CN102325792B - 用于生产高纯度神经毒素的手段和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体，或者特异性结合由具有如SEQ ID NO：1‑16任一项所示氨基酸序列的肽组成的表位的抗体，并涉及生产此类抗体的方法。此外，本发明涉及包含加工的神经毒素多肽的组合物，所述组合物不含未加工的或部分加工的神经毒素多肽，以及基于本发明的抗体，生产所述神经毒素多肽的方法。本发明还涉及前述抗体用于分离加工的神经毒素多肽与未加工的或部分加工的神经毒素多肽，或者用于测定未加工的或部分加工的神经毒素多肽的用途。本发明涉及生产药物的方法。

Description

用于生产高纯度神经毒素的手段和方法
本发明涉及特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体，或者特异性结合由具有如SEQ ID NO：1-16的任一项所示氨基酸序列的肽组成的表位的抗体。此外，本发明涉及用于生产神经毒素多肽的方法，包括以下步骤：将含有蛋白水解加工的、部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的混合物的溶液与特异性结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽、但不结合加工的神经毒素多肽的试剂在允许所述试剂与未加工的或部分加工的神经毒素多肽结合的条件下接触，从而形成抗原-试剂复合物，并去除所形成的抗原-试剂复合物，从而获得含有加工的神经毒素多肽而不含未加工的或部分加工的神经毒素多肽的溶液。本发明还涉及上述抗体用于分离蛋白水解加工的神经毒素多肽与未加工的或部分加工的神经毒素多肽的用途。本发明涉及用于生产药物的方法，包括上述方法的步骤，以及将蛋白水解加工的神经毒素多肽配制成药物的其他步骤。此外，本发明涉及包含可通过上述方法可获得的蛋白水解加工的神经毒素多肽的组合物。
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)分别产生高效价的神经毒素，即肉毒毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNT)特异性结合神经元细胞，破坏神经递质释放。每种毒素都作为无活性的未加工的约150kDa的单链蛋白质合成。翻译后加工涉及二硫键的形成和细菌蛋白酶的有限的蛋白水解作用(产生切口)。活性的双链神经毒素由两条链组成，由二硫键连接的约50kDa的N端轻链和约100kDa的重链。CNT结构上包括3个结构域，即，催化轻链、包含易位结构域(N端一半)和受体结合结构域(C端一半)的重链，参见Krieglstein 1990，Eur J Biochem 188，39；Krieglstein 1991，Eur J Biochem202，41；Krieglstein 1994，J Protein Chem 13，49。
肉毒梭菌分泌7种抗原性不同的血清型，命名为肉毒杆菌神经毒素 (BoNT)A至G。所有的血清型与由破伤风梭菌分泌的相关的破伤风神经毒素(TeNT)，都是Zn2+-内切蛋白酶，通过切割SNARE蛋白来阻断突触的胞吐。CNT导致在肉毒中毒和破伤风中可见的弛缓性肌肉麻痹，见Fischer 2007，PNAS 104，10447。
不论其毒性效应，肉毒杆菌毒素复合物已用作多种疾病的治疗剂。肉毒杆菌毒素A型血清型已于1989年被美国批准用于人类用途，治疗斜视、眼睑痉挛和其他病症。其可作为肉毒杆菌毒素A蛋白制剂商购，例如商标名BOTOX(Allergan Inc)、商标名DYSPORT(IpsenLtd)。对于治疗应用，复合物被直接注射到待治疗的肌肉中。在生理pH下，毒素从蛋白质复合物中释放，产生所希望的药理学作用。不含复合蛋白质的改良的BoNT/A制剂可以商标名XEOMIN(Merz Pharmaceuticals GmbH)获得。肉毒杆菌毒素的效应只是暂时的，这是维持治疗效果需要重复施用肉毒杆菌毒素的原因。
梭菌神经毒素减弱随意肌肌力，是斜视、灶性张力障碍包括颈肌张力障碍和良性自发性睑痉挛的有效疗法。其还进一步表现出缓解偏侧面肌痉挛和局部痉挛，并且对广泛的其他适应症有效，例如胃肠道功能障碍、多汗和美容纹校正，见Jost 2007，Drugs 67，669。
为了生产梭菌神经毒素，对含神经毒素的发酵溶液的纯化是特别重要的。在本上下文中，通常在不同的沉淀和提取步骤后使用浓缩步骤和其他不同的层析步骤，从而获得纯化的神经毒素，见DasGupta 1984，Toxicon 22，415；Sathyamoorthy 1985，J BiolChemistry 260，10461。目前，可获得的神经毒素制剂除理想的活性(加工的)神经毒素外，还包括蛋白水解未加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽。蛋白水解未加工的前体或部分加工的多肽仅在少数氨基酸的序列上不同于活性(加工的)神经毒素多肽。因此，基于其化学和物理性质它们是难以区分的。另一方面，蛋白水解未加工的前体和/或部分加工的神经毒素多肽占总蛋白质的比例在此类制剂中仍然是显著的。所述比例是由于生物学系统，并且是由生物合成和发酵过程的条件决定的。因而，神经毒素制剂中不需要的蛋白水解未加工的前 体和/或部分加工的神经毒素多肽的量是预先确定的，且目前是难以降低的。
用于降低未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽，以及从而改善神经毒素制剂的质量的的手段和方法是非常必需但仍不可得的。
因而，本发明潜在的技术问题可视为通过满足上述需要，提供改善神经毒素多肽生产的手段和方法。所述技术问题是由权利要求和下文表征的实施方案解决的。
本发明涉及特异性结合由具有如SEQ ID NO：1-16的任一项所示氨基酸序列的肽组成的表位的抗体。
本文所用的术语“抗体”涵盖了单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、人的、人源化的、灵长类化的或嵌合的抗体、双特异性抗体、合成抗体、化学或酶促修饰的衍生物、任意所述抗体的片段或由天然存在的和/或化学修饰的核酸组成的适体。所述抗体的片段包括F(ab′)2、F(ab)、Fv或scFv片段，或任意这类片段的化学或酶促修饰的衍生物。本发明的抗体应该特异性结合由上述肽组成的表位，如果所述肽包含在部分加工的或未加工的神经毒素多肽之内。
根据本发明的术语“表位”涉及被本发明的抗体识别的抗原决定簇。其由具有如SEQ ID NO：1-16的任一项所示氨基酸序列的肽组成。在本发明的一个方面，前述表位代表了这样的肽，所述肽的侧翼是神经毒素加工酶的切割位点或覆盖了所述切割位点，见下表1和2。在本发明的一个方面，表位包含在蛋白水解未加工的神经毒素多肽或在部分加工的神经毒素多肽中。部分加工的神经毒素多肽可以是用SEQ ID NO：1-8的任一项所示肽序列延伸的神经毒素多肽的轻链，或者是用SEQ ID NO：1-8的任一项所示肽序列延伸的神经毒素多肽的重链。由于存在所述表位，未加工的或部分加工的神经毒素多肽可以被抗体特异性的结合。
表1：神经毒素血清型的表位和全长多肽的氨基酸序列
a Krieglstein等，1991，Eur J Biochem 202，41-51.；Krieglstein等，1990，EurJ Biochem 188，39-45。
b Beecher和DasGupta 1997，J Protein Chem 16，701-712.；Krieglstein等，1994，J Protein Chem 13，49-57。
c Antharavally和DasGupta 1998，J Protein Chem 17，417-428。
d Sagane等，1999，J Protein Chem 18，885-892。
e Antharavally和DasGupta 1997，J Protein Chem 16，787-799。
表2：包括神经毒素血清型的切割位点的氨基酸序列
术语“特异性结合”意指本发明的抗体不与其他表位以显著的程度交叉反应，所述其他表位位于所述部分加工的或者所述未加工的神经毒素多肽上，或者位于其他一般性多肽上。在本发明的一个方面，本发明的抗体不与所述活性的、完全加工的神经毒素多肽交叉反应。表位特异性是本发明抗体的重要特征。一方面，抗体对于部分加工的或未加工的神经毒素的特异性相对于加工的神经毒素应该是至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％。可以通过各种公知的技术测试特异性结合，包括例如竞争研究。另一种重要的特征是抗体的灵敏度。在本发明的一个方面，灵敏度应该是使得样品所包含的加工的神经毒素的至少70％、至少80％、至少90％、至少95％是结合的。可以通过公知的技术测试灵敏度。本领域技术人员通过使用常规实验，能够确定用于每次确定的操作性和优化的测定条件。用于结合研究的常规技术包括放射免疫测定、ELISA、平衡透析、等温微量热法、测定(表面等离振子共振，SPR)或其他的表面吸附方法。 SPR系统测量抗体-抗原相互作用。SPR应答反映了随分析物的结合或解离，在检测仪表面的质量浓度的改变。基于SPR，实时 测量直接监测它们发生时的相互作用，见BIAapplications手册，AB版(1998年重印)， 编号：BR-1001-86；BIAtechnology手册，AB版(1998年重印)， 编号：BR-1001-84。原则上，可以通过使用位于传感器表面的固定化抗原(配体)的结合研究来确定本发明抗体的结合特性如灵敏度。可以在移动相，即溶液中提供待测试的抗体(分析物)。在一些情况下，抗原通过结合另一种固定化分子而间接的附着在表面上，所述固定化分子称为捕获分子。当抗体以离散的脉冲注射 在含固定化抗原的表面时，基本可以细分3个阶段：(i)在样品注射期间抗体与抗原的结合；(ii)在样品注射期间的平衡或稳定态，其中抗体结合的速率被抗体-抗原复合物的解离所平衡；(iii)在缓冲液流动期间抗体从表面解离。可以理解，此类测定可以备选地用固定化的待研究抗体和含抗原的溶液作为流动相来实施。缔合和解离阶段提供了关于分析物-配体相互作用动力学的信息(ka和kd，复合物形成和解离的速率，kd/ka＝KD)。平衡相提供了关于分析物-配体相互作用的亲和力的信息(KD)。在本发明的一个方面，本发明的抗体具有小于0.5μM的KD，在一个方面，小于0.05μM，在另一个方面，小于0.02μM。
可以使用以下方法生产本发明所称的抗体，所述方法描述在例如Harlow和Lane，“Antibodies，A Laboratory Manual”，CSH Press，ColdSpring Harbor，1988中。单克隆抗体可以按 1975，Nature 256，495和Galfré1981，Meth Enzymol 73，3中初始描述的技术来制备。所述技术包括将小鼠的骨髓瘤细胞与源自免疫动物的脾细胞融合。还可以通过本领域公知的技术进一步改良抗体。例如，用于 系统中的表面等离振子共振可用于增加与蛋白水解未加工的神经毒素多肽中的上述表位结合的噬菌体抗体的效率，参见Schier 1996，Human Antibodies Hybridomas 7，97；Malmborg 1995，J.ImmunolMethods 183，7。
在本发明的一个方面，根据本发明的抗体是使用包含上述表位的寡肽生产的。此类寡肽可以合成生产或通过重组表达生产。备选地，本发明的抗体可以通过使用天然存在的未加工的或部分加工的神经毒素多肽来生产。在后一种情况下，可以理解所获得的抗体应进一步测试它们对未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的特异性。在本发明的其他方面，使用部分加工的或未加工的神经毒素多肽来生产本发明的单克隆抗体，其中上述神经毒素多肽可用去垢剂处理，从而使表位是免疫学上可获得的。然而可以理解，在抗体将针对构象表位的情况下，不应进行此类去垢剂处理。在其他方面，免疫刺激剂如钥孔血蓝蛋白(KLH)也可用于此类方法，特别是当使用合成寡肽时。
本发明所称的抗体可例如用于部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的例如亲和层析、免疫沉淀和免疫定位，以及用于监测所述多肽在样品或重组生物中的存在。
在本发明的一个方面，部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽来自梭菌属。在本发明的一个方面，其来自选自肉毒梭菌ATCC 3502、肉毒梭菌ATCC 3502-Hall菌株的肉毒梭菌。所述来自肉毒梭菌的未加工的神经毒素多肽的一级结构公开在Krieglstein 1994，JProtein Chem 13，49中。
本文中所称的梭状杆菌属是革兰氏阳性、形成内生孢子的、专性厌氧细菌的属，属于硬壁菌门(Firmicutes)。梭菌神经毒素可以是由表型和基因型不同的梭菌生产的，所述梭菌属于物种肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、巴氏梭菌(Clostridiumbarati)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)。本文所用的肉毒梭菌是杆状的、革兰氏阳性的专性厌氧细菌种，除神经毒素外，它还产生卵圆形的近末端内孢子，一般可见于土壤中。
此外，在本发明抗体的另一方面，所述抗体与多肽载体结合。在本发明抗体的一个方面，所述多肽载体选自FC结合蛋白、蛋白A和蛋白G，以及特异性结合本发明抗体的抗体。一方面，这可以是例如物种特异性的抗体。此类抗体特异性的结合本发明抗体的FC部分或F(ab)。在本发明抗体的另一方面，所述多肽载体是金黄色葡萄球菌的蛋白A。在本发明的一个方面，所述多肽载体可用于分离本发明的抗体。
此外，在本发明抗体的另一方面，所述抗体与基质结合。在一个方面，所述基质是固体基质。
本文所用的术语“结合”涉及抗体和基质之间的任何类型的连接，只要所述连接实质上不干扰抗体与部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的结合。所述连接可以由相互作用产生，包括间接的或直接的、不可逆的或可逆的、物理的和化学的、静电的和/或共价的键。在一个方面，抗体与基质直接或通过接头分子共价连接。
根据本发明使用的术语“基质”指能够结合抗原或抗体的三维结构或 空间排列。公知的基质包括多肽、玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然的和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁石。在本发明的一个方面，固体基质是多糖基质，选自琼脂糖(sepharose)、Sephadex、琼脂糖(agarose)、葡聚糖纤维素(sephacell)、微晶纤维素和海藻糖珠。在另一方面，所述固体基质可由玻璃珠和/或多肽基质组成。
抗体可以通过接头与所述基质结合，包括小分子化合物、肽接头分子和小珠。基质实际上可具有任何可能的结构构型或排列，只要偶联的抗体能够结合它的抗原。因而，基质可以是球形的，如珠子，或者圆柱状的，如在试管的内表面，或者杆的外表面。备选地，表面可以是不规则的或平的，如层状、测试条等。在一个方面，所述支持物包括聚苯乙烯珠。
在本发明的一个方面，上述基质具有本发明抗体的至少一个结合位点。在本发明的另一个方面，所述基质具有识别其他表位的其他抗体的额外的结合位点。在一个方面，所述表位是允许部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽特异性结合的其他表位。固定在基质上的其他抗体还涵盖了识别神经毒素多肽以外的细菌多肽的抗体。此类被基质包括的其他抗体可用于去除其他不想要的多肽，从而用于神经毒素制剂的进一步纯化的目的。然而可以理解，在另一个方面，加工的神经毒素不应被固定在基质上的抗体特异性的结合。
本发明的上述抗体适合生产加工的神经毒素多肽，因其与上文经表征的表位特异性的结合，从而能够结合部分加工的或未加工的神经毒素多肽，进而将其与活性的加工的神经毒素多肽分离。在本发明的一个方面，能够结合和去除不需要的部分加工的和未加工的神经毒素多肽的抗体避免了与活性的加工的神经毒素多肽的相互作用，保留了它的生物学活性。由于本发明的缘故，纯化神经毒素是可能的，从而所需的活性多肽基本保持其活性不受影响。技术人员已知“活性”只在蛋白水解切割未加工的前体神经毒素多肽后获得，即使所述未加工的前体可以发挥一些生物学功能。因此，在本发明的一个方面，“蛋白水解加工的神经毒素多肽”是生物学活性的 神经毒素多肽。本发明中使用的术语“生物学活性”涉及神经毒素多肽的能力，所述能力是随后的受体结合、内化、跨内体膜易位到胞质中，和/或突触囊泡膜融合中涉及的一种或多种蛋白质的内切蛋白水解切割。
可以理解，除非另外指出，上文产生的术语的定义和解释都已作必要的修正的应用于本说明书下文描述的所有方面。
在本发明的另一个方面，提供了用于生产特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体的方法，包括步骤：
(a)将来自用肽免疫原免疫过的非人动物的多克隆抗血清与具有SEQ ID NO：25的肽，在允许形成包含上述肽和特异性的结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽的抗体的复合物的条件下接触，所述免疫原包含SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列；
b)从抗血清中去除步骤a)中形成的复合物；和
c)从所述复合物中释放与未加工的或部分加工的神经毒素多肽特异性结合的抗体。
上文使用的术语“肽免疫原”指具有如SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的寡肽，提供所述寡肽的方式允许在非人动物中引发免疫应答。在一个方面，所述免疫原还包含KLH，在另一方面，所述KLH是通过半胱氨酸(在一个方面，C-末端半胱氨酸)与具有SEQ ID NO：25的肽通过接头N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)连接。本领域公知如何通过接头分子如GMBS将KLH与肽连接，或如下文所附实施例所述。在另一个方面，非人动物是哺乳动物，在一个方面，是大鼠、小鼠、兔、绵羊或山羊。在进行本发明的方法之前，使用上述的肽免疫原免疫将作为多克隆抗血清来源的非人动物。本领域公知如何免疫非人动物，并描述在下文所附实施例中。所述免疫的结果是非人动物将产生抗肽免疫原的多克隆抗体。
可以通过多种技术从非人动物获得多克隆抗血清。在一个方面，通过本领域公知的标准技术和下文所附实施例所述，从血液、血清或血浆中获得多克隆抗血清。术语“多克隆抗血清”因而包括来自所述动物的纯化的 和部分纯化的血清。此类多克隆抗血清是上述方法的起始材料。除与未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽特异性结合的理想的抗体外，多克隆抗血清可包含不特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的其他抗体。这些抗体是通过将多克隆抗血清与同样具有如SEQ ID NO：25所示氨基酸序列的肽接触，与理想的特异性抗体分离的。在一个方面，所述肽如本文别处详细所述的固定在载体上。作为所述接触的结果，形成了肽和特异性抗体的复合物，所述复合物可以随后从多克隆血清中去除。然后可以从去除的复合物中释放出特异性抗体。从此类复合物中释放抗体的合适技术描述在本文的别处。
在另一个方面，所述方法在步骤a)之前进一步包含步骤：
i)在允许形成包含多克隆抗血清所包含的非特异性抗体和捕获肽的捕获复合物的条件下，将所述来自用肽免疫原免疫过的非人动物的多克隆抗血清与下列捕获肽接触：SLD、LDK和YNK，所述肽免疫原包含SEQ IDNO：25所示的氨基酸序列；和
ii)从多克隆抗血清中去除捕获复合物。
在本发明潜在的研究中，在山羊中使用与KLH偶联的接头肽作为免疫原，产生针对未加工的肉毒杆菌A型神经毒素(BoNT/A)的多克隆血清(抗接头肽scBoNT/A-血清)。即使在亲和纯化后，血清也在Western印迹中表现出与加工过的BoNT/A的交叉反应。经证实，交叉反应依赖于对三肽(SLD、LDK和YNK)的识别，所述三肽存在于接头肽中以及加工的BoNT/A的轻链和重链中。通过两步亲和层析纯化第二批山羊免疫血清，去除交叉反应的三肽-抗体。第二抗接头肽scBoNT/A-血清在western印迹中没有表现出针对加工的BoNT/A的交叉反应。在一个方面，三肽可以SEQ ID No：26至28的任一项所示的衍生物形式应用于亲和纯化。
在方法的一个方面，步骤a)至c)是通过亲和层析的手段进行的。
本发明使用的亲和层析指用于分离移动相中的分子的技术，该技术基于它们对层析使用的固定相的不同的亲和力。在一个方面，所述技术指从固定的配体上选择性吸附和之后回收化合物。在另一个方面，所述技术被 设计为高度特异和有效的纯化蛋白质和相关的化合物，使用在珠子和多孔基质上的恰当的选择性配体，用于结合目标化合物，并随后可以在温和的条件下回收。所述技术是基于高度特异性的相互作用，例如在抗原和抗体之间、酶和底物之间，或者受体和配体之间的相互作用。在另一个方面，所述亲和层析实施为柱层析。在一个方面，上文详细表征的亲和层析是免疫吸附层析、疏水相互作用层析(HIC)和反相层析，在另一个方面，是应用结合试剂的免疫亲和层析，所述结合试剂在另一方面是本发明的抗体。在一个方面，本文所称的固定相由将上述试剂作为固体基质组成。在一个方面，所述试剂与偶联在固体基质上的多肽载体结合，在另一个方面，与偶联在固体基质上的A蛋白结合。
在上述方法的另一个方面，步骤i)至ii)是通过亲和层析的手段进行的。
本发明还涉及鉴别特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体的方法，包括步骤：
a)确定抗体是否结合具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的肽；和
b)确定抗体是否结合具有下列氨基酸序列的肽：SLD、LDK和YNK，
其中，结合具有如SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列的肽但不结合具有下列氨基酸序列SLD、LDK和YNK的肽的抗体被鉴别为特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体。
根据鉴别抗体的方法使用的术语“确定”涵盖了用于确定结合给定肽的抗体的成熟技术，例如免疫印迹技术(Western印迹或点印迹技术)、亲和层析、等离振子表面共振技术( 测定)等。可以理解，在一个方面，前述抗体与肽的结合是特异性结合(即，没有交叉反应的结合)。
在一个方面，上述用于鉴别抗体的方法是针对单克隆抗体进行的。在一个方面，所述方法用于筛选杂交瘤细胞系，和之后生产与未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽特异性结合的单克隆抗体。在另一个方面，方法可应用于筛选多克隆抗体，例如，特异性结合未加工的和/或部分加工的 神经毒素多肽的肽抗体。在一个方面，方法可应用于验证通过本说明书的别处提到的本发明方法生产的抗体的特异性。
本发明还涉及可通过前述方法获得的抗体。在一个方面，所述抗体是多克隆抗体。在另一个方面，所述抗体与固相支持体偶联。
在一个方面，本发明的抗体允许以高灵敏度和特异性检测部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽，在一个方面，检测的极限是50至80pg/ml，在一个方面是69pg/ml。
原则上，前述抗体可用于从加工的神经毒素多肽中去除部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽，或者用于检测样品中的部分加工的和/或未加工的BoNT/A。
此外，本发明涉及用于生产神经毒素多肽的方法，包括步骤：
a)将含有蛋白水解加工的、部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的混合物的溶液与特异性的结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽但不结合加工的神经毒素多肽的试剂在允许所述试剂与未加工的或部分加工的神经毒素多肽结合的条件下接触，从而形成试剂-复合物，和
b)去除步骤a)中形成的试剂-复合物，从而获得含有加工的神经毒素多肽且不含未加工的或部分加工的神经毒素多肽的溶液。
本文所用的术语“接触”指使至少两种不同的化合物物理上邻近，以允许所述化合物的物理和/或化学相互作用。根据本发明的方法，在一个方面，所述两种不同的化合物是特异性结合包含在溶液中的部分加工的或未加工的神经毒素多肽的试剂。本文中意指的接触是在足以允许试剂与部分加工的或未加工的神经毒素多肽相互作用的条件下和时间内进行的。所述相互作用应导致部分加工的或未加工的神经毒素多肽与试剂的结合，从而形成抗原-试剂复合物。如本文中别处提出的，所述相互作用包括各种类型的结合，如间接的和直接的、不可逆的和可逆的方式。合适的条件允许试剂与溶液特异性相互作用。这是本领域技术人员公知的，可以不费周折的根据所述方法中应用的试剂和溶液确定所述条件。此外，本领域技术人员还可以不费周折的确定足以允许相互作用的时间。关于抗体用作试剂的条 件公开在下文所附的实施例中。
本文所用的溶液指任何含有神经毒素多肽及其部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的溶剂系统。溶剂系统进一步包含溶剂。在本发明的各个方面，溶剂涵盖了水、含水缓冲液体系、有机溶剂和离子液体。在本发明的一个方面，其是含水溶剂体系。此外，除神经毒素多肽和溶剂外，溶剂系统还可包含其他的分子，包括其他的细菌多肽。
本发明中使用的术语“试剂”指能够特异性结合部分加工的或未加工的神经毒素多肽的化合物。合适的化合物包括多肽、肽、抗体和有机化学分子。在本发明的一个方面，试剂是本文别处说明的多肽、肽或抗体。在本发明的另一个方面，所述试剂具有对于部分加工的或未加工的神经毒素多肽的至少一个结合位点。在本发明的另一个方面，所述试剂具有对于能够特异性结合试剂的其他抗体的额外结合位点。在本发明的另一个方面，试剂是上文说明的本发明的抗体。此外，在其他方面，试剂可以包括本发明的不同的抗体。例如，按照本发明，试剂可认为是根据本发明的一种抗体与本发明的另一种抗体的组合使用，其中，前者特异性的结合部分加工的神经毒素多肽，后者特异性的结合未加工的神经毒素多肽。备选地，按照本发明，试剂可包括两种或多种不同的本发明抗体，其中每种抗体特异性的结合存在于部分加工的和未加工的神经毒素多肽上的不同表位。
在本发明方法的一个方面，试剂固定在本文别处所提出的基质上。在其他方面，固定是通过试剂与基质的共价的直接结合或间接结合实现的。
本文所用的术语“特异性结合”指试剂与部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的结合，没有与其他神经毒素、宿主细胞蛋白质或更多的其他肽、多肽或其他化合物的交叉反应。可以通过多种公知的技术来测试特异性结合。在这一方面，可参照上文关于本发明的抗体所作出的已进行了必要修正的定义。
本发明使用的术语“试剂-复合物”指与部分加工的或与未加工的神经毒素多肽结合的物质。然而，此外，复合物还可以包含其他分子。在本发明的一个方面，复合物可包含稳定复合物或促进纯化的分子，例如通过允 许复合物与其他分子相互作用或促进复合物的沉淀。在本发明的一个方面，复合物所包含的额外分子涵盖了二级抗体，其照这样与试剂或复合物特异性的结合。所述二级抗体还可以随后被其他抗体或相互作用分子例如多肽载体间接的或直接的结合。可以理解，复合物还可以包含其他的细菌多肽，或包含在溶液中的其他分子。
本发明中使用的术语“去除”抗原-试剂复合物指将已复合的部分加工的和已复合的未加工的神经毒素多肽与含有活性加工的神经毒素的溶液分离。在本发明的一个方面，所述去除是通过亲和层析(例如通过使用免疫珠)的手段或通过免疫沉淀来进行的。
作为去除部分加工的和未加工的神经毒素多肽的结果，本发明的方法在一方面提供了高度纯化形式的活性加工的神经毒素多肽。在一个方面，本文所用的术语“高度纯化形式”指不含可检测量的部分加工的或未加工的神经毒素多肽的活性加工的神经毒素多肽，在另一个方面，也指不含可检测量的其他杂质的活性加工的神经毒素多肽。在一个方面，可检测量的部分加工的或未加工的神经毒素少于2.5％，少于1％或在另一个方面，少于0.1％。在本发明的其他方面，本文所指的活性加工的A型神经毒素多肽在分析(例如，通过SDS-PAGE)时，在还原条件下表现出在100kDa处可检测的单条带和50kDa处的可检测的单条带，但是在150kDa处没有带，后者是通常发生部分加工的或未加工的A型神经毒素多肽的位置。可以理解，也可以通过SDS-PAGE确定其他的多肽杂质。还可以理解，可以分别分析活性加工的神经毒素的其他血清型。
本发明的方法，其中所述神经毒素多肽选自：
a)神经毒素多肽BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或TeNT，和
b)具有与a)的神经毒素多肽的氨基酸序列至少40％同一性的氨基酸序列的神经毒素多肽。
本发明中使用的术语“神经毒素”指肉毒杆菌神经毒素的抗原性不同的血清型，即，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、 BoNT/G和破伤风神经毒素(TeNT)。在一个方面，所述BoNT/A具有SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列，BoNT/B具有SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，BoNT/C1具有SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列，BoNT/D具有SEQ ID NO：20所示的氨基酸序列，BoNT/E具有SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列，BoNT/F具有SEQ IDNO：22所示的氨基酸序列，BoNT/G具有SEQ ID NO：23所示的氨基酸序列，而TeNT具有SEQIDNO：24所示的氨基酸序列。
在本发明方法的其他方面，所述神经毒素多肽是任一种上述神经毒素多肽的变体，其具有的序列相对于SEQ ID NO：17至24的任一种具有至少一个氨基酸取代、添加和/或缺失。在另一个方面，所述变体神经毒素多肽具有的氨基酸序列与BoNT/A(SEQ ID NO：17)、BoNT/B(SEQ ID NO：18)、BoNT/C1(SEQ ID NO：19)、BoNT/D(SEQ ID NO：20)、BoNT/E(SEQ IDNO：21)、BoNT/F(SEQ ID NO：22)、BoNT/G(SEQ ID NO：23)或TeNT(SEQ ID NO：24)的氨基酸序列至少40％的序列同一性。在本发明的另一个方面，所述神经毒素多肽具有的氨基酸序列与BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G或TeNT的氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的序列同一性。本文所用的术语“同一”指由确定的氨基酸序列同一性表征的序列同一性，其中比对序列使得获得最高阶的匹配，可使用已出版的技术或计算机程序中编码的方法来计算，例如BLASTP、BLASTN、FASTA，Altschul 1990，J Mol Biol 215，403。在一个方面，百分比同一性的值是在完整的氨基酸序列上计算的。技术人员可获得基于多种算法的系列程序用于比较不同的序列。在本上下文中，Needleman和Wunsch，或Smith和Waterman的算法产生特别可靠的结果。为了进行序列比对，使用程序PileUp(1987，J Mol Evolution 25，351；Higgins1989CABIOS 5，151)或程序Gap和BestFit(Needleman和unsch1970，J Mol Biol 48；443；Smith和Waterman 1981，Adv Appl Math 2，482)，两者都是GCG软件包(Genetics ComputerGroup 1991，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)中的一部分。在本发明的一个方面，使用程序GAP用下列设置对整个序列区确定上文以百分比(％)陈述的序列同一性：空位权重：50，长度权重：3；平均匹配：10,000和平均错配：0.000，除非另外说明，否则其应该一直用作序列比对的标准设置。
可以理解，在本发明的一个方面，上述变体应该保留神经毒素的生物学特性。本领域技术人员可理解只有在蛋白水解激活后才获得完整的生物学活性，即使可以想到未加工的前体可以产生一些生物学功能或部分活性。本文所用的“生物学特性”指(a)受体结合，(b)内化，(c)跨内体膜易位到胞质中，和/或(d)涉及突触囊泡膜融合的蛋白质的内切蛋白水解切割。评估生物学活性的体内测定包括小鼠LD50测定和离体的小鼠偏侧膈测定，如Pearce LB，Borodic GE，First ER，MacCallum RD(1994)(Measurement of botulinumtoxin activity：evaluation of the lethalityassay.Toxicol Appl Pharmacol 128：69-77)和Dressler D，Lange M，BigalkeH(2005)(The mouse diaphragm assay fordetection of antibodies againstbotulinum toxin type B.Mov Disord 20：1617-1619)所述。生物学活性通常用小鼠单位(MU)表述。如本文中使用的，1MU是在腹膜内注射后，杀死50％的特定小鼠群体的神经毒性成分的量，即，小鼠i.p.LD50(Schantz&Kauter，1978)。在其他方面，变体可以是具有改良的或改变的生物学特性的神经毒素，例如它们可包含针对酶识别改良的切割位点，或者可针对受体结合或任何其他上述特性进行改良。可以想像，本发明的概念依赖于在神经毒素多肽的轻链和重链之间1、2或多个切割位点的存在，同时只要试剂对部分加工的或未加工的神经毒素多肽是特异性的，则切割位点的性质和它们之间的特定氨基酸序列是无关紧要的。因此，在另一个方面，可以替换蛋白酶识别位点和在神经毒素多肽的重链和轻链之间的接头肽，或围绕切割位点的侧翼序列(在单个切割位点的情况下)。
在另一个方面，根据本发明方法的神经毒素多肽可以是嵌合的分子。在一个方面，此类所述嵌合分子可具有被取代的单个结构域。因此，在另一个方面，神经毒素重链的部分被抗体的FC结构域的一部分取代。
在一个方面，根据本发明方法生产的神经毒素多肽可用于分析工具，包括ELISA、用于ELISA的抗原和对照标准。
为了实现也不含其他杂质的神经毒素制剂，可以在本发明的上述方法中加入本领域公知的进一步纯化步骤，并在下文中解释。
按照上文，在本发明方法的一个方面中，所述方法是通过亲和层析的手段实施的。
在本发明的另一个方面，如下制备用于免疫亲和层析的特定的免疫吸附剂：
-合成未加工的或部分加工的前体多肽的特定的寡肽(由SEQ ID NO：1至16或25的任一项表示)，制备合成的寡肽；
-将肽与用于免疫的适当载体(包括血蓝蛋白、BSA、脂多糖等)缀合，特别是，将寡肽与多肽载体结合；
-免疫动物以产生多克隆或单克隆抗体，具体而言，免疫兔子或山羊产生多克隆抗体，免疫小鼠产生单克隆抗体(为了获得亲合的抗体，需要免疫至少10只动物)；
-产生杂交瘤细胞系来生产单克隆抗体；
-通过常规的和亲合层析来纯化抗体(对于后者，寡肽可与载体结合)，具体而言，使用例如A或G蛋白，和/或通过与载体结合的寡肽(后者用于免疫)，或者通过肽亲和层析去除非特异性抗体后再亲和层析，来纯化抗体；
-切割特定的抗体为Fab片段，具体而言，用蛋白酶如木瓜蛋白酶处理特定的抗体，以便获得各个Fab片段；
-在进一步应用前表征Fab片段的结合特性；
-将抗体与柱基质偶联，如激活的琼脂糖，具体而言，将特定的Fab片段与载体材料的活化的连接基团偶联；
-使用合适的缓冲液体系洗涤和平衡(柱中的)免疫吸附剂；
-未加工的或部分加工的前体神经毒素多肽与免疫吸附剂特异性结合，而活性加工的神经毒素多肽无变化地穿过柱(不结合)并被收集。
在本发明方法的另一个方面，还额外的实施大小排阻层析。本发明使用的大小排阻层析，基于颗粒的大小，即，基于它们的流体动力学体积分离颗粒。流动相是用于运输样品的含水溶液(凝胶过滤层析)，或者是有机溶剂(凝胶渗透层析)。固定相是凝胶基质(聚丙烯酰胺、葡聚糖或琼脂糖)和低压下滤器，或者硅胶、或在更高压下的交联的聚苯乙烯介质。在另一个方面，所述大小排阻层析以柱层析来实施。在本发明方法的其他方面，所述大小排阻层析使用具有不同孔大小的分子筛来实施，例如活性碳、硅胶、沸石。
在另一个方面，本发明的方法还包括离子交换层析。
本发明使用的离子交换层析基于蛋白质和相关化合物的总体电荷之间的差异来分离分子。其用于蛋白质纯化、寡核苷酸、肽或其他带电分子的纯化。此类分子可作为污染物存在于应用于纯化方法的溶液中。蛋白质或相关的目标化合物(在本案例的情况下是神经毒素)必须具有与附着在树脂上的官能团相反的电荷以便结合。由于该相互作用是离子型的，结合必须发生在低离子条件下。通过增加离子强度至打破离子相互作用，或者通过改变蛋白质的pH来实现洗脱。在本发明方法的一个方面，所述交换层析作为柱层析实施。
在一个方面，根据本发明使用的交换层析是离子交换层析。
在另一个方面，本发明使用的离子交换层析是通过阳离子和/或阴离子层析来实施的。在本文所用的阴离子交换层析中，所结合的溶质(蛋白质、肽、核酸、内毒素)的表面电荷是净负电，因而为了得到特定蛋白质的结合，表面电荷应接近或高于所述蛋白质的pI。常规使用的阴离子交换树脂是Q-树脂(Q Sepharose)，季铵类；和DEAE(二乙基氨基乙烷)树脂。一般而言，离子交换树脂是小珠的不溶性基质，具有带电的表面，用作人工沸石。可以基于它们的官能团区分不同类型的树脂，包括强酸性树脂(磺酸基，例如聚苯乙烯磺酸钠或polyAMPS)、强碱性树脂(季铵基，例如三甲铵基，如polyAPTAC)、弱酸性树脂(大部分是羧酸基)、弱碱性树脂(伯、仲或叔氨基，例如聚乙二胺)。还有可进一步区分的专用类型的 树脂，包括螯合树脂(亚氨基二乙酸、硫脲)。
在本文所用的阳离子交换层析中，所结合的溶质的表面电荷是净正电，因而为了得到特定蛋白质的结合，表面电荷应接近或低于所述蛋白质的pI。常用的阳离子交换树脂是S-树脂、硫酸盐衍生物；和CM树脂，羧酸盐衍生离子。
在本发明方法的一个方面，所述离子交换层析是在亲和层析之前和/或之后进行的。在本发明方法的另一个方面，本文所用的所述离子交换层析是在本发明的亲和层析之前进行的。
由于该测量，可以进一步避免和降低在亲和层析过程中潜在的交叉反应或非特异性结合的风险。
本发明的方法允许生产不含未加工的或部分加工的前体多肽的活性加工的神经毒素，因而获得更大量的活性加工的神经毒素多肽。
原则上，本发明涉及本发明的抗体用于将活性加工的神经毒素与其未加工的或部分加工的前体多肽分离的用途。在一个方面，本发明的抗体用于在含有所述多肽的混合物的溶液中，将未加工的或部分加工的前体神经毒素多肽与活性加工的神经毒素多肽分离，因而获得如本文别处详细描述的不含未加工的或部分加工的前体神经毒素多肽的活性加工的神经毒素多肽。
本发明还涉及用于生产药物的方法，包括上述方法的步骤以及将所述蛋白水解加工的神经毒素多肽配制成药物的其他步骤。
本文所用的术语“药物”在一个方面指包含生物学活性的(蛋白水解加工的)神经毒素多肽作为药物活性化合物的药物组合物，其中所述药物组合物可以治疗有效剂量用于多种疾病或病症的人或非人的治疗。
本文所用的药物组合物包含本发明的生物学活性的(蛋白水解加工的)神经毒素多肽，和在一个方面，一种或多种可药用载体。活性的神经毒素可以液体或冻干的形式存在。在一个方面，所述化合物可以与甘油、蛋白质稳定剂(例如，人血清白蛋白(HAS))或非蛋白质稳定剂共存。
在一个方面，药物组合物是局部施用的。常规使用的药物施用方式是 肌内、皮下(靠近腺体)施用。然而，根据化合物的性质和作用方式，也可以通过其他途径施用药物组合物。
化合物，即生物活性(蛋白水解加工的)神经毒素多肽是组合物的活性成分，并且在一个方面，以通过将药物与标准药物载体根据常规步骤组合而制备的常规剂型施用。这类步骤可涉及混合、造粒和压片，或者当对所需制剂合适时将成分溶解。可以理解，可药用载体或稀释剂的形式和特征由其所组合的活性成分的量、施用途径和其他公知的变量来决定。
在与制剂的其他成分相容和对其受体无害的意义上，载体必须是可接受的。所使用的药物载体可以包括固体、凝胶或液体。固体载体的实例是乳糖、白土(terra alba)、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液体载体的实例是磷酸缓冲盐溶液、糖浆、油、水、乳液、各种类型的湿润剂等。类似地，载体或稀释剂可包括本领域公知的延时材料，例如不含或含有蜡的单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。所述合适的载体包括上文提及的，和其他本领域公知的那些，参见例如Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania。
所选择的稀释剂不影响组合的生物学活性。此类稀释剂的实例是蒸馏水、生理盐水、林格液、葡萄糖溶液和Hank液。此外，药物组合物或制剂还可以包括其他的载体、佐剂或无毒的、非治疗性的、非免疫原性的稳定剂等。
治疗有效剂量指用于本发明的药物组合物的化合物的量，所述量的化合物预防、缓解或治疗与本说明书所指的疾病或状况伴随的症状。可以通过标准的制药程序在细胞培养物或实验动物中确定化合物的疗效和毒性，例如ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(在50％的群体中致死的剂量)。治疗和毒性效应之间的剂量比是治疗指数，其可表示为比例LD50/ED50。
可由主治医师和其他的临床因素来确定剂量方案。如医学领域公知的，对任一个患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体格大小、体表面积、 年龄、待施用的特定化合物、性别、施用的时间和途径、健康状况和共同施用的其他药物。可以通过周期性评估来监测进程。
为了治疗或缓解或预防本说明书中阐述的疾病或状况，施用本文所指的药物组合物和制剂至少一次。然而，所述药物组合物可以施用一次以上。
特定的药物组合物以制药领域公知的方式制备，并包括至少一种上文所指的活性化合物与可药用载体或稀释剂的混合或其它方式结合。为了制备这些特定药物组合物，活性化合物一般与载体或稀释剂混合。所获得的制剂将适合施用方式。为了预见根据所考虑的受体而做出的剂量调节，在处方或使用者说明中应指出推荐剂量。
在本发明的其他方面，根据本发明的药物除生物学活性的(蛋白水解加工的)神经毒素多肽之外，还可以包含在其配制过程中添加到药物组合物中的药物。最后，可以理解，为了保证质量、制药安全和药物效果，在GMP标准化条件或类似条件下进行药物组合物的配制。
一般而言，本发明考虑了包含可通过本发明方法获得的蛋白水解加工的神经毒素多肽的组合物。
术语“药物组合物”指配制成固体、液体、气溶胶(或气体)形式的任何组合物。所述组合物包含本发明的化合物任选的与合适的辅助化合物，例如稀释剂或载体，或其他成分。在上下文中，辅助化合物与其他成分对本发明而言是可区分的，所述辅助化合物即在出于所需目的应用所述组合物时，对本发明化合物引发的效应没有帮助的化合物，而所述其他成分即对本发明化合物的效应产生进一步的影响或调节所述效应的化合物。合适的稀释剂和/或载体取决于组合物所用于的目的和其他成分。本领域技术人员可以不费周折的确定此类合适的稀释剂和/或载体。合适的稀释剂和/或载体的实例公开在本文的别处。
在本发明的其他方面，前述组合物是说明书的别处中更详细的说明的药物。在一个方面，所述药物可用于预防和/或治疗至少一种下列疾病和病症：随意肌肌力(voluntarymuscle strength)、灶性张力障碍包括颈部、头部张力障碍、和良性自发性睑痉挛、偏侧面肌痉挛和局限性痉挛、胃肠 道病症、多汗和化妆纹校正，在其他方面，包括眼睑痉挛、口颚肌张力障碍、颚开放型、颚闭合型磨牙症、梅热综合征、舌肌张力障碍、眼睑失用症、开放宫颈张力障碍、颈项前屈、颈后倾、laterocollis、斜颈、咽张力障碍、喉张力障碍、痉挛性发声困难/内收肌型、痉挛性发声困难/外展肌型、痉挛性呼吸困难、四肢张力障碍、手臂张力障碍、任务特异性张力障碍、书写痉挛、音乐家痉挛、高尔夫痉挛、腿张力障碍、大腿内收、大腿外展、膝盖屈曲、膝盖伸展、踝屈曲、踝伸展、内翻足、畸形足张力障碍、纹状趾、趾屈曲、趾延长、轴张力障碍、比萨(pisa)综合征、肚皮舞演员张力障碍、节段性肌张力障碍、偏侧肌张力障碍、全身性肌张力障碍、X连锁肌张力障碍(dystonia in lubag)、皮质基底退化中的肌张力障碍、X连锁肌张力障碍(dystonia in lubag)、迟发性肌张力障碍、脊髓小脑性共济失调中的肌张力障碍、帕金森病中的肌张力障碍、亨廷顿病中的肌张力障碍、哈-施病中的肌张力障碍、多巴诱发运动障碍/多巴诱发肌张力障碍、迟发型运动障碍/迟发型肌张力障碍、突发性运动障碍/肌张力障碍、促动性非促动作用-诱导型软腭阵挛、肌阵挛性肌纤维颤搐、僵硬、良性肌痉挛、遗传型下巴震颤、异常的颚肌活性、半侧咀嚼肌痉挛、肥大性鳃肌病、嚼肌肥大、胫骨前肌肥大、眼球震颤、振动幻视性核上性凝视麻痹、癫痫、持续性癫痫、痉挛性斜颈手术的方案(planning of spasmodic torticollisoperation)、外展肌声带麻痹、顽固性突变型肌张力障碍、上食道括约肌功能障碍、声襞肉芽肿、口吃型吉勒德拉图雷综合征、中耳肌阵挛、保护性喉闭合、喉切除术后、演讲障碍、保护性下垂症、睑内翻括约肌Odii功能失调、假性食道弛不能、非迟缓不能、食道运动功能障碍、阴道痉挛、术后固定性震颤、膀胱功能障碍、逼尿肌括约肌协同失调、膀胱括约肌痉挛、半面痉挛、神经移植术运动失调、化妆品使用性鱼尾纹、皱眉性面部不对称、颏肌浅凹、僵人综合征、破伤风型前列腺增生、肥胖症、治疗婴儿大脑性麻痹斜视、混合型麻痹伴生、视网膜脱落手术术后、白内障手术后、无晶状体的肌炎性斜视、肌病性斜视、分离垂直性偏斜、作为斜视手术的附属物、内斜视、外斜视、迟缓不能、肛裂、外分泌腺活动过度、弗 赖综合征、鳄鱼泪综合征、多汗症、腋窝、掌部、足底的鼻液溢、中风中、帕金森病中、肌萎缩性脊髓侧索硬化症痉挛病症中、脑炎和脊髓炎的自身免疫进程中的相对多涎症、多发性硬化、横贯性脊髓炎、视神经脊髓炎、病毒感染、细菌感染、寄生虫感染、真菌感染、遗传痉挛性轻截瘫中的脑卒中后综合征、脑半球性梗塞、脑干梗塞、脊髓梗塞、中枢神经系统肿瘤中的脑半球性损伤、脑干损伤、脊髓损伤、中枢神经系统大出血中的出血、脑内出血、蛛网膜下出血、硬膜下出血、椎管内出血、肿瘤中的脑半球肿瘤、脑干肿瘤、脊髓肿瘤。关于细节和症状，参见例如Jost 2007，Drugs 67(5)，669或Dressier 2000in Botulinum Toxin Therapy，Thieme Verlag，Stuttgart，New York。
在本发明的另一个方面，组合物是可以按为上文的药物组合物所述配制的化妆品组合物。对于化妆品组合物，可类似的视为在一个方面以基本纯的形式使用本发明的化合物。在其他方面，化妆品组合物是肌内施用的。在本发明的其他方面，包含了神经毒素的化妆品组合物可以配制为抗皱溶液。
本说明书引用的所有参考文献都通过引用以其完整的公开内容和本说明书中具体提及的公开内容并入到本文中。
附图描述：
图1：神经毒素多肽的常规层析纯化的示意图。
图2：生物学活性的(蛋白水解加工的)神经毒素多肽的层析纯化，及其根据本发明的部分加工的或未加工的多肽前体的分离的示意图。
图3：使用特异性识别SEQ ID NO：25且通过本发明的方法获得的抗体的Western印迹。用kDa表示条带的大小。实施例中说明了每一泳道。
下列实施例示例了本发明，且无论如何不应被视为是对其范围的限制。
实施例
实施例1：产生免疫原和抗体
免疫原的产生
1、接头肽-免疫原I：通过外部供应商产生具有序列NH2-TKSLDKGYNK-C-COOH的肽，然后通过接头GMBS与载体-蛋白质KLH偶联。
2、接头肽-免疫原II：a）激活卵清蛋白：将2.18mg硫代-smcc（磺基琥珀酰亚胺基-4(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯）溶解在50μlDMSO中。之后，添加2.5ml含7.5mg/ml卵清蛋白的卵清蛋白溶液（缓冲液：5mM磷酸钠；0.9%NaCl），并在室温下旋转温育溶液1h。使用PD10柱实施缓冲液改变，用3.5ml含10mM磷酸钠的0.9%NaCl缓冲液洗脱活化的卵清蛋白。b）将肽与卵清蛋白偶联：将8mg的肽Ac-DKGYNC-OH溶解在250μl H2O和2.5μl500mM TCEP HCL（三[2-羧乙基]膦HCl）中，之后用1mM NaOH中和。最后，加入活化的卵清蛋白，并在室温下旋转温育反应混合物4.4h。通过加入10mM半胱氨酸溶液，旋转温育1h，封闭剩余的反应残基。使用10mM磷酸钠；0.9%NaCl实施透析。
免疫
通过免疫获得抗血清。
1）抗接头肽scBoNT/A-血清I：使用接头肽免疫原I作为免疫原，所述接头肽免疫原I通过接头GMBS与载体-蛋白KLH偶联。皮下免疫两只山羊，每只首先用在弗氏佐剂中的300μg dekapeptid免疫原，最终用在不完全弗氏佐剂中的100μg免疫原以2周的节律免疫4次。在49、63、77和84天后，收集抗血清。使用第84天时最后一次取血所收集的血清来实施亲和层析。
2）抗接头肽scBoNT/A-血清II：使用接头肽免疫原II作为免疫原，所述接头肽免疫原II通过接头SMCC与载体-蛋白卵清蛋白偶联。皮内免疫两只兔子，每只首先用在弗氏佐剂中的300μg接头肽免疫原II，最终用在Montanide ISA206中的150μg接头肽免疫原II以2周的节律免疫5次。 分别使用第60或110天时放血所收集的血清来实施亲和层析。
血清的两步亲和层析
1、产生基质：对于两步亲和层析，产生含有不同肽的两种不同的超连接碘代乙酰基质。
一方面，交联反应肽SLD、LDK和YNK以下列肽的形式呈现：Ac-ELDKYN-C-COOH（SEQID NO:26）、NH2-NISLDL-C-COOH（SEQ ID NO:27）和NH2-YYNKF-C-COOH（SEQ ID NO:28），并使用下文给出的一般说明与基质偶联。另一方面，以下列衍生物的形式：Ac-TKSLDKGYNKA-C-COOH，使用下文给出的一般说明将接头肽（SEQ ID NO:25）与基质偶联。
一般说明：
偶联缓冲液：50mM Tris，5mM EDTA-Na，pH8.5。制备的缓冲液的体积等于将使用的Iodoacyl Gel体积的20倍。
L-半胱氨酸HCl：洗涤溶液：1mM氯化钠（NaCl）。
可以在顶部和底部封闭的空的重力流动或旋转柱：
制备肽或蛋白质样品
用偶联缓冲液溶解肽。
与Iodoacyl Gel偶联：
1、将底盖置于重力流动柱上，加入希望量的Iodoacyl Gel浆液，让凝胶沉降15分钟。
2、从填装的柱中排出液体，用5倍凝胶柱床体积的偶联缓冲液洗涤/平衡odoacyl Gel，通过将所述缓冲液加入凝胶床的顶部，允许通过柱排出。防止凝胶床流干。
3、替换底盖，加入制备好的含巯基的样品。每ml的 Iodoacyl Gel可应用约1ml的样品溶液。
4、替换顶盖，在RT混合柱15分钟。
5、将柱竖直直立，在不搅拌的条件下RT温育30分钟。
6、顺序去除柱顶部和底部的盖子，允许溶液排出。
7、用3倍凝胶柱床体积的偶联缓冲液洗涤柱子。
封闭凝胶上的非特异性结合位点：
1、替换柱子上的底盖。
2、制备50mM L-半胱氨酸HCl在偶联缓冲液中的溶液，将每毫升该凝胶1ml的该溶液加入到柱子中。
3、替换顶盖，在RT混合15分钟，然后在不搅拌的条件下再RT温育反应物30分钟。
2、两步亲和层析：
首先从血液中分离待纯化的血清。
将原始血清加至含有交叉反应三肽的第一柱上。交叉反应抗体结合所述三肽，并从原始血清中分离。将该第一柱的滤液加至含结合接头肽的第二柱上。接头肽特异性抗体结合接头肽。通过用PBS缓冲液（0.5M NaCl）的高严谨度洗涤，从柱中去除低亲和力的抗接头肽scBoNT/A抗体。之后，洗脱并浓缩结合的高亲和力抗接头肽scBoNT/A抗体。该浓缩液对应于所使用的抗接头肽scBoNT/A血清。
实施例2：测试和验证抗体特异性
试剂ELISA：
包被缓冲液：0.005M-1M Tris；0.9%NaCl，优选0.01M-0.2M Tris；0.9%NaCl，pH=8.5。
捕获抗体：抗接头肽scBoNT/A血清。
封闭和抗体稀释缓冲液：在0.01M磷酸钠中的0.5%-5%BSA；0.9% NaCl，pH=7.4。
样品缓冲液：在0.005M-1M磷酸钠中的0.5%-5%BSA；0.1-0.5MNaCl；0.01%-1%Tween20，优选在0.005-0.1M磷酸钠中的1%-3%BSA；0.15M-0.4M NaCl；0.05%-0.5%Tween20，pH=7.4。
洗涤缓冲液：0.01M磷酸钠；0.9%NaCl；0.05%Tween20，pH=7.4。
检测抗体：抗BoNT/A的单克隆抗体。
二级抗体：缀合了过氧化物酶的抗小鼠IgG（H&L）抗体的多克隆抗体。
底物：TMB，可商购。
2、试剂Western印迹：
变性样品缓冲液，可商购。
SDS凝胶，可商购。
MES电泳缓冲液（SDS PAGE）：可商购。
PVDF膜：可商购。
转移缓冲液（Western印迹）：可商购。
样品：含双链-BoNT/A和scBoNT/A的肉毒杆菌神经毒素A。
一级抗体：抗接头肽scBoNT/A血清。
二级抗体：缀合了碱性磷酸酶的多克隆驴抗山羊抗体IgG（H&L）。
封闭和抗体稀释缓冲液：在0.01M-0.1M Tris中的0.5%-5%BSA；0.9%NaCl，0.05%-5%Tween20，pH=7.4。
洗涤缓冲液：0.01M-0.1M Tris；0.9%NaCl；0.05%-5%Tween20，pH=7.4。
Tris缓冲液：0.025M Tris，pH=8.0。
底物：BCIP/NBT，可商购。
a）抗血清对BoNT/B和BoNT/E的特异性：为了确定抗血清对BoNT/B和BoNT/E的特异性，在ELISA中分析了物质的回收率。用100μl/孔的 包被缓冲液在室温温育微量滴定板16h，所述缓冲液中含有0.5μg抗接头肽scBoNT/A-血清/ml，之后用洗涤缓冲液洗涤3次。向微量滴定板中加入200μl/孔封闭溶液，并在室温温育1h。抗原scBoNT/A（在样品缓冲液中系列稀释；pg/ml浓度）用作校正标准，用100μl/孔的校正标准温育微量滴定板。分别在样品缓冲液中稀释BoNT/B或BoNT/E，并以100μl/孔的体积应用于微量滴定板。两种物质都过量使用，使用的稀释度为200ng/ml。在37°C温育样品和标准品2h。用洗涤缓冲液洗涤微量滴定板3次。加入100μl的检测缓冲液/孔，并在室温温育1h。然后，用洗涤缓冲液洗涤微量滴定板3次。之后，用100μl/孔的二级抗体在室温温育1h。然后，用洗涤缓冲液洗涤微量滴定板3次。
通过加入100μl底物/孔开始检测反应。在室温温育30分钟后，通过加入50μl2MH2SO4/孔来终止反应，并测定450nm的吸光度。为了确定特异性，通过标准化计算BoNT/B和BoNT/E的浓度。通过计算回收率，可以确定抗接头肽scBoNT/A对血清型B和E的特异性。回收率越低，交叉反应越低，且血清对scBoNT/A的特异性越好。
b）抗接头肽BoNT/A对双链BoNT/A的特异性：为了确定抗血清对活化的双链BoNT/A的特异性，通过Western印迹实施免疫组织化学检测。在还原条件下通过SDS-PAGE将NT样品（scBoNT/A至少50ng，双链BoNT/A取决于所使用的样品）根据其分子量分离为scBoNT/A、LC和HC（双链BoNT/A）。然后，将蛋白质印迹在PVDF膜上。用20ml封闭缓冲液在室温封闭膜1h。去除封闭缓冲液，加入20ml含0.005μg/ml抗接头肽scBoNT/A血清的一级抗体溶液。一级抗体在4°C温育过夜。去除含抗体的溶液，用20ml洗涤缓冲液在37°C洗涤3次，30分钟。之后，用浓度为0.4μg/ml的二级抗体在室温温育膜3小时。去除二级抗体溶液，用20ml洗涤缓冲液在37°C洗涤3次，30分钟。此外，在室温用20ml的25mM TRIS缓冲液洗涤膜1次，5分钟。
通过添加底物来实施检测反应。底物温育15分钟，通过加水终止显色反应。通过染色在150kDa的scBoNT/A条带来确定特异性。当只检测到 150kDa的特异性条带，而没有对100kDa（HC）和50kDa（LC）处的双链BoNT/A特异性的条带时，确定抗接头肽的特异性。图3：在泳道3显示了对BoNT/A制备物的150kDa scBoNT/A的特异性（NT样品，见上文）。在100kDa或50kDa没有表现出任何条带，仅识别了scBoNT/A。出于比较，泳道4显示了部分加工的和未加工的scBoNT/A的掺合物，泳道5显示了不可切割的scBoNT/A对照。泳道2显示了缓冲液对照。

Claims (18)

1.抗体，其结合由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列组成的表位并且不与活性的、完全加工的肉毒杆菌A型神经毒素(BoNT/A)多肽交叉反应。
2.权利要求1的抗体，其是单克隆或多克隆抗体。
3.权利要求1的抗体，其中所述表位包含在蛋白水解未加工的或部分加工的BoNT/A神经毒素多肽中。
4.权利要求3的抗体，其中所述BoNT/A神经毒素多肽来自梭菌属。
5.生产特异性结合未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的抗体的方法，包括步骤：
a)将来自用包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的肽免疫原免疫过的非人动物的多克隆抗血清与如SEQ ID NO:25所示的肽在允许形成包含前述肽和特异性结合未加工的或部分加工的神经毒素多肽的抗体的复合物的条件下接触；
b)从抗血清中去除步骤a)中形成的复合物；和
c)从所述复合物中释放与未加工的或部分加工的神经毒素多肽特异性结合的抗体，
其中所述方法在步骤a)之前进一步包括步骤：
i)将所述来自用包含SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列的肽免疫原免疫过的非人动物的多克隆抗血清与下列捕获肽：SLD、LDK和YNK在如下条件下接触，所述条件允许形成包含多克隆抗血清中包含的非特异性抗体和捕获肽的捕获复合物；和
ii)从多克隆抗血清中去除捕获复合物。
6.权利要求5的方法，其中所述免疫原还包含KLH。
7.权利要求6的方法，其中所述KLH通过接头N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)与如SEQ ID NO:25所示的肽连接。
8.权利要求5-7任一项的方法，其中步骤a)至c)是通过亲和层析进行的。
9.权利要求5-7任一项的方法，其中步骤i)至ii)是通过亲和层析进行的。
10.通过权利要求5-9任一项的方法获得的抗体。
11.权利要求10的抗体，其是多克隆抗体。
12.权利要求1-4、10或11任一项的抗体，其中所述抗体与固相支持体偶联。
13.权利要求1-4或10-12任一项的抗体的用途，用于从加工的神经毒素多肽中去除部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽。
14.权利要求1-4或10-12任一项的抗体的用途，用于检测样品中部分加工的和/或未加工的肉毒杆菌A型神经毒素(BoNT/A)。
15.用于生产加工的神经毒素多肽的方法，包括步骤：
a)将含有加工的和部分加工的和/或未加工的神经毒素多肽的混合物的溶液与权利要求1-4或10-12的抗体在允许所述抗体与未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽结合的条件下接触，从而形成包含所述抗体和部分加工的或未加工的神经毒素多肽的复合物，和
b)去除步骤a)中形成的所述复合物，从而获得含有加工的神经毒素多肽且不含未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽的溶液。
16.权利要求15的方法，其中步骤a)和b)是通过亲和层析进行的。
17.权利要求15或16的方法，其中所述方法还包括离子交换层析。
18.用于生产药物的方法，包括权利要求15-17任一项方法的步骤以及将所述溶液配制成药物的另一步骤，所述溶液含有加工的神经毒素多肽且不含未加工的和/或部分加工的神经毒素多肽。
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