CN111621525A - Stx1b基因在促进人脂肪间充质干细胞生长和分化中的用途 - Google Patents

Stx1b基因在促进人脂肪间充质干细胞生长和分化中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及STX1B基因在促进人脂肪间充质干细胞生长和分化中的用途。其中将STX1B基因在脂肪干细胞中过表达后，其神经细胞的诱导效率以及诱导后的神经细胞的增殖速度都得到了显著的提高，神经细胞鉴定也具有较好的效果。

Description

STX1B基因在促进人脂肪间充质干细胞生长和分化中的用途
技术领域
本发明涉及干细胞领域，具体的涉及STX1B基因在促进人脂肪间充质干细胞生长和分化中的用途。
背景技术
随着分子生物学理论和技术的发展与成熟，应用组织工程的方法来修复组织缺损已成为国内外学者广泛认同的发展方向，其中种子细胞的选择是组织工程学的前提和关键。脂肪间充质干细胞于2001年被发现，为近年来研究颇为迅速的一种成体干细胞，来源于中胚层，实验证明其具有向骨、软骨、神经元、肌腱、脂肪等方向分化的潜能，其体内含量较大，倍增速度快，原代取材对机体损伤小，正逐步取代对机体创伤较大的骨髓来源的间充质干细胞，有望成为组织工程中理想的种子细胞。脂肪干细胞具有取材容易，可以简单的抽脂法获得，而且供应充足，能反复取材，损伤较小，也不会引起道德争论。通过抽脂法获取干细胞的过程，还可以同时对肥胖症有一定的治疗作用，也可达到美容健身的目的；另外，脂肪干细胞增殖快速，因此是优秀的组织工程的种子细胞之一，配合相适应的三维生物材料，有望在骨组织工程，脂肪组织工程，软骨、肌肉的损伤修复，整形外科等方面的研究和治疗上得以广泛应用。
近年来，随着干细胞生物学的发展和对成人神经发生的分子机制的研究，细胞替代疗法由于它拥有能够治愈神经退行性疾病的潜力引起了研究人员的重视。脂肪间充质干细胞在体内储量丰富、获取方便，已成为干细胞治疗神经退行性疾病的研究热点。
ADSCs朝向神经方向分化，常用的方法包括:(1)神经诱导培养基培养；(2)共培养；(3)基因转染；(4)电刺激。神经诱导培养基诱导培养是采用直接诱导分化或分步诱导分化法，即ADSCs先转分化为神经干细胞(neural stem cells，NSCs)，再朝向神经细胞分化。在培养基中添加生长因子运用得较为广泛，也有添加激素类蛋白、小分子化合物等。Razavi等首先将人ADSCs诱导成神经营养因子分泌细胞，再将其制成细胞微胶囊与人ADSCs诱导成的神经球以1∶1的比例共培养，最终诱导成的细胞表达的MAP2和nestin明显升高，而GFAP下降，表明将人ADSCs和神经营养因子分泌细胞共培养促进了朝向神经元的分化，这种促进作用是通过分泌神经营养因子分泌细胞分泌BDNF、神经营养因子(nerve growth factor，NGF)、睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)等产生。除了在神经培养基中添加各类细胞因子、激素、小分子化合物，或是ADSCs与有分泌功能的细胞共培养促进神经方向的分化外，科研人员还采用基因转染技术，将BDNF和神经营养因子-3(neurotrophin-3)经由慢病毒转入SD大鼠的脂肪间充质干细胞，再经由神经培养基诱导，其表达的NSE基因量有所增加。
CN105567637A公开了将人源脂肪干细胞，采用SHH和RA共同诱导分化为运动神经元细胞，用特异神经细胞标记蛋白表征获得的所述运动神经元细胞；所述特异神经细胞标记蛋白为HB9和Oligo2；同时，利用电生理功能鉴定获得的所述运动神经元细胞。
然而尽管脂肪间充质干细胞朝向神经方向的诱导方式各样，方法众多，但是仍有进一步改进的空间。
发明内容
本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种改进的促进脂肪间充质干细胞向神经细胞分化的方法。
更进一步的，本发明提供一种鉴定差异基因的方法，本发明通过分析脂肪间充质干细胞在向神经细胞诱导前后的表达差异，筛选获得了二个具有较大差异的基因，推测二个基因具有促进干细胞向神经细胞分化或者增殖的作用。
本发明的另外一个目的，提供一种脂肪间充质干细胞的分离方法。
具体的，所述分离方法包括本领域常规的分离方法。
更进一步的，本发明的脂肪间充质干细胞的分离培养方法为，取脂肪组织约300mg，用含200U/mL青霉素、200mg/L链霉素的PBS反复清洗，眼科剪剪碎至糊状，移入培养瓶，加入3倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，37℃恒温水浴锅内振荡消化70min，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的胶原酶层。1500r/min离心15min，弃上清，加完全培养液(含体积分数为10％胎牛血清、100×双抗的HG-DMEM培养基)吹打细胞沉淀，200目细胞筛过滤，于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度条件下培养。24h后首次换液，生长至80％融合时，用1∶1混合的胰蛋白酶与EDTA消化传代，将获得的脂肪间充质干细胞体外持续传代培养。
更进一步的，本发明提供了STX1B基因在促进脂肪间充质干细胞分化为神经细胞中的用途。
更进一步的，提供一种诱导脂肪间充质干细胞分化为神经细胞的方法，具体的，向脂肪间充质干细胞加人神经诱导液：10ug/L EGF、20ug/L bFGF和10ug/L BDNF，3d后加入神经诱导剂：120umol/L吲哚美辛、3mg/L胰岛素、300umo1/LIBMX。
本发明还提供一种转基因的脂肪间充质干细胞。
具体的，转基因脂肪间充质干细胞的制备方法为，根据STX1B基因的序列，设计了上下游引物。用TRIzol法提取脂肪间充质干细胞RNA，反转录生成cDNA；以cDNA为模板，PCR扩增。经PCR扩增后获得的基因产物，经琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段和pLVX—IRES—ZsGreenl空载体分别经双酶切后，应用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。将回收的目的片段和载体混合，用DNA连接酶连接过夜；随后用该体系转化Top10大肠杆菌，提取质粒经经酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒用于细胞转染。慢病毒包装：提前将293FT细胞接种到5cm培养板中，于5ml含10％FBS的DMEM培养基，5％CO2,37℃条件下培养，待细胞汇合度达到约80％时，进行转染。将前述制备的重组慢病毒质粒5ug、pCMV-VSVG7ug、pCMVΔ8.917ug，三质粒共转染后约12h更换培养液，继续培养72h。转染完成后，收集富含慢病毒的细胞上清液，0.45μm滤膜去除细胞后，采用浓缩试剂盒进行浓缩。将长势良好、形态均一的BMSCs，以细胞密度为1x105/孔接种到24孔板。37℃,5％CO2培养箱孵育过夜，利用前述合成的慢病毒以MOI值为100进行病毒感染感染BMSCs，2h后，补加250uL含10％FBS正常培养基，于5％CO2培养箱培养；病毒感染细胞12h后弃除培养基，每孔再加入500uLIMDM培养基。病毒感染96h后，筛选阳性的转基因细胞，培养备用。
更进一步的，提供一种诱导转基因的脂肪间充质干细胞分化为神经细胞的方法，具体的，向转基因的脂肪间充质干细胞加人神经诱导液：l0ug/L EGF、20ug/L bFGF和10ug/L BDNF，3d后加入神经诱导剂：120umol/L吲哚美辛、3mg/L胰岛素、300umo1/LIBMX。
一种神经细胞，由上述诱导脂肪间充质干细胞分化的方法制备得到的。
本发明的有益效果
本发明通过分析脂肪间充质干细胞在向神经细胞诱导前后的表达差异，筛选获得了二个具有较大差异的基因，推测二个基因具有促进干细胞向神经细胞分化或者增殖的作用。其中将STX1B基因在脂肪干细胞中过表达后，其神经细胞的诱导效率以及诱导后的神经细胞的增殖速度都得到了显著的提高，神经细胞鉴定也具有较好的效果。
附图说明
图1细胞增殖活性图
图2是蛋白表达量检测图
图3全细胞膜片钳检测细胞静息电位图
具体实施方式：
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明做出一些非本质的改进和调整。
实施例1脂肪间充质干细胞的分离培养
取脂肪组织约300mg，用含200U/mL青霉素、200mg/L链霉素的PBS反复清洗，眼科剪剪碎至糊状，移入培养瓶，加入3倍体积的0.1％Ⅰ型胶原酶，37℃恒温水浴锅内振荡消化70min，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的胶原酶层。1500r/min离心15min，弃上清，加完全培养液(含体积分数为10％胎牛血清、100×双抗的HG-DMEM培养基)吹打细胞沉淀，200目细胞筛过滤，于37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度条件下培养。24h后首次换液，生长至80％融合时，用1∶1混合的胰蛋白酶与EDTA消化传代，将获得的脂肪间充质干细胞体外持续传代培养。取生长状态良好的第4代脂肪间充质干细胞，PBS洗4次(1500r/min离心15min)，调整细胞密度为1×109/L，吸取荧光标记的单克隆抗体5μL(鼠抗人CD13-FITC，CD34-PE，CD44-FITC，CD59-PE，HLA-DR-FITC标记的单克隆抗体)，加入细胞悬液100μL，混匀后室温避光孵育15min，加PBS 500μL重悬，同时设立空白对照。上机检测，cell Quest软件分析。流式细胞仪检测结果显示，第4代脂肪间充质干细胞表面标志CD13，CD44，CD59均呈阳性表达，阳性率分别为94.5％，99.9％，99.3％；而造血干细胞表面标志CD34(3.51％)及成纤维细胞表面标志LA-DR(3.17％)均呈阴性表达。表明培养到第4代的的脂肪间充质干细胞即为可备后续实验使用的脂肪间充质干细胞，调整细胞浓度为1×107/L备用。
实施例2脂肪间充质干细胞向神经细胞诱导实验
第3代脂肪干细胞铺满80％时，弃掉完全培养基，对照组继续加入完全培养基，实验组采用的诱导方法为：加人神经诱导液：l0ug/L EGF、20ug/L bFGF和10ug/L BDNF，3d后加入神经诱导剂：120umol/L吲哚美辛、3mg/L胰岛素、300umo1/LIBMX。加入神经诱导剂48h后，观察到ADSCs分化成神经细胞，弃去6孔板中的液体，PBS洗2次，每次5min。加入同定透化剂(甲醇：丙酮＝1：1)，30min后用PBS洗3次，每次5min。然后加入抗GFAP一抗(按1：50稀释)，抗β-tubulin III一抗(按1：50稀释)，对照组加入等量的PBS，4℃孵育过夜，加入羊抗人FITC二抗(按1：100稀释)37℃避光孵育l h，用PBS洗3次。最后加入DAPI染色液，室温5min，PBS洗3次，每次5min。荧光显微镜下观察。样本免疫荧光染色后在低倍镜下随机观察5个不同视野，计数每个视野内50个细胞中GFAP、β-tubulin III阳性细胞数，用图像分析系统进行分析，结果如表1所示。
表1 GFAP、β-tubulin III阳性细胞率(％)
GFAP β-tubulin III
神经细胞诱导 73.27±5.1 66.29±4.3
选择阳性的细胞备用。
实施例3生物信息学分析筛选神经细胞相关基因
申请人将人脂肪间充质干细胞向神经细胞分化前以及实施例2诱导后获得的细胞进行表达谱分析，首先获得了原始基因的表达值，通过R软件分析数据，最后的数据用limma函数包分析得到分化前后的差异表达基因，确定的差异分析条件为基因的表达倍数大于1倍，且FDR小玉0.01。通过分析最后筛选得到受分化调节剂诱导差异表达最显著的基因2个，具体如表1所示。
表1差异表达基因
基因 倍数改变
Homosapiensnudixhydrolase12(NUDT12) 3.271
Homo sapiens syntaxin 1B(STX1B) 4.023
根据这两个差异基因的变化情况，初步确定，这二个基因对于神经细胞的增殖以及诱导分化应当具有积极的促进作用。
实施例4STX1B转染人脂肪间充质干细胞
根据STX1B基因的序列，设计了上下游引物。分别是
上游引物：5’-atgaaggatcggactcaaga-3’；
下游引物：5’-cctacaagcccagcgtcccc-3’。
用TRIzol法提取脂肪间充质干细胞RNA，反转录生成cDNA；以cDNA为模板，。
PCR反应条件：
98℃5min；98℃12S、63℃40S、72℃1min，30个循环；72℃延伸10min。经PCR扩增后获得的基因产物，经琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段和pLVX—IRES—ZsGreenl空载体分别经双酶切后，应用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。将回收的目的片段和载体以6：1的比例混合，用DNA连接酶于4℃连接过夜；随后用该体系转化Top10大肠杆菌，在氨苄抗性选择的LB琼脂平板上筛选克隆，挑取阳性克隆，LB小摇过夜，应用小提试剂盒抽取质粒；再经酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒用于细胞转染。
慢病毒包装：提前将293FT细胞接种到5cm培养板中，于5ml含10％FBS的DMEM培养基，5％CO2,37℃条件下培养，待细胞汇合度达到约80％时，进行转染。将前述制备的重组慢病毒质粒5ug、pCMV-VSVG 7ug、pCMVΔ8.917ug，三质粒共转染后约12h更换培养液，继续培养72h。转染完成后，收集富含慢病毒的细胞上清液，0.45μm滤膜去除细胞后，采用浓缩试剂盒进行浓缩。基因组Q-PCR方式测定病毒滴度。病毒滴度测定结果如下，pLVX—IRES—ZsGreenl-STX1B该病毒测定滴度为1.42X1011TU/ml。
将前述制备的长势良好、形态均一的P3代脂肪间充质干细胞BMSCs，以细胞密度为1x105/孔接种到24孔板。37℃,5％CO2培养箱孵育过夜，利用前述合成的慢病毒以MOI值为100进行病毒感染BMSCs，2h后，补加250uL含10％FBS正常培养基，于5％CO2培养箱培养；病毒感染细胞12h后弃除培养基，每孔再加入500uLIMDM培养基。病毒感染96h后，在荧光显微镜下对转染后的细胞进行观察，拍照分析细胞感染的效率为72.53％，筛选阳性的转基因细胞，培养备用。
实施例5转基因脂肪间充质干细胞向神经细胞诱导实验
将实施例3制备的转基因脂肪干细胞以及对照第3代脂肪干细胞分别培养待铺满80％时，弃掉完全培养基，加人神经诱导液：l0ug/L EGF、20ug/L bFGF和10ug/L BDNF，3d后加入神经诱导剂：120umol/L吲哚美辛、3mg/L胰岛素、300umo1/LIBMX。加入神经诱导剂48h后，弃去6孔板中的液体，PBS洗2次，每次5min。加入同定透化剂(甲醇：丙酮＝1：1)，30min后用PBS洗3次，每次5min。然后加入抗GFAP一抗(按1：50稀释)，抗β-tubulin III一抗(按1：50稀释)，对照组加入等量的PBS，4℃孵育过夜，加入羊抗人FITC二抗(按1：100稀释)37℃避光孵育l h，用PBS洗3次。最后加入DAPI染色液，室温5min，PBS洗3次，每次5min。荧光显微镜下观察。样本免疫荧光染色后在低倍镜下随机观察5个不同视野，计数每个视野内50个细胞中GFAP、β-tubulin III阳性细胞数，用图像分析系统进行分析，结果如表1所示。
表1 GFAP、β-tubulin III阳性细胞率(％)
Figure BDA0002544830300000071
Figure BDA0002544830300000081
从结果可以看出，转基因的脂肪间充质肝细胞具有比未转基因的脂肪间充质干细胞具有显著的GFAP、β-tubulin III阳性细胞率，这充分说明，该转基因脂肪间充质干细胞具有更好的向神经细胞分化的作用。
实施例6MTT法检测分化后神经细胞增殖活性
1、将实施例4分化获得的神经细胞培养传代3代后(对照为未转基因的脂肪干间充质干细胞采用同样的诱导方法诱导得到的神经细胞)，0.25％胰蛋白酶消化，培养基重悬后计数，稀释细胞悬液，按每孔调整浓度控制在104/ml；
2、按每孔150μl将细胞接种至96孔板，复设5个平行孔；
3、分别于转染1～6天时，弃掉各孔培养基，加入MTT培养液100μl(0.5mg/ml)继续培养5h。弃去MTT培养液，每孔加入150μl DMSO溶解MTT还原物，摇床上震荡10min，使结晶物充分溶解，酶联免疫仪检测490nm处吸光度值；
4、统计每天的细胞吸光度值，得到的数值用曲线图表示。
5、结果
结果如图1所示，与对照相比，转基因组的神经细胞增殖速度显著增加，提示增加STX1B基因的表达水平可以改变分化后神经细胞的增殖能力，具有较好的促进作用。
实施例7Western blotting检测STX1B过表达
收集实施例4诱导后的转基因脂肪干细胞细胞，吸弃培养液，用预冷的PBS轻洗2遍，加入预冷的含有蛋白酶抑制剂PMSF的细胞裂解液RIPA，冰浴5～10min后刮取细胞至离心管，冰上超声2min，12000×g离心后取上清，分光光度计进行蛋白浓度定量，分别取8ug蛋白样品进行10％SDS-PAGE电泳并湿转至PVDF膜，5％脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，用抗STX1B单克隆抗体(1:1000)4℃孵育过夜，TBST洗膜3次后，以羊抗兔二抗(1:5000)孵育1h，TBST洗膜3次后，ECL化学发光显色，Tanon 4600全自动化学发光图像分析系统扫描并分析结果，从图2可以看出，相对于actin蛋白来说，转基因的神经细胞中的STX1B蛋白得到了高表达，表达量约提高380％，具有较好的提高效果。
实施例8MSCs诱导后神经细胞的功能检测
全细胞膜片钳检测细胞静息电位：分化的神经细胞组选取折光性强、带有两个或多个长突起、胞体较圆的神经样细胞进行实验。微电极外径1.2mm、内径0.5mm，冲灌电极内液。电阻为2～5M，采样频率10kHz，低通滤波为1kHz。采用高阻抗封接技术，负压打孔，形成细胞钳制。用AXOPATCH 200B放大器常法进行全细胞记录。对照组脂肪间充质干细胞静息膜电位为-11.00±2.23mV，经诱导后所得神经细胞静息膜电位明显增高，为-29.48±3.55mV(p<0.05)，提示此神经细胞有电生理的功能。而转基因脂肪干细胞经过诱导后获得的神经细胞较无转基因的诱导的神经元样细胞有更大负值膜电位-37.99±1.08(p<0.05)(见图3)。结果证实转基因的脂肪间充质干细胞诱导后得到的神经细胞在功能上具有更大优势。
应当理解的是，本发明在其应用上并不一定局限于在以下说明中所描述和/或在附图中所说明的组件的构造和布置的细节。本发明能够具有除所述和以不同方式实践或进行的那些实施方案之外的实施方案。而且，应理解本文所采用的短语和术语以及摘要出于描述目的并且不应视为限制性的。
这样，本领域技术人员将了解在基于本公开时的概念可容易用作设计用于执行本发明的若干目的的其他结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求书应被认为是包括此类等效结构至它们不背离本发明的精神和范围的程度。

Claims (6)

1.STX1B基因在促进人脂肪间充质干细胞分化为神经细胞中的用途。
2.STX1B过表达在促进人脂肪间充质干细胞分化为神经细胞并促进分化的神经细胞快速增殖中的用途。
3.一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经细胞并促进分化后神经细胞快速增殖的方法，其特征在于包括构建转STX1B基因的脂肪间充质干细胞步骤以及对所述的转基因脂肪间充质干细胞进行诱导分化以及细胞培养的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法制得神经细胞，由上述诱导干细胞神经分化的方法制得。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：具体的诱导方法为：向脂肪间充质干细胞加人神经诱导液：l0ug/L EGF、20ug/L bFGF和10ug/L BDNF，3d后加入神经诱导剂：120umol/L吲哚美辛、3mg/L胰岛素、300umo1/LIBMX。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于构建转STX1B基因的脂肪间充质干细胞步骤为，根据STX1B基因的序列，设计了上下游引物。用TRIzol法提取脂肪间充质干细胞RNA，反转录生成cDNA；以cDNA为模板，PCR扩增。经PCR扩增后获得的基因产物，经琼脂糖凝胶电泳，凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段和pLVX—IRES—ZsGreenl空载体分别经双酶切后，应用DNA产物纯化试剂盒回收酶切产物。将回收的目的片段和载体混合，用DNA连接酶连接过夜；随后用该体系转化Top10大肠杆菌，提取质粒经经酶切鉴定，将鉴定正确的重组质粒用于细胞转染。慢病毒包装：提前将293FT细胞接种到5cm培养板中，于5ml含10％FBS的DMEM培养基，5％CO2,37℃条件下培养，待细胞汇合度达到80％时，进行转染；将前述制备的重组慢病毒质粒5ug、pCMV-VSVG 7ug、pCMV△8.917ug，三质粒共转染后约12h更换培养液，继续培养72h。转染完成后，收集富含慢病毒的细胞上清液，0.45μm滤膜去除细胞后，采用浓缩试剂盒进行浓缩，将长势良好、形态均一的BMSCs，以细胞密度为1x105/孔接种到24孔板。37℃,5％CO2培养箱孵育过夜，利用前述合成的慢病毒以MOI值为100进行病毒感染脂肪间充质干细胞，2h后，补加250uL含10％FBS正常培养基，于5％CO2培养箱培养；病毒感染细胞12h后弃除培养基，每孔再加入500uLIMDM培养基，病毒感染96h后，筛选阳性的转基因细胞，培养备用。
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