BRPI1008885B1

BRPI1008885B1 - Método para obter uma solução purificada de polipeptídeos de neurotoxina processados e composição

Info

Publication number: BRPI1008885B1
Application number: BRPI1008885-7A
Authority: BR
Inventors: Michael Pfeil; Karl-Heinz Eisele; Harold V. Taylor; Josef Friedrich; Cornelia BRÜNN
Original assignee: Merz Pharma Gmbh & Co. Kgaa
Priority date: 2009-02-19
Filing date: 2010-02-17
Publication date: 2021-09-28
Also published as: IL214372A0; MX2011008759A; KR20110122852A; KR101806567B1; EP2398824B1; RU2571212C2; MX340772B; CN102325792B; US20160340417A1; CA2751311C; BRPI1008885A2; EP2398824A1; US9963502B2; CA2751311A1; AU2010214834A1; CN102325792A; JP2012518018A; US9447175B2; RU2011138060A; AU2010214834B2

Abstract

ANTICORPO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, USO DO ANTICORPO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE POLIPEPTÍDEO DE NEUROTOXINA PROCESSADO, MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE UM MEDICAMENTO E COMPOSIÇÃO A presente invenção se refere a um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e/ou parcialmente processado ou um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo consistindo de um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 16 e a métodos para a produção de tais anticorpos. Além disso, a presente invenção diz respeito a uma composição compreendendo o polipeptídeo de neurotoxina processado livre de polipeptídeo de neurotoxina não processado ou parcialmente processado e um método para a produção do dito polipeptídeo de neurotoxina com base nos anticorpos da invenção. A presente também diz respeito ao uso do anticorpo acima separar polipeptídeos de neurotoxina processados de polipeptídeos de neurotoxina não processados ou parcialmente processados ou para determinar polipetídeos de nurotoxina não processados ou parcialmente processados. A presente invenção se refere a um método para a produção de um medicamento.

Description

[0001] A presente invenção se refere a um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado ou um anticorpo que liga especificamente um epítopo consistindo de um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 16. Além disso, a presente invenção se refere a um método para a produção de um polipeptídeo de neurotoxina, compreendendo as etapas de, contactar uma solução contendo uma mistura de polipeptídeos de neurotoxina proteoliticamente processados, parcialmente processados e / ou não processados com um agente que se liga especificamente a polipeptídeos de Neurotoxina não processados ou parcialmente processados, mas não polipeptídeos de neurotoxina processados em condições que permitam a ligação do dito agente com os polipeptídeos de neurotoxina não processados ou parcialmente processados pelos quais um complexo antígeno-agente é formado, e remover o complexo antígeno-agente formado, através do qual uma solução contendo polipeptídeos de neurotoxina processados livres de polipeptídeos de neurotoxina não processados ou parcialmente processados é obtida. A presente invenção também diz respeito ao uso do anticorpo acima para separar polipeptídeos de neurotoxina proteoliticamente processados de polipeptídeos de neurotoxina não processados ou parcialmente processados. A presente invenção se refere a um método para a produção de um medicamento compreendendo as etapas do método acima e a etapa de formular os polipeptídeos de neurotoxina proteoliticamente processados como medicamento. Além disso, a presente invenção diz respeito a uma composição que compreende o polipeptídeo de neurotoxina proteoliticamente processado obtido pelo método referido anteriormente.

[0002] Clostridium botulinum e Clostridium tetani produzem neurotoxinas altamente potentes, ou seja, toxinas botulínicas (BoNTs) e toxina tetânica (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas Clostridiais (CNT) se ligam especificamente a células neuronais e interrompem a liberação do neurotransmissor. Cada toxina é sintetizada como uma proteína de cadeia única, inativa, não processada de aproximadamente 150 kDa. O processamento pós-traducional envolve a formação de pontes de dissulfeto, e proteólise limitada (corte) por protease bacteriana(s). Neurotoxina de bi-cadeia ativa consiste de duas cadeias, uma cadeia leve N-terminal de aprox. 50 kDa e uma cadeia pesada de aprox. 100 kDa ligada por uma ligação dissulfeto. CNTs estruturalmente consistem de três domínios, ou seja, a cadeia leve catalítica, a cadeia pesada abrangendo o domínio de translocação (metade N-terminal) e o domínio de ligação ao receptor (metade C-terminal), ver Krieglstein 1990, Eur J Biochem 188, 39; Krieglstein 1991, Eur J Biochem 202, 41; Krieglstein 1994, Proteína J Chem 13, 49.

[0003] Clostridium botulinum secreta sete sorotipos distintos antigenicamente designados A a G da neurotoxina botulínica (BoNT). Todos os sorotipos juntos com a neurotoxina de tétano relacionada (TeNT) secretada pelo Clostridium tetani, são Zn2+ -endoproteases que bloqueiam exocitose sináptica pela clivagem de proteínas SNARE. CNTs causam a paralisia flácida muscular vista em botulismo e tétano, ver Fischer 2007, PNAS 104, 10447.

[0004] Apesar de seus efeitos tóxicos, o complexo de toxina botulínica tem sido usado como um agente terapêutico em um grande número de doenças. Sorotipo A de toxina botulínica foi aprovado para uso humano nos Estados Unidos em 1989 para o tratamento de estrabismo, blefaroespasmo, e outros distúrbios. É comercialmente disponível como uma preparação de proteína A de Toxina Botulínica, por exemplo, sob o nome comercial de BOTOX (Allergan Inc), sob o nome comercial DYSPORT (Ipsen Ltd). Para aplicação terapêutica o complexo é injetado diretamente no músculo a ser tratado. Em pH fisiológico, a toxina é liberada a partir do complexo de proteína e ocorre o efeito farmacológico desejado. Uma melhor preparação de BoNT/A sendo livre de proteínas complexantes está disponível sob o nome comercial XEOMIN (Merz Pharmaceuticals GmbH). O efeito da Toxina Botulínica é apenas temporário, que é a razão pela qual a administração repetida de Toxina Botulínica pode ser necessária para manter um efeito terapêutico.

[0005] As neurotoxinas Clostridiais enfraquecem a força muscular voluntária e são uma terapia eficaz de estrabismo, distonia focal, incluindo distonia cervical, e blefarospasmo essencial benigno. Elas foram ainda mostradas para alívio de espasmo hemifacial, e espasticidade focal e, além disso, para ser eficaz em uma ampla gama de outras indicações, tais como distúrbios gastrointestinais, hiperidrose, e correção cosmética de rugas, ver Jost 2007, Drugs 67, 669.

[0006] Para a produção de neurotoxinas Clostridiais, a purificação da neurotoxina contendo solução de fermentação é de particular importância. Neste contexto, diferentes etapas de precipitação e extração seguidas por uma etapa de concentração e ainda etapas cromatográficas distintas são normalmente aplicadas para a obtenção de neurotoxina purificada, ver DasGupta 1984, Toxicon 22, 415; Sathyamoorthy 1985, J Biol Chemistry 260, 10461. Atualmente, preparações de neurotoxina disponíveis compreendem, além da neurotoxina ativa (processada) desejada, um precursor proteoliticamente não processado e / ou polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado. O precursor proteoliticamente não processado ou polipeptídeo parcialmente processado difere do polipeptídeo de neurotoxina ativo (processado) em uma sequência de apenas poucos aminoácidos. Portanto, dificilmente podem ser distinguidos com base em suas propriedades químicas e físicas. Por outro lado, a proporção de precursor proteoliticamente não processado e / ou polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado da relação de proteína total é ainda significativa em tais preparações. A dita proporção é devido ao sistema biológico, e é determinada pela biossíntese e as condições do processo de fermentação. Assim, a quantidade de precursor proteoliticamente não processado indesejado e / ou polipeptídeo de Neurotoxina parcialmente processado em preparações de Neurotoxina é pré-definida e, atualmente, bastante difícil de reduzir.

[0007] Meios e métodos para reduzir a quantidade dos polipeptídeos de neurotoxina não transformados e / ou parcialmente processados e, assim, melhorar a qualidade das preparações de neurotoxina são altamente desejáveis, mas ainda não disponíveis.

[0008] Assim, o problema técnico subjacente a presente invenção pode ser visto como a disponibilidade de meios e métodos para melhorar a produção de polipeptídeos de neurotoxina através do cumprimento das necessidades acima mencionadas. O problema técnico é resolvido pelas modalidades caracterizadas nas reivindicações e aqui abaixo.

[0009] A presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a um epítopo consistindo de um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 16.

[0010] O termo "anticorpos", como usado neste documento, engloba um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal, um anticorpo de cadeia única, um humano, anticorpo humanizado, primatizado, ou quimerizado, um anticorpo bi-específico, um anticorpo sintético, derivados modificados quimicamente ou enzimaticamente, um fragmento de qualquer um dos ditos anticorpos ou aptâmeros consistindo de ácidos nucléicos de ocorrência natural e / ou quimicamente modificados. Fragmentos dos ditos anticorpos incluem F(ab')2, F(ab), Fv ou fragmentos de scFv ou derivados modificados quimicamente ou enzimaticamente de qualquer um desses fragmentos. O anticorpo da presente invenção se liga especificamente ao epítopo consistindo do peptídeo acima, se o dito peptídeo é composto pelo polipeptídeo da neurotoxina parcialmente processado ou não processado.

[0011] O termo "epítopo" de acordo com a presente invenção refere-se ao determinante antigênico que é reconhecido pelo anticorpo da presente invenção. Ele consiste de um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos como mostrada em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 16. Os epítopos acima representam, em um aspecto da invenção, peptídeos que são flanqueados pelos sítios de clivagem para enzimas de processamento de neurotoxina ou que cobrem o sítio(s) de clivagem, ver tabelas 1 e 2 abaixo. O epítopo é, em um aspecto da invenção, composto por um polipeptídeo de neurotoxina proteoliticamente não processado ou por um polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado. O polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado pode ser tanto a cadeia leve do polipeptídeo de neurotoxina alongado com as sequências de peptídeos como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 8, ou a cadeia pesada da neurotoxina do polipeptídeo alongada com as sequências de peptídeos como mostrado em qualquer uma das posições SEQ ID NOs: 1 a 8. Devido à presença do dito epítopo, os polipeptídeos de neurotoxina não processados ou parcialmente processados podem ser especificamente ligados pelo anticorpo.

[0012] Tabela 1: Sequências de aminoácidos dos epítopos e os polipeptídeos de comprimento total dos sorotipos de Neurotoxina

aKrieglstein et al. 1991, Eur J Biochem 202, 41-51.; Krieglstein et al. 1990, Eur J Biochem 188, 39-45. bBeecher and DasGupta 1997, J Protein Chem 16, 701-712.; Krieglstein et al. 1994, J Protein Chem 13, 49-57. cAntharavally and DasGupta 1998, J Protein Chem 17, 417-428. dSagane et al. 1999, J Protein Chem 18, 885-892. eAntharavally and DasGupta 1997, J Protein Chem 16, 787-799.

[0013] Tabela 2: Sequências de aminoácidos incluindo os sítios de clivagem dos sorotipos da Neurotoxina

[0014] O termo "se liga especificamente" significa que o anticorpo da presente invenção não atravessa para reagir de forma significativa com outros epítopos quer nos ditos polipeptídeos de neurotoxina parcialmente processados, quer nos ditos polipeptídeos de neurotoxina não processados, ou em outros polipeptídeos em geral. Em um aspecto da invenção, o anticorpo da presente invenção não atravessa para reagir com o dito polipeptídeo de neurotoxina ativo totalmente processado. Especificidade do epítopo é uma característica importante do anticorpo da presente invenção. Especificidade do anticorpo com relação à neurotoxina parcialmente processada ou não processada versus a neurotoxina processada será, em um aspecto, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%. Ligação específica pode ser testada por várias técnicas bem conhecidas, incluindo, por exemplo, estudos de competição. Outra característica importante é a sensibilidade do anticorpo. Sensibilidade deve ser, em um aspecto da invenção, de tal forma que pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% da neurotoxina processada composta por uma amostra seja ligada. Sensibilidade pode ser testada por meio de técnicas bem conhecidas. Aqueles hábeis na arte serão capazes de determinar as condições operacionais e de ensaio ideal para cada determinação, empregando a experimentação de rotina. Técnicas convencionais para estudos de ligação incluem radioimunoensaio, ELISA, diálise de equilíbrio, microcalorimetria isotérmica, ensaios BIACORE ® (ressonância plásmica de superfície, SPR) ou outros métodos de adsorção de superfície. O sistema BIACORE ® SPR mede a interação antígeno-anticorpo. Resposta SPR reflete uma mudança na concentração de massa na superfície do detector como analitos ligados ou dissociados. Com base na SPR, BIACORE ® em tempo real mede interações de monitor diretamente à medida que ocorrem, ver BIAapplications Handbook, versão AB (reimpressão 1998), BIACORE ® Código No: BR-1001-1086; BIAtechnology Handbook, versão AB (reimpressão 1998), BIACORE ® Código No: BR-1001-1084. As propriedades de ligação, como a sensibilidade de um anticorpo da presente invenção, podem, em princípio, ser determinadas por estudos de ligação usando um antígeno imobilizado (o ligante), apresentado em uma superfície do sensor. O anticorpo a ser testado (o analito) será fornecido na fase móvel, ou seja, em uma solução. Em alguns casos, o antígeno é ligado indiretamente à superfície através da ligação a uma outra molécula imobilizada que é referida como a molécula de captura. Quando o anticorpo é injetado em um pulso discreto em toda a superfície com os antígenos imobilizados, essencialmente três fases podem ser subdivididas: (i) Associação do anticorpo com o antígeno durante a injeção da amostra, (ii) Equilíbrio ou estado estacionário durante a injeção da amostra, onde a taxa de ligação do anticorpo é equilibrada pela dissociação do complexo antígeno-anticorpo; (iii) A dissociação de anticorpos a partir da superfície durante o fluxo de tampão. Será entendido que tal ensaio pode, alternativamente, realizado com anticorpos imobilizados a serem investigados e um antígeno contendo solução como fase móvel. As fases de associação e dissociação fornecem informações sobre a cinética da interação analito-ligante (ka e kd, as taxas de formação de complexo e dissociação, kd / ka = KD). A fase de equilíbrio fornece informações sobre a afinidade da interação analito-ligante (KD). Em um aspecto da invenção, o anticorpo da presente invenção tem um KD inferior a 0,5 μM, em um aspecto, menos de 0,05 μM e, em outro aspecto, menos de 0,02 μM.

[0015] O anticorpo tal como referido na presente invenção pode ser produzido usando métodos que são descritos, por exemplo, em Harlow e Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, de 1988. Anticorpos monoclonais podem ser preparados pelas técnicas descritas originalmente em Kohler 1975, Nature 256, 495, e Galfré 1981, Meth Enzymol 73, 3. As ditas técnicas envolvem a fusão de células de mieloma de rato para células do baço provenientes de mamíferos imunizados. Anticorpos podem ser melhorados por meio de técnicas bem conhecidas na arte. Por exemplo, a ressonância de plasma de superfície como empregada no sistema BIACORE ® pode ser usada para aumentar a eficiência de anticorpos fagos que se ligam ao epítopo acima dentro do polipeptídeo de neurotoxina proteoliticamente não processado, ver Schier 1996, Human Antibodies Hybridomas 7, 97; Malmborg 1995, J. Immunol Methods 183, 7.

[0016] Em um aspecto da invenção, o anticorpo de acordo com o anticorpo da presente invenção é, em um aspecto, produzido usando uma oligopeptídeo compreendendo o epítopo acima mencionado. Tal oligopeptídeo pode ser produzido sinteticamente ou por expressão recombinante. Alternativamente, o anticorpo da invenção pode ser produzido através da aplicação de polipeptídeo de neurotoxina que ocorre naturalmente não processado ou parcialmente processado. Neste último caso, é preciso entender que os anticorpos resultantes devem ser testados para especificidade em relação ao polipeptídeo(s) de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado. Em outro aspecto da invenção, um anticorpo monoclonal da invenção é produzido usando polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado ou não processado que pode ser tratado por um detergente a fim de fazer o epítopo imunologicamente disponível. No entanto, será entendido que em um caso o anticorpo deve ser dirigido contra um epitopo conformacional, nenhum tratamento de detergente deve ser realizado. Em outro aspecto, agentes de imuno- estimulação, tais como hemocianina do molusco keyhole limpet (KLH) podem ser também aplicados nesse processo, especialmente quando se utiliza um oligopeptídeo sintético.

[0017] O anticorpo tal como referido na presente invenção pode ser usado, por exemplo, para cromatografia de afinidade, imunoprecipitação e imunolocalização do polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e / ou não processado, bem como para o monitoramento da presença do dito polipeptídeo em amostras ou em organismos recombinantes.

[0018] Em um aspecto da invenção, o polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e / ou não processado é de Clostridium spp.. Em outro aspecto da invenção, é a partir de Clostridium botulinum selecionado do grupo de Clostridium botulinum ATCC 3502, Clostridium botulinum ATCC 3502 - cepa Hall. A estrutura primária do dito polipeptídeo de neurotoxina não processado de Clostridium botulinum é divulgada em Krieglstein 1994, J Protein Chem 13, 49.

[0019] Clostridium spp. como aqui referido é o gênero de bactérias Gram-positivas, formadoras de endósporos, bactérias anaeróbias obrigatórias que pertencem aos Firmicutes. Neurotoxinas Clostridiais podem ser produzidas por clostridias diferentes fenotípica e geneticamente pertencentes às espécies Clostridium botulinum, Clostridium butyricum, Clostridium barati e Clostridium tetani. Clostridium botulinum como aqui utilizado é espécie em forma de uma haste, bactéria anaeróbia obrigatória, Gram-positiva, que produz, além das neurotoxinas, endósporos ovais, subterminais, e é comumente encontrada no solo.

[0020] Além disso, em outro aspecto do anticorpo da presente invenção, o dito anticorpo é ligado a um polipeptídeo transportador. Em um aspecto do anticorpo da presente invenção, o referido polipeptídeo transportador é selecionado do grupo que consiste de: uma proteína de ligação FC, Proteína A e Proteína G e um anticorpo que se liga especificamente aos anticorpos da presente invenção. Isso pode ser, por exemplo, em um aspecto, um anticorpo que é específico da espécie. Tal anticorpo se liga especificamente à porção FC ou F(ab) do anticorpo da invenção. Em outro aspecto do anticorpo da presente invenção o dito polipeptídeo transportador é Proteína A de Staphylococcus aureus. O dito polipeptídeo transportador pode ser usado, em um aspecto da invenção, para isolar o anticorpo da presente invenção.

[0021] Além disso, em outro aspecto do anticorpo da presente invenção, o dito anticorpo é ligado a uma matriz. Em um aspecto, a dita matriz é uma matriz sólida.

[0022] O termo "ligação" como aqui utilizado, refere-se a qualquer tipo de ligação entre o anticorpo e da matriz, enquanto a dita ligação não interfere essencialmente com a ligação do anticorpo ao polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e / ou não processado. A dita ligação pode ser feita por meio de interações incluindo ligações diretas ou indiretas, não reversíveis ou reversíveis, físicas e químicas, eletrostáticas, e / ou covalentes. Em um aspecto, o anticorpo é covalentemente ligado, diretamente ou através de uma molécula ligadora, com a matriz.

[0023] O termo "matriz" como utilizado de acordo com a presente invenção se refere a uma estrutura tridimensional ou arranjo espacial capaz de ligar um antígeno ou um anticorpo. Matrizes bem conhecidas compreendem polipeptídeos, vidro, poliestireno, polipropileno, polietileno, polietileno glicol (PEG), dextran, nylon, amilases, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, gabros e magnetita. Uma matriz sólida é, em um aspecto da invenção, uma matriz de polissacarídeo selecionada do grupo consistindo em: sefarose, sefadex; agarose, sefacel, micro-celulose, e contas de alginato. Em outro aspecto, a dita matriz sólida pode ser composta de contas de vidro, e / ou matrizes de polipeptídeos.

[0024] O anticorpo pode ser ligado à dita matriz através de um ligador, incluindo compostos de moléculas pequenas, moléculas de peptídeo ligadores e esferas. A matriz pode ter praticamente qualquer configuração estrutural possível ou arranjo, desde que o anticorpo acoplado seja capaz de se ligar ao seu antígeno. Assim, a matriz pode ser esférica, como em um cordão, ou cilíndrica, como na superfície interna de um tubo de ensaio, ou a superfície externa de uma vara. Alternativamente, a superfície pode ser irregular ou achatada, como uma folha, fita de teste, etc. Em um aspecto o referido suporte inclui contas de poliestireno.

[0025] A matriz acima, em um aspecto da invenção, tem pelo menos um sítio de ligação para o anticorpo da presente invenção. Em outro aspecto da invenção, a dita matriz tem outros sítios de ligação para os anticorpos que reconhecem outros epítopos. Em um aspecto, os ditos epítopos são outros epítopos que permitem a ligação específica do polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e / ou não processado. Anticorpos adicionais imobilizados na matriz também englobam anticorpos que reconhecem polipeptídeos bacterianos que não sejam os polipeptídeos de neurotoxina. Tais anticorpos ainda compreendidos pela matriz podem ser usados para remover mais polipeptídeos indesejados e, assim, para fins de purificação adicional de uma preparação de neurotoxina. No entanto, é preciso entender que em outro aspecto a neurotoxina processada não deve ser ligada especificamente pelos anticorpos imobilizados na matriz.

[0026] O anticorpo acima da presente invenção é adequado para a produção de polipeptídeo de neurotoxina processado porque se liga especificamente ao epítopo acima caracterizado, assim, permitindo a ligação do polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado ou não processado e ainda que o separa do polipeptídeo de neurotoxina processado ativo. Um anticorpo que é capaz de se ligar e remover o polipeptídeo de neurotoxina indesejado parcialmente processado e não processado evita, em um aspecto da invenção, a interação com o polipeptídeo de neurotoxina processado ativo que mantém a sua atividade biológica. Graças à presente invenção, purificação de neurotoxina é possível através da qual o polipeptídeo ativo desejado permanece essencialmente inalterado em sua atividade. O técnico qualificado sabe que "atividade" é obtida somente após clivagem proteolítica do polipeptídeo de neurotoxina precursor não processado, embora o dito precursor não processado possa exercer algumas funções biológicas. Assim, o "polipeptídeo de neurotoxina proteoliticamente processado" em um aspecto da invenção, é polipeptídeo de neurotoxina biologicamente ativo. O termo "biologicamente ativo", como usado na presente invenção refere-se à capacidade do polipeptídeo de neurotoxina de receptor subsequente se ligar, interiorizar, translocar através da membrana endossomal no citosol, e / ou clivagem endoproteolítica de uma ou mais proteínas envolvidas na fusão de membrana da vesícula sináptica.

[0027] É preciso entender que as definições e explicações dos termos feitos acima aplicam-se mutatis mutandis para todos os aspectos descritos nesta especificação a seguir, exceto quando indicado em contrário.

[0028] Em um outro aspecto da presente invenção, um método para a produção de um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado é fornecido, o dito método compreendendo as etapas de: a) contactar um anti-soro policlonal a partir de um animal não-humano que tem sido imunizado usando um antígeno de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido, como mostrado na SEQ ID NO: 25 com um peptídeo tendo SEQ ID NO: 25 em condições que permitam a formação de um complexo que inclui o peptídeo acima e um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado ou parcialmente processado; b) remover o complexo formado na etapa c) do anti-soro; e c) liberar o anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado ou parcialmente processado do dito complexo.

[0029] O termo "antígeno de peptídeo" como usado acima refere-se a um oligopeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 25, que é fornecida de forma a permitir a provocação de uma resposta imune em um animal não-humano. Em um aspecto, o dito antígeno ainda inclui KLH e ainda um aspecto adicional, o dito KLH é ligado através de uma cisteína e, em um aspecto uma cisteína C-terminal, para o peptídeo tendo SEQ ID NO: 25 via o ligador éster N-[gama- maleimidobutiriloxi]succinimida (GMBS). Como se ligar KLH a um peptídeo por uma molécula ligadora como GMBS é bem conhecido na arte ou descrito nos exemplos que acompanham a seguir. Em outro aspecto o animal não-humano é um mamífero, em um aspecto um rato, camundongo, coelho, ovinos e caprinos. Antes de efetuar o método da invenção, um animal não-humano que deve ser a fonte do anti-soro policlonal será imunizado com o antígeno de peptídeo acima mencionado. Como imunizar um animal não-humano é bem conhecido na arte e descrito nos Exemplos de acompanhamento, abaixo. Como resultado da dita imunização, o animal não-humano irá produzir anticorpos policlonais contra o imunogênio de peptídeo.

[0030] Um anti-soro policlonal pode ser proveniente do animal não-humano por várias técnicas. Em um aspecto ele é obtido a partir do sangue, do soro ou plasma por técnicas padrão bem conhecidas na arte e descritas nos Exemplos de acompanhamento, abaixo. O termo "anti-soro policlonal", portanto, inclui soros purificados e parcialmente purificados a partir do dito animal. Como anti-soro policlonal é o material de partida para a aplicação do referido método. Além do anticorpo desejado (ou anticorpos) que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado, o anti-soro policlonal pode incluir anticorpos adicionais que não se ligam especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado. Estes anticorpos são separados e formam os anticorpos específicos pretendidos por contato do anti-soro policlonal com um peptídeo também tendo uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 25. Em um aspecto, o dito peptídeo é imobilizado em um veículo, tal como descrito em detalhes neste documento. Como resultado do dito contato, um complexo de peptídeos e anticorpos específicos é formado o qual pode ser posteriormente removido do soro policlonal. Os anticorpos específicos podem ser liberados a partir do complexo removido. Técnicas adequadas para liberar anticorpos de tal complexo são descritas neste documento.

[0031] Em outro aspecto do dito método ainda compreende antes da etapa a) as etapas de i) contactar o dito anti-soro policlonal a partir de um animal não-humano que tem sido imunizado usando um antígeno de peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 25 com os seguintes peptídeos de captura SLD, LDK, e YNK em condições que permitam a formação de complexos de captura compreendendo anticorpos inespecíficos compostos por anti-soro policlonal e os peptídeos de captura, e ii) remover os complexos de captura do anti-soro policlonal.

[0032] Nos estudos de base da invenção, um soro policlonal foi levantado contra a neurotoxina botulínica tipo A não processada (BoNT/A), utilizando o peptídeo ligador acoplado ao KLH como antígeno (peptídeo anti-ligador scBoNT/soro A) em caprinos. Mesmo depois da purificação de afinidade, os soros mostraram reatividade cruzada para BoNT / A processadas em um Western blot. Foi demonstrado que as reações cruzadas dependiam do reconhecimento de tripeptídeos (SLD, LDK e YNK), que ocorreu no peptídeo ligador, bem como, nas cadeias leves e pesadas de BoNT / A processados. Um segundo lote de imunosoro de cabra foi purificado através de duas etapas de cromatografia de afinidade, removendo a reação cruzada de tripeptídeo-anticorpos. O segundo peptídeo anti-ligador scBoNT/soro A exibiu qualquer reatividade cruzada contra BoNT / A processados em um western blot. Os tripeptídeos podem ser aplicados, em um aspecto, para a purificação de afinidade em forma de derivados mostrados em qualquer uma das SEQ ID NOs 26 a 28.

[0033] Em um aspecto do método as etapas a) a c) são realizadas por meio de cromatografia de afinidade.

[0034] Cromatografia de afinidade, usada na presente invenção refere-se a uma técnica de separação de moléculas em uma fase móvel com base em suas afinidades diferentes para uma fase estacionária utilizada na cromatografia. Em um aspecto, a dita técnica refere-se a adsorção seletiva e posterior recuperação de um composto a partir de um ligante imobilizado. Em outro aspecto, a dita técnica é projetada para a purificação altamente específica e eficiente de proteínas e compostos relacionados usando ligantes seletivos apropriados em contas e matrizes porosas para ligação de compostos alvo, que podem então ser recuperados em condições brandas. A dita técnica é baseada em uma interação altamente específica, tal como aquela entre antígeno e anticorpo, enzima e substrato, ou receptor e ligante. Em outro aspecto, a dita cromatografia de afinidade é realizada como cromatografia em coluna. Cromatografia de afinidade como caracterizada em detalhe acima é em um aspecto, a cromatografia imunoabsorvedora e, cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), cromatografia em fase reversa, e em outro aspecto, cromatografia de imunoafinidade aplicando o agente de ligação que está no mesmo aspecto, o anticorpo da presente invenção. Uma fase estacionária, tal como referida aqui num aspecto consiste no agente acima mencionado como uma matriz sólida. O dito agente está em um aspecto, ligado a um polipeptídeo transportador acoplado a uma matriz sólida, e em outro aspecto, ligado à proteína A acoplada a uma matriz sólida.

[0035] Em outro aspecto da aplicação do referido método as etapas i) e ii) são realizadas por meio de cromatografia de afinidade.

[0036] A presente invenção também se refere a um método para identificar e anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado compreendendo as etapas de: a) determinar se o anticorpo se liga a um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 25, e b) determinar se o anticorpo se liga a peptídeos tendo as seguintes sequências de aminoácidos SLD, LDK e YNK, onde um anticorpo que se liga a um peptídeo tendo uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 25, mas não a peptídeos tendo a seguinte sequência de aminoácidos SLD, LDK e YNK é identificado como um anticorpo que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado.

[0037] O termo "determinação", como usado de acordo com o método para a identificação de um anticorpo engloba técnicas bem estabelecidas para determinar se o anticorpo se liga a um dado peptídeo como técnicas de imunoblotting (tecnologias Western ou Dot-blot), cromatografia de afinidade, técnicas de ressonância de plasma de superfície (Ensaios BIACORE®) e similares. Será entendido que em um aspecto, a ligação acima mencionada do anticorpo ao peptídeo ou peptídeos é uma ligação específica (ou seja, ligação sem reatividade cruzada).

[0038] Em um aspecto, o referido método para a identificação de um anticorpo é realizado por anticorpos monoclonais. Em um aspecto, o método é usado para triagem de linhagens celulares de hibridoma e, posteriormente, para produzir anticorpos monoclonais que se ligam especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado. Em outro aspecto, o método pode ser aplicado para triagem de anticorpos policlonais, por exemplo, anticorpos de peptídeo, que se ligam especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado e / ou parcialmente processado. Em um aspecto, o método pode ser aplicado para a confirmação da especificidade de um anticorpo produzido por um método da presente invenção referido em outro lugar deste relatório.

[0039] A presente invenção também se refere a um anticorpo obtido pelo método referido anteriormente. No aspecto o anticorpo é um anticorpo policlonal. Em outro aspecto, o dito anticorpo é acoplado a um suporte sólido.

[0040] O anticorpo da invenção, em um aspecto, permite a detecção de polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e / ou não processado com uma alta sensibilidade e especificidade, em um aspecto com um limite de detecção de 50 a 80 pg / ml, em um aspecto 69 pg / ml.

[0041] Em princípio, o anticorpo acima pode ser usado para a remoção do polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e / ou não processado a partir do polipeptídeo de neurotoxina processado ou para detectar BoNT / A processados e / ou não processados em uma amostra.

[0042] Em adição, a presente invenção se refere a um método para produção do polipeptídeo de neurotoxina compreendendo as etapas de: a) contactar uma solução contendo uma mistura de polipeptídeos de neurotoxina proteoliticamente processados, parcialmente processados e / ou não processados com um agente que se liga especificamente aos polipeptídeos de neurotoxina não processados ou parcialmente processados, mas não para os polipeptídeos de neurotoxina processados em condições que permitam a ligação do referido agente com os polipeptídeos de neurotoxina não processados ou parcialmente processados pelos quais um agente complexo é formado, e b) remoção do complexo de agente formado na etapa a) na qual uma solução contendo polipeptídeo de neurotoxina processado livre de polipeptídeo de neurotoxina não processado ou parcialmente processado é obtida.

[0043] O termo "contactar" como aqui utilizado refere-se a trazer pelo menos dois compostos diferentes em proximidade física como para permitir interação física e / ou química dos ditos compostos. De acordo com o método desta invenção, os ditos dois compostos diferentes são, em um aspecto, o agente que se liga especificamente ao polipeptídeo da neurotoxina parcialmente processado ou não processado que são compreendidos pela solução. Contactar como aqui dito é realizado sob condições e por um tempo sendo suficiente para permitir a interação entre o agente e o polipeptídeo da neurotoxina parcialmente processado ou não processado. A dita interação deve resultar em ligação do polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado ou não processado com o agente através do qual um complexo antígeno-agente é formado. Conforme estabelecido em outros lugares aqui, a dita interação compreende vários tipos de ligação, tais como indiretas e diretas, medidas não reversíveis e reversíveis. Condições adequadas que permitam a interação específica do agente e da solução. Isto é bem conhecido para o técnico qualificado e a dita condição pode depender do agente e da solução a ser aplicada na forma determinada, sem mais delongas. Além disso, um tempo sendo suficiente para permitir a interação também pode ser determinado pelo técnico qualificado sem mais delongas. Condições para anticorpos como agentes são divulgadas nos exemplos que acompanham, abaixo.

[0044] Uma solução como aqui utilizada refere-se a qualquer sistema de solvente contendo polipeptídeo de neurotoxina e seus polipeptídeos de neurotoxina parcialmente processados e / ou não processados. O sistema de solventes adicionalmente compreende um solvente. Os solventes abrangidos, em vários aspectos da invenção, são água, sistemas de tampão aquoso, solventes orgânicos e líquidos iônicos. Em um aspecto da invenção, é um sistema solvente aquoso. Além disso, o sistema de solvente, além do polipeptídeo de neurotoxina e o solvente pode assim ainda incluir moléculas, incluindo polipeptídeos bacterianos adicionais.

[0045] O termo "agente" como usado neste documento refere- se a um composto que é capaz de se ligar especificamente a um polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado ou não processado. Compostos adequados compreendem polipeptídeos, peptídeos, anticorpos e moléculas químicas orgânicas. Em um aspecto da presente invenção, um agente é um polipeptídeo, peptídeo ou um anticorpo, conforme especificado neste documento. O dito agente em um aspecto da presente invenção, tem pelo menos um sítio de ligação para o polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado ou não processado. Em outro aspecto da invenção, o dito agente tem mais sítios de ligação para os anticorpos que são capazes de ligar especificamente o agente. No mesmo outro aspecto da invenção, o agente é o anticorpo da presente invenção, conforme especificado acima. Além disso, num outro aspecto, o agente pode incluir diferentes anticorpos da invenção. Por exemplo, é concebível que, como um agente no sentido da invenção, um anticorpo de acordo com a invenção que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado é usado em combinação com um anticorpo da invenção, que se liga especificamente ao polipeptídeo de neurotoxina não processado. Alternativamente, um agente no sentido da invenção pode compreender dois ou mais diferentes anticorpos da invenção, em que cada anticorpo se liga especificamente a um epítopo diferente presente no polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e não processado.

[0046] Em um aspecto do método da invenção, o agente é imobilizado em uma matriz, conforme estabelecido neste documento. Em outro aspecto, a imobilização é conseguida através da ligação covalente direta ou indireta do agente com a matriz.

[0047] O termo "ligação específica", tal como aqui utilizado refere-se a ligação do agente ao polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e / ou não processado sem qualquer reação cruzada com outras neurotoxinas, proteínas da célula hospedeira, ou ainda outros peptídeos, polipeptídeos, ou outros compostos. Ligação específica pode ser testada por várias técnicas bem conhecidas. A este respeito, é referido às definições feitas acima em conexão com o anticorpo da invenção que se aplicam mutatis mutandis.

[0048] O termo "complexo agente", como utilizado na presente invenção refere-se ao agente ligado ao polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado ou não processado. No entanto, o complexo pode, além disso, compreender moléculas adicionais. Em um aspecto da invenção, o complexo pode incluir moléculas que estabilizam o complexo ou que facilitam a purificação, por exemplo, permitindo a interação do complexo com as moléculas adicionais ou que facilitam a precipitação do complexo. Moléculas adicionais compostas pelo complexo, em um aspecto da invenção, compreendem anticorpos secundários que se ligam especificamente ao agente ou ao complexo como tal. Os ditos anticorpos secundários podem então também ser ligados por meio de anticorpos adicionais ou moléculas de interação, como veículos de polipeptídeo direta ou indiretamente. É preciso entender que o complexo também pode incluir ainda polipeptídeos bacterianos, ou outras moléculas compreendidas pela solução.

[0049] O termo "removendo" o complexo antígeno-agente como usado na presente invenção refere-se à separação do polipeptídeo de neurotoxina complexado parcialmente processado e do complexado não processado, da neurotoxina processada ativa contendo solução. Em um aspecto da invenção, a dita remoção é realizada por meio de cromatografia de afinidade, por exemplo, usando imunocontas, ou por imunoprecipitação.

[0050] Como consequência da remoção do polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado e do não processado, o método da presente invenção, em um aspecto, fornece o polipeptídeo de neurotoxina processado ativo na forma altamente pura. O termo "forma altamente pura" como aqui utilizado refere-se, em um aspecto, ao polipeptídeo de neurotoxina ativa processado livre de quantidades detectáveis de seu polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado ou não processado, e em outro aspecto, ao polipeptídeo de neurotoxina processado ativo livre de quantidades detectáveis de outras impurezas também. Em um aspecto, a quantidade detectável de neurotoxina parcialmente processada ou não processada é inferior a 2,5%, menos de 1% ou, em outro aspecto, menos de 0,1%. Em outro aspecto da presente invenção polipeptídeo de neurotoxina processado ativa tipo A, como referido aqui sob condições redutoras uma banda única detectável a 100 kDa, e uma banda única detectável em 50 kDa, mas nenhuma banda de 150 kDa onde os polipeptídeos de neurotoxina processados parcialmente ou não processados tipo A normalmente ocorrem quando analisados, por exemplo, por SDS- PAGE. É preciso entender que outras impurezas polipeptídicas podem ser determinadas também por SDS PAGE. Além disso, é preciso entender que outros sorotipos das neurotoxinas processadas ativas podem ser analisados, respectivamente.

[0051] O método da presente invenção, onde o dito polipeptídeo de neurotoxina é selecionado do grupo que consiste de: a) um polipeptídeo de neurotoxina BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT, e b) um polipeptídeo de neurotoxina tendo uma sequência de aminoácidos sendo pelo menos 40% idêntica à sequência de aminoácidos do polipeptídeo de neurotoxina de a)

[0052] O termo "neurotoxina" como usado na presente invenção refere-se à sorotipos antigenicamente diferentes de neurotoxinas botulínicas, ou seja BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, e Neurotoxina de Tétano (TeNT). Em um aspecto, o dito BoNT/A tem uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 17, BoNT/B tem uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 18, BoNT/C1 tem uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 19, BoNT/D tem uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 20, BoNT/E tem uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 21, BoNT/F tem uma sequência de aminoácidos como mostrado na SEQ ID NO: 22, BoNT/G tem uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 23, e TeNT tem uma sequência de aminoácidos, como mostrado na SEQ ID NO: 24.

[0053] Em outro aspecto do método da presente invenção, o dito polipeptídeo de neurotoxina é uma variante de qualquer um dos polipeptídeos de neurotoxina acima mencionados que têm uma sequência que compreende pelo menos uma substituição, adição e / ou exclusão de aminoácido, em relação a qualquer uma das SEQ ID NOs 17 a 24. Em outro aspecto, o dito polipeptídeo de neurotoxina variante tem uma sequência de aminoácidos sendo pelo menos 40% de sequência idêntica à sequência de aminoácidos de BoNT/A (SEQ ID NO: 17), BoNT/B (SEQ ID NO: 18), BoNT/C1 (SEQ ID NO: 19), BoNT/D (SEQ ID NO: 20), BoNT/E (SEQ ID NO: 21), BoNT/F (SEQ ID NO: 22), BoNT/G (SEQ ID NO: 23), ou TeNT (SEQ ID NO: 24). Em outro aspecto da invenção, o polipeptídeo de neurotoxina tem uma sequência de aminoácidos sendo pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou, pelo menos, 99% de sequência idêntica à sequência de aminoácidos de BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G ou TeNT.

[0054] O termo "idêntico" como aqui utilizado refere-se a identidade de sequência caracterizada como a determinação da identidade das sequências de aminoácidos onde as sequências são alinhadas de modo que a partida de ordem mais alta é obtida, e que pode ser calculada usando técnicas ou métodos publicados codificados em programas de computador como, por exemplo, BLASTP, BLASTN, FASTA, Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403. Os valores de identidade percentual são em um aspecto calculados sobre a sequência de aminoácido inteira. Uma série de programas baseados em uma variedade de algoritmos está disponível ao técnico qualificado para a comparação de diferentes sequências Neste contexto, os algoritmos de Needleman e Wunsch ou Smith e Waterman dão resultados particularmente confiáveis. Para realizar os alinhamentos de sequência, o programa PileUp (1987, J Mol Evolution 25, 351; Higgins 1989 CABIOS 5, 151) ou os programas Gap e BestFit (Needleman e Wunsch 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith e Waterman 1981, Adv Appl Math 2, 482), que fazem parte do pacote de software GCG (Genetics Computer Group 1991 , 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711), devem ser usados. Os valores de identidade de sequência recitados acima em porcentagem (%) são determinados, em um aspecto da invenção, usando o programa GAP sobre a região de sequência inteira com as seguintes definições: Peso de Gap: 50, Peso de Comprimento: 3, Média de Pares: 10,000 e Média de Incompatibilidades: 0,000, o que, salvo disposição em contrário, serão sempre usadas como configurações padrão para alinhamentos de sequência.

[0055] Será entendido que as variantes acima referidas, em um aspecto da invenção, mantêm as propriedades biológicas de neurotoxinas. Aqueles de habilidade na arte vão apreciar que a atividade biológica plena é alcançada apenas após a ativação proteolítica, embora seja possível que o precursor não processado possa exercer algumas funções biológicas ou ser parcialmente ativa. "Propriedades biológicas" como aqui utilizado refere-se a (a) ligação do receptor, (b) internalização, (c) translocação através da membrana endossomal no citosol, e / ou (d) clivagem endoproteolítica de proteínas envolvidas na fusão da membrana da vesícula sináptica. Em ensaios in vivo para avaliar a atividade biológica incluiram o ensaio LD50 de camundongo e o ensaio ex vivo de hemidiafragma de rato, como descrito por Pearce LB, GE Borodic, First ER, RD MacCallum (1994) (Measurement of botulinum toxin activity: evaluation of the lethality assay. Toxicol Appl Pharmacol 128: 69-77) e Dressler D, M Lange, Bigalke H (2005) (The mouse diaphragm assay for detection of antibodies against botulinum toxin type B. Mov Disord 20:16171619). A atividade biológica é comumente expressa em Unidades Mouse (MU). Como usado aqui, uma MU é a quantidade de componente neurotóxico, que mata 50% de uma população específica de rato após injeção intraperitoneal, ou seja, o rato de ip LD50 (Schantz & Kauter, 1978). Em outro aspecto, as variantes podem ser neurotoxinas tendo propriedades biológicas melhoradas ou alteradas, por exemplo, elas podem incluir sítios de clivagem, que são melhorados para o reconhecimento da enzima, ou podem ser melhorados para a ligação do receptor ou qualquer outra propriedade especificada acima. É concebível que o conceito da presente invenção conta com a presença de um, dois ou mais sítios de clivagem entre cadeia leve e pesada do polipeptídeo de neurotoxina, enquanto a natureza do sítio(s) de clivagem e a sequência de aminoácido em particular entre eles não importa, desde que o agente seja específico para o polipeptídeo de neurotoxina parcialmente processado ou não processado. Assim, é outro aspecto, para substituir os sítios de reconhecimento de protease e o peptídeo ligador entre a cadeia leve e pesada do polipeptídeo de neurotoxina ou sequências de flanqueamento em torno do sítio de clivagem (no caso de um sítio de clivagem único).

[0056] Em outro aspecto, o polipeptídeo de neurotoxina de acordo com o método da invenção pode ser uma molécula quimérica. Tal dita molécula quimérica, em um aspecto, pode ter domínios únicos substituídos. Assim, em outro aspecto, a parte da cadeia pesada da neurotoxina é substituída por uma parte de um domínio FC de um anticorpo.

[0057] Em um aspecto, o polipeptídeo de neurotoxina produzido de acordo com o método da presente invenção pode ser utilizado para ferramentas analíticas incluindo ELISA, antígenos para ELISA, e padrões de controle.

[0058] Para conseguir uma preparação de neurotoxina sendo livre de outras impurezas, bem como, etapas adicionais de purificação bem conhecidas na arte podem ser adicionadas ao referido método da presente invenção e será explicado a seguir.

[0059] Como decorre do acima em um aspecto do método da presente invenção, o dito método é realizado por meio de cromatografia de afinidade.

[0060] Em outro aspecto da invenção, o imunoabsorvente específico é preparado para a cromatografia de imunoafinidade como segue: - Síntese dos oligopeptídeos específicos (representados por qualquer uma das SEQ ID NOs: 1 a 16 ou 25) do polipeptídeo precursor não processado ou parcialmente processado em particular, preparação de um oligopeptídeo sintético; - Conjugação do peptídeo com um transportador adequado para imunização (incluindo hemocianina, BSA, lipopolisacarídeos, e outros), especificamente, a ligação do oligopeptídeo com um transportador polipeptídeo; - Imunização de animais para produzir anticorpos poli ou monoclonais em particular, imunização de coelhos ou cabras para produzir policlonais, e imunização de camundongos para produzir anticorpos monoclonais (pelo menos dez animais precisam ser imunizados, a fim de obter um anticorpo afim; - Linhagens celulares de hibridoma são geradas para produzir anticorpos monoclonais; - Purificação de anticorpos por cromatografia convencional e de afinidade (para este último o oligopeptídeo será ligado a um veículo), especificamente, os anticorpos são purificados usando, por exemplo, a Proteína A ou G e / ou através de oligopeptídeos ligados a um veículo (o último foi utilizado para a imunização) ou via cromatografia de afinidade de peptídeo para remoção de anticorpos inespecíficos seguido por cromatografia de afinidade; - A clivagem dos anticorpos específicos em fragmentos Fab em particular, os anticorpos específicos são tratados com uma protease, tais como Papaína, a fim de obter os respectivos fragmentos Fab; - Os fragmentos Fab são caracterizados pelas suas propriedades de ligação antes de outras aplicações; - Os anticorpos serão acoplados a uma matriz de coluna, como Sefarose ativada em particular, fragmentos Fab específicos são acoplados a um grupo de ligação ativa de um material de suporte; - Um imuno-absorvente (em uma coluna) é lavado e equilibrado utilizando um sistema tampão adequado; - O polipeptídeo de neurotoxina precursor não processado ou parcialmente processado é especificamente ligado ao imunoabsorvente enquanto o polipeptídeo de neurotoxina processado ativo, passa através da coluna inalterada (sem ser ligado a) e será coletado;

[0061] Em outro aspecto do método da invenção, cromatografia por exclusão de tamanho é realizada em adição. Por cromatografia de exclusão de tamanho, usada na presente invenção, as partículas são separadas com base em seu tamanho, ou seja, o seu volume hidrodinâmico. Uma fase móvel é ou uma solução aquosa utilizada para o transporte da amostra (cromatografia de filtração em gel), ou um solvente orgânico (cromatografia de permeação em gel). Uma fase estacionária é tanto um meio de gel (poliacrilamida, dextran ou agarose) e o filtro sob baixa pressão, ou uma de sílica, ou meio de poliestireno retrocruzado sob uma pressão mais elevada. Em outro mesmo aspecto, a dita cromatografia por exclusão de tamanho é realizada como cromatografia em coluna. Em outro aspecto do método da presente invenção, a dita cromatografia por exclusão de tamanho é realizada utilizando peneiras moleculares com diferentes tamanhos de poros, tais como carvão ativado, sílica gel, zeólita.

[0062] O método da presente invenção, em outro aspecto, ainda compreende cromatografia de troca iônica.

[0063] Cromatografia de troca iônica, como usado na presente invenção, separa as moléculas com base nas diferenças entre o custo total das proteínas e compostos relacionados. Ela é usada para purificação de proteínas, para a purificação de oligonucleotídeos, peptídeos ou outras moléculas carregadas. Tais moléculas podem estar presentes na solução a ser aplicada ao método de purificação como contaminantes. A proteína ou composto relacionado de interesse, no presente caso, a neurotoxina, deve ter uma carga oposta para que o grupo funcional ligado à resina se ligue. Porque esta interação é iônica, a ligação deve ocorrer sob condições iônicas baixas. Eluição é conseguida através do aumento da força iônica para quebrar a interação iônica, ou alterando o pH da proteína. Em um aspecto do método da invenção, a dita cromatografia de troca é realizada como cromatografia em coluna.

[0064] Em um aspecto, cromatografia de troca como utilizada de acordo com a presente invenção é cromatografia de troca iônica.

[0065] A cromatografia de troca iônica, como usada na presente invenção é de um outro aspecto realizada por cátions e / ou cromatografia aniônica. Em cromatografia de troca aniônica como aqui utilizada a carga da superfície dos solutos (proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, endotoxinas) que se ligam será negativa, para obter ligação de uma proteína específica deve-se estar perto ou acima do pI dessa proteína. Resinas de troca aniônica comumente usadas são Q-resina (Q Sefarose), uma amina quaternária e resina DEAE (DiEtilAminoEtano). Geralmente, uma resina de troca iônica é uma matriz insolúvel de pequenas contas com uma superfície carregada, usada como um zeólito artificial. Diferentes tipos de resinas podem ser distinguidos com base em seus grupos funcionais, incluindo resinas fortemente ácidas (grupos de ácido sulfônico, por exemplo. poliestireno sulfonato de sódio ou poliAMPS), resinas fortemente básicas, (grupos amino quaternário, grupos trimetilamônio por exemplo, PoliAPTAC), resinas fracamente ácidas (principalmente, grupos ácido carboxílicos), resinas fracamente básicas (primária, secundária e / ou grupos amino ternários, por exemplo, polietileno amina). Há também tipos especializados de resinas que podem ser ainda mais distinguíveis incluindo resinas quelantes (ácido iminodiacético, tiouréia).

[0066] Em cromatografia de troca catiônica como usado neste documento, a carga de superfície dos solutos (proteínas, peptídeos, ácidos nucléicos, endotoxinas) que se ligam será positiva, para assim obter ligação de uma proteína específica deve-se estar perto ou abaixo do pI da proteína. Resinas de troca catiônica comumente utilizadas são S-resina, derivados de sulfato, e resinas CM, íons derivados carboxilato.

[0067] Em um aspecto do método da presente invenção a dita cromatografia de troca iônica é realizada antes e / ou após a cromatografia de afinidade. Em outro aspecto do método da invenção, a dita cromatografia de troca iônica como aqui utilizada é realizada antes da cromatografia de afinidade da presente invenção.

[0068] Devido a esta medida, o risco de reatividade cruzada potencial ou ligação inespecífica durante a cromatografia de afinidade pode ser ainda mais evitado e reduzido.

[0069] O método da presente invenção permite a produção de neurotoxina processada ativa livre de polipeptídeo precursor não processado ou parcialmente processado e, assim, a obtenção de maiores quantidades do polipeptídeo de neurotoxina ativo processado.

[0070] A presente invenção refere-se, em princípio, ao uso do anticorpo da presente invenção para separar a neurotoxina ativa processada do seu estado polipeptídeo precursor não processado ou parcialmente processado. Em um aspecto, o anticorpo da presente invenção é utilizado para a separação do polipeptídeo de neurotoxina precursor não processado ou parcialmente processado do polipeptídeo de neurotoxina ativo processado, em solução contendo uma mistura dos ditos polipeptídeos, e, assim, obtendo o polipeptídeo de neurotoxina processado ativo livre de um polipeptídeo de neurotoxina precursor não processado ou parcialmente processado como descrito em detalhes neste documento.

[0071] A presente invenção também se refere a um método para a produção de um medicamento compreendendo as etapas do referido método e a etapa adicional de formular o polipeptídeo de neurotoxina proteoliticamente processado como medicamento.

[0072] O termo "medicamento" como aqui utilizado refere-se, em um aspecto, a uma composição farmacêutica contendo o polipeptídeo de neurotoxina biologicamente ativo (proteoliticamente processado) como composto ativo farmacêutico, em que a composição farmacêutica pode ser usada para o tratamento humano ou não-humano de várias doenças ou distúrbios em uma dose terapeuticamente eficaz.

[0073] Uma composição farmacêutica como aqui utilizada compreende o polipeptídeo de Neurotoxina biologicamente ativo (proteoliticamente processado) da presente invenção, em um aspecto, um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. A neurotoxina ativa pode estar presente em forma líquida ou liofilizada. Em um aspecto, o dito composto pode estar presente juntamente com glicerol, estabilizadores de proteínas (por exemplo, albumina sérica humana (HAS)) ou estabilizadores não-protéicos.

[0074] A composição farmacêutica é, em um aspecto, administrada por via tópica. Administração de medicamentos convencionalmente usados é administrado na forma intramuscular, subcutânea (perto de glândulas). No entanto, dependendo da natureza e do modo de ação de um composto a composição farmacêutica pode ser administrada também por outras vias.

[0075] O composto, ou seja, o polipeptídeo de neurotoxina biologicamente ativo (proteoliticamente processado) é o ingrediente ativo da composição, e é em um aspecto administrado nas formas de dosagens convencionais preparadas pela combinação da droga com veículos farmacêuticos padrão de acordo com procedimentos convencionais. Estes procedimentos podem envolver mistura, granulação e compressão, ou dissolução dos ingredientes conforme apropriado para a preparação desejada. Será apreciado que a forma e o caráter do veículo farmacêutico aceitável ou diluente são ditados pela quantidade de ingrediente ativo com o qual será combinado, a via de administração, e outras variáveis bem conhecidas.

[0076] O veículo (s) deve ser aceitável no sentido de ser compatível com os outros ingredientes da formulação e não ser prejudicial para o destinatário do mesmo. O veículo farmacêutico empregado pode incluir um sólido, um gel, ou um líquido. Exemplos de veículos sólidos são lactose, terra alba, sucrose, talco, gelatina, ágar, pectina, acácia, estearato de magnésio, ácido esteárico e similares. Exemplos de veículos líquidos são solução salina de tampão fosfato, xarope, óleo, água, emulsões, vários tipos de agentes umectantes, e assim por diante. Da mesma forma, o veículo ou diluente pode incluir material de atraso de tempo bem conhecido da arte, tais como mono estearato gliceril ou diestearato gliceril sozinho ou com uma cera. Os ditos veículos adequados compreendem os mencionados acima e outros bem conhecidos na arte, ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

[0077] O diluente (s) é / são selecionados de modo a não afetar a atividade biológica da combinação. Exemplos de tais diluentes são água destilada, soro fisiológico, soluções de Ringer, solução de dextrose, e solução de Hank. Além disso, a composição farmacêutica ou formulação pode também incluir outros veículos, adjuvantes, ou estabilizadores não-tóxicos, não-terapêuticos, não imunogênicos e similares.

[0078] Uma dose terapeuticamente eficaz refere-se a uma quantidade do composto a ser usado em uma composição farmacêutica da presente invenção que evita, melhora ou trata os sintomas que acompanham uma doença ou condição referida na presente especificação. Eficácia terapêutica e toxicidade do composto podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêuticos padrão em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população). A relação da dose entre efeitos terapêuticos e tóxicos é o índice terapêutico, e pode ser expressa como a razão, LD50/ED50.

[0079] O regime de dosagem será determinado pelo médico assistente e outros fatores clínicos. Como é bem conhecido nas artes médicas, dosagens para qualquer paciente depende de muitos fatores, incluindo o tamanho do paciente, área de superfície corporal, idade, o composto particular a ser administrado, sexo, tempo e via de administração, saúde geral, e outras drogas que estão sendo administradas concomitantemente. O progresso pode ser monitorado por avaliação periódica.

[0080] As composições farmacêuticas e formulações aqui referidas são administradas pelo menos uma vez, a fim de tratar ou amenizar ou prevenir uma doença ou condição recitada nesta especificação. No entanto, as ditas composições farmacêuticas podem ser administradas mais de uma vez.

[0081] Composições farmacêuticas específicas são preparadas de uma forma bem conhecida na arte farmacêutica e inclui pelo menos um composto ativo aqui referido acima em mistura ou não associado com um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente. Para fazer as composições farmacêuticas específicas, o composto(s) ativo será geralmente misturado com um veículo ou diluente. As formulações resultantes devem ser adaptadas ao modo de administração. Recomendações de dosagem devem ser indicadas nas prescrições ou instruções de usuários, a fim de antecipar os ajustes de dose, dependendo do destinatário considerado.

[0082] O medicamento de acordo com a presente invenção pode, em um outro aspecto da invenção compreender as drogas, além do polipeptídeo de neurotoxina biologicamente ativo (proteoliticamente processado) que é adicionado à composição farmacêutica durante sua formulação. Finalmente, é preciso entender que a formulação de uma composição farmacêutica ocorre sob condições padronizadas de GMP ou similares, a fim de garantir a qualidade, segurança farmacêutica e eficácia do medicamento.

[0083] A presente invenção, em geral, contempla uma composição compreendendo polipeptídeo de neurotoxina proteoliticamente processado obtido pelo método da presente invenção.

[0084] O termo "composição" refere-se a qualquer composição formulada na forma sólida, líquida, aerosol (ou gasosa). A dita composição compreende o composto da invenção, opcionalmente, em conjunto com compostos auxiliares adequados, tais como diluentes ou veículos ou outros ingredientes. Neste contexto, destaca-se a presente invenção entre compostos auxiliares, ou seja, compostos que não contribuem para os efeitos provocados pelo composto da presente invenção, o pedido da composição para o fim desejado, e outros ingredientes, ou seja, compostos que contribuem para um efeito adicional ou modulem o efeito do composto da presente invenção. Diluentes e / ou veículos apropriados dependem da finalidade para a qual a composição é para ser usada e os outros ingredientes. O técnico hábil na arte pode determinar tais diluentes adequados e / ou veículos, sem mais delongas. Exemplos de veículos adequados e / ou diluentes são divulgados neste documento.

[0085] Em outro aspecto da invenção, a composição acima é um medicamento, conforme especificado em outros lugares na descrição com mais detalhes. Em um aspecto o dito medicamento pode ser usado para a prevenção e / ou tratamento de pelo menos uma das seguintes doenças e distúrbios: força muscular voluntária, distonia focal, incluindo cervical, distonia cranial, e blefarospasmo essencial benigno, espasmo hemifacial e espasticidade focal, distúrbios gastrointestinais, hiperhidrose, e correção cosmética de rugas, em um outro aspecto também Blefarospasmo, distonia oromandibular, tipo de abertura da mandíbula, maxilar tipo de fechamento, bruxismo, síndrome de Meige, distonia lingual, apraxia da pálpebra, distonia cervical, antecollis, retrocolis, laterocolo, torcicolo, distonia faríngea, distonia laríngea, disfonia de coxa / tipo adutor, tipo de disfonia / abdutor espasmódica, dispnéia espasmódica, distonia de membro, distonia de braço, distonia de tarefa específica, cãibra nas mãos, cólicas, cãibras, distonia de perna, adução da coxa, flexão espasmódica de abdução do joelho, extensão do joelho, flexão de tornozelo, extensão do tornozelo, equinovarus, deformidade do pé, distonia, estriado, flexão do dedo do pé, extensão do dedo do pé, distonia axial, síndrome de pisa, distonia de dançarina do ventre, distonia segmentar, hemidistonia, distonia generalizada, distonia em lubag, distonia em degeneração corticobasal, distonia em lubag, distonia tardia, distonia em ataxia espinocerebelar, distonia na doença de Parkinson, distonia na doença de Huntington, distonia na doença de Hallervorden Spatz, discinesias dopa-induzidas / dopa induzida por distonia, discinesias tardia / distonia tardia, discinesias paroxísticas / distonias, ação cinesiogênicas ou não cinesiogênica induzida, mioclonia palatal, mioclonia mioquimia, rigidez, câimbras musculares benignas, tremor de queixo hereditário, atividade muscular paradoxal da mandíbula, espasmos hemimastigatórios, miopatia branquial hipertrófica, hipertrofia maseterica, hipertrofia tibial anterior, nistagmo, paralisia oscilopsia supranuclear do olhar, epilepsia, parcial contínua, planejamento da operação espasmódica, torcicolo, paralisia das cordas vocais abdutoras, disfonia mutacional recalcitante, disfunção do esfíncter superior do esôfago, granuloma de pregas vocais, gagueira de Gilles de Ia Tourette, síndrome mioclonia do ouvido médio, fechamento da laringe de proteção, postlaringectomia, fracasso de fala, ptose de proteção, disfunção de entrópio de esfíncter Odii, pseudoacalasia, nonacalsia, distúrbios motores do esôfago, vaginismo, tremor de imobilização pós-operatória, disfunção da bexiga, dissinergia do detrusor esfincteriano, espasmo do esfíncter da bexiga, espasmo hemifacial, discinesias reinervação, pés cosméticos, assimetrias faciais, covinhas mentalis, síndrome de pessoa dura, tétano, hiperplasia prostática, adipositas, tratamento de estrabismo, paralisia cerebral infantil, concomitante com paralisia mista, após cirurgia de descolamento de retina, após cirurgia de catarata, estrabismo em afacia miositica, estrabismo miopático, divergência vertical dissociada, como adjuvante da cirurgia de estrabismo, esotropia, exotropia, acalasia, fissuras anais, hiperatividade das glândulas exócrinas, Frey, síndrome Crocodile Tears, hiperidrose, axilar rinorréia, palmar plantar, hipersalivação relativa de AVE, em Parkinsosn, condições de esclerose lateral espástica em amiotrófica, na encefalite e processos de mielite auto-imunes, esclerose múltipla, mielite transversa, síndrome de Devic, infecções virais, infecções bacterianas, infecções parasitárias, infecções fúngicas, na síndrome pós-apoplética de paraparesia espástica, infarto, infarto cerebral, infarto do mielona, trauma do sistema nervoso central, lesões hemisféricas, lesões de tronco cerebral, lesão do mielona, na hemorragia do sistema nervoso central, hemorragia intracerebral, hemorragia subaracnóidea, hemorragia subdural, hemorragia interna, em neoplasias, os tumores hemisféricos, tumores do tronco cerebral, tumores de mielona. Para mais detalhes e sintomas ver, por exemplo, Jost 2007, Drogas 67 (5), 669 ou Dressler 2000 em Terapia Toxina Botulínica, Thieme Verlag, Stuttgart, New York.

[0086] Em outro aspecto da invenção, a composição é uma composição cosmética que pode ser formulada como descrito para uma composição farmacêutica acima. Para uma composição cosmética, de igual modo, prevê-se que o composto da presente invenção é utilizado em um aspecto na forma substancialmente pura. Composições cosméticas são, em outro aspecto, para serem aplicadas de forma intramuscular. Em um aspecto adicional da invenção, composições cosméticas compreendendo a neurotoxina podem ser formuladas como uma solução anti-rugas.

[0087] Todas as referências citadas nesta especificação são, assim, incorporadas por referência no que diz respeito ao todo conteúdo divulgado e o conteúdo divulgado especificamente mencionado nesta especificação. As figuras mostram:

[0088] Figura 1: Esquema da purificação cromatográfica convencional do polipeptídeo de neurotoxina.

[0089] Figura 2: Esquema da purificação cromatográfica do polipeptídeo de neurotoxina biologicamente ativo (proteoliticamente processado) e a separação de seu polipeptídeo precursor parcialmente processado ou não processado de acordo com a presente invenção.

[0090] Figura 3: Western blot usando um anticorpo que reconhece especificamente SEQ ID NO: 25, e que foi obtido pelo método da presente invenção. Tamanho das bandas está indicado em kDa. As linhagens individuais são explicadas nos Exemplos.

[0091] Os seguintes Exemplos ilustram a invenção e mostram, tudo o quanto possível, não é construído de forma a limitar o seu escopo. EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de Imunogênio e Anticorpos Geração de Imunogênios

[0092] 1. Imunogênio-Peptídeo Ligador I: O peptídeo com a sequência de NH2-TKSLDKGYNK-C-COOH foi gerado por um fornecedor externo e, em seguida acoplado pelo ligador GMBS à proteína transportadora KLH.

[0093] 2. Imunogênio-Peptídeo Ligador II: a) Ativação de ovalbumina; 2,18mg de sulfo-smcc (sulfosuccinimidil-4(N- maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato) foram dissolvidos em 50 ml de DMSO. Posteriormente, 2,5 ml de solução de ovalbumina contendo 7,5 mg / ml de ovalbumina (tampão: 5mM de sodiofosfato; 0,9% de NaCl) foram adicionados e a solução foi incubada por 1 h em temperatura ambiente com rotação. Uma troca de tampão foi realizada utilizando colunas PD10, ovalbumina ativada foi eluída em 3,5 ml de tampão contendo 10 mM de sodiofosfato; 0,9% de NaCl. b) acoplamento do peptídeo à ovalbumina; 8 mg do peptideo Ac-DKGYNC-OH foram dissolvidos em 250 ml de H2O e 2,5 ml a 500 mM de TCEP HCL (tris [2- carboxetil] fosfina HCL) e posteriormente neutralizado com 1 mM de NaOH. Finalmente, ovalbumina ativada foi adicionada e a mistura de reação foi incubada em temperatura ambiente por 4,4 h com rotação. Pela adição uma solução de 10 mM de cisteína restando resíduos reativos foi bloqueada por incubação por 1 h com rotação. Uma diálise foi realizada usando 10 mM de sodiofosfato, a 0,9% de NaCl. Imunização Anti-soros foram obtidos através da imunização.

[0094] 1) Peptídeo Anti-ligador ScBoNT / soro A I: Como imunogênio o imunogênio peptídeo ligador I foi usado, o qual foi acoplado pelo ligador GMBS à proteína transportadora KLH. Duas cabras foram imunizadas cada por via subcutânea primeiro com 300 mg de imunogênio decapeptídeo em adjuvante incompleto Freud'schem e, finalmente, imunizadas por quatro vezes em um ritmo de 2 semanas com 100 mg de imunogênio em adjuvante incompleto freud 'schem. Após 49, 63, 77 e 84 dias soros foram coletados. Cromatografia de afinidade foi realizada com o soro coletado do último sangramento no dia 84.

[0095] 2) Peptídeo Anti-ligador scBoNT / soro A II: Como o imunogênio o peptídeo ligador imunogênio II foi usado, o qual foi acoplado pelo ligador SMCC à proteína transportadora ovalbumina. Dois coelhos foram imunizados intradermicamente cada primeiro com 300 mg de peptídeo ligador imunogênio II em adjuvante de freud' schem e, finalmente, imunizados por cinco vezes em um ritmo de 2 semanas com 150 mg de peptídeo ligador imunogênio II em Montanide ISA 206. Cromatografia de afinidade foi realizada utilizando o soro coletado de sangramento no dia 60 ou 110, respectivamente. Duas etapas de cromatografia de afinidade dos soros

[0096] 1. Geração da matriz: Para as duas etapas de cromatografia de afinidade duas diferentes matrizes de ultra- ligação de iodoacetil contendo diferentes peptídeos foram geradas.

[0097] Por um lado, no sítio, os peptídeos reativos cruzados SLD, LDK e YNK foram apresentados na forma dos seguintes peptídeos Ac-ELDKYN-C-COOH (SEQ ID NO: 26), NH2- NISLDLC-COOH (SEQ ID NO: 27) e NH2-YYNKFC-COOH (SEQ ID NO: 28) e foram acopladas à matriz usando a descrição geral dada abaixo. Por outro lado, o peptídeo ligador (SEQ ID NO: 25) foi acoplado à matriz usando a descrição geral dada abaixo, na forma do seguinte derivado: Ac-TKSLDKGYNKA-C-COOH. Descrição geral:

[0098] Tampão de ligação: 50 mM de Tris, 5 mM de EDTA-Na, pH 8.5. Prepare um volume de tampão igual a 20 vezes o volume de Gel Iodoacil UltraLink ® a ser utilizado.

[0099] HCL L-Cisteína; solução de lavagem: 1 mM de cloreto de sódio (NaCl).

[0100] Vazio de fluxo por gravidade ou coluna de rotação que pode ser tampado na parte superior e inferior: Preparar o Peptídeo ou a Amostra de Proteína Dissolver o peptídeo com tampão de acoplamento. Dupla para Gel UltraLink® Iodoacil:

[0101] 1. Com a tampa inferior no lugar em uma coluna de fluxo por gravidade, adicione a quantidade desejada da pasta de Gel Iodoacil UltraLink®, deixe que o gel se acomode por 15 minutos.

[0102] 2. Drene o líquido da coluna empacotada e lave / equilibre o Gel Iodoacil UltraLink® com 5 volumes de cama de gel de tampão de acoplamento, adicionando tampão ao topo da cama de gel permitindo a drenagem através da coluna. Não permita que a cama de gel seque.

[0103] 3. Recoloque a tampa inferior e adicione a amostra preparada contendo sulfidrila.

[0104] Cerca de 1 ml de solução da amostra pode ser aplicado por ml de Gel Iodoacil UltraLink®.

[0105] 4. Recoloque a tampa superior e misture a coluna de RT por 15 minutos.

[0106] 5. Fixe a coluna ereta e incube à temperatura ambiente por 30 minutos sem misturar.

[0107] 6. Sequencialmente remova tampas e colunas superior e inferiores e permita que a solução drene.

[0108] 7. Lave a coluna com três volumes de cama de gel de tampão de acoplamento.

[0109] Sítios de Ligação Inespecíficos de Bloco em Gel.

[0110] 1. Recoloque a tampa inferior na coluna.

[0111] 2. Prepare uma solução de 50 mM de L-Cisteína HCL no tampão de acoplamento e adicione 1 ml desta solução na coluna para cada mililitro de gel.

[0112] 3. Recoloque a tampa superior e misture por 15 minutos em temperatura ambiente e, em seguida incube a reação sem misturar por mais 30 minutos em RT. 2. Duas etapas de cromatografia de afinidade:

[0113] Soros a serem purificados são primeiro separados do sangue.

[0114] O soro bruto é dado na primeira coluna que contém os tripeptídeos reativos cruzados. Os anticorpos reativos cruzados se ligam aos tripeptídeos e são separados a partir do soro cru. O filtrado desta primeira coluna é dado para a segunda coluna que contém o peptídeo ligador ligado. Os anticorpos específicos de peptídeo ligador se ligam ao peptídeo ligador. Anticorpos A/ antiligadores scBoNT de baixa afinidade são removidos da coluna por uma lavagem de alta estringência com tampão PBS (0,5 M NaCl). Posteriormente, a ligação de alta afinidade do peptídeo anti-ligador scBoNT / anticorpos A é eluída e concentrada. Este concentrado corresponde ao peptídeo anti-ligador scBoNT / soro A usado. Exemplo 2: Teste e verificação da especificidade do anticorpo Reagentes ELISA:

[0115] Tampão de revestimento: 0,005 M - 1M de Tris, 0,9% de NaCl, preferível 0,01 M - 0,2 M de Tris, 0,9% de NaCl, pH = 8,5.

[0116] Anticorpo de captura: peptídeo anti-ligador scBoNT / soro A.

[0117] Bloqueio e tampão diluente de anticorpo: 0,5% - 5% de BSA em 0,01 M de fosfato de sódio, 0,9% de NaCl, pH = 7,4.

[0118] Tampão de amostra: 0,5% - 5% de BSA em 0,005 M-1 M de fosfato de sódio; 0,1-0,5 M de NaCl; 0,01% - 1% de Tween 20, de preferência de 1% - 3% de BSA em 0,005-0,1 M de fosfato de sódio; 0,15 M - 0,4 M de NaCl; 0,05% - 0,5% de Tween 20, pH = 7,4.

[0119] Tampão de lavagem: 0,01 M de fosfato de sódio, 0,9% de NaCl; 0,05% de Tween 20, pH = 7,4.

[0120] Detecção de anticorpos: anticorpo monoclonal contra BoNT / A.

[0121] Anticorpo secundário: um anticorpo policlonal anti rato IgG (H & L) conjugado com peroxidase.

[0122] Substrato: TMB, comercialmente disponível. 2. Reagentes Western Blot:

[0123] Tampão desnaturante de amostra, comercialmente disponível.

[0124] Gel SDS, disponível comercialmente.

[0125] Tampão de corrida MES (SDS PAGE): disponível comercialmente.

[0126] Membrana PVDF: comercialmente disponível.

[0127] Tampão de Transferência (Western Blot): disponível comercialmente.

[0128] Amostra: Neurotoxina Botulínica A com BoNT di- cadeia/ A e scBoNT / A.

[0129] Anticorpo primário: peptídeo anti-ligador scBoNT / soro A.

[0130] Anticorpo secundário: anticorpo policlonal de burro de IgG anti cabra (H&L) conjugado com fosfatase alcalina.

[0131] Bloqueio e tampão diluente de anticorpo: 0,5% - 5% de BSA em 0,01 M - 0,1 M de Tris, 0,9% de NaCl; 0,05% - 5% de Tween 20, pH = 7,4.

[0132] Tampão de lavagem: 0,01 M - 0,1 M de Tris, 0,9% de NaCl; 0,05% - 5% de Tween 20, pH = 7,4.

[0133] Tampão Tris: 0,025 M de Tris, pH = 8.0.

[0134] Substrato: BCIP / NBT, comercialmente disponível.

[0135] a) Especificidade do anti-soro em relação à BoNT / B e BoNT / E: Para determinar a especificidade do anti-soro em relação à BoNT / B e BoNT / E a taxa de recuperação de substâncias foram analisadas em ELISA. Placas de microtitulação são incubadas com 100 m l / poço de tampão de revestimento contendo 0,5 mg de peptídeo anti-ligador scBoNT / soro A / ml por 16 h à temperatura ambiente e, posteriormente, lavadas três vezes com tampão de lavagem. 200 m l / poço de solução de bloqueio é adicionado às placas de microtitulação e incubado por 1 h em temperatura ambiente. O antígeno scBoNT / A (série de diluição em tampão de amostra; pg / ml de concentração) é usado como um padrão de calibração, placas de microtitulação são incubadas com 100 m l / poço de padrão de calibração. BoNT / B ou BoNT / E, respectivamente, são diluídos em tampão de amostra e aplicados sobre a placa de microtitulação em um volume de 100 ml / poço. Ambas as substâncias são aplicadas em excesso, uma diluição de 200 ng / ml é utilizada. Amostras e padrões são incubados por 2 horas a 37° C. Placas de microtitulação são lavadas três vezes com tampão de lavagem. 100 ml de tampão de detecção / poço são adicionados e incubados por 1 h em temperatura ambiente. Em seguida, placas de microtitulação são lavadas três vezes com tampão de lavagem. Posteriormente, a incubação com 100 ml / poço do anticorpo secundário por 1 hora a temperatura ambiente é realizada. Em seguida, placas de microtitulação são lavadas três vezes com tampão de lavagem.

[0136] A reação de detecção é iniciada pela adição de 100 ml de substrato / poço. Após a incubação por 30 minutos em temperatura ambiente a reação é parada pela adição de 50 m l de 2 MH 2 SO 4 / poço e a absorbância é determinada a 450 nm. Para a determinação da especificidade das concentrações de BoNT/b e BoNT/E são calculados pela normalização. Ao calcular a taxa de recuperação a especificidade dos peptídeos anti- ligadores scBoNT / A para sorotipos B e E pode ser determinada. Quanto menor a taxa de recuperação, menor reatividade de cruzamento e melhor a especificidade do soro em relação ao scBoNT / A.

[0137] b) Especificidade do peptídeo anti-ligador scBoNT / A em relação à BoNT di-cadeia / A: Para a determinação da especificidade do anti-soro em relação à BoNT di-cadeia ativada / A uma detecção imunohistológica por Western blotting é executada. Uma amostra NT (scBoNT / A de pelo menos 50 ng, BoNT di-cadeia/ A dependente da amostra utilizada) é separada em condições redutoras por SDS-PAGE, de acordo com seu peso molecular em scBoNT / A LC, e HC (BoNT di-cadeia/ A). As proteínas são então apagadas em uma membrana de PVDF. A membrana é bloqueada com 20 ml de tampão de bloqueio por 1 h em temperatura ambiente. O tampão de bloqueio é removido e 20 ml de solução de anticorpo primário contendo 0,005 mg / ml de peptídeo anti-ligador scBoNT / soro A são adicionados. O anticorpo primário é incubado durante a noite a 4° C. A solução contendo anticorpos é removida e a membrana é lavada três vezes, durante 30 minutos com 20 ml de tampão de lavagem a 37° C. Posteriormente, a membrana é incubada por 3 h à temperatura ambiente com 20 ml do anticorpo secundário em uma concentração de 0,4 mg / ml. A solução de anticorpo secundário é removida e a membrana é lavada três vezes, durante 30 minutos com 20 ml de tampão de lavagem a 37 ° C. Além disso, a membrana é lavada uma vez com 20 ml de um tampão TRIS 25 mM por 5 minutos em temperatura ambiente.

[0138] A reação de detecção é realizada através da adição do substrato. O substrato é incubado por 15 minutos e a reação de coloração é interrompida por adição de água. A especificidade é determinada pela coloração da banda scBoNT / A de 150 kDa. Especificidade do peptídeo anti-ligador foi determinada quando somente a banda específica de 150 kDa foi detectada, mas nenhuma banda específica para BoNT di-cadeia/ A a 100 kDa (HC) e 50 kDa (LC). A Fig. 3 mostra na linha 3, a especificidade para o scBoNT / A de 150 kDa de uma preparação BoNT / A (amostra NT, veja acima). Nenhuma banda é aparente a 100 kDa ou 50 kDa, apenas a scBoNT / A é reconhecida. Para comparação, na linha 4, uma mistura de scBoNT/ A parcialmente processado e não processado é mostrada e a linha 5 mostra um scBoNT/ A controle não-clivável. Controle de tampão é mostrado na linha 2.

Claims

1. Método para obter uma solução purificada de polipeptídeos de neurotoxina processados caracterizado por compreender as etapas de: a) contactar uma solução contendo uma mistura de polipeptídeo de neurotoxina processado e parcialmente processado e/ou não processado com um anticorpo que foi colocado em contato com um imunogênio peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25; b) permitir a ligação do anticorpo aos polipeptídeos de neurotoxina não processados e/ou parcialmente processados pelos quais complexos compreendendo o dito anticorpo e os polipeptídeos de neurotoxina parcialmente processados e/ou não processados são formados; c) remover os ditos complexos formados na etapa b) para obter uma solução de polipeptídeo de neurotoxina processado que é livre de polipeptídeo de neurotoxina não processado e/ou parcialmente processado; d) formular a solução de polipeptídeos de neurotoxina processados obtidos na etapa c) com pelo menos um estabilizador da neurotoxina di-cadeia ativa biologicamente selecionada a partir de estabilizadores de proteína e estabilizadores não- proteicos.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as etapas de a) a c) serem realizadas por meio de cromatografia de afinidade.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito método ainda compreender uma etapa de cromatografia de troca iônica.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito método ainda compreender formular a solução de polipeptídeos de neurotoxina processados obtida na etapa d) em adjuvantes, veículos e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis.