CN105339790A - 用于确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的工具和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于确定梭菌神经毒素的生物活性的方法和试剂盒。本发明的方法允许直接确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性。将对神经毒素敏感的细胞，例如神经细胞与神经毒素(例如BoTN/A)孵育，然后固定，并使用特异结合切割的神经毒素(例如SNAP-25)的抗体和结合切割的和未切割的神经毒素两者的抗体染色，用于确定细胞中神经毒素底物的总的量和含量。所述神经毒素多肽的生物活性在细胞中直接确定，并且通过检测两种复合体的方式计算。

Description

用于确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的工具和方法
本发明涉及用于直接确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：a)将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽在允许所述神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下孵育一段时间；b)固定所述细胞，并且，任选地，用去垢剂对所述细胞进行可渗透化处理；c)将所述细胞与特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的至少第一捕获抗体并且与特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的至少第二捕获抗体在允许所述捕获抗体结合所述底物的条件下接触；d)将所述细胞与特异结合所述第一捕获抗体的至少第一检测抗体在允许所述第一检测抗体结合所述第一捕获抗体的条件下接触，从而形成第一检测复合体，并且与特异结合所述第二捕获抗体的至少第二检测抗体在允许所述第二检测抗体结合所述第二捕获抗体的条件下接触，从而形成第二检测复合体；e)确定步骤d)的第一和第二检测复合体的量，和f)通过第二检测复合体计算所述细胞中由所述神经毒素多肽切割的底物的量，从而确定所述神经毒素多肽在所述细胞中的生物活性。本发明还提供用于进行本发明的方法的试剂盒。
肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)和破伤风梭菌(Clostridiumtetani)分别产生高度有效的神经毒素，即肉毒杆菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNT)特异结合神经元细胞并且破坏神经递质释放。每种毒素被合成为无活性的未加工的约150kDa单链蛋白。转录后加工包括二硫桥键的形成，和通过细菌蛋白酶的有限蛋白水解(切割)。活性神经毒素由两条链组成，约50kDa的N末端轻链和约100kDa的重链，它们通过二硫键连接。CNT结构上和功能上由三个结构域构成，即催化轻链，包括易位结构域(N端半)和受体结合结构域(C端半)的重链；参见，例如，Krieglstein1990，Eur.J.Biochem.188，39；Krieglstein1991，Eur.J.Biochem.202，41；Krieglstein1994，J.ProteinChem.13，49。肉毒杆菌神经毒素被合成为分子复合体，其包含150kDa神经毒素蛋白和相关非毒性蛋白。复合体尺寸根据梭菌菌株和不同的神经毒素血清型而不同，范围为从300kDa，大于500kDa，和900kDa。这些复合体中的无毒蛋白稳定神经毒素并且保护其免受降解；参见Silberstein2004，PainPractice4，S19–S26。
肉毒梭菌分泌七种抗原上不同的血清型，其被指定为肉毒杆菌神经毒素(BoNT)A至G。所有血清型连同破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)是通过切割SNARE蛋白阻断突触胞吐作用的Zn2+-内切蛋白酶；参见Couesnon，2006，Microbiology，152，759。CNT引起肉毒中毒和破伤风中观察到的弛缓性肌肉麻痹；参见Fischer2007，PNAS104，10447。
尽管其具有毒性效应，肉毒杆菌毒素复合体已经在大量疾病中被用作治疗剂。1989年肉毒杆菌毒素血清型A在美国被批准用于人类使用，用于治疗斜视、睑痉挛和其他病症。其作为例如商品名为BOTOX(Allergan，Inc.)或商品名为DYSPORT/RELOXIN(Ipsen，Ltd)的肉毒杆菌毒素A(BoNT/A)蛋白制剂是可商购的。商品名为XEOMIN(MerzPharmaceuticals，LLC)的改善的、无复合体的肉毒杆菌毒素A制剂是可商购的。对于治疗应用，将所述制剂直接注射入要治疗的肌肉中。在生理pH，所述毒素从蛋白复合体释放并且产生所需要的药理效果。肉毒杆菌毒素的效果仅是暂时的，这是为什么可能需要重复施用肉毒杆菌毒素以维持治疗效果的原因。
梭菌神经毒素弱化自主肌肉强度并且是用于斜视，局部肌张力障碍(focaldystonia)，包括宫颈肌张力障碍(cervicaldystonia)，和良性自发性睑痉挛(benignessentialblepharospasm)的有效疗法。已经进一步证明其减轻偏侧面肌痉挛(hemifacialspasm)，灶性痉挛状态(focalspasticity)，并且此外，在多种适应证中有效，如胃肠病症、多汗症和美容皱纹矫正；参见Jost2007，Drugs67，669。
在梭菌神经毒素的制造过程中，所述神经毒素的定性和定量确定以及生物活性神经毒素多肽的质量控制特别重要。此外，政府机构仅接受简单、可靠且经验证的肉毒杆菌毒素活性测定。目前，小鼠LD50生物测定(一种致死性试验)仍是药物制造商分析其制剂效力的“金标准”；参见Arnon等人(2001)，JAMA285，1059-1070。然而，近年来，已近进行大量努力去寻找替代性方法以减少对动物试验的需要和与这种类型的基于动物的测定相关的所有缺点、成本和伦理问题。此外，监管机构使制药公司参与将三“R”原则应用于肉毒杆菌神经毒素的效力测试：“减少(Reduce)、改善(Refine)、替代(Replace)”；参见Straughan，Altern.Lab.Anim.(2006)，34，305-313。因此，已经开发了基于细胞的测试系统以提供对使用活体动物的方法的合理的替代方案。然而，迄今仅有三种细胞测试系统可用于确定神经毒素生物活性，其被证明对神经毒素多肽足够敏感。这些基于细胞的测试系统包括使用体外分化的分离自啮齿动物胚胎的原代神经元(Pellett等人(2011)，Biochem.Biophys.Res.Commun.404，388-392)，分化的神经元诱导的多能干细胞(Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35)，和SiMa细胞系的亚克隆(WO2010/105234A1)。
然而，原代神经元的分离需要杀死动物并且费力和费时。此外，使用不同原代神经元的测试系统显示大的差异。类似地，分化的神经元诱导的多能干细胞的产生困难且耗时。此外，这种细胞的储存非常成问题。使用肿瘤细胞系的测定常常对BoNT不足够敏感。此外，所述肿瘤细胞系需要复杂的分化方案，这导致使用所述细胞系的测定的大的偏差和/或高的失败率。
本领域中所述的用于确定梭菌神经毒素的生物活性的测定包括蛋白质印迹分析，其中神经毒素活性通过细胞裂解物中切割的神经毒素底物的量来量化。在其他测定中，梭菌神经毒素的活性通过电化学发光(ECL)夹心ELISA测量；参见WO2009/114748A1。同样在此情况中，梭菌神经毒素的生物活性通过在自细胞裂解物分离后检测切割的梭菌神经毒素底物来确定。此外，在两种测定中，神经毒素底物需要浓缩。
根据以上所述，政府机构可接受的和/或提供基于动物的测试系统的替代方案的用于确定神经毒素多肽活性的进一步的测试系统是非常需要的。
因此，本发明的技术问题可以被视为提供符合前述需求的工具和方法。该技术问题由在权利要求和在以下的本文中表征的实施方案解决。
在第一方面，本发明涉及用于直接确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽在允许所述神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下孵育一段时间；
b)固定所述细胞并且，任选地，用去垢剂对所述细胞进行可渗透化处理；
c)将所述细胞与特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的至少第一捕获抗体并与特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的至少第二捕获抗体在允许所述捕获抗体结合所述底物的条件下接触；
d)将所述细胞与特异结合所述第一捕获抗体的至少第一检测抗体在允许所述第一检测抗体结合所述第一捕获抗体的条件下接触，从而形成第一检测复合体，并且与特异结合所述第二捕获抗体的至少第二检测抗体在允许所述第二检测抗体结合所述第二捕获抗体的条件下接触，从而形成第二检测复合体；
e)确定步骤d)的第一和第二检测复合体的量；和
f)通过所述第二检测复合体计算所述细胞中由所述神经毒素多肽切割的底物的量，从而确定所述细胞中所述神经毒素多肽的生物活性。
本发明的方法允许直接确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性。这意味着，不再如在现有技术中所述的方法中那样需要裂解细胞和自细胞裂解物分离或浓缩切割的神经毒素底物。例如，在本领域的基于蛋白质印迹分析的测定中，通过在SDS聚丙烯酰胺凝胶中分离和浓缩各样品的成分来浓缩神经毒素底物。在前所述的本领域中所述的ECL夹心ELISA中，神经毒素底物的浓缩通过使用特异结合切割的神经毒素底物的抗体在添加有细胞裂解物的微量滴定板上进行。通过所述抗体的结合从裂解物分离切割的神经毒素底物，这导致所述切割的梭菌神经毒素底物的浓缩。相反，在本发明的方法中，切割的神经毒素底物，如对于SNAP-25所例证的，可以在细胞中直接被检测。为此，将对神经毒素中毒敏感的细胞(如在本文中其他地方更详细定义的)与神经毒素多肽在允许所述神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下孵育一段时间。在下一步中，例如通过添加固定剂如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或提及的固定剂的混合物来将所述细胞固定。任选地，可以通过使用如本文其他地方定义的至少一种去垢剂对所述细胞进行可渗透化处理，所述去垢剂如TritonX-100、Tween20、皂苷、洋地黄皂苷或正辛基-β-吡喃葡糖苷。所述去垢剂可以被包含在适当的缓冲剂如PBS中。之后，将所述细胞与特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的至少第一捕获抗体并且与特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的至少第二捕获抗体在允许所述捕获抗体结合所述底物的条件下接触。在本文中，通过特异结合存在于未切割的和神经毒素切割的神经毒素底物中的适当的表位，所述第一捕获抗体能够确定所述细胞中神经毒素底物的总的含量或量。例如通过特异结合神经毒素底物中的神经毒素切割位点，所述第二捕获抗体识别并特异结合仅存在于切割的神经毒素底物中的表位。备选地，可以将所述细胞与所述第一和第二捕获抗体的混合物接触，即在提及的条件下将所述细胞与至少第一捕获抗体和至少第二捕获抗体同时接触。在下一步中，将所述细胞与特异结合所述第一捕获抗体的至少第一检测抗体在允许所述第一检测抗体结合所述第一捕获抗体的条件下接触，从而形成第一检测复合体。在接着的步骤中，将所述细胞与特异结合所述第二捕获抗体的至少第二检测抗体在允许所述第二检测抗体结合所述第二捕获抗体的条件下接触，从而形成第二检测复合体。备选地，可以将所述细胞与所述第一和第二检测抗体的混合物接触，即在所述条件下，将所述细胞同时与至少第一检测抗体和至少第二检测抗体接触。备选地，在所述细胞的可渗透化处理后，可以将其与所述第一和第二捕获抗体和所述第一和第二检测抗体的混合物在所述条件下同时接触。在下一步中，确定所述第一和第二检测复合体的量。最后，通过所述第二检测复合体计算所述细胞中由所述神经毒素多肽切割的底物的量。由此，直接确定所述神经毒素多肽在细胞中的生物活性。
以下，更详细地描述本发明的方法。对于细胞培养，首先将如本文定义的对神经毒素中毒敏感的细胞，如神经元细胞、SiMa细胞或iPS-衍生的神经元，接种在96孔微量滴定板上。例如根据WO2010/105234中公开的步骤将SiMa细胞分化为神经元表型，并且例如根据WO2012/135621中所述的测定将iPS-衍生的神经元分化为神经元表型。然后，用神经毒素多肽如BoNT/A使细胞中毒达约72小时。在随后的步骤中，将细胞固定在微量滴定板上，随后进行ELISA测定。对于固定细胞，可以在-20℃将例如冰冷的甲醇(-20℃)添加到所述细胞达20分钟。
对于进行ELISA测定，首先洗涤细胞。作为洗涤缓冲液，可以使用例如在10mMPBS缓冲液(pH7.4)中的0.1％TritonX-100。之后，通过猝灭缓冲液如在10mMPBS(pH7.4)中的0.6％H2O2将内源性蛋白酶猝灭，继之以另一个洗涤步骤。在接下来的步骤，将微量滴定板上的自由结合位点用适当的封闭缓冲液如例如在10mMPBS缓冲液(pH7.4)中的2％BSA及0.05％TritonX-100封闭。随后，通过使用适当的去垢剂对细胞进行可渗透化处理。作为可渗透化缓冲液，可以使用例如在10mMPBS缓冲液中的0.5％TritonX-100。可渗透化处理使得抗体通过细胞中形成的孔扩散。之后，将细胞用上文所述的洗涤缓冲液洗涤。
在下一步中，将可渗透化处理的细胞例如与两种不同抗体的混合物孵育。所述混合物包含特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的第一捕获抗体和特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的第二捕获抗体。所述第一和第二捕获抗体也可以被相继适用。例如，第一捕获抗体可以特异结合未切割的和神经毒素切割的SNAP-25，由此允许定量细胞中SNAP-25的总的量或含量。此外，在本文所述的评估后，该第一捕获抗体可以用于归一化细胞中切割的SNAP-25的量。第二捕获抗体特异结合神经毒素切割的底物的切割位点并且因此允许确定和检测切割的神经毒素底物，如BoNT/A切割的SNAP-25。
在本发明的方法中，以下对总神经毒素底物和神经毒素切割的神经毒素底物的检测可以直接在微量滴定板或细胞培养皿上(即在细胞内)进行。有利地，因此，在本发明的方法中，不需要如在本领域中所述的方法中那样制备细胞提取物并且从细胞裂解物分离和/或浓缩神经毒素底物。之后，将细胞洗涤从而去除未结合各自抗原的过量抗体。在之后的步骤中，将可渗透化处理的细胞与至少第一检测抗体和至少第二检测抗体接触。所述抗体可以作为混合物被施用，即同时或相继适用。第一检测抗体特异结合第一捕获抗体。由此形成第一检测复合体。第一检测抗体可以针对第一捕获抗体所来源于的物种。例如，在使用兔多克隆抗-SNAP-25抗体S9684(Sigma)作为特异结合未切割的和BoNT/A切割的底物SNAP-25的第一捕获抗体的情况下，可以使用抗-兔碱性磷酸酶缀合的抗体作为第一检测抗体。第二检测抗体特异结合第二捕获抗体。由此形成第二检测复合体。第二检测抗体可以针对第二捕获抗体所来源于的物种。例如，在本文其他地方所述的本发明的小鼠单克隆抗体(mAb)20-2-5用作特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的第二捕获抗体的情况下，抗-小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体可以用作第二检测抗体。对于本领域技术人员而言，第一检测抗体和第二检测抗体被缀合以不同酶从而允许特异检测本发明方法中使用的各个第一和第二捕获抗体是显而易见的。例如，如本文其他地方所述的基于HRP的检测可以用于BoNT/A切割的SNAP-25并且基于碱性磷酸酶的检测可以用于总(BoNT/A切割的和未切割的)SNAP-25。之后，将细胞再次洗涤。在接着的步骤中，将荧光HRP底物加至细胞。作为HRP底物，可以使用例如AmplexUltraRed(Invitrogen)，其在540nm被激发并且在600nm发射。进行与HRP底物的孵育达足够辣根过氧化物酶充分转化底物的时间。在与HRP底物孵育后，例如，可以将AP底物DiFMUP(6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(6,8-difluoro-4-methylumbelliferylphosphate)；激发360nm；发射450nm)加入至HRP底物并且将细胞与所述两种底物的混合物孵育。将与所述AP底物的孵育进行一段时间，所述时间允许碱性磷酸酶充分转化底物。如本领域已知的，根据对检测极限的定义，底物必须以一定的量转化，所述量足以使测量的信号至少高达空白(blank)的平均值加上三个平均值标准差。检测极限可以如文献中所述确定；参见，例如，Armbruster和Pry，ClinicalBiochem.Rev.2008，29(附录1)：S49-S52。因为碱性磷酸酶的最佳pH在碱性区域，所以相应的底物缓冲液是强碱性的。如果将碱性磷酸酶底物加至HRP底物，辣根过氧化物酶的反应由碱性pH终止，并且碱性磷酸酶转化DiFMUP。转化的HRP底物不受碱性pH影响。最后，两种底物的荧光测量如下：
AmplexUltraRed：激发540nm；发射600nm
DiFMUP：激发360nm；发射450nm
如本领域技术人员理解的，在本发明的方法中，仅呈现所用底物的不同的激发/发射波长的那些荧光底物适于检测第一和第二捕获抗体。仅在该情况下，其允许特异检测各抗原，即总神经毒素底物(如未切割的和神经毒素切割的SNAP-25)和切割的神经毒素底物(如神经毒素切割的SNAP-25)。由此可能同时量化每个孔或细胞培养皿中神经毒素底物的总含量和切割的神经毒素底物的量。据此，有利地可能使本发明的方法自动化。如本文其他地方陈述的，预期选用于本发明方法的荧光底物呈现激发/发射谱之间的充分位移，从而允许特异检测各底物。例如，对于HRP底物Amplex及其衍生物和对于AP底物DiFMUP，该需求得以实现。而在最佳的情况下，使用的荧光底物的激发/发射谱之间不存在重叠，已经证明，所用荧光底物的激发谱的峰区域中多至30％的重叠是容许的。
如本领域技术人员进一步承认的，本发明的方法允许直接检测和量化细胞中被神经毒素多肽切割的神经毒素底物，由此确定所述细胞中所述神经毒素多肽的生物活性。有利地，本发明的方法不需要制备细胞裂解物或提取物和从细胞裂解物/提取物分离或浓缩切割的神经毒素底物，这对于本领域中已知的方法是必须的。作为其结果，可以节省样品材料。此外，通过本发明的方法可以减少样品制备和样品数量，因为样品中总神经毒素底物的量和切割的神经毒素底物的量可以同时确定。在本领域中所述的测定中，必须将样品细分以彼此分开地检测两种抗原，即总神经毒素底物和切割的神经毒素底物。本发明的方法使得不需要细分样品。由此，可以避免由细分样品导致的不均一性并且可以节省样品材料。此外，在本领域中所述测定中，抗原可能被降解，其可能伪造切割的神经毒素底物的检测。这是因为在本领域中所述的测定中，将细胞与含去垢剂的裂解缓冲液(而其不能使神经毒素多肽或其他内源性蛋白酶失活)孵育，导致在较长期的样品储存后神经毒素底物的降解。由于在所述测定中需要使用细胞裂解物，因此较强的裂解缓冲液不能用于现有技术中所述的ECL夹心ELISA。这是因为上述抗原的聚集可能导致抗原非特异吸附于细胞培养皿或微量滴定板的塑料表面，其又扰乱适当的抗体对抗原的检测。因为用于检测抗原的抗体也与裂解物接触，所以抗体也可能聚集。在这种情况下，不再可能有可信且准确的抗原检测。通过使用本领域中所述的用于检测神经毒素活性的生物活性的蛋白质印迹测定，本发明人已经遇到这样的降解反应。在-20℃较长地储存裂解物后，与新鲜裂解物样品相比，已经发现，由于冷冻期间的降解过程，总SNAP-25的检测信号强烈减少并且切割的神经毒素底物SNAP-25与未切割的神经毒素底物SNAP-25之比改变。本发明人已经发现，神经毒素底物的降解和/或样品的不稳定性可以通过直接将细胞固定在细胞培养皿上来避免，因为神经毒素底物和神经毒素或其他内源性蛋白酶通过在细胞培养皿上聚集而立即失活。这可以通过使用例如通过甲醇或本领域中已知的其他固定剂(fixative)或固定剂(fixationagent)如乙醇、丙酮、甲醛或其混合物或本文所述的其他固定剂的细胞的固定来实现。使用此种固定方法分析例如亲本SiMa细胞(人成神经细胞瘤细胞；DSMZno.：ACC164)和iPS衍生的神经元(Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35)的稳定性不显示新鲜的和在冰箱中储存七天的细胞培养皿之间的任何差异。
如本文使用的，单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”包括单数和复数所指，除非上下文另有明确指示。通过实施例的方式，“细胞”是指一个或多于一个细胞。
如本文使用的，术语“约”，在量化所述的项、数量、百分数或术语的值时，是指加上或减去所述的项、数量、百分数或术语的值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的范围。优选为加上或减去10％的范围。
如本文使用的术语“包含(comprising)”、“包含(comprises)”和“由……组成(comprisedof)”与“包括(including)”、“包括(includes)”或“含有(containing)”、“含有(contains)”同义，并且是包含的或开放的并且不排除另外的、未列举的成员、元件或方法步骤。显然，术语“包含(comprising)”涵盖术语“由…组成(consistingof)”。更具体地，如本文使用的术语“包含(comprise)”意为，权利要求涵盖所有列出的元件或方法步骤，但也可以包括另外的、未指定的元件或方法步骤。例如，包括步骤a)、b)和c)的方法在其最狭义中涵盖由步骤a)、b)和c)组成的方法。短语"由…组成"意为，组合物(或装置，或方法)具有陈述的元件(或步骤)并且没有更多。相反，术语“包含”还可以涵盖除了步骤a)、b)和c)之外还包括步骤例如步骤d)和e)的方法。
在本文中使用数值范围(如“以1至5微摩的浓度”)的情况下，所述范围不仅包括1和5微摩，而且还包括1至5微摩之间的任何数值，例如，2、3和4微摩。
术语“体外”如本文使用的表示在动物或人体外部或外面。如本文使用的术语“在体外”应该被理解为包括“离体(exvivo)”。术语“离体”通常是指自动物或人体移除并在体外(例如，在培养容器中)维持或增殖的组织或细胞。如本文使用的术语“体内”表示在动物或人体里面或内部。
术语“神经毒素多肽”如本文使用的表示肉毒梭菌和破伤风梭菌神经毒素，即肉毒杆菌毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。更具体地，所述术语涵盖BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G和破伤风神经毒素(TeNT)。神经毒素多肽(以及，尤其是，其轻链和重链)源自上文指示的肉毒杆菌神经毒素的抗原上不同的血清型之一。在一个方面，神经毒素多肽的所述轻链和重链是选自由以下各项组成的组的神经毒素的轻链和重链：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或TeNT。在另一方面，编码所述神经毒素多肽的多核苷酸包含以下各项中所示的核酸序列：SEQIDNO:1(BoNT/A)、SEQIDNO:3(BoNT/B)、SEQIDNO:5(BoNT/C1)、SEQIDNO:7(BoNT/D)、SEQIDNO:9(BoNT/E)、SEQIDNO:11(BoNT/F)、SEQIDNO:13(BoNT/G)或SEQIDNO:15(TeNT)。此外，在一个方面，包括的是包含编码以下各项中任一个所示的氨基酸序列的核酸序列的多核苷酸：SEQIDNO:2(BoNT/A)、SEQIDNO:4(BoNT/B)、SEQIDNO:6(BoNT/C1)、SEQIDNO:8(BoNT/D)、SEQIDNO:10(BoNT/E)、SEQIDNO:12(BoNT/F)、SEQIDNO:14(BoNT/G)或SEQIDNO:16(TeNT)。此外，在本发明的工具和方法的一个方面，包括的是包含选自由以下各项组成的组的氨基酸序列或由选自由以下各项组成的组的氨基酸序列组成的神经毒素多肽：SEQIDNO:2(BoNT/A)、SEQIDNO:4(BoNT/B)、SEQIDNO:6(BoNT/C1)、SEQIDNO:8(BoNT/D)、SEQIDNO:10(BoNT/E)、SEQIDNO:12(BoNT/F)、SEQIDNO:14(BoNT/G)和SEQIDNO:16(TeNT)。
在另一个方面，所述所述多核苷酸是包含一个以上核苷酸置换、删除和/或添加的前述多核苷酸的变体，其在另一个方面可以导致具有一个以上氨基酸置换、删除和/或添加的多肽。此外，在另一个方面，本发明的变体多核苷酸应该包含与如SEQIDNO：1、3、5、7、9、11、13或15中的任一项所示的核酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列变体或编码与如SEQIDNO：2、4、6、8、10、12、14、或16中任一项所示的氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列的核酸序列变体。如本文使用的术语"相同”是指通过确定两条核酸序列或两条氨基酸序列之间相同的氨基酸的数目表征的序列同一性，其中将所述序列比对以获得最高位匹配。其可以使用发表的在计算机程序如例如BLASTP、BLASTN或FASTA中代码化的技术或方法计算(Altschul1990，JMolBiol215，403)。在一个方面，对整个氨基酸序列计算同一性百分数值。对于技术人员而言，可以获得一系列基于多种算法的程序用于比较不同序列。在该情况下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出尤其可信的结果。为了进行序列比对，可以使用程序PileUp(Higgins1989，CABIOS5，151)或程序Gap和BestFit(Needleman1970，JMolBiol48；443；Smith1981，AdvApplMath2，482)，其是GCG软件包(GeneticsComputerGroup1991，575ScienceDrive，Madison，Wisconsin，USA53711)的部分。在本发明的另一个方面，确定上文列举的以百分数(％)计的序列同一性值，以以下设置对整个序列区域使用程序GAP：缺口权重(GapWeight)：50，长度权重(LengthWeight)：3，平均匹配(AverageMatch)：10.000和平均错配(AverageMismatch)：0.000，除非另有说明，其总是用作用于序列比对的标准设定。在一个方面，前述变体多核苷酸中的每个编码多肽，所述多肽保持各神经毒素多肽，即BoNT/A，BoNT/B，BoNT/C1，BoNT/D，BoNT/E，BoNT/F，BoNT/G或破伤风神经毒素(TeNT)中的一个或多个并且，在另一个方面，全部生物活性。本领域技术人员将理解，仅在蛋白水解激活后维持完全生物活性，即使可想到的是未处理的前体可以发挥一些生物功能或有部分活性。如本文使用的"生物性质"是指(a)受体结合、(b)内化、(c)跨内体膜移位到细胞溶质中和/或(d)内部蛋白水解切割参与突触囊泡膜融合的蛋白。用于评价生物活性的体内测定包括小鼠LD50测定和离体小鼠单侧膈测定，如Pearce等人(Pearce1994，Toxicol.Appl.Pharmacol.128：69-77)和Dressler等人(Dressler2005，Mov.Disord.20:1617-1619，Keller2006，Neuroscience139：629-637)所述。生物活性通常以小鼠单位(MU)表达。如本文使用的，1MU是在腹膜内注射后杀死50％的指定小鼠群体的神经毒性成分的量，即小鼠i.p.LD50。在另一个方面，变体多核苷酸可以编码具有改善的或改变的生物性质的神经毒素，例如，其可以包含针对酶识别进行改善的切割位点，或可以针对受体结合或上文指定的任何其他性质得到改善。
因此，如本文使用的术语“神经毒素多肽的生物活性”意为神经毒素多肽的特征性生物性质，即，a)受体结合、(b)内化、(c)跨内体膜移位到细胞溶质中和/或(d)内部蛋白水解切割参与突触囊泡膜融合的蛋白。预期如本文使用的神经毒素多肽呈现上文提及的性质a)至d)中的至少一个，优选内部蛋白水解切割参与突触囊泡膜融合的蛋白，或a)至d)中列出的两种或三种或全部四种生物性质。
本公开内容的各个方面部分地包括来自建立的细胞系的细胞。如本文使用的，术语"细胞"是指对由神经毒素如例如BoNT/A导致的神经毒素中毒敏感的任何真核细胞，或可以摄取神经毒素的任何真核细胞。术语细胞包括来自多种生物的细胞，如，例如，鼠、大鼠、猪、牛、马、灵长类和人细胞；来自多种细胞类型的细胞，如，例如，神经元细胞和非神经元细胞；并且可以从异源细胞群体、组织或生物分离或是异源细胞群体、组织或生物的部分。如本文使用的，术语"建立的细胞系"与"永生细胞系"或"转化的细胞系"同义并且是指来自源于生物、组织或器官来源的细胞群体的被选择用于无限增殖的细胞的细胞培养物。通过定义，建立的细胞系排除了原代细胞的细胞培养物。如本文使用的，术语"原代细胞"是直接从新鲜组织或器官收获的细胞并且不具有无限增殖的潜能。例如，原代神经元细胞可以用于本发明的方法。建立的细胞系可以包括异质细胞群体或细胞的均一群体。源自单个细胞的建立的细胞系也称为克隆细胞系。建立的细胞系可以是这样的细胞系，其细胞内源表达细胞进行整个细胞机制(由此，神经毒素如BoNT/A蛋白水解切割底物如SNAP-25，并且包括神经毒素与神经毒素受体的结合，如BoNT/A与BoNT/A受体的结合，神经毒素/受体复合体的内化，神经毒素轻链从细胞内囊泡移位到细胞质中和神经毒素底物的蛋白水解切割)所需的所有成分。备选地，建立的细胞系可以是这样的细胞系，其细胞已经从外部来源引入细胞进行整个细胞机制(由此，神经毒素如BoNT/A蛋白水解切割底物如SNAP-25，并且包括神经毒素与神经毒素受体的结合，如BoNT/A与BoNT/A受体的结合，神经毒素/受体复合体的内化，神经毒素轻链从细胞内囊泡移位到细胞质中和神经毒素底物的蛋白水解切割)所需的至少一种成分。也被称为遗传改造的细胞系，来自此种建立的细胞系的细胞，可以例如，表达外源FGFR2，外源FGFR3，外源SV2，外源神经毒素底物如SNAP-25，或其任意组合。
如本文表示的术语“对神经毒素中毒敏感的细胞”是指能够进行整个细胞机制(由此，神经毒素多肽(例如，BoNT/A)切割神经毒素底物(例如，BoNT/A底物SNAP-25)，并且包括神经毒素与其相应受体的结合(例如，BoNT/A与BoNT/A受体的结合)，神经毒素/受体复合体的内化，神经毒素轻链从细胞内囊泡移位到细胞质中和神经毒素底物的蛋白水解切割)的细胞。用于确定神经毒素多肽的生物活性的测定是本领域公知的并且也在本文其他地方描述；参见，例如，Pellett等人(2011)，Biochem.Biophys.Res.Commun.404，388-392；Whitemarsh等人(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35。因此，如本文使用的“对神经毒素中毒敏感的细胞”意为神经毒素敏感细胞。提及的术语包括细胞或细胞系，例如，分离的原代细胞或其细胞系或建立的细胞系的细胞或建立的细胞系，例如，能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞或肿瘤细胞系，如本文其他地方定义的成神经细胞瘤细胞或成神经细胞瘤细胞系。例如，所述成神经细胞瘤细胞系可以是SiMa细胞系，其可从DSMZ(ACC164)商购。细胞系SiMa的具体克隆进一步在WO2010/105234中公开。可以用于本发明的方法的其他成神经细胞瘤细胞系可以在以下ATCC或DSMZ编号下获自ATCC或DSMZ：CRL-2263下的细胞系N1E-115，CCL-131下的细胞系Neuro2a，CRL-2266下的细胞系SH-SY5Y，CRL-1721下的细胞系PC12，ACC157(DSMZ)下的细胞系MHH-NB-11和CRL-2271下的细胞系SK-N-BE(2)。对神经毒素中毒敏感的其他肿瘤细胞是P-19细胞(鼠胚胎癌细胞系)(DSMZno.ACC316)。对神经毒素中毒敏感的细胞进一步包括的是诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元，优选人诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元；参见，例如，Whitemarsh等人(2012)，在上述引文中。这样的人iPS衍生的神经元也是可例如从CellularDynamics商购的。例如在Yu等人(Science2009May8；324(5928)：797-801.Epub2009)，WO2011/056971和WO2011/025852中描述了产生iPS细胞的方法。在一些方面，使用合适的方法(例如，在WO2012/135621和美国专利申请US2010/0279403和US2010/0216181中描述的那些)将iPS分化为神经元。
术语“固定细胞”意为使用本领域中所述的方法固定细胞。通常，固定是化学过程，通过该化学过程，生物组织被保持免于腐烂，由此防止自分解。固定终止任何进行的生化反应，并且还可以增加处理的组织的机械强度或稳定性。在准备所述组织或细胞用于检查或分析的过程中，固定将生物材料如组织或细胞的样品保持为与其天然状态尽可能接近。为此，固定剂通常用于使内在的生物分子-尤其是蛋白水解酶无效，否则所述生物分子消化或损坏样品。此外，固定剂通常保护样品免受外部损伤。固定剂对多数常见微生物(包括可能存在于组织或细胞培养物中或可能另外地定殖于固定的组织或细胞培养物中的细菌)是有毒的。此外，很多固定剂在化学上改变固定的材料以使其对机会主义微生物较不适口(不可消化或有毒)。最后，固定剂常在分子水平上改变细胞或组织以增加其机械强度或稳定性。这种增加的强度和刚性可以有助于在将其加工以用于进一步分析时保持样品的形态如形状和结构。对本领域技术人员显而易见的是，固定剂和固定方案的选择可以取决于计划的另外的加工步骤和最终分析。例如，免疫组化使用特异结合特定蛋白靶标抗原的抗体。延长的固定可以在化学上掩蔽这些靶标并阻止抗体结合。在这些情况下，例如，可以使用利用冷福尔马林的快速固定法。备选地，可以通过添加冰冷的甲醇(-20℃)将细胞固定。除了醛如甲醛或戊二醛和醇如乙醇或甲醇之外，氧化剂，Hepes-谷氨酸缓冲液调节的有机溶剂保护效应(HOPE)固定剂，丙酮，或其混合物，如甲醇和丙酮，甲醇和乙醇，多聚甲醛和TritonX-100，或多聚甲醛和甲醇的混合物，可以用于固定方案。在本发明的方法的一个方面，通过添加选自由以下各项组成的组的固定剂进行固定细胞：甲醇，乙醇，丙酮，甲醛或其混合物。为了保证和/或支持抗体自由接近其抗原，可以任选地通过使用适当的可渗透化缓冲液对细胞进行可渗透化处理，所述可渗透化缓冲液包含至少一种去垢剂，如TritonX-100。可用于本发明方法的可渗透化缓冲液为，例如，在10mMPBS缓冲液中的0.5％TritonX-100。在本发明的方法的其他方面，可以通过使用可渗透化缓冲液对细胞进行可渗透化处理，所述可渗透化缓冲液如包含至少一种选自以下的去垢剂的PBS：Tween20，皂苷，洋地黄皂苷或正辛基-β-吡喃葡萄糖苷。在其他方面，本文提及的两种以上去垢剂的混合物可以用于所述可渗透化缓冲液。通常，细胞所需的固定强度和时间比在更厚的、结构上复杂的组织切片上短得多。对于免疫细胞化学，样品制备基本上需要将靶细胞固定在载玻片，细胞培养皿或微量滴定板上。完美的固定将固定抗原，同时保留真实的细胞和亚细胞结构并允许抗体不受阻地接近所有细胞和亚细胞区室。通常使用如上文列举的多种固定剂，并且方法的正确选择将取决于检测的抗原的性质并且取决于使用的抗体的性质。固定方法通常落入两种类型中：有机溶剂和交联试剂。有机溶剂如醇和丙酮去除脂质并且使细胞脱水，同时将蛋白沉淀在细胞结构上。交联试剂如多聚甲醛通常通过游离氨基形成分子间桥接，从而产生连接的抗原的网。交联剂比有机溶剂更好地保留细胞结构，但可能减少一些细胞成分的抗原性，并且常常需要加入如上文指示的可渗透化处理步骤，以允许抗体接近样本。用两种方法固定都可能使蛋白抗原变性，并且因此，针对变性蛋白制备的抗体可能对于细胞染色更有用。适当的固定方法应该根据相关应用选择。细胞的固定方法在本领域中充分描述(参见，例如，Mehtodsincellbiology，第37卷：Antibodiesincellbiology；由DavidJ.Asai编辑；1993，AcademicPressInc.)。
根据本发明的方法使用的术语“接触”是指使细胞和相应的抗体物理接近，从而允许物理和/或化学相互作用。允许特异相互作用的合适条件对于本领域技术人员而言是公知的。显然，所述条件将取决于应用于本发明的方法的抗体和细胞，并且可以由本领域技术人员常规改变。此外，足以允许相互作用的时间也可以由技术人员不费力地确定。要理解，可以在将本发明的方法中所述的细胞和相应抗体接触的个体步骤之间进行洗涤步骤，以获得适用于接触的条件。例如，在本发明的方法的步骤c)中将细胞与特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的至少第一捕获抗体和特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的至少第二捕获抗体接触之后，可以结合洗涤步骤以去除剩余的溶液和/或过量的第一和第二捕获抗体，之后应用第一检测抗体和/或第二检测抗体。类似地，在本发明的方法中，在将细胞与第一和/或第二检测抗体接触后，可以包括洗涤步骤。适当的洗涤缓冲液例如是在10mMPBS缓冲液(pH7.4)中的0.1％TritonX-100。更具体地，如本文使用的术语“接触”在本发明的方法的步骤c)中是指，将细胞与特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的至少第一捕获抗体并且与特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的至少第二捕获抗体在允许所述捕获抗体结合所述底物的条件下接触。第一和第二捕获抗体可以同时(例如，作为混合物)或相继地施用于细胞。“接触”还指在本发明的方法的步骤d)中，将细胞与特异结合第一捕获抗体的至少第一检测抗体在允许所述第一检测抗体结合所述第一捕获抗体的条件下接触，并且与特异结合第二捕获抗体的至少第二检测抗体在允许所述第二检测抗体结合所述第二捕获抗体的条件下接触。由此，形成第一和第二检测复合体。备选地，也可以相继地施用第一和第二检测抗体。
如本文使用的，术语"抗体"是指由免疫系统产生的分子，其被制成以响应特定抗原以致特异结合所述抗原，并且包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体两种。如本文使用的“抗体”包括单克隆抗体，多克隆抗体，单链抗体，二聚体或多聚体，嵌合抗体，双特异性抗体，双特异性单链抗体，多特异性抗体，合成的抗体，人源化抗体，双功能抗体，细胞相关抗体如Ig受体，线性抗体，双抗体(diabody)，迷你抗体(minibody)，或所述抗体中任一种的片段。所述抗体的片段包括，例如，Fab，Fv或scFv片段，或这些片段中任一种的化学修饰的衍生物。可以通过使用本领域中所述的方法制造抗体；参见，例如，Harlow和Lane“Antibodies，ALaboratoryManual”，CSHPress，ColdSpringHarbor，1988。单克隆抗体可以通过最初在1975，Nature256，495，和Galfré1981，Meth.Enzymol.73，3中所述的技术制备。所述技术包括将小鼠骨髓瘤细胞与源自免疫的哺乳动物的脾细胞融合。抗体可以进一步通过本领域公知的技术改进。例如，Biacore系统中所使用的表面等离子共振可以用于增加结合表位的噬菌体抗体的效率；参见，例如，Schier1996，HumanAntibodiesHybridomas7，97；Malmborg1995，J.Immunol.Methods183，7。如本文使用的抗体还包括抗体的功能等效物，即能够特异结合所需的神经毒素底物的表位或部分的试剂。在一个方面，这样的功能等效物包括特异结合神经毒素底物的结合蛋白或其能够介导所述特异结合的结构域。如本文使用的抗体可以是全长免疫球蛋白分子，其包含VH和VL结构域，以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域，CH1，CH2和CH3，或全长免疫球蛋白分子的免疫活性片段，如，例如，Fab片段，F(ab')2片段，Fc片段，Fd片段，或Fv片段。抗体可以源自任何脊椎动物物种(例如，人，山羊，马，驴，鼠，大鼠，兔，或鸡)，并且可以是任意类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，或IgA)，种类(例如，IgA，IgD，IgE，IgG，或IgM)或亚类(IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1或IgA2)。对于天然存在的抗体，非天然存在的抗体，及其抗原性化合物结合片段的结构的一般公开内容，参见，例如，Plueckthun于ThePharmacologyofMonoclonalAntibodies，第113卷，Rosenburg和Moore编辑，Springer-Verlag，NewYork，pp.269-315(1994)；Borrabeck，AntibodyEngineering2ded.(OxfordUniversityPress)。天然存在的抗体通常是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链构成。各个轻链通过一个共价二硫键与重链连接，而二硫键连接的数目在不同免疫球蛋白同种型的重链间不同。各个重链和轻链还具有规律间隔开的链内二硫桥键。各个重链在一端具有可变结构域(VH)继之以若干恒定结构域。各个轻链在一端具有可变结构域(VL)并且在其另一端具有一个恒定结构域。轻链的恒定结构域与重链的第一个恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。据信，特定氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。
整个抗原识别和抗原结合位点包含在抗体的可变结构域内，即，Fv片段。该片段包括紧密、非共价连接的一个重链可变结构域(VH)和一个轻链可变结构域(VL)的二聚体。各个结构域包含四个框架区(FR)，其主要采用β-折叠构型，通过三个高变区连接，其形成环连接，并且在一些情况下形成β-折叠结构的部分。各高变区包含对应于互补决定区(CDR)的氨基酸序列。总的来说，六个CDR区的三维构型限定VH-VL二聚体表面上的赋予抗原结合特异性的抗原结合位点。参见例如，CyrusChothia等人，ConformationsofImmunoglobulinHypervariableRegions，Nature342(6252)：877-883(1989)；ElvinA.Kabat等人SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，第5版.PublicHealthService，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md.(1991)。抗体的恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但显示不同的效应功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒作用。
如本文使用的“选择性结合”或“特异结合”包括结合性质如，例如，结合亲和性，结合特异性，和结合亲合力；参见，例如，DavidJ.King，ApplicationsandEngineeringofMonoclonalAntibodies，pp.240(1998)。结合亲和性是指抗体在其表位结合位点停留的时长，并且可以被看作是抗体结合其表位的强度。结合亲和性可以被描述为抗体的平衡解离常数(KD)，其被定义为平衡时的Kd/Ka比。Ka是抗体的结合速率常数并且Kd是抗体的解离速率常数。结合亲和性由结合和解离二者决定并且单独的高结合或低解离都不能保证高亲和性。结合速率常数(Ka)，或结合速率(on-rate)常数(Kon)，测量每单位时间的结合事件数，或抗体和抗原可逆结合为其抗体-抗原复合体的倾向。结合速率常数以M-1s-1表达，并且用符号表示如下：[Ab]x[Ag]xKon。结合速率常数越大，抗体越快结合其抗原，或抗体和抗原之间的结合亲和性越高。解离速率常数(Kd)或解离速率(off-rate)常数(Koff)，测量每单位时间的解离事件数，抗体-抗原复合体可逆分离(解离)为其组成分子(即抗体和抗原)的倾向。解离速率常数以s-1表达，并且用符号表示如下：[Ab+Ag]xKoff。解离速率常数越小，抗体与其抗原结合越紧密，或抗体和抗原之间的结合亲和性越高。平衡解离常数(KD)测量平衡时形成的新的抗体-抗原复合体等于抗体-抗原复合体解离的速率的速率。平衡解离常数以M表达，并且定义为Koff/Kon＝[Ab]x[Ag]/[Ab+Ag]，其中[Ab]是抗体的摩尔浓度，[Ag]是抗原的摩尔浓度，并且[Ab+Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，其中当系统平衡时，所有浓度都所述组分的。平衡解离常数越小，抗体与其抗原结合越紧密，或抗体和抗原之间的结合亲和性越高。因此，在本发明的方法的一个方面，特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的第一捕获抗体可以具有例如，小于1x105M-1s-1，小于1x106M-1s-1，小于1x107M-1s-1或小于1x108M-1s-1的结合速率常数。在另一个方面，特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的第一捕获抗体可以具有例如，大于1x105M-1s-1，大于1x106M-1s-1，大于1x107M-1s-1或大于1x108M-1s-1的结合速率常数。在进一步的方面，特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的第一捕获抗体可以具有例如，小于1x10-3M-1s-1，小于1x10-4M-1s-1，小于1x10-5M-1s-1或小于1x10-6M-1s-1的解离速率常数。在进一步的方面，特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的第一捕获抗体可以具有例如，大于1x10-3M-1s-1，大于1x10-4M-1s-1，大于1x10-5M-1s-1或大于1x10-6M-1s-1的解离速率常数。在进一步的方面，特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的第二捕获抗体可以具有例如，小于1x105M-1s-1，小于1x106M-1s-1，小于1x107M-1s-1或小于1x108M-1s-1的结合速率常数。在另一个方面，特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的第二捕获抗体可以具有例如，大于1x105M-1s-1，大于1x106M-1s-1，大于1x107M-1s-1或大于1x108M-1s-1的结合速率常数。在进一步的方面，特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的第二捕获抗体可以具有例如，小于1x10-3M-1s-1，小于1x10-4M-1s-1，小于1x10-5M-1s-1或小于1x10-6M-1s-1的解离速率常数。在进一步的方面，特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的第二捕获抗体可以具有例如，大于1x10-3M-1s-1，大于1x10-4M-1s-1，大于1x10-5M-1s-1或大于1x10-6M-1s-1的解离速率常数。
靶抗原如神经毒素切割的或未切割的神经毒素底物SNAP-25，VAMP/小突触泡蛋白，或突触融合蛋白通常具有一个或多个结合位点(也被称为表位)，其被抗体的CDR形成的抗原结合位点识别。如本文使用的，"表位"与"抗原决定簇"同义，并且是指能够特异结合免疫球蛋白或T-细胞受体或另外与分子相互作用的靶抗原，如，例如，含肽，多肽，多糖或含脂质的分子上的位点。特异结合不同表位的各抗体具有不同结构。因此，一个抗原可以具有多于一个相应抗体。本文所称的“特异结合”可以通过多种已知技术测试，所述技术包括例如竞争实验和蛋白质印迹。根据本发明使用的表位涉及神经毒素底物，例如SNAP-25，VAMP/小突触泡蛋白，或突触融合蛋白中的抗原决定簇，其被抗体识别。如本文使用的，术语“特异”具有选择性的意义，并且是指具有唯一的效果或影响或仅以一种方式反应或仅与一种事物反应。如本文使用的，术语“特异结合”或“选择性结合”，当涉及抗体或结合蛋白或结合结构域时，是指抗体或结合蛋白/结构域与指定靶表位的差异结合，以致所述抗体或结合蛋白/结构域基本上不与非靶表位交叉反应。如本文定义的，肽表位的最小尺寸为约五个氨基酸残基，并且肽表位通常包含至少5，至少6，至少7，至少8，至少9，至少10，至少11，至少12，至少13，至少14，至少15，至少16，至少17，至少18，至少19，至少20，至少21，至少22，至少23，至少24，至少25，或至少30个氨基酸残基。肽表位可以是线性或不连续表位。不连续表位包含在肽的一级结构中不相邻但通过肽的二级、三级或四级结构在一起形成一个表位的氨基酸残基。此外，还注意到，表位可以包含除氨基酸序列以外的分子部分，如，例如，碳水化合物部分，脂质部分如糖脂或脂蛋白，或化学修饰的氨基酸部分如磷酸化的氨基酸。
根据本发明的方法，“第一捕获抗体”特异结合未切割的和神经毒素切割的底物包含的表位。所述神经毒素底物可以是，例如，SNAP-25，VAMP/小突触泡蛋白，或突触融合蛋白。例如，SNAP-25是BoNT/A，BoNT/C1和BoNT/E的已知底物。VAMP/小突触泡蛋白是BoNT/B，BoNT/D，BoNT/F，BoNT/G和TeNT的底物，而突触融合蛋白是BoNT/C1的底物。所述第一捕获抗体允许确定细胞中相应神经毒素底物的总量，即完全含量。例如，在具有205个氨基酸残基的总长的SNAP-25中，BoNT/A的切割位点位于氨基酸残基Gln197和Arg198之间。因此，特异结合位于BoNT/A切割位点N端的表位(即位于SNAP-25的氨基酸残基1至198之间的表位)的抗体可以用作第一捕获抗体。例如，所述抗体可以特异结合N端表位或位于SNAP-25的中间部分的表位。对于BoNT/C1，位于BoNT/C1切割位点(Arg198–Ala199)的N端(即SNAP-25的氨基酸残基1至199之间)的表位可以用作第一捕获抗体。对于BoNT/E，位于BoNT/E切割位点(Arg180–Ile181)的N端(即SNAP-25的氨基酸残基1至181之间)的表位可以用作第一捕获抗体。如果将VAMP用作神经毒素底物，则位于BoNT/B切割位点(Gln76–Phe77)的N端(即VAMP的氨基酸残基1至77之间)的表位可以用作第一捕获抗体。位于BoNT/D切割位点(Lys59–Leu60)的N端(即VAMP2的氨基酸残基1至60之间)的表位可以用作第一捕获抗体。位于BoNT/F切割位点(Gln58–Lys59)的N端(即VAMP2的氨基酸残基1至59之间)的表位可以用作第一捕获抗体。位于BoN/G切割位点(Ala81–Ala82)的N端(即VAMP2的氨基酸残基1至82之间)的表位可以用作第一捕获抗体。如果将突触融合蛋白用作底物，则位于BoN/C1切割位点(Lys253–Ala254)的N端(即突触融合蛋白1a的氨基酸残基1至254之间)的表位可以用作第一捕获抗体。
在本发明的一个方面，被BoNT/A蛋白酶识别和切割的神经毒素切割位点，源自对BoNT/A的切割敏感的蛋白。在一个方面，这种蛋白是人SNAP-25A或SNAP-25B或其来自大鼠、小鼠、牛、鲐、鲫、爪蟾、电鳐、海胆、枪乌贼、椎实螺或海螺的同系物、旁系同源物或直系同源物。源自所述蛋白的合适的切割位点在例如EP1926744B1中公开。
在本发明的一个方面，被BoNT/B蛋白酶识别和切割的神经毒素切割位点，源自对BoNT/B的切割敏感的蛋白。在一个方面，这样的蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/小细胞小泡蛋白，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳐VAMP-1，海胆VAMP，果蝇sybA，synB，synC，synD，或syn，水蛭VAMP，爪蟾VAMP-2或VAMP-3，鲐VAMP-1或VAMP-2，枪乌贼VAMP，椎实螺VAMP，海螺VAMP或新杆状线虫SNB1-like或其任意直系同源物，旁系同源物或同系物。源自所述蛋白的合适的切割位点在EP1926744B1中公开。
在本发明一个方面，被BoNT/C1蛋白酶识别和切割的神经毒素切割位点，源自对BoNT/C1的切割敏感的蛋白。在一个方面，这样的蛋白是人和小鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白1B1，突触融合蛋白2-1，突触融合蛋白2-2，突触融合蛋白2-3，突触融合蛋白3A或突触融合蛋白1B2，牛或大鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白1B1或突触融合蛋白1B2，大鼠突触融合蛋白2或大鼠突触融合蛋白3，小鼠突触融合蛋白1A，突触融合蛋白1B1，突触融合蛋白1B2，突触融合蛋白2，突触融合蛋白3A，突触融合蛋白3B或突触融合蛋白3C，鸡突触融合蛋白1A或突触融合蛋白2；爪蟾突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，鲐突触融合蛋白1A，突触融合蛋白1B或突触融合蛋白3，电鳐突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，海胆突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，果蝇突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，水蛭突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，枪乌贼突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B，椎实螺突触融合蛋白1A或突触融合蛋白1B或其任意直系同源物，旁系同源物或同系物。源自所述蛋白的合适的切割位点在EP1926744B1中公开。
在本发明一个方面，被BoNT/D蛋白酶识别和切割的神经毒素切割位点，源自对BoNT/D的切割敏感的蛋白。在一个方面，这样的蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/小细胞小泡蛋白，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳐VAMP-1，海胆VAMP，果蝇sybA，synB，synC，synD，或syn，水蛭VAMP，爪蟾VAMP-2或VAMP-3，鲐VAMP-1或VAMP-2，枪乌贼VAMP，椎实螺VAMP，海螺VAMP或新杆状线虫SNB1-like或其任意直系同源物，旁系同源物或同系物。源自所述蛋白的合适的切割位点在EP1926744B1中公开。
在本发明一个方面，被BoNT/E蛋白酶识别和切割的神经毒素切割位点，源自对BoNT/E的切割敏感的蛋白。在一个方面，这样的蛋白是人SNAP-25A或B或其来自大鼠、小鼠、牛、鲐、鲫、爪蟾、电鳐、海胆、枪乌贼、椎实螺或海螺的同系物，旁系同源物或直系同源物。源自所述蛋白的合适的切割位点在EP1926744B1中公开。
在本发明一个方面，被BoNT/F蛋白酶识别和切割的神经毒素切割位点，源自对BoNT/F的切割敏感的蛋白。在一个方面，这样的蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/小细胞小泡蛋白，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳐VAMP-1，海胆VAMP，果蝇sybA，synB，synC，synD，或syn，水蛭VAMP，爪蟾VAMP-2或VAMP-3，鲐VAMP-1或VAMP-2，枪乌贼VAMP，椎实螺VAMP，海螺VAMP或新杆状线虫SNB1-like或其任意直系同源物，旁系同源物或同系物。源自所述蛋白的合适的切割位点在EP1926744B1中公开。
在本发明一个方面，被BoNT/G蛋白酶识别和切割的神经毒素切割位点，源自对BoNT/G切割敏感的蛋白。在一个方面，这样的蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/小细胞小泡蛋白，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳐VAMP-1，海胆VAMP，果蝇sybA，synB，synC，synD，或syn，水蛭VAMP，爪蟾VAMP-2或VAMP-3，鲐VAMP-1或VAMP-2，枪乌贼VAMP，椎实螺VAMP，海螺VAMP或新杆状线虫SNB1-like或其任意直系同源物，旁系同源物或同系物。源自所述蛋白的合适的切割位点在EP1926744B1中公开。
在本发明一个方面，被TeNT蛋白酶识别和切割的神经毒素切割位点，源自对TeNT切割敏感的蛋白。在一个方面，这样的蛋白是人或小鼠VAMP-1，VAMP-2和VAMP-3/小细胞小泡蛋白，牛VAMP-2，大鼠VAMP-2或VAMP-3，鸡VAMP-1，VAMP-2或VAMP-3，电鳐VAMP-1，海胆VAMP，果蝇sybA，synB，synC，synD，或syn，水蛭VAMP，爪蟾VAMP-2或VAMP-3，鲐VAMP-1或VAMP-2，枪乌贼VAMP，椎实螺VAMP，海螺VAMP或新杆状线虫SNB1-like或其任意直系同源物，旁系同源物或同系物。源自所述蛋白的合适的切割位点在EP1926744B1中公开。
在本发明的方法中，可以用作第一捕获抗体的适当的抗体的实例包括，例如，兔多克隆抗-SNAP-25抗体S9684(Sigma)(Fernández-SalasE，WangJ，MolinaY，NelsonJB，JackyBPS等人(2012)BotulinumNeurotoxinSerotypeaSpecificCell-BasedPotencyAssaytoReplacetheMouseBioassay.PLoSONE7(11)：e49516.doi:10.1371/journal.pone.0049516)，兔多克隆抗-SNAP25抗体PA5-19708(PierceAntibodies)，兔多克隆抗-SNAP25抗体PA5-19701(PierceAntibodies)，VAMP/小突触泡蛋白抗体sc-13992(SantaCruzBiotechnology)或#104203(SynapticSystems)，或突触融合蛋白抗体ADI-VAM-SV013(EnzoLifeSciences)。
在一个方面，识别未切割的和神经毒素切割的底物以确定细胞中神经毒素底物的总量的第一捕获抗体用于归一化(normalization)，如以下实施例中所示。
如本文使用的“第二捕获抗体”特异结合神经毒素切割的底物的切割位点。因此，所述第二捕获抗体选择性识别被神经毒素切割的神经毒素底物，例如，BoNT/ASNAP-25切割产物。相反，所述第二捕获抗体不能结合未切割的神经毒素底物，如，例如，未切割的SNAP-25。在本发明的方法中可以用作第二捕获抗体的适当的抗体的实例包括，例如，下文所述的本发明的小鼠单克隆抗体，小鼠单克隆抗体MC-6053(R&DSystems)，其识别BoNT/A切割的SNAP-25(Baldwin和Barbieri2007，Biochemistry46，3200-3210)，以及小鼠单克隆抗体DMAB4345(CreativeDiagnostics)。
在进一步的方面，本发明提供新的特异结合神经毒素切割的SNAP-25的切割位点，即仅结合神经毒素切割的SNAP-25的单克隆抗体，而它们不结合未切割的SNAP-25。已经如以下实施例所述产生和表征了所述单克隆抗体，并且已经发现由于其对神经毒素切割的SNAP-25的高亲和性和特异性，其尤其适合作为用于本发明的方法的第二捕获抗体。优选地，本发明的单克隆抗体识别和特异结合SEQIDNO:74中所示的表位SNAP-25190-197“TRIDEANQ”和/或特异结合SNAP-25197，即神经毒素(例如，BoNT/A)切割的SNAP-25。更优选地，本发明的单克隆抗体识别和特异结合SEQIDNO:75中所示的表位SNAP-25191-197“RIDEANQ”和/或SNAP-25197，SEQIDNO:76中所示的序列的表位SNAP-25192-197“IDEANQ”和/或SNAP-25197，或SEQIDNO:77中所示的表位SNAP-25193-197“DEANQ”和/或SNAP-25197。
在一个方面，本发明涉及抗体或其片段，所述抗体或其片段特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点，并且包含重链可变区(VH)(包含SEQIDNO.18中所示氨基酸序列)和/或轻链可变区(VL)(包含SEQIDNO.19中所示的氨基酸序列)。本发明进一步包括的是包含所述重链和/或轻链可变区的一个、两个或三个互补决定区(CDR)的抗体或其片段。相应的CDRH1，CDRH2和CDRH3序列分别在SEQIDNO.20至22中显示，而相应的CDRL1，CDRL2和CDRL3序列分别在SEQIDNO.23至25中显示。提及的序列对应于以下实施例中所示的小鼠单克隆抗体20-2-5。此外，本发明涉及抗体或其片段，所述抗体或其片段特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点，并且包含重链可变区(VH)(包含SEQIDNO.26中所示氨基酸序列)和/或轻链可变区(VL)(包含SEQIDNO.27中所示的氨基酸序列)。本发明还包括的是包含所述重链和/或轻链可变区的一个、两个或三个互补决定区(CDR)的抗体或其片段。相应的CDRH1，CDRH2和CDRH3序列分别在SEQIDNO.28至30中显示，而相应的CDRL1，CDRL2和CDRL3序列分别显示在SEQIDNO.31至33中。提及的序列对应于以下实施例中所示的小鼠单克隆抗体5-10-5。此外，本发明涉及抗体或其片段，所述抗体或其片段特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点并且包含重链可变区(VH)(包含SEQIDNO.34中所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(VL)(包含SEQIDNO.35中所示的氨基酸序列)。本发明还包括的是包含所述重链和/或轻链可变区的一个、两个或三个互补决定区(CDR)的抗体或其片段。相应的CDRH1，CDRH2和CDRH3序列分别在SEQIDNO.36至38中显示，而相应的CDRL1，CDRL2和CDRL3序列分别在SEQIDNO.39至41中显示。提及的序列对应于以下实施例中所示的小鼠单克隆抗体1-10-4。本发明还涉及抗体或其片段，所述抗体或其片段特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点并且包含重链可变区(VH)(包含SEQIDNO.42中所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(VL)(包含SEQIDNO.43中所示的氨基酸序列)。本发明还包括的是包含所述重链和/或轻链可变区的一个、两个或三个互补决定区(CDR)的抗体或其片段。相应的CDRH1，CDRH2和CDRH3序列分别在SEQIDNO.44至46中显示，而相应的CDRL1，CDRL2和CDRL3序列分别在SEQIDNO.47至49中显示。提及的序列对应于以下实施例中所示的小鼠单克隆抗体16-5-4。此外，本发明涉及抗体或其片段，所述抗体或其片段特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点并且包含重链可变区(VH)(包含SEQIDNO.50中所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(VL)(包含SEQIDNO.51中所示的氨基酸序列)。本发明还包括的是包含所述重链和/或轻链可变区的一个、两个或三个互补决定区(CDR)的抗体或其片段。相应的CDRH1，CDRH2和CDRH3序列分别在SEQIDNO.52至54中显示，而相应的CDRL1，CDRL2和CDRL3序列分别在SEQIDNO.55至57中显示。提及的序列对应于以下实施例中所示的小鼠单克隆抗体6-3-8。本发明还涉及抗体或其片段，所述抗体或其片段特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点并且包含重链可变区(VH)(包含SEQIDNO.58中所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(VL)(包含SEQIDNO.59中所示的氨基酸序列)。本发明还包括的是包含所述重链和/或轻链可变区的一个、两个或三个互补决定区(CDR)的抗体或其片段。相应的CDRH1，CDRH2和CDRH3序列分别在SEQIDNO.60至62中显示，而相应的CDRL1，CDRL2和CDRL3序列分别在SEQIDNO.63至65中显示。提及的序列对应于以下实施例中所示的小鼠单克隆抗体18-3-3。此外，本发明涉及抗体或其片段，所述抗体或其片段特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点并且包含重链可变区(VH)(包含SEQIDNO.66中所示的氨基酸序列)和/或轻链可变区(VL)(包含SEQIDNO.67中所示的氨基酸序列)。本发明还包括的是包含所述重链和/或轻链可变区的一个、两个或三个互补决定区(CDR)的抗体或其片段。相应的CDRH1，CDRH2和CDRH3序列分别在SEQIDNO.68至70中显示，而相应的CDRL1，CDRL2和CDRL3序列分别在SEQIDNO.71至73中显示。提及的序列对应于以下实施例中所示的小鼠单克隆抗体14-12-1。
如本文使用的术语“第一检测抗体”是特异结合第一捕获抗体的抗体。所述第一检测抗体允许特异检测第一捕获抗体。通过测量结合的第一检测抗体的量，可以确定第一检测复合体的量，因为第一检测复合体中的结合的第一检测抗体的量与第一检测复合体包含的第一捕获抗体的量(并且因此与总的(即切割的和未切割的)神经毒素底物的量)相关。例如，适当的物种特异性抗体可以用作第一检测抗体：如果小鼠抗体被用作第一捕获抗体，则所述第一检测抗体可以是特异结合小鼠抗体的抗-小鼠抗体。第一检测抗体可以例如是碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体，辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体或与荧光染料缀合的抗体。例如通过使用戊二醛的酶与抗体的缀合是本领域公知的。
已经将酶联免疫吸附测定(ELISA)用于量化大量的化合物和病原达近40年。最初，使用放射性来量化所述测定，但放射免疫测定(RIA)已经被使用酶来获得比色结果的测定代替。近来，已经开发了新的底物以产生荧光和发光产物。新的测定的基本原则仍然与比色测定相同。通过与赋予特异性的抗体缀合的蛋白的酶活性将底物转变为可测量的化合物。
ELISA中通常使用的酶缀合物是碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。因此，在一个方面，第一检测抗体可以，例如，与碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶缀合。在本发明的方法中可以用作第一检测抗体的酶缀合物的进一步实例包括使用葡萄糖作为底物的葡萄糖氧化酶，转变底物1-(4-甲基-香豆素-7-yl)-3-(4-羟苯基)脲)(PAP-AMC)的酪氨酸酶(StratisAvrameas，Immunochemistry，第6卷，第1期，1969年1月，第43–48页，IN9–IN11，49–52)或转变底物6,8-二氟-4-甲基伞形酮β-d-吡喃半乳糖苷(DiFMUG)的β-半乳糖酐酶(Gee等人，AnalyticalBiochemistry，第273卷，第1期，1999年8月，第41-48页)。在添加底物后，所述底物被所述酶转化为可检测的形式。例如，碱性磷酸酶催化磷酸的酯的切割。如果碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体用作第一检测抗体，则适当的底物如4-甲基伞形酮磷酸酯衍生物，例如，6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(DiFMUP)，或荧光素二磷酸酯(FDP)。6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(DiFMUP)被AP转化为可检测形式，即荧光产物6,8-二氟-4-甲基伞形酮。所述底物由例如MolecularProbes提供。DiFMUP的该反应产物的荧光强度可以使用约358/450nm的最大激发/发射来测量。其他可以用于此目的的底物有9H-(1,3-二氯-9,9-二甲基吖啶-2-酮-7-基)磷酸酯(DDAO-磷酸酯；Invitrogen)，荧光素二磷酸酯(FDP；SigmaAldrich)或4-甲基伞形酮磷酸酯(MUP；Invitrogen)。DDAO-磷酸酯被AP转化为荧光产物二甲基吖啶酮(DDAO)，其具有约646/659nm的最大激发/发射。如果FDP用作AP的底物，则反应产物是荧光素，其具有约490/514nm的最大激发/发射。对于MUP，相应的反应产物是4-甲基伞形酮(7-羟基-4-甲基香豆素)，其具有约360/449nm的最大激发/发射。此外这些底物可例如从MolecularProbes商购。备选地，辣根过氧化物酶可以用作本发明的方法的第一检测抗体中的酶缀合物。辣根过氧化物酶(HRP)催化过氧化氢(H2O2)还原为水(H2O)。在充当氢供体的特定底物的存在下，HRP的作用分别将无色或不发荧光的分子转化为有色的和/或荧光部分。例如，Red(LifeTechnologies)是与含HRP的测定一起使用的底物。AmplexRed，在过氧化物酶的存在下，以1:1化学计量与H2O2反应，产生试卤灵(resorufin)，一种红色荧光化合物，其分别具有563nm和587nm的最大吸收和荧光发射。用于HRP底物的另一实例是UltraRed(LifeTechnologies)。已经报道了，在辣根过氧化物酶或辣根过氧化物酶偶联的酶测定中，UltraRed试剂(～570/585nm的激发/发射)相比Red试剂的性能有所改善，提供更亮的荧光和增强的灵敏性(在每摩尔基础上)。氧化的UltraRed试剂(UltroxRed试剂)的荧光还对pH不那么敏感，并且在过氧化氢(H2O2)或硫醇如二硫苏糖醇(DTT)的存在下，底物及其氧化产物呈现比Red试剂更大的稳定性。其他可用于本发明的方法的适当的HRP底物包括，例如，10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(ADHP；AnaSpec)或3-(4-羟苯基)丙酸(HPPA；AnaSpec)(Tuuminen等人1991，J.Immunoassay12，29-46)。
备选地，第一检测抗体可携带允许检测第一捕获抗体的适当的可检测标记物。标记可以通过直接或间接方法进行。直接标记包括标记物直接(共价或非共价)结合于第一检测抗体。非直接标记包括特异结合第一检测抗体和携带可检测标记物的试剂的结合(共价或非共价)。这样的试剂可以是例如特异结合第一检测抗体的第二(更高级)抗体。在这样地情况下，第二抗体将与可检测标记物偶联。将理解，更高级的抗体可以额外地用于检测第一检测复合体。更高级抗体常用于增加信号。合适的更高级抗体还可以包括公知的链霉亲和素-生物素系统(VectorLaboratories，Inc.)，和公知的DakoLSABTM2和LSABTM+(标记的链霉亲和素-生物素)，或DakoPAP(过氧化物酶抗-过氧化物酶)。在进一步的方面，第一检测抗体的所述标记物是荧光染料，即第一抗体缀合于荧光染料。在这种情况下，荧光可以直接通过荧光读数器测量。典型的荧光标记物包括荧光蛋白如GFP及其衍生物，Cy染料如Cy3或Cy5，德克萨斯红(TexasRed)，荧光素(Fluorescein)，和Alexa染料，例如Alexa568。
如本文使用的“第二检测抗体”是特异结合第二捕获抗体的抗体。第二检测抗体可以例如缀合于酶如碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶或酪氨酸酶。因此，在一个方面，第二检测抗体是碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体，辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体，葡萄糖氧化酶缀合的抗体或酪氨酸酶缀合的抗体。所述第二检测抗体允许特异检测第二捕获抗体。通过测量结合的第二检测抗体的量，可以确定第二检测复合体的量，因为第二检测复合体中的结合的第二检测抗体的量与第一检测复合体包含的第二捕获抗体的量(并且因此与切割的神经毒素底物的量)相关。例如，如果兔抗体已经被用作第二捕获抗体，则抗-兔抗体可以用作第二检测抗体。第二检测抗体可以携带如上所述的酶或如本文其他地方关于第一检测抗体所述的标记物如荧光染料(即第二检测抗体缀合于荧光染料)。在本发明的方法的一个方面，缀合于第一检测抗体的酶不同于缀合于第二检测抗体的酶，从而允许在本发明的方法中特异检测相应的第一和第二捕获抗体。例如，如果第一检测抗体是AP缀合的抗体，则第二检测抗体可以是辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体或反之亦然。此外，AP和HRP的荧光底物的激发/发射谱基本上不重叠而是彼此不同，即它们显示明确的移位，从而允许区分由相应的产物产生的荧光强度。例如，DiFMUP在～358/450nm呈现激发/发射，而AmplexUltraRed在～570/585nm呈现激发/发射，由此允许准确测量由所述荧光底物通过相应的酶的转化产生的荧光强度。在其他方面，碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体用作针对过量存在于细胞中的抗原的第一检测抗体，即用于测量细胞中总的(未切割的和切割的)神经毒素底物，如总的SNAP-25的量。辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体用作针对以较低量存在于细胞中的抗原的第二检测抗体，即用于测量细胞中切割的神经毒素底物，如BoNT/A切割的SNAP-25的量。如本领域中已知的，HRP底物比AP底物更灵敏，这意味着可以检测更少量的分析物。如果HRP抗体用作用于检测切割的SNAP-25的第二抗体，则可检测更少量的切割的SNAP-25。回过来，可以确定更少量的BoNT/A，由此增加测定的灵敏度。因为AP抗体测量细胞中SNAP-25的总量，所以由于分析物过量而不需要对底物的高灵敏度。
如本文使用的术语“至少”如，例如，“至少第一捕获抗体”意为除了特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的抗体，另外的一种或多种具有所述特异性的抗体可以用于本发明的方法。类似地，“至少第二捕获抗体”意为除了特异结合神经毒素切割的底物的切割位点的抗体，另外的一种或多种具有所述特异性的抗体可以用于本发明的方法。此外，一种或多种特异结合第一检测抗体(或第一检测抗体)的第一检测抗体可以用于本发明的方法。类似地，一种或多种特异结合第二检测抗体(或第二检测抗体)的第二检测抗体可以用于本发明的方法。
术语“第一检测复合体”是指包含第一捕获抗体和第一检测抗体的复合体，其特异结合未切割的和神经毒素切割的底物，由此允许确定细胞中神经毒素底物的总含量。第一检测复合体的量可以通过确定特异结合的第一检测抗体的量来测量。这可以根据第一检测抗体的酶或标记物的性质来实现，例如通过测量荧光强度。
术语“第二检测复合体”是指包含第二捕获抗体和第二检测抗体的复合体，其特异结合神经毒素切割的底物的切割位点，由此允许确定细胞中切割的神经毒素底物的量。第二检测复合体的量可以通过确定特异结合的第二检测抗体的量来测量。这可以根据第二检测抗体的酶或标记物的性质来实现，例如通过测量荧光强度。
可以预期，任何检测系统都可以替代酶联免疫吸附分析(ELISA)用于实施本发明方法的各个方面，前提条件是，信噪比可以在统计学显著的程度上将来自形成的抗体-抗原复合体的信号与背景信号相区分。基于免疫的检测系统的非限制性实例包括免疫印迹分析，如蛋白质印迹法和斑点印迹法(dot-blotting)，免疫沉淀分析，和夹心ELISA。信号的检测可以使用以下实现：利用成像或磷光成像(phosphorimaging)的放射自显影(AU)，生物发光(BL)，荧光，共振能量转移，平面偏振，比色，或流式细胞术(FC)。基于免疫的检测系统的描述，在例如CommonlyUsedTechniquesinMolecularCloning，pp.A8.1-A8-55(Sambrook&Russell编辑，MolecularCloningALaboratoryManual，第3卷，3.sup.rded.2001)；DetectionSystems，pp.A9.1-A9-49(Sambrook&Russell编辑，MolecularCloningALaboratoryManual，第3卷，3.sup.rded.2001)中公开。
在其他方面，本文中所称的细胞、抗体、神经毒素多肽和神经毒素底物或任何其它产物分别是分离的细胞、抗体、神经毒素多肽、神经毒素底物或产物。如本文使用的，术语“分离的”如分离的抗体是指通过使用人为干预从其天然环境分离的分子。
在本发明的方法的一个方面，所述方法是荧光方法。
在本发明的方法的另一个方面，如本文其他地方详细定义的，神经毒素多肽是BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F或BoNT/G多肽或破伤风(TeNT)神经毒素多肽。
在本发明的方法的其他方面，神经毒素底物是VAMP/小突触泡蛋白、SNAP-25或突触融合蛋白。
在下文中，指出可以用于本发明的方法的相应的神经毒素底物的对应的登陆号(accessionnumber)：人SNAP-25P60880，人突触融合蛋白-1AQ16623，突触融合蛋白-1BP61266，突触融合蛋白-2P32856，突触融合蛋白-3Q13277，突触融合蛋白-4Q12846，突触融合蛋白-5Q13190，突触融合蛋白-6O43752，突触融合蛋白-7O15400，突触融合蛋白-8Q9UNK0，突触融合蛋白-10O60499，突触融合蛋白-11O75558，突触融合蛋白-12Q86Y82，突触融合蛋白-16O14662，突触融合蛋白-17P56962，突触融合蛋白-18Q9P2W9，突触融合蛋白-19Q8N4C7；人小突触泡蛋白-1P23763，小突触泡蛋白-2P63027，小突触泡蛋白-3Q15836；人突触结合蛋白：突触结合蛋白-1P21579，突触结合蛋白-2Q8N9I0，突触结合蛋白-3Q9BQG1，突触结合蛋白-4Q9H2B2，突触结合蛋白-5O00445，突触结合蛋白-6Q5T7P8，突触结合蛋白-8Q8NBV8，突触结合蛋白-9Q86SS6，突触结合蛋白-10Q6XYQ8，突触结合蛋白-11Q9BT88，突触结合蛋白-12Q8IV01，突触结合蛋白-13Q7L8C5，突触结合蛋白-14Q8NB59，突触结合蛋白-15Q9BQS2，突触结合蛋白-16Q17RD7，突触结合蛋白-17Q9BSW7，人囊泡相关膜蛋白(VAMP)：囊泡相关膜蛋白1P23763，囊泡相关膜蛋白2P63027，囊泡相关膜蛋白3Q15836，囊泡相关膜蛋白4O75379，囊泡相关膜蛋白5O95183，囊泡相关膜蛋白7P51809，囊泡相关膜蛋白8Q9BV40；突触囊泡糖蛋白(SV2)：突触囊泡糖蛋白2AQ7L0J3，突触囊泡糖蛋白2BQ7L1I2，突触囊泡糖蛋白2C。
在本发明的另一个方面，所述细胞是选自由以下各项组成的组的神经元细胞或神经元分化细胞：原代神经元细胞，如本文其他地方定义的能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞如成神经细胞瘤细胞或细胞系，P19细胞或诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元，优选人诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元。
在本发明的方法的其他方面，固定细胞通过添加选自由以下各项组成的组的固定剂来进行：甲醇，乙醇，丙酮，甲醛或其混合物。优选，固定细胞通过添加冰冷的甲醇(-20℃)并在-20℃孵育约20分钟来进行。
在本发明的方法的一个方面，特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的第一捕获抗体允许确定细胞中神经毒素底物的总量。在相应的神经毒素底物内的第一捕获抗体的合适的结合区和表位在本文其他地方定义。
在本发明的方法的具体方面，特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的第一捕获抗体是兔多克隆抗-SNAP-25抗体S9684，兔多克隆抗-SNAP25抗体PA5-19708(PierceAntibodies)，或兔多克隆抗-SNAP25抗体PA5-19701(PierceAntibodies)。
在本发明的方法的进一步方面，第二捕获抗体是本发明的小鼠单克隆抗体20-2-5，5-10-5，1-10-4，16-5-4，6-3-8，18-3-3，或14-12-1，或小鼠单克隆抗体克隆MC-6053(R&DSystems)。优选，第二捕获抗体是小鼠单克隆抗体20-2-5。本发明的小鼠单克隆抗体的可变区和CDR的相应序列已经在本文其他地方描述。
在本发明的方法的具体方面，第一和/或第二捕获抗体被固定。例如，所述第一和/或第二捕获抗体被连接于固相支持物。如本文使用的，术语"固相支持物"与"固相"同义，并且是指任何可以用于固定本说明书中公开的第一和/或第二捕获抗体的基质。固相支持物的非限制性实例包括，例如，管；板；柱；针或"浸渍片(dipstick)"；磁性颗粒，小珠或其他球形或纤维色谱介质，如，例如，琼脂糖，琼脂糖凝胶，二氧化硅和塑料；和片或膜，如，例如，硝酸纤维素和聚偏二氟乙烯(PVDF)。固相支持物可以使用多种材料构建，所述材料如，例如，玻璃，碳，聚苯乙烯，聚氯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，葡聚糖，尼龙，重氮纤维素，或淀粉。选择的固相支持物可以具有这样的物理性质，所述物理性质使其可容易地与可溶或未结合的材料分离并且通常允许未结合的材料，如，例如，过量的试剂，反应副产物，或溶剂，与结合固相支持物的测定组分分离或另外地去除(通过，例如，洗涤，过滤，离心等)。如何制备和使用固相支持物的非限制性实例在，例如，MolecularCloning，ALaboratoryManual，上述，(2001)；和CurrentProtocolsinMolecularBiology，上述，(2004)中描述，所述文献中的每个通过引用完整地结合于此。在一个方面，第一和/或第二捕获抗体缀合于小珠。预期的是，抗体-小珠缀合物足够小以能够通过对细胞进行可渗透化处理而产生的孔进入所述细胞。
在本发明的方法的具体方面，第一检测抗体是碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体，辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体或与荧光染料缀合的抗体。
在本发明的方法的进一步的具体方面，第二检测抗体是碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体，辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体，葡萄糖氧化酶缀合的抗体，酪氨酸酶缀合的抗体或β-半乳糖酐酶缀合的抗体。
优选地，碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体用作第一检测抗体，用于测量细胞中总的(未切割的和切割的)神经毒素底物如总的SNAP-25的量；并且辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体用作第二检测抗体，用于测量细胞中切割的神经毒素底物如BoNT/A切割的SNAP-25的量。
在本发明的方法的某些方面，AP底物是4-甲基伞形酮磷酸酯衍生物如6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(DiFMUP)，或荧光素二磷酸酯(FDP)。
在本发明的方法的具体方面，HRP底物是AmplexUltraRed，10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(ADHP)或3-(4-羟苯基)丙酸(HPPA)。
在本发明的方法的更具体的方面，所述方法如图1中所示进行。
在其他方面，本发明涉及用于进行本发明的方法的试剂盒，其包含：
a)第一捕获抗体，第二捕获抗体，第一检测抗体和第二检测抗体的装置，其中所述装置允许进行本发明的方法；
b)用于基于由根据a)的装置确定的第一和第二检测复合体的量计算由所述神经毒素切割的底物的量的工具；和
c)用于进行所述方法的使用说明。
如本文使用的术语“试剂盒”是指本发明前述工具或试剂的集合，所述工具或试剂可以包装在一起或可以不包装在一起。试剂盒的组分可以由分开的小瓶包含(即作为分开的部分的试剂盒)或以单个小瓶提供。此外，要理解本发明的试剂盒要用于实施上文述及的方法。在一个方面，预期以即用的方式提供所有组分以用于实施本文述及的方法。在其他方面，所述试剂盒包含进行所述方法的使用说明。可以以纸件形式或电子形式通过用户手册提供使用说明。例如，手册可以包含用于解释使用本发明的试剂盒进行前述方法时获得的结果的使用说明。
最后，在另一个方面，本发明涉及用于制造配制的神经毒素产品的方法，所述配制的神经毒素产品用于药物或化妆品应用，所述方法包括(i)通过本发明的方法确定神经毒素产品的生物活性，和(ii)配制神经毒素产品用于药物或化妆品应用。神经毒素产品可以通过各种技术配制，这取决于本领域中已知的所希望的应用目的。例如，(生物活性)神经毒素产品可以与一种或多种药用载体组合用作药物组合物。药用载体必须在与制剂中其他成分相容和对其接受者无害的意义上是可接受的。使用的药物载体可以包括固体，凝胶或液体。示例性的固体载体是乳糖，白土，蔗糖，滑石，明胶，琼脂，果胶，阿拉伯胶，硬脂酸镁，硬脂酸等。示例性的液体载体是甘油，磷酸缓冲盐水溶液，水，乳液，各种类型的湿润剂等。合适的载体包括上文提及的那些和本领域中公知的其他载体，参见，例如，Remington’sPharmaceuticalSciences，MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania。在一个方面，可以将药物组合物溶解在稀释剂中，之后施用。还这样选择稀释剂以致不影响神经毒素产品的生物活性。这种稀释剂的实例是蒸馏水或生理盐水。此外，药物组合物或制剂还可以包括其他载体或无毒、非治疗性、无免疫原性的稳定剂等。因此，在一个方面，配制的神经毒素产品可以以液体或冻干形式存在。在一个方面，其可以与甘油，蛋白稳定剂(HSA)或非蛋白稳定剂如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，透明质酸或游离氨基酸一起存在。在一个方面，合适的非蛋白稳定剂在WO2005/007185或WO2006/020208中公开。在一个方面，通过本发明的方法根据步骤(i)确定的生物活性对应于25，50，75，100，125，150或200U(小鼠LD50单位)的肉毒杆菌毒素活性。配制的神经毒素产品可以以治疗有效剂量用于人或动物的各种疾病或病症的治疗或用于化妆品目的。
本文所称的疾病或病症选自由以下各项组成的组：随意肌强度(voluntarymusclestrength)，灶性张力障碍(focaldystonia)，包括宫颈(cervical)、头部肌张力障碍(cranialdystonia)，和良性自发性睑痉挛(benignessentialblepharospasm)，偏侧面肌痉挛(hemifacialspasm)，和灶性肌痉挛(focalspasticity)，胃肠病症，多汗症(hyperhidrosis)，和美容皱纹矫正，睑痉挛，口颚肌张力障碍(oromandibulardystonia)，颌开放型(jawopeningtype)，颌闭合型(jawclosingtype)，磨牙症(bruxism)，梅热综合征(Meigesyndrome)，舌肌张力障碍(lingualdystonia)，眼睑失用症(apraxiaofeyelid)，开放宫颈肌张力障碍(openingcervicaldystonia)，颈项前屈(antecollis)，颈后倾(retrocollis)，颈侧倾(laterocollis)，斜颈(torticollis)，咽肌张力障碍(pharyngealdystonia)，喉肌张力障碍(laryngealdystonia)，痉挛性发音困难(spasmodicdysphonia)/内收肌型(adductortype)，痉挛性发音困难/外展肌型(abductortype)，痉挛性呼吸困难(spasmodicdyspnea)，肢肌张力障碍(limbdystonia)，臂肌张力障碍(armdystonia)，任务特异性肌张力障碍(taskspecificdystonia)，指痉挛(writer'scramp)，音乐家痉挛(musician'scramps)，高尔夫球手痉挛(golfer'scramp)，腿肌张力障碍(legdystonia)，大腿内收(thighadduction)，大腿外展膝屈曲(thighabductionkneeflexion)，膝伸展(kneeextension)，踝屈曲(ankleflexion)，踝伸展(ankleextension)，马蹄内翻足(equinovarus)，畸形足肌张力障碍(deformityfootdystonia)，纹状趾(striataltoe)，趾屈曲(toeflexion)，趾伸展(toeextension)，轴肌张力障碍(axialdystonia)，比萨综合征(pisasyndrome)，肚皮舞者肌张力障碍(bellydancerdystonia)，节段性肌张力障碍(segmentaldystonia)，半侧肌张力障碍(hemidystonia)，全身性肌张力障碍(generaliseddystonia)，lubag肌张力障碍(dystoniainlubag)，皮质基底变性肌张力障碍(dystoniaincorticobasaldegeneration)，lubag肌张力障碍，迟发性肌张力障碍(tardivedystonia)，脊髓小脑共济失调肌张力障碍(dystoniainspinocerebellarataxia)，帕金森病肌张力障碍(dystoniainParkinson'sdisease)，亨廷顿病肌张力障碍(dystoniainHuntington'sdisease)，哈勒沃登-施帕茨病肌张力障碍(dystoniainHallervorden-Spatzdisease)，多巴诱导的运动障碍(dyskinesias)/多巴诱导的肌张力障碍，迟发性运动障碍(tardivedyskinesias)/迟发性肌张力障碍(tardivedystonia)，发作性运动障碍(paroxysmaldyskinesias)/肌张力障碍，运动机能非运动机能作用诱发的软腭阵挛(kinesiogenicnon-kinesiogenicaction-inducedpalatalmyoclonus)，肌阵挛性肌纤维颤搐(myoclonusmyokymia)，僵硬(rigidity)，良性肌痉挛(benignmusclecramps)，遗传性颏震颤(hereditarychintrembling)，颚肌活动反常(paradoxicjawmuscleactivity)，半咀嚼痉挛(hemimasticatoryspasms)，肥厚性鳃肌病(hypertrophicbranchialmyopathy)，咬肌肥大(maseterichypertrophy)，胫骨前肌肥大(tibialisanteriorhypertrophy)，眼球震颤(nystagmus)，振动幻视核上性凝视麻痹(oscillopsiasupranucleargazepalsy)，癫痫(epilepsia)，partialiscontinua，痉挛性斜颈手术计划(planningofspasmodictorticollisoperation)，外展肌声带麻痹(abductorvocalcordparalysis)，对抗性突变性发声障碍(recalcitantmutationaldysphonia)，上食管括约肌功能障碍(upperoesophagealsphincterdysfunction)，声襞肉芽肿(vocalfoldgranuloma)，口吃抽动秽语综合征(stutteringGillesdelaTourettesyndrome)，中耳肌阵挛(middleearmyoclonus)，保护性喉闭合(protectivelarynxclosure)，喉头切除术后(postlaryngectomy)，不能言语(speechfailure)，保护性上睑下垂(protectiveptosis)，睑内翻括约肌Odii功能障碍(entropionsphincterOdiidysfunction)，假性弛缓不能(pseudoachalasia)，非弛缓不能(nonachalsia)，食管运动障碍(oesophagealmotordisorders)，阴道痉挛(vaginismus)，术后固定性震颤(postoperativeimmobilisationtremor)，膀胱功能障碍(bladderdysfunction)，逼尿肌括约肌协同失调(detrusorsphincterdyssynergia)，膀胱括约肌痉挛(bladdersphincterspasm)，偏侧面肌痉挛(hemifacialspasm)，神经移植运动障碍(reinnervationdyskinesias)，颏肌微凹(mentalisdimples)，僵人综合征(stiffpersonsyndrome)，破伤风前列腺增生(tetanusprostatehyperplasia)，多脂症(adipositas)，治疗小儿大脑性麻痹斜视(treatmentinfantilecerebralpalsystrabismus)，混合麻痹伴发(mixedparalyticconcomitant)，视网膜脱离手术后(afterretinaldetachmentsurgery)，白内障手术后(aftercataractsurgery)，无晶状体肌炎斜视中(inaphakiamyositicstrabismus)，肌病性斜视(myopathicstrabismus)，分离垂直性偏斜(dissociatedverticaldeviation)，作为斜视手术的辅助(asanadjuncttostrabismussurgery)，内斜视(esotropia)，外斜视(exotropia)，弛缓不能(achalasia)，肛裂(analfissures)，外分泌腺机能亢进(exocrineglandhyperactivity)，弗雷综合征(Freysyndrome)，鳄鱼泪综合征(CrocodileTearssyndrome)，多汗症(hyperhidrosis)，腋下手掌足底鼻漏(axillarpalmarplantarrhinorrhea)，相对的唾液分泌过多(hypersalivation)，在卒中(stroke)中，在帕金森病中，在肌萎缩侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis)中，痉挛状态(spasticconditions)，在脑炎(encephalitis)和脊髓炎(myelitis)自身免疫过程中，多发性硬化(multiplesclerosis)，横贯性脊髓炎(transversemyelitis)，视神经脊髓炎(Devicsyndrome)，病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、真菌感染，在遗传性痉挛性轻截瘫中风后综合征半球梗死(hereditaryspasticparaparesispostapoplecticsyndromehemisphericinfarction)中，脑干梗死(brainsteminfarction)，脊髓梗死(myeloninfarction)，在中枢神经系统创伤中，半球损伤(hemisphericlesions)，脑干损伤(brainstemlesions)，脊髓损伤(myelonlesion)，在中枢神经系统出血中，脑内出血(intracerebralhemorrhage)、蛛网膜下出血(subarachnoidalhemorrhage)、硬脑膜下出血(subduralhemorrhage)、脊髓出血(intraspinalhemorrhage)，在瘤形成(neoplasias)中，半球肿瘤(hemispherictumors)，脑干肿瘤(brainstemtumors)，脊髓肿瘤和阴道痉挛(vaginism)。化妆品用途选自治疗或减少皱纹如鱼尾纹或GFL，皱眉，面部不对称。
本说明书中引用的所有参考文献，关于其整个公开内容和本说明书中具体提及的公开内容，通过引用结合于此。
附图显示：
图1：表示本发明的基于细胞的测定的作用模式的示意图。将对神经毒素中毒敏感的细胞接种在多孔板中，之后，用神经毒素多肽使细胞中毒并且在给定的中毒期后，将细胞固定。针对神经毒素切割的SNAP-25的特异抗体和针对未切割的SNAP-25的特异抗体结合SNAP-25上的特定结合位点。使用酶偶联的抗宿主特异性第二抗体，这些结合事件可以用于产生可测量的信号，所述信号与孔内的神经毒素切割的SNAP-25的浓度和SNAP-25的总量相关。随着BoNT/A浓度增加，测量的切割的SNAP-25的量增加，从而获得信号。
图2：两张图表示根据实施例2的iPS衍生的神经元和SiMa细胞的得到的BoNT/A校准曲线。其显示BoNT/A的浓度和活性分别与确定的HRP底物的荧光信号(RFU)和针对孔内SNAP-25的总量归一化的BoNT/A切割的SNAP-25的含量之间的依赖性。在BoNT/A的浓度和活性分别增加后，更多SNAP-25被神经毒素转化，导致切割的SNAP-25的含量增加。
图3：该图表示根据实施例4的iPS衍生的神经元的得到的BoNT/A校准曲线。其显示BoNT/A的浓度和活性分别与确定的HRP底物的荧光信号(RFU)和BoNT/A切割的SNAP-25的含量和针对孔内SNAP-25的总量归一化的BoNT/A切割的SNAP-25的含量之间的依赖性。在BoNT/A的浓度和活性分别增加后，更多的SNAP-25被神经毒素转化，导致切割的SNAP-25的含量增加。
现在将通过以下实施例说明本发明，然而，其不应该被认为限制本发明的范围。
实施例1：特异结合神经毒素切割的底物SNAP-25的切割位点的单克隆抗体的产生
已经使用杂交瘤标准技术产生特异结合神经毒素切割的底物SNAP-25的切割位点的小鼠单克隆抗体。为此，将Balb/c小鼠(雌性，8周)用在N端具有半胱氨酸残基的SNAP-25190-197，“C-TRIDEANQ”(SEQIDNO:17)免疫。所述N端半胱氨酸残基不源自SNAP-25氨基酸序列，而是被引入以将SNAP-25190-197肽(SEQIDNO:74)与钥孔戚血蓝素(KLH)连接。杂交瘤细胞通过将小鼠脾细胞与购自GermanCollectionofMicroorganismsandCellCulture的骨髓瘤细胞系SP2/0-Ag14(SP2/0)(DSMZGmbH，Braunschweig，ACC146)融合而获得；还参见Hemmerlein等人，MolecularCancer2006，5，41。在ELISA中筛选特异结合神经毒素切割的底物SNAP-25的切割位点的抗体。就其对BoNT/A切割的SNAP-25的特异性和亲和性选择获得的克隆。作为阴性对照，对克隆测试其不结合未切割的SNAP-25206。结果，在ELISA和蛋白质印迹中，发现小鼠单克隆抗体20-2-5，5-10-5，1-10-4，16-5-4，6-3-8，18-3-3，和14-12-1对BoNT/A切割的SNAP-25197高度特异，没有可检测的对SNAP25206的交叉反应性。使用小鼠单克隆抗体同种分型检测试剂盒(Serotec)对所述单克隆抗体进行同种分型。结果发现，mAb20-2-5，14-12-1，6-3-8和5-10-5是IgG1抗体，而mAb18-3-3，16-5-4和1-10-4是IgG2a抗体。
所述小鼠单克隆抗体的VH和VL链的相应氨基酸序列和相应的CDR(互补决定区)序列在序列表中显示。
实施例2：双-荧光-CB-BoNT/A活性ELISA
细胞的固定
1.去除培养基/毒素溶液。添加100μl/孔冰冷的甲醇(-20℃)并在-20℃孵育20min。
注意：在室温进行所有随后步骤。
细胞固定后：
1.去除甲醇溶液并且添加100μl/孔的PBS缓冲液。为了更长期储存(>1天)，应该加入300μl//孔的PBS缓冲液并且将板用封口膜密封。应该将板储存在冰箱中。
2.去除PBS缓冲液并且将细胞用200μl/孔的洗涤缓冲液洗涤3次。每个步骤应该进行1分钟伴以温和振荡。
3.去除洗涤缓冲液并且加入100μl/孔的猝灭缓冲液并且孵育20分钟，伴以温和振荡。
4.去除猝灭缓冲液并且在温和振荡下将细胞用300μl/孔的洗涤缓冲液洗涤一次达5分钟。
5.去除洗涤缓冲液，并且添加200μl/孔的封闭缓冲液并且孵育1小时，伴以温和振荡。
6.去除封闭缓冲液，并且添加100μl/孔的可渗透化缓冲液并且孵育15分钟，伴以温和振荡。
7.去除可渗透化缓冲液并将细胞用300μl/孔的PBS缓冲液洗涤一次。该步骤应该进行1分钟，伴以温和振荡。
8.去除PBS缓冲液并且将100μl的第一抗体混合物(在封闭缓冲液中的抗体稀释液)加入各孔中。孵育过夜(16-18h)，伴以温和振荡。将细胞同时与两种第一抗体孵育：对BoNT/A切割的SNAP-25特异的小鼠抗体和识别SNAP-25的多克隆兔抗体(用于确定用于归一化的SNAP-25的总量的抗体)。
9.去除第一抗体混合物并将细胞用200μl的洗涤缓冲液洗涤4次。各个步骤应该进行5分钟，伴以温和振荡。
10.去除洗涤缓冲液，并将100μl的第二抗体混合物：HRP缀合的抗-小鼠和AP缀合的抗-兔第二抗体(在封闭缓冲液中的抗体稀释液)加入各个孔中并孵育2.5-3小时，伴以温和振荡。
11.去除第二抗体混合物并将细胞用200μl/孔的洗涤缓冲液洗涤5次，接着1个用300μl/孔的HEPES缓冲液的洗涤步骤。各个洗涤步骤应该进行5分钟，伴以温和振荡。
12.从板中去除PBS缓冲液并且将75μl的辣根过氧化物酶的荧光底物(HRP底物)加至各个孔中。孵育50分钟，伴以温和振荡。使板避免直射光。
13.将75μl的用碱性磷酸酶的荧光底物(AP底物)加入各个孔中并且孵育另外50分钟，伴以温和振荡。将板避免直射光。
14.使用荧光平板读数器读板：
在540nm激发；在600nm发射。
在360nm激发；在450nm发射。
15.计算
对于归一化，将切割的SNAP-25的RFU值(在600nm处的荧光)相对每孔中的总SNAP-25的RFU(450nm)进行归一化。为了更好地在示意图中显示RFU，使用以下等式将所有值都乘以因子1000：
R F U ( 600 n m ) R F U ( 450 n m ) x 1000
随后，对于各个标准品或样品，将得到的RFU值平均。
试剂准备
洗涤缓冲液:
0.1％TritonX-100，在10mMPBS缓冲液(pH7.4)中
PBS缓冲液(10mM):
磷酸缓冲盐水(Sigma，#P5368)(pH7.4)
猝灭缓冲液:
0.6％H2O2，在10mMPBS缓冲液(pH7.4)中
封闭缓冲液:
2％BSA，在10mMPBS缓冲液(pH7.4)中+0.05％TritonX-100
可渗透化缓冲液:
0.5％TritonX-100，在10mMPBS缓冲液中
HEPES缓冲液:
50mMHEPES(pH7,4)
HRP底物:
50mMHEPES(pH7.4)
0.007％H2O2
150pMAmplexUltraRed
AP底物:
25mM二乙醇胺(pH9.8)
2mMMgCl2
100μlMDiFMUP
实施例3：根据本发明的实施例2的CBA-ELISA中的BoNT/A校准曲线的说明
根据供应商的手册进行亲本SiMa细胞的细胞培养和利用BoNT/A的中毒。类似地，根据制造商提供的方案进行人诱导多能干(iPS)细胞衍生的神经元(CellularDynamics)的细胞培养和利用BoNT/A的中毒。
根据实施例2进行ELISA。作为特异结合未切割的和BoNT/A切割的SNAP-25的第一捕获抗体，使用兔多克隆抗-SNAP-25抗体S9684(Sigma)。该抗体允许检测细胞内SNAP-25的总量。作为特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点的第二捕获抗体，使用本发明的单克隆抗体克隆20-2-5(参见实施例1)。
图2中的两张图显示获得的BoNT/A校准曲线。它们显示了BoNT/A的浓度和活性分别与确定的HRP底物的荧光信号(RFU)和BoNT/A切割的SNAP-25的含量之间的依赖性(RFU值不进行空白校正以便显示单个BoNT/A标准的误差)。在分别增加BoNT/A的浓度和活性后，更多SNAP-25被神经毒素转化，导致切割的SNAP-25的含量增加。使用4参数等式显示BoNT/A的信号BoNT/A的浓度/活性的依赖性。
实施例4：双-荧光-CB-BoNT/A活性ELISA
细胞的固定
1.去除培养基/毒素溶液。添加100μl/孔的冰冷的甲醇(-20℃)并在-20℃孵育20min。
注意：在室温进行所有随后的步骤。
细胞固定后:
1.去除甲醇溶液并且加入100μl/孔的PBS缓冲液。对于更长期储存(>1天)，应该加入300μl//孔的PBS缓冲液并将板用封口膜密封。应该将板储存在冰箱中。
2.去除PBS缓冲液并且将细胞用200μl/孔的PBS缓冲液洗涤3次。每个步骤应该进行1分钟并伴以温和振荡。
3.去除PBS缓冲液并且加入100μl/孔的猝灭缓冲液并且孵育20分钟，伴以温和振荡。
4.去除猝灭缓冲液并且在温和振荡下将细胞用300μl/孔的PBS缓冲液洗涤一次达3分钟。
5.去除PBS缓冲液，并且添加200μl/孔的封闭缓冲液并且孵育1小时，伴以温和振荡。
6.去除封闭缓冲液，并且将100μl/孔的第一抗体混合物(在封闭缓冲液中的抗体稀释液)加入各个孔中。孵育过夜(16-18h)，伴以温和振荡。将细胞同时与用两种第一抗体孵育：对BoNT/A切割的SNAP-25特异的小鼠抗体和识别SNAP-25的多克隆兔抗体(用于确定用于归一化的SNAP-25的总量的抗体)。
7.去除第一抗体混合物并将细胞用200μl的PBS缓冲液洗涤4次。各个步骤应该进行3分钟，伴以温和振荡。
8.去除PBS缓冲液，并100μl的第二抗体混合物：HRP缀合的抗-小鼠和AP缀合的抗-兔第二抗体(在封闭缓冲液中的抗体稀释液)加入各个孔中并孵育2.5-3小时，伴以温和振荡。
9.去除第二抗体混合物并将细胞用200μl/孔的PBS缓冲液洗涤5次，接着1次利用300μl/孔的HEPES缓冲液的洗涤步骤。各个洗涤步骤应该进行3分钟，伴以温和振荡。
10.从板中去除HEPES缓冲液并将75μl的辣根过氧化物酶的荧光底物(HRP底物)加入各个孔中。孵育50分钟，伴以温和振荡。将板避免直射光。
11.将75μl碱性磷酸酶的荧光底物(AP底物)加入各个孔中并且孵育另外50分钟，伴以温和振荡。将板避免直射光。
12.使用荧光平板读数器读板:
在540nm激发；在600nm发射。
在360nm激发；在450nm发射。
13.计算
对于归一化，将切割的SNAP-25的RFU值(在600nm处的荧光)相对各孔中总SNAP-25的RFU(450nm)进行归一化。为了更好地在示意图中显示RFU，使用以下等式将所有值都乘以因子1000:
R F U ( 600 n m ) R F U ( 450 n m ) x 1000
随后，对于各个标准品或样品，将得到的RFU值平均。
试剂准备
PBS缓冲液(10mM):
磷酸缓冲盐水(Sigma，#P5368)(pH7.4)
猝灭缓冲液:
0.6％H2O2，在10mMPBS缓冲液(pH7.4)中
封闭缓冲液:
2％BSA，在10mMPBS缓冲液(pH7.4)中+0.05％TritonX-100
HEPES缓冲液:
50mMHEPES(pH7,4)
HRP底物:
50mMHEPES(pH7.4)
0.007％H2O2
150pMAmplexUltraRed
AP底物:
25mM二乙醇胺(pH9.8)
2mMMgCl2
100μlMDiFMUP
实施例5：在根据本发明的实施例4的CBA-ELISA中的BoNT/A校准曲线的说明
根据制造商的方案进行人诱导多能干(iPS)细胞衍生的神经元(CellularDynamics)的细胞培养和利用BoNT/A的中毒。
根据实施例4进行ELISA。作为特异结合未切割的和BoNT/A切割的SNAP-25的第一捕获抗体，使用兔多克隆抗-SNAP-25抗体S9684(Sigma)。该抗体允许检测细胞内SNAP-25的总量。作为特异结合BoNT/A切割的SNAP-25的切割位点第二捕获抗体，使用本发明的单克隆抗体克隆20-2-5(参见实施例1)。
图3中显示的图表示获得的BoNT/A校准曲线。其显示BoNT/A的浓度和活性分别与确定的HRP底物的荧光信号(RFU)和BoNT/A切割的SNAP-25的含量之间的依赖性。在BoNT/A的浓度和活性分别增加后，更多的SNAP-25被神经毒素转化，导致切割的SNAP-25的含量增加。使用4参数等式显示BoNT/A的信号BoNT/A的浓度/活性的依赖性。

Claims (15)

1.用于直接确定神经毒素多肽在细胞中的生物活性的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽在允许所述神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下孵育一段时间；
b)固定所述细胞并且，任选地，用去垢剂对所述细胞进行可渗透化处理；
c)将所述细胞与特异结合未切割的和神经毒素切割的底物的至少第一捕获抗体并且与特异结合所述神经毒素切割的底物的切割位点的至少第二捕获抗体，在允许所述捕获抗体结合所述底物的条件下相接触；
d)将所述细胞与特异结合所述第一捕获抗体的至少第一检测抗体在允许所述第一检测抗体结合所述第一捕获抗体的条件下相接触，从而形成第一检测复合体，并且与特异结合所述第二捕获抗体的至少第二检测抗体在允许所述第二检测抗体结合所述第二捕获抗体的条件下相接触，从而形成第二检测复合体；
e)确定步骤d)的所述第一和第二检测复合体的量；和
f)通过所述第二检测复合体计算所述细胞中由所述神经毒素多肽切割的底物的量，从而确定所述神经毒素多肽在所述细胞中的生物活性。
2.权利要求1所述的方法，其中所述方法是荧光方法。
3.权利要求1或2所述的方法，其中所述神经毒素多肽是BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/F或TeNT。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述底物是VAMP/小突触泡蛋白、SNAP-25或突触融合蛋白。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述细胞是选自由以下各项组成的组的神经元细胞或神经元分化细胞：原代神经元细胞、能够分化为神经元细胞的肿瘤细胞如成神经细胞瘤细胞、P19细胞或诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中固定所述细胞通过添加选自由以下各项组成的组的固定剂进行：甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或其混合物。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中特异结合所述未切割的和神经毒素切割的底物的所述第一捕获抗体允许确定所述细胞中神经毒素底物的总量。
8.权利要求7中任一项所述的方法，其中特异结合所述未切割的和神经毒素切割的底物的所述第一捕获抗体是兔多克隆抗-SNAP-25抗体S9684、兔多克隆抗-SNAP25抗体PA5-19708(PierceAntibodies)或兔多克隆抗-SNAP25抗体PA5-19701(PierceAntibodies)。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述第二捕获抗体是小鼠单克隆抗体克隆20-2-5或小鼠单克隆抗体MC-6053(R&DSystems)。
10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述第一和/或第二捕获抗体被固定。
11.权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述第一检测抗体是碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体、辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体或与荧光染料缀合的抗体。
12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述第二检测抗体是碱性磷酸酶(AP)缀合的抗体、辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体、葡萄糖氧化酶缀合的抗体、酪氨酸酶缀合的抗体或β-半乳糖酐酶抗体。
13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中HRP底物是AmplexUltraRed、10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪(ADHP)或3-(4-羟苯基)丙酸(HPPA)。
14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中AP底物是4-甲基伞形酮磷酸酯衍生物如6,8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸酯(DiFMUP)或荧光素二磷酸酯(FDP)。
15.用于进行权利要求1至14中任一项所述的方法的试剂盒，其包含：
a)第一捕获抗体、第二捕获抗体、第一检测抗体和第二检测抗体的装置，其中所述装置允许进行权利要求1至14中任一项所述的方法；
b)用于基于由根据a)的装置确定的所述第一和第二检测复合体的量计算由所述神经毒素切割的底物的量的工具；和
c)用于进行所述方法的使用说明。
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