ES2822905T3 - Métodos para aumentar la captación específica de las neurotoxinas botulínicas en las células - Google Patents
Métodos para aumentar la captación específica de las neurotoxinas botulínicas en las células Download PDFInfo
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Abstract
Un método in vitro para determinar directamente la actividad biológica de un polipéptido de la neurotoxina en las células, que comprende: a) incubar las células susceptibles a la intoxicación por la neurotoxina con un polipéptido de la neurotoxina durante un tiempo y en condiciones que permitan que el polipéptido de la neurotoxina ejerza su actividad biológica, en donde el polipéptido de la neurotoxina es la neurotoxina botulínica BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G o BoNT/H, y en donde la incubación comprende (i) la despolarización de las células mediada por K+, en donde la despolarización de las células mediada por K+ se lleva a cabo a una concentración final de K+ de 15 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM o 60 mM, durante al menos 30 minutos, y un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina de al menos 24 horas y menos de 96 horas, o (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina de al menos 24 horas y menos de 96 horas y agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina; b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente; c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato no escindido y escindido con la neurotoxina y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de escisión del sustrato escindido con la neurotoxina, en condiciones que permitan la unión de dichos anticuerpos de captura para dichos sustratos; d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, en condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, que forman así primeros complejos de detección y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, en condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, que forman así segundos complejos de detección; e) determinar la cantidad del primer y segundo complejo de detección de la etapa d); y f) determinar la cantidad de sustrato de la neurotoxina total y la cantidad de sustrato escindido por dicho polipéptido de la neurotoxina al mismo tiempo, lo que determina así la actividad biológica de dicho polipéptido de la neurotoxina en dichas células.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos para aumentar la captación específica de las neurotoxinas botulínicas en las células
La presente invención se define en las reivindicaciones 1 a 10.
Clostridium botulinum y Clostridium tetani producen neurotoxinas muy potentes, es decir, toxinas botulínicas (BoNT) y toxina tetánica (TeNT), respectivamente. Estas neurotoxinas clostridiales (CNT) se unen específicamente a las células neuronales e interrumpen la liberación de neurotransmisores. Cada toxina se sintetiza como una proteína monocatenaria inactiva sin procesar de aproximadamente 150 kDa. El procesamiento postraduccional implica la formación de puentes disulfuro y una proteólisis limitada (corte) por parte de las proteasas bacterianas. La neurotoxina activa consta de dos cadenas, una cadena ligera N-terminal de aprox. 50 kDa y una cadena pesada de aprox. 100 kDa unidas por un enlace disulfuro. Las CNT consisten estructural y funcionalmente en tres dominios, es decir, la cadena ligera catalítica, la cadena pesada que abarca el dominio de translocación (mitad N-terminal) y el dominio de unión al receptor (mitad C-terminal); véase, por ejemplo, Krieglstein 1990, Eur. J. Biochem. 188, 39; Krieglstein 1991, Eur. J. Biochem. 202, 41; Krieglstein 1994, J. Protein Chem. 13, 49. Las neurotoxinas botulínicas se sintetizan como complejos moleculares que comprenden la proteína neurotoxina de 150 kDa y las proteínas no tóxicas asociadas. Los tamaños de los complejos difieren con base en la cepa clostridial y los distintos serotipos de la neurotoxina que van desde 300 kDa, más de 500 kDa y 900 kDa. Las proteínas no tóxicas de estos complejos estabilizan la neurotoxina y la protegen contra la degradación; véase Silberstein 2004, Pain Practice 4, S19 - s 26.
Clostridium botulinum secreta siete serotipos antigénicamente distintos designados de A a G de la neurotoxina botulínica (BoNT/A - BoNT/G). Todos los serotipos, junto con la neurotoxina tetánica relacionada (TeNT) secretada por Clostridium tetani, son endoproteasas Zn2+ que bloquean la exocitosis sináptica al escindir las proteínas SNARE; véase Couesnon, 2006, Microbiology, 152, 759. Las CNT causan la parálisis muscular flácida que se observa en el botulismo y el tétanos; véase Fischer 2007, PNAS 104, 10447. Recientemente, se ha identificado un nuevo tipo de toxina botulínica, es decir, BoNT/H; véase Barash y Arnon, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 183-191 y Dover, Barash, Hill, Xie y Arnon, J. Infect. Dis. (2014), 209(2): 192-202. Kroken y otros (Journal of Biological Chemistry 286, p. 26828 26837, 2011) describen la nueva entrada mediada por gangliósidos de la neurotoxina botulínica serotipo D en las neuronas. El documento WO 2009/114748 describe ensayos de actividad de serotipo A de la toxina botulínica basados en inmunología. Keller y otros (Biochemistry 43, p. 526-532, 2004) describen la captación de la neurotoxina botulínica en neuronas cultivadas.
A pesar de sus efectos tóxicos, el complejo de toxina botulínica se ha usado como agente terapéutico en un gran número de enfermedades. La toxina botulínica serotipo A fue aprobada para uso humano en los Estados Unidos en 1989 para el tratamiento del estrabismo, blefaroespasmo y otros trastornos. Está disponible comercialmente como preparación de proteína de la toxina botulínica A (BoNT/A), por ejemplo, con el nombre comercial BOTOX (Allergan, Inc.) o con el nombre comercial DYSPORT/RELOXIN (Ipsen, Ltd). Una preparación mejorada de toxina botulínica A libre de complejos está disponible comercialmente con el nombre comercial XEOMIN (Merz Pharma GmbH & Co. KGaA). Para aplicaciones terapéuticas, la preparación se inyecta directamente en el músculo a tratar. A pH fisiológico, la toxina se libera del complejo proteico y tiene lugar el efecto farmacológico deseado. El efecto de la toxina botulínica es solo temporal, razón por la cual puede ser necesaria la administración repetida de toxina botulínica para mantener un efecto terapéutico.
Las neurotoxinas clostridiales debilitan la fuerza muscular voluntaria y son una terapia eficaz para el estrabismo, la distonía focal, incluida la distonía cervical y el blefaroespasmo esencial benigno. Se ha demostrado además que alivian el espasmo hemifacial y la espasticidad focal y, además, son eficaces en una amplia gama de otras indicaciones, tales como trastornos gastrointestinales, hiperhidrosis y corrección cosmética de arrugas; véase Jost 2007, Drugs 67, 669.
Durante el proceso de fabricación de las neurotoxinas clostridiales, la determinación cualitativa y cuantitativa de dichas neurotoxinas, así como también el control de calidad de los polipéptidos de la neurotoxina biológicamente activos es de particular importancia. Además, las agencias gubernamentales solo aceptan ensayos de actividad de toxina botulínica simples, confiables y validados. En la actualidad, el bioensayo LD50 en ratón, una prueba de letalidad sigue siendo el "estándar de oro" usado por los fabricantes de productos farmacéuticos para analizar la potencia de sus preparaciones; véase Arnon y otros (2001), JAMA 285, 1059-1070. Sin embargo, en los últimos años, se ha realizado un esfuerzo considerable para buscar enfoques alternativos para aliviar la necesidad de pruebas con animales y todas las desventajas, costos y preocupaciones éticas asociadas con este tipo de ensayos basados en animales. Además, las agencias reguladoras están contratando a las compañías farmacéuticas para que apliquen el principio de las tres "R" a las pruebas de potencia de las neurotoxinas botulínicas: "Reducir, Refinar, Reemplazar"; véase Straughan, Altern. Lab. Anim. (2006), 34, 305-313. Como consecuencia, se han desarrollado sistemas de prueba basados en células con el fin de proporcionar alternativas razonables a los métodos que usan animales vivos. Sin embargo, hasta el momento sólo se encuentran disponibles tres sistemas de prueba celulares para la determinación de la actividad biológica de las neurotoxinas que han demostrado ser suficientemente sensibles a los polipéptidos de las neurotoxinas. Estos sistemas de prueba basados en células incluyen el uso de neuronas primarias aisladas de embriones de roedores que se diferencian in vitro (Pellett y otros (2011), Biochem. Biophys. Res. Comun. 404, 388-392), células
madre pluripotentes inducidas diferenciadas neuronales (Whitemarsh y otros (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35) y un subclon de la línea celular SiMa (documento WO 2010/105234 A1).
Sin embargo, el aislamiento de neuronas primarias requiere la matanza de animales y es laborioso y requiere mucho tiempo. Además, los sistemas de prueba que usan diferentes neuronas primarias muestran grandes variaciones. De manera similar, la generación de células madre pluripotentes inducidas diferenciadas neuronales es difícil y requiere mucho tiempo. Además, el almacenamiento de tales células es muy problemático. Los ensayos que usan líneas celulares tumorales con frecuencia no son lo suficientemente sensibles a la BoNT. Además, se requieren protocolos de diferenciación complejos para dichas líneas celulares tumorales que dan como resultado grandes variaciones y/ o altas tasas de fracaso de los ensayos que usan dichas líneas celulares.
A la luz de lo anterior, son muy deseables otros sistemas de prueba para la determinación de la actividad polipeptídica de la neurotoxina.
Por tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención puede verse como la provisión de medios y métodos que satisfagan las necesidades antes mencionadas. El problema técnico se resuelve mediante las modalidades caracterizadas en las reivindicaciones y en la presente descripción más abajo.
En un primer aspecto, la presente descripción se refiere a un método para aumentar la captación específica de un polipéptido de la neurotoxina en las células, el método que comprende:
incubar las células susceptibles a la intoxicación por la neurotoxina con un polipéptido de la neurotoxina durante un tiempo y en condiciones que permitan que el polipéptido de la neurotoxina ejerza su actividad biológica, la incubación que comprende al menos una de las siguientes etapas: (i) despolarización de las células mediada por K+, (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina y/ o (iii) agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina, lo que aumenta así la captación específica del polipéptido de la neurotoxina en dichas células. Preferentemente, este método es un método in vitro.
Los polipéptidos clostridiales de la neurotoxina actúan dentro del terminal sináptico para bloquear la liberación de neurotransmisores. La neurotoxina entra a la neurona mediante la unión a los receptores de la membrana neuronal, es absorbida hacia un compartimiento similar al endosoma y penetra la membrana del endosoma a través de un proceso de translocación dependiente del pH. Una vez dentro del citoplasma sináptico, las neurotoxinas clostridiales escinden sus correspondientes sustratos proteicos SNARE, necesarios para la fusión de las vesículas sinápticas.
Más específicamente, las neurotoxinas clostridiales se caracterizan porque inhiben específicamente la secreción de neurotransmisores de las terminaciones nerviosas presinápticas. La selectividad por neuronas periféricas está mediada por el reconocimiento de diferentes receptores, tales como SV2 y GT1b. Por ejemplo, la captación específica de BoNT/A en las terminales nerviosas presinápticas es un proceso de múltiples etapas estrictamente controlado, que involucra una combinación de receptores de alta y baja afinidad. La unión al gangliósido GT1b media una etapa de unión inicial y, a través de este, concentra BoNT/A en la superficie celular. Una vez anclados en la membrana, los movimientos laterales dentro de la membrana plasmática facilitan las interacciones intermoleculares de BoNT/A con receptores (de proteínas) adicionales, tales como SV2 o FGFR3. El receptor de BoNT/A es el gangliósido GT1b con un bolsillo de unión dentro de la porción C-terminal del dominio de unión al receptor. De acuerdo con el modelo del receptor APR, una serie de receptores presinápticos (APR), agrupados en microdominios en la membrana presináptica, son responsables de la captación específica de las neurotoxinas, incluida la BoNT/A. Es la unión al gangliósido GT1b lo que media en la etapa de unión inicial y concentra la BoNT/A en la superficie celular. Una vez anclados en la membrana, los movimientos laterales dentro de la membrana plasmática facilitan la interacción intermolecular de la BoNT/A con los receptores de proteínas, incluidas las tres isoformas de la glicoproteína 2 de la vesícula sináptica (SV), SV2A (ENSG00000159164), B (ENSG00000185518) y C (ENSG00000122012) que se exponen en la membrana plasmática externa después de la fusión de vesículas sinápticas a la membrana presináptica. La BoNT/A reconoce específicamente el cuarto dominio luminal (LD4) de SV2. Aún no se ha identificado la secuencia específica en el dominio de unión de BoNT/A que interactúa con SV2. SV2A, B y C glicosilados también se han identificado como receptores para BoNT/F y SV2a y B glicosilados como receptores para BoNT/E. Se informó que BoNT/D entra a las neuronas a través de dos sitios de unión de gangliósidos, un sitio en una posición previamente identificada en BoNT/A, B, E, F y G, y el otro sitio que se asemeja al segundo bolsillo de unión de gangliósidos de TeNT. Recientemente, también se ha demostrado que BoNT/D usa SV2 (las tres isoformas) para ingresar a las neuronas del hipocampo, pero BoNT/ D se une a SV2 a través de un mecanismo distinto de BoNT/A y BoNT/ E. También se ha informado que SV2A y SV2B median la unión y la entrada de TeNT en las neuronas centrales; véase Jacky y otros, PLoS Pathog. 2013 mayo; 9(5): e1003369 y referencias allí citadas.
El efecto fisiológico de las neurotoxinas se basa en la escisión de una proteína del complejo SNARE posterior a la unión del receptor y la translocación de la cadena ligera de la neurotoxina. La determinación de la actividad biológica de las neurotoxinas clostridiales es un aspecto importante en la caracterización de dichas proteínas neurotoxinas y es requerida, entre otras cosas, por las autoridades reguladoras para el aclaramiento de productos que contienen neurotoxinas clostridiales. Por tanto, una prueba fiable para la medición de la actividad biológica de las neurotoxinas clostridiales es la base para la investigación, el desarrollo y la comercialización de productos que contienen neurotoxinas clostridiales. Además, los sistemas de ensayo basados en células sustituirán a los ensayos con animales
predominantes hasta ahora por razones éticas. Para establecer tales sistemas de prueba basados en células, es esencial una sensibilidad suficientemente alta de células neuronales o líneas celulares hacia las neurotoxinas clostridiales.
Los presentes inventores han descubierto ventajosamente que la captación específica de polipéptidos clostridiales de la neurotoxina en células susceptibles a la intoxicación por neurotoxina clostridial puede incrementarse mediante al menos una de las siguientes etapas: (i) despolarización de las células mediada por K+, (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina o (iii) agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina. Al mismo tiempo, puede reducirse la absorción inespecífica del polipéptido de la neurotoxina o los productos de degradación de la misma, mediante estas medidas. En particular, la captación celular inespecífica de la neurotoxina mencionada o los productos de degradación de la misma se reduce mediante una reducción del período de tiempo en el que las células se incuban con la neurotoxina. La despolarización de las células mediada por K+ estimula la captación específica de la neurotoxina. Además, la agitación de las células tras la intoxicación por la neurotoxina influye en la concentración de biofase adyacente a la membrana neuronal y, por lo tanto, puede reducir la captación inespecífica, así como también aumentar la captación específica de la neurotoxina en las células. Los datos correspondientes se muestran en los siguientes ejemplos. Además, la figura 1 muestra una comparación de tres ejemplos de ensayo basados en células, donde las muestras estresadas muestran una cinética comparable en decadencia con el ensayo de referencia, el bioensayo LD50 en ratón.
Por consiguiente, en un aspecto del método de la descripción, se reduce la captación celular inespecífica del polipéptido de la neurotoxina o los productos de degradación del mismo.
La presente descripción también comprende la selectividad por moléculas dañadas, por ejemplo, por degradación como efecto del almacenamiento de estabilidad de la neurotoxina botulínica. Dado que la liberación del neurotransmisor es inducida por la despolarización mediada por K+, el siguiente aumento en la recaptación de vesículas comprende la captación específica mediante la unión a receptores como GT1b y/o miembros de la familia de proteínas SV2. Una molécula alterada puede exhibir una unión más débil o nula a un receptor. Lo mismo se aplica a las influencias físicas como las agitaciones. Una unión menos estable de la molécula dañada incluso se reducirá mediante agitación.
Con el fin de aumentar la captación específica de un polipéptido de la neurotoxina en las células que son susceptibles de intoxicación por la neurotoxina, se incuban con un polipéptido de la neurotoxina durante un período de tiempo y en condiciones que permitan que el polipéptido de la neurotoxina ejerza su actividad biológica. Estos periodos de tiempo y condiciones de cultivo celular son conocidos en la técnica. En el método de la descripción, las condiciones de cultivo celular comprenden al menos una de las siguientes etapas: (i) despolarización de las células mediada por K+, (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina o (iii) agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina. El método de la descripción también puede abarcar al menos dos de las etapas mencionadas, por ejemplo, las etapas (i) y (ii), las etapas (i) y (iii), las etapas (ii) y (iii), o las tres de las etapas (i) a (iii). Se prefiere que las condiciones de cultivo celular comprendan cada una de las siguientes etapas, es decir (i) despolarización de las células mediada por K+, (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina y (iii) agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina.
Normalmente, el medio de cultivo celular usado en los ensayos de actividad de la neurotoxina en la técnica contiene aproximadamente 5 mM de K+. Las neuronas suelen establecer un gradiente iónico al transportar activamente iones K+ desde el medio a la célula y iones Na+ desde el citosol a través de la membrana plasmática hacia el exterior de la célula. El resultado es un potencial de membrana que está estrictamente regulado por la célula y que es la base de varios procesos celulares diferentes, incluida la comunicación entre células. Un cambio repentino de la permeabilidad iónica específica de la membrana plasmática o una alteración rápida de la composición iónica a ambos lados de la membrana conduce a un cambio del potencial de membrana llamado despolarización. La despolarización de las células mediada por K+ puede llevarse a cabo a una mayor concentración de K+ en el medio de cultivo celular, por ejemplo, una concentración adicional de K+ de aproximadamente 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, o 55 mM. La concentración final de K+ en el método de la descripción puede ser de aproximadamente 15 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM o 60 mM de K+. El periodo de tiempo de la despolarización mediada por K+ es de al menos aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 1 hora y media, 2 horas, 2 horas y media, 3 horas o incluso más.
La despolarización de las células mediada por K+ y/o la exposición al polipéptido de la neurotoxina puede realizarse en presencia del gangliósido GT1b. GT1b puede usarse en una concentración de aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 o 60 pM, preferentemente entre aproximadamente 15 pM y aproximadamente 50 pM, con mayor preferencia aproximadamente 20 pM.
El tiempo de exposición al polipéptido de la neurotoxina usado en la técnica es normalmente entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 96 horas, frecuentemente aproximadamente 72 horas. El tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina es la intoxicación de las células con el polipéptido de la neurotoxina durante al menos 24 horas y menos de 96 horas, preferentemente durante al menos 48 horas, al menos 60 horas y 72 horas como máximo.
La agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina puede llevarse a cabo mediante el uso de los medios y métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, un agitador magnético, matraces giratorios o agitación de las células con la utilización de agitadores. La agitación de las células se realiza a una velocidad de flujo del medio de cultivo celular apropiado que evita el desprendimiento de las células del matraz de tejido. Los regímenes de flujo adecuados del medio están, por ejemplo, entre aproximadamente 25 cm/min y aproximadamente 300 cm/min.
La despolarización de las células mediada por K+ antes mencionada también puede llevarse a cabo en presencia de GT1b y el polipéptido de la neurotoxina, seguido de una exposición al polipéptido de la neurotoxina durante un período de tiempo adicional, como aproximadamente 24 horas, 36 horas, 48 horas, 60 horas o 72 horas, bajo agitación.
También se prevé que un tiempo de incubación sin polipéptido de la neurotoxina preceda a la exposición al polipéptido de la neurotoxina. Por ejemplo, el tiempo de incubación sin el polipéptido de la neurotoxina puede ser, aproximadamente, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 54 o 60 horas, preferentemente entre aproximadamente 16 y aproximadamente 48 horas.
Otras modalidades preferidas del método de la descripción pueden derivarse de los siguientes ejemplos.
El término "polipéptido de la neurotoxina" o brevemente "neurotoxina" o "toxina" como se hace referencia en la presente descripción denota neurotoxinas clostridiales, es decir, neurotoxinas de Clostridium botulinum y Clostridium tetani, en particular neurotoxinas botulínicas (BoNT) y neurotoxina tetánica (TeNT). Más específicamente, dicho término comprende BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H (Barash y Arnon, J. Infect. Dis. (2014), 209 (2): 183-191) y neurotoxina tetánica (TeNT), así como también sus subtipos. Por ejemplo, los subtipos de BonT/A incluyen BoNT/A1, BoNT/A2, BoNT/A3, BoNT/A4 y BoNT/A5. Los subtipos de BoNT/B abarcan, por ejemplo, BoNT/B1, BoNT/B2, BoNT/B3, BoNT/B4, BoNT/B5, BoNT/B6, BoNT/B7 y BoNT/B8. Los subtipos de BoNT/C comprenden, por ejemplo, BoNT/Cl-1 y BoNT/Cl-2. Se abarca también el subtipo BoNT/DC. Los subtipos de BoNT/E incluyen, por ejemplo, BoNT/E1, BoNT/E2, BoNT/E3, BoNT/E4, BoNT/E5, BoNT/E6, BoNT/E7, BoNT/E8 y BoNT/E9. Además, los subtipos de BoNT/F comprenden, por ejemplo, BoNT/F1, BoNT/F2, BoNT/F3, BoNT/F4, BoNT/F5, BoNT/F6 y BoNT/F7. Se describen los subtipos adicionales, por ejemplo, en Hill y otros (J Bacteriol. 2007 Feb; 189 (3): 818-32. Epub 2006 17 de noviembre). El polipéptido de la neurotoxina y, en particular, su cadena ligera y cadena pesada son derivables de uno de los serotipos antigénicamente diferentes de las neurotoxinas botulínicas o subtipos indicados anteriormente. En un aspecto, dichas cadenas ligera y pesada del polipéptido de la neurotoxina son la cadena ligera y pesada de una neurotoxina seleccionada del grupo que consiste en: BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H o TeNT. En otro aspecto, el polinucleótido que codifica dichos polipéptidos de la neurotoxina comprende una secuencia de ácido nucleico como se muestra en SEQ ID NO: 1 (BoNT/A), SEQ ID NO: 3 (BoNT/B), SEQ ID NO: 5 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 7 (BoNT/D), SEQ ID NO: 9 (BoNT/E), SEQ ID NO: 11 (BoNT/F), SEQ ID NO: 13 (BoNT/G) o SEQ ID NO: 15 (TeNT). Además, se incluye, en un aspecto, un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de SEQ ID NO: 2 (BoNT/A), SEQ ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) o SEQ ID NO: 16 (TeNT). También se incluye en un aspecto del método de la presente descripción, un polipéptido de la neurotoxina que comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en: SEC ID NO: 2 (BoNT/A), SEC ID NO: 4 (BoNT/B), SEQ ID NO: 6 (BoNT/C1), SEQ ID NO: 8 (BoNT/D), SEQ ID NO: 10 (BoNT/E), SEQ ID NO: 12 (BoNT/F), SEQ ID NO: 14 (BoNT/G) y SEQ ID NO: 16 (TeNT). También se incluye la secuencia de aminoácidos y ácido nucleico correspondiente de la BoNT/H descrita recientemente como se muestra, por ejemplo, en Dover, N. y otros, (2014), J Infect Dis 209 (2): 192-202.
En otro aspecto, dicho polinucleótido es una variante de los polinucleótidos o polipéptidos mencionados anteriormente. La variante puede ser un polinucleótido o polipéptido de la neurotoxina de origen natural, tal como las isoformas o subtipos de la neurotoxina clostridial mencionados anteriormente. Por ejemplo, los expertos en la técnica reconocen que dentro de cada serotipo de la neurotoxina botulínica puede haber variantes de la neurotoxina botulínica de origen natural que difieren algo en su secuencia de aminoácidos y también en los ácidos nucleicos que codifican estas proteínas.
La variante también puede ser un polipéptido no natural de la neurotoxina. Como se usa en la presente descripción, el término "variante no natural" de una neurotoxina clostridial significa una neurotoxina clostridial producida con la ayuda de manipulación humana, que incluye, sin limitación, neurotoxina clostridial producida por ingeniería genética o métodos recombinantes, por ejemplo, mediante el uso de mutagénesis aleatoria o diseño racional, variantes enzimáticamente modificadas de las neurotoxinas clostridiales que son modificadas por la actividad de enzimas, tales como enzimas endo o exoproteolíticas, o neurotoxinas clostridiales producidas por síntesis química. "Manipulación genética" se refiere a métodos conocidos en la técnica para modificar la neurotoxina clostridial nativa de cualquier serotipo/subtipo mediante la modificación del gen que codifica la neurotoxina clostridial o los ácidos nucleicos respectivos como ADN o ARNm. Los métodos recombinantes para la ingeniería genética de un polinucleótido que codifica un polipéptido de la neurotoxina o un polipéptido de la neurotoxina están bien descritos en la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook, J. Y Russell, D. (2001). Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 3a ed. Cold Spring Harbor, Nueva York: Laboratorio de Cold Spring Harbor.
Además, una variante de origen natural o no natural del polinucleótido tal como se refiere en la presente descripción comprenderá en otro aspecto una variante de secuencia de ácido nucleico que sea al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 % , al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 o 15, o la secuencia de ácido nucleico de BoNT/H como se muestra en Dover, N. y otros, (2014), J Infect Dis 209 (2): 192-202, o una variante de la secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos que es al menos 40 %, al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos como se muestra en cualquiera de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16, o la secuencia de aminoácidos de BoNT/H como se muestra en Dover, N. y otros, (2014), J Infect Dis 209 (2): 192-202. El término "idéntico" como se usa en la presente descripción se refiere a la identidad de secuencia caracterizada por determinar el número de aminoácidos idénticos entre dos secuencias de ácido nucleico o dos secuencias de aminoácidos en donde las secuencias están alineadas de modo que se obtenga la coincidencia de orden más alto. Puede calcularse mediante el uso de las técnicas publicadas o los métodos codificados en programas informáticos tales como, por ejemplo, BLASTP, BLASTN o FASTA (Altschul 1990, J Mol Biol 215, 403). Los valores de porcentaje de identidad se calculan, en un aspecto, sobre la secuencia de aminoácidos completa, por ejemplo, la cadena ligera o la cadena pesada del polipéptido de la neurotoxina o ambas. El experto en la materia dispone de una serie de programas basados en una variedad de algoritmos para comparar diferentes secuencias. En este contexto, los algoritmos de Needleman y Wunsch o Smith y Waterman dan resultados particularmente fiables. Para llevar a cabo los alineamientos de secuencia, el programa PileUp (Higgins 1989, CABIOS 5, 151) o los programas Gap y BestFit (Needleman 1970, J Mol Biol 48; 443; Smith 1981, Adv Appl Math 2, 482), que forman parte del paquete de software GCG (Genetics Computer Group 1991, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EE.UU. 53711) pueden usarse. Los valores de identidad de secuencia citados anteriormente en porcentaje (%) deben determinarse, en otro aspecto de la descripción, mediante el uso del programa GAP en toda la región de secuencia con las siguientes configuraciones: Peso de Separación: 50, Peso de Longitud: 3, Coincidencia Promedio: 10000 y desajuste medio: 0,000, que, a menos que se especifique de cualquier otra manera, siempre se usará como configuración estándar para alineaciones de secuencia. En un aspecto, cada uno de las variantes de los polinucleótidos antes mencionados codifica un polipéptido que retiene uno o más y, en otro aspecto, todas las propiedades biológicas definidas en la presente descripción del polipéptido de la neurotoxina respectivo, es decir, la BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/H o neurotoxina tetánica (TeNT). Los expertos en la técnica apreciarán que la actividad biológica completa se mantiene solo después de la activación proteolítica, aunque es concebible que el precursor no procesado pueda ejercer algunas funciones biológicas o ser parcialmente activo. Los ensayos in vivo para evaluar la actividad biológica de una neurotoxina clostridial incluyen el ensayo de LD50 de ratón y el ensayo de hemidiafragma de ratón ex vivo, como describen Pearce y otros (Pearce 1994, Toxicol. Appl. Pharmacol. 128: 69-77) y Dressler y otros (Dressler 2005, Mov. Disord. 20: 1617-1619, Keller 2006, Neuroscience 139: 629-637). La actividad biológica se expresa comúnmente en Unidades de Ratón (MU). Como se usa en la presente descripción, 1 MU es la cantidad del componente neurotóxico, que mata al 50 % de una población específica de ratones después de la inyección intraperitoneal, es decir, la LD50 i.p. de ratón En un aspecto adicional, las variantes de los polinucleótidos pueden codificar neurotoxinas que tienen propiedades biológicas mejoradas o alteradas, por ejemplo, pueden comprender sitios de escisión que se mejoran para el reconocimiento de enzimas y/o pueden mejorarse para la unión al receptor, internalización, translocación a través de la membrana endosomal en el citosol o la escisión endoproteolítica del sustrato correspondiente de la familia de proteínas SNARE.
Los ejemplos no limitantes de las variantes de la neurotoxina clostridial de origen no natural incluyen, por ejemplo, las variantes conservadoras de la neurotoxina clostridial. Como se usa en la presente descripción, el término "variante conservadora de la neurotoxina clostridial" significa una neurotoxina clostridial que tiene al menos un aminoácido sustituido por otro aminoácido o un análogo de aminoácido que tiene al menos una propiedad similar a la del aminoácido original de la secuencia de referencia de la neurotoxina clostridial como se expone en otra parte de la presente descripción, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 o 16 o la secuencia de aminoácidos de BoNT/H como se muestra en Dover, N. y otros, (2014), J Infect Dis 209 (2): 192-202. La variante puede tener una, dos, tres, cuatro, cinco o incluso sustituciones de aminoácidos más conservadoras en comparación con la secuencia de referencia. La variante tendrá propiedades comparables o incluso mejoradas de la secuencia de referencia de la neurotoxina clostridial. Los ejemplos de propiedades incluyen, sin limitación, tamaño, topografía, carga, hidrofobicidad, hidrofilicidad, lipofilia, capacidad de unión covalente, capacidad de unión de hidrógeno, una propiedad fisicoquímica similar, o cualquier combinación de las mismas, de tamaño similar, topografía, carga, hidrofobicidad, o cualquier combinación de las mismas. Preferentemente, la propiedad es una propiedad biológica como se define en otra parte de la presente descripción, es decir (a) unión al receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosomal al citosol y/o (d) escisión endoproteolítica de proteínas involucradas en la fusión de la membrana de la vesícula sináptica. Una variante conservadora de la neurotoxina clostridial puede funcionar sustancialmente de la misma manera que la neurotoxina clostridial de referencia en la que se basa la variante conservadora de la neurotoxina clostridial, y puede sustituirse por la neurotoxina clostridial de referencia en cualquier aspecto de la presente descripción. La neurotoxina clostridial descrita en la presente descripción típicamente contendrá residuos de aminoácidos de origen natural, pero en algunos casos también pueden estar presentes residuos de aminoácidos de origen no natural. Por tanto, los denominados " péptidos miméticos" y "análogos de péptidos", que pueden incluir estructuras químicas que no son aminoácidos que imitan la estructura de un aminoácido o péptido particular, también pueden usarse dentro del contexto de la descripción. Tales miméticos o análogos se caracterizan
generalmente por exhibir características físicas similares tales como tamaño, carga o hidrofobicidad, y la orientación espacial apropiada que se encuentra en sus contrapartes de péptidos naturales. Un ejemplo específico de un compuesto mimético de péptido es un compuesto en el que el enlace amida entre uno o más de los aminoácidos se reemplaza por, por ejemplo, un enlace carbono-carbono u otro enlace no amida, como es bien conocido en la técnica; véase, por ejemplo, Sawyer, en Peptide Based Drug Design, págs. 378-422, ACS, Washington DC 1995.
La variante de polipéptido de la neurotoxina como se usa en la presente descripción comprende además los polipéptidos de la neurotoxina modificados químicamente. "Modificación química" como se usa en la presente descripción se refiere generalmente a los métodos conocidos en la técnica para modificar la neurotoxina clostridial nativa o recombinante de cualquier serotipo o subtipo por medio de reacciones químicas o similares; se refiere especialmente a sustituciones, deleciones, inserciones, adiciones o modificaciones postraduccionales de aminoácidos de la neurotoxina clostridial. Un polipéptido de la neurotoxina químicamente modificado puede ser uno que se modifica por piruvato, fosforilación, sulfatación, lipidación, pegilación, glicosilación y/o la adición química de un aminoácido o un polipéptido que comprende, por ejemplo, entre aproximadamente dos y aproximadamente 500 aminoácidos. Por ejemplo, al incorporar ácido hialurónico o polivinilpirrolidona o polietilenglicol o mezclas de los mismos en el polipéptido de la neurotoxina, puede estabilizarse la neurotoxina clostridial o la toxina que se deriva de la toxina clostridial mediante modificación química o manipulación genética.
Otra variante de origen no natural de la neurotoxina clostridial que puede usarse en el método de la descripción es una neurotoxina clostridial híbrida. En un aspecto, la neurotoxina clostridial híbrida comprende una combinación de una cadena pesada y una cadena ligera de la neurotoxina clostridial, en donde la cadena ligera y la cadena pesada no son del mismo serotipo o subtipo.
Los métodos para fabricar tales variantes modificadas química, enzimática o genéticamente de las neurotoxinas clostridiales, y los métodos para identificar si dichas variantes mantienen las propiedades biológicas a las que se hace referencia en la presente descripción, tales como (a) unión al receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosomal al citosol y/o (d) la escisión endoproteolítica de las proteínas implicadas en la fusión de la membrana de la vesícula sináptica son bien conocidas por cualquier experto en la técnica; véase, por ejemplo, Sambrook, loc. cit.
El término "actividad biológica de un polipéptido de la neurotoxina" como se usa en la presente descripción significa las propiedades biológicas características de un polipéptido de la neurotoxina, a saber, a) unión al receptor, (b) internalización, (c) translocación a través de la membrana endosomal al citosol y/o (d) escisión endoproteolítica de proteínas implicadas en la fusión de la membrana de la vesícula sináptica. Se prevé que el polipéptido de la neurotoxina como se usa en la presente descripción exhibe al menos una de las propiedades a) a d) mencionadas anteriormente, preferentemente escisión endoproteolítica de proteínas involucradas en la fusión de la membrana de la vesícula sináptica, o dos o tres o las cuatro propiedades biológicas enumeradas en a) a d). Los ensayos para determinar la actividad biológica de los polipéptidos de la neurotoxina son bien conocidos en la técnica y también se describen en otra parte de la presente descripción; véase, por ejemplo, Pellett y otros (2011), Biochem. Biophys. Res. Comun. 404, 388-392; Whitemarsh y otros (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35.
SNAP-25 es un sustrato conocido y escindido por BoNT/A, BoNT/C1 y BoNT/E. VAMP/Sinaptobrevina es un sustrato y escindido por BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G y TeNT, mientras que la sintaxina es un sustrato y escindida por BoNT/C1. Los sustratos mencionados y las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos correspondientes son bien conocidos en la técnica; véase, por ejemplo, el documento WO 2014/207109.
Como se usa en la presente descripción, el término "célula" se refiere a cualquier célula eucariota susceptible de intoxicación por la neurotoxina por una neurotoxina tal como, por ejemplo, BoNT/A, o cualquier célula eucariota que pueda captar una neurotoxina. Los aspectos de la presente descripción comprenden, en parte, una célula de una línea celular establecida. El término "célula" abarca células de una variedad de organismos, tales como, por ejemplo, células murinas, de rata, porcinas, bovinas, equinas, de rhesus, primates y humanas; de una variedad de tipos de células tales como, por ejemplo, neuronales y no neuronales; y puede aislarse de o ser parte de una población de células, tejido u organismo heterogéneos. Debe entenderse que las células embrionarias humanas están excluidas del alcance del método de la invención. Como se usa en la presente descripción, el término "línea celular establecida" es sinónimo de "línea celular inmortal" o "línea celular transformada" y se refiere a un cultivo celular de células seleccionadas para la propagación indefinida a partir de una población celular derivada de un organismo, tejido o fuente de órganos. Por definición, una línea celular establecida excluye un cultivo celular de células primarias. Como se usa en la presente descripción, el término "células primarias" son células cultivadas directamente de tejidos u órganos frescos y no tienen el potencial de propagarse indefinidamente. Por ejemplo, pueden usarse células neuronales primarias en el método de la invención. Una línea celular establecida puede comprender una población heterogénea de células o una población uniforme de células. Una línea celular establecida derivada de una sola célula se denomina línea celular clonal. Una línea celular establecida puede ser aquella cuyas células expresan endógenamente todos los componentes necesarios para que las células se sometan al mecanismo celular general por el cual una neurotoxina, como BoNT/A, escinde proteolíticamente un sustrato, como SNAP-25, y abarca la unión de una neurotoxina a un receptor de la neurotoxina, tal como BoNT/A, a un receptor de BoNT/A, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la neurotoxina desde una vesícula intracelular al
citoplasma y la escisión proteolítica de un sustrato de la neurotoxina. Alternativamente, una línea celular establecida puede ser aquella cuyas células han introducido de una fuente exógena al menos un componente necesario para que las células experimenten el mecanismo celular general por el cual una neurotoxina, tal como BoNT/A, escinde proteolíticamente un sustrato, como SNAP-25, y abarca la unión de una neurotoxina a un receptor, como BoNT/A a un receptor de BoNT/A, la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la neurotoxina de una vesícula intracelular al citoplasma y la escisión proteolítica de un sustrato de la neurotoxina. También denominada línea celular modificada genéticamente, las células de dicha línea celular establecida pueden, por ejemplo, expresar un FGFR2 exógeno, un FGFR3 exógeno, un SV2 exógeno, un sustrato de la neurotoxina exógeno como SNAP-25, o cualquier combinación de los mismos.
"Cultivo celular", como se usa en la presente descripción, se refiere en el sentido más amplio a la eliminación de células de un animal o humano y su posterior crecimiento en un entorno artificial favorable. Las células pueden extraerse del tejido directamente y desagregarse por medios enzimáticos o mecánicos antes del cultivo, o pueden derivarse de una línea celular o cepa celular que ya se ha establecido. El cultivo primario se refiere a la etapa del cultivo después de que las células se aíslan del tejido y proliferan en las condiciones apropiadas hasta que ocupan todo el sustrato disponible, es decir, alcanzan la confluencia. En esta etapa, las células deben subcultivarse, es decir, pasarlas transfiriéndolas a un nuevo recipiente con medio de crecimiento fresco para proporcionar más espacio para el crecimiento continuo. Las células normales generalmente se dividen solo un número limitado de veces antes de perder su capacidad de proliferar, que es un evento determinado genéticamente conocido como senescencia; estas líneas celulares se conocen como finitas. Sin embargo, algunas líneas celulares se vuelven inmortales a través de un proceso llamado transformación, que puede ocurrir espontáneamente o puede ser inducida química o viralmente. Cuando una línea celular finita se transforma y adquiere la capacidad de dividirse indefinidamente, se convierte en una línea celular continua. Las condiciones de cultivo varían ampliamente para cada tipo de célula, pero el entorno artificial en el que se cultivan las células consiste invariablemente en un recipiente adecuado que contiene lo siguiente: un sustrato o medio que suministra los nutrientes esenciales (aminoácidos, carbohidratos, vitaminas, minerales), factores de crecimiento, hormonas, gases (O2 , CO2), un entorno físico-químico regulado (pH, presión osmótica, temperatura), etc. La mayoría de las células dependen del anclaje y deben cultivarse mientras están unidas a un sustrato sólido o semisólido (adherente o cultivo en monocapa), mientras que otros pueden crecer flotando en el medio de cultivo (cultivo en suspensión).
El término "células susceptibles a la intoxicación por la neurotoxina", como se indica en la presente descripción, significa una célula que puede sufrir los mecanismos celulares generales mediante los cuales un polipéptido de la neurotoxina (por ejemplo, BoNT/A) escinde un sustrato de la neurotoxina (por ejemplo, el sustrato de BoNT/A SNAP-25) y abarca la unión del polipéptido de la neurotoxina a su receptor correspondiente (por ejemplo, unión de BoNT/A al receptor de BoNT/A), la internalización del complejo neurotoxina/receptor, la translocación de la cadena ligera de la neurotoxina desde una vesícula intracelular en el citoplasma y la escisión proteolítica del sustrato de la neurotoxina. Por consiguiente, una "célula susceptible a la intoxicación por neurotoxina", como se usa en la presente descripción, significa una célula sensible a neurotoxina. El término mencionado comprende una célula o una línea celular, por ejemplo, una célula primaria aislada o una línea celular de la misma o una célula de una línea celular establecida o una línea celular establecida, por ejemplo, células tumorales o líneas celulares tumorales que son capaces de diferenciarse en células neuronales, tales como células de neuroblastoma o líneas celulares de neuroblastoma como se define en otra parte de la presente descripción. Por ejemplo, dicha línea celular de neuroblastoma puede ser una línea celular SiMa que está disponible comercialmente de DSMZ (ACC 164). Los clones específicos de la línea celular SiMa se describen además en el documento WO 2010/105234. Otras líneas celulares de neuroblastoma que pueden usarse en el método de la invención pueden obtenerse de ATCC o DSMZ, con los siguientes números ATCC o DSMZ: Línea celular N1E-115 bajo CRL-2263, línea celular Neuro2a bajo CCL-131, línea celular SH-SY5Y bajo CRL-2266, línea celular PC12 bajo CRL-1721, línea celular MHH-NB-11 bajo ACC 157 (DSMZ) y línea celular SK-N-BE(2) bajo CRL-2271. Otras células tumorales que son susceptibles a la intoxicación por neurotoxina son las células P-19 (línea celular de carcinoma embrionario murino) (DSMZ núm. ACC 316). En algunos aspectos, por ejemplo, para ensayos de actividad, puede ser necesario diferenciar dichas células en células neuronales. Tales métodos de diferenciación están bien descritos en la literatura. Además, dentro de las células susceptibles de intoxicación por neurotoxinas se encuentran las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (iPS), preferentemente neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPS); véase, por ejemplo, Whitemarsh y otros (2012), loc. cit. Tales neuronas derivadas de iPS humanas también están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Cellular Dynamics. Los métodos para generar células iPS se describen, por ejemplo, en Yu y otros (Science, 8 de mayo de 2009; 324(5928): 797-801. Epub 2009), documentos WO 2011/056971 y WO 2011/025852. En algunos aspectos, las iPS se diferencian en neuronas mediante el uso de los métodos adecuados, por ejemplo, los descritos en el documento WO 2012/135621 y las solicitudes de patente de EE.UU. US 2010/0279403 y US 2010/0216181.
Los términos "diferenciación", "diferenciar" o "diferenciado", como se usan en la presente descripción, indican el proceso mediante el cual una célula no especializada o relativamente menos especializada se vuelve relativamente más especializada. En el contexto de la ontogenia celular, el adjetivo "diferenciado" es un término relativo. Por tanto, una "célula diferenciada" es una célula que ha progresado más en una determinada vía de desarrollo que la célula con la que se está comparando. Una célula diferenciada puede ser, por ejemplo, una célula diferenciada terminalmente, es decir, una célula completamente especializada que asume funciones especializadas en varios tejidos y órganos de un organismo, y que puede ser posmitótica, pero no necesariamente. Por ejemplo, las neuronas
iCell® se diferencian terminalmente de las células iPS humanas y exhiben características y funciones neuronales. En otro ejemplo, una célula diferenciada también puede ser una célula progenitora dentro de un linaje de diferenciación, que puede proliferar y/o diferenciarse más. De manera similar, una célula es "relativamente más especializada" si ha progresado más en una determinada ruta de desarrollo que la célula con la que se está comparando, en donde esta última se considera, por tanto, "no especializada" o "relativamente menos especializada". Una célula relativamente más especializada puede diferir de la célula no especializada o relativamente menos especializada en una o más características fenotípicas demostrables, como, por ejemplo, la presencia, ausencia o nivel de expresión de componentes o productos celulares particulares, por ejemplo, ARN, proteínas, marcadores celulares específicos u otras sustancias, actividad de ciertas vías bioquímicas, apariencia morfológica, capacidad de proliferación y/o cinética, potencial de diferenciación y/o respuesta a señales de diferenciación, etc., en donde tales características significan la progresión de la célula relativamente más especializada hacia dicha vía de desarrollo. Las condiciones de cultivo celular para diferenciar células en células neuronales son bien conocidas en la técnica como es evidente a partir de la bibliografía citada en la presente descripción.
Además, las condiciones de cultivo celular para incubar células susceptibles a la intoxicación por neurotoxina con un polipéptido de la neurotoxina durante un tiempo y en condiciones que permitan que el polipéptido de la neurotoxina ejerza su actividad biológica están bien descritas en la técnica y también pueden derivarse de las publicaciones citadas en la presente descripción.
El término "captación específica del polipéptido de la neurotoxina" como se usa en la presente descripción significa un proceso en el que el polipéptido de la neurotoxina entra a la neurona y se une a su receptor o receptores específicos de la membrana neuronal, por ejemplo, SV2, gangliósidos, GD1a, Sinaptotagmina II para BoNT/B, o Sinaptotagmina I para BoNT/D-C, se recoge en un compartimento similar al endosoma y penetra en la membrana del endosoma mediante un proceso de translocación dependiente del pH. Por consiguiente, el término mencionado abarca a) la unión al receptor del polipéptido de la neurotoxina, (b) la internalización del polipéptido de la neurotoxina y (c) la translocación del polipéptido de la neurotoxina a través de la membrana endosomal al citosol. Como apreciarán los expertos en la técnica, la célula sensible a neurotoxinas es preferentemente capaz de captar primero una neurotoxina y luego experimenta los mecanismos celulares generales enumerados anteriormente. La expresión "captación inespecífica o inespecífica de un polipéptido de la neurotoxina", como se indica en la presente descripción, significa un proceso en el que el polipéptido de la neurotoxina o un producto de degradación del mismo entra a la neurona al unirse a receptores de membrana neuronal no específicos o al ingresar a la célula a través de mecanismos inespecíficos, por ejemplo, por un transporte conjunto accidental en caso de pinocitosis. Una célula sensible a neurotoxinas como se usa en la presente descripción puede absorber, por ejemplo, aproximadamente 100 nanomolar (nM), aproximadamente 10 nM, aproximadamente 1 nM, aproximadamente 500 picomolar (pM), aproximadamente 400 pM, aproximadamente 300 pM, aproximadamente 200 pM, aproximadamente 100 pM, aproximadamente 90 pM, aproximadamente 80 pM, aproximadamente 70 pM, aproximadamente 60 pM, aproximadamente 50 pM, aproximadamente 40 pM, aproximadamente 30 pM, aproximadamente 20 pM, aproximadamente 10 pM, aproximadamente 9 pM, aproximadamente 8 pM, aproximadamente 7 pM, aproximadamente 6 pM, aproximadamente 5 pM, aproximadamente 4 pM, aproximadamente 3 pM, aproximadamente 2 pM, aproximadamente 1 pM, aproximadamente 0,5 pM o aproximadamente 0,1 pM de polipéptido de la neurotoxina o menos de uno de los valores indicados. Se han informado en la bibliografía valores de EC50 superiores a 100 pM. Por definición, una célula susceptible a la intoxicación por neurotoxina debe expresar, o diseñarse para expresar, al menos un receptor de la neurotoxina y al menos un sustrato de la neurotoxina. Los receptores y sustratos para neurotoxinas se describen en la técnica y se mencionan en otra parte de la presente descripción. Por consiguiente, dicha célula es preferentemente susceptible a un polipéptido de la neurotoxina maduro o biológicamente activo como se definió en la presente descripción. Preferentemente, la célula sensible a neurotoxinas como se usa en la presente descripción es susceptible a la intoxicación por neurotoxina por, por ejemplo, aproximadamente 1 nM o menos, 500 pM o menos, aproximadamente 400 pM o menos, aproximadamente 300 pM o menos, aproximadamente 200 pM o menos, aproximadamente 100 pM o menos , aproximadamente 90 pM o menos , aproximadamente 80 pM o menos aproximadamente 70 pM o menos, aproximadamente 60 pM o menos, aproximadamente 50 pM o menos, aproximadamente 40 pM o menos, aproximadamente 30 pM o menos, aproximadamente 20 pM o menos, aproximadamente 10 pM o menos , aproximadamente 9 pM o menos, aproximadamente 8 pM o menos, aproximadamente 7 pM o menos, aproximadamente 6 pM o menos, aproximadamente 5 pM o menos, aproximadamente 4 pM o menos, aproximadamente 3 pM o menos, aproximadamente 2 pM o menos, aproximadamente 1 pM o menos, aproximadamente 0,9 pM o menos, aproximadamente 0,8 pM o menos, aproximadamente 0,7 pM o menos, aproximadamente 0,6 pM o menos, aproximadamente 0,5 pM o menos, aproximadamente 0,4 pM o menos, aproximadamente 0,3 pM o menos, aproximadamente 0,2 pM o menos, o incluso aproximadamente 0,1 pM o menos. Como se conoce en la técnica, la "concentración media máxima eficaz (EC50)" se refiere a la concentración de un fármaco, anticuerpo o tóxico que induce una respuesta a la mitad entre la línea base y el máximo después de un tiempo de exposición especificado. Se usa comúnmente como una medida de la potencia de un medicamento. Por tanto, la EC50 de una curva de respuesta a dosis graduada representa la concentración de un compuesto en la que se observa el 50 % de su efecto máximo. La EC50 de una curva de respuesta a la dosis cuántica representa la concentración de un compuesto donde el 50 % de la población presenta una respuesta, después de una duración de exposición. Se conocen en la técnica métodos para la identificación de células o líneas celulares susceptibles de intoxicación por neurotoxinas y/o que tienen capacidad de captación de las neurotoxinas, es decir, células sensibles a neurotoxinas como se definen en la presente descripción; véase, por ejemplo, el documento US
2012/0122128 A1. La actividad biológica de los polipéptidos de la neurotoxina, en un aspecto, resulta de todas las propiedades biológicas mencionadas anteriormente. Hasta ahora, sólo se han descrito en la técnica anterior unos pocos ensayos basados en células con una sensibilidad suficientemente alta hacia las neurotoxinas que pueden usarse para la determinación de la actividad biológica de una neurotoxina, como se indica en otra parte de la presente descripción.
El término "aumentar" como se utiliza en la presente descripción significa que la captación específica de un polipéptido de la neurotoxina en la célula mejora o aumenta, en comparación con la intoxicación por la neurotoxina clostridial que no usa (i) despolarización de las células mediada por K+, (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina y (iii) agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina. La captación específica de un polipéptido de la neurotoxina en la célula aumenta preferentemente al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o incluso al menos 10 veces, en comparación con los métodos que utilizan condiciones de cultivo celular que no comprenden (i) despolarización de las células mediada por K+, (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina y (iii) agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina. Generalmente, los métodos descritos en la técnica usan una concentración final de K+ de aproximadamente 5 mM, un tiempo de exposición al polipéptido de la neurotoxina de aproximadamente 72 horas y sin agitación de las células. Los presentes inventores han descubierto que las medidas anteriores (i), (ii) y/o (iii) no solo mejoran la captación específica de la neurotoxina en las células, sino que también dan como resultado una captación inespecífica reducida de la neurotoxina mencionada o la degradación de los productos en las células. La captación inespecífica de un polipéptido de la neurotoxina en la célula se reduce preferentemente al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o incluso al menos 10 veces, en comparación con los métodos que usan condiciones de cultivo celular que no comprenden (i) despolarización de las células mediada por K+, (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina y/o (iii) agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina. Los medios y métodos para medir la absorción específica o inespecífica de un polipéptido de la neurotoxina en la célula están bien descritos en la bibliografía y en la presente descripción y se muestran además en los siguientes ejemplos. Por ejemplo, el efecto de la exposición a las neurotoxinas de BoNT/A, BoNT/C y BoNT/E sobre la proteólisis de SNAP-25 en cultivos de células neuronales puede usarse como un indicador de la translocación de las neurotoxinas. Lo mismo es válido para la exposición a la neurotoxina de BoNT/C en la proteólisis de sintaxina en células neuronales y la exposición a neurotoxina de BoNT/E, BoNT/D y BoNT/G en la proteólisis de VAMP.
El método de la descripción mencionado anteriormente va seguido de un método para determinar la actividad biológica del polipéptido de la neurotoxina en las células, en un aspecto adicional del método de la descripción.
Como se demuestra en los siguientes ejemplos, un ensayo de potencia basado en células podría mejorarse ventajosamente al aumentar la captación específica de polipéptidos de la neurotoxina clostridial en las células, mediante el uso de la despolarización de las células mediada por K+, un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina y/o agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina. Al mismo tiempo, pudo observarse una disminución de la absorción inespecífica de la neurotoxina mencionada o de los productos de degradación en las células.
Se han descrito en la técnica varios ensayos para determinar la actividad biológica de polipéptidos de la neurotoxina, tales como los ensayos de cadenas ligeras (ELISA), Endopep-MS, FRET, HPLC-UPLC, DARET o los ensayos basados en células mediante el uso, por ejemplo, de células SH-SY5Y o Neuro2a, neuronas embrionarias de pollo, neuronas primarias de la médula espinal o de los ganglios de la raíz dorsal (Pellett y otros (2011), Biochem. Biophys. Res. Comun. 404, 388-392), neuronas derivadas de células madre embrionarias (Whitemarsh y otros (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35) basándose en la lectura de transferencia Western o en células SiMa de neuroblastoma humano diferenciado; véase, por ejemplo, Fernandez-Salas, E. y otros, (2012). PLoS One 7 (11).
T
La invención proporciona un método in vitro para determinar directamente la actividad biológica de un polipéptido de la neurotoxina en las células, que comprende:
a) incubar las células susceptibles a la intoxicación por la neurotoxina con un polipéptido de la neurotoxina durante un tiempo y en condiciones que permitan que el polipéptido de la neurotoxina ejerza su actividad biológica, en donde el polipéptido de la neurotoxina es la neurotoxina botulínica BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C 1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNt /G, o BoNT/H, y en donde la incubación comprende (i) despolarización de las células mediada por K+, en donde la despolarización de las células mediada por K+ se lleva a cabo a una concentración final de K+ de 15 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM o 60 mM, durante al menos 30 minutos, y un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina de al menos 24 horas y menos de 96 horas, o (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina de al menos 24 horas y menos de 96 horas y agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina;
b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente;
c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato no escindido y escindido con la neurotoxina y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de escisión del sustrato escindido con la neurotoxina, en condiciones que permitan la unión de dichos anticuerpos de captura para dichos sustratos;
d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, en condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, que forman así primeros complejos de detección y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, en condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, que forman así segundos complejos de detección;
e) determinar la cantidad del primer y segundo complejo de detección de la etapa d); y
f) determinar la cantidad de sustrato de la neurotoxina total y la cantidad de sustrato escindido por dicho polipéptido de la neurotoxina al mismo tiempo, lo que determina así la actividad biológica de dicho polipéptido de la neurotoxina en dichas células.
Este método de la invención permite la determinación directa de la actividad biológica de un polipéptido de la neurotoxina en las células. Esto significa que ya no es necesaria la lisis de las células ni el aislamiento o la concentración del sustrato de la neurotoxina escindido de los lisados celulares, como en los métodos descritos en la técnica. Por ejemplo, en el ensayo de la técnica basado en análisis de transferencia Western, el sustrato de la neurotoxina se concentra mediante la separación y concentración de los componentes de la muestra respectiva en el gel de SDS poliacrilamida. En el ELISA sándwich de ECL descrito en la técnica, la concentración del sustrato de la neurotoxina se lleva a cabo mediante el uso de anticuerpos que se unen específicamente al sustrato de la neurotoxina escindido en una placa de microtitulación a la que se añade el lisado celular. El sustrato de la neurotoxina escindido se aísla del lisado mediante la unión del anticuerpo mencionado que da como resultado una concentración de dicho sustrato de la neurotoxina clostridial escindido.
Por el contrario, el sustrato de la neurotoxina escindido, por ejemplo, SNAP-25, puede detectarse directamente en la célula, en este método de la invención. Con este fin, las células que son susceptibles a la intoxicación por la neurotoxina como se define con más detalle en otra parte de la presente descripción se incuban con un polipéptido de la neurotoxina durante un tiempo y en condiciones que permiten que el polipéptido de la neurotoxina ejerza su actividad biológica. La incubación comprende la despolarización de las células mediada por K+, un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina y/o la agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina, como se expone en otra parte de la presente descripción. Estas medidas aumentan la captación celular específica de la neurotoxina mientras que al mismo tiempo reducen la captación inespecífica de la neurotoxina o los productos de degradación en las células. En una siguiente etapa, las células se fijan, por ejemplo, mediante la adición de un agente de fijación como metanol, etanol, acetona, formaldehído o mezclas de los agentes de fijación mencionados. Opcionalmente, las células pueden permeabilizarse mediante el uso de al menos un detergente tal como Tritón X-100, Tween 20, Saponina, Digitonina o n-Octil-p-glucopiranósido. El detergente puede estar comprendido en un tampón apropiado tal como PBS. Posteriormente, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato no escindido y escindido con la neurotoxina y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de escisión del sustrato escindido con la neurotoxina, en condiciones que permitir la unión de dichos anticuerpos de captura a dichos sustratos. En la presente descripción, el primer anticuerpo de captura es capaz de determinar el contenido total o la cantidad de sustrato de la neurotoxina en las células, al unirse específicamente a un epítopo apropiado presente en el sustrato de la neurotoxina no escindido y escindido con la neurotoxina. El segundo anticuerpo de captura reconoce y se une específicamente a un epítopo presente solo en el sustrato de la neurotoxina escindido, por ejemplo, al unirse específicamente al sitio escindido de la neurotoxina en el sustrato de la neurotoxina. Alternativamente, las células pueden ponerse en contacto con una mezcla de dichos primeros y segundos anticuerpos de captura, es decir, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de captura y al menos un segundo anticuerpo de captura simultáneamente, en las condiciones mencionadas. En la siguiente etapa, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura en condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, que forman así los primeros complejos de detección. En una etapa posterior, las células se ponen en contacto con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, en condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, que forman así los segundos complejos de detección. Alternativamente, las células pueden ponerse en contacto con una mezcla de dichos primeros y segundos anticuerpos de detección, es decir, las células se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección y al menos un segundo anticuerpo de detección simultáneamente, en las condiciones mencionadas. Alternativamente, después de la permeabilización de las células, pueden ponerse en contacto con una mezcla de dichos primeros y segundos anticuerpos de captura y dichos primeros y segundos anticuerpos de detección simultáneamente, en las condiciones mencionadas. En la siguiente etapa, se determinan las cantidades del primer y segundo complejo de detección. Finalmente, la cantidad de sustrato escindido por dicho polipéptido de la neurotoxina en dichas células se calcula al determinar la cantidad de sustrato de la neurotoxina total y la cantidad de sustrato escindido por dicho polipéptido de la neurotoxina al mismo tiempo. Por tanto, la actividad biológica de dicho polipéptido de la neurotoxina se determina directamente en las células.
A continuación, este método de la invención se describe con más detalle. Para el cultivo celular, las células susceptibles a la intoxicación por la neurotoxina como se definió en la presente descripción, tales como células neuronales, células SiMa o neuronas derivadas de iPS, se siembran primero en placas de microtitulación de 96 pocillos. Las células SiMa se diferencian en un fenotipo neuronal, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos descritos en el documento WO 2010/105234, y las neuronas derivadas de iPS se diferencian en un fenotipo neuronal, por ejemplo, de acuerdo con los ensayos descritos en el documento WO 2012/135621. Luego, las células se incuban con un polipéptido de la neurotoxina, tal como BoNT/A, durante un tiempo y en condiciones que permitan que el polipéptido de la neurotoxina ejerza su actividad biológica. La incubación comprende la despolarización de las células mediada por K+, un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina y/o la agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina, como se describió en otra parte de la presente descripción.
En la etapa posterior, las células se fijan en la placa de microtitulación, antes del ensayo ELISA. Para fijar las células, por ejemplo, puede añadirse metanol helado (-20 °C) a las células durante 20 minutos a -20 °C.
Para realizar el ensayo ELISA, primero se lavaron las células. Como tampón de lavado, puede usarse, por ejemplo, Tritón X-100 al 0,1 % en tampón PBS 10 mM (pH 7,4). Después de eso, las proteasas endógenas se inactivan mediante un tampón de inactivación tal como H2O2 al 0,6 % en PBS 10 mM (pH 7,4), seguido de otra etapa de lavado. En la siguiente etapa, los sitios de unión libres en la placa de microtitulación se bloquean con un tampón de bloqueo apropiado tal como, por ejemplo, BSA al 2 % en tampón PBS 10 mM (pH 7,4) y Tritón X-100 al 0,05 %. Luego, las células se permeabilizaron, mediante el uso de un detergente apropiado. Como tampón de permeabilización, por ejemplo, puede utilizarse Tritón X-100 al 0,5 % en tampón PBS 10 mM. La permeabilización permite la difusión de los anticuerpos a través de los poros formados en las células. A continuación, las células se lavaron con tampón de lavado como se mencionó anteriormente.
En la siguiente etapa, las células permeabilizadas se incubaron, por ejemplo, con una mezcla de dos anticuerpos diferentes. La mezcla comprende un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato no escindido y escindido con la neurotoxina y un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de escisión del sustrato escindido con la neurotoxina. Dichos primeros y segundos anticuerpos de captura también pueden aplicarse posteriormente. Por ejemplo, el primer anticuerpo de captura puede unirse específicamente a SNAP-25 no escindido y escindido con la neurotoxina, lo que permite así la cuantificación de la cantidad total o contenido de SNAP-25 en las células. Además, este primer anticuerpo de captura puede usarse para la normalización de la cantidad de SNAP-25 escindido en las células, tras la evaluación. El segundo anticuerpo de captura se une específicamente al sitio de escisión del sustrato escindido con la neurotoxina y, por tanto, permite la determinación y detección del sustrato de la neurotoxina escindido, tal como SNAP-25 escindido con BoNT/A.
La siguiente detección de sustrato de la neurotoxina total y el sustrato de la neurotoxina escindida por la neurotoxina en el método de la invención puede llevarse a cabo directamente en la placa de microtitulación o placa de cultivo celular, es decir, dentro de las células. Ventajosamente, por lo tanto, no es necesario preparar extractos de células y aislar y/o concentrar el sustrato de la neurotoxina del lisado celular en el método de la invención, como en los métodos descritos en la técnica. Posteriormente, las células se lavaron para eliminar el exceso de anticuerpo no unido al antígeno respectivo. En la etapa posterior, las células permeabilizadas se ponen en contacto con al menos un primer anticuerpo de detección y al menos un segundo anticuerpo de detección. Dichos anticuerpos pueden aplicarse como mezcla, es decir, simultáneamente o posteriormente. El primer anticuerpo de detección se une específicamente al primer anticuerpo de captura. Por tanto, se forman los primeros complejos de detección. El primer anticuerpo de detección puede dirigirse contra la especie de la que se deriva el primer anticuerpo de captura. Por ejemplo, en caso de que el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684 (Sigma) se use como un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato SNAP-25 no escindido y escindido con BoNT/A, un anticuerpo anti-conejo conjugado a fosfatasa alcalina puede usarse como primer anticuerpo de detección. El segundo anticuerpo de detección se une específicamente al segundo anticuerpo de captura. De esta manera, se forman los segundos complejos de detección. El segundo anticuerpo de detección puede dirigirse contra la especie de la que se deriva el segundo anticuerpo de captura. Por ejemplo, en caso de que el anticuerpo monoclonal de ratón (mAb) 20-2-5 descrito en el documento WO 2014/207109 se use como un segundo anticuerpo de captura que se una específicamente al SNAP-25 escindido con BoNT/A, un anticuerpo anti-ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) puede usarse como un segundo anticuerpo de detección. Es evidente para los expertos en la técnica que el primer anticuerpo de detección y el segundo anticuerpo de detección están conjugados con diferentes enzimas para permitir la detección específica del primer y segundo anticuerpo de captura respectivos como se usa en el método de la invención. Por ejemplo, la detección basada en HRP como se describe en otra parte de la presente descripción puede usarse para SNAP-25 escindido con BoNT/A y la detección basada en fosfatasa alcalina para el SNAP-25 total (escindido y no escindido con BoNT/A). Posteriormente, las células se lavaron nuevamente. En una etapa posterior, se agrega un sustrato de HRP fluorogénico a las células. Como sustrato de HRP, por ejemplo, puede usarse Amplex UltraRed (Invitrogen) que se excita a 540 nm y que emite a 600 nm. La incubación con el sustrato de HRP se lleva a cabo durante un tiempo suficiente para una conversión suficiente del sustrato por la peroxidasa de rábano picante. Posteriormente a la incubación con el sustrato HRP, por ejemplo, el sustrato AP DiFMUP (fosfato de 6,8-difluoro-4-metilumbeliferilo; excitación 360 nm; emisión 450 nm) puede agregarse al sustrato HRP y las células se incuban con una mezcla de dichos dos sustratos. La incubación con dicho sustrato AP se realiza durante un tiempo que permite una conversión suficiente del sustrato por la fosfatasa alcalina. Como se conoce en la técnica, un sustrato debe
convertirse en una cantidad que sea suficiente para que la señal medida sea al menos tan alta como el valor medio del blanco más tres desviaciones estándar de la media, de acuerdo con la definición de límite de detección. El límite de detección puede determinarse como se describe en la literatura; véase, por ejemplo, Armbruster y Pry, Clinical Biochem. Rev.2008, 29 (Suplemento 1): S49-S52. Debido a que el pH óptimo de la fosfatasa alcalina está en la región alcalina, el tampón de sustrato correspondiente es fuertemente alcalino. Si el sustrato de la fosfatasa alcalina se agrega al sustrato de la HRP, la reacción de la peroxidasa de rábano picante se detiene por el pH alcalino y la fosfatasa alcalina convierte DiFMUP. El sustrato de la HRP convertido no se ve afectado por el pH alcalino. Finalmente, la fluorescencia de los dos sustratos se mide de la siguiente manera:
Amplex UltraRed: Excitación 540 nm; emisión 600 nm
DiFMUP: Excitación 360 nm; emisión 450 nm
Como apreciarán los expertos en la técnica, solo aquellos sustratos fluorogénicos son apropiados para la detección del primer y segundo anticuerpo de captura en el método de la invención que exhiben diferentes longitudes de onda de excitación/emisión de los sustratos usados. Solo en este caso, permiten la detección específica de cada antígeno, es decir, el sustrato de la neurotoxina total (tal como SNAP-25 no escindido y escindido con la neurotoxina) y el sustrato de la neurotoxina escindido (tal como SNAP-25 escindido con la neurotoxina). Por tanto, es posible cuantificar el contenido total de sustrato de la neurotoxina y el contenido de sustrato de la neurotoxina escindido en cada pocillo o placa de cultivo celular al mismo tiempo. A la luz de esto, es posible de manera ventajosa automatizar el método de la invención. Como se expone en otra parte de la presente descripción, se prevé que los sustratos fluorogénicos elegidos para el método de la invención exhiban un cambio suficiente entre los espectros de excitación/emisión para permitir la detección específica del sustrato respectivo. Este requisito se cumple, por ejemplo, para el sustrato HRP Amplex y sus derivados y para el sustrato AP DiFMUP. Mientras que, en un caso óptimo, no hay superposición entre los espectros de excitación/emisión de los sustratos fluorogénicos usados, se ha experimentado que una superposición de hasta el 30 % en el área de pico de los espectros de excitación de los sustratos fluorogénicos usados es tolerable. Se describen más detalles con respecto a este método de la invención, por ejemplo, en el documento WO 2014/207109.
Como también reconocen los expertos en la técnica, el método de la presente invención permite la detección y cuantificación directa del sustrato de la neurotoxina escindido por el polipéptido de la neurotoxina en las células, lo que determina así la actividad biológica de dicho polipéptido de la neurotoxina en dichas células. Ventajosamente, el método de la invención no requiere la preparación de lisados o extractos de células y el aislamiento o concentración del sustrato de la neurotoxina escindido de los lisados/extractos de células, lo que es necesario para los métodos conocidos en la técnica. Como consecuencia de esto, puede ahorrarse material de muestra. Además, la preparación de la muestra y el número de muestras pueden reducirse mediante el método de la invención ya que la cantidad de sustrato de la neurotoxina total y la cantidad de sustrato de la neurotoxina escindida en la muestra se pueden determinar al mismo tiempo. En los ensayos descritos en la técnica, las muestras deben subdividirse para detectar ambos antígenos, es decir, el sustrato de la neurotoxina total y el sustrato de la neurotoxina escindido, por separado entre sí. El método de la invención hace innecesaria la subdivisión de la muestra. De esta manera, pueden evitarse las heterogeneidades resultantes de la subdivisión de muestras y puede ahorrarse material de muestra. Además, los antígenos pueden degradarse en los ensayos descritos en la técnica que pueden falsificar la detección del sustrato de la neurotoxina escindido. Esto se debe a que, en los ensayos descritos en la técnica, las células se incuban con tampones de lisis que contienen detergente que, sin embargo, no son capaces de inactivar el polipéptido de la neurotoxina u otras proteasas endógenas dando como resultado la degradación del sustrato de la neurotoxina tras un almacenamiento más prolongado de las muestras. No pueden usarse tampones de lisis más fuertes en el ELISA sándwich ECL descrito en la técnica anterior debido al uso requerido del lisado celular en dicho ensayo. Esto se debe a que la agregación de los antígenos mencionados anteriormente puede dar como resultado una adsorción inespecífica de los antígenos a la superficie plástica de las placas de cultivo celular o placas de microtitulación, lo que a su vez perturba la detección de los antígenos por los anticuerpos apropiados. Dado que los anticuerpos para la detección de los antígenos también entran en contacto con el lisado, los anticuerpos también pueden agregarse. En este caso, ya no es posible una detección fiable y precisa del antígeno. Los presentes inventores han experimentado tales reacciones de degradación mediante el uso de ensayos de transferencia Western para la detección de la actividad biológica de la actividad de la neurotoxina descrita en la técnica. Tras un almacenamiento más prolongado de los lisados a -20 °C, en comparación con las muestras de lisado fresco, se ha descubierto que la señal de detección de SNAP-25 total se reduce considerablemente y la relación entre el sustrato de la neurotoxina escindida SNAP-25 y el sustrato de la neurotoxina no escindida SNAP-25 se ha desplazado debido a los procesos de degradación durante la congelación. Los presentes inventores han descubierto que la degradación del sustrato de la neurotoxina y/o la inestabilidad de las muestras pueden evitarse al fijar directamente las células en la placa de cultivo celular porque tanto el sustrato de la neurotoxina como la neurotoxina u otras proteasas endógenas se inactivan inmediatamente por agregación en la placa de cultivo celular. Esto puede lograrse mediante el uso, por ejemplo, de la fijación de las células con metanol u otros fijadores o agentes de fijación conocidos en la técnica, tales como etanol, acetona, formaldehído o mezclas de los mismos u otros agentes de fijación descritos en la presente descripción. El análisis de la estabilidad de, por ejemplo, las células SiMa parentales (células de neuroblastoma humano; DSMZ número: ACC 164) y neuronas derivadas de iPS (Whitemarsh y otros (2012), Toxicol. Sci. 126, 426-35) mediante el uso de este método de fijación no reveló ninguna diferencia entre las placas frescas y de cultivo celular almacenadas siete días en el refrigerador.
Los anticuerpos adecuados que se unen específicamente al sustrato no escindido y escindido con la neurotoxina que pueden usarse como primer anticuerpo de captura en el método de la invención abarcan, por ejemplo, el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP-25 S9684 (Sigma), el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19708 (Pierce Antibodies), el anticuerpo policlonal de conejo anti-SNAP25 PA5-19701 (Pierce Antibodies), o el anticuerpo monoclonal de conejo anti-SNAP25 ab108990 (Abcam).
Los anticuerpos apropiados que se unen específicamente al sitio de escisión del sustrato escindido con la neurotoxina que pueden utilizarse como segundo anticuerpo de captura en el método de la invención incluyen, por ejemplo, el clon 20-2-5 del anticuerpo monoclonal de ratón (documento WO 2014/207109), el anticuerpo monoclonal de ratón descrito en el documento EP 14199282.6, el anticuerpo monoclonal de ratón MC-6053 (clon 4F3-2C1, R&D Systems), MAB4733 (Abnova), orb26633 (Biorbyt) o GWB-T00279 (Genway).
Los anticuerpos de detección adecuados que pueden usarse como primer y segundo anticuerpos de detección se conocen en la técnica. Por ejemplo, el primer anticuerpo de detección puede ser un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) o un anticuerpo conjugado con un tinte de fluorescencia. Como segundo anticuerpo de detección, pueden usarse, por ejemplo, un anticuerpo conjugado con fosfatasa alcalina (AP), un anticuerpo conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP), un anticuerpo conjugado con glucosa oxidasa, un anticuerpo conjugado con tirosinasa o un anticuerpo con p-galactosidasa. Preferentemente, el primer y segundo anticuerpos de detección difieren entre sí, cuando se usan en el método de la invención.
Como se usa en la presente descripción, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referencias tanto en singular como en plural a menos que el contexto indique claramente de cualquier otra manera. A modo de ejemplo, "una célula" se refiere a una o más de una célula.
Como se usa en la presente descripción, el término "aproximadamente" cuando se califica un valor de un artículo, número, porcentaje o término establecido se refiere a un intervalo de más o menos 10 por ciento, 9 por ciento, 8 por ciento, 7 por ciento, 6 por ciento, 5 por ciento, 4 por ciento, 3 por ciento, 2 por ciento, 1 por ciento o 0 por ciento del valor del artículo, número, porcentaje o término indicado. Se prefiere un intervalo de más o menos 10 por ciento.
Los términos "que comprende", "comprende" y "compuesto de" como se usan en la presente descripción son sinónimos de "que incluye", "incluye" o "que contiene", "contiene", y son inclusivos o abiertos y no excluyen otros miembros, elementos o etapas del método. Evidentemente, el término "que comprende" abarca el término "que consiste en". Más específicamente, el término "comprende" como se usa en la presente descripción significa que la reivindicación abarca todos los elementos o etapas del método enumerados, pero también puede incluir elementos o etapas del método adicionales sin nombre. Por ejemplo, un método que comprende las etapas a), b) y c) abarca, en su sentido más estricto, un método que consta de las etapas a), b) y c). La frase "que consiste en" significa que la composición (o dispositivo, o método) tiene los elementos (o etapas) enumeradas y nada más. Por el contrario, el término "comprende" puede abarcar también un método que incluye etapas adicionales, por ejemplo, las etapas d) y e), además de las etapas a), b) y c).
En caso de que se usen en la presente descripción intervalos numéricos tales como "en una concentración entre 1 y 5 micromolar", el intervalo incluye no solo 1 y 5 micromolar, sino también cualquier valor numérico entre 1 y 5 micromolar, por ejemplo, 2, 3 y 4 micromolar.
El término "in vitro" como se usa en la presente descripción denota fuera, o externo, al cuerpo animal o humano. Debe entenderse que el término "in vitro" como se usa en la presente descripción incluye "ex vivo". El término "ex vivo" se refiere típicamente a tejidos o células extraídos del cuerpo de un animal o humano y mantenidos o propagados fuera del cuerpo, por ejemplo, en un recipiente de cultivo. Se prefiere que el método de la invención sea un método in vitro. El término "in vivo", como se usa en la presente descripción, denota por dentro o el interior del cuerpo animal o humano.
Normalmente, el medio de cultivo celular usado en la técnica contiene 5 mM de K+.
En otro aspecto más del método de la invención, la despolarización de las células mediada por K+ y/o la exposición al polipéptido de la neurotoxina se lleva a cabo en presencia de GT1b.
En otro aspecto del método de la invención, GT1b se usa en una concentración entre 15 y 50 pM, preferentemente 20 pM.
En un aspecto adicional del método de la invención, el tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina es la exposición de las células al polipéptido de la neurotoxina durante al menos 48 horas y 72 horas como máximo.
En un aspecto adicional del método de la invención, la agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina se logra con un agitador magnético o matraces giratorios o con la agitación de las células. La agitación de las células se lleva a cabo a un régimen de flujo de medio de cultivo celular apropiado, preferentemente un régimen
de flujo medio (o promedio) de medio de aproximadamente 25 cm/min a aproximadamente 300 cm/min, con mayor preferencia de aproximadamente 25 cm/min a aproximadamente 150 cm/min.
En un aspecto adicional del método de la invención, un tiempo de incubación sin polipéptido de la neurotoxina precede a la exposición al polipéptido de la neurotoxina.
En un aspecto adicional del método de la invención, el tiempo de incubación sin polipéptido de la neurotoxina es de entre 16 y 48 horas.
En un aspecto adicional del método de la invención, el método es un método de fluorescencia.
En un aspecto adicional del método de la invención, el polipéptido de la neurotoxina es BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/F, BoNT/G, o BoNT/H, o los subtipos de los mismos como se definen en otra parte de la presente descripción.
En un aspecto adicional del método de la invención, el sustrato es VAMP/sinaptobrevina, SNAP-25 o sintaxina. En un aspecto adicional del método de la invención, las células son células neuronales o células diferenciadas neuronales seleccionadas del grupo que consiste en: células neuronales primarias, células tumorales que son capaces de diferenciarse a células neuronales tales como células de neuroblastoma, células P19 o células inducidas. neuronas derivadas de células madre pluripotentes (IPS).
Otras modalidades preferidas del método de la invención pueden derivarse de los siguientes ejemplos.
La Figura muestra:
Figura 1: Cinética en la pérdida de actividad de las muestras de medicamentos estresados. Las muestras de medicamentos que contenían BoNT/A se almacenaron a 70 °C durante hasta cuatro semanas. Después de 0, 1, 2 y 4 semanas se extrajeron muestras y se sometieron a análisis en el bioensayo de LD50 de ratón, así como también en el ensayo basado en células (CBA) mediante el empleo de diferentes protocolos. En el eje x se indica el tiempo de almacenamiento en semanas, mientras que en el eje y se indica la potencia relativa. La potencia en el punto de inicio se estableció en 100 % y los puntos de tiempo de prueba consecutivos se expresan en relación con el punto de inicio. Los valores del bioensayo LD50 se representan como diamantes. El protocolo de ensayos basados en células que emplea despolarización de K+ se representa en cuadrados, el protocolo que emplea un tiempo de incubación de la toxina de 8 horas seguido de un tiempo de incubación libre de la toxina de 64 horas se representa en triángulos y el protocolo que emplea agitación durante el tiempo de incubación de 72 horas se representa en círculos. El protocolo CBA que no se modificó se representa en símbolos de línea. En resumen, la Figura 1 muestra una comparación de los ejemplos de ensayo basados en tres de células donde las muestras estresadas muestran una cinética comparable en decadencia con el ensayo de referencia, el bioensayo LD50 ratón.
La invención se ilustrará ahora con los siguientes ejemplos.
Ejemplos:
Ejemplo 1: ELISA de actividad de BoNT/A basada en células con Doble Fluorescencia
Fijación de las células
1. Retirar la solución de medio/toxina. Añadir 100 pl/pocillo de metanol helado (-20 °C) e incubar durante 20 min a -20 ° C.
Nota: Realizar todas las etapas posteriores a temperatura ambiente.
Después de la fijación celular:
1. Retirar la solución de metanol y agregar 100 pl/pocillo de tampón PBS. Para un almacenamiento más prolongado (> 1 día), deben agregarse 300 pl de tampón PBS/pocillo y sellar las placas con parafilm. Los platos deben guardarse en el frigorífico.
2. Retirar el tampón PBS y lavar las células 3 veces con 200 pl/pocillo de tampón PBS. Cada etapa debe realizarse durante 1 minuto con agitación suave.
3. Retirar el tampón PBS y agregar 100 pl/pocillo de tampón de inactivación e incubar durante 20 minutos con agitación suave.
4. Retirar el tampón de inactivación y lavar las células una vez con 300 pl/pocillo de tampón PBS durante 3 minutos con agitación suave.
5. Retirar el tampón PBS y agregar 200 pl/pocillo de tampón de bloqueo e incubar durante 1 hora con agitación suave.
6. Retirar el tampón de bloqueo y agregar 100 pl de la mezcla de anticuerpo primario (dilución de anticuerpo en tampón de bloqueo) a cada pocillo. Incubar durante la noche (16-18 h) con agitación suave. Las células se incubaron simultáneamente con dos anticuerpos primarios: un anticuerpo de ratón específico para SNAP-25 escindido con BoNT/A y un anticuerpo policlonal de conejo que reconoce SNAP-25 (anticuerpo para determinar la cantidad total de SNAP 25 para la normalización).
7. Retirar la mezcla de anticuerpo primario y lavar las células 4 veces con 200 pl de tampón PBS. Cada etapa debe realizarse durante 3 minutos con agitación suave.
8. Retirar el tampón PBS y agregar 100 pl de la mezcla de anticuerpos secundarios: anticuerpos secundarios anti conejo conjugado con HRP y anti-ratón conjugado con AP (dilución de anticuerpos en tampón de bloqueo) a cada pocillo e incubar durante 2,5 a 3 horas con agitación suave.
9. Retirar la mezcla de anticuerpos secundarios y lavar las células 5 veces con 200 pl/pocillo de tampón PBS, seguido de 1 etapa de lavado con 300 pl/pocillo de tampón HEPES. Cada etapa de lavado debe realizarse durante 3 minutos con agitación suave.
10. Retirar el tampón HEPES de la placa y agregar 75 pl de un sustrato fluorogénico para peroxidasa de rábano picante (sustrato HRP) a cada pocillo. Incubar durante 50 minutos con agitación suave. Proteger las placas de la luz directa.
11. Añadir 75 pl de un sustrato fluorogénico para fosfatasa alcalina (sustrato AP) a cada pocillo e incubar durante 50 minutos más a temperatura ambiente con agitación suave. Proteger las placas de la luz directa.
12. Leer las placas con un lector de placas de fluorescencia:
excitación a 540 nm; emisión a 600 nm.
excitación a 360 nm; emisión a 450 nm.
13. Cálculo
Para la normalización, el valor de RFU para SNAP-25 escindido (fluorescencia a 600 nm) se normaliza a RFU de SNAP-25 total (450 nm) en cada pocillo. Para una mejor ilustración de RFU en un diagrama, todos los valores se multiplican por un factor de 1000 mediante el uso de la siguiente ecuación:
RFU (600 nm)
RFU (450 nm) *1000
Posteriormente, los valores de RFU resultantes se promedian para cada estándar o muestra.
Preparación de Reactivos
Tampón PBS (10 mM):
Solución salina tamponada con fosfato (Sigma, # P5368) (pH 7,4)
Tampón de inactivación:
H2O20,6 % en tampón PBS 10 mM (pH 7,4)
Tampón de bloqueo:
BSA 2 % en tampón PBS 10 mM (pH 7,4) Tritón X-1000,05 %
Tampón HEPES:
HEPES 50 mM (pH 7,4)
Sustrato HRP:
HEPES 50 mM (pH 7,4)
H2O20,007 %
Amplex UltraRed 150 pM
Sustrato AP:
Dietanolamina 25 mM (pH 9,8)
MgCl22 mM
100 pl M DiFMUP
Ejemplo 2: Aumento de la captación específica de polipéptidos de la neurotoxina clostridial en las células
a) Las neuronas iCell® se descongelaron y se colocaron en placas de acuerdo con el manual de usuario de Cellular Dynamics International (CDI) en placas de 96 pocillos de 4 lotes de células diferentes. 24 horas (h) después de la siembra en placa, el medio se reemplazó por medio de mantenimiento fresco como se describió en el manual del usuario.
Después de 72 h más de tiempo de incubación, el medio se retiró y se reemplazó por medio fresco que contenía BoNT/A en concentraciones variables y iones K+ en una concentración total de 30 mM (es decir, 25 mM de K+ adicional
Claims (10)
1. Un método in vitro para determinar directamente la actividad biológica de un polipéptido de la neurotoxina en las células, que comprende:
a) incubar las células susceptibles a la intoxicación por la neurotoxina con un polipéptido de la neurotoxina durante un tiempo y en condiciones que permitan que el polipéptido de la neurotoxina ejerza su actividad biológica, en donde el polipéptido de la neurotoxina es la neurotoxina botulínica BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C1, BoNT/D, BoNT/E, BoNt /F, BoNT/G o BoNT/H, y en donde la incubación comprende (i) la despolarización de las células mediada por K+, en donde la despolarización de las células mediada por K+ se lleva a cabo a una concentración final de K+ de 15 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM o 60 mM, durante al menos 30 minutos, y un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina de al menos 24 horas y menos de 96 horas, o (ii) un tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina de al menos 24 horas y menos de 96 horas y agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina;
b) fijar las células y, opcionalmente, permeabilizar las células con un detergente;
c) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de captura que se une específicamente al sustrato no escindido y escindido con la neurotoxina y con al menos un segundo anticuerpo de captura que se une específicamente al sitio de escisión del sustrato escindido con la neurotoxina, en condiciones que permitan la unión de dichos anticuerpos de captura para dichos sustratos;
d) poner en contacto las células con al menos un primer anticuerpo de detección que se une específicamente al primer anticuerpo de captura, en condiciones que permiten la unión de dicho primer anticuerpo de detección a dicho primer anticuerpo de captura, que forman así primeros complejos de detección y con al menos un segundo anticuerpo de detección que se une específicamente al segundo anticuerpo de captura, en condiciones que permiten la unión de dicho segundo anticuerpo de detección a dicho segundo anticuerpo de captura, que forman así segundos complejos de detección;
e) determinar la cantidad del primer y segundo complejo de detección de la etapa d); y
f) determinar la cantidad de sustrato de la neurotoxina total y la cantidad de sustrato escindido por dicho polipéptido de la neurotoxina al mismo tiempo, lo que determina así la actividad biológica de dicho polipéptido de la neurotoxina en dichas células.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la exposición al polipéptido de la neurotoxina se lleva a cabo en presencia del gangliósido GT1b.
3. El método de la reivindicación 2, en donde GT1b se usa en una concentración entre 15 y 50 pM, preferentemente 20 pM.
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el tiempo de exposición reducido al polipéptido de la neurotoxina es la exposición de las células al polipéptido de la neurotoxina durante al menos 48 horas y 72 horas como máximo.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la agitación de las células durante la exposición al polipéptido de la neurotoxina se lleva a cabo con un agitador magnético, matraces giratorios o agitación de las células con un agitador, preferentemente a un régimen de flujo medio de 25 cm/min a 300 cm/min.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde un tiempo de incubación sin el polipéptido de la neurotoxina precede a la exposición al polipéptido de la neurotoxina.
7. El método de la reivindicación 6, en donde el tiempo de incubación sin el polipéptido de la neurotoxina es de entre 16 y 48 horas.
8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el método es un método de fluorescencia.
9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el sustrato es VAMP/sinaptobrevina, SNAP-25 o sintaxina.
10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde las células son células neuronales o células diferenciadas neuronales seleccionadas del grupo que consiste en: células neuronales primarias, células tumorales que son capaces de diferenciarse a células neuronales tales como células de neuroblastoma, células P19 o neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas (IPS).
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