KR102175159B1 - 재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 d/c형 중쇄 c말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트 - Google Patents

재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 d/c형 중쇄 c말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR102175159B1
KR102175159B1 KR1020180172372A KR20180172372A KR102175159B1 KR 102175159 B1 KR102175159 B1 KR 102175159B1 KR 1020180172372 A KR1020180172372 A KR 1020180172372A KR 20180172372 A KR20180172372 A KR 20180172372A KR 102175159 B1 KR102175159 B1 KR 102175159B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
type
heavy chain
coli
botulinum toxin
recombinant
Prior art date
Application number
KR1020180172372A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200082118A (ko
Inventor
정병열
황미혜
손영민
이경현
현방훈
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020180172372A priority Critical patent/KR102175159B1/ko
Publication of KR20200082118A publication Critical patent/KR20200082118A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102175159B1 publication Critical patent/KR102175159B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/33—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Clostridium (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/24—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a MBP (maltose binding protein)-tag

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단을 발현하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 삽입되어 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 대량 생산할 수 있는 형질전환 대장균, 상기 형질전환 대장균을 배양하여 분리한 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 재조합 단백질을 이용하여 가축 보툴리즘 D/C형 중독증을 예방하기 위한 백신 및 가축의 보툴리즘 D/C형 중독증 진단용 키트에 관한 것이다.

Description

재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 D/C형 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트{Recombinant vector, transformed E.coli, vaccine composition comprising recombinant protein derived from heavy-chain C-terminal domain of Clostridium botulinum type D/C}
본 발명은 재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트에 관한 것으로, 보다 상세하게는 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 발현하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터가 삽입되어 상기 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 대량 생산할 수 있는 형질전환 대장균, 상기 형질전환 대장균을 배양하여 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 대량 생산하는 방법 및 상기 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 포함하는 가축의 보툴리즘 D/C형에 의한 중독증을 예방하기 위한 백신 조성물과 가축의 보툴리즘 D/C형 중독증 진단용 키트에 관한 것이다.
보툴리즘(Botulism)은 혐기성 세균인 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum)이 산생한 신경독소에 의해 유발되는 신경성 중독증이다. 클로스트리디움 보툴리눔은 그람 양성 간균으로서 산소에 노출되거나 낮은 습도, 고온, 영양부족과 같은 발육여건이 좋지 않으면 장기간 생존하기 위하여 아포(spore)를 형성하는 특징이 있다. 따라서 이러한 아포를 이용하여 클로스트리디움 보툴리눔은 토양 등 환경에 널리 분포하며, 수년간 생존할 수 있다.
보툴리눔 독소는 치사량이 척추동물 1 ㎏당 1 ng으로 지구상에 존재하는 독소 중 가장 강력한 독소이며, 청산가리보다 100만배 이상 강력한 것으로 알려져 있다. 높은 독성 때문에 미국 질병관리본부(Centers for Disease control and prevention, CDC)에서는 위험도, 무기화 가능성 등을 고려하여 탄저, 페스트 및 두창과 함께 생물 작용제 카테고리 A로 분류하였다(비특허문헌 1).
소 보툴리즘은 주로 이완성 마비를 나타내는데, 초기에는 보행착란으로 시작하여 수 시간에서 수일 동안 병증이 진행되어 횡와자세를 보이다가 결국 호흡근육마비로 폐사하는데, 국내의 경우 2011~2012년에 포천과 연천지역의 소 수백 두에서 보툴리즘이 발생하여 큰 사회 문제가 되었으며, 이후 매년 수십 두의 소에서 산발적으로 보툴리즘이 발생하여 농가에 지속적인 피해를 유발하고 있다.
보툴리눔 균은 환경 등에 널리 분포하고 있다가 혐기조건, 적절한 온도와 수분 등 균이 발육하기 좋은 여건이 되면 증식하면서 주위에 독소를 퍼트리는데, 보툴리눔 독소는 주로 사체나 밀폐된 곤포 사일레지 등을 오염시키는 것으로 알려져 있다(비특허문헌 2).
보툴리눔 신경독소(botulinum neurotoxin)는 A~G까지 7가지 독소형으로 구분되는데, 사람은 주로 A, B, E형에 중독되며, 소와 말은 주로 B, C, D형, 조류는 C, D형, 돼지는 보툴리눔 중독에 대한 보고가 거의 없으며 어류나 해산물은 주로 독소형 E에 영향을 받는다. G형은 1970년대에 발견되었으나 작용 기작이나 특이성 여부가 명확하게 규명되지 않았다(비특허문헌 3).
보툴리눔은 생화학 성상에 따라 4그룹으로 나누어지는데, 가축이 중독되는 그룹III는 C와 D형, 그리고 C와 D형이 융합된 C/D mosaic형과 D/C mosaic형이 있다(비특허문헌 4).
보툴리눔 신경독소는 약 150kDa 크기의 단백질로 세 개의 작용 도메인을 가지고 있다. 그 기능에 따라 중쇄 C말단, 중쇄 N말단(heavy chain N-terminal, Hn), 경쇄(Light chain, LC) 세 가지의 도메인으로 나눌 수 있다.
상기 중쇄 C말단은 50kDa의 분자량을 가지고 있으며 신경세포에 존재하는 수용체(receptor)에 특이적으로 결합 하여 보툴리눔 독소가 신경세포내로 들어가게 유도한다. 또한, 중쇄 N말단은 50kDa의 분자량으로 세포내로 들어온 보툴리눔 독소에서 실제 독성을 띄는 경쇄를 이동시키는 역할을 한다.
한편, 경쇄는 활성화 부위에 존재하는 아연(Zinc, Zn2 +)을 매개로 하여 시냅스 소포체(synaptic vesicle) 단백질을 가수분해하는 역할을 한다. 보툴리눔 독소형 B, D, F, G는 시냅스 소포체에 존재하는 시냅토브레빈(synaptobrevin)을 분해하고, 독소형 A, C, E는 신경세포막에 부착해 있는 SNAP-25를 분해하며, 독소형 C는 신탁신(syntaxin)을 분해하는데, 모든 독소형들은 아세틸콜린의 분비를 방해하여 근육의 이완성 마비를 유발한다(비특허문헌 5).
보툴리즘은 세균에 의한 감염증이 아니라 독소에 의한 중독증이므로, 항생제를 투여해도 큰 효과를 기대할 수 없다. 확진된 독소형에 대한 항독소를 주사한다면 혈액 중의 독소를 중화시켜 병증의 진행을 막을 수 있으나, 항독소의 가격 등을 고려할 때 현재 가축에게 항독소를 사용하는 것은 실효성이 없다.
보툴리즘은 집단폐사가 아니면 초기 진단이 어렵고, 특징적인 부검소견이 없어 실험실 진단 또한 어려워 백신접종이 유일한 대책이다. 초창기의 보툴리눔 백신은 독소를 포르말린으로 불활화한 톡소이드 백신인데 이들이 현재까지 사용되고 있다.
그러나, 대량의 균배양이 필요한 톡소이드 백신은 생물안전 3등급 시설을 현재 요구하고 있으며, 많은 양의 독소를 다루어야 하므로 불활성화가 되지 않을 경우 심각한 부작용을 유발할 수 있는 위험성이 있다. 최근에는 독소의 중쇄 및 경쇄를 이용한 재조합 단백질에 대한 연구가 시도되고 있다(비특허문헌 6).
가축의 보툴리즘은 주로 B, C, C/D, D, D/C형 독소에 의해 유발되며, D/C형 보툴리즘 발생에 대비하여 안전성과 효능이 담보된 재조합 형태의 D/C형 보툴리즘 백신 개발이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 재조합 기술을 이용하여 국내에서 분리한 보툴리눔 독소 D/C형에서 중쇄 C말단 염기서열을 이용하여 재조합 벡터를 제작하였고, 상기 재조합 벡터를 이용한 형질전환 대장균에서 생산되는 재조합 단백질을 백신 및 진단 조성물로 하여 가축에서 발생하는 보툴리눔 독소 D/C형에 의한 중독증을 예방 및 진단할 수 있도록 하였다.
JAMA. 2001;285:1059-1070 J Vet Diagn Invest. 1999;12:453-455 Botulinum toxin. 2007, Chapter 16, 337-353 Appl Environ Microbiol. 2012;78:3120-3127 Ann Rev Biochem. 2010;79:591-617 Infect Immun. 1995;63:2738-2742
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 도출된 것으로, 본 발명의 목적은 보툴리눔 독소 D/C형에서 중쇄 C말단의 염기서열이 삽입된 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 생산할 수 있는 형질전환 대장균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 대장균을 이용하여 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 대량으로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 말토오스 결합 단백질(MBP)을 코딩하는 유전자 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 보툴리눔 D/C형의 중쇄 C말단 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터가 삽입된 형질전환 대장균을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 대장균을 배양하는 단계를 포함하는, 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래 재조합 단백질의 대량생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 대장균이 생산하는 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 가축의 보툴리즘 D/C형 중독증 예방용 백신 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환 대장균이 생산하는 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 가축의 보툴리즘 B형 진단용 키트를 제공한다.
본 발명은 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 생산하는 형질전환 대장균을 제작하고, 상기 균주가 생성하는 보툴리눔 D/C형 독소 중쇄 C말단 단백질을 백신 및 진단용으로 가축에 사용함으로써, 효과적이고 안전하게 보툴리즘 D/C형 예방 및 진단에 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따라, 말토오스 결합 단백질(MBP), 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 결합의 형태인 재조합 벡터 pMAL-c2X-HCR-D/C의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 2에 의해 발현 유도된 보툴리눔 D/C형 독소 중쇄 C말단 재조합 단백질의 발현 확인 및 정제를 마친 후 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 것으로서, A의 레인 M은 마커, S는 수용성 단백질, P는 불용성 단백질로 IPTG를 이용하여 단백질의 발현 전과 후를 확인한 것이고, B의 레인 M은 마커, 레인 1은 보툴리눔 D/C형 독소 중쇄 C말단 단백질을 확인한 것이다.
본 발명의 제1 구현예는 말토오스 결합 단백질(MBP)을 코딩하는 유전자 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 보툴리눔 D/C형의 중쇄 C말단 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결된 재조합 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 상기 재조합 벡터에서, 상기 보툴리눔 D/C형의 중쇄 C말단 단백질을 코딩하는 유전자는 국내에서 분리된 보툴리눔 D/C형 균주로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 벡터에서, 상기 재조합 벡터는 도 1의 개열지도를 갖는 pMAL-c2X-HCR-D/C일 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 벡터는 국내에서 분리한 보툴리눔 독소 D/C형의 중쇄 C말단 부위를 증폭하여, 말토오스 결합 단백질(MBP) 및 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 결합의 형태로 발현시킬 수 있는 특징을 가지고 있다.
본 발명의 제2 구현예는 상기의 재조합 벡터가 삽입된 형질전환 대장균에 관한 것이다.
본 발명의 상기 형질전환 대장균은 대장균(Escherichia coli) pMAL-c2X-HCR-D/C (KCTC 13655BP)일 수 있다.
본 발명의 제3 구현예는 상기 형질전환 대장균을 배양하는 단계를 포함하는 보툴리눔 B형 중쇄 C말단 유래 재조합 단백질의 대량생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 대량생산 방법은 상기 형질전환 대장균을 항생제, 바람직하게는 암피실린이 포함되어 있는 배지, 바람직하게는 LB(Luria-Bertani) 배지에 접종하여 35~39℃, 바람직하게는 36~38℃에서, 10~24시간, 바람직하게는 10~18시간, 보다 바람직하게는 12시간 동안 진탕 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 대량생산 방법은 상기 배양이 끝난 후 원심분리하고, 펠렛(pellet)을 회수 정제하는 단계를 더 포함한다.
본 발명의 상기 대량생산 방법은 상기 형질전환 대장균의 배양에 의해 발현된 단백질을 정제하기 위하여, 말토오스 결합 친화성 컬럼(maltose binding affinity column)을 이용하여 보툴리눔 D/C형 독소 중쇄 C말단 재조합 단백질을 분리해 낼 수 있다.
본 발명의 제4 구현예는 상기 형질전환 대장균이 생산하는 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 가축의 보툴리즘 D/C형 중독증 예방용 백신 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 예방용 백신 조성물에서, 상기 가축은 소, 말, 양, 조류, 개, 고양이, 밍크 및 여우로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서는 유럽약전(European Pharmacopoeia 5th ed. Clostridium botulinum vaccine for veterinary use)에서 제시한 마우스 실험을 통해 보툴리눔 독소 D/C형에 대한 방어효능을 확인하였다.
본 발명의 제5 구현예는 상기 형질전환 대장균이 생산하는 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 가축의 보툴리즘 D/C형 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명의 상기 키트에서, 상기 가축은 소, 말, 양, 조류, 개, 고양이, 밍크 및 여우로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 재조합 유전자 및 재조합 벡터의 구축
보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단에 대한 염기서열을 BLAST로 분석하고, 프라이머를 이용하여 국내에서 분리된 보툴리눔 독소 D/C형의 중쇄 C말단 부분을 증폭하였다.
증폭된 산물은 pMAL-c2X 벡터에 클로닝하였고, 상기에서 제작한 벡터를 pMAL-c2X-HCR-D/C로 최종 명명하였으며, 그 개열지도는 도 1과 같다.
< 실시예 2> 재조합 유전자의 단백질 발현
상기 실시예 1에서 제작한 재조합 벡터 pMAL-c2X-HCR-D/C를 숙주세포인 대장균에 삽입시켜 형질전환 대장균을 제작하여 재조합 단백질 발현에 사용하였다.
이때, 유전자 발현을 위한 상기 숙주세포로는 대장균 BL21(DE3)을 사용하였으며, 상기 재조합 벡터의 삽입은 100㎕ 수용성(competent) 대장균 BL21를 얼음에서 해동하고, 상기 재조합 벡터 5㎕를 혼합한 후, 얼음에서 30분간 정치시켰다.
그런 다음, 42℃에서 45초간 열 쇼크를 가하고 얼음에서 2분간 정치한 후, 1㎖의 LB 배지를 첨가하여, 37℃에서 1시간 동안 진탕 배양하였다. 형질 전환된 대장균을 암피실린(ampicillin, 50 ㎍/㎖)이 포함된 아가 플레이트에 도말하고, 37℃에서 16시간 두었다. 암피실린 내성을 갖는 클론을 선택하여 상기 형질전환 대장균을 제조하였다.
상기 형질전환 대장균은 한국생명공학연구원의 생물자원센터에 기탁하여 기탁번호(KCTC 13655BP)를 부여받았다.
상기 형질전환 대장균을 암피실린이 포함되어 있는 LB 배지에 접종하여 37℃, 12시간 진탕 배양하였다. 배양액은 암피실린과 2% 글루코오스(glucose)가 포함되어 있는 500 ㎖의 LB 배지에 1/50로 접종하였다.
OD600=0.6까지 형질전환 대장균이 자라면 4℃에서 1시간 동안 배양하여 대장균의 성장을 멈추었다. IPTG를 첨가하여 16℃, 24시간 진탕 배양이 끝난 후 6,000rpm, 10분 원심분리하고 펠렛을 회수하였다.
용균 버퍼(lysis buffer)로 펠렛을 부유시켜 초음파 파쇄를 통하여 균을 파쇄하였다. 파쇄된 용액을 17,000rpm, 4℃, 30분간 원심분리하여 수용성 단백질 구획과 불용성 단백질 구획으로 나누어, 12% SDS-PAGE상에서 단백질 발현 양상을 확인하였다(도 2 참조).
발현된 단백질을 정제하기 위하여, MBP 결합 친화성 컬럼(MBP binding affinity column을 이용하여 재조합 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 얻었다.
< 실시예 3> 보툴리눔 독소 D/C형 재조합 단백질의 실험동물 방어효과
보툴리눔 독소 D/C형에 대한 재조합 단백질의 마우스 방어효과를 확인하였다. 18~20g ICR 마우스를 실험군당 10마리씩 나누어, 보툴리눔 독소 D/C형 재조합 단백질을 1㎍/마우스, 5㎍/마우스 및 10㎍/마우스의 양으로 1회 근육 접종하였고, 음성 대조군은 PBS를 동일 용량으로 근육 접종하였다.
재조합 단백질 접종 3주째에 보툴리눔 독소 D/C형을 각각 25LD50의 용량으로 복강에 공격접종한 후, 1주일 동안 생존율을 확인하였다.
하기 표 1은 다양한 농도의 재조합 단백질로 마우스에 1회 면역시킨 후, 각각 보툴리눔 독소 D/C형 25LD50으로 공격접종한 뒤 1주일간 생존율을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
Figure 112020074053016-pat00005
상기 표 1에 제시된 바와 같이, 보툴리눔 독소 D/C형 공격접종 시 PBS를 접종한 음성 대조군과 재조합 단백질 1㎍/마우스 접종군에서는 모두 폐사하였고, 5㎍/마우스 접종군에서는 1마리가 폐사하여 90%의 생존율 보였고, 10㎍/마우스 접종군에서는 100% 생존율을 보였다.
하기 표 2는 다양한 농도의 재조합 단백질로 마우스를 2회 면역시킨 후, 각각 보툴리눔 독소 D/C형 25LD50으로 공격접종한 뒤 일주일간 생존율을 관찰한 결과를 나타낸 것이다.
즉, 하기 표 2는 18~20g ICR 마우스를 실험군당 10마리로 그룹을 나누어, 보툴리눔 독소 D/C형 재조합 단백질을 1㎍/마우스, 5㎍/마우스 및 10㎍/마우스의 양으로 1차 접종 2주 후에 2차 접종하고, 1차 접종 3주후에 보툴리눔 독소 D/C형을 각각 25LD50의 용량으로 복강에 공격접종한 후, 일주일 동안 생존율을 확인한 결과이다.
Figure 112020074053016-pat00006
상기 표 2에 제시된 바와 같이, 보툴리눔 독소 D/C형 공격접종 시 PBS를 접종한 음성 대조군은 모두 폐사하였으나, 본 발명의 보툴리눔 독소 D/C형 재조합 단백질을 2회 접종한 1㎍/마우스 접종군은 2마리가 폐사하여 80%의 생존율을 보였고, 5㎍/마우스 및 10㎍/마우스 접종군에서는 100% 생존율을 보였다.
상술한 바와 같이 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 본 발명의 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명은 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 재조합 단백질을 대량 생산하는 형질전환 대장균을 이용하여 상기 균주가 생성하는 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 백신 및 진단용 항원으로 사용함으로써, 국내 가축에서 발생하는 D/C형 보툴리즘을 효과적으로 예방 및 진단하여 가축의 폐사율을 크게 감소시킬 것으로 예상된다.
또한, 국내 백신 제조업체의 신제품 개발로 수입 백신 대체에 따른 외화 절감 효과 및 국내 백신의 해외 수출 효과 등 국가 경제에 미치는 긍정적 효과가 클 것으로 기대된다.
한국생명공학연구원 KCTC13655BP 20181004
<110> Republic of Korea(Animal and Plant Quarantine Agency) <120> Recombinant vector, transformed E.coli, vaccine composition comprising recombinant protein derived from heavy-chain C-terminal domain of Clostridium botulinum type D/C <130> 11230 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1233 <212> DNA <213> Clostridium botulinum <400> 1 aaaaatactt tgatggatac atcaggatat aacgcagaag tgagagtaga aggcaatgtt 60 cagcttaatc caatatttcc atttgacttt aaattaggta gttcagggga tgatagaggt 120 aaagttatag taacccagaa tgaaaatatt gtatataatg ctatgtatga aagttttagt 180 attagttttt ggattaggat aaataaatgg gtaagtaatt tacctggata tactataatt 240 gatagtgtta aaaataactc aggttggagt ataggtatta ttagtaattt tttagtgttt 300 actttaaaac aaaatgaaaa tagtgaacaa gatataaact ttagttatga tatatcaaag 360 aatgctgcgg gatataataa atggtttttt gtaactatta ctaccaatat gatgggaaat 420 atgatgattt atataaatgg aaaattaata gatactataa aagttaaaga gttaactgga 480 attaatttta gcaaaactat aacatttcaa atgaataaaa ttccaaatac tggcttaatt 540 acctcagatt ctgataacat caatatgtgg ataagggatt tttatatctt tgctaaagaa 600 ttagatgata aagatattaa tatattattt aatagcttgc aatatactaa tgttgtaaaa 660 gattattggg gaaatgattt aagatatgat aaagaatatt acatgattaa cgtaaattat 720 atgaatagat atatgtctaa aaaaggcaat ggaattgttt ttaatacacg taaaaataat 780 aatgacttca atgaaggata taaaattata ataaaaagaa ttagaggaaa tacaaatgat 840 actagagtac gaggagaaaa tgtattatat tttaatacta caattgataa caaacaatat 900 agtttaggta tgtataaacc ttctagaaat ctagggactg atttagttcc actaggtgca 960 ttggatcaac caatggatga gatacgtaaa tatggttcgt ttataataca accatgcaat 1020 acttttgatt actgtgcatc acaattattt ttgtcaagta atgcaacaac aaataggctt 1080 ggaatactat caattggtag ttatagtttc aaacttggag atgactattg gtttaatcac 1140 gaatatttaa ttcctgttat aaaaatagag cattatgctt cattattaga atcaacatca 1200 actcattggg tttttgtacc tgcaagtgaa taa 1233

Claims (10)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 재조합 벡터가 삽입된 형질전환 대장균(Escherichia coli) pMAL-c2X-HCR-D/C (KCTC 13655BP)이 생산하는 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는, 가축의 보툴리즘 D/C형 중독증 예방용 백신 조성물로서,
    상기 재조합 벡터는 말토오스 결합 단백질(MBP)을 코딩하는 유전자, 및 서열번호 1의 염기서열로 이루어지고, 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)의 중쇄 C말단 단백질을 코딩하는 유전자가 작동가능하게 연결되고,
    상기 보툴리눔 독소 D/C 모자이크형(BoNT/DC)형의 중쇄 C말단 단백질을 코딩하는 유전자는 국내에서 분리된 보툴리눔 D/C형 균주 유래이며,
    상기 재조합 벡터가 도 1의 개열지도를 갖는 pMAL-c2X-HCR-D/C인 것을 특징으로 하는 가축의 보툴리즘 D/C형 중독증 예방용 백신 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 가축은 소, 말, 양, 조류, 개, 고양이, 밍크 및 여우로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  9. 삭제
  10. 삭제
KR1020180172372A 2018-12-28 2018-12-28 재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 d/c형 중쇄 c말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트 KR102175159B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180172372A KR102175159B1 (ko) 2018-12-28 2018-12-28 재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 d/c형 중쇄 c말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020180172372A KR102175159B1 (ko) 2018-12-28 2018-12-28 재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 d/c형 중쇄 c말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200082118A KR20200082118A (ko) 2020-07-08
KR102175159B1 true KR102175159B1 (ko) 2020-11-05

Family

ID=71601258

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020180172372A KR102175159B1 (ko) 2018-12-28 2018-12-28 재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 d/c형 중쇄 c말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR102175159B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996041881A1 (en) * 1995-06-12 1996-12-27 Microbiological Research Authority Type f botulinum toxin and use thereof

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101670934B1 (ko) * 2014-11-11 2016-11-09 대한민국 클로스트리디움 보툴리눔의 독소형 탐지용 프라이머 세트, 이를 포함하는 탐지용 조성물 및 탐지키트

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1996041881A1 (en) * 1995-06-12 1996-12-27 Microbiological Research Authority Type f botulinum toxin and use thereof

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. Nakamura 등, Veterinary Microbiology, Vol.140, p.147-154 (2010)*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20200082118A (ko) 2020-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Logan et al. Bacillus
Fedhila et al. The InhA2 metalloprotease of Bacillus thuringiensis strain 407 is required for pathogenicity in insects infected via the oral route
Schleifer Phylum XIII. Firmicutes gibbons and murray 1978, 5 (firmacutes [sic] gibbons and murray 1978, 5)
Bogni et al. War against mastitis: Current concepts on controlling bovine mastitis pathogens
Abi Khattar et al. The dlt operon of Bacillus cereus is required for resistance to cationic antimicrobial peptides and for virulence in insects
CN101489584B (zh) 重组减毒梭状芽孢杆菌生物体和疫苗
Antúnez et al. Paenibacillus larvae enolase as a virulence factor in honeybee larvae infection
Nagahama et al. A recombinant carboxy‐terminal domain of alpha‐toxin protects mice against Clostridium perfringens
EP2183597B1 (en) Immunogenic streptococcus proteins
Egan et al. Identification of sortase A (SrtA) substrates in Streptococcus uberis: evidence for an additional hexapeptide (LPXXXD) sorting motif
Feng et al. Immunogenicity and protective capacity of EF-Tu and FtsZ of Streptococcus suis serotype 2 against lethal infection
Scarff et al. The roles of AtxA orthologs in virulence of anthrax‐like B acillus cereus G9241
CN111925426B (zh) 一种产气荚膜梭菌α毒素突变体、表达系统、制备方法及应用
KR102175159B1 (ko) 재조합 벡터, 형질전환 대장균, 보툴리눔 d/c형 중쇄 c말단 유래의 재조합 단백질을 포함하는 백신 조성물 및 키트
Logan et al. Family Bacillaceae
DK2213297T3 (en) Antigenic polypeptides of Staphylococcus aureus
Langroudi Isolation, Specification, Molecular Biology Assessment and Vaccine Development of Clostridiumin Iran: A Review
Register et al. Immune response in mice and swine to DNA vaccines derived from the Pasteurella multocida toxin gene
Titball et al. Clostridium perfringens: wound infections
US11375720B2 (en) Construction of a quadruple enterotoxin-deficient mutant of Bacillus thuringiensis
Fisher Clostridium perfringens beta2 toxin: a potential accessory toxin in gastrointestinal diseases of humans and domestic animals
JP5145506B2 (ja) バシラス属細菌、及びその用途
WO2000005252A1 (en) Vaccine comprising a non-toxic immunogenic derivative of clostridium botulinum type d neurotoxin
Mastrantonio et al. Erratum to: updates on Clostridium difficile in Europe
Sangdee et al. Heterologously type IV pilus expressed protein of Burkholderia pseudomallei is immunogenic but fails to induce protective immunity in mice

Legal Events

Date Code Title Description
E701 Decision to grant or registration of patent right