TW201639875A - 用於增進肉毒桿菌神經毒素進入細胞之特定攝取的方法 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種用於增進神經毒素多胜肽進入細胞之特定攝取的方法,該方法包含:在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽培育一時間,該培育包含下列步驟中至少一者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露(exposition)時間,及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞,從而增進該神經毒素多胜肽進入該細胞之特定攝取。此外,本發明有關一種用於直接在細胞中測定一神經毒素多胜肽之生物活性的方法,其包含:a)在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽培育一時間,該培育包含下列步驟中至少一者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞;b)固定該細胞,且任選地以一清潔劑透化(permeabilizing)該細胞;c)將該細胞與特異性結合至該無切割及經神經毒素切割受質之至少一第一捕捉抗體,及特異性結合至該經神經毒素切割受質之切割位點的至少一第二捕捉抗體,在允許該等捕捉抗體結合到該受質之條件下接觸;d)將該等細胞於允許該第一偵測抗體結合至該第一捕捉抗體的條件下,與特異性結合至該第一捕捉抗體之至少一第一偵測抗體接觸,由此形成第一偵測複合物,並於允許該第二偵測抗體結合至該第二捕捉抗體的條件下,與特異性結合至該第二捕捉抗體之至少一第二偵測抗體接觸,由此形成第二偵測複合物;e)測定步驟d)之第一與第二偵測複合物的數量;及f)藉助於該第二偵測複合物,計算在該細胞中由該神經毒素多胜肽所切割的受質數量,從而測定該神經毒素多胜肽在該細胞中之生物活性。
Description
本發明提供一種用於增進神經毒素多胜肽進入細胞之特定攝取的方法,該方法包含:在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽培育一時間,該培育包含下列步驟中至少一者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露(exposition)時間,及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞,從而增進該神經毒素多胜肽進入該細胞之特定攝取。此外,本發明有關一種用於直接在細胞中測定一神經毒素多胜肽之生物活性的方法,其包含:a)在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽培育一時間,該培育包含下列步驟中至少一者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞;b)固定該細胞,且任選地以一清潔劑透化(permeabilizing)該細胞;c)將該細胞與特異性結合至該無切割及經神經毒素切割受質之至
少一第一捕捉抗體,及特異性結合至該經神經毒素切割受質之切割位點的至少一第二捕捉抗體,在允許該等捕捉抗體結合到該受質之條件下接觸;d)將該等細胞於允許該第一偵測抗體結合至該第一捕捉抗體的條件下,與特異性結合至該第一捕捉抗體之至少一第一偵測抗體接觸,由此形成第一偵測複合物,並於允許該第二偵測抗體結合至該第二捕捉抗體的條件下,與特異性結合至該第二捕捉抗體之至少一第二偵測抗體接觸,由此形成第二偵測複合物;e)測定步驟d)之第一與第二偵測複合物的數量;及f)藉助於該第二偵測複合物,計算在該細胞中由該神經毒素多胜肽所切割的受質數量,從而測定該神經毒素多胜肽在該細胞中之生物活性。
肉毒梭狀芽抱桿菌(Clostridium botulinum)與破傷風梭狀芽孢桿菌(Clostridium tetani)產生強效的神經毒素,亦即分別為肉毒桿菌毒素(BoNTs)及破傷風毒素(TeNT)。這些梭狀芽孢桿菌神經毒素(CNTs)特異性地結合至神經細胞並破壞神經傳導物質的釋放。每一毒素係以一非活化、未經加工、大約150kDa的單鏈蛋白質合成。該轉譯後加工涉及到雙硫鍵的形成、及藉由細菌蛋白酶(等)的有限蛋白質水解(切口)。活化的神經毒素由兩個鏈組成,一大約50kDa的N-末端輕鏈,及一大約100kDa的重鏈,該兩鏈係由一雙硫鍵鏈接。CNTs由三個結構域結構
地與功能地組成,亦即該催化性輕鏈、含括該易位(translocation)結構域(N末端半部)及該受體結合結構域(C末端半部)之重鏈;參閱,例如,Krieglstein之”1990,Eur.J.Biochem.188,39”;Krieglstein之”1991,Eur.J.Biochem.202,41”;Krieglstein之”1994,J.Protein Chem.13,49”。該肉毒桿菌神經毒素係以包含該150kDa神經毒素蛋白質與相關的非毒性蛋白質的分子複合物合成。該複合物大小基於該梭狀芽孢桿菌品系及該區隔的神經毒素血清型而有差異,範圍從300kDa,超過500kDa及900kDa。在這些複合物中的非毒性蛋白質安定該神經毒素並保護其免於降解作用;參閱Silberstein之”2004,Pain Practice 4,S19-S26”。
肉毒梭狀芽孢桿菌分泌7種抗原性區隔的血清型,命名為肉毒桿菌神經毒素A至G(BoNT/A-BoNT/G)。所有血清型連同由破傷風梭狀芽孢桿菌分泌的相關破傷風神經毒素(TeNT)係為Zn2+-內切蛋白酶,該者藉由切割SNARE蛋白質阻斷突觸胞釋作用;參閱Couesnon之”2006,Microbiology,152,759”。CNTs造成在肉毒症與破傷風中看到的弛緩性肌肉麻痺;參閱Fischer 2007,PNAS 104,10447。近來,一種新的肉毒桿菌毒素類型,亦即BoNT/H,已被辨識;參閱Barash及Arnon之”J.Infect.Dis.(2014),209(2):183 191”,及Dover、Barash、Hill、Xie及Arnon之”J.Infect.Dis.(2014),209(2):192-202”。
儘管其之毒性效應,肉毒桿菌毒素複合物在大量疾病中已使用做為醫療劑。肉毒桿菌毒素血清型A於
1989年在美國被批准用於人類用途,以治療斜視、眼瞼痙攣及其他病症。舉例而言,在商標名BOTOX(Allergan Inc)下或在商標名DYSPORT/RELOXIN(Ipsen Ltd)下,其係以肉毒桿菌毒素A(BoNT/A)蛋白質製劑而購得。一種改良、無複合物的肉毒桿菌毒素A型製劑係於商標名XEOMIN(Merz Pharma GmbH & Co.KGaA)下購得。針對醫療應用,該製劑係直接注射至待治療的肌肉內。在生理pH時,毒素係從該蛋白複合物中釋出,並產生所欲的藥理效果。肉毒桿菌毒素的效果僅僅為暫時的,這是為什麼要求重複施打肉毒桿菌毒素以維持一醫療效果的原因。
該梭狀芽孢桿菌神經毒素削弱隨意肌的肌力,並為斜視、包括頸肌張力不全症的局部肌張力不全症、及良性自發性眼瞼痙攣的有效療法。其等已進一步顯示紓解面肌痙攣及局部痙攣,再者,在廣泛範圍的適應症中為有效的,諸如腸胃病症、多汗症及美容除皺;參閱Jost之”2007,Drugs 67,669”。
在梭狀芽孢桿菌神經毒素之生產製程期間,該神經毒素之定性與定量測定以及該生物活化神經毒素多胜肽的品質管制係特別重要。此外,政府機關僅接受簡單、可靠及經驗證的肉毒桿菌毒素活性檢測。目前,小鼠LD50生物檢測法,一種致死性試驗,依舊為製藥廠商用來分析其製劑之效力的”黃金準則”;參閱Arnon等人於v(2001),JAMA 285,1059-1070”。然而,近年來,大量努力已投入,用於尋求替代方法,以減輕對動物試驗的需求,並減
輕關聯於此類型動物式檢測的所有缺點、成本及道德考量。此外,主管機構也促使製藥公司在測試肉毒桿菌神經毒素效力時,採取”3R”原則:”減量、精確、代替”;參閱Straughan於”Altern.Lab.Anim.(2006),34,305-313”。因此,細胞式測試系統已經研發,以提供對使用活動物式方法的合理替代。然而,截至目前為止,用於測定神經毒素生物活性的細胞測試系統中,僅有三種對於神經毒素多胜肽顯示充分的靈敏。這些細胞式測試系統包括使用從囓齒動物胚胎所分離及在體外分化的初代神經元(Pellett等人於(2011)之”Biochem.Biophys.Res.Commun.404,388-392”);誘發型多能性幹細胞所分化的神經元(Whitemarsh等人於”(2012),Toxicol.Sci.126,426-35”);及SiMa細胞株的次選殖株(WO 2010/105234 A1)。
然而,初代神經元的分離要求殺死動物,且為費力又費時的。進一步,使用不同初代神經元的測試系統顯示大幅的變異。類似地,分化為神經元的誘發型多能性幹細胞的生成係困難與費時的。此外,此等細胞的儲存也是個問題。使用腫瘤細胞株之檢測對於BoNT常常是不夠靈敏的。再者,對於該等腫瘤細胞株,複雜的分化程序係要求的,該者引致使用該等細胞株之檢測的大幅變異及/或高失敗率。
鑑於上文,用於測定神經毒素多胜肽活性的進一步測試系統為高度所欲的。
由此,本發明所面臨的技術問題可能視為提供與前述提及需求相符的手段及方法。該技術問題係由在該等申請專利範圍及本文以下中所表徵的實施例等所解決。
在一第一層面中,本發明有關一種用於增進神經毒素多胜肽進入細胞之特定攝取的方法,該方法包含:在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽培育一時間,該培育包含下列步驟中至少一者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞,從而增進該神經毒素多胜肽進入該細胞之特定攝取。較佳地,此方法係為一體外方法。
梭狀芽抱桿菌神經毒素多胜肽在該突觸末端內作用,以阻斷神經傳導物質的釋放。該神經毒素藉由結合至一神經元膜受體進入神經元,被攝取進入一似核內體(endosome)的隔室,並經由pH依賴性易位過程穿透該核內體膜。一但在該突觸細胞質之中,該梭狀芽孢桿菌神經毒素切割其對應的SNARE蛋白質受質,該者係為突觸囊泡融合所要求的。
更具體地,梭狀芽孢桿菌神經毒素其特徵在於它們特異性地抑制的來自突觸前神經末梢之神經傳導物質的分泌。對於週邊神經元的選擇性係藉由不同受體,諸如
SV2與GT1b之識別而介導。舉例而言,該BoNT/A進入突觸前神經末端的特定攝取係為一嚴密控制的多步驟過程,該等過程涉及高與低親和力受體的組合。結合至該神經節苷脂GT1b介導一初始的結合步驟,並經由此濃縮細胞表面上的BoNT/A。一旦在該膜中錨定,在該原生質膜內的橫向移動促進BoNT/A與額外(蛋白質)受體,諸如SV2或FGFR3,的分子間交互作用。針對BoNT/A的受體,係為在該受體結合結構域之C-末端部分內具一結合口袋(binding pocket)的神經節苷脂GT1b。按照APR受體模式,一突觸前受體的配置(APRs),聚集在突觸前膜之微結構域中,係負責包括BoNT/A之神經毒素的特定攝取。其係為與神經節苷脂GT1b的結合介導了細胞表面上的BoNT/A之初始結合步驟及濃縮。一旦在膜中錨定,在該原生質膜內的橫向移動促進BoNT/A與蛋白質受體的分子間交互作用,蛋白質受體包括突觸囊泡(SV)醣蛋白2之三種同功型,SV2A(ENSG00000159164)、B(ENSG00000185518)與C,其等在突觸囊泡融合至該突觸前膜後在該外原生質膜上露出。BoNT/A特異性地識別SV2之第四管腔(luminal)結構域(LD4)。在該BoNT/A結合結構域中與SV2交互作用的特定序列尚未辨識的。經醣化SV2A、B與C亦已被辨識為BoNT/F的受體,而經醣化SV2A與B已被辨識為BoNT/E的受體。BoNT/D被報導經由兩個神經節苷脂結合位點進入神經元,一個位點在先前於BoNT/A、B、E、F與G中辨識的位置,而另一個位點類似TeNT之該第二神經節苷脂結
合口袋。近來,BoNT/D亦已顯示使用SV2(所有三種同功型)以進入海馬神經元,但BoNT/D經由與BoNT/A與BoNT/E區隔的機制結合SV2。SV2A與SV2B亦已被報導介導TeNT之結合與進入中樞神經元;參閱Jacky等人之”PLoSPathog.2013 May;9(5):e1003369”,及其中引用之文獻。
該神經毒素之生理作用係基於在該受體結合之後的該SNARE複合物之一蛋白質的切割作用,及該神經毒素輕鏈的易位作用。該梭狀芽孢桿菌神經毒素之生物活性的測定在該神經毒素蛋白質之表徵中為一重要的層面,且,除其他外,對含有梭狀芽孢桿菌神經毒素產品的許可係由主管機關所要求的。對於梭狀芽孢桿菌神經毒素生物活性測量的一可靠測試因此係為研究、開發及營銷含有梭狀芽孢桿菌神經毒素之產品的基礎。更進一步,細胞式測試系統因為道德原因應取代截至目前為止為主的動物試驗。為了建立這種細胞式測試系統,對梭狀芽孢桿菌神經毒素一充分的高靈敏度之神經元細胞或細胞株為必要的。
已經由本發明人有利地發現的是,梭狀芽孢桿菌神經毒素多胜肽之特定攝取進入易受梭狀芽抱桿菌神經毒素毒害的細胞內可以藉由下列步驟中至少一者而提高:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞。同一時間,神經毒素多胜肽或其降解產物之非特定攝取可以藉由這些措施降低的。特別地,該所提及的神經毒素或
其降解產物的非特定細胞攝取係下降的,藉由降低該等細胞與該神經毒素培育的時間段。該K+介導的細胞去極化刺激神經毒素的特定攝取。進一步,緊接著神經毒素毒害後攪動細胞影響相鄰於該神經元膜的生物相濃度,並從而能夠降低神經毒素進入細胞的非特定攝取,以及提高特定攝取。該對應的數據係於下列例子中顯示。進一步,圖1顯示了三個細胞式檢測法之例子的比較,其中該等受壓力試樣對該參照檢測法,小鼠LD50生物檢測法,顯示一可比擬的衰變動力學。
相應地,在本發明之方法的一層面中,該神經毒素多胜肽或其降解產物的非特定細胞攝取係降低的。
本發明亦包含針對受損分子之選擇性,例如因為肉毒桿菌神經毒素安定性儲存招致的降解作用。由於神經傳導物質的釋放係藉由K+介導的去極化誘發,在囊泡再攝取中的接著提高包含藉由結合至像GT1b及/或SV2蛋白質家族成員之受體的特定攝取。一受損分子可能對一受體展現較弱的結合或不結合。該者適用於像震盪的物理影響。受損分子的較不安定結合將藉由震盪甚至再降低的。
為了增進神經毒素多胜肽進入易受神經毒素毒害之細胞的特定攝取,係在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害的細胞與一神經毒素多胜肽培育一段時間。此等時間段及細胞培養條件在該技藝中為已知的。在本發明之方法中,該細胞培養條件包含下列步驟中至少一者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)
一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞。本發明之方法亦可以涵蓋至少兩個提及的步驟,舉例而言,步驟(i)與(ii)、步驟(i)與(iii)、步驟(ii)與(iii),或步驟(i)至(iii)全部三個。其係較佳的是,該細胞培養條件包括下列步驟之每一者,亦即(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞。
通常,在本技藝中於神經毒素活性檢測中使用的細胞培養基含有約5mM之K+。神經元通常藉由從培養基主動運輸K+離子進入細胞內,並從細胞質透過該原生質膜主動運輸Na+至細胞外部而建立離子梯度。其結果為由細胞嚴格地調控的膜電位,且該者係為數種不同細胞過程的基礎,包括細胞間溝通。原生質膜之特定離子滲透性的突然改變或於該膜任一側之離子組成物的快速變更導致稱為去極化的膜電位改變。K+介導的細胞去極化可以在細胞培養基中一提高的K+濃度下實行,舉例而言,一約10mM、20mM、30mM、40mM、50mM或55mM的額外K+濃度。在本發明之方法中,K+之終濃度可以為約15mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM或60mM之K+。K+介導之去極化的時間段係至少約30分鐘、1小時、1個半小時、2小時、2個半小時、3小時或更長的時間。
該K+介導的細胞去極化及/或神經毒素多胜肽曝露可以在神經節苷脂GT1b存在下執行。GT1b可以在約5、
10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、或60μM之一濃度中使用,較佳地約15μM至約50μM之間,更佳地約20μM。
在本技藝中所使用之該神經毒素多胜肽曝露時間通常為約4小時及約96小時之間,經常約72小時。該降低的神經毒素多胜肽曝露時間係為藉由神經毒素多胜肽達至少24小時且小於96小時的細胞毒害,較佳地達至少48小時、至少60小時,且最多72小時。
神經毒素多胜肽曝露期間的細胞攪動可以藉由使用該技藝中已知的工具及方法實行,例如一電磁攪拌器、轉動旋轉式燒瓶,或藉由利用震盪器而震盪該細胞。細胞攪動係於避免從該組織培養瓶脫離該細胞之一適當的細胞培養基流速下執行。該培養基之適合的平均流速為,舉例而言,約25cm/min及約300cm/min之間。
前述提及之K+介導的細胞去極化亦可以於GT1b與神經毒素存在下實行,繼之在攪動下神經毒素多胜肽曝露達一額外的時間段,諸如約24小時、36小時、48小時、60小時或72小時。
其亦設想的是,先於神經毒素多胜肽曝露前,一不具神經毒素多胜肽的培育時間。譬如,該不具神經毒素多胜肽的培育時間可以為約6、12、18、24、30、36、42、48、54或60小時,較佳地約16及約48小時之間。
本發明之方法的進一步較佳實施例可以衍自於下列例子。
如本文所意指,術語”神經毒素多胜肽”或簡短地”神經毒素”或”毒素”表示梭狀芽孢桿菌神經毒素,亦即肉毒梭狀芽孢桿菌與破傷風梭狀芽孢桿菌神經毒素,特別是肉毒桿菌神經毒素(BoNTs)及破傷風神經毒素(TeNT)。更具體地,該術語涵蓋BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H(Barash與Arnon之”J.Infect.Dis.(2014),209(2):183-191”),及破傷風神經毒素(TeNT),以及其等之亞型。舉例而言,BoNT/A之亞型,包括BoNT/A1、BoNT/A2、BoNT/A3、BoNT/A4及BoNT/A5。該BoNT/B亞型涵蓋,譬如,BoNT/B1、BoNT/B2、BoNT/B3、BoNT/B4、BoNT/B5、BoNT/B6、BoNT/B7及BoNT/B8。該BoNT/C亞型包含,例如BoNT/C1-1及BoNT/C1-2。亦為涵蓋的是該BoNT/D-C亞型。該BoNT/E亞型包括,例如BoNT/E1、BoNT/E2、BoNT/E3、BoNT/E4、BoNT/E5、BoNT/E6、BoNT/E7、BoNT/E8及BoNT/E9。進一步,該BoNT/F亞型包含,譬如,BoNT/F1、BoNT/F2、BoNT/F3、BoNT/F4、BoNT/F5、BoNT/F6及BoNT/F7。進一步亞型係描述的,例如於Hill等人之(J Bacteriol.2007 Feb;189(3):818-32.Epub 2006 Nov 17.),該者之揭露內容係併入於此以作為參考。該神經毒素多胜肽,且特別是其輕鏈與重鏈,係可衍自於上文指出的肉毒桿菌神經毒素或亞型之不同抗原性血清型中之一者。在一層面中,該神經毒素多胜肽之輕與重鏈係為選自於由下列所組成之該群組之一神經毒素的輕鏈
與重鏈:BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT。在另一層面中,編碼該神經毒素多胜肽之該聚核苷酸包含如下列中所顯示的一核酸序列:序列辨識編號:1(BoNT/A)、序列辨識編號:3(BoNT/B)、序列辨識編號:5(BoNT/C1)、序列辨識編號:7(BoNT/D)、序列辨識編號:9(BoNT/E)、序列辨識編號:11(BoNT/F)、序列辨識編號:13(BoNT/G)或序列辨識編號:15(TeNT)。再者,在一層面中,係為涵蓋的是一聚核苷酸其包含編碼如下列任一者中所顯示之一胺基酸序列的一核酸序列者:序列辨識編號:2(BoNT/A)、序列辨識編號:4(BoNT/B)、序列辨識編號:6(BoNT/C1)、序列辨識編號:8(BoNT/D)、序列辨識編號:10(BoNT/E)、序列辨識編號:12(BoNT/F)、序列辨識編號:14(BoNT/G)或序列辨識編號:16(TeNT)。在本發明之方法的一層面中,進一步涵蓋的是一神經毒素多胜肽其包含或由選自於下列所組成之該群組之一胺基酸序列所組成:序列辨識編號:2(BoNT/A)、序列辨識編號:4(BoNT/B)、序列辨識編號:6(BoNT/C1)、序列辨識編號:8(BoNT/D)、序列辨識編號:10(BoNT/E)、序列辨識編號:12(BoNT/F)、序列辨識編號:14(BoNT/G)或序列辨識編號:16(TeNT)。亦為涵蓋的是如於,例如Dover,N.等人之”(2014),J Infect Dis 209(2):192-202”中所顯示、最近描述之BoNT/H的對應核酸與胺基酸序列。
在另一層面中,該等聚核苷酸係為前述提及之
聚核苷酸或多胜肽的變異體。該等變異體可以為天然發生的神經毒素聚核苷酸或多胜肽,諸如前述提及的梭狀芽孢桿菌神經毒素同功型或亞型。舉例而言,由熟習該項技藝者所公認的是,在肉毒桿菌神經毒素的每種血清型中可以有在其胺基酸序列中,及亦在編碼這些蛋白質之核酸中有所不同的天然發生之肉毒桿菌神經毒素變異體。
這些變異體亦可以為一非天然發生的神經毒素多胜肽。如本文所使用,術語梭狀芽孢桿菌神經毒素之”非天然發生的變異體”意謂借助於人為操作產生的梭狀芽孢桿菌神經毒素,包括但不限於,藉由遺傳工程或重組方法產生的梭狀芽孢桿菌神經毒素,例如使用隨機誘變或合理設計;經酵素改質的梭狀芽孢桿菌神經毒素變異體,該者係藉由酵素活性改質,諸如內切或外切蛋白質水解酵素;或藉由化學合成產生的梭狀芽孢桿菌神經毒素。”基因操作”意指在該技藝中已知用於改質任何血清型/亞型的原生梭狀芽孢桿菌神經毒素的方法,其中該等方法係藉助於改質編碼該梭狀芽孢桿菌神經毒素之基因,或改質個別核酸,像DNA或mRNA。用於遺傳工程編碼神經毒素多胜肽之一聚核苷酸,或遺傳工程神經毒素多胜肽的重組方法在該技藝中係廣為描述地;參閱,例如Sambrook,J.& Russell,D.之”(2001).Molecular Cloning:a Laboratory Manual,3rd edn.Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory”。
再者,在另一層面中,如本文所意指,一天然
或非天然發生的變異體聚核苷酸應包含一核酸序列變異體,該者係至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致於序列辨識編號:1、3、5、7、9、11、13或15中任一者所顯示的核酸序列,或一致於如Dover,N.等人於”(2014),J Infect Dis 209(2):192-202”中顯示之BoNT/H的核酸序列;或包含一核酸序列變異體,該者所編碼的一胺基酸序列係至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致於序列辨識編號:2、4、6、8、10、12、14或16中任一者所顯示的胺基酸序列,或一致於如Dover,N.等人於”(2014),J Infect Dis 209(2):192-202”中顯示之BoNT/H的胺基酸序列。如本文所使用,術語”一致”意指序列一致性,其係藉由測定二個核酸序列或二個胺基酸序列之間一致的胺基酸數目而表徵,其中該等序列係對準使得最高階的匹配係獲得。可以使用編入電腦程式之公開技術或方法計算,諸如舉例而言,BLASTP、BLASTN或FASTA(Altschul 1990,J Mol Biol 215,403)。在一層面中,該一致性百分比值係在整個胺基酸序列計算,例如,該神經毒素多胜肽之輕鏈或重鏈,或兩者。基於各種演算法的一系列程式可供熟習該項技藝者用於比較不同序列。在這種情況下,Needleman與Wunsch或Smith與Waterman之演算法給予特別可靠的結果。為了實
行序列比對,可能使用PileUp程式(Higgins 1989,CABIOS 5,151)或Gap及BestFit程式(Needleman 1970,J Mol Biol 48;443;Smith 1981,Adv Appl Math 2,482),該等係為GCG套裝軟體(Genetics Computer Group 1991,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)的一部分。在本發明之另一層面中,上文以百分比(%)列出的序列一致性係使用GAP程式在該整個序列區測定的,伴隨下列設定:空位權重:50、長度權重:3、平均匹配:10.000及平均錯配:0.000,這些應總是使用作為序列比對時的標準設定,除非另有具體說明。在一層面中,前述提及之變異體聚核苷酸每一者編碼一多胜肽其保有該個別神經毒素多胜肽於本文界定之一或多種生物性質,且在另一層面中,保有於本文界定所有的生物性質,該等個別的神經毒素多胜肽亦即BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或破傷風神經毒素(TeNT)。熟習該項技藝者將瞭解的是,僅有在蛋白質水解活化作用之後,完整的生物活性才能維持,即使可想而知的,該未經加工的前驅物可能發揮一些生物功能或為部分活化的。用於評估梭狀芽孢桿菌神經毒素生物活性的體內檢測包括小鼠LD50檢測法,及離體小鼠半橫膈檢測法,後者係由Pearce等人(Pearce 1994,Toxicol.Appl.Pharmacol.128:69-77)及Dressler等人(Dressler 2005,Mov.Disord.20:1617-1619,Keller 2006,Neuroscience 139:629-637)所描述。生物活性普遍地在小鼠單位(MU)中表示。如於此所
使用,1MU係為在腹膜內注射之後,殺死50%之特定小鼠族群的神經毒性組分的數量,亦即小鼠i.p.LD50。在一進一步層面中,該等變異體聚核苷酸可以編碼具有改良或變更之生物性質的神經毒素,例如其等可能包含針對酵素識別作用改良的切割位點,及/或可能針對受體結合、內化作用、跨越該核內體膜進入細胞質內之易位作用、或該SNARE蛋白質家族之對應受質的內切蛋白質水解切割作用而改良的。
非天然發生梭狀芽孢桿菌神經毒素變異體之非限制性例子包括,例如保守性梭狀芽孢桿菌神經毒素變異體。如本文所使用,術語”保守性梭狀芽孢桿菌神經毒素變異體”意謂具有至少一胺基酸經由另一胺基酸或胺基酸類似物取代的梭狀芽孢桿菌神經毒素者,其中該另一胺基酸或胺基酸類似物具有至少一種與源自如本文別處所闡述之該等參照梭狀芽孢桿菌神經毒素序列之原始胺基酸類似的性質,例如,於序列辨識編號2、4、6、8、10、12、14或16中所顯示的胺基酸序列,或如Dover,N.等人於”(2014),J Infect Dis 209(2):192-202”中顯示之BoNT/H的胺基酸序列。該等變異體可能具有一、二、三、四、五或甚至更多個保守性胺基酸取代,相較於該參照序列。該變異體應具有該參照梭狀芽孢桿菌神經毒素序列之可比擬,或甚至改善的性質。性質之例子包括但不限於,類似大小、構形、電荷、疏水性、親水性、親脂性、共價鍵結能力、氫鍵結能力、物理化學性質或其等之類、或其之任何組合。較佳
地,該性質係為如本文別處所界定之一生物性質,亦即,(a)受體結合、(b)內化作用、(c)跨越核內體膜進入細胞質的易位作用、及/或(d)涉及突觸囊泡膜融合之蛋白質的內切蛋白質水解切割。一保守性梭狀芽孢桿菌神經毒素變異體可以與該保守性梭狀芽孢桿菌神經毒素變異體所基於之該參照梭狀芽孢桿菌神經毒素實質上相同的方式起作用,且在本發明之任何層面中可以取代該參照梭狀芽孢桿菌神經毒素。本文描述之該梭狀芽孢桿菌神經毒素典型地將含有天然發生的胺基酸殘基,但在一些事例中,非天然發生的胺基酸殘基亦可能存在。所以,所謂的”胜肽模擬物”與”胜肽類似物”,該二者可能包括模擬特定胺基酸或胜肽結構的非胺基酸化學結構,亦可能在本發明之情況中使用。此種模擬物與類似物一般表徵為展現類似的物理特性,諸如大小、電荷或疏水性、及在其天然胜肽對應物中發現的適合空間定向。胜肽模擬物化合物之具體例子為,一化合物其中該等胺基酸之一或多者間的醯胺鍵係由,舉例而言,碳-碳鍵或其他非醯胺鍵所代替,如該技藝中所廣為知悉的;參閱,舉例而言Sawyer之”Peptide Based Drug Design,pp.378-422,ACS,Washington D.C.1995”。
如本文中所使用,該神經毒素多胜肽變異體進一步涵蓋經化學修飾的神經毒素多胜肽。如本文所使用,”化學修飾”一般意指在該技藝中已知用於改質任何血清型或亞型的原生或重組梭狀芽孢桿菌神經毒素的方法,其中該等方法係藉助於化學反應或之類;該者尤其意指該
梭狀芽孢桿菌神經毒素胺基酸之取代、缺失、插入、添加或轉譯後修飾。一經化學修飾的神經毒素多胜肽可能為藉由丙酮酸化(pyruvation)、磷酸化、硫酸化、脂化、聚乙二醇化、醣基化及/或化學添加一胺基酸或包含例如約兩與約500之間胺基酸之一多胜肽而改質者。舉例而言,藉由併入透明質酸或聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇或其等之混合物到神經毒素多胜肽內,該梭狀芽孢桿菌毒素、或藉由化學改質或藉由基因操作衍自該梭狀芽孢桿菌毒素的這種毒素,可以被穩定化。
可以在本發明之方法中使用的另一種非天然發生的梭狀芽孢桿菌神經毒素變異體為一雜交的梭狀芽孢桿菌神經毒素。在一層面中,該雜交的梭狀芽孢桿菌神經毒素包含一梭狀芽孢桿菌神經毒素重鏈與輕鏈之組合,其中該輕鏈與重鏈係非相同血清型或亞型的。
用於製造此等經化學、酵素或基因改質之梭狀芽孢桿菌神經毒素變異體的方法,及用於辨識此等變異體是否維持本文意指之該等生物性質,諸如(a)受體結合、(b)內化作用、(c)跨越核內體膜進入細胞質的易位作用、及/或(d)涉及突觸囊泡膜融合之蛋白質的內切蛋白質水解切割,的方法對該技藝中任一一般技藝人士為廣為知悉的;參閱,例如Sambrook,同上述引文。
如本文所使用,術語”一神經毒素多胜肽之生物活性”意謂針對一神經毒素多胜肽表徵的生物性質,亦即,(a)受體結合、(b)內化作用、(c)跨越核內體膜進入細
胞質的易位作用、及/或(d)涉及突觸囊泡膜融合之蛋白質的內切蛋白質水解切割。其係設想的是,如本文所使用之該神經毒素多胜肽展現上文提及性質a)至d)中至少一者,較佳地涉及突觸囊泡膜融合之蛋白質的內切蛋白質水解切割,或在a)至d)中所列舉之二種或三種或所有四種生物性質。用於測定神經毒素多胜肽之生物活性的檢測在該技藝中係廣為知悉的,且亦於本文別處描述;參閱,例如Pellett等人之”(2011),Biochem.Biophys.Res.Commun.404,388-392”;Whitemarsh等人之”(2012),Toxicol.Sci.126,426-35”。
SNAP-25係為BoNT/A、BoNT/C1與BoNT/E的一種已知受質,並由其等所切割。VAMP/突觸泡蛋白(Synaptobrevin)係為BoNT/B、BoNT/D、BoNT/F、BoNT/G與TeNT的一受質,並由其等所切割,而突觸蛋白(Syntaxin)係為BoNT/C1之一受質並由其所切割。該等提及的受質,及其對應的核酸與胺基酸序列在該技藝中係廣為知悉的;參閱,例如WO 2014/207109。
如本文所使用,術語”細胞”意指,藉由一神經毒素諸如BoNT/A,易受一神經毒素毒害的任一真核細胞,或可以攝取一神經毒素的任一真核細胞。本揭露內容之一層面某種程度上包含源自一已建立細胞株的一細胞。術語”細胞”涵蓋來自各種生物體之細胞,諸如鼠類、大鼠、豬、牛、馬、恆河猴、靈長類及人類細胞;來自各種細胞類型,諸如神經元與非神經元之細胞;及可分離自異
源細胞族群、組織或生物體或為其一部分之細胞。應為理解的是,人類胚胎細胞係從本發明該等方法之範疇中排除。如本文所使用,術語”已建立細胞株”係與”永生細胞株”或”轉形細胞株”同義,且意指從一生物體、組織或器官來源所衍生的一細胞族群中選出、用於無限增殖之細胞的細胞培養。根據定義,一已建立細胞株排除初代細胞的細胞培養。如於此所使用,術語”初代細胞”意指直接從新鮮組織或器官直接採集且不具有無限增殖潛力的細胞。舉例而言,初代神經元細胞可以在本發明之方法中使用的。一已建立的細胞株可以包含一異質的細胞族群或一同質的細胞族群。衍自於單一細胞的已建立細胞株係意指為一選殖細胞株。一已建立細胞株可以為其細胞內源性表現對該等細胞進行整體細胞機制為必要之所有組分的細胞株者,藉此,諸如BoNT/A之一神經毒素蛋白質水解切割一受質,諸如SNAP-25;並涵蓋一神經毒素與一神經毒素受體的結合作用,諸如BoNT/A至一BoNT/A受體;神經毒素/受體複合物的內化作用;神經毒素輕鏈從胞內囊泡進入細胞質的易位作用;及神經毒素受質的蛋白質水解切割作用。或者,一已建立細胞株可以為其細胞已從一外源性來源引入對該細胞進行整體細胞機制為必要的至少一種組分之一細胞株者,藉此,諸如BoNT/A之一神經毒素蛋白質水解切割一受質,諸如SNAP-25;並涵蓋一神經毒素與一神經毒素受體的結合作用,諸如BoNT/A至一BoNT/A受體;神經毒素/受體複合物的內化作用;神經毒素輕鏈從胞內囊
泡進入細胞質的易位作用;及神經毒素受質的蛋白質水解切割作用。還意指一遺傳工程細胞株,源自此種已建立細胞株之細胞可能,例如表現一外源性FGFR2、外源性FGFR3、外源性SV2、外源性神經毒素受質諸如SNAP-25、或其之任何組合。
如本文所使用,”細胞培養”在最廣泛的意義中意指,從一動物或人類之細胞移除,並在一有利的人工環境中的隨後生長。細胞可能直接從組織中取出,並在培養之前藉由酵素或機械工具解集,或者它們可能衍自於已建立的細胞株或細胞品系。初代培養意指在該細胞從組織分離後並在適當條件下增生,直到其佔據了所有可用基質,亦即達到匯集的培養階段。在這個階段,細胞必須次培養,亦即,藉由將它們轉移到具新鮮生長培養基之一新的容器中,以提供持續生長的空間而繼代。正常的細胞在失去其增生能力前通常僅分裂有限的次數,這是一種稱為衰老的遺傳決定事件;這些細胞株被稱為有限的。然而,某些細胞株透過一稱為轉形的過程變成不朽的,該過程可以自發地發生,或可以經化學或病毒誘發的。當一有限細胞株經歷轉形,並獲取無限分裂的能力,其變成一連續細胞株。對每一細胞類型,培養條件係廣泛變化地,但該等細胞培養於其中的人工環境,一貫地由含有下列的一適合容器組成:供給該等必需營養素(胺基酸、碳水化合物、維生素、礦物質)的一基質或培養基、生長因子、激素、氣體(O2,CO2)、經調控的物理化學環境(pH、滲透壓、溫
度)……等。多數細胞為錨定依賴性的,且必須在貼附於一固體或半固體基質時培養(附著或單層培養),而其他可以在該培養基中漂浮生長(懸浮培養)。
本文中所表示之術語”易受神經毒素毒害的細胞”,意謂可以進行整體細胞機制之一細胞,藉此一神經毒素多胜肽(例如BoNT/A)切割一神經毒素受質(例如BoNT/A之受質SNAP-25),並涵蓋該神經毒素多胜肽至其對應受體的結合作用(例如BoNT/A至該BoNT/A受體的結合作用);該神經毒素/受體複合物的內化作用;神經毒素輕鏈從胞內囊泡進入細胞質之易位作用;及神經毒素受質的蛋白質水解切割作用。因此,如本文所使用之”易受神經毒素毒害的細胞”意謂一神經毒素敏感的細胞。該所提及之術語包含一細胞或一細胞株,舉例而言一種分離的初代細胞或其細胞株,或一已建立細胞株之一細胞或一已建立細胞株,舉例而言能夠分化成神經元細胞之腫瘤細胞或腫瘤細胞株,諸如本文別處所界定之神經母細胞瘤細胞或神經母細胞瘤細胞株。舉例而言,該神經母細胞瘤細胞株可以為可購自DSMZ的SiMa細胞株(ACC 164)。SiMa細胞株之特定選殖株係更進一步於WO 2010/105234中揭露。可以在本發明之方法中使用的其他神經母細胞瘤細胞株可以得自ATCC或DSMZ,在下列之ATCC或DSMZ編號下:在CRL-2263下之細胞株N1E-115、在CCL-131下之細胞株Neuro2a、在CRL-2266下之細胞株SH-SY5Y、在CRL-1721下之細胞株PC12、在ACC 157下之細胞株
MHH-NB-11(DSMZ)及在CRL-2271下之細胞株SK-N-BE(2)。其他易受神經毒素毒害的腫瘤細胞為P-19細胞(鼠類胚胎性癌細胞株)(DSMZ編號ACC 316)。在一些層面中,例如對於活性檢測,分化該等細胞成神經元細胞可以為必要的。此等分化方法在文獻中係廣為描述的。易受神經毒素毒害的細胞進一步涵蓋誘發型多能性幹細胞(iPS)所衍生的神經元,較佳地人類誘發型多能性幹細胞(iPS)所衍生的神經元;參閱例如上文引述之Whitemarsh等人(2012)。此等人類iPS衍生型神經元亦可購自,譬如Cellular Dynamics。生成iPS細胞之方法係描述於,舉例而言Yu等人之”Science 2009 May 8;324(5928):797-801.Epub 2009”、WO 2011/056971及WO 2011/025852。在一些層面中,iPS係使用適合的方法分化成神經元,例如於WO 2012/135621及美國專利申請案US 2010/0279403與US 2010/0216181中所描述者。
如本文所使用,術語”分化(differentiation)”、”分化(differentiating)”或”分化(differentiated)”表示一非特異化或一相對較少特異化之細胞藉由其變得相對更特異化的一過程。在細胞個體發育的情況下,形容詞”分化”係為一相對的術語。因此,一個”分化細胞”係為較諸被比較細胞已進一步向下進展某個發育途徑的細胞。一分化的細胞可能為,舉例而言,一終端分化的細胞,亦即,一完全特異化的細胞,該者在一生物體的各種組織及器官中負起特異化的功能,且其可能不必是有絲分裂後的。譬如,iCell®
神經元為從人類iPS細胞終端分化的,並展現神經元的特性與功能。在另一例子中,一分化的細胞亦可能為在一分化譜系內的前驅細胞(progenitor cell),其可以進一步增生及/或分化。類似地,一細胞係為”相對更特異化”,假若其較諸被比較細胞已進一步向下進展某個發育途徑,其中後者所以被視為”非特異化”或”相對較少特異化”。一相對更特異化的細胞可能在一或多個可證明的表型特徵中不同於該非特異化或相對較少特異化的細胞,諸如,舉例而言,特定細胞組分或產物的存在、不存在或表現水平,例如RNA、蛋白質、特異性細胞標記物或其它物質;某些生化途徑之活性;外觀形態;增生能力及/或動力學;分化潛能及/或對分化訊號之回應等等,其中此等特徵表明該相對更特異化的細胞進一步沿該發育途徑之進展。用於分化細胞成神經元細胞的細胞培養條件從本文引用的文獻係明顯在該技藝中為廣為知悉的。
更進一步,在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽的細胞培養一時間之培養條件係於該技藝中廣為描述的,且亦可以衍自本文所列舉之出版物。
如本文所使用,術語“一神經毒素多胜肽之特定攝取”意謂一過程,在該過程中神經毒素多胜肽藉由結合至其之特異性神經元膜受體(等)進入神經元,舉例而言對BoNT/B,為SV2、神經節苷酯、GD1a、人類突觸結合蛋白II(Synaptotagmin II),或對BoNT/D/-C為人類突觸結合
蛋白I;被攝取進入一似核內體的隔室;並經由pH依賴性易位過程穿透該核內體膜。因此,該所提及術語涵蓋(a)該神經毒素多胜肽之受體結合、(b)該神經毒素多胜肽之內化作用、(c)該神經毒素多胜肽跨越核內體膜進入細胞質的易位作用。如熟習該項技藝者所瞭解的是,該神經毒素敏感的細胞較佳地首先能夠攝取一神經毒素,而然後進行上文列出的總體細胞機制。如本文所表示,”一神經毒素多胜肽之不特定或非特定攝取”意謂一過程,其中該神經毒素多胜肽或其降解產物藉由結合至不特異性神經元膜受體(等)進入神經元或經由非特異性機制進入細胞,例如藉由在胞飲作用(pinocytosis)事件中,一偶然的共同運輸。如本文所使用,一神經毒素敏感的細胞可以攝取,例如約100奈莫耳(nM)、約10nM、約1nM、約500picomolar(pM)、約400pM、約300pM、約200pM、約100pM、約90pM、約80pM、約70pM、約60pM、約50pM、約40pM、約30pM、約20pM、約10pM、約9pM、約8pM、約7pM、約6pM、約5pM、約4pM、約3pM、約2pM、約1pM、約0.5pM或約0.1pM的神經毒素多胜肽,或小於該等指出值中之一者。EC50值超過100pM者已經在文獻中報導。根據定義,一易受神經毒素毒害的細胞必須表現,或被工程化以表現至少一種神經毒素受體與至少一種神經毒素受質。針對神經毒素之受體與受質在該技藝中係描述的,且係於本文別處提及。因此,該細胞係較佳地易感於本文界定之生物活化或成熟神經毒素多胜肽。較佳
地,如本文中所使用的神經毒素敏感細胞係易受神經毒素毒害,通過,例如約1nM或更小、約500pM或更小、約400pM或更小、約300pM或更小、約200pM或更小、約100pM或更小、約90pM或更小、約80pM或更小、約70pM或更小、約60pM或更小、約50pM或更小、約40pM或更小、約30pM或更小、約20pM或更小、約10pM或更小、約9pM或更小、約8pM或更小、約7pM或更小、約6pM或更小、約5pM或更小、約4pM或更小、約3pM或更小、約2pM或更小、約1pM或更小、約0.9pM或更小、約0.8pM或更小、約0.7pM或更小、約0.6pM或更小、約0.5pM或更小、約0.4pM或更小、約0.3pM或更小、約0.2pM或更小、或甚至約0.1pM或更小。如該技藝中所知,”半最大有效濃度(EC50)”意指一藥物、抗體或毒物其在某些特定的曝露時間後誘發介於該基線與該最大之間一半回應的濃度。該者通常使用作為一藥物效力的量度。因此逐級劑量反應曲線(graded dose response curve)之EC50代表,一化合物之最大有效應的50%係觀察到時的濃度。一可數劑量反應曲線(quantal dose response curve represents)之EC50代表,在一曝露期間之後,50%該族群展現一回應時的化合物濃度。用於為辨識別易受神經毒素毒害之細胞或細胞株及/或具有神經毒素攝取能力,亦即如本文所界定的神經毒素敏感細胞,的方法,在該技藝中為已知的;參閱,例如美國2012/0122128 A1。在一層面中,該神經毒素多胜肽之生物活性,為前述提及的所有生
物性質之結果。迄今,僅有一些對神經毒素具充分高靈敏度、可用於測定一神經毒素之生物活性的細胞式檢測已於先前技藝術中描述,如本文別處所指出。
如本文所利用,術語”增進”意謂一個神經毒素多胜肽進入細胞之該特定攝取係改善或提高,相較於梭狀芽孢桿菌神經毒素毒害其不使用下列者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞。該神經毒素多胜肽進入細胞之特定攝取較佳地提高至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6-倍、至少7-倍、至少8-倍、至少9倍或甚至至少10倍,相較於方法其使用的細胞培養條件不包含下列者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞。一般地,在該技藝中所描述的該等方法使用約5mM的K+終濃度,約72小時的神經毒素多胜肽曝露時間且無細胞攪動。已經由本發明人發現的是,上述措施(i)、(ii)及/或(iii)不僅改善神經毒素進入細胞的特定攝取,但亦引致該所提及神經毒素或降解產物進入細胞之非特定攝取的降低。一神經毒素多胜肽進入細胞之非特定攝取較佳地係降低至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、在至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或甚至至少10倍,相較於方法其使用的細胞培養條件不包含下列者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間
攪動該細胞。用於測量一神經毒素多胜肽進入細胞之特定或非特定攝取的工具與方法在文獻及本文中係廣為描述的,且進一步於下列例子中顯示。舉例而言,BoNT/A、BoNT/C與BoNT/E神經毒素曝露在神經元細胞培養中於SNAP-25蛋白質水解上的效果,可以用作神經毒素易位的一個指標。這同樣適用於BoNT/C神經毒素曝露在神經元細胞中於突觸蛋白質水解上,以及BoNT/E、BoNT/D及BoNT/G神經毒素於VAMP水解上。
在本發明之方法的進一步層面中,本發明之前述方法係由用於在該等細胞內測定神經毒素多胜肽之生物活性的一個方法繼之。
如下列例子中所證明,一細胞式的效力檢測可以有利地藉由提高梭狀芽孢桿菌神經毒素多胜肽進入細胞內的特定攝取而改善,該者係藉由使用K+介導的細胞去極化、一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及/或在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞。於同一時間,該所提及神經毒素或降解產物進入細胞之非特定地攝取的下降係觀察的。
用於測定神經毒素多胜肽之生物活性的許多檢測法已於該技藝中描述,諸如輕鏈檢測法(ELISA)、Endopep-MS、FRET、HPLC-UPLC、DARET、或細胞式活性檢測其使用,譬如,SH-SY5Y或Neuro2a細胞、胚胎雞神經元、源自脊髓或背根神經節之初代神經元(Pellett等人於”(2011),Biochem.Biophys.Res.Commun.404,
388-392”)、憑藉西方印漬讀出的胚胎幹細胞衍生之神經元(Whitemarsh等人於”(2012),Toxicol.Sci.126,426-35”)、或分化的人類神經母細胞瘤SiMa細胞;參閱,例如Fernández-Salas,E.等人於”(2012).PLoS One 7(11)”。
在一第二層面中,本發明提供一種用於直接在細胞中測定一神經毒素多胜肽之生物活性的方法,其包含:a)在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽培育一時間,該培育包含下列步驟中至少一者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞;b)固定該細胞,且任選地以一清潔劑透化(permeabilizing)該細胞可滲透的;c)將該細胞與特異性結合至該無切割及經神經毒素切割受質之至少一第一捕捉抗體,及特異性結合至該經神經毒素切割受質之切割位點的至少一第二捕捉抗體,在允許該等捕捉抗體結合到該受質之條件下接觸;d)將該等細胞於允許該第一偵測抗體結合至該第一捕捉抗體的條件下,與特異性結合至該第一捕捉抗體之至少一第一偵測抗體接觸,由此形成第一偵測複合物,並於允許該第二偵測抗體結合至該第二捕捉抗體的條件下,與特異性結合至該第二捕捉抗體之至少一第二偵測抗體接觸,由此形成第二偵測複合物;
e)測定步驟d)之第一與第二偵測複合物的數量;及f)藉助於該第二偵測複合物,計算在該細胞中由該神經毒素多胜肽所切割的受質數量,從而測定該神經毒素多胜肽在該細胞中之生物活性。
較佳地,此方法係為一體外方法。本發明之方法允許直接測定一神經毒素多胜肽在細胞中的生物活性。這意謂的是,不像該技藝中所描述的方法,細胞的胞溶及從細胞胞溶物中分離或濃縮經切割的神經毒素受質係不再為必要的。舉例而言,在該技藝中之西方印漬分析式檢測法中,藉由在SDS聚丙烯醯胺凝膠中分離與濃縮個別試樣的組分,神經毒素受質係濃縮的。在該技藝中所描述的ECL夾心ELISA中,該神經毒素受質的濃縮作用係藉由抗體之使用而實行,其中該等抗體係特異性地結合至已加入細胞胞溶物的一微量滴定平板上之經切割型神經毒素受質。藉由與該所提及抗體的結合,該經切割的神經毒素受質係從胞溶物中分離,其引致該經切割的梭狀芽孢桿菌神經毒素受質的濃縮。
反之,在本發明之此方法中,該經切割的神經毒素受質,舉例而言SNAP-25,可以直接在細胞中偵測。為此,如於本文別處更詳細界定的易受神經毒素毒害的細胞,係在允許神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下與一神經毒素多胜肽培養一時間。該培育包含K+介導的細胞去極化、一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及/或在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞,如本文別處所闡述。
這些措施增進了該神經毒素之特定細胞攝取,而在同一時間降低神經毒素或降解產物進入細胞內之非特定攝取。在下一步驟中,細胞係固定的,舉例而言藉由加入一種固定劑,諸如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛或所提及固定劑之混合物。任選地,該等細胞可藉由使用至少一種清潔劑而可透化,諸如Triton X-100、Tween 20、皂素、毛地黃皂苷或正辛基-ß-葡哌喃糖苷。該清潔劑可以含括於諸如PBS的一適當緩衝液中。其後,在允許該等捕捉抗體與該等受質結合的條件下,讓細胞與特異性結合至該未經切割型與經神經毒素切割型受質的至少一第一捕捉抗體,及與特異性結合至該經神經毒素切割型受質之切割位點的至少一第二捕捉抗體接觸。於此,該第一捕捉抗體能夠藉由特異性結合至存在於該未經切割型與經神經毒素切割型兩者神經毒素受質中的適當抗原決定位,而測定細胞中的神經毒素受質總含量或數量。該第二捕捉抗體識別並特異性地結合至僅存在於該經切割型神經毒素受質中的一抗原決定位,舉例而言,藉由特異性地結合至在該神經毒素受質中的神經毒素切割位點。或者,該等細胞可以與該第一與第二捕捉抗體之一混合物接觸,亦即在所提及條件下,細胞係同時與至少一第一捕捉抗體及至少一第二捕捉抗體接觸。在下一步驟中,在允許該第一偵測抗體與該第一捕捉抗體結合的條件下,將細胞與特異性結合至該第一捕捉抗體的至少一第一偵測抗體接觸,由此形成第一偵測複合物。在一隨後步驟中,在允許該第二偵測抗體與該第二捕捉抗體結合的條
件下,將細胞與特異性結合至該第二捕捉抗體的至少一第二偵測抗體接觸,由此形成第二偵測複合物。或者,該細胞可與該第一與第二偵測抗體之一混合物接觸,亦即在所提及條件下,細胞係同時與至少一第一偵測抗體及至少一第二偵測抗體接觸。或者,在細胞透化作用後,在所提及條件下,其等可以同時與該第一與第二捕捉抗體及該第一與第二偵測抗體的混合物接觸。在下一步驟中,該第一與第二偵測複合物之數量係測定。最後,藉助於該第二偵測複合物,在該細胞中由該神經毒素多胜肽所切割的受質數量係計算。從而,該神經毒素多胜肽的生物活性係於細胞中直接測定。
在下文中,本發明之方法係更詳細地說明。對於細胞培養,如本文所界定之易受神經毒素毒害的細胞,諸如神經元細胞、SiMa細胞或iPS衍生型神經元,係首先接種至96孔微量滴定平板上。SiMa細胞係分化成一種神經元表現型,舉例而言依據WO 2010/105234中所揭露之程序;而iPS衍生型神經元分化成一種神經元表現型,例如依據WO 2012/135621中所描述之檢測法。然後,在允許神經毒素多胜肽發揮其生物活性的條件下,將細胞與諸如BoNT/A之一神經毒素多胜肽培育一時間。該培育包含K+介導的細胞去極化、一降低的神經毒素多胜肽曝露時間,及/或在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞,如本文別處所描述。
在隨後步驟中,在ELISA檢測之前,將細胞固
定在微量滴定平板上。為了固定細胞,舉例而言冰冷甲醇(-20℃)可以於-20℃加入至該等細胞達20分鐘。
為了執行ELISA檢測,細胞首先係清洗。作為清洗緩衝液,可以使用例如於10mM PBS緩衝液(pH 7.4)中的0.1% Triton X-100。其後,藉由諸如於10mM PBS(pH 7.4)中的0.6% H2O2之淬滅緩衝液,內源性蛋白酶係淬滅,繼之進行另一清洗步驟。在接續步驟中,藉由一種適當的阻斷緩衝液,諸如譬如於10mM PBS緩衝液(pH 7.4)及0.05% Triton X-100中的2% BSA,在該微量滴定平板上自由的結合位點係阻斷。然後,藉由使用一適當的清潔劑,該細胞係可透化的。作為透化緩衝液,可以利用例如於10mM PBS緩衝液中的0.5% Triton X-100。透化作用允許該等抗體透過在細胞中形成的孔洞擴散。其後,藉由上文提及的清洗緩衝液清洗細胞。
在下一步驟中,該經透化細胞係與,例如二種不同抗體之混合物一起培育。該混合物包含特異性結合至該未經切割型與經神經毒素切割型受質的一第一捕捉抗體,及特異性結合至該經神經毒素切割型受質的切割位點的一第二捕捉抗體。該第一與第二捕捉抗體亦可以依序地施加。舉例而言,該第一捕捉抗體可以特異性地結合至未經切割型與經神經毒素切割型SNAP-25兩者,從而允許定量在該細胞中的SNAP-25總數量或含量。進一步,在估算上,此第一捕捉抗體可以使用於細胞中經切割型SNAP-25之數量的常態化。該第二捕捉抗體特異性結合至該經神經
毒素切割型受質的剪切位點,且所以允許該經切割的神經毒素受質之測定與偵測,諸如經BoNT/A切割的SNAP-25。
在本發明之方法中,該總神經毒素受質及該經神經毒素切割的神經毒素受質的接續偵測可以直接在微量滴定平板或細胞培養皿上,亦即在細胞內,實行。所以,有利地,不像在該技藝中所描述的方法,在本發明之方法中,製備細胞萃取物並從該細胞胞溶物中分離及/或濃縮神經毒素受質係為不必要的。其後,細胞係清洗,以為了移除未與個別抗原結合的過量抗體。在隨後步驟中,該經透化的細胞係與至少一第一偵測抗體及至少一第二偵測抗體接觸。該等抗體可以混合物施加,亦即同時或依序施加。該第一偵測抗體特異性地結合至該第一捕捉抗體。從而,第一偵測複合物係形成。該第一偵測抗體可被導向對抗衍生該第一捕捉抗體的物種。舉例而言,在兔多株抗SNAP-25抗體S9684(Sigma)係使用作為特異性結合至該未經切割型及經BoNT/A切割型受質SNAP-25之第一捕捉抗體的事例中,一抗兔鹼性磷酸酶共軛抗體可以使用作為一第一偵測抗體。該第二偵測抗體特異性地結合至該第二捕捉抗體。從而,第二偵測複合物係形成的。該第二偵測抗體可被導向對抗衍生該第二捕捉抗體之物種。譬如,於WO 2014/207109中所描述之該小鼠單株抗體(mAb)20-2-5係使用作為特異性地結合至經BoNT/A切割型SNAP-25的一第二捕捉抗體的事例中,一抗小鼠辣根過氧化酶(HRP)
共軛抗體可以使用作為一第二偵測抗體。如熟習該項技藝者所顯而易見的是,該第一偵測抗體與該第二偵測抗體係與不同酵素共軛,以為了允許特異性偵測如本發明方法中所用之個別的第一與第二捕捉抗體。譬如,如本文別處所描述之HRP式偵測作用可以用於經BoNT/A切割型SNAP-25,而該鹼性磷酸酶式偵測作用可以用於總SNAP-25(經BoNT/A切割型與未經切割型)。其後,細胞係再度清洗。在一隨後步驟中,一螢光性HRP受質係加入至該細胞。作為一HRP受質時,例如,可使用在540nm激發並在600nm發射的Amplex UltraRed(Invitrogen)。與HRP受質的培育係實行達一充分時間,用於讓辣根過氧化酶充分地轉化受質。在與HRP受質培育之後,該AP受質,舉例而言DiFMUP(6,8-二氟-4-甲基繖形酮醯磷酸酯;在360nm激發;在450nm發射)可以加入至該HRP受質,且該細胞係與該二受質之混合物一起培育。與該AP受質之培育係實行達一段時間,該段時間允許讓鹼性磷酸酶充分地轉化該受質。如該技藝中所知,根據偵測極限之定義,一受質必須在一充分數量中轉化,使得該所測量的訊號係至少如空白組的平均值加上平均值之三倍標準偏差的高。偵測之極限可以如文獻中所描述般測定;參閱,例如Armbruster及Pry之”Clinical Biochem.Rev.2008,29(Supplement 1):S49-S52”。因為鹼性磷酸酶的最佳pH係位於鹼性範圍,該對應的受質緩衝液係強鹼的。假若將鹼性磷酸酶受質加入至該HRP受質,該辣根過氧化酶的反應係藉由鹼性pH停
止,而該鹼性磷酸酶將轉化DiFMUP。經轉化的HRP受質並不受鹼性pH的影響。最後,該二受質的螢光係如下測量:Amplex UltraRed:在540nm激發;在600nm發射DiFMUP:在360nm激發;在450nm發射
如熟習該項技藝者所瞭解,僅有所用受質展現不同激發/發射波長的這些螢光受質,是適合在本發明的方法中用於偵測該第一與第二捕捉抗體。僅有在這種事例中,它們允許對每一抗原的特異性偵測,亦即該總神經毒素受質(諸如未經切割型與經神經毒素切割型SNAP-25)及經切割的神經毒素受質(諸如經神經毒素切割的SNAP-25)。從而,其係可能同時量化在各個孔或細胞培養皿中之神經毒素受質總含量及經切割神經毒素受質含量。鑑於此,有利地可能將本發明的方法自動化。如於本文別處所闡述,可以設想的是,所抉擇用於本發明方法的螢光受質在該激發/發射光譜之間展現充分的偏移,以允許個別受質之特異性偵測。此項要求係滿足的,舉例而言,對HRP之受質Amplex及其衍生物,及對AP之受質DiFMUP。而在一最佳事例中,在所用螢光受質的激發/發射光譜之間係沒有重疊,其已經體認的是,在所用螢光受質之激發光譜的峰面積中,高達30%的重疊為可容忍的。當考慮本發明之此方法,進一步的細節係於,例如WO 2014/207109中描述的。
如熟習該項技藝者所進一步知悉,本發明之方法允許直接偵測及量化由該神經毒素多胜肽在細胞中所切
割的神經毒素受質,從而測定該神經毒素多胜肽在該細胞中的生物活性。有利地,本發明之方法不要求製備細胞胞溶物或萃取物,及不要求從該細胞胞溶物/萃取物中分離或濃縮經切割的神經毒素受質,這些對該技藝中已知的方法為必要的。因此,試樣材料可以節省。進一步,藉由本發明之方法,試樣製備及試樣數目可以降低,由於在該試樣中之總神經毒素受質數量及經切割型神經毒素受質數量可以同時測定。在該技藝中所描述的檢測法中,該等試樣必需細分,以各自分開偵測二種抗原,亦即總神經毒素受質與經切割神經毒素受質。本發明之方法使得細分試樣為非必要的。從而,可避免起因於細分試樣的不均勻性,並可以節省試樣材料。更進一步,在該技藝中所描述的檢測法中,抗原可以被降解,該者可以扭曲經切割神經毒素受質之偵測。這是因為在該技藝所描述的檢測法中,細胞係與含有清潔劑的胞溶緩衝液一起培育,然而該緩衝液不能夠使神經毒素多胜肽或其他內源性蛋白酶去活化,引致在試樣長期儲存中的神經毒素受質降解作用。較強的胞溶緩衝液不能在先前技藝所描述的ECL夾心ELISA中使用,因為在該檢測法中要求使用細胞胞溶物。這是因為上文提及的抗原集結作用可以引致該等抗原在非特異性方式中吸附在細胞培養皿或微量滴定平板的塑料表面,進而干擾由適當抗體對該抗原的偵測作用。由於用於偵測抗原的抗體亦與胞溶物產生接觸,該等抗體亦可能集結。在這種事例中,可靠與準確的抗原偵測係不再可能的。本發明者藉由
使用在該技藝中描述用於偵測神經毒素活性之生物活性的西方印漬檢測法,已體認此種降解反應。當胞溶物在-20℃長期儲存時,相較於新鮮的胞溶物試樣,總SNAP-25的偵測訊號已發現大幅地降低,且該經切割的神經毒素受質SNAP-25相對於未經切割的神經毒素受質SNAP-25之比率歸因於冷凍期間的降解過程已偏移。本發明者已發現,藉由在細胞培養皿上直接固定細胞,神經毒素受質的降解作用及/或試樣的不安定性可以避免的,因為神經毒素受質及神經毒素或其他內源性蛋白酶皆藉由在細胞培養皿上的集結作用而立即去活化的。這可以藉由使用,舉例而言,甲醇或該技藝中已知的其他固定液或固定劑,諸如乙醇、丙酮、甲醛或其混合物,或本文中所述的其他固定劑,來固定細胞而實現。使用此固定方法,例如親代SiMa細胞(人類神經母細胞瘤細胞;DSMZ編號:ACC 164)及iPS衍生型神經元(Whitemarsh等人於”(2012),Toxicol.Sci.126,426-35”)之安定性分析,在新鮮與在冰箱存放數天的細胞培養皿之間並無顯現任何差異。
在本發明之方法中,可以使用作為第一捕捉抗體、特異性地結合至該未經切割型及經神經毒素切割型受質的適合抗體涵蓋,例如兔多株抗SNAP-25抗體S9684(Sigma)、兔多株抗SNAP25抗體PA5-19708(Pierce Antibodies)、兔多株抗SNAP25抗體PA5-19701(Pierce Antibodies)、或兔單株抗SNAP25抗體ab108990(Abcam)。
在本發明之方法中,可以利用作為第二捕捉抗
體、特異性地結合至該經神經毒素切割受質之切割位點的適當抗體包括,舉例而言,小鼠單株抗體選殖株20-2-5(WO 2014/207109)、於EP 14199282.6中所描述之該小鼠單株抗體、小鼠單株抗體MC-6053(選殖株4F3-2C1,R&D Systems)、MAB4733(Abnova)、orb26633(Biorbyt)、或GWB-T00279(Genway)。
可以使用作為第一與第二偵測抗體的適合偵測抗體為該技藝中已知的。舉例而言,該第一偵測抗體可以為一鹼性磷酸酶(AP)共軛抗體、辣根過氧化酶(HRP)共軛抗體或共軛至一螢光染料的抗體。作為一第二偵測抗體,例如一鹼性磷酸酶(AP)共軛抗體、辣根過氧化酶(HRP)共軛抗體、葡萄糖氧化酶共軛抗體、酪胺酸酶共軛抗體或β-半乳糖苷酶抗體可以使用的。較佳地,該第一與第二偵測抗體彼此不同,當在本發明之方法中使用時。
如於此所使用,單數形式”一”、”一個”及”該”包括單數與複數指涉物,除非上下文另有明確指定。作為例子,”一細胞”意指一個或一個以上的細胞。
如於此所使用,術語”約”當修飾一陳述項目、數字、百分比或期限之值時,意指該陳述項目、數字、百分比或期限之值之正或負10百分比、9百分比、8百分比、7百分比、6百分比、5百分比、4百分比、3百分比、2百分比、1百分比、或0百分比之一範圍。較佳的是正或負10百分比範圍。
如本文所使用,術語”包含(comprising)”、”包含
(comprises)”及”由...所構成”係與”包括(including)”、”包括(includes)”或”含有(containing)”、”含有(contains)”同義,且係為包容性及為開放式的,不排除額外、未列舉的成員、元件或方法步驟。顯然地,術語”包含”涵蓋術語”由...所組成”。更具體地,如本文所使用,術語”包含”意謂該主張涵蓋所有列出的元件或方法步驟,但亦可能包括額外、未透露的元件或方法步驟。舉例而言,在一最狹隘的含意中,一種包含步驟a)、b)及c)的方法涵蓋一種由步驟a)、b)及c)所組成的方法。”由...所組成”一詞意謂該組成物(或裝置或方法)具有所列舉的元件(或步驟),僅此而已。相反的,術語”包含”亦可以涵蓋一種包括進一步步驟的方法,例如除了步驟a)、b)及c)之外,包括步驟d)及e)。
在本文數值範圍係使用的事例中,諸如”在介於1與5微莫耳之間之一濃度”,該範圍不僅包括1與5微莫耳,亦包括在1與5微莫耳之間的任一數值,舉例而言,2、3及4微莫耳。
如本文所使用,術語”體外”表示動物或人體之外部或外面的。如本文所使用,術語”體外”應理解為包括”離體”。術語”離體”典型地意指從動物或人體移除的一組織或細胞,並在身體外部維持或增殖,例如在一培養容器中。其係較佳的是,本發明之方法為體外方法。如本文所使用,術語”體內”表示動物或人體之內部或裡面。
在本發明之方法的進一步層面中,該K+介導的細胞去極化係於約20mM至約55mM之一額外的K+濃度實
行,達至少2小時。
通常,在本技藝中所使用的該細胞培養基含有5mM之K+。因此,在本發明之方法中的最終K+濃度較佳地係約25mM至約60mM之K+之間。
在本發明之方法的還進一步層面中,該K+介導的細胞去極化及/或該神經毒素多胜肽曝露係於GT1b存在下實行。
在本發明之方法的另一層面中,GT1b係於15及50μM之間的一濃度中使用,較佳地20μM。
在本發明之方法的進一步層面中,該降低的神經毒素多胜肽曝露時間係曝露該細胞於神經毒素多胜肽達至少24小時,且小於96小時,較佳地至少48小時,且最長72小時。
在本發明之方法的進一步層面中,在神經毒素多胜肽曝露期間的細胞攪動係以一電磁攪拌器或轉動旋轉式燒瓶或震盪該細胞而實現。細胞之攪動係於一適當的細胞培養基流速下實行,較佳地約25cm/min至約300cm/min之一平均值(或平均)培養基流速,更佳地約25cm/min至約150cm/min。
在本發明之方法的進一步層面中,該K+介導的細胞去極化係在20μM的GT1b及神經毒素多胜肽存在下,於至少約20mM至約55mM之一額外的K+濃度,實行達至少2小時,繼之在攪動下神經毒素多胜肽曝露達額外70小時。
在本發明之方法的進一步層面中,一不具神經毒素多胜肽的培育時間係先於該神經毒素多胜肽曝露之前。
在本發明之方法的進一步層面中,該不具神經毒素多胜肽的培育時間係於16與48小時之間。
在本發明之方法的進一步層面中,該方法係為一螢光方法。
在本發明之方法的進一步層面中,該神經毒素多胜肽係為BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H或TeNT、或其本文別處所界定之亞型。
在本發明之方法的進一步層面中,該受質係為VAMP/突觸泡蛋白、SNAP-25或突觸蛋白。
在本發明該等方法之進一步層面中,該細胞係為神經元細胞或分化為神經元的細胞,其選自由下列所組成之該群組:初代神經元細胞、能夠分化為神經元細胞的腫瘤細胞,諸如神經母細胞瘤細胞、P19細胞,或誘發型多能性幹細胞(IPS)衍生的神經元。
本發明之方法的進一步較佳實施例可以衍自於下列例子。
本發明現今將藉由下列例子例示,然而,該等例子不應解釋為限制本發明之範疇。
圖1:受壓力(stressed)藥物產品試樣之活性損失
動力學。含有BoNT/A的藥物產品試樣係儲存在70℃下長達四週。在第0、1、2及4週後的試樣係取出並經受在小鼠LD50生物檢測法以及在採用不同程序的細胞式檢測法(CBA)之分析。在x軸上,單位為週的儲存時間係給定,而在y軸上相對效力係給定。在起點的效力係設為100%,而該連續測試時間點係相對於該起點而表示。LD50生物檢測之值係以菱形描繪。採用K+去極化的細胞式檢測程序係以方形描繪,採用8小時毒素培育時間繼之64小時無毒素培育時間的程序係以三角形描繪,而在72小時培育時間期間採用震盪的程序係以圓形描繪。未經修改的CBA程序係以直線符號描繪。總之,圖1顯示了三種細胞式檢測法例子之比較,其中該等受壓力試樣對該參照檢測法,小鼠LD50生物檢測法,顯示一可比擬的衰變動力學。
細胞固定作用
1. 將培養基/毒素溶液移除。加入100μl/孔的冰冷甲醇(-20℃),並在-20℃培育達20分鐘。
備註:後續所有步驟皆於室溫中執行。
在細胞固定作用之後:
1. 移除甲醇溶液並加入100μl/孔的PBS緩衝液。為了較長時間的儲存(>1天),應加入300μl/孔的PBS緩衝液,並
以石蠟膜封住平板。將平板儲存於冰箱中。
2. 移除該PBS緩衝液,並用200μl/孔的PBS緩衝液清洗細胞三次。每一步驟應伴隨溫和震盪執行達1分鐘。
3. 移除該PBS緩衝液,並加入100μl/孔的淬滅緩衝液,伴隨溫和震盪培育達20分鐘。
4. 移除該淬滅緩衝液,並伴隨溫和震盪,用300μl/孔的PBS緩衝液清洗細胞一次計3分鐘。
5. 移除該PBS緩衝液,並加入200μl/孔的阻斷緩衝液,且伴隨溫和震盪培育達1小時。
6. 移除該阻斷緩衝液,並在每一孔中加入100μl的初級抗體混合物(以阻斷緩衝液稀釋抗體)。伴隨溫和震盪培育過夜(16-18h)。該等細胞係同時與二種初級抗體一起培育:一種對經BoNT/A切割的SNAP-25具特異性之小鼠抗體,及一種識別SNAP-25之多株兔抗體(用於測定SNAP-25之總數量,用於常態化之抗體)。
7. 移除該初級抗體混合物,並用200μl的PBS緩衝液清洗細胞四次。每一步驟應伴隨溫和震盪執行達3分鐘。
8. 移除該PBS緩衝液,並在每一孔中加入100μl的二級抗體混合物:HRP-共軛型抗小鼠二級抗體及AP-共軛型抗兔二級抗體(以阻斷緩衝液稀釋抗體),且伴隨溫和震盪培育達2.5至3小時。
9. 移除該二級抗體混合物,並以200μl/孔的PBS緩衝液清洗細胞五次,繼之以300μl/孔的HEPES緩衝液的一清洗步驟。每一清洗步驟應伴隨溫和震盪執行達3分鐘。
10. 移除平板中的HEPES緩衝液,並在每一孔中加入75μl之辣根過氧化酶的螢光受質(HRP受質)。伴隨溫和震盪培育達50分鐘。保護該等平板免受直接光線(照射)。
11. 在每一孔中加入75μl之鹼性磷酸酶的螢光受質(AP受質),並伴隨溫和震盪培育達一額外50分鐘。保護該等平板免受直接光線(照射)。
12. 使用螢光平板讀取儀讀取該等平板:於540nm激發;於600nm發射。
於360nm激發;於450nm發射。
13. 計算
為了常態化之目的,經切割型SNAP-25的RFU值(於600nm之螢光)係就每一孔中的總SNAP-25 RFU值(450nm)常態化。為了在一圖示中較佳地例示RFU,所有值係使用下列公式乘以因子1000:
隨後將每一標準品或試樣所得到的RFU值平均。
試劑製備
磷酸鹽緩衝型食鹽水(Sigma,# P5368)(pH 7.4)
於10mM PBS緩衝液中之0.6%的H2O2(pH 7.4)
於10mM PBS緩衝液中之2%的BSA(pH 7.4)+0.05%之
Triton X-100
50mM HEPES(pH 7.4)
50mM HEPES(pH 7.4)
0.007%之H2O2
150pM Amplex UltraRed
25mM之二乙醇胺(pH 9.8)
2mM MgCl2
100μl M DiFMUP
a)iCell®神經元係按照Cellular Dynamics International(CDI)使用者手冊從4種不同的細胞批次解凍並接種在96孔板上。在接種後24小時(h),以新鮮維持的培養基如使用者手冊中所描述般替換培養基。
在進一步72h培育時間後,培養基係移除並以含有變化濃度之BoNT/A及30mM總濃度之K+離子的新鮮培養基替換(亦即相較於培養基本身,25mM之額外K+)。在2小時後,該高K+培養基係移除,而含有變化濃度之BoNT/A的新鮮培養基係加入到細胞。
在另一70h後,培養基係吸出,將細胞固定且ELISA讀取係如例子1中所描述般執行。此程序之結果係
於圖1中以正方形給出。
b)iCell®神經元係按照Cellular Dynamics International(CDI)使用者手冊從4種不同的細胞批次解凍並接種在96孔板上。在接種後24小時(h),以新鮮維持的培養基如使用者手冊中所描述般替換培養基。
在進一步72h培育時間後,培養基係移除並以含有變化濃度之BoNT/A的新鮮培養基替換。在8小時後,該含有BoNT/A的培養基係移除,而不具BoNT/A之新鮮培養基係加入到細胞。
在另一64h後,培養基係吸出,將細胞固定且ELISA讀取係如例子1中所描述般執行。此程序之結果係於圖1中以三角形給出。
c)iCell®神經元係按照Cellular Dynamics International(CDI)使用者手冊從4種不同的細胞批次解凍並接種在96孔板上。在接種後24小時(h),以新鮮維持的培養基如使用者手冊中所描述般替換培養基。
在進一步72h培育時間後,培養基係移除並以含有變化濃度之BoNT/A的新鮮培養基替換。細胞係放在培養箱中的平板震盪器上,並在毒素曝露期間以300cm/min之一平均流速震盪。
在另一72h後,培養基係吸出,將細胞固定且ELISA讀取係如例子1中所描述般執行。此程序之結果係於圖1中以圓形給出。
d)iCell®神經元係按照Cellular Dynamics
International(CDI)使用者手冊從4種不同的細胞批次解凍並接種在96孔板上。在接種後24小時(h),以新鮮維持的培養基如使用者手冊中所描述般替換培養基。
在進一步72h培育時間後,培養基係移除並以含有變化濃度之BoNT/A的新鮮培養基替換。
在另一72h後,培養基係吸出,將細胞固定且ELISA讀取係如例子1中所描述般執行。此程序之結果係於圖1中給出。
總之,K+介導的細胞去極化、一降低的神經毒素多胜肽曝露時間、或在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞促進例子1之細胞式檢測法之可比擬安定性指示動力學,相較於小鼠LD50生物測定。
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<221> 不能歸類的特性
<222> (20)..(20)
<223> n為a、c、g或t
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<213> 肉毒梭狀芽抱桿菌
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<221> 不能歸類的特性
<222> (7)..(7)
<223> Xaa可以為任何天然發生的胺基酸
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<213> 破傷風梭狀芽孢桿菌
<400> 16
Claims (15)
- 一種用於增進一神經毒素多胜肽進入細胞之特定攝取的方法,該方法包含:在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽培育一時間,該培育包含下列步驟中至少二者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露(exposition)時間,及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞,從而增進該神經毒素多胜肽進入該細胞之特定攝取。
- 如請求項1之方法,繼之測定該神經毒素多胜肽在該細胞中之生物活性。
- 一種用於直接在細胞中測定一神經毒素多胜肽之生物活性的方法,其包含:a)在允許該神經毒素多胜肽發揮其生物活性之條件下,將易受神經毒素毒害細胞與一神經毒素多胜肽培育一時間,該培育包含下列步驟中至少二者:(i)K+介導的細胞去極化,(ii)一降低的神經毒素多胜肽曝露時間;及/或(iii)在神經毒素多胜肽曝露期間攪動該細胞;b)固定該細胞,且任選地以一清潔劑透化(permeablizing)該細胞;c)將該細胞與特異性結合至該無切割及經神經毒素切割受質之至少一第一捕捉抗體,及特異性結合至該經神經 毒素切割受質之切割位點的至少一第二捕捉抗體,在允許該捕捉抗體結合到該受質之條件下接觸;d)將該細胞與特異性結合至該第一捕捉抗體之至少一第一偵測抗體於允許該第一偵測抗體結合至該第一捕捉抗體的條件下接觸,由此形成第一偵測複合物,,以及將該細胞與特異性結合至該第二捕捉抗體之至少一第二偵測抗體於允許該第二偵測抗體結合至該第二捕捉抗體的條件下接觸,由此形成第二偵測複合物;e)測定步驟d)之該第一與第二偵測複合物的量;及f)藉助於該第二偵測複合物,計算在該細胞中由該神經毒素多胜肽所切割的受質量,從而測定該神經毒素多胜肽在該細胞中之生物活性。
- 如請求項1至3中任一項之方法,其中該K+介導的細胞去極化係於約20mM至約55mM之一額外的K+濃度實行,達至少2小時。
- 如請求項1至4中任一項之方法,其中該K+介導的細胞去極化及/或該神經毒素多胜肽曝露係於GT1b存在下實行。
- 如請求項1至5中任一項之方法,其中GT1b係以15及50μM之間的一濃度使用,較佳地20μM。
- 如請求項1至6中任一項之方法,其中該降低的神經毒素多胜肽曝露時間係曝露該細胞於神經毒素多胜肽達至少24小時且小於96小時,較佳地至少48小時且最長72小時。
- 如請求項1至7中任一項之方法,其中在神經毒素多胜肽曝露期間之細胞攪動係以一電磁攪拌器、轉動旋轉式燒瓶,或藉由一震盪器震盪該細胞而實行,較佳地於約25cm/min至約300cm/min之一平均培養基流速下。
- 如請求項1至8中任一項之方法,其中該K+介導的細胞去極化係在20μM的GT1b及神經毒素多胜肽存在下,於至少約20mM至約55mM之一額外的K+濃度,實行達至少2小時,繼之在攪動下神經毒素多胜肽曝露額外70小時。
- 如請求項1至8中任一項之方法,其中一不具神經毒素多胜肽的培育時間係先於該神經毒素多胜肽曝露之前。
- 如請求項1至10中任一項之方法,其中該不具神經毒素多胜肽的培育時間係16與48小時之間。
- 如請求項1至11中任一項之方法,其中該方法係一螢光方法。
- 如請求項1至12中任一項之方法,其中該神經毒素多胜肽為BoNT/A、BoNT/B、BoNT/C1、BoNT/D、BoNT/E、BoNT/F、BoNT/G、BoNT/H、TeNT、或其亞型。
- 如請求項1至13中任一項之方法,其中該受質為VAMP/突觸泡蛋白(synaptobrevin)、SNAP-25或突觸蛋白(Syntaxin)。
- 如請求項1至14中任一項之方法,其中該細胞係神經元細胞或分化為神經元的細胞,其選自由下列所組成之該群組:初代神經元細胞、能夠分化為神經元細胞的腫瘤細胞,諸如神經母細胞瘤細胞、P19細胞或誘發型多能 性幹細胞(IPS)衍生的神經元。
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