌Mc2931菌株(ATCC43617)的BASB132多核苷酸。
另一方面，本发明提供分离的核酸分子，这些核酸分子可编码和(或)表达BASB132多肽和多核苷酸，特别是粘膜炎莫拉氏菌的BASB132多肽和多核苷酸，其中包括，例如，未加工的RNAs、核酶RNAs、mRNAs、cDNAs、基因组DNAs、B型DNAs和Z型DNAs。本发明的其他实施方案还包括，具有生物学、诊断、预防、临床或治疗作用的多核苷酸和多肽及其变异体和含有这些多核苷酸和(或)多肽的组合物。
另一方面，本发明涉及分离的多核苷酸，该多核苷酸至少包括一个全长基因，并且可编码具有序列编号：2或4所示推导氨基酸序列的BASB132多肽，以及与其密切相关的多核苷酸及其变异体。
在另一项特别优选实施方案中，本发明的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多肽含有或包括序列编号：2或4的氨基酸序列或其变异体。
利用文中提供的信息，如序列编号：1或3所示多核苷酸序列，本发明的编码BASB132多肽的多核苷酸可采用标准的克隆和筛选方法来产生，例如以粘膜炎莫拉氏菌Catlin细胞为原材料将细菌的染色体DNA片段克隆和测序，然后获得全长克隆。举例来说，为了获得本发明的多核苷酸序列，如序列编号：1或3的多核苷酸序列，典型的方法是利用由部分序列获得的放射性标记寡核苷酸，优选的是含有17个或更多核苷酸的寡核苷酸，对大肠杆菌或其他适当宿主中的粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌株染色体DNA克隆库进行探测。然后用严格杂交条件鉴别出带有与探针序列完全相同的DNA的克隆。然后利用由最初的多肽或多核苷酸序列设计出的测序引物对杂交鉴定出的克隆分别测序，这样就可能使多核苷酸序列双向延伸，从而确定全长基因序列。这种测序方法可采用，例如，由质粒克隆制备的双链变性DNA来方便地实现。适当的技术在Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook et al.，分子克隆实验手册，第二版；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)中有所描述。(特别是第1.90节“通过杂交进行筛选”和第13.70节“双链变性DNA模板的测序”)。也可通过基因组DNA的直接测序来获得全长基因序列。需要说明的是，序列编号：1或3的多核苷酸是在粘膜炎莫拉氏菌的DNA库中发现的。
此外，序列编号：1或3的DNA序列均包含一种可读框，可编码大致含有序列编号：2或4的氨基酸残基数量的一种蛋白，该蛋白的推导分子量可利用该领域技术人员熟知的氨基酸残基分子量值来加以计算。
在序列编号：1中，第1位核苷酸的起始密码子与开始于第5017位核苷酸的终止密码子之间的多核苷酸可编码序列编号：2的多肽。
在序列编号：3中，第2042位核苷酸的起始密码子与开始于第5014位核苷酸的终止密码子之间的多核苷酸可编码序列编号：4的多肽。
另一方面，本发明提供一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有或包括：
(a)一段多核苷酸序列，该序列与序列编号：1或3的全长序列分别具有至少85％的同一性，优选的是至少90％的同一性，更优选的是至少95％的同一性，再更优选的是至少97-99％的同一性或完全相同；或
(b)一段多核苷酸序列，该序列可编码一种多肽，该多肽与序列编号：2或4的全长氨基酸序列分别具有至少85％的同一性，优选的是至少90％的同一性，更优选的是至少95％的同一性，再更优选的是至少97-99％的同一性或100％相同。
利用一种方法可获得编码本发明所述多肽的多核苷酸，其中包括由粘膜炎莫拉氏菌以外的物种获得的同源物和直向同源物，该方法包括，在严格杂交条件下(如采用45-65℃的温度和0.1-1％的SDS浓度)用一种含有或包括序列编号：1或3所述序列或其片段的标记探针或可检测探针对适当的库进行筛选；分离出含有所述多核苷酸序列的全长基因克隆和(或)基因组克隆。
本发明提供一种多核苷酸序列，该序列的全长序列与序列编号：1或3的编码序列(可读框)完全相同。本发明还提供一种可编码成熟多肽或其片段的独立序列，以及可编码成熟多肽或其片段并且含有可读框吻合的另一编码序列的序列，另一编码序列可编码，例如，前导序列或分泌序列、前蛋白序列、原蛋白序列或前原蛋白序列。本发明的多核苷酸还可含有至少一种非编码序列，其中包括，例如，至少一种5’和3’非编码序列，如转录但不翻译的序列，终止信号(如rho-依赖性和rho-非依赖性终止信号)、核糖体结合位点、Kozak序列、可保持mRNA稳定的序列、内含子以及多腺苷酸化信号，但不局限于此。多核苷酸序列还可含有编码额外氨基酸的额外编码序列。例如可编码一种有利于融合多肽纯化的标记序列。在本发明的某些实施方案中，该标记序列为Gentz etal，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 86：821-824(1989)描述的由pQE载体(Qiagen，Inc.)提供的六组氨酸肽，或HA肽标记(Wilson et al.，Cell37：767(1984))，这两种标记均可用来纯化与其融合的多肽序列。本发明的多核苷酸还包括，但不局限于，含有一种结构基因以及调控该基因表达的天然相关序列的多核苷酸。
序列编号：2或4所述BASB132多肽的核苷酸编码序列可分别与序列编号：1中第1-5016位核苷酸包含的多肽编码序列或序列编号：3中第1-5016位核苷酸包含的多肽编码序列完全相同。作为选择，也可以是由于遗传密码冗余(简并性)而同样编码序列编号：2或4所述多肽的序列。
文中使用的术语“编码多肽的多核苷酸”包括那些含有一种序列的多核苷酸，该序列可编码本发明的多肽，特别是细菌多肽，更明确地说是具有序列编号：2或4所示氨基酸序列的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多肽。该术语还包括那些含有连续或不连续的单一区域以及附加区域的多核苷酸(例如，被整合噬菌体、整合插入序列、整合载体序列、整合转座子序列打断的多核苷酸，或由于RNA编辑或基因组DNA重排而被打断的多核苷酸)，其中，单一区域可编码本发明的多肽，附加区域也可以含有编码序列和(或)非编码序列。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，这些变异体可编码一种具有序列编号：2或4所述推导氨基酸序列的多肽的变异体。本发明所述多核苷酸的片段可用来，例如，合成本发明的全长多核苷酸。
其他的特别优选实施方案还包括可编码BASB132变异体的多核苷酸，这些变异体具有序列编号：2或4所述BASB132多肽的氨基酸序列，并且以任意组合方式取代、修饰、缺失和(或)添加若干个、几个、5-10个、1-5个、1-3个、2个、1个或0个氨基酸残基。其中，特别优选的是不改变BASB132多肽的特性和活性的沉寂取代、添加和缺失。
本发明的其他优选实施方案还包括一些多核苷酸及其互补多核苷酸，这些多核苷酸的全长序列与具有序列编号：2或4所述氨基酸序列的BASB132多肽的编码多核苷酸至少有85％同一性。作为选择，最优选的是含有一种区域的多核苷酸及其互补多核苷酸，该区域的全长序列与编码BASB132多肽的多核苷酸至少有90％的同一性。由此来看，特别优选的多核苷酸的全长序列与编码BASB132多肽的多核苷酸至少有95％的同一性。而在至少有95％的同一性的多核苷酸中，高度优选的是至少有97％的同一性的多核苷酸，其中，特别高度优选的是至少有98％的同一性和至少有99％的同一性的多核苷酸，而更优选的是至少有99％的同一性的多核苷酸。
优选的实施方案是可编码一些多肽的多核苷酸，这些多肽可保持与序列编号：1或3所述DNA编码的成熟多肽基本相同的生物功能或活性。
本发明的某些优选实施方案提供一些多核苷酸，这些多核苷酸能够与BASB132多核苷酸序列杂交，明确地说，是在严格条件下杂交，如序列编号：1或3的多核苷酸。
本发明还涉及一些能够与文中提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。因此，本发明特别涉及一些能够在严格条件下与文中提供的多核苷酸序列杂交的多核苷酸。文中使用的术语“严格条件”和“严格杂交条件”的含义是，只有在序列间至少有95％的同一性的条件下才发生杂交，优选的是至少有97％的同一性的条件下才发生杂交。严格杂交条件的具体实例是，在含有：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt’s溶液、10％硫酸葡聚糖和20微克/ml剪切的变性鲑鱼精DNA的溶液中42℃保温过夜，然后在约65℃的0.1×SSC中清洗杂交支持物。
杂交和清洗条件已众所周知，其实例可参考Sambrook，et al.，分子克隆实验手册，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)，特别是其中的第11章。利用本发明的多核苷酸序列还可以进行溶液杂交。
本发明还提供一种多核苷酸，该多核苷酸含有或包括一种多核苷酸序列，该序列的获得方法是在严格杂交条件下用含有序列编号：1或3所述多核苷酸序列或其片段的探针对含有序列编号：1或3所述多核苷酸序列的完整基因的适当库进行筛选；然后分离出所述多核苷酸序列。可用来获得这种多核苷酸的片段包括，例如，文中其他地方详细描述的探针和引物。
举例来说，按照文中有关本发明的多核苷酸测定方法的描述，本发明的多核苷酸可作为RNA、cDNA和基因组DNA的杂交探针用来分离编码BASB132的全长cDNA和基因组克隆，并且可用来分离与BASB132基因具有高度同一性的其他基因的cDNA和基因组克隆，特别是与BASB132基因具有高度序列同一性的其他基因的cDNA和基因组克隆。这些探针一般含有至少15个核苷酸残基或碱基对。优选的是含有至少30个核苷酸残基或碱基对，也可以含有至少50个核苷酸残基或碱基对。特别优选的是含有至少20个但又少于30个核苷酸残基或碱基对的探针。
为了合成寡核苷酸探针，可通过筛选方法用序列编号：1或3的DNA序列分离出BASB132基因的一段编码区。然后用含有与本发明所述基因互补的序列的标记寡核苷酸来筛选cDNA库、基因组DNA库或mRNA库，以确定与探针杂交的库成分。
有几种该领域技术人员熟知的方法可用来获得全长DNAs或延伸短DNAs，例如基于cDNA末端快速扩增(RACE)的方法(可参考，例如，Frohman，et al.，PNAS USA 85：8998-9002，1988)。近期的改进技术，例如MarathonTM技术(Clontech Laboratories Inc.)，能够显著简化对较长cDNAs的搜索。MarathonTM技术是利用由选定组织提取的mRNA制备cDNAs并将“衔接”序列连接在每个末端上。然后用基因特异性和衔接序列特异性寡核苷酸引物的组合进行核酸扩增(PCR)，以扩增出DNA中“丢失的”5’末端。然后用“嵌套”引物，即设计成可与扩增产物退火的引物(通常是能够与衔接序列的其他3’区退火的一个衔接序列特异性引物和能够与选定基因序列的其他5’区退火的一个基因特异性引物)，重复PCR反应。然后对该反应的产物进行DNA测序分析，再将产物直接与已有的DNA连接而产生完整序列，或利用新序列信息设计出5’引物再进行一次单独的全长PCR，由此构建出全长DNA。
按照文中有关本发明的多核苷酸测定方法的描述，可将本发明的多核苷酸和多肽作为研究试剂和研究材料用来，例如，探索疾病的治疗和诊断方法，尤其是人类的疾病。
在本发明的多核苷酸中，来源于序列编号：1或3所述序列的寡核苷酸可在文中描述的方法中使用，但优选的是用于PCR，以确定感染组织内的细菌是否转录完整的或部分的本文所述多核苷酸。应该了解的是，这些序列还可用来诊断病原体所处的感染期和感染类型。
本发明还提供可编码一种多肽的多核苷酸，该多肽为成熟蛋白加上氨基端的或羧基端的或成熟多肽内部的额外氨基酸(例如当成熟形式具有一条以上的多肽链时)。这些序列可以在蛋白由前体变为成熟形式的加工过程中起一定的作用，也可以用于蛋白运输，或是延长或缩短蛋白的半寿期，或是有利于测定或产生蛋白的操作，等等。额外氨基酸可以象体内的通常情况那样由细胞酶去除，以产生成熟蛋白。
本发明还提供所述各种多核苷酸的互补多核苷酸。优选的是这些互补多核苷酸与各自的多核苷酸完全互补。
一种或多种原序列与成熟多肽融合成的前体蛋白可以是非活性的状态。这些非活性前体在原序列被去除后一般会活化。在活化前可以将部分或所有原序列去除。这些前体通常称为蛋白原。
除利用常规的A、G、C、T/U来表示核苷酸外，还可利用术语“N”来描述本发明的某些多核苷酸。“N”的含义是，在DNA或RNA序列的该指定位置可以是四种DNA核苷酸或RNA核苷酸中的任意一种，优选的是不出现下述情况，即按照正确可读框读码时，N与邻近核苷酸的组合可导致该可读框过早产生终止密码子。
总之，由本发明所述多核苷酸编码的蛋白可以是成熟蛋白、成熟蛋白加前导序列(可称为前蛋白)、含有非前蛋白前导序列的一种或多种原序列的成熟蛋白前体、或前蛋白原，即含有一种前导序列和一种或多种原序列的蛋白原前体，这些序列通常在产生活性多肽和成熟多肽的加工过程中被去除。
一方面，本发明提供所述多核苷酸的治疗或预防性应用，特别是用于遗传免疫。
将本发明所述多核苷酸应用于遗传免疫时，优选的是采用一种适当的递送方法，例如直接把质粒DNA注射到肌肉中(Wolff et al.，Hum MolGenet(1992)1：363；Manthorpe et al.，Hum.Gene Ther.(1983)4：419)、递送与特定蛋白载体复合的DNA(Wu et al.，J Biol Chem.(1989)264：16985)、DNA与磷酸钙共沉淀(Benvenisty & Reshef，PNAS USA，(1986)83：9551)、将DNA封装在不同形式的脂质体中(Kaneda et al.，Science(1989)243：375)、颗粒轰击(Tang et al.，Nature(1992)356：152，Eisenbraun et al.，DNA Cell Biol(1993)12：791)以及用克隆化逆转录病毒载体进行体内感染(Seeger et al.，PNAS USA(1984)81：5849)。
载体、宿主细胞、表达系统
本发明还涉及含有本发明的一种或多种多核苷酸的载体、用本发明的载体改造的基因工程宿主细胞，以及由重组技术产生本发明所述多肽的方法。也可采用无细胞翻译系统，利用由本发明所述DNA构建体获得的RNAs产生这些蛋白。
本发明的重组多肽可采用该领域技术人员所熟知的方法，由包含表达系统的基因工程宿主细胞来加以制备。因此，另一方面，本发明涉及含有本发明的一种或多种多核苷酸的表达系统、含有这些表达系统的基因工程宿主细胞，以及由重组技术产生本发明所述多肽的方法。
在利用重组方法产生本发明的多肽时，可对宿主细胞进行基因工程改造，以掺入表达系统或其部分或本发明的多核苷酸。将多核苷酸引入宿主细胞可采用Davis，et al.，分子生物学基本方法，(1986)和Sambrooket al.，分子克隆实验手册，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)等常规实验手册中描述的方法，如磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、显微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、摩擦引入、冲击引入和感染。
适当宿主的代表性实例包括，细菌细胞，如链球菌、葡萄球菌、肠球菌、大肠杆菌、链霉菌、蓝细菌、枯草芽孢杆菌、脑膜炎奈瑟菌和粘膜炎莫拉氏菌；真菌细胞，如酵母菌、克鲁维酵母、酵母属、担子菌、白色念珠菌和曲霉菌；昆虫细胞，如果蝇S2细胞和秋粘虫Sf9细胞；动物细胞，如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293、CV-1和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞，如裸子植物或被子植物的细胞。
有很多种表达系统可用来产生本发明的多肽。这些载体尤其包括来源于染色体、游离基因或病毒的载体，例如，来源于细菌质粒、噬菌体、转座子、酵母游离基因、插入元件、酵母染色体元件的载体、来源于诸如杆状病毒、乳头多瘤空泡病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、鸡痘病毒、假狂犬病病毒、小核糖核酸病毒、逆转录病毒和甲病毒等病毒的载体，以及来源于其组合物的载体，如粘粒和噬菌粒等来源于质粒与噬菌体遗传因子的载体。表达系统构建体可含有能够引发并调控表达的调控区。一般而言，能够维持、增殖或表达多核苷酸并且(或者)在宿主内表达多肽的任何适当系统或载体均可用于该表达。将适当DNA序列插入表达系统的方法可采用多种众所周知的常规技术中的任何一种，如Sambrooket al.，分子克隆实验手册，(见上文)中描述的技术。
在真核细胞的重组表达系统中，可将适当的分泌信号掺入到表达的多肽内，以使翻译的蛋白能够分泌到内质网腔、外周质间隙或细胞外环境中。这些信号可以是多肽的内源性信号，也可以是外源性信号。
由重组细胞培养物回收和纯化本发明所述多肽的方法已众所周知，其中包括硫酸铵或乙醇沉淀法、酸抽提法、阴离子或阳离子交换层析法、磷酸纤维素层析法、疏水相互作用层析法、亲和层析法、羟磷灰石层析法和外源凝集素层析法。最优选的是用金属离子亲和层析法(IMAC)来进行纯化。若多肽在胞内合成、分离和(或)纯化的过程中变性，可利用众所周知的蛋白重折叠技术来产生活性构象。
表达系统也可以是病毒或细菌等活体重组微生物。可将目的基因插入到活体重组病毒或细菌的基因组中。用这种活体载体进行接种或体内感染会使抗原在体内表达，并且可诱导免疫应答。可用于此目的的病毒和细菌包括，例如，痘病毒(如痘苗病毒、鸡痘病毒、金丝雀痘病毒)、甲病毒(辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内端拉马脑脊髓炎病毒)、腺病毒、腺相关病毒、小核糖核酸病毒(脊髓灰质炎病毒、鼻病毒)、疱疹病毒(水痘带状疱疹病毒等)、李斯特杆菌、沙门菌、志贺氏菌、卡介菌。这些病毒和细菌可以是毒性的，为了获得活体疫苗，也可以使用由不同方式减毒的病毒和细菌。这些活体疫苗也构成本发明的一部分。
诊断、预防、血清型及突变测定
本发明还涉及本发明所述BASB132多核苷酸及多肽在作为诊断试剂方面的应用。在真核细胞中，特别是哺乳动物细胞，尤其是人类细胞中，检测BASB132多核苷酸和(或)多肽可作为诊断疾病、病期或被感染生物对药物的反应的一种方法。利用众所周知的技术以及文中提供的方法，可以在核酸或氨基酸水平上来检测真核细胞，特别是哺乳动物，尤其是人类，特别是被含有BASB132基因或蛋白的生物感染的人或怀疑被感染的人。
用于预后、诊断或其他分析的多肽和多核苷酸可由怀疑被感染的个体和(或)感染个体的身体材料获得。由任意的这些来源获得的多核苷酸，特别是DNA或RNA，可直接用于检测，也可以在分析前先用酶学方法由PCR或其他任何扩增技术进行扩增。RNA，特别是mRNA，以及cDNA和基因组DNA也可同样使用。对生物的选定多核苷酸进行扩增和基因型分析，由此可鉴定个体中存在的感染性或定居生物的物种和品系。将扩增产物与选自相关生物的参考序列基因型进行比较，优选的是与选自同属不同种或同种不同株系的生物的参考序列基因型进行比较，由其尺寸的变化可检测缺失和插入。将扩增的DNA与标记的BASB132多核苷酸序列杂交，由此可检测点突变。分别用DNase或RNase对DNA或RNA进行消化，或是检测解链温度或复性动力学的差异，由此可以从不完全匹配甚至明显错配的双螺旋体中鉴别出完全匹配或明显匹配的序列。将多核苷酸片段在凝胶中的电泳迁移率与参考序列进行比较，由其变化可同样检测出多核苷酸序列的差异。这种检测方法可使用变性剂，也可以不使用变性剂。直接对DNA或RNA测序也可以检测多核苷酸的差异。可参考，例如，Myers et al.，Science，230：1242(1985)。利用核酸酶保护测定法，如RNase、V1及S1保护测定法，或化学裂解法还可以检测特定部位的序列变化。可参考，例如，Cotton et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：4397-4401(1985)。
在另一项实施方案中，可将含有BASB132核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针排成阵列，以有效地筛选，例如，基因突变、血清型、系统分类或鉴定。有关阵列技术的方法已众所周知，这些方法具有广泛的适用性，可用来解决多种分子遗传学问题，其中包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(可参考，例如，Chee et al.，Science，274：610(1996))。
另一方面，本发明涉及一种诊断试剂盒，该试剂盒含有：
(a)本发明的一种多核苷酸，优选的是序列编号：1或3的核苷酸序列，或其片段；
(b)与(a)互补的核苷酸序列；
(c)本发明的一种多肽，优选的是序列编号：2或4的多肽，或其片段；或
(d)抗本发明所述多肽的一种抗体，优选的是抗序列编号：2或4的多肽。
应该了解的是，所有这些试剂盒中的(a)、(b)、(c)或(d)均可以包含一种基本成分。这种试剂盒尤其适用于疾病或疾病易感性的诊断。
本发明还涉及所述多核苷酸在作为诊断试剂方面的应用。对本发明中与疾病或致病性相关的多核苷酸的突变形式进行检测的方法，优选的是对序列编号：1或3所示多核苷酸的突变形式进行检测的方法，可作为一种诊断工具，该方法可以由这种多核苷酸的低表达、过表达或表达水平变化的结果来对疾病诊断、病程预后、病期或疾病易感性判定进行补充或说明。有多种技术，如文中描述的方法，可以在多核苷酸水平上检测所述多核苷酸中含有突变的生物，特别是感染性生物。
还可以用多种技术对本发明所述多核苷酸和(或)多肽中含有突变或多态性(等位变异)的生物细胞进行检测，由此为，例如，血清分型做准备。举例来说，RT-PCR方法可检测RNA中的突变。特别优选的是将RT-PCR方法与诸如GeneScan等自动检测系统结合使用。为此也可以在PCR中使用RNA、cDNA或基因组DNA。例如，可利用与BASB132多肽的编码多核苷酸互补的PCR引物来对突变进行鉴定和分析。
本发明还提供5’和(或)3’端被去除1、2、3或4个核苷酸的引物。这些引物尤其适用于扩增那些由个体的样品，如身体材料，分离的BASB132 DNA和(或)RNA。这些引物可用来扩增那些分离自感染个体的多核苷酸，继而可通过不同的技术来阐明该多核苷酸的序列。这样就可以检测该多核苷酸序列中的突变，并可将其用于感染、感染期或感染过程的诊断和(或)预后，或用于感染物的血清分型和(或)分类。
本发明还提供一种方法，用于诊断疾病，优选的是细菌性感染，更优选的是由粘膜炎莫拉氏菌引起的感染，该方法包括，测定具有序列编号：1或3所述序列的多核苷酸在个体的样品，如身体材料，中的表达水平是否提高。BASB132多核苷酸的表达增加或降低情况可以用该领域熟知的任何一种多核苷酸定量方法来检测，如扩增、PCR、RT-PCR、RNase保护、RNA印迹、光谱测定和其他杂交方法。
此外，本发明的诊断测定法可检测BASB132多肽相对于正常对照组织样品的过表达，该方法可检测，例如，是否存在一种感染。可检测宿主样品，如身体材料，中的BASB132多肽含量的测定技术已为该领域技术人员所熟知。这些测定方法包括，放射免疫测定法、竞争性结合测定法、蛋白印迹分析法、抗体夹层测定法、抗体检测法和ELISA测定法。
本发明的多核苷酸可用作多核苷酸阵列的成分，优选的是用于高密度阵列或网格。这些高密度阵列特别适用于诊断和预后。举例来说，可利用各含有不同基因并且另含有本发明的一种或多种多核苷酸的一组点来进行探查，如利用一种来自身体样品的探针进行杂交或核酸扩增，以确定个体中是否存在特定的多核苷酸序列或相关序列。如果存在，则表明存在病原体，特别是存在粘膜炎莫拉氏菌，这种方法适用于疾病或病程的诊断和(或)预后。优选的网格可含有序列编号：1或3所述多核苷酸序列的多种变异体。含有一种多核苷酸序列的多种变异体的网格也同样优选，这种多核苷酸序列可编码序列编号：2或4的多肽序列。
抗体
本发明的多肽和多核苷酸，或其变异体，或表达这些多肽和多核苷酸的细胞可作为免疫原用来产生分别对这些多肽或多核苷酸具有免疫特异性的抗体。术语“免疫特异性”的含义是，这些抗体对本发明所述多肽的亲和力基本上高于对先有技术中其他相关多肽的亲和力。
在某些优选实施方案中，本发明提供抗BASB132多肽或多核苷酸的抗体。
产生抗本发明所述多肽或多核苷酸的抗体的方法是，利用常规方案将本发明的多肽和(或)多核苷酸，或二者或二者之一的带有表位的片段，或二者或二者之一的类似物，或表达二者或二者之一的细胞，向动物给药，优选的是向非人类的动物给药。单克隆抗体的制备可采用该领域已知的任何能够由连续细胞系培养物产生抗体的技术。其实例包括多种技术，例如Kohler，G.and Milstein，C.，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor et al.，Immunology Today 4：72(1983)；《单克隆抗体与癌症治疗》，Alan R.Liss，Inc.(1985)的Cole et al.，第77-96页中描述的技术。
可采用单链抗体生产技术(美国专利号4,946,778)来产生抗本发明所述多肽或多核苷酸的单链抗体。也可利用转基因小鼠或其他生物或动物，如其他哺乳动物，来表达对本发明所述多肽或多核苷酸具有免疫特异性的人源化抗体。
作为选择，也可以用噬菌体展示技术来筛选与本发明所述多肽具有结合活性的抗体基因，筛选可以在具有抗BASB132特性的人淋巴细胞的PCR扩增v-基因库中进行，也可以在天然库中进行(McCafferty et al.，(1990)Nature 348，552-554；Marks，et al.，(1992)Biotechnology 10，779-783)。还可以通过，例如，链改组方法来提高这些抗体的亲和力(Clackson et al.，(1991)Nature 352：628)。
上述抗体可用来分离或鉴定那些可表达本发明所述多肽或多核苷酸的克隆，从而通过，例如，亲和层析来纯化这些多肽或多核苷酸。
因此，抗BASB132多肽或BASB132多核苷酸的抗体尤其可用来治疗感染，特别是细菌性感染。
在抗原性、表位或免疫学方面等价的多肽变异体构成本发明的一个特别方面。
优选的是对抗体或其变异体进行修饰，使其在个体中的免疫原性降低。举例来说，若个体为人类，则最优选的是将抗体“人源化”，例如可按照Jone et al.(1986)Nature 321，522-525或Tempest et al.，(1991)Biotechnology 9，266-273所述，将来源于杂交瘤的抗体的互补决定区移植到人单克隆抗体中。
拮抗剂和激动剂——测定和分子
本发明的多肽和多核苷酸还可用来评定，例如，细胞、无细胞制剂、化学库和天然产物混合物中的小分子底物与配体的结合。这些底物和配体可以是天然的，也可以是结构或功能模拟物。可参考，例如，Coligan etal.，Current Protocols in Immunology 1(2)：第5章(1991)。
筛选方法可以是，通过与候选化合物直接或间接相连的标记，简单地测量该候选化合物与多肽或多核苷酸、带有多肽或多核苷酸的细胞或膜、或多肽的融合蛋白的结合。作为选择，筛选方法也可涉及与标记竞争物的竞争。此外，还可通过这些筛选方法，利用适合于含有本发明所述多肽或多核苷酸的细胞的检测系统，来测试候选化合物能否随多肽或多核苷酸的活化或抑制而产生一种信号。一般而言，在含有已知激动剂的情况下可测定活化的抑制剂，而在含有候选化合物的情况下可测定激动剂对活化作用的影响。在不含有激动剂或抑制剂时，可利用组成型活性多肽和(或)组成型表达的多肽和多核苷酸来筛选反向激动剂或抑制剂，方法是测试候选化合物能否对多肽或多核苷酸的活化产生抑制作用，其结果需视情况而定。此外，该筛选方法的步骤可简单地包括，将候选化合物与含有本发明所述多肽或多核苷酸的一种溶液相混合，以形成一种混合物，测量混合物中BASB132多肽和(或)多核苷酸的活性，并将测量结果与标准值进行比较。还可利用上文所述的融合蛋白，例如Fc部分与BASB132多肽的融合蛋白，来进行高通量的筛选测定，以鉴别本发明所述多肽的拮抗剂以及系统发生相关多肽或功能相关多肽的拮抗剂(参考D.Bennett et al.，J Mol Recognition，8：52-58(1995)；和K.Johanson et al.，J Biol Chem，270(16)：9459-9471(1995))。
还可利用本发明的多核苷酸、多肽以及能够与本发明所述多肽结合和(或)相互作用的抗体来设计筛选方法，以检测添加的化合物对细胞产生mRNA和(或)多肽的影响。例如可设计一种ELISA测定方法，用于通过该领域已知的标准方法由单克隆抗体和多克隆抗体对多肽分泌水平或细胞结合水平进行测量。该方法可用于从适当处理的细胞或组织中发现一些可抑制或提高多肽产量的作用剂(分别称为拮抗剂或激动剂)。
本发明还提供一种筛选化合物的方法，用于鉴别那些可提高(激动剂)或阻断(拮抗剂)BASB132多肽或多核苷酸的功能的化合物，特别是抑菌性和(或)杀菌性化合物。该筛选方法可涉及高通量技术。举例来说，为了筛选激动剂或拮抗剂，可在不含或含有候选分子的情况下，即不含或含有BASB132的可能激动剂或拮抗剂的情况下，将含有BASB132多肽及其标记底物或标记配体的合成反应混合物、细胞间隔，如细胞膜、细胞被膜或细胞壁，或其制剂进行保温。标记配体的结合量下降情况或标记底物的产物的产量下降情况可反映出候选分子促进或拮抗BASB132多肽的能力。最可能的优良拮抗剂是能够无偿结合的分子，也就是在不影响BASB132多肽情况下发生结合的分子。能够良好结合并且，例如，提高底物生成产物的速率、加强信号转导，或提高化学通道活性的分子为激动剂。利用报告系统可促进对，例如，底物生成产物的速率、信号转导水平或化学通道活性水平的检测。可用于此方面的报告系统包括，但不局限于，该领域已知的比色法、测定标记底物向产物的转化、可反映BASB132多核苷酸或多肽活性变化的报告基因，以及结合测定法。
测定BASB132激动剂的另一实例为竞争性测定法，该方法是在适当条件下将BASB132和一种潜在的激动剂与能够结合BASB132或重组BASB132的分子、天然底物或配体，或底物模拟物或配体模拟物相混合，并进行竞争性抑制测定。可以用放射性或比色分析化合物等将BASB132标记，以便精确测量与结合分子结合的或转化成产物的BASB132分子的数量，由此来评定潜在拮抗剂的效力。
潜在的拮抗剂包括，例如，能够与本发明的多核苷酸和(或)多肽结合从而抑制或消除其活性或表达的有机小分子、肽、多肽和抗体。潜在的拮抗剂还包括，能够与结合分子的相同位点结合但不产生由BASB132诱导的活性的有机小分子、肽、多肽如密切相关的蛋白，或抗体，它们使BASB132多肽和(或)多核苷酸不能进行结合，由此阻碍其功能或表达。
潜在的拮抗剂还包括一种小分子，这种小分子可结合并占据多肽结合位点，从而阻碍其与细胞结合分子结合，继而阻碍正常生物学活性。这些小分子的实例包括，但不局限于，有机小分子、肽或肽样分子。其他潜在的拮抗剂还包括反义分子(有关这些分子的描述可参考Okano，JNeurochem.56：560(1991)；利用寡脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。优选的潜在拮抗剂包括，与BASB132及其变异体相关的化合物。
另一方面，本发明涉及可溶性基因工程融合蛋白，这些融合蛋白含有本发明的多肽或其片段，并含有不同亚类免疫球蛋白(IgG、IgM、IgA、IgE)的重链或轻链恒定区的不同部分。优选的免疫球蛋白是人类IgG的重链恒定区，特别是IgG1的重链恒定区，并且融合出现在铰链区。在一项特别实施方案中，去除Fc部分的方法只是简单地掺入一种能被凝血因子Xa剪切的酶切序列。此外，本发明还涉及通过基因工程方法制备这些融合蛋白的方法，以及这些融合蛋白在药物筛选、诊断和治疗中的应用。另一方面，本发明涉及编码这些融合蛋白的多核苷酸。有关融合蛋白技术的实例可参考国际专利申请WO94/29458和WO94/22914。
文中提供的每种多核苷酸序列都可用来开发和研制抗菌性化合物。这些多核苷酸被表达后，其编码的蛋白可作为标的物用于抗菌药物的筛选。此外，还可利用编码这些蛋白的氨基端区域的多核苷酸序列，或编码相应mRNA的Shine-Delgarno序列或其他促翻译序列的多核苷酸序列来构建反义序列，以调控目的编码序列的表达。
本发明还提供所述多肽、多核苷酸、激动剂或拮抗剂的一种应用，即用来干扰一种或多种病原体与导致感染后遗症的真核宿主之间的最初物理相互作用，优选的是与哺乳动物宿主之间的最初物理相互作用。详细地说，本发明的这些分子可用来：阻碍细菌，特别是革兰氏阳性菌和(或)革兰氏阴性菌，粘附于留置装置上或伤口内的真核细胞外基质蛋白，优选的是哺乳动物细胞外基质蛋白；阻断真核细胞外基质蛋白，特别是哺乳动物细胞外基质蛋白，与介导组织损伤的细菌BASB132蛋白之间的细菌性吸附；以及(或者)阻断感染的正常发病进程，这些感染由留置装置移植或其他外科技术以外的因素引起。
再一方面，本发明提供BASB132的激动剂和拮抗剂，优选的是抑菌性或杀菌性激动剂和拮抗剂。
本发明的拮抗剂和激动剂可用于，例如，疾病的预防、抑制和(或)治疗。
另一方面，本发明涉及本发明所述多肽的拟表位(mimotope)。拟表位是指与天然肽(在序列或结构上)非常相似的一种肽序列，它可被能够识别天然肽的抗体所识别；或可诱发出一些抗体，这些抗体与适当载体结合后可识别天然的肽。
通过特定氨基酸的添加、缺失或取代可设计出用于特定目的的肽拟表位。因此，可以对肽进行，使其便于与一种蛋白载体结合。例如，对一些化学结合方法而言，希望在肽的末端引入一个半胱氨酸。而对与蛋白载体结合的肽而言，希望在肽的结合端的远端引入一种疏水末端，使该肽的未结合游离末端能与载体蛋白表面保持结合。这样就可获得在构象上与完整天然肽分子最为接近的肽。举例来说，可以对肽进行改造，使其具有一个N-端半胱氨酸和一种疏水的C-端酰胺化尾。作为选择，也可以添加或取代成一个或多个D-型氨基酸异构体，以产生有利的衍生物，例如可提高肽的稳定性的衍生物。
作为选择，还可通过噬菌体展示等技术(EP0552267B1)，用自身能够与本发明的多肽结合的抗体来鉴别肽拟表位。利用该技术可产生大量能够模拟天然肽结构、从而能够与抗-天然肽的抗体结合的肽序列，但这些肽序列本身不一定与天然多肽有明显的序列同源性。
疫苗
另一方面，本发明涉及一种方法，用于在个体中，特别是在哺乳动物中，优选的是在人体中，诱导一种免疫应答，该方法包括，用足以产生抗体和(或)T细胞免疫应答的BASB132多核苷酸和(或)多肽或其片段或变异体对个体进行接种，以保护该个体不受感染，特别是不受细菌性感染，最明确地说是不受粘膜炎莫拉氏菌感染。另外还提供通过这种免疫应答来延缓细菌复制的方法。再一方面，本发明还涉及一种在个体中诱导免疫应答的方法，该方法包括，用一种可指导BASB132多核苷酸和(或)多肽或其片段或变异体表达的核酸载体、核酸序列或核酶向所述个体给药，使BASB132多核苷酸和(或)多肽或其片段或变异体能够在体内表达，以便诱导一种免疫应答，如抗体免疫应答和(或)T细胞免疫应答，其中包括，例如，产细胞因子T细胞或细胞毒性T细胞，从而无论该个体是否已形成该疾病，都可以保护该个体免得疾病，优选的是保护人类免得疾病。基因给药方法的实例是将基因作为颗粒的包被或以其他方式快速轰击到目的细胞内。所述核酸载体包括DNA、RNA、核酶、修饰的核酸、DNA/RNA杂合体、DNA-蛋白复合物或RNA-蛋白复合物。
另一方面，本发明涉及一种免疫组合物，该组合物被引入一种能够在体内产生免疫应答的个体时，优选的是被引入人体时，可在该个体内诱导一种抗BASB132多核苷酸和(或)其编码的多肽的免疫应答，其中该组合物含有一种重组BASB132多核苷酸和(或)其编码的多肽，以及(或者)可编码或表达该BASB132多核苷酸、其编码的多肽，或本发明的其他多肽抗原的DNA和(或)RNA。这种免疫应答可用于治疗和预防，并且可采用抗体免疫和(或)细胞免疫的形式，例如由CTL或CD4+T细胞产生的细胞免疫。
BASB132多肽或其片段可以与辅助蛋白或化学半分子(moiety)相融合，这些辅助蛋白或化学半分子可以自身产生抗体，也可以自身不产生抗体，它们可稳定第一蛋白，并且可产生一种具有抗原性和(或)免疫原性的融合或修饰蛋白，优选的是产生一种具有保护特性的融合或修饰蛋白。优选的是这种融合重组蛋白另含有一种抗原性辅助蛋白，如来源于流感嗜血菌的脂蛋白D、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)或β-半乳糖苷酶，或其他任何能够稳定蛋白并利于其产生和纯化的较大的辅助蛋白。此外，辅助蛋白可以对接受该蛋白的生物的免疫系统进行广泛刺激，因而可作为一种佐剂。辅助蛋白可以联接在第一蛋白的氨基端或羧基端。
在本发明的疫苗组合物中，BASB132多肽和(或)多核苷酸、或其片段或拟表位或变异体可以由一种载体来提供，如上文描述的活细菌载体等活体重组载体。
BASB132多肽也可使用适当的非活体载体，例如细菌的外膜小泡或“大泡”。OM大泡来源于革兰氏阴性菌双层膜的外膜，据资料显示，OM大泡在多种革兰氏阴性菌中都存在(Zhou，L et al.1998.FEMSMicrobiol.Lett.163：223-228)，其中包括沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体。据报道，可产生大泡的部分细菌变异体包括：百日咳博德特氏菌、博氏疏螺旋体、马尔他布氏杆菌、绵羊布氏杆菌、大肠杆菌、流感嗜血菌、嗜肺军团菌、粘膜炎莫拉氏菌、淋病奈瑟球菌、脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌和小肠结肠炎耶尔森菌。
大泡的优点是能提供天然构象的外膜蛋白，因而特别适用于疫苗。在疫苗应用方面，还可以对大泡进行改良，方法是对细菌进行改造，以改变外膜的一种或多种分子的表达。举例来说，利用这种方法可引入BASB132多肽等所需免疫原性蛋白或对其表达进行增量调节(如改变启动子)。另外，还可以对无关外膜分子(如非保护性抗原或可变的优势免疫蛋白)或有害外膜分子(如LPS等毒性分子或潜在的自身免疫应答诱导剂)的表达进行减量调节。这些方法将在下文做更详细地描述。
BASB132基因的非编码侧翼区含有对该基因表达十分重要的调控元件。这种调控可以在转录和翻译水平上进行。这些区域无论处在基因可读框的上游还是下游，都可通过DNA测序来获得其序列。该序列信息能用来确定可能的调控基元，如不同的启动子元件、终止子序列、可诱导序列元件、阻抑物、负责相变异的元件、SD序列、具有潜在二级结构并参与调控的区域，以及其他类型的调控基元或序列。该序列构成本发明的另一方面。
该序列信息可用来调变BASB132基因的天然表达。基因表达的增量调节可通过改变启动子、SD序列、潜在的阻抑物或操纵子序列或其他任何有关元件来实现。也可通过类似的修饰来实现对表达的减量调节。作为选择，也可以改变相变异序列，使基因表达受相变异的调控或是脱离这种调控。另一方法是用一种或多种能够实现受控表达的可诱导元件来控制基因的表达。这种调控的实例包括，但不局限于，用温度的改变进行诱导、添加诱导剂底物，如选定的糖类或其衍生物、微量元素、维生素、辅助因子、金属离子，等等。
有几种不同的方法可用来引入上述修饰。对参与基因表达的序列进行修饰的体内实现方法是，进行随机诱变，然后筛选预期表型。另一种方法的步骤包括，分离出目的区域，并通过随机诱变或定点取代、插入或缺失诱变对其进行修饰。然后用同源重组方法将修饰区域重新引入细菌基因组，并评定对基因表达的影响。另一种方法是，根据目的区域的序列信息，将所有或部分天然调控序列替换或去除。这种方法需要分离出靶调控区并进行修饰，使其含有另一种基因的调控元件、来自不同基因的组合调控元件、合成调控区或其他任何调控区，或将其野生型调控序列的选定部分去除。然后用同源重组方法将这些修饰序列重新引入细菌基因组。可用于对基因表达进行增量调节的部分优选启动子包括，来源于脑膜炎奈瑟菌或淋病奈瑟球菌的启动子porA、porB、lbpB、tbpB、p110、1st、hpuAB；ompCD、copB、lbpB、ompE、UspA1；UspA2；来源于粘膜炎莫拉氏菌的TbpB；来源于流感嗜血菌的p1、p2、p4、p5、p6、lpD、tbpB、D15、Hia、Hmw1、Hmw2。
在一项实施例中，基因表达的调变可通过将其启动子与一种强启动子互换的方法来实现(包括分离该基因的上游序列，对该序列进行体外修饰，并用同源重组方法将其重新引入基因组)。在细菌及细菌脱落(或产生)的外膜小泡中均可以实现对表达的增量调节。
其他实施例中描述的方法可用来产生一些重组细菌菌株，这些重组细菌菌株的特性更适合于疫苗应用。这些菌株包括，但不局限于，减毒菌株、选定抗原的表达水平增强的菌株、干扰免疫应答的基因被敲除(或表达水平降低)的菌株、优势免疫蛋白的表达被调变的菌株、外膜小泡的脱落被调变的菌株。
因此，本发明还提供一种修饰的BASB132基因上游区域，该区域含有一种可改变外膜BASB132蛋白表达水平的异种调控元件。该区域构成本发明的一个方面，其中包括BASB132基因的上游序列。该区域从紧接着BASB132基因的上游位置开始，通常持续到该基因上游的一个离ATG起始密码子不足约1000bp的位置。当基因处在多顺反子序列(操纵子)中时，该区域可以从紧接着该基因的上一位置开始，也可以从紧接着该操纵子的第一个基因的上一位置开始。优选的是，这种修饰的上游区域在ATG上游500-700bp之间含有一种异种启动子。
因此，本发明提供一种位于修饰的细菌大泡内的BASB132多肽。本发明还提供改良的宿主细胞，这些宿主细胞可产生非活性膜泡载体。本发明还提供含有BASB132基因的核酸载体，该BASB132基因含有一段修饰的上游区域，该区域中含有一种异种调控元件。
本发明还提供所述宿主细胞及细菌大泡的制备方法。
本发明还提供一些组合物，特别是疫苗组合物，以及这些组合物的制备方法，这些组合物中含有本发明的多肽和(或)多核苷酸以及免疫刺激性DNA序列，如Sato，Y.et al.Science 273：352(1996)中描述的DNA序列。
此外，本发明还提供一些方法，这些方法是将已证明能够编码细菌表面蛋白非可变区的所述多核苷酸或其特定片段构建成多核苷酸构建体，并利用这些构建体在粘膜炎莫拉氏菌感染的动物模型中进行遗传免疫实验。这些实验特别适用于鉴别那些可激发预防性或治疗性免疫应答的蛋白表位。相信该方法还可随后用于从成功抵抗或清除感染的动物的必需器官中制备具有特定用途的单克隆抗体，以获得可用于哺乳动物，特别是人类的细菌性感染，特别是粘膜炎莫拉氏菌感染的预防药或治疗方法。
本发明还提供一种疫苗制剂，该疫苗制剂含有本发明的一种免疫原性重组多肽和(或)多核苷酸，同时含有一种适当的载体，如药学容许的载体。由于多肽和多核苷酸在胃内可被降解，因而优选的是均以胃肠外方式给药，包括皮下给药、肌内给药、静脉内给药或真皮内给药。适于胃肠外给药的制剂包括水性和非水性的无菌注射液，其中可含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌化合物以及使制剂与个体的体液等渗的溶液，优选的是与血液等渗的溶液；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其中可含有悬浮剂或增稠剂。该制剂可以在诸如密封安瓿瓶和小药水瓶等单位剂量或多剂量容器中提供，并且可在冻干条件下保存，在使用前只需直接添加无菌流质载体。
为了提高制剂的免疫原性，本发明的疫苗制剂还可含有佐剂系统。优选的是用优选佐剂系统来诱发TH1型应答。
免疫应答可大致分为两大类，即体液介导的免疫应答和细胞介导的免疫应答(传统的鉴定方法是保护机制分别为抗体效应剂和细胞效应剂)。这两类应答被称为TH1型应答(细胞介导的应答)和TH2型免疫应答(体液应答)。
TH1型免疫应答的特征在于，可产生抗原特异性单倍体细胞毒性T淋巴细胞以及天然杀伤细胞应答。小鼠TH1型应答的特征是产生IgG2a亚型抗体，而相应的人类TH1型应答则产生IgG1型抗体。TH2型免疫应答的特征是产生广泛的同种免疫球蛋白，小鼠中产生的免疫球蛋白包括IgG1、IgA和IgM。
细胞因子被认为是产生这两种免疫应答类型的驱动力。高水平的TH1型细胞因子倾向于产生针对给定抗原的细胞介导的免疫应答，而高水平的TH2型细胞因子倾向于产生针对抗原的体液免疫应答。
TH1型免疫应答与TH2型免疫应答的区别并不是绝对的。实际上，个体可维持TH1占优势的免疫应答，也可以维持TH2占优势的免疫应答。但为了方便，通常是根据Mosmann和Coffman(Mosmann，T.R.andCoffman，R.L.(1989)TH1与TH2细胞：不同的淋巴因子分泌方式导致不同的功能特性。Annual Review of Immunology，7，p145-173)对鼠CD4+ve T细胞克隆的描述来研究细胞因子家族。根据传统观点，TH1型应答与T-淋巴细胞产生的INF-γ和IL-2细胞因子有关。但是，常与诱导TH1型免疫应答直接相关的其他细胞因子不由T细胞产生，如IL-12。相比之下，TH2型应答与IL-4、IL-5、IL-6和IL-13的分泌有关。
已知某些疫苗佐剂特别适用于刺激TH1型或TH2型细胞因子应答。能够在接种或感染后显示免疫应答TH1∶TH2平衡的最佳方法通常包括，在用抗原重新刺激后，直接对T淋巴细胞产生的TH1或TH2细胞因子进行体外测量，以及(或者)对抗原特异性抗体应答的IgG1∶IgG2a比率进行测量。
因此，用抗原对分离的T细胞群体重新进行体外刺激时，TH1型佐剂可优先刺激这些T细胞产生高水平的TH1型细胞因子，并且可促进CD8+细胞毒性T淋巴细胞的产生以及与TH1型相关的抗原特异性同种免疫球蛋白应答的产生。
可优先刺激TH1型细胞应答的佐剂在国际专利申请WO94/00153和WO95/17209中有所描述。
3-脱氧-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)就是这样一种佐剂。它公开于GB2220211(Ribi)。从化学角度来看，它是带有4、5或6个酰化链的3-脱氧-酰化单磷酰脂A的混合物，这种混合物由Ribi Immunochem，Montana制造。3-脱氧-酰化单磷酰脂A的优选形式公开于欧洲专利0689454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)。
优选的是，3D-MPL的颗粒足够小，使其能够通过0.22微米滤膜过滤除菌(欧洲专利0689454)。3D-MPL的提供量为每剂10μg-100μg，优选的是每剂25-50μg，其中抗原的提供量一般为每剂2-50μg。
另一种优选佐剂包括QS21，它是用HPLC方法由Quillaja SaponariaMolina的树皮纯化出的一种无毒成分。作为选择，可将QS21与3-脱氧-酰化单磷酰脂A(3D-MPL)相混合，也可选择再与一种载体混合。
美国专利5,057,540公开了产生QS21的方法。
有关含有QS21的反应原性佐剂，前人已有所描述(WO96/33739)。当与一种抗原混合时，这些含有QS21和胆固醇的制剂表现为一种有效的TH1刺激佐剂。
可优先刺激TH1型细胞应答的其他佐剂还包括免疫调制寡核苷酸，如WO96/02555中公开的未甲基化CpG序列。
还可考虑将如上所述的不同TH1刺激佐剂的组合作为优先产生TH1型细胞应答的刺激佐剂。例如QS21可以与3D-MPL配制在一起。QS21∶3D-MPL的典型比率为1∶10到10∶1；优选的是1∶5到5∶1，通常情况下基本为1∶1。产生最佳协同作用的优选3D-MPL∶QS21比率为2.5∶1到1∶1。
优选的是，本发明的疫苗组合物中还含有一种载体。该载体可以是一种水包油乳剂，或一种铝盐，如磷酸铝或氢氧化铝。
优选的水包油乳剂可含有一种可代谢的油，如角鲨烯、α-生育酚和Tween80。在一项特别优选的实施方案中，本发明所述疫苗组合物中的抗原可以在这种乳剂中与QS21和3D-MPL混合。此外，该水包油乳剂可含有Span85和(或)卵磷脂和(或)三辛酸甘油酯。
当用于人类给药时，疫苗中的QS21及3D-MPL含量通常为每剂1μg-200μg，如每剂10-100μg，优选的是每剂10μg-50μg。水包油乳剂一般可含有2-10％的角鲨烯、2-10％的α-生育酚和0.3-3％的Tween80。角鲨烯∶α-生育酚的优选比率为等于或小于1，因为这样的乳剂更加稳定。此外还可含有1％的Span85。本发明的疫苗可另含有一种稳定剂，这在某些情况下是有益的。
优选地，无毒水包油乳剂可以在一种水性载体中含有一种无毒的油，如角鲨烷或角鲨烯，以及一种乳化剂，如Tween80。该水性载体可以是，例如，磷酸缓冲盐溶液。
在WO95/17210中描述了一种特别有效的佐剂，该佐剂是在一种水包油乳剂中含有QS21、3D-MPL和生育酚。
本发明还提供一种多价疫苗组合物，该疫苗组合物同时含有本发明的疫苗制剂和其他抗原，特别是可用来治疗癌症、自身免疫疾病及其相关病情的抗原。这种多价疫苗组合物可含有上文所述的一种TH-1诱导佐剂。
尽管本发明是依据某些BASB132多肽和多核苷酸来进行描述，但应该了解的是，本发明还包括天然的多肽和多核苷酸的片段，以及带有添加、缺失或取代的类似多肽和多核苷酸，这些添加、缺失或取代基本不影响重组多肽或多核苷酸的免疫原性。
组合物、试剂盒与给药方法
另一方面，本发明提供含有BASB132多核苷酸和(或)BASB132多肽的组合物，用于向细胞或多细胞生物给药。
本发明还涉及一些组合物，这些组合物含有文中描述的一种多核苷酸和(或)多肽或其激动剂或拮抗剂。本发明的多肽和多核苷酸可以与未灭菌或灭菌的一种或多种载体形成组合物，以供细胞、组织或生物使用，例如适于向个体给药的药用载体。这些组合物可含有例如介质添加剂或药学有效剂量的本发明所述多肽和(或)多核苷酸，以及一种药学容许的载体或赋形剂。这些载体包括，但不局限于，盐溶液、缓冲盐溶液、葡糖、水、甘油、乙醇及其组合。制剂需适应其给药方式。本发明还涉及含有一个或多个容器的诊断及药用的包和试剂盒，容器中装有一种或多种本发明所述组合物成分。
本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可以单独使用，或与诸如治疗化合物等其他化合物结合使用。
药用组合物可采用任何有效而又便利的方式进行给药，其中尤其包括，例如，通过局部、口腔、肛门、阴道、静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内或真皮内途径进行给药。
当用于治疗或预防时，可将活性剂作为可注射的组合物向个体给药，例如无菌的水性分散体，优选的是等渗的无菌的水性分散体。
另一方面，本发明提供一些药用组合物，这些组合物含有药学有效剂量的多肽和(或)多核苷酸，例如可溶形式的本发明所述多肽和(或)多核苷酸，以及显效肽或拮抗肽或小分子化合物，同时含有一种药学容许的载体或赋形剂。这些载体包括，但不局限于，盐溶液、缓冲盐溶液、葡糖、水、甘油、乙醇及其组合。本发明还涉及含有一个或多个容器的药用包和药用试剂盒，容器中装有一种或多种上述组合物成分。本发明的多肽、多核苷酸和其他化合物可以单独使用，或与诸如治疗化合物等其他化合物结合使用。
组合物需适应其给药途径，如通过全身或口腔途径给药。优选的全身给药方式包括注射，一般为静脉内注射。也可采用其他注射方法，如皮下注射、肌内注射或腹膜内注射。全身给药的替代方法还包括，利用诸如胆汁盐或梭链孢酸或其他去污剂等渗透剂进行穿粘膜给药和穿皮给药。此外，若能将本发明的多肽或其他化合物配制成肠溶制剂或胶囊制剂，则也可以进行口服给药。也可将这些化合物以油膏剂、糊剂、凝胶、溶液、粉末等形式进行局部和(或)局限性给药。
当给药于哺乳动物，特别是给药于人类时，活性剂的日剂量应为0.01mg/kg-10mg/kg，通常约为1mg/kg。医生必须确定最适合某一个体的实际剂量，该剂量随特定个体的年龄、体重和反应而有所不同。以上提供的剂量为典型的平均剂量。当然，在个别情况下应采用更高或更低的剂量，这些情况也处在本发明的范围内。
所需剂量范围取决于选择的肽、给药途径、制剂性质、主体状况的特性和主治医师的判断。但适当的剂量范围为0.1-100μg/kg主体。
为方便起见，疫苗组合物可以是可注射的形式。可以用传统的佐剂来加强免疫应答。适于接种的单位剂量为0.5-5μg/kg的抗原，优选的是以该剂量给药1-3次，间隔1-3周。以所述剂量给药时，本发明的化合物不会产生可阻碍将其给药于适当个体的毒副作用。
但考虑到可用化合物的多样性和不同给药途径的效率差异，所需剂量会有很大的不同。举例来说，与静脉内注射给药相比，口服给药需要更大的剂量。利用该领域熟知的以常规经验为依据的优化方法可对这些剂量水平的变化进行调整。
序列库、有形介质中的序列以及算法
多核苷酸与多肽的序列是一种重要的信息资源，可用来确定其二维及三维结构，以及鉴别具有类似同源性的其他序列。实现这些方法的最便利途径是，将序列储存在可被计算机读取的介质中，然后用已知的大分子结构程序中的存储数据进行分析，或利用众所周知的搜索工具，如GCG程序包，对序列库进行搜索。
本发明还提供字符序列或字符串的分析方法，特别是遗传序列或编码的蛋白序列的分析方法。优选的序列分析方法包括，例如，序列同源性分析方法，如同一性或相似性分析方法，DNA、RNA及蛋白结构分析方法、序列装配方法、分支分析方法、序列基元分析方法、可读框判定方法、核酸碱基调用方法、密码子选择分析方法、核酸碱基修剪方法，以及序列层析谱峰值分析方法。
本发明提供一种用计算机进行同源性鉴定的方法。该方法的步骤包括：在可被计算机读取的介质中提供一种含有本发明所述多核苷酸序列的第一多核苷酸序列；并将所述第一多核苷酸序列至少与另一种多核苷酸或多肽序列进行比较，以确定同源性。
本发明还提供一种用计算机进行同源性鉴定的方法，该方法的步骤包括：在可被计算机读取的介质中提供一种含有本发明所述多肽序列的第一多肽序列；并将所述第一多肽序列至少与另一种多核苷酸或多肽序列进行比较，以确定同源性。
该申请书引用的所有出版物和参考文献均在此全面引入作为参考，其中包括专利和专利申请，但不局限于此，这等同于对每个出版物或参考文献都特别单独标明要在此完整引入作为参考。在该申请书中要求优先权的所有专利申请也在此全面引入作为参考，其方式与上述出版物和参考文献的方式相同。
定义
在该领域中，“同一性”是指通过序列比较而确定的两种或多种多肽序列之间的关系、或两种或多种多核苷酸序列之间的关系，这种关系视具体情况而定。在该领域中，“同一性”还表示通过序列串之间的匹配情况而确定的多肽或多核苷酸序列之间的序列相关程度，这种相关程度同样视具体情况而定。利用已知的方法能够很容易地计算出“同一性”，这些方法包括，但不局限于，《计算分子生物学》，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；《生物计算：信息学与基因组计划》，Smith，D.W，ed.，Academic Press，New York，1993；《序列数据的计算机分析》，Part I，Griffin，A.M.，and Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；《分子生物学中的序列分析》，von Heine，G.，AcademicPress，1987；以及《序列分析入门》，Gribskov，M.and Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H，and Lipman，D.，SIAM J.Applied Math，48：1073(1988)中描述的方法。计算同一性的方法可以给出测试序列间最大的匹配程度。此外，计算同一性的方法还被编写成公用的计算机程序。能够计算两个序列间同一性的计算机程序包括，但不局限于，GCG程序包中的GAP程序(Devereux，J.，et al.，Nucleic AcidsResearch 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN(Altschul，S.F.et al.，J.Molec.Biol.215：403-410(1990))，以及FASTA(Pearson and LipmanProc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444-2448(1988))。由NCBI和其他资源可获得共用的BLAST系列程序(BLAST手册，Altschul，S.，et al.，NCBINLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.，et al.，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。还可使用众所周知的Smith Waterman算法来计算同一性。
用于多肽序列比较的参数包括：
算法：Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970)
对比矩阵：Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：10915-10919(1992)中的BLOSSUM62
间隔损失：8
间隔长度损失：2
采用这些参数的有效程序有Genetics Computer Group，Madison WI的公用“gap”程序。以上参数是进行肽比较的默认值(对末端间隔不计算损失)。
用于多核苷酸序列比较的参数包括：
算法：Needleman and Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970)
对比矩阵：匹配＝+10，错配＝0
间隔损失：50
间隔长度损失：3
可用程序：Genetics Computer Group，Madison WI的“gap”程序。这些参数是进行核酸比较的默认值。
下文(1)和(2)分别为多核苷酸和多肽的“同一性”的优选含义。
(1)多核苷酸实施方案还包括一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有一段多核苷酸序列，该序列与序列编号：1的参考序列至少有50、60、70、80、85、90、95、97或100％的同一性，其中，所述多核苷酸序列可以与序列编号：1的参考序列完全相同，也可以与参考序列相比含有多至特定整数个核苷酸改变，其中，所述改变可选自，至少有一个核苷酸缺失、至少有一个核苷酸被取代，包括转换和颠换，或至少插入一个核苷酸，并且该改变可出现在参考核苷酸序列的5’或3’端位置或其间的任意位置，可单个地散布在参考序列的核苷酸中，也可分布在参考序列内的一个或多个连续基团中，并且所述核苷酸改变数量的计算方法是，序列编号：1的总核苷酸数乘以确定同一性的整数除以100所得的百分率，然后用序列编号：1的总核苷酸数减去所得结果，或：
nn≤xn-(xn·y)，
其中nn为核苷酸改变数量，xn为序列编号：1的总核苷酸数，y用0.50表示50％，用0.60表示60％，用0.70表示70％，用0.80表示80％，用0.85表示85％，用0.90表示90％，用0.95表示95％，用0.97表示97％，用1.00表示100％，而·为乘法运算符，其中xn和y的任何非整数结果都先舍成最接近的整数，然后用xn减去该整数。通过改变序列编号：2所述多肽的多核苷酸编码序列，可以在该编码序列内产生无义、错义或移码突变，从而由此改变该多核苷酸编码的多肽。
举例来说，本发明的多核苷酸序列可以与序列编号：1的参考序列完全相同，即100％相同，也可以与参考序列相比而含有多至特定整数个核苷酸改变，从而使同一性百分率小于100％。这些改变可选自，至少有一个核苷酸缺失、至少有一个核苷酸被取代，包括转换和颠换，或至少插入一个核苷酸，其中该改变可出现在参考多核苷酸序列的5’或3’端位置或其间的任意位置，可单个地散布在参考序列的核酸中，也可分布在参考序列内的一个或多个连续基团中。特定同一性百分率的核苷酸改变数量的计算方法是，序列编号：1的总核苷酸数乘以确定同一性的整数除以100所得的百分率，然后用序列编号：1的总核苷酸数减去所得结果，或：
nn≤xn-(xn·y)，
其中nn为核苷酸改变数量，xn是序列编号：1的总核苷酸数，y是，例如，用0.70表示70％，用0.80表示80％，用0.85表示85％等等，·为乘法运算符，其中xn和y的任何非整数结果都先舍成最接近的整数，然后用xn减去该整数。
(2)多肽实施方案还包括一种分离的多肽，该多肽含有一段与序列编号：2的参考多肽序列至少有50、60、70、80、85、90、95、97或100％同一性的多肽，其中所述多肽序列可以与序列编号：2的参考序列完全相同，也可以与参考序列相比而含有多至特定整数个氨基酸改变，其中，所述改变可选自，至少有一个氨基酸缺失、至少有一个氨基酸被取代，包括保守和非保守取代，或至少插入一个氨基酸，并且该改变可出现在参考多肽序列的氨基端或羧基端位置或其间的任意位置，可单个地散布在参考序列的氨基酸中，也可分布在参考序列内的一个或多个连续基团中，并且所述氨基酸改变数量的计算方法是，序列编号：2的总氨基酸数乘以确定同一性的整数除以100所得的百分率，然后用序列编号：2的总氨基酸数减去所得结果，或：
na≤xa-(xa·y)，
其中na为氨基酸改变数量，xa为序列编号：2的总氨基酸数，y用0.50表示50％，用0.60表示60％，用0.70表示70％，用0.80表示80％，用0.85表示85％，用0.90表示90％，用0.95表示95％，用0.97表示97％，用1.00表示100％，而·为乘法运算符，其中xa和y的任何非整数结果都先舍成最接近的整数，然后用xa减去该整数。
举例来说，本发明的多肽序列可以与序列编号：2的参考序列完全相同，即100％相同，也可以与参考序列相比而含有多至特定整数个氨基酸改变，从而使同一性百分率小于100％。这些改变可选自，至少有一个氨基酸缺失、至少有一个氨基酸被取代，包括保守和非保守取代，或至少插入一个氨基酸，并且该改变可出现在参考多肽序列的氨基端或羧基端位置或其间的任意位置，可单个地散布在参考序列的氨基酸中，也可分布在参考序列内的一个或多个连续基团中。特定同一性百分率的氨基酸改变数量的计算方法是，序列编号：2的总氨基酸数乘以确定同一性的整数除以100所得的百分率，然后用序列编号：2的总氨基酸数减去所得结果，或：
na≤xa-(xa·y)，
其中na为氨基酸改变数量，xa是序列编号：2的总氨基酸数，y是，例如，用0.70表示70％，用0.80表示80％，用0.85表示85％等等，·为乘法运算符，其中xa和y的任何非整数结果都先舍成最接近的整数，然后用xa减去该整数。
文中使用的关于生物的“个体”是指一种多细胞真核生物，其中包括，但不局限于，后生动物、哺乳动物、ovid、牛、猿、灵长类动物和人。
“分离的”是指由天然状态被“人工”改变的，即如果天然存在，则已发生改变或已由最初环境转移，或两种情况都发生。举例来说，在活体生物中天然存在的多核苷酸或多肽不属于本文使用的术语“分离的”，但由其天然共存物分离出的相同多核苷酸或多肽则属于“分离的”。此外，通过转化、遗传操作或其他任何重组方法被引入生物体的多核苷酸或多肽即使在该生物体中仍然存在，也是属于“分离的”，其中该生物体可以有生命或无生命。
“多核苷酸”通常指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，它可以是含有单链和双链区的未修饰或修饰的RNA或DNA。
“变异体”是指与参考多核苷酸或多肽不同，但仍保持基本特性的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸变异体与其参考多核苷酸的核苷酸序列不同。变异体中的核苷酸序列变化可以改变或不改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所述，核苷酸变化的结果可以是参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截断。典型的多肽变异体与其参考多肽的氨基酸序列不同。其差异通常有限，因而参考多肽与其变异体的序列整体上非常相似，并且有许多区域完全相同。变异体与参考多肽在氨基酸序列上的差异可以是一个或多个取代、添加、缺失的任意组合。取代或插入的氨基酸残基可以被遗传密码编码，也可以不能被遗传密码编码。多核苷酸或多肽的变异体可以是天然的，如等位变异体，也可以是不知是否天然的变异体。多核苷酸和多肽的非天然变异体可通过诱变技术或直接合成的方法来获得。
“疾病”是指由细菌感染引起或与其相关的任何疾病，其中包括，例如，幼儿及儿童中耳炎、老年肺炎、鼻窦炎、院内感染以及侵袭性疾病、慢性中耳炎伴听力丧失、中耳内液体累积、听神经损伤、语言学习延迟、上呼吸道感染和中耳炎症。
实施例
除详细描述的地方外，以下实施例均采用该领域技术人员熟知的和常规的标准技术来实现。这些实施例均作为说明，而不是限制本发明。
实施例1：来源于粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株的BASB132 基因的DNA序列
A：粘膜炎莫拉氏菌中的BASB132
序列编号：1显示来源于粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株(也称为MC2931菌株)的BASB132基因的DNA序列。序列编号：2显示BASB132多核苷酸序列的翻译结果。
B：粘膜炎莫拉氏菌43617菌株中的BASB132
确定粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株中的BASB132基因的序列。为此，用Big Dyes试剂盒(Applied biosystems)对含有截断形式的粘膜炎莫拉氏菌ATCC 43617菌株BASB132基因编码区(相当于3’端的最后2977个核苷酸)的质粒DNA(见实施例2A)进行DNA测序，并按照供应商提供的条件在ABI 373/A DNA测序仪上进行分析，所用引物是对粘膜炎莫拉氏菌BASB132基因有特异性的oli5 YtfN(5’-CCC ACC GTTTGC CCT TCA AT-3’)〔序列编号：5〕、oli6 YtfN(5’-CAT TTT TCC CGAGCA TTC AAA C-3’)〔序列编号：6〕和oli7 YtfN(5’-AAT CAG CCA CTTATC GCC AC-3’)〔序列编号：7〕，以及对载体有特异性的M13通用测序引物(5’-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3’)〔序列编号：8〕和M13反向测序引物(5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’)〔序列编号：9〕。结果是获得了分别称为序列编号：3和序列编号：4的多核苷酸序列及其推导多肽序列。
利用DNASTAR软件包的MegAlign程序对序列编号：1和3的多核苷酸序列进行比较，结果显示于图1；成对比较的同一性结果显示，两种BASB132多核苷酸基因序列在重叠区100％相同。利用该MegAlign程序对序列编号：2和4的多肽序列进行比较，结果显示于图2；成对比较的同一性结果显示，两种BASB132多肽序列在重叠区100％相同。
实施例2：构建质粒以表达截断形式的重组BASB132
A：截断BASB132的克隆
正向扩增引物oli1 YtfN(5’-TCA TGA ATG ACT CAG GCA AAG-3’)〔序列编号：10〕和反向扩增引物oli2 YtfN(5’-AGA TCT AAA CTTCCA ACG ATA AAT C-3’)〔序列编号：11〕中分别设计了BspHI和BglII限制位点，使PCR产物能够定向克隆到大肠杆菌表达质粒pQE60中，从而可将截断形式的BASB132蛋白作为C-端含有(His)6亲和层析标记的融合蛋白来加以表达。由于基因较大，所以用两组并行的PCR实验来扩增整个编码序列，第一组扩增使用oli1 YtfN(5’-TCA TGA ATG ACT CAGGCA AAG-3’)〔序列编号：10〕和oli3 YtfN(5’-AAA CAA ATC GCA CCCACG CC-3’)〔序列编号：12〕，第二组扩增使用oli2 YtfN(5’-AGA TCTAAA CTT CCA ACG ATA AAT C-3’)〔序列编号：11〕和oli4 YtfN(5’-ACAAAT TGC AGC GCA TTG TTG G-3’)〔序列编号：13〕。扩增的两组片段都具有一段含BstXI单一限制位点的公用区。首先用Top10细菌按厂商说明将BASB132的PCR产物引入到pCRIITOPO克隆载体中(Invitrogen)。这种中间构建体有利于进一步克隆到表达载体中。利用限制酶分析方法筛选出含有BASB132 DNA插入序列的转化体。约取20μl消化后的反应物试样进行琼脂糖凝胶电泳分析(Tris-醋酸盐-EDTA(TAE)缓冲液中含有0.8％的琼脂糖)。凝胶电泳结束后用溴化乙锭染色，然后用UV光显示DNA片段。将DNA分子量标准(1Kb梯形分子量标准，Life Technologies)与测试样品并行电泳，以估计DNA片段的大小。然后根据厂商建议，用BspHI与BstXI或BstXI与BglII限制酶(LifeTechnologies)依次完全消化从每次克隆的选定转化体纯化出的质粒。消化的DNA片段用硅胶旋转柱纯化，然后与pQE60质粒连接。
B：PCR-阳性转化体的表达分析
为了制备用于连接的表达质粒pQE60，用NcoI和BglII将其进行类似的完全消化，然后按厂商说明用牛小肠磷酸酶(CIP，～0.02单位/pmol5’末端，Life Technologies)进行处理，以避免自身连接。连接反应使用了约5倍摩尔数过量的消化片段来制备载体。用该领域熟知的方法以T4DNA连接酶(～2.0单位/反应，Life Technologies)进行～20μl的标准连接反应(～16℃，～16小时)。按该领域熟知的方法用连接反应的试样(～5μl)对电感受态细胞进行转化。再将转化细胞置于～1.0ml LB培养基中37℃生长～2-3小时，然后铺在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB琼脂平板上。添加的抗生素可用于筛选。将平板37℃过夜保温～16小时。用无菌牙签挑取ApR单菌落，并对新鲜LB ApR平板进行“点状”接种，同时对～1.0ml LB ApR液体培养基接种。在普通培养箱(用于平板)或振荡水浴中将接种的平板和液体培养基37℃保温过夜。然后进行限制酶分析，以证实转化体中含有BASB132 DNA插入序列。约取20μl消化后的反应物试样进行琼脂糖凝胶电泳分析(Tris-醋酸盐-EDTA(TAE)缓冲液中含有0.8％的琼脂糖)。凝胶电泳结束后用溴化乙锭染色，然后用UV光显示DNA片段。将DNA分子量标准(1Kb梯形分子量标准，LifeTechnologies)与测试样品并行电泳，以估计DNA片段的大小。产生预期大小DNA片段的转化体即为含有BASB132表达构建体的菌株。然后对含有表达质粒的菌株进行重组BASB132的可诱导表达分析。
C：PCR-阳性转化体的表达分析
然后用该领域熟知的方法将重组质粒的DNA试样(～1μl)转化到感受态M15(pREP4)细菌中。将转化细胞置于～1.0ml LB培养基中37℃生长～2-3小时，然后铺在含有氨苄青霉素(100μg/ml)和卡那霉素(30μg/ml)的LB琼脂平板上。添加的抗生素可用于筛选。将平板37℃过夜保温～16小时。用无菌牙签挑取ApR单菌落，并接种到～5.0ml的LB ApRKmR液体培养基中。将液体培养基37℃振荡(～250rpm)保温过夜。再把过夜的接种培养物的试样(～1.0ml)接种到含有～25ml LB Ap培养基的125ml锥形瓶中，然后37℃振荡(～250rpm)培养，直到培养物的混浊度达到O.D.600为～0.5，即对数中期(一般约为1.5-2.0小时)。此时将大约一半的培养物(～12.5ml)转到另一个125ml锥形瓶中，并通过添加终浓度为1.0mM的IPTG(在无菌水中配制的1.0M储液，Sigma)来诱导重组BASB132蛋白的表达。将IPTG诱导的和未诱导的培养物都于37℃及振荡条件下再保温～4小时。诱导期结束后，从诱导的和未诱导的培养物中取样(～1.0ml)，并在微量离心机中室温离心～3分钟，以收集细胞。将细胞沉淀分别悬浮在～50μl无菌水中，然后与等体积的含有2-巯基乙醇的2×Laemelli SDS-PAGE样品缓冲液相混合，并在沸水浴中煮～3分钟，以使蛋白变性。将IPTG诱导的和未诱导的粗制细胞裂解物以相同的体积(～15μl)加样到12％Tris/甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上(1mm厚的Mini-gels，Novex)，一式两份。在常规条件下用标准的SDS/Tris/甘氨酸电泳缓冲液(BioRad)将诱导的和未诱导的裂解物样品及预染的分子量标准(SeeBlue，Novex)一同进行电泳。电泳结束后，一块胶用考马斯亮蓝R250(BioRad)染色，然后脱色，以显示可由IPTG诱导而新产生的BASB132蛋白(图3A)。另一块胶则用BioRad Mini-Protean II印迹装置和Towbin’s甲醇(20％)转移缓冲液在PVDF膜(0.45微米孔径，Novex)上4℃电印迹～2小时。膜的阻断和抗体保温是按该领域熟知的方法来进行。利用抗RGS(His)3单克隆抗体和HRP偶联的兔抗鼠二抗(QiaGen)来验证BASB132重组蛋白及其表达(图3B)。用ABT不溶底物或Hyperfilm和Amersham ECL化学发光系统来显示抗-His抗体的反应模式。
实施例3：重组BASB132的产生
菌株
用含有粘膜炎莫拉氏菌BASB132编码质粒(pQE60)的大肠杆菌M15重组表达菌株(PREP4)来产生用于纯化重组蛋白的细胞团。在含有100μg/ml氨苄青霉素(“Ap”)和30μg/ml卡那霉素(“Km”)的LB琼脂平板上培养表达菌株，以确保pQE60和pREP4得以维持。用于-80℃冷冻保存的菌株是在含有相同浓度抗生素的LB培养基中增殖，然后与等体积的含有30％(w/v)甘油的LB培养基相混合。
培养基
用于产生重组蛋白的发酵培养基含有2×YT培养基(Difco)和100μg/ml Ap及30μg/ml Km。在发酵罐中使用的培养基添加了0.25ml/L消泡剂(Antifoam 204，Sigma)。在发酵罐中添加IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)(终浓度1mM)，以诱导BASB132重组蛋白的表达。
发酵
用0.3ml快速融解的冷冻培养物，或选择性琼脂平板培养基上的数个菌落，对含有50ml工作容积的500-ml接种锥形瓶进行接种，并在150rpm的振荡平台上(Innova2100，New Brunswick Scientific)于37±1℃保温约12小时。然后用该接种培养物对含有2×YT培养基和Ap抗生素的工作容积为5-L的发酵罐进行接种。发酵罐(Bioflo 3000，New BrunswickScientific)在37±1℃、曝气速率0.2-0.4 VVM以及Rushton叶轮转速250rpm的条件下运转。接种锥形瓶与发酵罐中的pH值均不做调整。发酵其间，发酵罐中的pH值为6.5-7.3。当培养物达到对数中期时(～0.7 O.D.600单位)，把IPTG(溶于无菌水的1.0M储液)添加到发酵罐中。细胞诱导2-4小时，然后用28RS Heraeus(Sepatech)或RC5C超速离心机(SorvallInstruments)离心以收集细胞。细胞浆在处理前保存于-20℃。
化学剂与材料
咪唑和Triton X-100购于Merck公司。盐酸胍购于Fluka公司。抑肽酶来自Sigma化学制品公司。尿素和AEBSF来自ICN-Biochemicals公司。其他所有化学剂均为试剂纯或更高程度。
Ni-NTA Superflow树脂和不含BSA的Penta-His抗体购于QiaGen公司。MicroBCA测定剂来自Pierce公司；Amicon 3滤膜来自Millipore公司。透析膜(MWCO12-14000)购于MFPI，USA。分子量标准(梯形标准)购于Life-technologies。
实施例4：由大肠杆菌纯化重组BASB132
提取-纯化
把2750ml IPTG诱导的培养物(～4小时，OD620＝0.5)获得的细胞浆重悬在110ml含有6M盐酸胍的100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，pH8缓冲液中(缓冲液A)，室温放置1小时，然后10,000g离心20分钟。将上清液加到用缓冲液A平衡的Ni-NTA Superflow树脂上，立即收集。用含有8M尿素的100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，pH6.3缓冲液(缓冲液C)将树脂清洗两次。洗脱是用4×1.5ml含有8M尿素的100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，pH5.9缓冲液(缓冲液D)，然后用4×1.5ml含有8M尿素的100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，pH4.5缓冲液(缓冲液E)。洗脱组分用25％体积pH7.5的200mM磷酸缓冲液中和。将含有BASB132蛋白的组分合并，并对含有8M尿素的100mMNaH2PO4，pH7.4缓冲液透析，然后对含有4M尿素的该缓冲液透析，再对含有2M尿素的该缓冲液透析，最后对含有0.1％Triton-X100的pH7.4的PBS缓冲液透析三次。
由于在透析过程中产生沉淀，所以溶液呈混浊状(溶液A)。离心(3000rpm，10分钟)两次后，溶液变得澄清(溶液B)。利用MicroBCA测定剂对溶液A和溶液B的纯化BASB132蛋白进行定量。溶液A的结果为170μg/ml。获得的纯化澄清蛋白(溶液B)为1.65mg，终浓度为75μg/ml。如图4-A所示，纯化的BASB132蛋白在SDS-PAGE分析中显示为一条迁移率约100kDa(估计的相对分子量)的主带。纯度估计在70％以上。BASB132蛋白与一种针对6-组氨酸基元诱发的小鼠单克隆抗体具有反应活性(图4-B)。
实施例5：产生抗重组BASB132的抗血清
用纯化的重组BASB132蛋白对兔子接种可产生抗BASB132蛋白的多价抗血清。
用纯化的重组BASB132蛋白对小鼠接种也可产生抗BASB132蛋白的多价抗血清。
在首次免疫前(免疫前血)和最后一次免疫后取动物血。
通过ELISA方法用纯化的重组BASB132蛋白测定抗BASB132蛋白的效价。该效价的定义是用XL Fit软件由4-参数逻辑模型计算出的中点效价。
另外还按下文实施例7所述，用蛋白印迹方法以抗血清为一抗对蛋白进行鉴定。蛋白印迹的结果显示，在免疫动物的血清内存在抗BASB132抗体。
实施例6：免疫学鉴定：BASB132的表面暴露情况
利用被福尔马林杀死的粘膜炎莫拉氏菌全细胞以ELISA方法测定抗BASB132蛋白的效价。该效价的定义是用XL Fit软件由4-参数逻辑模型计算出的中点效价。
实施例7：免疫学鉴定：蛋白质印迹分析
在Muller Hinton琼脂平板上将包括ATCC43617菌株在内的几种粘膜炎莫拉氏菌菌株以及来自不同地理区的临床分离物于36℃培育24小时。用几个菌落来接种培养基。培养物生长到A620约为0.6时，离心收集细胞。然后将细胞浓缩并溶解在PAGE样品缓冲液中。然后在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上对溶解的细胞进行解析，并将分离的蛋白电泳转移到PVDF膜上。然后用饱和缓冲液对PVDF膜进行预处理。随后的所有保温步骤都使用这种预处理缓冲液。
用免疫前血清或兔或鼠的免疫血清与PVDF膜保温。然后清洗PVDF膜。
用生物素标记的绵羊抗兔或抗鼠Ig与PVDF膜保温，再与抗生蛋白链菌素-过氧化物酶保温。然后用清洗缓冲液将PVDF膜清洗3次，再用4-氯-1-萘酚显色。
实施例8：免疫学鉴定：杀菌活性
检测抗-BASB132抗体的补体介导的细胞毒性，以确定按上文所述制备的BASB132蛋白抗血清的疫苗效力。检测免疫前血清与抗-BASB132抗血清的补体介导的杀粘膜炎莫拉氏菌活性。在平板上培育粘膜炎莫拉氏菌菌株。将几个菌落接种到液体培养基中。使培养物增殖，并在A620约为0.4时收集细胞。清洗一次，然后将沉淀悬浮并稀释。
96孔板的第一个孔中附着免疫前血清和抗-BASB132血清，同一行的其他孔中附着一系列稀释度的血清。然后添加稀释的活体粘膜炎莫拉氏菌，并将混合物保温。按照在毒性测定试验中预先确定的有效稀释度将补体添加到每个孔中。
每次测试都包括补体对照(不含血清但含有活性或灭活补体源的孔)、阳性对照(含有血清和已知效价的杀菌性抗体的孔)、培养物对照(不含血清和补体的孔)和血清对照(不含补体的孔)。
测量兔或鼠抗血清的杀菌活性(杀死50％的同源菌株)。
实施例9：抗BASB132抗体在人类恢复期血清中的存在情况
除一抗采用来源于被粘膜炎莫拉氏菌感染的儿童的人类血清之外，按上文实施例7所述对纯化的重组BASB132进行蛋白印迹分析。
实施例10：BASB132疫苗的效力：提高小鼠肺部的粘膜炎莫拉氏 菌清除率
该小鼠模型的依据是对接种小鼠进行标准的鼻内诱发，然后分析粘膜炎莫拉氏菌对肺的侵袭。
用BASB132疫苗对成组小鼠进行免疫。在促升接种后，将细菌悬浮液滴注到麻醉状态的小鼠的鼻孔内，以此来激发小鼠。在激发后30分钟到24小时之间处死小鼠，在无菌条件下取出肺脏并分别匀浆。把匀浆的稀释物铺在琼脂平板上，然后计算生长的菌落，并由此确定CFU/肺的log10加权平均数。计算各组CFU/肺的log10加权平均数的算术平均值和标准偏差。用统计学方法对结果进行分析。
该实验中的各组小鼠是用BASB132或死亡的粘膜炎莫拉氏菌全细胞制剂(kwc)进行免疫或进行假免疫。
实施例11：抗BASB132抗血清对粘膜炎莫拉氏菌粘附于细胞的抑 制
该试验可测量抗BASB132血清对莫拉氏菌粘附于上皮细胞的抑制能力。该活性可阻碍莫拉氏菌在鼻咽部建群。
将1体积细菌与1体积免疫前血清或抗BASB132免疫血清的稀释物置于冰上保温。然后把该混合物添加到含有为去除痕量抗生素而用培养基清洗一次的铺满细胞培养物的24孔板中。将板离心并保温。然后温和清洗每个孔。清洗完后，在孔中加入甘胆酸钠。将板保温，然后刮出细胞层并匀浆。把匀浆的稀释物铺在琼脂平板上并保温。对每个平板的菌落计数，并计算出每个孔中存在的细菌数。
保藏材料
含有粘膜炎莫拉氏菌Catlin菌株的保藏物已于1997年6月21日保藏在美国典型培养物保藏中心(文中称为“ATCC”)，保藏号为43617。被描述成粘膜炎布兰汉氏球菌(Frosch and Kolle)的该保藏物是一种由粘膜炎莫拉氏菌分离物构建的冻干形式的1.5-2.9kb插入序列库，其中的粘膜炎莫拉氏菌分离物是从患有慢性支气管炎的一名煤矿工人的穿气管吸出物中获得。该保藏物在Antimicrob.Agents Chemother.21：506-598(1982)中有所描述。
该粘膜炎莫拉氏菌菌株保藏物在文中称为“保藏菌株”或“保藏菌株的DNA”。
该保藏菌株含有全长BASB132基因。
含有插入到pQE30中的粘膜炎莫拉氏菌DNA的pMC-D15载体保藏物已于1999年2月12日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为207105。
该保藏菌株/克隆中包含的多核苷酸序列及其编码的所有多肽的氨基酸序列如果与文中关于序列的任何描述有任何冲突，则以前者为准。
该保藏菌株的保藏符合“国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约”的规定。本申请获得专利权时，该保藏菌株即可以不可撤消的方式不受限制地或无条件地向公众发放。提供该保藏菌株只是为该领域的技术人员提供方便，而不是认为保藏是申请专利的必需条件，例如35 U.S.C.§112即要求该条件。
序列信息
BASB132的多核苷酸及多肽序列
序列编号：1
来源于ATCC43617菌株的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多核苷酸序列
ATGACTCATCAGGATAATTCAAAAAACTCGTCATCGGCAGAAAATGGGGTTTCTGCTGGCGTTGCTGCACCGACTAAAA
CTCAGCCCAAACCACCAAACCCACCCAAACCACAATGGCTAATCTATTTAATTCGCTTAATTGTCGGAGCAATTATTGC
CGCTTTATTGTTGTTGGCGGTGTTATTTGCCATGACCAACAGCGAGTCAGGTTCAAAGTTTTTAATCGAAAAAATTGCG
TTAGAAACTGGCACTAAGCTTAAGTACAGCGAAGGCTCAATTCGCCATGGAGTTTGGGTGCAAGATGTCAAAATCGCTC
AAAGTGAAGATATTACCATCACCATTAATCGTGCCTATGTACAGCTTGGGTGGCGAGCCTTGTTTGCTCGCCAAGTGCA
TTTGGTCAATCCTAAGATTGATAAAGTTTATGTGACAAACACCAAGCCATCAACAGGCGAACCCTTTGATTATGCGACC
ATCAACCTACCAGTGACGCTTAAGCTTGAAAATGCCAAAGTCAATGAAATTATCTATGACCAAGTGGATTCTGAGCCTG
TCGTACTGCATCATATCGCATTTGATCACGCATCATGGGCAGATTCAACAGTTAAAATTGATAACGCCATGCTAAGCTA
TGGTGATGATATTAATATCAGCCATGCCACTGGTGGAATTGATTTAACAGGTCATTATCCGCTGTCGTTGTCGGCAGAT
GTGCATATTTTGGCACTTGATGATGCGTATTTTGATACTTTGTCGGTGAAAGCAGGCGGTAGCCTTAAGCGTACCGTTG
GTACACTCACTGGCAAATATAATCAGCATCATGTGACAGGCAGCTTTATCGCTCAAGGGTTGGATAAAAACTCACCTTT
TAGCGCACGCCTTGATTTTGATGAAGTACGATTGCCTTATGCTGACAGTCAAAATATTTTACTAAAAAATGGCTCTATC
ATCGCTGATGGCGTCATCTCAAATATCGAGCTACGCATTAACACTGAGTTATCCGCCAAAGATATTCCTGATGGGCATT
ATCAGGGTCGTGGAATTATTCGTGGCAGTACCATGCAAATCCCATATTTGCAGGCTGATACTGCCAATGGTACTTTGGT
GGCAACGGGTGATATGACTTGGGAAGATGGCTATGAGCTTGATGCCACCATTACAGCAGACGGCTATCGTATCCGTGAA
GAGATGCCAAGTGATTATCATGAATATAGAGCCTATCTACCTAAGGTTTTGACAGGCTCACTTGGGGTTAAGTATACGC
TATTAGACAAAGCCAGTCATGATACTCGGTTTGAGTTTGATCTGAATCAAAAAGACGGTGAACGCATTCAAGCGACGCT
GGCTCAAAATCAACAGAGTGATCATGAGCCTTGGCGTATTGATGCGACTTGGGCAAATCTAATCCGCCATGATATTCCA
CAAATTGGCGAGATTCATAGCCGCTCAGGTCAGGCATCAGTTCGTTTGGAGAACGGACATACCTATATTAACGCCTCTG
CTGACATTGTTAAACTTAATGCCGTCCCAAGCGGATCATATCATGTGCAAGCAAATATTGAGCAAAATCAGCACTTGCA
CTTGACAGATTTTAACTATCAAGGTGTGATGGGCGAGTTGACAGGTACTGGCAGGGTTGATTTTGCGACTGCCCAAAGA
CCGCTTGAGTGGCAGCTTGATGTCACTGCCAATCCAGTCAAACCCAATGCGTATTTTCAAACACCCAATCAAACACCGT
TTGAGCAAATTTCAGGCAGAATAATTGCTTCAGGGCGTCTGCGTGAGATAGATGGTGTGTCAATTCATGACATTAAAGT
GGATGACAGTGATTTAACCGCTTTATTAAATGACGGCAAGCAAGTACATCTGATGGGTCAAGGCGTCAGCAAGATTAGG
CTACAAGATGGACAAATTAGCCATCTTAAGGCAAATTTTGATGGCAAGCTTGCTCAAGATATCTTACCGCAGGTAGCTG
ACTCAAGCATTGGATTGGATATTGAAGGTGATTTGAATGATTTGACCATCACACGGGCAGTCATGATGAATGACTCAGG
CAAAGTATCGCTTGCAGGTCGTCTTGGATTAAATGACGGTATTCATTGGCAAATTCAAGGGCGATTAGATGAGGTGGAT
ACCGCCGCTTTTGTTGATGATGACAATTTAGTTGCGATCATCACAGGCGATCTTGCCACATCAGGCAGATATCGTGATG
GCGTGATGGATGATATCGCACTCACTTTTGATGGTCAAGTGATTAACAATTCAATCCCAAATGGTCATCTAAGTATTGA
TGCGACAGGTTCTGGCAATCGCTTTATGGTCAATCATCTAAGACATGATGGCACAGCAGGCACGCTGAATGCGACAGGC
TGGGTAGATATTAGCCAAGGTGCTGCATGGCAGCTAGAGGCTGATATGAATTCATTGAATTTGGGTGCATTTATCCAGT
CGCTAGATACTGACTTAAACGGTACAATTCAGCTTGCAGGCAACTGGCAAGAGTCTCATCAAGTCATTGATATCAGTAA
TTTGGATATTACAGGTAGCTACAATAATCAGCCACTTATCGCCACAGGCAGCTTATATGCCAAGCTTTCCCTACCTAAA
GATTTGGCTGGGTATATCCAAAGTATCAAGCAAGCAAGCCGCCCACCGACTTCGTCTGATGATTTATTGGCACTAAAAA
ATCGTATTGATAACAACGCACGCCAAACCCAAAATATCGTTCATAAACTCAATGCTGATAATCTACAAGTCCGCATTGG
CAATAATCATTTGGCCATATCAGGCGATGAAAGACAGTTGACCGCCAGTGTGAATGTGATTGATCTTGGGCAGCTGATT
GATACCGCAAGTGGTGCGATTCAAGGCGGTGTGATTGTCGTCAATGATCATCACGCTTTGCCAACTTTATATATTGATG
CCAGTGTCTCATCACTCAGATTTGCCAATATCACCATCCAAAACGCCCAAGCTATCGGTAAAATTGTCAATCTGGGTAA
TAGCGAAAGCCAGCTGTTGGTTCAGGGTGATGATATTATCGTGATGGGACGCACCATTAAATCTGCTCGGATGGATTTT
AGTGGCACAGAAGCCGATCATATCTTATCAATTTCAACCAAAAGCGGTGATATCGAAGCATCTATGCATATTGATGGGG
CATTTAATCGCAACAATATGCGATATCATGGTGTTTTGTCTGATGGTTTTGTCAAGAGTGGATTTGGCAAAATGTCACA
GCGTCAGCCGACCGAGTTTAGCTATGGATTGGATGATAATAGCTTACAAATTGCAGCGCATTGTTGGCAATCGGCACAT
ATCCAAGGCGATGGCGTGGGTGCGATTTGTTTACAAGATACATTAAGTTATACACCGCAATCAGGGAATGTCAATCTTA
TTATCCAAAATCTTGATACTCAAGTACTATTGGCGGCTCTACCCAGTGATATTCATTGGAAATCCATGCTCAATGGTCG
CATTAAGGCAATGTGGCAGGCAGGTCAATCACCTTTGGTTGATGCTGTACTGTATTCTGATGATGGTACAATTGGCTTA
ACTCAAGAAGAGACAGGTTATATTGAGATGCCATATCAGCGTGCGTCTGTGATTGCCAAAAGTGTTGATAATGGCTTAA
AGGTAAGAACCGATATCTTGGGTACGGCAGGTCGTGGTTATGCCGATGTAATCATCAACCCCAAGCAAACAGACAAGCC
CATTTCTGGTGCGCTTGTTATGAATGATCTTAATTTGGCGGTATTGCGACCATTTTTCCCGAGCATTCAAACATTGAGC
GGTAAAGTCAGCTTGGCAGGTGGCTTAGGTGGTACATTATCCAAACCATTGTTTTATGGTAATGCCAATTTAAAGAATG
GTGCATTAGCGATTGTTGGCGTACCAATGCCCATTTCTGATGTTGATGCCACGGTGAACATACGAGGTACTAAAGCACG
CTTAGACGGTAGATTTATGGGTGGTGAGGGTCATGGTGTGCTTTATGGTGAAATGGATTGGGCAGAAGAGCTGTATGCT
CGCCTTGGCGTATTTGGTGAAAATCTGACCGTCAGCCAGCCACCGCTTGTGACGGCACAAATCAGCCCTGAGCTGGAAG
TGATTATCAGACCTTTCCAAAAATTTGTAGATGTTCAAGGCGTTGTTAGTATCCCATCAGCAACCATTCGTCCGCCAGA
GGCAACCGCAGATATCGTAACCGAATCCCCAGATGTATCAGTCATTGACCGCCGTATCACAGGTAATATTGACCAGATT
TTAAGTAGAGCGAAACCTTGGGATATTAATGCAAATATCGGTGTTGATTTGGGTAATGAGATTGAATTTCGTGGATTTG
GGGCGGTATTACCATTGGCAGGCGCGATACATTTGACTCAGTCAGGACAAGGTGCAATGCAAGCTCTTGGCGTGGTTCA
GGTTTCTAAACGCACAAAAATCGATGTCATCGGTCAAAATTTGGATTTAAATTATGCCCAAATTCGTTTTGATGGCGAC
ATGCTTAATCCACGCTTATCTATTGAGGGTGAAAAACAAATTGAAGGGCAAACGGTGGGCGTTCGCATTCGTGGAACGG
CATCAAATCCAAACATTACCGTATTTAATGATGCAGGTTTGGATGAATACCAAGCAATGAATGCACTGGTGACAGGACG
CATTAGCGAATCAAGTGATTTGGGTATCACAGAGCAGGGTTTTCGCTCACAAGTAACCAATCACCTTGCTGCTGCTGGC
TTAAGCTTAGGTTTGTCAGGAACCAGAGATTTAACCAACCAAATTGGTCACGCATTTGGTTTTCAGAGTTTGACCATTG
ATGCCTCGGGCAGCTCAGATGATACCAATGTTAATGTTACAGGCTATATTACACCAGATTTGTATTTGCGTTATGGCGT
GGGTGTGTTTAATGCTGAATCAACCTTATCCATGCGTTATCAATTGACACGCCGTGTTTATATTGAAGCAACCAGTGCC
GCTGAAAATATGGTTGATGTGATTTATCGTTGGAAGTTTTAG
序列编号：2
由序列编号：1的多核苷酸序列推导出的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多肽序列
MTHQDNSKNSSSAENGVSAGVAAPTKTQPKPPNPPKPQWLIYLIRLIVGAIIAALLLLAVLFAMTNSESGSKFLIEKIAL
ETGTKLKYSEGSIRHGVWVQDVKIAQSEDITITINRAYVQLGWRALFARQVHLVNPKIDKVYVTNTKPSTGEPFDYATIN
LPVTLKLENAKVNEIIYDQVDSEPVVLHHIAFDHASWADSTVKIDNAMLSYGDDINISHATGGIDLTGHYPLSLSADVHI
LALDDAYFDTLSVKAGGSLKRTVGTLTGKYNQHHVTGSFIAQGLDKNSPFSARLDFDEVRLPYADSQNILLKNGSIIADG
VISNIELRINTELSAKDIPDGHYHGRGIIRGSTMQIPYLQADTANGTLVATGDMTWEDGYELDATITADGYRIREEMPSD
YHEYRAYLPKVLTGSLGVKYTLLDKASHDTRFEFDLNQKDGERIQATLAQNQQSDHEPWRIDATWANLIRHDIPQIGEIH
SRSGQASVRLENGHTYINASADIVKLNAVPSGSYHVQANIEQNQHLHLTDFNYQGVMGELTGTGRVDFATAQRPLEWQLD
VTANPVKPNAYFQTPNQTPFEQISGRIIASGRLREIDGVSIHDIKVDDSDLTALLNDGKQVHLMGQGVSKIRLQDGQISH
LKANFDGKLAQDILPQVADSSIGLDIEGDLNDLTITRAVMMNDSGKVSLAGRLGLNDGIHWQIQGRLDEVDTAAFVDDDN
LVAIITGDLATSGRYRDGVMDDIALTFDGQVINNSIPNGHLSIDATGSGNRFMVNHLRHDGTAGTLNATGWVDISQGAAW
QLEADMNSLNLGAFIQSLDTDLNGTIQLAGNWQESHQVIDISNLDITGSYNNQPLIATGSLYAKLSLPKDLAGYIQSIKQ
ASRPPTSSDDLLALKNRIDNNARQTQNIVHKLNADNLQVRIGNNHLAISGDERQLTASVNVIDLGQLIDTASGAIQGGVI
VVNDHHALPTLYIDASVSSLRFANITIQNAQAIGKIVNLGNSESQLLVQGDDIIVMGRTIKSARMDFSGTEADHILSIST
KSGDIEASMHIDGAFNRNNMRYHGVLSDGFVKSGFGKMSQRQPTEFSYGLDDNSLQIAAHCWQSAHIQGDGVGAICLQDT
LSYTPQSGNVNLIIQNLDTQVLLAALPSDIHWKSMLNGRIKAMWQAGQSPLVDAVLYSDDGTIGLTQEETGYIEMPYQRA
SVIAKSVDNGLKVRTDILGTAGRGYADVIINPKQTDKPISGALVMNDLNLAVLRPFFPSIQTLSGKVSLAGGLGGTLSKP
LFYGNANLKNGALAIVGVPMPISDVDATVNIRGTKARLDGRFMGGEGHGVLYGEMDWAEELYARLGVFGENLTVSQPPLY
TAQISPELEVIIRPFQKFVDVQGVVSIPSATIRPPEATADIVTESPDVSVIDRRITGNIDQILSRAKPWDINANIGVDLG
NEIEFRGFGAVLPLAGAIHLTQSGQGAMQALGVVQVSKRTKIDVIGQNLDLNYAQIRPDGDMLNPRLSIEGEKQIEGQTV
GVRIRGTASNPNITVFNDAGLDEYQAMNALVTGRISESSDLGITEQGFRSQVTNHLAAAGLSLGLSGTRDLTNQIGHAFG
FQSLTIDASGSSDDTNVNVTGYITPDLYLRYGVGVFNAESTLSMRYQLTRRVYIEATSAAENMVDVIYRWKF
序列编号：3
来源于ATCC43617菌株的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多核苷酸序列
ATGAATGACTCAGGCAAAGTATCGCTTGCAGGTCGTCTTGGATTAAATGACGGTATTCATTGGCAAATTCAAGGGCGAT
TAGATGAGGTGGATACCGCCGCTTTTGTTGATGATGACAATTTAGTTGCGATCATCACAGGCGATCTTGCCACATCAGG
CAGATATCGTGATGGCGTGATGGATGATATCGCACTCACTTTTGATGGTCAAGTGATTAACAATTCAATCCCAAATGGT
CATCTAAGTATTGATGCGACAGGTTCTGGCAATCGCTTTATGGTCAATCATCTAAGACATGATGGCACAGCAGGCACGC
TGAATGCGACAGGCTGGGTAGATATTAGCCAAGGTGCTGCATGGCAGCTAGAGGCTGATATGAATTCATTGAATTTGGG
TGCATTTATCCAGTCGCTAGATACTGACTTAARCGGTACAATTCAGCTTGCAGGCAACTGGCAAGAGTCTCATCAAGTC
ATTGATATCAGTAATTTGGATATTACAGGTAGCTACAATAATCAGCCACTTATCGCCACAGGCAGCTTATATGCCAAGC
TTTCCCTACCTAAAGATTTGGCTGGGTATATCCAAAGTATCAAGCAAGCAAGCCGCCCACCGACTTCGTCTGATGATTT
ATTGGCACTAAAAAATCGTATTGATAACAACGCACGCCAAACCCAAAATATCGTTCATAAACTCAATGCTGATAATCTA
CAAGTCCGCATTGGCAATAATCATTTGGCCATATCAGGCGATGAAAGACAGTTGACCGCCAGTGTGAATGTGATTGATC
TTGGGCAGCTGATTGATACCGCAAGTGGTGCGATTCAAGGCGGTGTGATTGTCGTCAATGATCATCACGCTTTGCCAAC
TTTATATATTGATGCCAGTGTCTCATCACTCAGATTTGCCAATATCACCATCCAAAACGCCCAAGCTATCGGTAAAATT
GTCAATCTGGGTAATAGCGAAAGCCAGCTGTTGGTTCAGGGTGATGATATTATCGTGATGGGACGCACCATTAAATCTG
CTCGGATGGATTTTAGTGGCACAGAAGCCGATCATATCTTATCAATTTCAACCAAAAGCGGTGATATCGAAGCATCTAT
GCATATTGATGGGGCATTTAATCGCAACAATATGCGATATCATGGTGTTTTGTCTGATGGTTTTGTCAAGAGTGGATTT
GGCAAAATGTCACAGCGTCAGCCGACCGAGTTTAGCTATGGATTGGATGATAATAGCTTACAAATTGCAGCGCATTGTT
GGCAATCGGCACATATCCAAGGCGATGGCGTGGGTGCGATTTGTTTACAAGATACATTAAGTTATACACCGCAATCAGG
GAATGTCAATCTTATTATCCAAAATCTTGATACTCAAGTACTATTGGCGGCTCTACCCAGTGATATTCATTGGAAATCC
ATGCTCAATGGTCGCATTAAGGCAATGTGGCAGGCAGGTCAATCACCTTTGGTTGATGCTGTACTGTATTCTGATGATG
GTACAATTGGCTTAACTCAAGAAGAGACAGGTTATATTGAGATGCCATATCAGCGTGCGTCTGTGATTGCCAAAAGTGT
TGATAATGGCTTAAAGGTAAGAACCGATATCTTGGGTACGGCAGGTCGTGGTTATGCCGATGTAATCATCAACCCCAAG
CAAACAGACAAGCCCATTTCTGGTGCGCTTGTTATGAATGATCTTAATTTGGCGGTATTGCGACCATTTTTCCCGAGCA
TTCAAACATTGAGCGGTAAAGTCAGCTTGGCAGGTGGCTTAGGTGGTACATTATCCAAACCATTGTTTTATGGTAATGC
CAATTTAAAGAATGGTGCATTAGCGATTGTTGGCGTACCAATGCCCATTTCTGATGTTGATGCCACGGTGAACATACGA
GGTACTAAAGCACGCTTAGACGGTAGATTTATGGGTGGTGAGGGTCATGGTGTGCTTTATGGTGAAATGGATTGGGCAG
AAGAGCTGTATGCTCGCCTTGGCGTATTTGGTGAAAATCTGACCGTCAGCCAGCCACCGCTTGTGACGGCACAAATCAG
CCCTGAGCTGGAAGTGATTATCAGACCTTTCCAAAAATTTGTAGATGTTCAAGGCGTTGTTAGTATCCCATCAGCAACC
ATTCGTCCGCCAGAGGCAACCGCAGATATCGTAACCGAATCCCCAGATGTATCAGTCATTGACCGCCGTATCACAGGTA
ATATTGACCAGATTTTAAGTAGAGCGAAACCTTGGGATATTAATGCAAATATCGGTGTTGATTTGGGTAATGAGATTGA
ATTTCGTGGATTTGGGGCGGTATTACCATTGGCAGGCGCGATACATTTGACTCAGTCAGGACAAGGTGCAATGCAAGCT
CTTGGCGTGGTTCAGGTTTCTAAACGCACAAAAATCGATGTCATCGGTCAAAATTTGGATTTAAATTATGCCCAAATTC
GTTTTGATGGCGACATGCTTAATCCACGCTTATCTATTGAGGGTGAAAAACAAATTGAAGGGCAAACGGTGGGCGTTCG
CATTCGTGGAACGGCATCAAATCCAAACATTACCGTATTTAATGATGCAGGTTTGGATGAATACCAAGCAATGAATGCA
CTGGTGACAGGACGCATTAGCGAATCAAGTGATTTGGGTATCACAGAGCAGGGTTTTCGCTCACAAGTAACCAATCACC
TTGCTGCTGCTGGCTTAAGCTTAGGTTTGTCAGGAACCAGAGATTTAACCAACCAAATTGGTCACGCATTTGGTTTTCA
GAGTTTGACCATTGATGCCTCGGGCAGCTCAGATGATACCAATGTTAATGTTACAGGCTATATTACACCAGATTTGTAT
TTGCGTTATGGCGTGGGTGTGTTTAATGCTGAATCAACCTTATCCATGCGTTATCAATTGACACGCCGTGTTTATATTG
AAGCAACCAGTGCCGCTGAAAATATGGTTGATGTGATTTATCGTTGGAAGTTTTAG
序列编号：4
由序列编号：3的多核苷酸序列推导出的粘膜炎莫拉氏菌BASB132多肽序列
MNDSGKVSLAGRLGLNDGIHWQIQGRLDEVDTAAFVDDDNLVAIITGDLATSGRYRDGVMDDIALTFDGQVINNSIPNGH
LSIDATGSGNRFMVNHLRHDGTAGTLNATGWVDISQGAAWQLEADMNSLNLGAFIQSLDTDLNGTIQLAGNWQESHQVID
ISNLDITGSYNNQPLIATGSLYAKLSLPKDLAGYIQSIKQASRPPTSSDDLLALKNRIDNNARQTQNIVHKLNADNLQVR
IGNNHLAISGDERQLTASVNVIDLGQLIDTASGAIQGGVIVVNDHHALPTLYIDASVSSLRFANITIQNAQAIGKIVNLG
NSESQLLVQGDDIIVMGRTIKSARMDFSGTEADHILSISTKSGDIFASMHIDGAFNRNNMRYHGVLSDGFVKSGFGKMSQ
RQPTETSYGLDDNSLQIAAHCWQSAHIQGDGVGAICLQDTLSYTPQSGNVNLIIQNLDTQVLLAALPSDIHWKSMLNGRI
KAMWQAGQSPLVDAVLYSDDGTIGLTQEETGYIEMPYQRASVIAKSVDNGLKVRTDILGTAGRGYADVIINPKQTDKPIS
GALVMNDLNLAVLRPFFPSIQTLSGKVSLAGGLGGTLSKPLFYGNANLKNGALAIVGVPMPISDVDATVNIRGTKARLDG
RFMGGEGHGVLYGEMDWAEELYARLGVFGENLTVSQPPLVTAQISPELEVIIRPFQKFVDVQGVVSIPSATIRPPEATAD
IVTESPDVSVIDRRITGNIDQILSRAKPWDINANIGVDLGNEIEFRGFGAVLPLAGAIHLTQSGQGAMQALGVVQVSKRT
KIDVIGQNLDLNYAQIRFDGDMLNPRLSIEGEKQIEGQTVGVRIRGTASNPNITVFNDAGLDEYQAMNALVTGRISESSD
LGITEQGFRSQVTNHLAAAGLSLGLSGTRDLTNQIGHAFGFQSLTIDASGSSDDTNVNVTGYITPDLYLRYGVGVFNAES
TLSMRYQLTRRVYIEATSAAENMVDVIYRWKF
序列编号：5
CCC ACC GTT TGC CCT TCA AT
序列编号：6
CAT TTT TCC CGA GCA TTC AAA C
序列编号：7
AAT CAG CCA CTT ATC GCC AC
序列编号：8
GTA AAA CGA CGG CCA GT
序列编号：9
CAG GAA ACA GCT ATG AC
序列编号：10
TCA TGA ATG ACT CAG GCA AAG
序列编号：11
AGA TCT AAA CTT CCA ACG ATA AAT C
序列编号：12
AAA CAA ATC GCA CCC ACG CC
序列编号：13
ACA AAT TGC AGC GCA TTG TTG G序列表
                       序列表
<110>史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司(Smithkline Beecham Biologicals S.A.)
<120>来源于粘膜炎莫拉氏菌的免疫原性多肽及其应用
<130>BM45417
<160>13
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>5019
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>1atgactcatc aggataattc aaaaaactcg tcatcggcag aaaatggggt ttctgctggc       60gttgctgcac cgactaaaac tcagcccaaa ccaccaaacc cacccaaacc acaatggcta      120atctatttaa ttcgcttaat tgtcggagca attattgccg ctttattgtt gttggcggtg      180ttatttgcca tgaccaacag cgagtcaggt tcaaagtttt taatcgaaaa aattgcgtta      240gaaactggca ctaagcttaa gtacagcgaa ggctcaattc gccatggagt ttgggtgcaa      300gatgtcaaaa tcgctcaaag tgaagatatt accatcacca ttaatcgtgc ctatgtacag      360cttgggtggc gagccttgtt tgctcgccaa gtgcatttgg tcaatcctaa gattgataaa      420gtttatgtga caaacaccaa gccatcaaca ggcgaaccct ttgattatgc gaccatcaac      480ctaccagtga cgcttaagct tgaaaatgcc aaagtcaatg aaattatcta tgaccaagtg      540gattctgagc ctgtcgtact gcatcatatc gcatttgatc acgcatcatg ggcagattca      600acagttaaaa ttgataacgc catgctaagc tatggtgatg atattaatat cagccatgcc      660actggtggaa ttgatttaac aggtcattat ccgctgtcgt tgtcggcaga tgtgcatatt      720ttggcacttg atgatgcgta ttttgatact ttgtcggtga aagcaggcgg tagccttaag      780cgtaccgttg gtacactcac tggcaaatat aatcagcatc atgtgacagg cagctttatc      840gctcaagggt tggataaaaa ctcacctttt agcgcacgcc ttgattttga tgaagtacga      900ttgccttatg ctgacagtca aaatatttta ctaaaaaatg gctctatcat cgctgatggc      960gtcatctcaa atatcgagct acgcattaac actgagttat ccgccaaaga tattcctgat     1020gggcattatc acggtcgtgg aattattcgt ggcagtacca tgcaaatccc atatttgcag     1080gctgatactg ccaatggtac tttggtggca acgggtgata tgacttggga agatggctat     1140gagcttgatg ccaccattac agcagacggc tatcgtatcc gtgaagagat gccaagtgat     1200tatcatgaat atagagccta tctacctaag gttttgacag gctcacttgg ggttaagtat     1260acgctattag acaaagccag tcatgatact cggtttgagt ttgatctgaa tcaaaaagac     1320ggtgaacgca ttcaagcgac gctggctcaa aatcaacaga gtgatcatga gccttggcgt     1380attgatgcga cttgggcaaa tctaatccgc catgatattc cacaaattgg cgagattcat     1440agccgctcag gtcaggcatc agttcgtttg gagaacggac atacctatat taacgcctct     1500gctgacattg ttaaacttaa tgccgtccca agcggatcat atcatgtgca agcaaatatt     1560gagcaaaatc agcacttgca cttgacagat tttaactatc aaggtgtgat gggcgagttg     1620acaggtactg gcagggttga ttttgcgact gcccaaagac cgcttgagtg gcagcttgat     1680gtcactgcca atccagtcaa acccaatgcg tattttcaaa cacccaatca aacaccgttt     1740gagcaaattt caggcagaat aattgcttca gggcgtctgc gtgagataga tggtgtgtca     1800attcatgaca ttaaagtgga tgacagtgat ttaaccgctt tattaaatga cggcaagcaa     1860gtacatctga tgggtcaagg cgtcagcaag attaggctac aagatggaca aattagccat     1920cttaaggcaa attttgatgg caagcttgct caagatatct taccgcaggt agctgactca     1980agcattggat tggatattga aggtgatttg aatgatttga ccatcacacg ggcagtcatg     2040atgaatgact caggcaaagt atcgcttgca ggtcgtcttg gattaaatga cggtattcat     2100tggcaaattc aagggcgatt agatgaggtg gataccgccg cttttgttga tgatgacaat     2160ttagttgcga tcatcacagg cgatcttgcc acatcaggca gatatcgtga tggcgtgatg     2220gatgatatcg cactcacttt tgatggtcaa gtgattaaca attcaatccc aaatggtcat     2280ctaagtattg atgcgacagg ttctggcaat cgctttatgg tcaatcatct aagacatgat     2340ggcacagcag gcacgctgaa tgcgacaggc tgggtagata ttagccaagg tgctgcatgg     2400cagctagagg ctgatatgaa ttcattgaat ttgggtgcat ttatccagtc gctagatact     2460gacttaaacg gtacaattca gcttgcaggc aactggcaag agtctcatca agtcattgat     2520atcagtaatt tggatattac aggtagctac aataatcagc cacttatcgc cacaggcagc     2580ttatatgcca agctttccct acctaaagat ttggctgggt atatccaaag tatcaagcaa     2640gcaagccgcc caccgacttc gtctgatgat ttattggcac taaaaaatcg tattgataac     2700aacgcacgcc aaacccaaaa tatcgttcat aaactcaatg ctgataatct acaagtccgc     2760attggcaata atcatttggc catatcaggc gatgaaagac agttgaccgc cagtgtgaat     2820gtgattgatc ttgggcagct gattgatacc gcaagtggtg cgattcaagg cggtgtgatt     2880gtcgtcaatg atcatcacgc tttgccaact ttatatattg atgccagtgt ctcatcactc     2940agatttgcca atatcaccat ccaaaacgcc caagctatcg gtaaaattgt caatctgggt     3000aatagcgaaa gccagctgtt ggttcagggt gatgatatta tcgtgatggg acgcaccatt     3060aaatctgctc ggatggattt tagtggcaca gaagccgatc atatcttatc aatttcaacc     3120aaaagcggtg atatcgaagc atctatgcat attgatgggg catttaatcg caacaatatg     3180cgatatcatg gtgttttgtc tgatggtttt gtcaagagtg gatttggcaa aatgtcacag     3240cgtcagccga ccgagtttag ctatggattg gatgataata gcttacaaat tgcagcgcat     3300tgttggcaat cggcacatat ccaaggcgat ggcgtgggtg cgatttgttt acaagataca     3360ttaagttata caccgcaatc agggaatgtc aatcttatta tccaaaatct tgatactcaa     3420gtactattgg cggctctacc cagtgatatt cattggaaat ccatgctcaa tggtcgcatt     3480aaggcaatgt ggcaggcagg tcaatcacct ttggttgatg ctgtactgta ttctgatgat     3540ggtacaattg gcttaactca agaagagaca ggttatattg agatgccata tcagcgtgcg     3600tctgtgattg ccaaaagtgt tgataatggc ttaaaggtaa gaaccgatat cttgggtacg     3660gcaggtcgtg gttatgccga tgtaatcatc aaccccaagc aaacagacaa gcccatttct     3720ggtgcgcttg ttatgaatga tcttaatttg gcggtattgc gaccattttt cccgagcatt     3780caaacattga gcggtaaagt cagcttggca ggtggcttag gtggtacatt atccaaacca     3840ttgttttatg gtaatgccaa tttaaagaat ggtgcattag cgattgttgg cgtaccaatg     3900cccatttctg atgttgatgc cacggtgaac atacgaggta ctaaagcacg cttagacggt     3960agatttatgg gtggtgaggg tcatggtgtg ctttatggtg aaatggattg ggcagaagag     4020ctgtatgctc gccttggcgt atttggtgaa aatctgaccg tcagccagcc accgcttgtg     4080acggcacaaa tcagccctga gctggaagtg attatcagac ctttccaaaa atttgtagat     4140gttcaaggcg ttgttagtat cccatcagca accattcgtc cgccagaggc aaccgcagat     4200atcgtaaccg aatccccaga tgtatcagtc attgaccgcc gtatcacagg taatattgac     4260cagattttaa gtagagcgaa accttgggat attaatgcaa atatcggtgt tgatttgggt     4320aatgagattg aatttcgtgg atttggggcg gtattaccat tggcaggcgc gatacatttg     4380actcagtcag gacaaggtgc aatgcaagct cttggcgtgg ttcaggtttc taaacgcaca     4440aaaatcgatg tcatcggtca aaatttggat ttaaattatg cccaaattcg ttttgatggc     4500gacatgctta atccacgctt atctattgag ggtgaaaaac aaattgaagg gcaaacggtg     4560ggcgttcgca ttcgtggaac ggcatcaaat ccaaacatta ccgtatttaa tgatgcaggt     4620ttggatgaat accaagcaat gaatgcactg gtgacaggac gcattagcga atcaagtgat     4680ttgggtatca cagagcaggg ttttcgctca caagtaacca atcaccttgc tgctgctggc     4740ttaagcttag gtttgtcagg aaccagagat ttaaccaacc aaattggtca cgcatttggt     4800tttcagagtt tgaccattga tgcctcgggc agctcagatg ataccaatgt taatgttaca     4860ggctatatta caccagattt gtatttgcgt tatggcgtgg gtgtgtttaa tgctgaatca     4920accttatcca tgcgttatca attgacacgc cgtgtttata ttgaagcaac cagtgccgct     4980gaaaatatgg ttgatgtgat ttatcgttgg aagttttag                            5019
<210>2
<211>1672
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>2Met Thr His Gln Asp Asn Ser Lys Asn Ser Ser Ser Ala Glu Asn Gly1              5                  10                  15Val Ser Ala Gly Val Ala Ala Pro Thr Lys Thr Gln Pro Lys Pro Pro
        20                  25                  30Asn Pro Pro Lys Pro Gln Trp Leu Ile Tyr Leu Ile Arg Leu Ile Val
    35                  40                  45Gly Ala Ile Ile Ala Ala Leu Leu Leu Leu Ala Val Leu Phe Ala Met
50                  55                  60Thr Asn Ser Glu Ser Gly Ser Lys Phe Leu Ile Glu Lys Ile Ala Leu65                  70                  75                  80Glu Thr Gly Thr Lys Leu Lys Tyr Ser Glu Gly Ser Ile Arg His Gly
            85                  90                  95Val Trp Val Gln Asp Val Lys Ile Ala Gln Ser Glu Asp Ile Thr Ile
        100                 105                 110Thr Ile Asn Arg Ala Tyr Val Gln Leu Gly Trp Arg Ala Leu Phe Ala
    115                 120                 125Arg Gln Val His Leu Val Asn Pro Lys Ile Asp Lys Val Tyr Val Thr
130                 135                 140Asn Thr Lys Pro Ser Thr Gly Glu Pro Phe Asp Tyr Ala Thr Ile Asn145                 150                 155                 160Leu Pro Val Thr Leu Lys Leu Glu Asn Ala Lys Val Asn Glu Ile Ile
            165                 170                 175Tyr Asp Gln Val Asp Ser Glu Pro Val Val Leu His His Ile Ala Phe
        180                 185                 190Asp His Ala Ser Trp Ala Asp Ser Thr Val Lys Ile Asp Asn Ala Met
    195                 200                 205Leu Ser Tyr Gly Asp Asp Ile Asn Ile Ser His Ala Thr Gly Gly Ile
210                 215                 220Asp Leu Thr Gly His Tyr Pro Leu Ser Leu Ser Ala Asp Val His Ile225                 230                 235                 240Leu Ala Leu Asp Asp Ala Tyr Phe Asp Thr Leu Ser Val Lys Ala Gly
            245                 250                 255Gly Ser Leu Lys Arg Thr Val Gly Thr Leu Thr Gly Lys Tyr Asn Gln
        260                 265                 270His His Val Thr Gly Ser Phe Ile Ala Gln Gly Leu Asp Lys Asn Ser
    275                 280                 285Pro Phe Ser Ala Arg Leu Asp Phe Asp Glu Val Arg Leu Pro Tyr Ala
290                 295                 300Asp Ser Gln Asn Ile Leu Leu Lys Asn Gly Ser Ile Ile Ala Asp Gly305                 310                 315                 320Val Ile Ser Asn Ile Glu Leu Arg Ile Asn Thr Glu Leu Ser Ala Lys
            325                 330                 335Asp Ile Pro Asp Gly His Tyr His Gly Arg Gly Ile Ile Arg Gly Ser
        340                 345                 350Thr Met Gln Ile Pro Tyr Leu Gln Ala Asp Thr Ala Asn Gly Thr Leu
    355                 360                 365Val Ala Thr Gly Asp Met Thr Trp Glu Asp Gly Tyr Glu Leu Asp Ala
370                 375                 380Thr Ile Thr Ala Asp Gly Tyr Arg Ile Arg Glu Glu Met Pro Ser Asp385                 390                 395                 400Tyr His Glu Tyr Arg Ala Tyr Leu Pro Lys Val Leu Thr Gly Ser Leu
            405                 410                 415Gly Val Lys Tyr Thr Leu Leu Asp Lys Ala Ser His Asp Thr Arg Phe
        420                 425                 430Glu Phe Asp Leu Asn Gln Lys Asp Gly Glu Arg Ile Gln Ala Thr Leu
    435                 440                 445Ala Gln Asn Gln Gln Ser Asp His Glu Pro Trp Arg Ile Asp Ala Thr
450                 455                 460Trp Ala Asn Leu Ile Arg His Asp Ile Pro Gln Ile Gly Glu Ile His465                 470                 475                 480Ser Arg Ser Gly Gln Ala Ser Val Arg Leu Glu Asn Gly His Thr Tyr
            485                 490                 495Ile Asn Ala Ser Ala Asp Ile Val Lys Leu Asn Ala Val Pro Ser Gly
        500                 505                 510Ser Tyr His Val Gln Ala Asn Ile Glu Gln Asn Gln His Leu His Leu
    515                 520                 525Thr Asp Phe Asn Tyr Gln Gly Val Met Gly Glu Leu Thr Gly Thr Gly
530                 535                 540Arg Val Asp Phe Ala Thr Ala Gln Arg Pro Leu Glu Trp Gln Leu Asp545                 550                 555                 560Val Thr Ala Asn Pro Val Lys Pro Asn Ala Tyr Phe Gln Thr Pro Asn
            565                 570                 575Gln Thr Pro Phe Glu Gln Ile Ser Gly Arg Ile Ile Ala Ser Gly Arg
        580                 585                 590Leu Arg Glu Ile Asp Gly Val Ser Ile His Asp Ile Lys Val Asp Asp
    595                 600                 605Ser Asp Leu Thr Ala Leu Leu Asn Asp Gly Lys Gln Val His Leu Met
610                 615                 620Gly Gln Gly Val Ser Lys Ile Arg Leu Gln Asp Gly Gln Ile Ser His625                 630                 635                 640Leu Lys Ala Asn Phe Asp Gly Lys Leu Ala Gln Asp Ile Leu Pro Gln
            645                 650                 655Val Ala Asp Ser Ser Ile Gly Leu Asp Ile Glu Gly Asp Leu Asn Asp
        660                 665                 670Leu Thr Ile Thr Arg Ala Val Met Met Asn Asp Ser Gly Lys Val Ser
    675                 680                 685Leu Ala Gly Arg Leu Gly Leu Asn Asp Gly Ile His Trp Gln Ile Gln
690                 695                 700Gly Arg Leu Asp Glu Val Asp Thr Ala Ala Phe Val Asp Asp Asp Asn705                 710                 715                 720Leu Val Ala Ile Ile Thr Gly Asp Leu Ala Thr Ser Gly Arg Tyr Arg
            725                 730                 735Asp Gly Val Met Asp Asp Ile Ala Leu Thr Phe Asp Gly Gln Val Ile
        740                 745                 750Asn Asn Ser Ile Pro Asn Gly His Leu Ser Ile Asp Ala Thr Gly Ser
    755                 760                 765Gly Asn Arg Phe Met Val Asn His Leu Arg His Asp Gly Thr Ala Gly
770                 775                 780Thr Leu Asn Ala Thr Gly Trp Val Asp Ile Ser Gln Gly Ala Ala Trp785                 790                 795                 800Gln Leu Glu Ala Asp Met Asn Ser Leu Asn Leu Gly Ala Phe Ile Gln
            805                 810                 815Ser Leu Asp Thr Asp Leu Asn Gly Thr Ile Gln Leu Ala Gly Asn Trp
        820                 825                 830Gln Glu Ser His Gln Val Ile Asp Ile Ser Asn Leu Asp Ile Thr Gly
    835                 840                 845Ser Tyr Asn Asn Gln Pro Leu Ile Ala Thr Gly Ser Leu Tyr Ala Lys
850                 855                 860Leu Ser Leu Pro Lys Asp Leu Ala Gly Tyr Ile Gln Ser Ile Lys Gln865                 870                 875                 880Ala Ser Arg Pro Pro Thr Ser Ser Asp Asp Leu Leu Ala Leu Lys Asn
            885                 890                 895Arg Ile Asp Asn Asn Ala Arg Gln Thr Gln Asn Ile Val His Lys Leu
        900                 905                 910Asn Ala Asp Asn Leu Gln Val Arg Ile Gly Asn Asn His Leu Ala Ile
    915                 920                 925Ser Gly Asp Glu Arg Gln Leu Thr Ala Ser Val Asn Val Ile Asp Leu
930                 935                 940Gly Gln Leu Ile Asp Thr Ala Ser Gly Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile945                 950                 955                 960Val Val Asn Asp His His Ala Leu Pro Thr Leu Tyr Ile Asp Ala Ser
            965                 970                 975Val Ser Ser Leu Arg Phe Ala Asn Ile Thr Ile Gln Asn Ala Gln Ala
        980                 985                 990Ile Gly Lys Ile Val Asn Leu Gly Asn Ser Glu Ser Gln Leu Leu Val
    995                 1000                1005Gln Gly Asp Asp Ile Ile Val Met Gly Arg Thr Ile Lys Ser Ala Arg
1010                1015                1020Met Asp Phe Ser Gly Thr Glu Ala Asp His Ile Leu Ser Ile Ser Thr1025                1030                1035                104Lys Ser Gly Asp Ile Glu Ala Ser Met His Ile Asp Gly Ala Phe Asn
            1045                1050                1055Arg Asn Asn Met Arg Tyr His Gly Val Leu Ser Asp Gly Phe Val Lys
        1060                1065                1070Ser Gly Phe Gly Lys Met Ser Gln Arg Gln Pro Thr Glu Phe Ser Tyr
    1075                1080                1085Gly Leu Asp Asp Asn Ser Leu Gln Ile Ala Ala His Cys Trp Gln Ser
1090                1095                1100Ala His Ile Gln Gly Asp Gly Val Gly Ala Ile Cys Leu Gln Asp Thr1105                1110                1115                112Leu Ser Tyr Thr Pro Gln Ser Gly Asn Val Asn Leu Ile Ile Gln Asn
            1125                1130                1135Leu Asp Thr Gln Val Leu Leu Ala Ala Leu Pro Ser Asp Ile His Trp
        1140                1145                1150Lys Ser Met Leu Asn Gly Arg Ile Lys Ala Met Trp Gln Ala Gly Gln
    1155                1160                1165Ser Pro Leu Val Asp Ala Val Leu Tyr Ser Asp Asp Gly Thr Ile Gly
1170                1175                1180Leu Thr Gln Glu Glu Thr Gly Tyr Ile Glu Met Pro Tyr Gln Arg Ala1185                1190                1195                120Ser Val Ile Ala Lys Ser Val Asp Asn Gly Leu Lys Val Arg Thr Asp
            1205                1210                1215Ile Leu Gly Thr Ala Gly Arg Gly Tyr Ala Asp Val Ile Ile Asn Pro
        1220                1225                1230Lys Gln Thr Asp Lys Pro Ile Ser Gly Ala Leu Val Met Asn Asp Leu
    1235                1240                1245Asn Leu Ala Val Leu Arg Pro Phe Phe Pro Ser Ile Gln Thr Leu Ser
1250                1255                1260Gly Lys Val Ser Leu Ala Gly Gly Leu Gly Gly Thr Leu Ser Lys Pro1265                1270                1275                128Leu Phe Tyr Gly Asn Ala Asn Leu Lys Asn Gly Ala Leu Ala Ile Val
            1285                1290                1295Gly Val Pro Met Pro Ile Ser Asp Val Asp Ala Thr Val Asn Ile Arg
        1300                1305                1310Gly Thr Lys Ala Arg Leu Asp Gly Arg Phe Met Gly Gly Glu Gly His
    1315                1320                1325Gly Val Leu Tyr Gly Glu Met Asp Trp Ala Glu Glu Leu Tyr Ala Arg
1330                1335                1340Leu Gly Val Phe Gly Glu Asn Leu Thr Val Ser Gln Pro Pro Leu Val1345                1350                1355                136Thr Ala Gln Ile Ser Pro Glu Leu Glu Val Ile Ile Arg Pro Phe Gln
            1365                1370                1375Lys Phe Val Asp Val Gln Gly Val Val Ser Ile Pro Ser Ala Thr Ile
        1380                1385                1390Arg Pro Pro Glu Ala Thr Ala Asp Ile Val Thr Glu Ser Pro Asp Val
    1395                1400                1405Ser Val Ile Asp Arg Arg Ile Thr Gly Asn Ile Asp Gln Ile Leu Ser
1410                1415                1420Arg Ala Lys Pro Trp Asp Ile Asn Ala Asn Ile Gly Val Asp Leu Gly1425                1430                1435                144Asn Glu Ile Glu Phe Arg Gly Phe Gly Ala Val Leu Pro Leu Ala Gly
            1445                1450                1455Ala Ile His Leu Thr Gln Ser Gly Gln Gly Ala Met Gln Ala Leu Gly
        1460                1465                1470Val Val Gln Val Ser Lys Arg Thr Lys Ile Asp Val Ile Gly Gln Asn
    1475                1480                1485Leu Asp Leu Asn Tyr Ala Gln Ile Arg Phe Asp Gly Asp Met Leu Asn
1490                1495                1500Pro Arg Leu Ser Ile Glu Gly Glu Lys Gln Ile Glu Gly Gln Thr Val1505                1510                1515                152Gly Val Arg Ile Arg Gly Thr Ala Ser Asn Pro Asn Ile Thr Val Phe
            1525                1530                1535Asn Asp Ala Gly Leu Asp Glu Tyr Gln Ala Met Asn Ala Leu Val Thr
        1540                1545                1550Gly Arg Ile Ser Glu Ser Ser Asp Leu Gly Ile Thr Glu Gln Gly Phe
    1555                1560                1565Arg Ser Gln Val Thr Asn His Leu Ala Ala Ala Gly Leu Ser Leu Gly
1570                1575                1580Leu Ser Gly Thr Arg Asp Leu Thr Asn Gln Ile Gly His Ala Phe Gly1585                1590                1595                160Phe Gln Ser Leu Thr Ile Asp Ala Ser Gly Ser Ser Asp Asp Thr Asn
            1605                1610                1615Val Asn Val Thr Gly Tyr Ile Thr Pro Asp Leu Tyr Leu Arg Tyr Gly
        1620                1625                1630Val Gly Val Phe Asn Ala Glu Ser Thr Leu Ser Met Arg Tyr Gln Leu
    1635                1640                1645Thr Arg Arg Val Tyr Ile Glu Ala Thr Ser Ala Ala Glu Asn Met Val
1650                1655                1660Asp Val Ile Tyr Arg Trp Lys Phe1665                1670
<210>3
<211>2979
<212>DNA
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>3atgaatgact caggcaaagt atcgcttgca ggtcgtcttg gattaaatga cggtattcat        60tggcaaattc aagggcgatt agatgaggtg gataccgccg cttttgttga tgatgacaat       120ttagttgcga tcatcacagg cgatcttgcc acatcaggca gatatcgtga tggcgtgatg       180gatgatatcg cactcacttt tgatggtcaa gtgattaaca attcaatccc aaatggtcat       240ctaagtattg atgcgacagg ttctggcaat cgctttatgg tcaatcatct aagacatgat       300ggcacagcag gcacgctgaa tgcgacaggc tgggtagata ttagccaagg tgctgcatgg       360cagctagagg ctgatatgaa ttcattgaat ttgggtgcat ttatccagtc gctagatact       420gacttaaacg gtacaattca gcttgcaggc aactggcaag agtctcatca agtcattgat       480atcagtaatt tggatattac aggtagctac aataatcagc cacttatcgc cacaggcagc       540ttatatgcca agctttccct acctaaagat ttggctgggt atatccaaag tatcaagcaa       600gcaagccgcc caccgacttc gtctgatgat ttattggcac taaaaaatcg tattgataac       660aacgcacgcc aaacccaaaa tatcgttcat aaactcaatg ctgataatct acaagtccgc       720attggcaata atcatttggc catatcaggc gatgaaagac agttgaccgc cagtgtgaat       780gtgattgatc ttgggcagct gattgatacc gcaagtggtg cgattcaagg cggtgtgatt       840gtcgtcaatg atcatcacgc tttgccaact ttatatattg atgccagtgt ctcatcactc       900agatttgcca atatcaccat ccaaaacgcc caagctatcg gtaaaattgt caatctgggt       960aatagcgaaa gccagctgtt ggttcagggt gatgatatta tcgtgatggg acgcaccatt      1020aaatctgctc ggatggattt tagtggcaca gaagccgatc atatcttatc aatttcaacc      1080aaaagcggtg atatcgaagc atctatgcat attgatgggg catttaatcg caacaatatg      1140cgatatcatg gtgttttgtc tgatggtttt gtcaagagtg gatttggcaa aatgtcacag      1200cgtcagccga ccgagtttag ctatggattg gatgataata gcttacaaat tgcagcgcat      1260tgttggcaat cggcacatat ccaaggcgat ggcgtgggtg cgatttgttt acaagataca      1320ttaagttata caccgcaatc agggaatgtc aatcttatta tccaaaatct tgatactcaa      1380gtactattgg cggctctacc cagtgatatt cattggaaat ccatgctcaa tggtcgcatt      1440aaggcaatgt ggcaggcagg tcaatcacct ttggttgatg ctgtactgta ttctgatgat      1500ggtacaattg gcttaactca agaagagaca ggttatattg agatgccata tcagcgtgcg      1560tctgtgattg ccaaaagtgt tgataatggc ttaaaggtaa gaaccgatat cttgggtacg      1620gcaggtcgtg gttatgccga tgtaatcatc aaccccaagc aaacagacaa gcccatttct      1680ggtgcgcttg ttatgaatga tcttaatttg gcggtattgc gaccattttt cccgagcatt      1740caaacattga gcggtaaagt cagcttggca ggtggcttag gtggtacatt atccaaacca      1800ttgttttatg gtaatgccaa tttaaagaat ggtgcattag cgattgttgg cgtaccaatg      1860cccatttctg atgttgatgc cacggtgaac atacgaggta ctaaagcacg cttagacggt      1920agatttatgg gtggtgaggg tcatggtgtg ctttatggtg aaatggattg ggcagaagag      1980ctgtatgctc gccttggcgt atttggtgaa aatctgaccg tcagccagcc accgcttgtg      2040acggcacaaa tcagccctga gctggaagtg attatcagac ctttccaaaa atttgtagat      2100gttcaaggcg ttgttagtat cccatcagca accattcgtc cgccagaggc aaccgcagat      2160atcgtaaccg aatccccaga tgtatcagtc attgaccgcc gtatcacagg taatattgac      2220cagattttaa gtagagcgaa accttgggat attaatgcaa atatcggtgt tgatttgggt      2280aatgagattg aatttcgtgg atttggggcg gtattaccat tggcaggcgc gatacatttg      2340actcagtcag gacaaggtgc aatgcaagct cttggcgtgg ttcaggtttc taaacgcaca      2400aaaatcgatg tcatcggtca aaatttggat ttaaattatg cccaaattcg ttttgatggc      2460gacatgctta atccacgctt atctattgag ggtgaaaaac aaattgaagg gcaaacggtg      2520ggcgttcgca ttcgtggaac ggcatcaaat ccaaacatta ccgtatttaa tgatgcaggt      2580ttggatgaat accaagcaat gaatgcactg gtgacaggac gcattagcga atcaagtgat      2640ttgggtatca cagagcaggg ttttcgctca caagtaacca atcaccttgc tgctgctggc      2700ttaagcttag gtttgtcagg aaccagagat ttaaccaacc aaattggtca cgcatttggt      2760tttcagagtt tgaccattga tgcctcgggc agctcagatg ataccaatgt taatgttaca      2820ggctatatta caccagattt gtatttgcgt tatggcgtgg gtgtgtttaa tgctgaatca      2880accttatcca tgcgttatca attgacacgc cgtgtttata ttgaagcaac cagtgccgct      2940gaaaatatgg ttgatgtgat ttatcgttgg aagttttag                             2979
<210>4
<211>992
<212>PRT
<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)
<400>4Met Asn Asp Ser Gly Lys Val Ser Leu Ala Gly Arg Leu Gly Leu Asn1               5                  10                  15Asp Gly Ile His Trp Gln Ile Gln Gly Arg Leu Asp Glu Val Asp Thr
        20                  25                  30Ala Ala Phe Val Asp Asp Asp Asn Leu Val Ala Ile Ile Thr Gly Asp
    35                  40                  45Leu Ala Thr Ser Gly Arg Tyr Arg Asp Gly Val Met Asp Asp Ile Ala
50                  55                  60Leu Thr Phe Asp Gly Gln Val Ile Asn Asn Ser Ile Pro Asn Gly His65                  70                  75                  80Leu Ser Ile Asp Ala Thr Gly Ser Gly Asn Arg Phe Met Val Asn His
            85                  90                  95Leu Arg His Asp Gly Thr Ala Gly Thr Leu Asn Ala Thr Gly Trp Val
        100                 105                 110Asp Ile Ser Gln Gly Ala Ala Trp Gln Leu Glu Ala Asp Met Asn Ser
    115                 120                 125Leu Asn Leu Gly Ala Phe Ile Gln Ser Leu Asp Thr Asp Leu Asn Gly
130                 135                 140Thr Ile Gln Leu Ala Gly Asn Trp Gln Glu Ser His Gln Val Ile Asp145                 150                 155                 160Ile Ser Asn Leu Asp Ile Thr Gly Ser Tyr Asn Asn Gln Pro Leu Ile
            165                 170                 175Ala Thr Gly Ser Leu Tyr Ala Lys Leu Ser Leu Pro Lys Asp Leu Ala
        180                 185                 190Gly Tyr Ile Gln Ser Ile Lys Gln Ala Ser Arg Pro Pro Thr Ser Ser
    195                 200                 205Asp Asp Leu Leu Ala Leu Lys Asn Arg Ile Asp Asn Asn Ala Arg Gln
210                 215                 220Thr Gln Asn Ile Val His Lys Leu Asn Ala Asp Asn Leu Gln Val Arg225                 230                 235                 240Ile Gly Asn Asn His Leu Ala Ile Ser Gly Asp Glu Arg Gln Leu Thr
            245                 250                 255Ala Ser Val Asn Val Ile Asp Leu Gly Gln Leu Ile Asp Thr Ala Ser
        260                 265                 270Gly Ala Ile Gln Gly Gly Val Ile Val Val Asn Asp His His Ala Leu
    275                 280                 285Pro Thr Leu Tyr Ile Asp Ala Ser Val Ser Ser Leu Arg Phe Ala Asn
290                 295                 300Ile Thr Ile Gln Asn Ala Gln Ala Ile Gly Lys Ile Val Asn Leu Gly305                 310                 315                 320Asn Ser Glu Ser Gln Leu Leu Val Gln Gly Asp Asp Ile Ile Val Met
            325                 330                 335Gly Arg Thr Ile Lys Ser Ala Arg Met Asp Phe Ser Gly Thr Glu Ala
        340                 345                 350Asp His Ile Leu Ser Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Ile Glu Ala Ser
    355                 360                 365Met His Ile Asp Gly Ala Phe Asn Arg Asn Asn Met Arg Tyr His Gly
370                 375                 380Val Leu Ser Asp Gly Phe Val Lys Ser Gly Phe Gly Lys Met Ser Gln385                 390                 395                 400Arg Gln Pro Thr Glu Phe Ser Tyr Gly Leu Asp Asp Asn Ser Leu Gln
            405                 410                 415Ile Ala Ala His Cys Trp Gln Ser Ala His Ile Gln Gly Asp Gly Val
        420                 425                 430Gly Ala Ile Cys Leu Gln Asp Thr Leu Ser Tyr Thr Pro Gln Ser Gly
    435                 440                 445Asn Val Asn Leu Ile Ile Gln Asn Leu Asp Thr Gln Val Leu Leu Ala
450                 455                 460Ala Leu Pro Ser Asp Ile His Trp Lys Ser Met Leu Asn Gly Arg Ile465                 470                 475                 480Lys Ala Met Trp Gln Ala Gly Gln Ser Pro Leu Val Asp Ala Val Leu
            485                 490                 495Tyr Ser Asp Asp Gly Thr Ile Gly Leu Thr Gln Glu Glu Thr Gly Tyr
        500                 505                 510Ile Glu Met Pro Tyr Gln Arg Ala Ser Val Ile Ala Lys Ser Val Asp
    515                 520                 525Asn Gly Leu Lys Val Arg Thr Asp Ile Leu Gly Thr Ala Gly Arg Gly
530                 535                 540Tyr Ala Asp Val Ile Ile Asn Pro Lys Gln Thr Asp Lys Pro Ile Ser545                 550                 555                 560Gly Ala Leu Val Met Asn Asp Leu Asn Leu Ala Val Leu Arg Pro Phe
            565                 570                 575Phe Pro Ser Ile Gln Thr Leu Ser Gly Lys Val Ser Leu Ala Gly Gly
        580                 585                 590Leu Gly Gly Thr Leu Ser Lys Pro Leu Phe Tyr Gly Asn Ala Asn Leu
    595                 600                 605Lys Asn Gly Ala Leu Ala Ile Val Gly Val Pro Met Pro Ile Ser Asp
610                 615                 620Val Asp Ala Thr Val Asn Ile Arg Gly Thr Lys Ala Arg Leu Asp Gly625                 630                 635                 640Arg Phe Met Gly Gly Glu Gly His Gly Val Leu Tyr Gly Glu Met Asp
            645                 650                 655Trp Ala Glu Glu Leu Tyr Ala Arg Leu Gly Val Phe Gly Glu Asn Leu
        660                 665                 670Thr Val Ser Gln Pro Pro Leu Val Thr Ala Gln Ile Ser Pro Glu Leu
    675                 680                 685Glu Val Ile Ile Arg Pro Phe Gln Lys Phe Val Asp Val Gln Gly Val
690                 695                 700Val Ser Ile Pro Ser Ala Thr Ile Arg Pro Pro Glu Ala Thr Ala Asp705                 710                 715                 720Ile Val Thr Glu Ser Pro Asp Val Ser Val Ile Asp Arg Arg Ile Thr
            725                 730                 735Gly Asn Ile Asp Gln Ile Leu Ser Arg Ala Lys Pro Trp Asp Ile Asn
        740                 745                 750Ala Asn Ile Gly Val Asp Leu Gly Asn Glu Ile Glu Phe Arg Gly Phe
    755                 760                 765Gly Ala Val Leu Pro Leu Ala Gly Ala Ile His Leu Thr Gln Ser Gly
770                 775                 780Gln Gly Ala Met Gln Ala Leu Gly Val Val Gln Val Ser Lys Arg Thr785                 790                 795                 800Lys Ile Asp Val Ile Gly Gln Asn Leu Asp Leu Asn Tyr Ala Gln Ile
            805                 810                 815Arg Phe Asp Gly Asp Met Leu Asn Pro Arg Leu Ser Ile Glu Gly Glu
        820                 825                 830Lys Gln Ile Glu Gly Gln Thr Val Gly Val Arg Ile Arg Gly Thr Ala
    835                 840                 845Ser Asn Pro Asn Ile Thr Val Phe Asn Asp Ala Gly Leu Asp Glu Tyr
850                 855                 860Gln Ala Met Asn Ala Leu Val Thr Gly Arg Ile Ser Glu Ser Ser Asp865                 870                 875                 880Leu Gly Ile Thr Glu Gln Gly Phe Arg Ser Gln Val Thr Asn His Leu
            885                 890                 895Ala Ala Ala Gly Leu Ser Leu Gly Leu Ser Gly Thr Arg Asp Leu Thr
        900                 905                 910Asn Gln Ile Gly His Ala Phe Gly Phe Gln Ser Leu Thr Ile Asp Ala
    915                 920                 925Ser Gly Ser Ser Asp Asp Thr Asn Val Asn Val Thr Gly Tyr Ile Thr
930                 935                 940Pro Asp Leu Tyr Leu Arg Tyr Gly Val Gly Val Phe Asn Ala Glu Ser945                 950                 955                 960Thr Leu Ser Met Arg Tyr Gln Leu Thr Arg Arg Val Tyr Ile Glu Ala
            965                 970                 975Thr Ser Ala Ala Glu Asn Met Val Asp Val Ile Tyr Arg Trp Lys Phe
        980                 985                 990
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5cccaccgttt gcccttcaat                                                  20
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6catttttccc gagcattcaa ac                                               22
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7aatcagccac ttatcgccac                                                  20
<210>8
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<210>9
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<210>10
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10tcatgaatga ctcaggcaaa g                                                21
<210>11
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
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<210>13
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13acaaattgca gcgcattgtt gg                                               22
                       134表
申请人或代理人档案号 国际申请号  PCT/EP00/09495
                关于微生物保藏的说明
                     (细则13之二)
A.对说明书     第42页第 17行    -    第 43页第 5行  所述的微生物的说明
B.保藏事项
保藏单位名称 美国典型培养物保藏中心
保藏单位地址(包括邮政编码和国名)10801 University Blvd.Manassas，Virginia 20110-2209USA
保藏日期    1997年6月21日和1999年2月12日    保藏编号    43617和207105
C.补充说明(必要时)
对于寻求欧洲专利的指定，保藏的微生物样品将在欧洲专利被授予或者本申请被驳回或撤回或被视为撤回之日向公众发放，且发放对象限于请求人指定的专家。
D.本说明是为下列指定国作的(如果说明不是为所有指定国而作的)
E.补充说明(必要时)
下列说明将随后向国际局提供(写出说明的类别，例如：“保藏的编号”)
Figure A0081650100631
PCT/RO/134表(1992年7月)

Claims (26)

1.一种分离的多肽，该多肽含有一段氨基酸序列，该氨基酸序列与选自：序列编号：2和序列编号：4的全长氨基酸序列分别具有至少85％的同一性。
2.权利要求1的一种分离的多肽，其中的氨基酸序列与选自：序列编号：2和序列编号：4的全长氨基酸序列分别具有至少95％的同一性。
3.权利要求1的多肽，该多肽包含一段选自序列编号：2和序列编号：4的氨基酸序列。
4.序列编号：2或序列编号：4的一种分离的多肽。
5.权利要求1-4之一的多肽的一种免疫原性片段，其中该免疫原性片段的免疫原性与序列编号：2或序列编号：4的多肽基本相同。
6.权利要求1-5之一的一种多肽，其中该多肽是一种较大的融合蛋白的一部分。
7.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸可编码权利要求1-6之一的一种多肽。
8.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有一段可编码一种多肽的核苷酸序列，该多肽与序列编号：2或4的全长氨基酸序列分别具有至少85％的同一性；或与这种分离的多核苷酸互补的一种核苷酸序列。
9.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有一段核苷酸序列，该序列与编码序列编号：2或4的全部编码区的一种核苷酸序列具有至少85％的同一性；或与这种分离的多核苷酸互补的一种核苷酸序列。
10.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有一段核苷酸序列，该序列与序列编号：1或3的全长核苷酸序列分别具有至少85％的同一性；或与这种分离的多核苷酸互补的一种核苷酸序列。
11.权利要求7-10之一的一种分离的多核苷酸，其中与序列编号：1或3的同一性至少为95％。
12.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有一段核苷酸序列，该序列可编码序列编号：2或序列编号：4的多肽。
13.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有序列编号：1或序列编号：3的多核苷酸。
14.一种分离的多核苷酸，该多核苷酸含有一段核苷酸序列，该序列可编码序列编号：2、序列编号：4的多肽，获得该多核苷酸的方法可以是，在严格杂交条件下用一种具有序列编号：1或序列编号：3所述序列的标记探针或其片段对适当的库进行筛选。
15.一种表达载体或一种活体重组微生物，该载体或该活体重组微生物含有权利要求7-14之一的一种分离的多核苷酸。
16.含有权利要求15的表达载体的一种宿主细胞，或该宿主细胞的一种亚细胞组分或膜，该宿主细胞或其亚细胞组分或膜能够表达一种分离的多肽，该多肽含有一段氨基酸序列，该序列与选自序列编号：2和序列编号：4的氨基酸序列具有至少85％的同一性。
17.一种方法，用于产生权利要求1-6的一种多肽，该方法包括，在足以产生所述多肽的条件下培养权利要求16的一种宿主细胞，以及从培养基中回收这种多肽。
18.一种方法，用于表达权利要求7-14之一的一种多核苷酸，该方法包括，用至少含有一种所述多核苷酸的表达载体对一种宿主细胞进行转化，以及在足以表达任何一种所述多核苷酸的条件下培养该宿主细胞。
19.一种疫苗组合物，该组合物含有有效剂量的权利要求1-6之一的一种多肽和一种药学容许的载体。
20.一种疫苗组合物，该组合物含有有效剂量的权利要求7-14之一的一种多核苷酸和一种有效的药用载体。
21.权利要求19或20之一的一种疫苗组合物，其中该组合物至少含有粘膜炎莫拉氏菌以外的一种抗原。
22.一种抗体，该抗体对权利要求1-6之一的多肽或免疫原性片段具有免疫特异性。
23.一种诊断粘膜炎莫拉氏菌感染的方法，该方法包括，确定权利要求1-6之一的一种多肽或对该多肽具有免疫特异性的一种抗体在怀疑患有这种感染的动物的生物学样品中的存在情况。
24.一种组合物在一种药剂的制备中的应用，该组合物含有免疫学有效剂量的权利要求1-6之一的一种多肽，该药剂用于在动物体内产生免疫应答。
25.一种组合物在一种药剂的制备中的应用，该组合物含有免疫学有效剂量的权利要求7-14之一的一种多核苷酸，该药剂用于在动物体内产生免疫应答。
26.一种治疗组合物，可用于对患有粘膜炎莫拉氏菌性疾病的人进行治疗，该组合物至少含有一种针对权利要求1-6之一的多肽的抗体，以及一种适当的药用载体。
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