JP2012518018A - 高純度の神経毒素を製造するための手段および方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図2
Description
a)配列番号25に示されるアミノ酸配列を含むペプチド免疫原を用いて免疫された非ヒト動物由来のポリクローナル抗血清を、
配列番号25を有するペプチドと、
上記のペプチドと、プロセシングされていないもしくは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと特異的に結合する抗体とを含む複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ;
b)抗血清からステップa)で形成された複合体を取り出すステップ;ならびに
c)プロセシングされていないもしくは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと特異的に結合する抗体を複合体から放出させるステップ
を含んでいる。
i)配列番号25に示されるアミノ酸配列を含むペプチド免疫原を用いて免疫された非ヒト動物由来のポリクローナル抗血清を、
以下の捕捉ペプチドSLD、LDK、およびYNKと、
ポリクローナル抗血清に含まれる非特異的抗体および捕捉ペプチドを含む捕捉複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ;ならびに
ii)ポリクローナル抗血清から捕捉複合体を除去するステップ
を含む。
a)抗体が、配列番号25に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合するかどうかを決定するステップ;および
b)抗体が、次のアミノ酸配列SLD、LDK、およびYNKを有するペプチドと結合するかどうかを決定するステップ
を含んでいる、プロセシングされていないおよび/または部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと特異的に結合する抗体を同定する方法に関連し、ここで、配列番号25に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合するが、次のアミノ酸配列SLD、LDK、およびYNKを有するペプチドとは結合しない抗体が、プロセシングされていないおよび/または部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと特異的に結合する抗体として同定される。
a)タンパク質分解的にプロセシングされた神経毒素、部分的にプロセシングされたおよび/またはプロセシングされていない神経毒素ポリペプチドの混合物を含有する溶液を、プロセシングされていないもしくは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと特異的に結合するが、プロセシングされた神経毒素ポリペプチドとは結合しない物質と、その物質がプロセシングされていないもしくは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと結合することを可能にし、それによって物質‐複合体が形成される条件下で接触させるステップ、ならびに
b)ステップa)で形成された物質‐複合体を除去し、それによってプロセシングされていないもしくは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドを含まない、プロセシングされた神経毒素ポリペプチドを含有する溶液を得るステップ
を含む、神経毒素ポリペプチドの製造方法に関する。
a)神経毒素ポリペプチドBoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/GまたはTeNT、および
b)a)の神経毒素ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも40%同一のアミノ酸配列を有する神経毒素ポリペプチド
からなる群より選択される、本発明の方法。
−プロセシングされていないまたは部分的にプロセシングされた前駆体ポリペプチドの特異的オリゴペプチド(配列番号1〜16または25のいずれか1つによって表される)の合成、特に合成オリゴペプチドの調製;
−ペプチドの免疫付与に適した担体(ヘモシアニン、BSA、リポ多糖類、およびその他を含む)へのコンジュゲーション、具体的にはオリゴペプチドのポリペプチド担体への結合;
−ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を産生するための動物の免疫付与、特に、ポリクローナル抗体を産生するためのウサギもしくはヤギの免疫付与、およびモノクローナル抗体を産生するためのマウスの免疫付与(アフィン抗体(affine antibody)を得るために、少なくとも10匹の動物が免疫される必要がある);
−モノクローナル抗体を産生するために、ハイブリドーマ細胞株が作製される;
−標準的なクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーによる抗体の精製(後者ではオリゴペプチドは担体に結合される)、具体的には、抗体は、例えばプロテインAもしくはGを用いて、および/または担体に結合されたオリゴペプチドによって(後者は免疫付与に使用された)、あるいは非特異的抗体を除去するためのペプチドアフィニティークロマトグラフィーとそれに続くアフィニティークロマトグラフィーによって精製される;
−特異的抗体のFab断片への切断、特に、特異的抗体は、各Fab断片を得るためにパパインのようなプロテアーゼで処理される;
−Fab断片は、更なる適用の前にそれらの結合特性について解析される;
−抗体は、活性化セファロースなどのカラムマトリックスに結合され、特に、特異的Fab断片は、担体物質の活性連結基と結合される;
−(カラム中の)免疫吸収体(immuno-absorber)は、適切なバッファー系を用いて洗浄され、平衡化される;
−プロセシングされていないまたは部分的にプロセシングされた前駆体神経毒素ポリペプチドは免疫吸収体に特異的に結合するが、一方、活性のあるプロセシングされた神経毒素ポリペプチドは、変化せずに(結合することなく)カラムを通過し、回収される。
免疫原の作製
1. リンカーペプチド‐免疫原I:NH2-TKSLDKGYNK-C-COOHの配列を有するペプチドを外部の提供業者に作製させ、その後、リンカーGMBSによって担体タンパク質KLHと結合させた。
免疫付与により抗血清を得た。
1.マトリックスの作製:二段階アフィニティークロマトグラフィーのために、異なるペプチドを含有している2つの異なるultra linkヨードアセチルマトリックスを作製した。
カップリングバッファー:50 mM Tris、5 mM EDTA-Na、pH 8.5。使用されるUltraLink(登録商標)ヨードアシルゲルの20倍容に相当する量のバッファーを調製する。
L-システインHCL;洗浄液:1 mM塩化ナトリウム(NaCl)。
上部と下部の両方に蓋をしうる空の重力流カラムまたはスピンカラム。
ペプチドをカップリングバッファーに溶解する。
1. 重力流カラムの下部に蓋をして、目的とする量のUltraLink(登録商標)ヨードアシルゲルスラリーを加え、ゲルを15分間安定させる。
2. 充填したカラムから液を流出させ、ゲルベッドの5倍容量のカップリングバッファーを用いて、バッファーをゲルベッドの上部に添加し、カラムを通して流出させることによって、UltraLink(登録商標)ヨードアシルゲルを洗浄/平衡化する。ゲルベッドを干上がらせてはならない。
3. 下部の蓋をして、用意したスルフヒドリル含有サンプルを添加する。1 mlのUltraLink(登録商標)ヨードアシルゲルあたり、約1 mlのサンプル溶液が使用できる。
4. 上部の蓋をして、カラムを室温で15分間混合する。
5. カラムを直立させ、室温で30分間混合せずにインキュベートする。
6. 続いて上部と下部のカラムの蓋を取り、液を流出させる。
7. ゲルベッドの3倍容量のカップリングバッファーを用いて、カラムを洗浄する。
1. カラムの下部に蓋をする。
2. カップリングバッファー中50 mM L-システイン HCLの溶液を調製し、ゲル1 mlに対して1 mlのこの溶液をカラムに加える。
3. 上部の蓋をして、室温で15分間混合し、その後、混合せずに更に30分間室温でその反応をインキュベートする。
精製されるべき血清を、まず血液から分離する。
1. ELISA試薬:
コーティングバッファー:0.005 M〜1M Tris;0.9 % NaCl、好ましくは0.01 M〜0.2 M Tris;0.9% NaCl、pH=8.5。
捕捉抗体:抗リンカーペプチドscBoNT/A血清。
ブロッキングおよび抗体希釈バッファー:0.01 Mリン酸ナトリウム中0.5%〜5% BSA;0.9% NaCl、pH=7.4。
サンプルバッファー:0.005 M〜1 Mリン酸ナトリウム中0.5%〜5% BSA;0.1〜0.5 M NaCl;0.01%〜1% Tween 20、好ましくは0.005〜0.1 Mリン酸ナトリウム中1%〜3% BSA;0.15 M〜0.4 M NaCl;0.05%〜0.5% Tween 20、pH=7.4。
洗浄バッファー:0.01 Mリン酸ナトリウム;0.9% NaCl;0.05% Tween 20、pH=7.4。
検出抗体:BoNT/Aに対するモノクローナル抗体。
二次抗体:ペルオキシダーゼとコンジュゲートしたポリクローナル抗マウスIgG(HおよびL)抗体。
基質:市販のTMB。
市販の変性サンプルバッファー。
市販のSDSゲル。
MES泳動バッファー(SDS PAGE):市販。
PVDF膜:市販。
転写バッファー(ウェスタンブロット):市販。
サンプル:二本鎖BoNT/AおよびscBoNT/Aを含むボツリヌス神経毒素A。
一次抗体:抗リンカーペプチドscBoNT/A血清。
二次抗体:アルカリホスファターゼとコンジュゲートしたポリクローナルロバ抗ヤギ抗体IgG(H&L)。
ブロッキングおよび抗体希釈バッファー:0.01 M〜0.1 M Tris中0.5%〜5% BSA;0.9% NaCl;0.05%〜5% Tween 20、pH=7.4。
洗浄バッファー:0.01 M〜0.1 M Tris;0.9% NaCl;0.05%〜5% Tween 20、pH=7.4。
Trisバッファー:0.025 M Tris、pH=8.0。
基質:市販のBCIP/NBT。
Claims (20)
- 配列番号1〜16のいずれか1つに示されるアミノ酸配列を有するペプチドからなるエピトープと特異的に結合する抗体。
- モノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項1に記載の抗体。
- 前記エピトープがタンパク質分解的にプロセシングされていないまたは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドに含まれることを特徴とする、請求項1に記載の抗体。
- 前記神経毒素ポリペプチドがクロストリジウム属(Clostridium spp.)由来である、請求項3に記載の抗体。
- プロセシングされていないおよび/または部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと特異的に結合する抗体の製造方法であって、
a)配列番号25に示されるアミノ酸配列を含むペプチド免疫原を用いて免疫された非ヒト動物由来のポリクローナル抗血清を、
配列番号25を有するペプチドと、
上記のペプチドおよびプロセシングされていないもしくは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと特異的に結合する抗体を含む複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ;
b)ステップa)で形成された複合体を抗血清から除去するステップ;ならびに
c)プロセシングされていないもしくは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと特異的に結合する抗体を前記複合体から放出させるステップ
を含む、上記方法。 - 前記方法が更に、ステップa)の前に、
i)配列番号25に示されるアミノ酸配列を含むペプチド免疫原を用いて免疫された非ヒト動物由来の前記ポリクローナル抗血清を、
以下の捕捉ペプチドSLD、LDK、およびYNKと、
ポリクローナル抗血清に含まれる非特異的抗体および捕捉ペプチドを含む捕捉複合体の形成を可能にする条件下で接触させるステップ;ならびに
ii)捕捉複合体をポリクローナル抗血清から除去するステップ
を含む、請求項5に記載の方法。 - 前記免疫原が更にKLHを含む、請求項5または6に記載の方法。
- 前記KLHが、リンカーN- [γ-マレイミドブチリルオキシ] スクシンイミドエステル(GMBS)を介して配列番号25を有するペプチドに連結している、請求項7に記載の方法。
- ステップa)〜c)がアフィニティークロマトグラフィーによって行われる、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法。
- ステップi)およびii)がアフィニティークロマトグラフィーによって行われる、請求項6〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項5〜10のいずれか1項に記載の方法によって得られる抗体。
- ポリクローナル抗体である、請求項11に記載の抗体。
- 前記抗体が固相支持体と結合している、請求項1〜4、11または12のいずれか1項に記載の抗体。
- プロセシングされた神経毒素ポリペプチドから、部分的にプロセシングされたおよび/もしくはプロセシングされていない神経毒素ポリペプチドを除去するための、請求項1〜4または11〜13のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- サンプル中の部分的にプロセシングされたおよび/もしくはプロセシングされていないボツリヌス神経毒素A型(BoNT/A)を検出するための、請求項1〜4または11〜13のいずれか1項に記載の抗体の使用。
- プロセシングされた神経毒素ポリペプチドの製造方法であって、
a)プロセシングされたおよび部分的にプロセシングされたおよび/またはプロセシングされていない神経毒素ポリペプチドの混合物を含有する溶液を、請求項1〜4または11〜13のいずれか1項に記載の抗体と、該抗体がプロセシングされていないおよび/または部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドと結合することを可能にし、それによって該抗体および部分的にプロセシングされたまたはプロセシングされていない神経毒素ポリペプチドを含む複合体が形成される条件下で接触させるステップ、ならびに
b)ステップa)で形成された前記複合体を除去し、それによってプロセシングされていないおよび/または部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドを含まない、プロセシングされた神経毒素ポリペプチドを含有する溶液を得るステップ
を含む、上記方法。 - ステップa)およびb)がアフィニティークロマトグラフィーによって行われる、請求項16に記載の方法。
- 前記方法が更にイオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項16または17に記載の方法。
- 請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法のステップ、およびプロセシングされていないまたは部分的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドを含まない、プロセシングされた神経毒素ポリペプチドを含有する前記溶液を医薬として製剤化する更なるステップを含む、医薬の製造方法。
- 請求項16〜18のいずれか1項に記載の方法によって得られる、タンパク質分解的にプロセシングされた神経毒素ポリペプチドを含有する組成物。
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