CN108064310A

CN108064310A - 用于增强细胞对肉毒神经毒素的特异性摄取的方法

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Publication number: CN108064310A
Application number: CN201680013526.0A
Authority: CN
Inventors: 克劳迪娅·姚茨科; 卡尔-海因茨·艾泽勒; 格尔德·曼德; 克劳斯·芬克
Original assignee: Merz Pharma GmbH and Co KGaA
Current assignee: Merz Pharma GmbH and Co KGaA
Priority date: 2015-03-04
Filing date: 2016-03-03
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2036-03-03
Also published as: KR102418939B1; RU2017130580A; EP3265808A1; AU2016227655B2; KR20170121194A; WO2016139308A1; RU2017130580A3; JP2018506985A; IL254181A0; CA2978225C; ES2822905T3; JP6670842B2; BR112017018962A2; AU2016227655A1; MX2017011195A; IL254181B; CA2978225A1; US10725025B2; SG11201707157PA; RU2684404C2

Abstract

本发明提供了一种增强细胞对神经毒素多肽的特异性摄取的方法，所述方法包括：在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将对神经毒素中毒敏感的细胞与所述神经毒素多肽一起孵育一段时间，所述孵育包括以下步骤中的至少一个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动所述细胞，从而增强所述细胞对所述神经毒素多肽的特异性摄取。此外，本发明涉及一种直接测定细胞中神经毒素多肽的生物活性的方法，所述方法包括：a)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将对神经毒素中毒敏感的细胞与所述神经毒素多肽一起孵育一段时间，所述孵育包括以下步骤中的至少一个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动所述细胞；b)固定所述细胞，并且任选地用洗涤剂透化所述细胞；c)使所述细胞与至少一种特异性结合未裂解底物和神经毒素裂解底物的第一捕获抗体和至少一种特异性结合神经毒素裂解底物的裂解位点的第二捕获抗体在允许所述捕获抗体与所述底物结合的条件下接触；d)使所述细胞与至少一种特异性结合所述第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第一检测复合物，并且使所述细胞与至少一种特异性结合所述第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第二检测复合物；e)测定步骤d)中的第一检测复合物和第二检测复合物的量；以及f)利用所述第二检测复合物，计算在所述细胞中被所述神经毒素多肽裂解的底物的量，从而测定所述细胞中所述神经毒素多肽的生物活性。

Description

用于增强细胞对肉毒神经毒素的特异性摄取的方法

本发明提供了一种增强细胞对神经毒素多肽的特异性摄取的方法，该方法包括：在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽一起孵育一段时间，该孵育包括以下步骤中的至少一个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞，从而增强所述细胞对神经毒素多肽的特异性摄取。此外，本发明涉及一种直接测定细胞中神经毒素多肽的生物活性的方法，该方法包括：a)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽一起孵育一段时间，该孵育包括以下步骤中的至少一个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞；b)固定细胞，并且任选地用洗涤剂透化细胞；c)使细胞与至少一种特异性结合未裂解底物和神经毒素裂解底物的第一捕获抗体和至少一种特异性结合神经毒素裂解底物的裂解位点的第二捕获抗体在允许所述捕获抗体与所述底物结合的条件下接触；d)使细胞与至少一种特异性结合第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第一检测复合物，并且使细胞与至少一种特异性结合第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第二检测复合物；e)测定步骤d)中的第一检测复合物和第二检测复合物的量；以及f)利用第二检测复合物，计算在所述细胞中被所述神经毒素多肽裂解的底物的量，从而测定所述细胞中所述神经毒素多肽的生物活性。

肉毒梭菌(Clostridium botulinum)和破伤风梭菌(Clostridium tetani)能产生毒性很强的神经毒素，即分别为肉毒毒素(BoNT)和破伤风毒素(TeNT)。这些梭菌神经毒素(CNT)与神经细胞特异性结合，并破坏神经递质释放。每种毒素被合成为无活性且未加工的大约150kDa的单链蛋白。翻译后加工涉及二硫键的形成以及细菌蛋白酶作用下的限制性蛋白酶解(产生切口)。活性神经毒素由两条链组成，即，通过二硫键连接的大约50kDa的N末端轻链和大约100kDa的重链。CNT在结构上和功能上由三个域组成，即催化轻链、涵盖易位域(N末端部分)和受体结合域(C末端部分)的重链；参见例如Krieglstein 1990，Eur.J.Biochem.188，39(Krieglstein，1990年，《欧洲生物化学杂志》，第188卷，第39页)；Krieglstein 1991，Eur.J.Biochem.202，41(Krieglstein，1991年，《欧洲生物化学杂志》，第202卷，第41页)；Krieglstein 1994，J.Protein Chem.13，49(Krieglstein，1994年，《蛋白质化学杂志》，第13卷，第49页)。肉毒神经毒素被合成为包含150kDa神经毒素蛋白和相关无毒蛋白的分子复合物。复合物的大小基于梭菌菌株和不同的神经毒素血清型而不同，范围为300kDa、大于500kDa、和900kDa。这些复合物中的无毒蛋白使神经毒素稳定，并保护其免受降解；参见Silberstein 2004，Pain Practice 4，S19-S26(Silberstein，2004年，《疼痛治疗》，第4卷，第S19-S26页)。

根据抗原性不同，肉毒梭菌分泌A至G共7种血清型的肉毒神经毒素(BoNT/A-BoNT/G)。所有血清型与由破伤风梭菌分泌的相关破伤风神经毒素(TeNT)都是Zn2+内切蛋白酶，其通过裂解SNARE蛋白阻断突触的胞外分泌；参见Couesnon，2006，Microbiology，152，759(Couesnon，2006年，《微生物学》，第152卷，第759页)。CNT导致在肉毒中毒和破伤风中所见的弛缓性肌肉麻痹；参见Fischer 2007，PNAS 104，10447(Fischer，2007年，《美国科学院院报》，第104卷，第10447页)。最近鉴定出一种新的肉毒毒素类型，即BoNT/H；参见Barash andArnon，J.Infect.Dis.(2014)，209(2)：183-191(Barash和Arnon，《传染病杂志》，2014年，第209卷第2期：第183-191页)和Dover，Barash，Hill，Xie and Arnon，J.Infect.Dis.(2014)，209(2)：192-202(Dover、Barash、Hill、Xie和Arnon，《传染病杂志》，2014年，第209卷第2期：第192-202页)。

尽管其具有毒性效果，但该肉毒毒素复合物已在大量疾病中用作治疗剂。1989年，肉毒毒素血清型A在美国已被批准用于人类使用以治疗斜视、睑痉挛和其他失调症。其可作为肉毒毒素A(BoNT/A)蛋白制剂，例如以商品名BOTOX(艾尔建公司(Allergan，Inc.))或商品名DYSPORT/RELOXIN(易普森公司(Ipsen，Ltd.))商购获得。改进的不含复合物的肉毒毒素A制剂可以商品名XEOMIN(梅尔兹制药公司(Merz Pharma GmbH&Co.KGaA))商购获得。对于治疗应用，将该制剂直接注射到待治疗的肌肉中。在生理pH下，毒素从蛋白复合物中释放，然后产生所需的药理效果。肉毒毒素的效果仅仅是暂时性的，这正是可能需要重复施用肉毒毒素以保持治疗效果的原因。

梭菌神经毒素削弱随意肌的力量，是斜视、局限性肌张力障碍(包括颈部肌张力障碍)和良性原发性眼睑痉挛的有效治疗方法。其还表现出对偏侧面肌痉挛和局部痉挛的缓解，此外还对广泛的其他适应症有效，诸如肠胃疾病、多汗症和美容皱纹校正；参见Jost2007，Drugs 67，669(Jost，2007年，《药物》，第67卷，第669页)。

在生产梭菌神经毒素的过程中，所述神经毒素的定性和定量测定以及生物活性神经毒素多肽的质量控制是特别重要的。此外，政府机构仅接受简便可靠且经过验证的肉毒毒素活性测定。目前，小鼠LD₅₀生物测定致死性试验仍然是制药厂商用来分析其制剂效力的“黄金标准”；参见Arnon et a1.(2001)，JAMA 285，1059-1070(Arnon等人，2001年，《美国医学会杂志》，第285卷，第1059-1070页)。但是，近几年人们付出了相当大的努力来寻找替代方法，以减少对于动物试验的需要以及缓解与此类基于动物的测定法相关的所有缺点、成本和伦理问题。此外，监管机构鼓励制药公司在肉毒神经毒素的效力试验中应用三“R”原则：“减少(Reduce)、优化(Refine)、替代(Replace)”；参见Straughan，Altern.Lab.Anim.(2006)，34，305-313(Straughan，《实验动物替代》，2006年，第34卷，第305-313页)。因此，人们开发了基于细胞的试验系统，以便为使用活体动物提供合理的替代方法。然而，迄今为止只有三种已被证明对神经毒素多肽足够敏感的细胞试验系统可用于测定神经毒素的生物活性。这些基于细胞的试验系统包括使用从啮齿动物胚胎分离的在体外分化的原代神经元(Pellett et al.(2011)，Biochem.Biophys.Res.Commun.404，388-392(Pellett等人，2011年，《生物化学与生物物理研究通讯》，第404卷，第388-392页))、神经元分化诱导的多能干细胞(Whitemarsh et al.(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35(Whitemarsh等人，(2012)，《毒理学》，第126卷，第426-435页))以及SiMa细胞系的亚克隆(WO 2010/105234 A1)。

但是，原代神经元的分离需要杀死动物，并且非常费时费力。此外，采用不同原代神经元的试验系统表现出很大的差异。类似地，神经元分化诱导的多能干细胞的传代也非常困难和耗时。另外，此类细胞的保存也很成问题。采用肿瘤细胞系的测定法通常对BoNT不够敏感。此外，所述肿瘤细胞系需要非常复杂的分化方案，使得在使用所述细胞系时测定法会产生很大差异和/或高失败率。

鉴于上述原因，另外的用于测定神经毒素多肽活性的检测系统是十分可取的。

因此，本发明所解决的技术问题可以被看作是提供符合前述需要的手段和方法。该技术问题通过在权利要求和下文中表征的实施方案解决。

在第一方面，本发明涉及一种用于增强细胞对神经毒素多肽的特异性摄取的方法，该方法包括：

在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽一起孵育一段时间，该孵育包括以下步骤中的至少一个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞，从而增强所述细胞对神经毒素多肽的特异性摄取。优选地，该方法为体外方法。

梭菌神经毒素多肽在突触末端起作用以阻断神经递质释放。神经毒素通过与神经元膜受体结合，被吸收到核内体样腔室中，然后通过pH依赖性易位过程穿透核内体膜，从而进入神经元。一旦进入突触细胞质内，梭菌神经毒素裂解其对应的SNARE蛋白底物，以满足突触泡融合的需要。

更具体地，梭菌神经毒素的特征在于它们特异性地抑制神经递质从突触前神经末梢的分泌。外周神经元的选择性由不同受体(诸如SV2和GT1b)的识别来介导。例如，突触前神经末梢对BoNT/A的特异性摄取是一个严格受控的多步骤过程，涉及高亲和力受体和低亲和力受体的组合。与神经节苷脂GT1b的结合介导初始的结合步骤，并由此将BoNT/A集中在细胞表面。一旦锚定在膜中，质膜内的横向运动将促进BoNT/A与其他(蛋白)受体(诸如SV2或FGFR3)的分子间相互作用。BoNT/A的受体是神经节苷脂GT1b，其在受体结合域的C末端部分中具有结合口袋。根据APR受体模型，聚集在突触前膜的微域中的一系列突触前受体阵列(APR)负责神经毒素(包括BoNT/A)的特异性摄取。与神经节苷脂GT1b的结合介导初始的结合步骤，并将BoNT/A集中在细胞表面。一旦锚定在膜中，质膜内的横向运动将促进BoNT/A与蛋白受体的分子间相互作用，所述蛋白受体包括突触泡(SV)糖蛋白2的三种同种型，即SV2A(ENSG00000159164)、B(ENSG00000185518)和C(ENSG00000122012)，它们在突触泡融合到突触前膜之后暴露在外质膜上。BoNT/A特异性地识别SV2的第四腔域(LD4)。在BoNT/A结合域中与SV2相互作用的特异性序列尚未被鉴定。经鉴定，糖基化SV2A、SV2B和SV2C也是BoNT/F的受体，并且糖基化SV2A和SV2B是BoNT/E的受体。据报道，BoNT/D通过两个神经节苷脂结合位点进入神经元，一个位点位于先前在BoNT/A、BoNT/B、BoNT/E、BoNT/F和BoNT/G中鉴定的位置，而另一个位点类似于TeNT的第二神经节苷脂结合口袋。最近，BoNT/D还被证实使用SV2(全部三种同种型)进入海马神经元，但是BoNT/D通过与BoNT/A和BoNT/E不同的机制结合SV2。SV2A和SV2B还被报道可介导TeNT结合并进入中枢神经元；参见Jacky et al.，PLoSPathog.2013May；9(5)：e1003369(Jacky等人，《公共科学图书馆·病原体》，2013年5月；第9卷第5期：e1003369)及其中引用的参考文献。

神经毒素的生理效应基于结合受体之后SNARE复合物的蛋白裂解以及神经毒素轻链的易位。梭菌神经毒素生物活性的测定是表征所述神经毒素蛋白的一个重要方面，并且根据监管机构特别要求，用于清除包含梭菌神经毒素的产品。因此，测量梭菌神经毒素生物活性的可靠试验是研究、开发和销售含梭菌神经毒素的产品的基础。此外，出于伦理原因，基于细胞的试验系统应当替代迄今为止占主导地位的动物试验。为建立此类基于细胞的试验系统，对梭菌神经毒素具有足够高的敏感度的神经元细胞或细胞系是至关重要的。

本发明人有利地发现，可通过以下步骤中的至少一个来增加对梭菌神经毒素中毒敏感的细胞对梭菌神经毒素多肽的特异性摄取：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞。同时，通过这些措施可降低神经毒素多肽或其降解产物的非特异性摄取。具体地，通过减少细胞与所述神经毒素孵育的时间，来降低神经毒素或其降解产物的非特异性细胞摄取。K⁺介导的细胞去极化刺激神经毒素的特异性摄取。此外，神经毒素中毒期间搅动细胞会影响邻近神经元膜的生物相浓度，从而能够减少非特异性摄取，并同时增加细胞对神经毒素的特异性摄取。相应的数据在下面的实施例中示出。此外，图1示出了三种基于细胞的测定法示例的对比，其中应激样品显示出与参照测定法(小鼠LD₅₀生物测定法)相当的衰减动力学。

因此，在本发明的方法的一个方面，神经毒素多肽或其降解产物的非特异性细胞摄取减少。

本发明还包括对受损分子的选择性，例如，通过降解起到稳定储存肉毒神经毒素的作用。由于神经递质的释放是由K⁺介导的去极化诱导的，因此随后增加的囊泡再摄取包括通过与受体(如GT1b和/或SV2蛋白家族的成员)结合进行的特异性摄取。受损分子可以表现出与受体结合较弱或不与受体结合。对于诸如摇动的物理影响而言也是如此。受损分子的较不稳定结合甚至将通过摇动来降低。

为了增强对神经毒素中毒敏感的细胞对神经毒素多肽的特异性摄取，在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将该细胞与神经毒素多肽一起孵育一段时间。该时间段和细胞培养条件在本领域中是已知的。在本发明的方法中，细胞培养条件包括以下步骤中的至少一个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞。本发明的方法还可涵盖所述步骤中的两个，例如，步骤(i)和(ii)、步骤(i)和(iii)、步骤(ii)和(iii)或所有三个步骤(i)至(iii)。优选的是，细胞培养条件包括以下步骤中的每一个，即(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞。

通常，本领域的用于神经毒素活性测定法的细胞培养基包含约5mM K⁺。神经元通常通过将K⁺离子从培养基主动运输到细胞内并将Na+离子从细胞溶胶跨质膜运输到细胞外，来建立离子梯度。结果形成受细胞严格调控的膜电位，并且该膜电位是包括细胞间的通信在内的多种不同细胞过程的基础。质膜的特异性离子渗透性的突然变化或膜的任一侧离子组合物的快速改变会导致被称为去极化的膜电位变化。K⁺介导的细胞去极化可在K⁺浓度增加的细胞培养基中进行，例如，另外的约10mM、20mM、30mM、40mM、50mM或55mM的K⁺浓度。在本发明的方法中K⁺的最终浓度可为约15mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM或60mMK⁺。用于K⁺介导的去极化的时间段为至少约30分钟、1小时、1.5小时、2小时、2.5小时、3小时或甚至更久。

K⁺介导的细胞去极化和/或神经毒素多肽的暴露可在存在神经节苷脂GT1b的情况下进行。GT1b可以约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60μM，优选地介于约15μM和约50μM之间，更优选地约20μM的浓度使用。

本领域使用的神经毒素多肽暴露时间通常介于约4小时和约96小时之间，经常为约72小时。减少神经毒素多肽的暴露时间为用神经毒素多肽使细胞中毒至少24小时且小于96小时，优选地至少48小时、至少60小时且最多72小时。

在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞可以通过使用本领域已知的装置和方法进行，例如磁力搅拌器、旋转瓶或者通过利用摇动器摇动细胞。细胞的搅动在适当的细胞培养基流率下进行，以避免细胞附着在组织烧瓶上。培养基的合适平均流率为例如介于约25cm/min和约300cm/min之间。

上述K⁺介导的细胞去极化也可在存在GT1b和神经毒素多肽的情况下进行，之后在搅动下使神经毒素多肽的暴露持续另外的时间段，诸如约24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。

还可以设想，没有神经毒素多肽情况下的孵育时间先于神经毒素多肽的暴露。例如，没有神经毒素多肽情况下的孵育时间可为约6、12、18、24、30、36、42、48、54或60小时，优选地介于约16和约48小时之间。

本发明方法的另外优选的实施方案可从下面的实施例中得到。

如本文所用的术语“神经毒素多肽”或简称“神经毒素”或“毒素”表示梭菌神经毒素，即肉毒梭菌和破伤风梭菌神经毒素，特别是肉毒神经毒素(BoNT)和破伤风神经毒素(TeNT)。更具体地，所述术语涵盖BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H(Barash and Amon，J.Infect.Dis.(2014)，209(2)：183-191(Barash和Arnon，《传染病杂志》，2014年，第209卷第2期：第183-191页))和破伤风神经毒素(TeNT)、以及它们的亚型。例如，BoNT/A亚型包括BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4和BoNT/A5。BoNT/B亚型涵盖例如BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7和BoNT/B 8。BoNT/C亚型包括例如BoNT/C1-1和BoNT/C12。还涵盖BoNT/D-C亚型。BoNT/E亚型包括例如BoNT/E1、BoNT/E2、BoNT/E3、BoNT/E4、BoNT/E5、BoNT/E6、BoNT/E7、BoNT/E8和BoNT/E9。此外，BoNT/F亚型包括例如BoNT/F 1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6和BoNT/F7。另外的亚型在例如Hill et al.(J Bacteriol.2007Feb；189(3)：818-32.Epub2006Nov17.)(Hill等人，《细菌学杂志》，2007年2月；第189卷第3期：第818-832页，2006年11月17日电子版)中有所描述，该文献的公开内容以引用方式并入本文。神经毒素多肽以及特别是其轻链和重链源自上述肉毒神经毒素或亚型的具有不同抗原性的血清型之一。在一个方面，神经毒素多肽的轻链和重链是选自下列的神经毒素的轻链和重链：BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT。在另一方面，编码所述神经毒素多肽的多核苷酸包括如SEQ ID NO：1(BoNT/A)、SEQ ID NO：3(BoNT/B)、SEQ ID NO：5(BoNT/C1)、SEQ ID NO：7(BoNT/D)、SEQ ID NO：9(BoNT/E)、SEQ ID NO：11(BoNT/F)、SEQ ID NO：13(BoNT/G)或SEQ ID NO：15(TeNT)所示的核酸序列。此外，在一个方面，还涵盖多核苷酸，该多核苷酸包括编码如SEQ ID NO：2(BoNT/A)、SEQ ID NO：4(BoNT/B)、SEQ ID NO：6(BoNT/C1)、SEQ ID NO：8(BoNT/D)、SEQ ID NO：10(BoNT/E)、SEQ ID NO：12(BoNT/F)、SEQ ID NO：14(BoNT/G)或SEQ ID NO：16(TeNT)中任一个所示的氨基酸序列的核酸序列。在本发明的方法的一方面，还涵盖神经毒素多肽，该神经毒素多肽包括以下氨基酸序列或由选自下列的氨基酸序列组成：SEQ ID NO：2(BoNT/A)、SEQ ID NO：4(BoNT/B)、SEQ ID NO：6(BoNT/C1)、SEQ ID NO：8(BoNT/D)、SEQ ID NO：10(BoNT/E)、SEQ ID NO：12(BoNT/F)、SEQ ID NO：14(BoNT/G)和SEQ ID NO：16(TeNT)。还涵盖与最近描述的BoNT/H对应的核酸和氨基酸序列，如在例如Dover，N.et al.，(2014)，J Infect Dis209(2)：192-202(Dover，N.等人，2014年，《传染病杂志》，第209卷第2期：第192-202页)中所示。

在另一方面，所述多核苷酸为上述多核苷酸或多肽的变体。变体可以是天然存在的神经毒素多核苷酸或多肽，例如上述梭菌神经毒素的同种型或亚型。例如，本领域的技术人员应当认识到，在肉毒神经毒素的各个血清型中，可存在天然存在的肉毒神经毒素变体，其氨基酸序列以及编码这些蛋白质的核酸序列有所不同。

变体也可以是非天然存在的神经毒素多肽。如本文所用，术语梭菌神经毒素的“非天然存在的变体”意指在人类操作的帮助下产生的梭菌神经毒素，包括但不限于通过基因工程或重组方法产生的梭菌神经毒素，所述方法诸如采用随机诱变或合理设计、经酶(诸如内切或外切蛋白水解酶)活性修饰的梭菌神经毒素的酶促修饰变体或通过化学合成产生的梭菌神经毒素。“基因操纵”是指本领域已知的通过修饰编码梭菌神经毒素的基因或相应的核酸(如DNA或mRNA)的手段来修饰任何血清型/亚型的天然梭菌神经毒素的方法。用于对编码神经毒素多肽的多核苷酸或神经毒素多肽进行基因工程改造的重组方法在本领域中已充分描述；参见例如Sambrook，J.&Russell，D.(2001).Molecular Cloning：a LaboratoryManual，3rd edn.Cold Spring Harbor，NY：Cold Spring Harbor Laboratory(Sambrook，J.和Russell，D.，2001年，《分子克隆实验指南》，第3版，美国纽约州冷泉港，冷泉港实验室)。

此外，在另一方面，如本文所用的天然存在或非天然存在的变体多核苷酸包括与如SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13或15中任一个所示的核酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的核酸序列变体，或如在Dover，N.et al.，(2014)，J Infect Dis209(2)：192-202(Dover，N.等人，2014年，《传染病杂志》，第209卷第2期：第192-202页)中所示的BoNT/H的核酸序列，或编码与如SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14或16中任一个所示的氨基酸序列至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列或如Dover，N.et al.，(2014)，J Infect Dis 209(2)：192-202(Dover，N.等人，2014年，《传染病杂志》，第209卷第2期：第192-202页)中所示的BoNT/H的氨基酸序列的核酸序列变体。如本文所用的术语“相同”是指通过测定两个核酸序列或两个氨基酸序列之间的相同氨基酸的数量来表征的序列同一性，其中对序列进行比对以获得最高顺序匹配。其可使用被编入计算机程序(例如，BLASTP，BLASTN或FASTA)中的公开技术或方法来计算(Altschul1990，J Mol Biol215，403(Altschul，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页))。在一个方面，在整个氨基酸序列(例如，神经毒素多肽的轻链或重链或这两者)上计算同一性百分比值。技术人员可使用基于各种算法的一系列程序来比较不同序列。在这种情况下，Needleman和Wunsch或Smith和Waterman的算法给出了特别可靠的结果。为进行序列比对，可使用PileUp程序(Higgins 1989，CABIOS 5，151(Higgins，1989年，《生物科学中的计算机应用》，第5卷，第151页))或Gap和BestFit程序(Needleman 1970，J Mol Biol 48；443(Needleman，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443页)；Smith 1981，Adv Appl Math 2，482(Smith，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页))，这些程序是GCG软件包的组成部分(遗传学计算机小组，1991年，美国威斯康星州麦迪逊科学大道575号，邮编53711(Genetics Computer Group1991，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711))。在本发明的另一方面，上文中以百分数(％)表示的序列同一性值使用GAP程序和如下设置在全长序列区域范围内测定：间隙权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，以及平均错配：0.000，除非另外指明，否则这些设置应始终用作序列比对的标准设置。在一个方面，上述变体多核苷酸中的每一种所编码的多肽保留了本文定义的相应神经毒素多肽(即，BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或破伤风神经毒素(TeNT))的一种或多种生物学特性，在另一方面，所述多肽保留了其所有生物学特性。本领域技术人员将认识到，尽管可以设想未加工的前体可发挥一些生物功能或部分具有活性，但只有在蛋白分解活化后才能保持完整的生物活性。用于评估梭菌神经毒素的生物活性的体内测定法包括小鼠LD50测定法和离体小鼠偏侧膈测定法，如Pearce等人(Pearce 1994，Toxicol.Appl.Pharmacol.128：69-77(Pearce，1994年，《毒理学与应用药理学》，第128卷，第69-77页))和Dressler等人(Dressler 2005，Mov.Disord.20：1617-1619，Keller 2006，Neuroscience 139：629-637(Dressler，2005年，《运动障碍性疾病》，第20卷，第1617-1619页；Keller，2006年，《神经科学》，第139卷，第629-637页))所述。生物活性通常用小鼠单位(MU)表示。如本文所用，1MU为神经毒性组分的量，其在腹膜内注射后杀死指定小鼠群体的50％，即小鼠i.p.LD50。在又一方面，变体多核苷酸可以编码具有改善的或改变的生物学特性的神经毒素，例如它们可包括针对酶识别进行了改善的裂解位点，和/或可针对受体结合、内化、跨内吞体膜到细胞溶胶中的易位或对SNARE蛋白家族的对应底物的内切蛋白水解裂解进行改善。

非天然存在的梭菌神经毒素变体的非限制性示例包括例如保守性梭菌神经毒素变体。如本文所用，术语“保守性梭菌神经毒素变体”意指其至少一个氨基酸被另一个氨基酸或氨基酸类似物取代的梭菌神经毒素，所述另一个氨基酸或氨基酸类似物具有至少一种与来自如本文别处所述的参照梭菌神经毒素序列的原始氨基酸类似的特性，所述原始氨基酸诸如SEQ ID NO.2、4、6、8、10、12、14或16所示的氨基酸序列或如Dover，N.et al.，(2014)，J Infect Dis 209(2)：192-202(Dover，N.等人，2014年，《传染病杂志》，第209卷第2期：第192-202页)中所示的BoNT/H的氨基酸序列。与参照序列相比，该变体可具有一个、两个、三个、四个、五个或甚至更多个保守氨基酸取代。该变体应当具有与参照梭菌神经毒素序列相当或甚至改善的特性。特性的示例包括但不限于类似的尺寸、形貌、电荷、疏水性、亲水性、亲油性、共价结合能力、氢键结合能力、物理化学特性等或它们的任意组合。优选地，该特性是如本文别处所定义的生物学特性，即(a)受体结合、(b)内化、(c)跨内吞体膜到细胞溶胶中的易位和/或(d)对参与突触泡膜融合的蛋白的内切蛋白水解裂解。保守性梭菌神经毒素变体可以与该保守性梭菌神经毒素变体所基于的参照梭菌神经毒素基本上相同的方式起作用，并且在本发明的任何方面可取代该参照梭菌神经毒素。本文所述的梭菌神经毒素通常将包含天然存在的氨基酸残基，但在某些情况下也可存在非天然存在的氨基酸残基。因此，可包括模拟特定氨基酸或肽的结构的非氨基酸化学结构的所谓“模拟肽”和“肽类似物”也可用于本发明的上下文中。此类模拟物或类似物的特征通常表现为相似的物理特性，诸如尺寸、电荷或疏水性，以及在其天然肽对应物中发现的适当的空间取向。如本领域所熟知，肽模拟化合物的一个具体示例为其中一个或多个氨基酸之间的酰胺键被例如碳-碳键或其他非酰胺键所取代的化合物，参见例如Sawyer，in Peptide Based Drug Design，pp.378-422，ACS，Washington D.C.1995(Sawyer，《基于肽的药物设计》，第378-422页，美国化学学会，华盛顿特区，1995年)。

如本文所用的神经毒素多肽变体还涵盖经化学修饰的神经毒素多肽。如本文所用的“化学修饰”通常是指本领域已知的通过化学反应或类似方法来修饰任何血清型或亚型的天然或重组梭菌神经毒素的方法；尤其是指梭菌神经毒素的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或翻译后修饰。经化学修饰的神经毒素多肽可以是通过丙酮酸化、磷酸化、硫酸盐化、脂化、聚乙二醇化、糖基化和/或化学添加氨基酸或包含例如介于约2至约500个氨基酸的多肽而进行修饰的多肽。例如，通过向神经毒素多肽中掺入透明质酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇或它们的混合物，可使梭菌神经毒素或通过化学修饰或通过遗传操纵而衍生自梭菌毒素的毒素稳定。

可用于本发明的方法的梭菌神经毒素的另一种非天然存在的变体为混合梭菌神经毒素。在一个方面，该混合梭菌神经毒素包含梭菌神经毒素重链和轻链的组合，其中轻链和重链不属于同一血清型或亚型。

用于制备此类经化学修饰、酶促修饰或遗传修饰的梭菌神经毒素变体的方法，以及用于鉴定此类变体是否保持本文所述的生物学特性(诸如(a)受体结合、(b)内化、(c)跨内吞体膜到细胞溶胶中的易位和/或(d)对参与突触泡膜融合的蛋白的内切蛋白水解裂解)的方法是本领域的普通技术人员所熟知的；参见例如上述引文中的Sambrook。

如本文所用的术语“神经毒素多肽的生物活性”意指神经毒素多肽特有的生物学特性，即(a)受体结合、(b)内化、(c)跨内吞体膜到细胞溶胶中的易位和/或(d)对参与突触泡膜融合的蛋白的内切蛋白水解裂解。可以设想，如本文所用的神经毒素多肽表现出上述特性a)至d)中的至少一种，优选地表现出参与突触泡膜融合的蛋白的内切蛋白水解裂解，或a)至d)中所列的两种或三种或全部四种生物学特性。用于测定神经毒素多肽的生物活性的测定法是本领域中所熟知的，并且也在本文中别处进行了描述，参见例如Pellett etal.(2011)，Biochem.Biophys.Res.Commun.404，388-392(Pellett等人，2011年，《生物化学与生物物理研究通讯》，第404卷，第388-392页)；Whitemarsh et al.(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35(Whitemarsh等人，2012年，《毒理学》，第126卷，第426-435页)。

SNAP-25是BoNT/A、BoNT/C1和BoNT/E的已知底物并由其裂解。VAMP/小突触泡蛋白是BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G和TeNT的底物并由其裂解，而突触融合蛋白是BoNT/C1的底物并由其裂解。所述底物和对应的核酸和氨基酸序列是本领域所熟知的；参见例如WO2014/207109。

如本文所用，术语“细胞”是指对由神经毒素(例如，BoNT/A)引起的神经毒素中毒敏感的任何真核细胞，或可摄取神经毒素的任何真核细胞。本公开的各方面部分地包括来自已建立细胞系(established cell line)的细胞。术语“细胞”涵盖来自各种生物体的细胞(例如，小鼠、大鼠、猪、牛、马、恒河猴、灵长类动物和人类细胞)、来自各种细胞类型的细胞(例如，神经元细胞和非神经元细胞)；并且可以从异质细胞群体、组织或生物体中分离或部分分离。如本文所用，术语“已建立细胞系”与“永生细胞系”或“转化细胞系”同义，并且是指从源自生物体、组织或器官来源的细胞群体中选择用于无限繁殖的细胞的细胞培养物。根据定义，已建立细胞系不包括原代细胞的细胞培养物。如本文所用，术语“原代细胞”是直接从新鲜组织或器官获得的且不具有无限繁殖潜力的细胞。例如，原代神经元细胞可用于本发明的方法中。已建立细胞系可包括异质细胞群体或均质细胞群体。源自单个细胞的已建立细胞系被称为克隆细胞系。已建立细胞系可以是其细胞内源性表达细胞经历整个细胞机制所必需的所有组分的细胞系，凭借该机制，神经毒素(诸如BoNT/A)通过蛋白水解裂解底物(诸如SNAP-25)，并且该机制涵盖神经毒素与神经毒素受体的结合(诸如BoNT/A与BoNT/A受体的结合)、神经毒素/受体复合物的内化、神经毒素轻链从胞内小泡进入细胞质的易位以及神经毒素底物的蛋白水解裂解。另选地，已建立细胞系可以是其细胞从外源来源引入细胞经历整个细胞机制所需的至少一种组分的细胞系，凭借该机制，神经毒素(诸如BoNT/A)通过蛋白水解裂解底物(诸如SNAP-25)，并且该机制涵盖神经毒素与受体的结合(诸如BoNT/A与BoNT/A受体的结合)、神经毒素/受体复合物的内化、神经毒素轻链从胞内小泡进入细胞质的易位以及神经毒素底物的蛋白水解裂解。其也被称为基因工程改造细胞系，来自此类已建立细胞系的细胞可以例如表达外源FGFR2、外源FGFR3、外源SV2、外源神经毒素底物如SNAP-25，或它们的任意组合。

如本文所用的“细胞培养”广义上是指从动物或人移取细胞，随后使所述细胞在有利的人造环境中生长。细胞可直接从组织中移取，并且在培养前通过酶促或机械方法解聚，或者这些细胞可源自已建立的细胞系或细胞株。原代培养是指在将细胞从组织中分离出来后在适当的条件下增殖，直至它们占据所有可用底物(即，达到汇合)的培养阶段。在该阶段，细胞必须进行传代培养，即将其转移到装有新鲜生长培养基的新容器中，从而为持续生长提供更多的空间。正常细胞通常只能进行有限次数的分裂，然后失去其增殖能力，这是被称为衰老的由遗传决定的事件；这些细胞系被称为有限细胞系。然而，一些细胞系通过称为转化的过程而变得永生，该过程可自发发生或可以经化学或病毒诱导而发生。当有限细胞系经历转化并获得无限分裂的能力时，则变成连续细胞系。对于各种细胞类型，培养条件有很大不同，但是培养细胞的人造环境总是由含有以下物质的合适容器组成：提供必需营养物质(氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)的底物或培养基、生长因子、激素、气体(O₂，CO₂)、受控的物理化学环境(pH、渗透压、温度)等。大多数细胞是贴壁依赖性的，必须贴附到固体或半固体底物上进行培养(贴壁或单层培养)，而其他细胞可以漂浮在培养基中生长(悬浮培养)。

如本文所述的术语“对神经毒素中毒敏感的细胞”意指可经历整个细胞机制的细胞，凭借该机制，神经毒素多肽(例如BoNT/A)裂解神经毒素底物(例如BoNT/A底物SNAP25)，并且该机制涵盖神经毒素多肽与其对应受体的结合(例如BoNT/A与BoNT/A受体的结合)、神经毒素/受体复合物的内化、神经毒素轻链从胞内小泡进入细胞质的易位以及神经毒素底物的蛋白水解裂解。因此，如本文所用的“对神经毒素中毒敏感的细胞”意指神经毒素敏感细胞。所述术语包括细胞或细胞系，例如分离的原代细胞或其细胞系、或已建立细胞系的细胞或已建立细胞系，例如能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞或肿瘤细胞系，诸如本文别处所定义的成神经细胞瘤细胞或成神经细胞瘤细胞系。例如，所述成神经细胞瘤细胞系可以是从DSMZ(ACC 164)商购获得的SiMa细胞系。SiMa细胞系的特异性克隆此外还公开于WO 2010/105234中。可用于本发明的方法中的其他成神经细胞瘤细胞系可以下列ATCC或DSMZ编号从ATCC或DSMZ获得：编号CRL-2263的细胞系N1E-115、编号CCL-131的细胞系Neuro2a、编号CRL-2266的细胞系SH-SY5Y、编号CRL-1721的细胞系PC12、编号ACC157的细胞系MHH-NB-11(DSMZ)以及编号CRL-2271的细胞系SK-N-BE(2)。对神经毒素中毒敏感的其他肿瘤细胞为P-19细胞(小鼠胚胎恶性肿瘤细胞系)(DSMZ No.ACC 316)。在一些方面，例如对于活性测定，可能需要将所述细胞分化成神经元细胞。此类分化方法在文献中已充分描述。对神经毒素中毒敏感的细胞还涵盖由诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元，优选地为由人诱导多能干细胞(iPS)衍生的神经元，参见例如上述引文中的Whitemarsh等人(2012年)。此类人iPS衍生的神经元还可从例如细胞动力公司(Cellular Dynamics)商购获得。生成iPS细胞的方法在例如Yu et al.(Science 2009May 8；324(5928)：797-801.Epub 2009)(Yu等人，《科学》，2009年5月8日，第324卷第5928期：第797-801页，2009年电子版)、WO 2011/056971和WO 2011/025852中有所描述。在一些方面，使用合适的方法将iPS分化成神经元，所述方法诸如在WO 2012/135621和美国专利申请US 2010/0279403和US 2010/0216181中所述的那些。

如本文所用的术语“分化”表示非特化或相对较少特化的细胞变得相对更加特化的过程。在细胞个体发育的背景下，形容词“分化的”是一个相对性术语。因此，“分化细胞”是比与之相比较的细胞进一步向某一发育途径进展的细胞。分化细胞可以例如是终末分化细胞，即在生物体的各种组织和器官中具有独特功能的完全特化的细胞，并且其可以但不需要是有丝分裂期后的。例如，神经元来自人iPS细胞的终末分化，并表现出神经元的特征和功能。又如，分化细胞还可以是分化谱系中的祖细胞，其可以进一步增殖和/或分化。类似地，如果细胞比与之相比较的细胞进一步向某一发育途径进展，则前者为“相对更加特化的”，其中后者因此被认为是“非特化的”或“相对较少特化的”。相对更加特化的细胞可在一种或多种可证实的表型特征上与非特化或相对较少特化的细胞不同，例如特定细胞组分或产物(例如RNA、蛋白质、特异性细胞标志物或其他物质)的存在、缺失或表达水平，某些生化途径的活性、形态外观、增殖能力和/或动力学、分化潜能和/或对分化信号的响应等，其中这些特征意味着相对更加特化的细胞进一步沿着所述发育途径的进展。如从本文引用的文献可以看出，将细胞分化成神经元细胞的细胞培养条件是本领域所熟知的。

此外，用于在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽一起孵育一段时间的细胞培养条件在本领域中已充分描述，并且也可从本文所述的出版物中获得。

如本文所用的术语“神经毒素多肽的特异性摄取”意指神经毒素多肽通过与其特异性神经元膜受体(例如，对于BoNT/B为SV2、神经节苷脂、GD1a、突触结合蛋白II，或者对于BoNT/D/-C为突触结合蛋白I)结合，被吸收到核内体样腔室中，然后通过pH依赖性易位过程穿透核内体膜，从而进入神经元的过程。因此，所述术语涵盖a)神经毒素多肽的受体结合、(b)神经毒素多肽的内化和(c)神经毒素多肽跨内吞体膜到细胞溶胶中的易位。如本领域的技术人员所认识的那样，神经毒素敏感细胞优选地能够首先摄取神经毒素，然后经历上面列出的整个细胞机制。如本文所述的表述“神经毒素多肽的非特异性摄取”意指这样一个过程，其中神经毒素多肽或其降解产物通过与非特异性神经元膜受体结合或通过经由非特异性机制进入细胞而进入神经元，例如通过在胞饮作用下的偶然共运输。如本文所用的神经毒素敏感细胞可以摄取例如约100纳摩尔(nM)、约10nM、约1nM、约500皮摩尔(pM)、约400pM、约300pM、约200pM、约100pM、约90pM、约80pM、约70pM、约60pM、约50pM、约40pM、约30pM、约20pM、约10pM、约9pM、约8pM、约7pM、约6pM、约5pM、约4pM、约3pM、约2pM、约1pM、约0.5pM或约0.1pM的神经毒素多肽，或小于所述值中的一者。有文献报道了高于100pM的EC50值。根据定义，对神经毒素中毒敏感的细胞必须表达或经工程改造以表达至少一种神经毒素受体和至少一种神经毒素底物。神经毒素的受体和底物在本领域中有所描述，并且在本文别处有所提及。因此，所述细胞优选地对如本文所定义的具有生物活性的或成熟的神经毒素多肽敏感。优选地，本文所用的神经毒素敏感细胞对例如约1nM或更少、500pM或更少、约400pM或更少、约300pM或更少、约200pM或更少、约100pM或更少、约90pM或更少、约80pM或更少、约70pM或更少、约60pM或更少、约50pM或更少、约40pM或更少、约30pM或更少、约20pM或更少、约10pM或更少、约9pM或更少、约8pM或更少、约7pM或更少、约6pM或更少、约5pM或更少、约4pM或更少、约3pM或更少、约2pM或更少、约1pM或更少、约0.9pM或更少、约0.8pM或更少、约0.7pM或更少、约0.6pM或更少、约0.5pM或更少、约0.4pM或更少、约0.3pM或更少、约0.2pM或更少或甚至约0.1pM或更少的神经毒素中毒敏感。如本领域已知，“半最大效应浓度(EC50)”是指在一段指定的暴露时间之后，药物、抗体或有毒物引起介于基线值和最大值之间的中间值的响应的浓度。它通常用作对药物效力的量度。因此，分级剂量响应曲线的EC50表示观察到其最大效应的50％时的化合物浓度。定量剂量响应曲线的EC50表示在暴露持续时间后50％的群体表现出响应时的化合物浓度。用于鉴定对神经毒素中毒敏感和/或具有神经毒素摄取能力的细胞或细胞系(即，如本文所定义的神经毒素敏感细胞)的方法在本领域中是已知的；参见例如US 2012/0122128A1。在一个方面，神经毒素多肽的生物活性源自所有上述生物学特性。迄今为止，现有技术仅描述了几种可用于测定神经毒素生物活性的对神经毒素具有足够高敏感度的细胞测定法，如本文别处所述。

如本文所用的术语“增强”意指与未使用(i)K⁺介导的细胞去极化、(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞的梭菌神经毒素中毒相比，细胞对神经毒素多肽的特异性摄取得到改善或增加。与使用不包括(i)K⁺介导的细胞去极化、(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞的细胞培养条件的方法相比，细胞对神经毒素多肽的特异性摄取优选地增加至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或甚至至少10倍。一般来讲，本领域描述的方法使用约5mM的K⁺最终浓度、约72小时的神经毒素多肽暴露时间，并且不搅动细胞。本发明人发现，上述措施(i)、(ii)和/或(iii)不仅改善了细胞对神经毒素的特异性摄取，还导致细胞对上述神经毒素或降解产物的非特异性摄取减少。与使用不包括(i)K⁺介导的细胞去极化、(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞的细胞培养条件的方法相比，细胞对神经毒素多肽的非特异性摄取优选地降低至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或甚至至少10倍。用于测量细胞对神经毒素多肽的特异性或非特异性摄取的装置和方法在文献和本文中已充分描述，并且在下面的实施例中进一步示出。例如，BoNT/A、BoNT/C和BoNT/E神经毒素暴露对神经元细胞培养物中SNAP-25蛋白分解的影响可用作神经毒素易位的指示剂。BoNT/C神经毒素暴露对神经元细胞中突触融合蛋白的蛋白分解以及BoNT/E、BoNT/D和BoNT/G神经毒素暴露对VAMP的蛋白分解的影响也是如此。

在本发明的方法的又一方面，本发明的上述方法之后是测定细胞中神经毒素多肽的生物活性的方法。

如下面的实施例所示，通过使用K⁺介导的细胞去极化，减少神经毒素多肽的暴露时间和/或在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞，可通过增加细胞对梭菌神经毒素多肽的特异性摄取来有利地改善基于细胞的效力测定。同时，可观察到细胞对所述神经毒素或其降解产物的非特异性摄取减少。

本领域已经描述了多种测定神经毒素多肽的生物活性的测定法，诸如轻链测定法(ELISA)、内肽酶-MS、FRET、HPLC-UPLC、DARET，或使用例如SH-SY5Y或Neuro2a细胞、鸡胚胎神经元、来自脊髓或背根神经节的原代神经元(Pellett et al.(2011)，Biochem.Biophys.Res.Commun.404，388392(Pellett等人，2011年，《生物化学与生物物理研究通讯》，第404卷，第388-392页))、依赖于蛋白质印迹法读数的胚胎干细胞衍生神经元(Whitemarsh et al.(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35(Whitemarsh等人，2012年，《毒理学》，第126卷，第426-435页))或分化的人成神经细胞瘤SiMa细胞的基于细胞的测定法；参见例如Fernández-Salas，E.et al.，(2012).PLoS One 7(11)(Fernández-Salas，E.等人，2012年，《公共科学图书馆·综合》，第7卷，第11期)。

在第二方面，本发明提供了一种用于直接测定细胞中神经毒素多肽的生物活性的方法，该方法包括：

a)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽一起孵育一段时间，该孵育包括以下步骤中的至少一个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞；

b)固定细胞，并且任选地用洗涤剂透化细胞；

c)使细胞与至少一种特异性结合未裂解底物和神经毒素裂解底物的第一捕获抗体和至少一种特异性结合神经毒素裂解底物的裂解位点的第二捕获抗体在允许所述捕获抗体与所述底物结合的条件下接触；

d)使细胞与至少一种特异性结合第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第一检测复合物，并且使细胞与至少一种特异性结合第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第二检测复合物；

e)测定步骤d)中的第一检测复合物和第二检测复合物的量；以及

f)利用第二检测复合物，计算在所述细胞中被所述神经毒素多肽裂解的底物的量，从而测定所述细胞中所述神经毒素多肽的生物活性。

优选地，该方法为体外方法。本发明的该方法允许直接测定细胞中神经毒素多肽的生物活性。如在本领域所述的方法中，这意味着不再需要裂解细胞并且不再需要从细胞裂解物中分离或浓缩裂解的神经毒素底物。例如，在本领域的基于蛋白质印迹分析的测定法中，通过分离和浓缩SDS聚丙烯酰胺凝胶中各个样品的组分来浓缩神经毒素底物。在本领域所述的ECL夹心ELISA法中，通过使用抗体来进行神经毒素底物的浓缩，该抗体在加入了细胞裂解物的微量滴定板上与裂解的神经毒素底物特异性结合。该裂解的神经毒素底物通过与所述抗体的结合从裂解物中分离，从而使得所述裂解的梭菌神经毒素底物浓缩。

相比之下，在本发明的方法中，可直接在细胞中检测裂解的神经毒素底物，例如SNAP 25。为此，在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将如本文别处更详细地定义的对神经毒素中毒敏感的细胞与神经毒素多肽一起孵育一段时间。该孵育包括K⁺介导的细胞去极化，减少神经毒素多肽的暴露时间和/或在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞，如本文别处所述。这些措施增强了神经毒素的特异性细胞摄取，同时减少了细胞对神经毒素或降解产物的非特异性摄取。在下一步骤中，例如通过加入固定剂如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或所述固定剂的混合物，固定细胞。任选地，可通过使用至少一种洗涤剂如Triton X-100、Tween 20、皂素、洋地黄皂苷或正辛基-β-吡喃葡萄糖苷使细胞透化。洗涤剂可包含在适当的缓冲液(诸如PBS)中。然后，使细胞与至少一种特异性结合未裂解底物和神经毒素裂解底物的第一捕获抗体和至少一种特异性结合神经毒素裂解底物的裂解位点的第二捕获抗体在允许所述捕获抗体与所述底物结合的条件下接触。在此，通过与同时存在于未裂解的神经毒素底物和经神经毒素裂解的神经毒素底物中的适当表位特异性结合，第一捕获抗体能够测定细胞中神经毒素底物的总含量或量。例如通过与神经毒素底物中的神经毒素裂解位点特异性结合，第二捕获抗体识别并特异性结合仅存在于经裂解的神经毒素底物中的表位。另选地，可使细胞与所述第一捕获抗体和第二捕获抗体的混合物接触，即在所述条件下，使细胞同时与至少一种第一捕获抗体和至少一种第二捕获抗体接触。在下一步骤中，使细胞与至少一种特异性结合第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第一检测复合物。在随后的步骤中，使细胞与至少一种特异性结合第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第二检测复合物。另选地，可使细胞与所述第一检测抗体和第二检测抗体的混合物接触，即在所述条件下，使细胞同时与至少一种第一检测抗体和至少一种第二检测抗体接触。另选地，在细胞透化后，在所述条件下，使细胞同时与所述第一捕获抗体和第二捕获抗体以及所述第一检测抗体和第二检测抗体的混合物接触。在下一步骤中，测定第一检测复合物和第二检测复合物的量。最后，利用第二检测复合物，计算在所述细胞中被所述神经毒素多肽裂解的底物的量。从而，直接在所述细胞中测定所述神经毒素多肽的生物活性。

在下文中对本发明的方法进行了进一步详细说明。为进行细胞培养，首先将如本文所定义的对神经毒素中毒敏感的细胞诸如神经元细胞、SiMa细胞或iPS衍生神经元接种在96孔微量滴定板中。例如根据WO 2010/105234所公开的方法，将SiMa细胞分化成神经元表型，并且例如根据WO 2012/135621所述的测定法，将iPS衍生神经元分化成神经元表型。然后，在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将细胞与神经毒素多肽诸如BoNT/A一起孵育一段时间。该孵育包括K⁺介导的细胞去极化、减少神经毒素多肽的暴露时间和/或在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞，如本文别处所述。

在后续步骤中，将细胞固定在微量滴定板中，然后进行ELISA测定。为固定细胞，例如可将冰冻甲醇(-20℃)加入细胞中，在-20℃下孵育20分钟。

为进行ELISA测定，首先洗涤细胞。作为洗涤缓冲液，可使用例如含0.1％TritonX-100的10mM PBS缓冲液(pH 7.4)。然后，使用淬灭缓冲液诸如含0.6％H₂O₂的10mM PBS(pH7.4)淬灭内源性蛋白酶，然后进行另一洗涤步骤。在接下来的步骤中，使用适当的封闭缓冲液例如含2％BSA的10mM PBS缓冲液(pH 7.4)和0.05％Triton X-100，封闭微量滴定板上的自由结合位点。然后，通过使用合适的洗涤剂使细胞透化。作为透化缓冲液，可使用例如含0.5％Triton X-100的10mM PBS缓冲液。透化作用允许抗体通过细胞中形成的孔进行扩散。然后，如上所述用洗涤缓冲液洗涤细胞。

在下一步骤中，将透化细胞与例如两种不同抗体的混合物一起孵育。该混合物包含特异性结合未裂解底物和神经毒素裂解底物的第一捕获抗体和特异性结合神经毒素裂解底物的裂解位点的第二捕获抗体。所述第一捕获抗体和第二捕获抗体也可依次施用。例如，第一捕获抗体可特异性结合未裂解的和神经毒素裂解的SNAP 25两者，从而允许对细胞中SNAP-25的总量或含量进行定量。此外，在评估时，该第一捕获抗体可用于细胞中裂解的SNAP 25的量的归一化。第二捕获抗体特异性结合神经毒素裂解底物的裂解位点，从而允许对裂解的神经毒素底物诸如BoNT/A-裂解的SNAP 25进行测定和检测。

在本发明的方法中，总的神经毒素底物和神经毒素裂解的神经毒素底物的后续检测可直接在微量滴定板或细胞培养皿上(即，细胞中)进行。因此，有利的是，如同本领域所述的方法，在本发明的方法中不需要制备细胞提取物并且不需要从细胞裂解物中分离和/或浓缩神经毒素底物。然后，洗涤细胞以去除未结合到相应抗原的多余抗体。在后续步骤中，使透化的细胞与至少一种第一检测抗体和至少一种第二检测抗体接触。所述抗体可作为混合物(即，同时)或依次施用。第一检测抗体特异性结合第一捕获抗体。从而形成第一检测复合物。第一检测抗体可靶向第一捕获抗体所源自的物种。例如，在兔多克隆抗SNAP 25抗体S9684(西格玛公司(Sigma))用作特异性结合未裂解的和BoNT/A裂解的底物SNAP-25的第一捕获抗体的情况下，抗兔碱性磷酸酶缀合抗体可用作第一检测抗体。第二检测抗体特异性结合第二捕获抗体。从而形成第二检测复合物。第二检测抗体可靶向第二捕获抗体所源自的物种。例如，在WO 2014/207109中所述的小鼠单克隆抗体(mAb)20-2-5用作特异性结合BoNT/A裂解的SNAP-25的第二捕获抗体的情况下，抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合抗体可用作第二检测抗体。对于本领域技术人员而言显而易见的是，如本发明的方法所用，第一检测抗体和第二检测抗体与不同的酶缀合，以允许对相应的第一捕获抗体和第二捕获抗体进行特异性检测。例如，如本文别处所述的基于HRP的检测可用于BoNT/A裂解的SNAP 25，而基于碱性磷酸酶的检测可用于总的(BoNT/A裂解和未裂解)SNAP 25。然后，再次洗涤细胞。在后续步骤中，向细胞中加入荧光HRP底物。作为HRP底物，可使用例如Amplex UltraRed(英杰公司(Invitrogen))，其激发波长为540nm且发射波长为600nm。与HRP底物一起进行孵育的时间足以在辣根过氧化物酶的作用下使底物充分转化。用HRP底物孵育后，例如，可向HRP底物中加入AP底物DiFMUP(6，8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸盐；激发波长为360nm，发射波长为450nm)，然后将细胞与所述两种底物的混合物一起孵育。与所述AP底物一起进行孵育的时间允许在碱性磷酸酶的作用下使底物充分转化。如本领域所知，根据检测限的定义，底物必须以足够的量进行转化，使得测得的信号至少与空白的平均值加上该平均值的三倍标准偏差一样高。检测限可如文献所述来测定，参见例如Armbruster and Pry，ClinicalBiochem.Rev.2008，29(Supplement 1)：S49-S52(Armbruster和Pry，《临床生物化学评论》，2008年，第29卷(增刊1)，第S49-S52页)。由于碱性磷酸酶的pH最佳值在碱性区域中，因此对应的底物缓冲液是强碱性的。如果将碱性磷酸酶底物加入到HRP底物中，辣根过氧化物酶的反应因碱性pH而停止，而碱性磷酸酶将转化DiFMUP。转化的HRP底物不受碱性pH的影响。最后，如下所述测量两种底物的荧光值：

Amplex UltraRed：激发波长为540nm；发射波长为600nm

DiFMUP：激发波长为360nm；发射波长为450nm

如本领域的技术人员所认识的那样，在本发明的方法中，只有那些显示出所用底物的不同激发/发射波长的荧光底物才适合用于检测第一捕获抗体和第二捕获抗体。只有在这种情况下，它们才允许对每种抗原进行特异性检测，即总的神经毒素底物(例如，未裂解的和神经毒素裂解的SNAP 25)和裂解的神经毒素底物(例如，神经毒素裂解的SNAP 25)。从而，可同时对每个孔或细胞培养皿中的神经毒素底物总含量和裂解的神经毒素底物含量进行定量。有鉴于此，可有利地使本发明的方法自动化。如本文别处所述，可以设想，本发明的方法选用的荧光底物在激发/发射光谱之间表现出足够的位移，以允许对相应底物进行特异性检测。例如，对于HRP底物Amplex和其衍生物以及AP底物DiFMUP而言，该要求得到满足。然而，在最佳情况下，所用的荧光底物的激发/发射光谱之间没有重叠，经验发现，所用的荧光底物的激发光谱的峰面积重叠高达30％是容许的。有关本发明的该方法的进一步细节例如在WO 2014/207109中有所描述。

如本领域技术人员还认识到，本发明的方法允许对细胞中被神经毒素多肽裂解的神经毒素底物直接进行检测和定量，从而测定所述细胞中所述神经毒素多肽的生物活性。有利的是，本发明的方法不需要制备细胞裂解物或提取物并且不需要从细胞裂解物/提取物中分离或浓缩裂解的神经毒素底物，而这对于本领域已知的方法是必需的。因此，这样可以节省样品材料。此外，本发明的方法可减少样品的制备和样品的数量，因为可同时测定样品中总的神经毒素底物的量和裂解的神经毒素底物的量。在本领域所述的测定法中，必须将样品细分，以便将两种抗原(即，总的神经毒素底物和裂解的神经毒素底物)彼此分开检测。本发明的方法不需要对样品进行细分。从而，可避免由样品细分引起的不均匀性，并且可节省样品材料。此外，抗原可在本领域所述的测定法中降解，这可导致裂解的神经毒素底物的检测出错。这是因为，在本领域所述的测定法中，细胞与含洗涤剂的裂解缓冲液一起孵育，而该缓冲液不能使神经毒素多肽或其他内源性蛋白酶失活，从而导致样品在长期储存时神经毒素底物发生降解。由于细胞裂解物在所述测定法中的所需用途，在现有技术中所述的ECL夹心ELISA检测不能使用强效的裂解缓冲液。这是因为，上述抗原的聚集可导致该抗原非特异性地吸附到细胞培养皿或微量滴定板的塑料表面上，继而通过适当的抗体干扰该抗原的检测。由于用于检测抗原的抗体也会与裂解物接触，因此抗体也可能发生聚集。在这种情况下，对抗原的检测将不再可靠和准确。本发明人在使用蛋白质印迹测定法检测本领域所述的神经毒素生物活性时就经历了这种降解反应。当裂解物在-20℃下长时间储存时，经发现，相比于新鲜的裂解样品，由于在冷冻期间的降解过程，总SNAP-25的检测信号显著降低，并且裂解的神经毒素底物SNAP 25与未裂解的神经毒素底物SNAP 25的比例发生了变化。本发明人已经发现，由于神经毒素底物和神经毒素或其他内源性蛋白酶通过在细胞培养皿上的聚集立即失活，因此可通过将细胞直接固定在细胞培养皿中来避免神经毒素底物的降解和/或样品的不稳定性。这可通过使用以下方式来实现，例如用甲醇或本领域已知的其他固色剂或固定剂诸如乙醇、丙酮、甲醛或它们的混合物或本文所述的其他固定剂来固定细胞。使用该固定方法分析例如亲本SiMa细胞(人成神经细胞瘤细胞；DSMZ编号：ACC164)和iPS衍生神经元(Whitemarsh et al.(2012)，Toxicol.Sci.126，426-35(Whitemarsh等人，2012年，《毒理学》，第126卷，第426-435页))的稳定性，未在新鲜的细胞培养皿和在冰箱中储存了七天的细胞培养皿之间发现差异。

在本发明的方法中可用作第一捕获抗体的特异性结合未裂解底物和神经毒素裂解底物的合适抗体涵盖例如兔多克隆抗SNAP-25抗体S9684(西格玛公司(Sigma))、兔多克隆抗SNAP25抗体PA5-19708(Pierce Antibodies公司)、兔多克隆抗SNAP25抗体PA5-19701(Pierce Antibodies公司)或兔单克隆抗SNAP25抗体ab108990(艾博抗公司(Abcam))。

在本发明的方法中可用作第二捕获抗体的特异性结合神经毒素裂解底物的裂解位点的适当抗体包括例如小鼠单克隆抗体克隆20-2-5(WO 2014/207109)、EP 14199282.6中所述的小鼠单克隆抗体、小鼠单克隆抗体MC-6053(克隆4F3-2C1，R&D Systems公司)、MAB4733(亚诺法公司(Abnova))、orb26633(Biorbyt公司)或GWB-T00279(Genway公司)。

可用作第一检测抗体和第二检测抗体的合适检测抗体是本领域已知的。例如，第一检测抗体可以是碱性磷酸酶(AP)缀合抗体、辣根过氧化物酶(HRP)缀合抗体或与荧光染料缀合的抗体。作为第二检测抗体，可使用例如碱性磷酸酶(AP)缀合抗体、辣根过氧化物酶(HRP)缀合抗体、葡萄糖氧化酶缀合抗体、酪氨酸酶缀合抗体或β-半乳糖苷酶抗体。优选地，当用于本发明的方法中时，第一检测抗体和第二检测抗体彼此不同。

如本文所用，除非上下文另外明确规定，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括单数指代和复数指代两者。举例来说，“一个细胞”是指一个或多个细胞。

如本文所用，在对所述项、数量、百分比或术语的值进行限定时，术语“约”是指所述项、数量、百分比或术语的值的正负10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或0％的范围。优选地为正负10％的范围。

如本文所用，术语“包括”和“由…构成”与“包含”或“含有”同义，是包容性的或开放式的，并且不排除另外的未述及的构件、要素或方法步骤。显然，术语“包括”涵盖术语“由…组成”。更具体地，如本文所用的术语“包括”意指权利要求涵盖所有列出的要素或方法步骤，但也可包括另外的未提及的要素或方法步骤。例如，包括步骤a)、b)和c)的方法狭义上涵盖由步骤a)、b)和c)组成的方法。短语“由…组成”意指组合物(或设备或方法)具有述及的要素(或步骤)，而不包括更多。相比之下，术语“包括”也可涵盖包括除步骤a)、b)和c)以外的另外的步骤如步骤d)和e)的方法。

在本文中使用数值范围诸如“以介于1和5微摩尔之间的浓度”的情况下，该范围不仅包括1和5微摩尔，还包括介于1和5微摩尔之间的任何数值，例如2、3和4微摩尔。

如本文所用的术语“体外”表示在动物或人体的外面或外部。如本文所用的术语“体外”应当理解为包括“离体”。术语“离体”通常是指从动物或人体移取组织或细胞，并在体外例如在培养容器中维持或繁殖。如本文所用的术语“体内”表示在动物或人体的里面或内部。

在本发明的方法的又一方面，K⁺介导的细胞去极化在另外的约20mM至约55mM的K⁺浓度下进行至少2小时。

通常，本领域所用的细胞培养基包含5mM K⁺。因此，本发明方法中的K⁺最终浓度优选地介于约25mM和约60mM K⁺之间。

在本发明的方法的又一方面，K⁺介导的细胞去极化和/或神经毒素多肽的暴露在存在GT1b的情况下进行。

在本发明的方法的另一方面，GT1b以介于15和50μM之间，优选地20μM的浓度使用。

在本发明的方法的又一方面，减少神经毒素多肽的暴露时间为使细胞暴露于神经毒素多肽至少24小时且小于96小时，优选地至少48小时且最多72小时。

在本发明的方法的又一方面，通过磁力搅拌器或旋转瓶或者摇动细胞来实现神经毒素多肽暴露期间的细胞搅动。在适当的细胞培养基流率下搅动细胞，优选地平均培养基流率为约25cm/min至约300cm/min，更优选地为约25cm/min至约150cm/min。

在本发明的方法的又一方面，在存在20μM GT1b和神经毒素多肽的情况下，使K⁺介导的细胞去极化在另外的至少约20mM至约55mM的K⁺浓度下进行至少2小时，之后在搅动下使神经毒素多肽的暴露持续另外70小时。

在本发明的方法的又一方面，没有神经毒素多肽情况下的孵育时间先于神经毒素多肽的暴露。

在本发明的方法的又一方面，没有神经毒素多肽情况下的孵育时间介于16和48小时之间。

在本发明的方法的又一方面，该方法为荧光方法。

在本发明的方法的又一方面，神经毒素多肽为BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT、或者它们的亚型，如本文别处所定义。

在本发明的方法的又一方面，底物为VAMP/小突触泡蛋白、SNAP-25或突触融合蛋白。

在本发明的方法的又一方面，细胞为选自下列的神经元细胞或神经元分化细胞：原代神经元细胞；能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞，诸如成神经细胞瘤细胞；P19细胞或诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元。

附图说明：

图1：应激药物产品样品的活性损失动力学。将包含BoNT/A的药物产品样品在70℃下储存长达4周。在0、1、2和4周后抽取样品，并通过小鼠LD₅₀生物测定法以及采用不同方案的基于细胞的测定法(CBA)进行分析。x轴表示以周为单位的储存时间，而y轴表示相对效力。起始点的效力设为100％，连续的测试时间相对于起始点表示。LD₅₀生物测定法得到的值以菱形表示。采用K⁺去极化的基于细胞的测定方案以正方形表示，采用8小时毒素孵育时间加上64小时无毒素孵育时间的方案以三角形表示，而采用在72小时孵育时间期间摇动的方案以圆形表示。未经修改的CBA方案用线条符号表示。总之，图1示出了三种基于细胞的测定法示例的对比，其中应激样品显示出与参照测定法(小鼠LD₅₀生物测定法)相当的衰减动力学。

现在将通过下面的实施例来说明本发明，但这些实施例不应被解释为对本发明的范围的限制。

实施例：

实施例1：基于双荧光细胞的BoNT/A活性ELISA测定法

细胞的固定

1.移除培养基/毒素溶液。加入100μL/孔的冰冻甲醇(-20℃)，并在-20℃下孵育20 分钟。

注意：所有后续步骤在室温下进行。

细胞固定后：

1.移除甲醇溶液，并加入100μL/孔的PBS缓冲液。为进行长期储存(大于1天)，应加入300μL/孔的PBS缓冲液，并用石蜡膜密封平板。平板应储存在冰箱中。

2.移除PBS缓冲液，并用200μL/孔的PBS缓冲液洗涤细胞3次。每一步应在轻微摇动下进行1分钟。

3.移除PBS缓冲液，并加入100μL/孔的淬灭缓冲液，在轻微摇动下孵育20分钟。

4.移除淬灭缓冲液，在轻微摇动下用300μL/孔的PBS缓冲液洗涤细胞一次，持续3分钟。

5.移除PBS缓冲液，并加入200μL/孔的封闭缓冲液，然后在轻微摇动下孵育1小时。

6.移除封闭缓冲液，并向每个孔加入100μL的一抗混合物(抗体稀释于封闭缓冲液中)。在轻微摇动下孵育过夜(16-18h)。将细胞与两种一抗同时孵育：对BoNT/A裂解的SNAP-25具有特异性的小鼠抗体和识别SNAP-25的多克隆兔抗体(用于测定SNAP 25总量以进行归一化的抗体)。

7.移除一抗混合物，并用200μL PBS缓冲液洗涤细胞4次。每一步应在轻微摇动下进行3分钟。

8.移除PBS缓冲液，并向每个孔加入100μL的二抗混合物：将HRP缀合的抗小鼠二抗和AP缀合的抗兔二抗(抗体稀释于封闭缓冲液中)加入每个孔中，在轻微摇动下孵育2.5至3小时。

9.移除二抗混合物，并用200μL/孔的PBS缓冲液洗涤细胞5次，随后用300μL/孔的HEPES缓冲液洗涤一次。每个洗涤步骤应在轻微摇动下进行3分钟。

10.移除平板中的HEPES缓冲液，并向每个孔加入75μL辣根过氧化物酶的荧光底物(HRP底物)。在轻微摇动下孵育50分钟。使平板避免阳光直射。

11.向每个孔加入75μL碱性磷酸酶的荧光底物(AP底物)，并在轻微摇动下再孵育50分钟。使平板避免阳光直射。

12.用荧光读板仪读取平板：

激发波长为540nm；发射波长为600nm。

激发波长为360nm；发射波长为450nm。

13.计算

对于归一化，将每个孔中裂解的SNAP-25的RFU值(600nm处的荧光)归一化为总SNAP-25的RFU值(450nm)。为了更好地说明图中的RFU值，使用以下公式将所有值都乘以系数1000：

随后，对于每个标准品或样品，对所得的RFU值求平均值。

试剂制备

PBS缓冲液(10mM)：

磷酸盐缓冲盐水(西格玛公司(Sigma)，#P5368)(pH 7.4)

淬灭缓冲液：

含0.6％H₂O₂的10mM PBS缓冲液(pH 7.4)

封闭缓冲液：

含2％BSA的10mM PBS缓冲液(pH 7.4)+0.05％Triton X-100

HEPES缓冲液：

50mM HEPES(pH 7.4)

HRP底物：

50mM HEPES(pH 7.4)

0.007％H2O2

150pM Amplex UltraRed

AP底物：

25mM二乙醇胺(pH 9.8)

2mM MgCl₂

100μL M DiFMUP

实施例2：增强细胞对梭菌神经毒素多肽的特异性摄取

a)将来自4个不同细胞批次的神经元解冻，并根据细胞动力学国际公司(CDI)用户手册在96孔板上铺板。铺板24小时(h)后，如用户手册所述，将培养基替换为新鲜的保持培养基。

在另外的72h孵育时间后，移除培养基并替换为新鲜的含不同浓度的BoNT/A和总浓度为30mM的K⁺离子(即，与原本的培养基相比增加了25mM另外的K⁺)培养基。2小时后，移除该高K⁺培养基，并向细胞中加入含不同浓度的BoNT/A的新鲜培养基。

再过70h后，吸出培养基，如实施例1所述固定细胞并进行ELISA读数。该方案的结果在图1中以正方形表示。

b)将来自4个不同细胞批次的神经元解冻，并根据细胞动力学国际公司(CDI)用户手册在96孔板上铺板。铺板24小时(h)后，如用户手册所述，将培养基替换为新鲜的保持培养基。

在另外的72h孵育时间之后，移除培养基并替换为新鲜的含不同浓度的BoNT/A的培养基。8小时后，移除该含BoNT/A的培养基，并向细胞中加入不含BoNT/A的新鲜培养基。

再过64h后，吸出培养基，如实施例1所述固定细胞并进行ELISA读数。该方案的结果在图1中以三角形表示。

c)将来自4个不同细胞批次的神经元解冻，并根据细胞动力学国际公司(CDI)用户手册在96孔板上铺板。铺板24小时(h)后，如用户手册所述，将培养基替换为新鲜的保持培养基。

在另外的72h孵育时间之后，移除培养基并替换为新鲜的含不同浓度的BoNT/A的培养基。将细胞置于培养箱中的平板摇动器上，并在毒素暴露期间以300cm/min的平均流率摇动。

再过72h后，吸出培养基，如实施例1所述固定细胞并进行ELISA读数。该方案的结果在图1中以圆形表示。

d)将来自4个不同细胞批次的神经元解冻，并根据细胞动力学国际公司(CDI)用户手册在96孔板上铺板。铺板24小时(h)后，如用户手册所述，将培养基替换为新鲜的保持培养基。

在另外的72h孵育时间之后，移除培养基并替换为新鲜的含不同浓度的BoNT/A的培养基。

再过72h后，吸出培养基，如实施例1所述固定细胞并进行ELISA读数。该方案的结果在图1中以线条表示。

结论：

总之，当与小鼠LD₅₀生物测定法相比时，K⁺介导的细胞去极化、减少神经毒素多肽的暴露时间或在神经毒素多肽暴露期间搅动细胞实现了相当的稳定性，指示实施例1的基于细胞的测定法具有相当的动力学。

Claims

1.一种用于增强细胞对神经毒素多肽的特异性摄取的方法，所述方法包括：

在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将对神经毒素中毒敏感的细胞与所述神经毒素多肽一起孵育一段时间，所述孵育包括以下步骤中的至少两个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动所述细胞，从而增强所述细胞对所述神经毒素多肽的特异性摄取。

2.根据权利要求1所述的方法，之后测定所述细胞中所述神经毒素多肽的生物活性。

3.一种用于直接测定细胞中神经毒素多肽的生物活性的方法，包括：

a)在允许神经毒素多肽发挥其生物活性的条件下，将对神经毒素中毒敏感的细胞与所述神经毒素多肽一起孵育一段时间，所述孵育包括以下步骤中的至少两个：(i)K⁺介导的细胞去极化，(ii)减少神经毒素多肽的暴露时间和/或(iii)在神经毒素多肽暴露期间搅动所述细胞；

b)固定所述细胞，并且任选地用洗涤剂透化所述细胞；

c)使所述细胞与至少一种特异性结合未裂解底物和神经毒素裂解底物的第一捕获抗体和至少一种特异性结合神经毒素裂解底物的裂解位点的第二捕获抗体在允许所述捕获抗体与所述底物结合的条件下接触；

d)使所述细胞与至少一种特异性结合所述第一捕获抗体的第一检测抗体在允许所述第一检测抗体与所述第一捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第一检测复合物，并且使所述细胞与至少一种特异性结合所述第二捕获抗体的第二检测抗体在允许所述第二检测抗体与所述第二捕获抗体结合的条件下接触，从而形成第二检测复合物；

f)利用所述第二检测复合物，计算在所述细胞中被所述神经毒素多肽裂解的底物的量，从而测定所述细胞中所述神经毒素多肽的生物活性。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述K⁺介导的细胞去极化在另外的约20mM至约55mM的K⁺浓度下进行至少2小时。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述K⁺介导的细胞去极化和/或所述神经毒素多肽的暴露在存在GT1b的情况下进行。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中GT1b以介于15和50μM之间，优选地20μM的浓度使用。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述减少神经毒素多肽的暴露时间为使所述细胞暴露于所述神经毒素多肽至少24小时且小于96小时，优选地至少48小时且最多72小时。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中在神经毒素多肽暴露期间搅动所述细胞以磁力搅拌器、旋转瓶或者通过摇动器摇动细胞，优选地在约25cm/min至约300cm/min的平均培养基流率下进行。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中在存在20μM GT1b和神经毒素多肽的情况下，使所述K⁺介导的细胞去极化在另外的至少约20mM至约55mM的K⁺浓度下进行至少2小时，之后在搅动下使神经毒素多肽的暴露持续另外70小时。

10.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中没有神经毒素多肽情况下的孵育时间先于所述神经毒素多肽的暴露。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述没有神经毒素多肽情况下的孵育时间介于16和48小时之间。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述方法为荧光方法。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述神经毒素多肽为BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、TeNT、或者它们的亚型。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述底物为VAMP/小突触泡蛋白、SNAP-25或突触融合蛋白。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述细胞为选自下列的神经元细胞或神经元分化细胞：原代神经元细胞；能够分化成神经元细胞的肿瘤细胞，诸如成神经细胞瘤细胞；P19细胞或诱导多能干细胞(IPS)衍生的神经元。