CN102711798A - 刺激干细胞的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及刺激干细胞的人用或兽用药物组合物(B)，包含至少两种干细胞刺激剂和至少一种药学上可接受的赋形剂。

Description

刺激干细胞的药物组合物

技术领域

本发明大体涉及靶向组织和/或器官的药物组合物。特别地，其涉及通过对需要心脏组织再生的个体的心脏施用干细胞刺激剂的心脏疾病治疗。特别地，其公开了使用这种干细胞刺激剂，改善来自活体内心脏干细胞的心脏组织的再生。

背景技术

心肌梗死(Ml)导致心肌细胞受损，瘢痕形成，心室重构，最终心力衰竭。药物的、导管的和外科的发明已经改善了冠状动脉疾病(CAD)患者的生存，但是他们不能使死亡的心肌再生。因此，由于缺血性心力衰竭，增加的发病率伴随着降低的死亡率。在近几年里，干细胞治疗在心脏治疗修复方面作为具有潜力的策略出现(Dimmeler S.等，J Clin Invest 2005，11，572-583)。修复损伤心肌的最佳细胞来源是项深入研究的课题。用于心脏再生的干细胞的重要特征包括自我更新，集落生成，以及分化成心肌细胞、内皮细胞和促血管平滑肌细胞的能力。

过去10年以来，在动物研究中，研究者曾经将多种骨髓(BM)-衍生的干/祖细胞应用于心脏修复治疗，例如谱系标记物阴性(lineage negative，lin neg)c-kit阳性(c-kit pos)BM干细胞(Orlic等，Nature 2001；410：701-705；Kajstura等，Circ.Res.2005；96：127-137；Rota等，Proc Natl Acad SciUSA 2007；104：17783-17788)，BM-衍生的骨髓间充质干细胞(MSCs)(Min等，Ann Thor Surg 2002；74：1568-1575；Amado等，Proc Natl Acad SciUSA 2005；102：11474-11479)和内皮祖细胞(EPCs)(Cho等，J Exp Med 2007；204：3257-3269；Schuh等，Basic Res Cardiol 2008；103：60-77)。尽管这些研究显示：BM-衍生的干/祖细胞分化成具有心肌细胞和血管细胞主要特征的细胞，其它研究表明移植BM干细胞在受损心脏中不容易获得心肌表型(Balsam等，Nature 2004；428：668-673；Murry等，Nature 2004；428：664-668；Nygren等，Nat Med 2004；10：494-501)。

因此，移植BM-衍生干/祖细胞之后，增强他们的分化存在巨大挑战，以使研究者在心脏再生治疗中有效利用这些细胞。其它干细胞来源可以用于心脏再生治疗，除了BM-衍生干/祖细胞之外。特别地，在心脏本身中找到了原位心脏干细胞(CSCs)(Beltrami等，Cell 2003；114：763-776；Uranek等，Proc Natl Sci USA2006；103：9226-9231)。因为CSCs已经存在于心脏内部并且被计划形成心脏组织，当大规模心脏组织受损发生时，它们代表了在心脏再生治疗中利用的逻辑来源。假设CSCs具有独一无二的特征，那么识别原位CSCs产生极大的兴奋，引发了强烈的愿望：使用来自心脏本身的细胞进行心肌再生，从而固有的计划形成以重构心脏组织。

心脏修复要求形成新的肌肉细胞和冠状血管，它不能通过已经致力于肌肉细胞谱系的细胞完成。在梗死的情况下，单一肌肉细胞的形成不能在运动不能区中恢复收缩性能；肌肉细胞在血管没有形成的情况下不能生长或者生存。小动脉对于血液供应是重要的，氧的运输被毛细血管网控制。相似地，单独的血管新生在心室壁的梗死部分不能恢复死亡心肌细胞，也不能重新建立收缩活性。观察结果：局部注入到动物梗死心肌的CSCs修复了坏死组织并改善心室功能(Beltrami等，Cell 2003；114：763-776；Bearzi等，Proc Natl Sci USA 2007；104：14068-14073)；这一结果构成了新的范例基础，其中CSCs与肌肉细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和纤维组织母细胞的正常更新有关。为了开发病人未来的治疗相关策略，提出了新的假说，以引领技术发展方向，其详细说明了CSCs在个体基础上的临床治疗。

已经做出了许多努力，为了处理已经发现的CSCs使之应用于临床。第一种方法是分离、培养、克隆和扩大CSCs。这种细胞被注入回到梗死心脏，以再生功能心肌。尽管如此，所述CSC细胞种群的缺乏，以及严格的细胞培养条件和贫乏的产量，是使用这种方法的限制性因素。在现有技术中描述的另一种可选的方法是使用外源试剂使内生CSCs补充和分化。尽管如此，据描述，没有明显的证据表明这种方法的有效性，这使得在活体内有效补充和使CSCs分化具有不确定性。

发明概述

本发明提供了完全新颖的方法，刺激活体内原位CSCs，以及在另一方面中，使他们致力于分化成心脏谱系，特别地是从他们中获得显著数量的充足的功能细胞(其具有心肌细胞的主要特征)。

本发明涉及刺激干细胞的人用或兽用药物组合物(B)，其包含至少两种干细胞刺激剂和至少一种药学上可接受的赋形剂。

所述至少两种干细胞刺激剂可以选自：TGFβ-1、BMP-4、FGF-2、IGF-1、活化素A、α-凝血酶、心肌营养蛋白1、Cardiogenol C及其混合物。特别地，所述至少两种干细胞刺激剂选自：TGFβ-1、BMP-4、FGF-2、IGF-1、活化素A、心肌营养蛋白1、Cardiogenol C及其混合物.

本发明涉及药物混合物，其包含根据本发明的药物组合物(B)、和包含至少一种药学活性物质组合物(A)。本发明的组合物或混合物允许提供刺激剂指导的干细胞(其意味着在被放入后所述原位心脏干细胞与所述组合物或者混合物接触)，被刺激进入分化阶段。因此，所述刺激的干细胞可以专注分化成心脏谱系并成为心肌细胞。

在本文件框架内，除非有另外的指明，引用之间的下文的术语具有下述的定义。

如本文使用的，所述术语“刺激”(″stimulation或者stimulating″)是指干细胞的补充、增殖、生存和/或分化。

如本文使用的，所述术语“心脏组织”和“心肌”是指肌肉细胞、血管和成纤维细胞。

“心脏干细胞(CSCs)”、“心脏祖细胞”、“原位心脏干细胞”或者“原位心脏祖细胞”指出了这些干细胞存在于心肌中。它们是自我更新的、克隆源性的、多潜能的，并且可以形成心肌。

“干细胞刺激剂”是改进干细胞能力的试剂，使其招募补充道所述位点进行再生、增殖和分化成心脏组织。

“干细胞刺激剂组合物“是包含至少两种干细胞刺激剂的组合物。

“刺激剂指导的干细胞”是干细胞，其与上文定义的干细胞刺激剂组合物接触，并进一步进入分化阶段(即专注于成为心脏谱系)。

所述“分化”是过程，通过其较少的特异性细胞成为更多的特异性细胞。

除非另有说明，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明从属的本领域技术人员的普通理解相同的意思。尽管与本文描述相似或者相等的方法和材料可以使用以实施本发明，合适的方法和材料在下文中描述。所有的出版物、专利申请、专利和其它本文提及的参考资料以参考的方式并入本文。假设有冲突，本发明说明书，包括定义，将控制本发明术语的意思。另外，所述材料、方法和实施例只是解释性的，不作为限制。

发明详述

在优选的实施方案中，所述药物组合物(B)可以包含至少五种干细胞刺激剂，其选自：TGFβ-1、BMP-4、FGF-2、IGF-1、活化素A、心肌营养蛋白1、Cardiogenol C及其混合物。

特别的地，所述药物组合物(B)可以包含TGFβ-1、BMP-4、FGF-2、IGF-1、活化素A、心肌营养蛋白1和Cardiogenol C。

另外，所述药物组合物(B)可以进一步的任意地包含α-凝血酶。所述药物组合物(B)可以进一步包含凝血酶抑制体，例如水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、阿加曲班、美拉加群、希美加群、达比加群和肝素。α-凝血酶是促凝剂。可选择的，在某些情况下，所述药物组合物(B)可以任意的不含有α-凝血酶。

本发明所述药物组合物(B)可以进一步包含至少一种物质，其选自：生长因子、细胞因子、激素及其组合。所述至少一种物质可以选自：

-骨形成蛋白(BMP)，例如BMP-1、BMP-2、BMP-5、BMP-6；

-表皮生长因子(EGF)；

-促红细胞生成素(EPO)；

-成纤维细胞生长因子(FGF)，例如FGF-1、FGF-4、FGF-5、FGF-12、FGF-13、FGF-15、FGF-20；

-粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；

-粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；

-生长分化因子-9(GDF-9)；

-肝细胞生长因子(HGF)；

-胰岛素样生长因子(IGF)，例如IGF-2；

-肌肉生长抑制素(GDF-8)；

-神经营养蛋白，例如NT-3、NT-4、NT-1和神经生长因子(NGF)；

-血小板衍生生长因子(PDGF)，例如PDGF-β、PDGF-AA，PDGF-BB；

-促血小板生成素(TPO)；

-TGF-(转化生长因子α)

-转化生长因子β(TGF-β)，例如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3；

-VEGF(血管内皮生长因子)，例如VEGF-A，VEGF-C；

-TNF-α、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素6(IL-6)、维生素A酸、C SDF-1(基质细胞衍生因子-1)、BDNF(脑衍生神经营养因子)、骨母细胞特异性因子-2、血管紧张素II、Flt3配体、胶质细胞衍生的神经营养因子、肝素、胰岛素样生长因子结合蛋白-3、胰岛素样生长因子结合蛋白-5、白细胞介素-3、白细胞介素-8、中期因子、黄体酮、腐胺、干细胞因子、TGF-α、Wntl、Wnt3a、Wnt5a、胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-4、趋化因子配体1、趋化因子配体2、趋化因子配体5、趋化因子配体7、趋化因子配体11、趋化因子配体20、结合珠蛋白、植物凝血素、胆固醇25-羟化酶、突触融合蛋白-8、突触融合蛋白-11、血浆铜蓝蛋白、补体成分1、补体成分3、整联蛋白α6、溶酶体酸脂酶1、θ-2微球蛋白、泛素、巨噬细胞移动抑制因子、丝切蛋白、亲环素A、FKBP12、NDPK、肌动蛋白抑制蛋白1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、钙周边蛋白、斯钙素-1、PGE-2、mpCCL2、IDO、iNOS、HLA-G5、M-CSF、血管生成素、PIGF、MCP-1、细胞外基质分子、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)、CX3CL1(不规则趋化因子)、CXCL5(ENA-78)、CXCL11(i-TAC)、CXCL1(GROα)、CXCL2(GROβ)、CXCL8(IL-8)、CCL10(IP-10)及其组合。

被刺激的干细胞可以是原位心脏干细胞(CSCs)或者循环干细胞或者注射干细胞。

所述药物组合物可以进一步包含一级粒子。所述一级粒子可以选自：藻酸盐、壳聚糖、葡萄聚糖、纤维素、脂质体、或者聚酯的纳米微球或微球体(例如PLGA、聚已酸内酯或者共聚多酯)。优选的，所述一级粒子可以囊封所述药物组合物(B)的所述至少两种干细胞刺激剂。因此，所述一级粒子可以囊封包含在所述药物组合物(B)内的所述干细胞刺激剂。所述术语“一级”意味着所述药物组合物可以被囊封在颗粒的第一种类型中(如上文定义。

优选地，所述药物组合物(B)可以联合含有至少一种药学活性物质的组合物(A)，以形成药物混合物。在一个实施方案中，所述一种药学活性物质可以选自：胰岛素样生长因子1(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)和/或其变体(例如NK1、1K1、1K2、HP11、或者HP21、及其组合)。在另一个实施方案中，所述组合物(A)可以进一步包含SCF-1。所述组合物(A)可以进一步包含二级粒子，其选自：藻酸盐、壳聚糖、葡萄聚糖、纤维素、脂质体、或者聚酯的微球体或纳米微球(例如PLGA、聚已酸内酯或共聚多酯)。所述二级粒子可以囊封所述至少一种药学活性物质。所述术语“二级”意味着组合物(A)可以被囊封进颗粒的第二种类型中(如上文所定义的)。另外，所述二级粒子可以配置使在其中囊封的基材的递送在一级粒子中囊封的基材的递送之前。

所述药物混合物可以包含所述组合物(B)的样品和所述组合物(A)的样品。选择性地，组合物(A)和(B)可以混合成单一的样品。当一起混合时，组合物(A)和(B)可以被施用或者给药在区域内，或者在区域周边，使其分别治疗。

本发明的所述药物组合物或者所述药物混合物可以作为药物使用。选择性地，本发明的所述药物组合物或者所述药物混合物可以用于心脏组织再生。选择性地，本发明的所述药物组合物或者所述药物混合物可以用于治疗心脏疾病，包括心力衰竭、心脏缺血或者心肌梗死。

在本发明的另一方面中，提供了对人类或动物的活体内或活体外CSCs起作用的方法。所述方法包括施用本发明所述药物组合物(B)或所述药物混合物于人类或动物的步骤。

所述药物组合物(B)的施用可以在含有至少一种药学活性物质的组合物(A)的初步施用之后进行。

所述施用可以通过顺序注射的方式进行：组合物A、B或者其混合物。

此外，本发明所述药物组合物或者药物混合物的两次连续施用之间的持续时间可以是从1小时到180天。每次施用可以被重复。选择性地，每次或某些所述组合物(A)的施用可以是任意的。

因此，所述药物组合物(B)或者药物混合物可以是非肠胃施用。此外，所述药物组合物(B)或者药物混合物可以被施用到人类或者动物的循环系统。所述药物组合物(B)或者药物混合物可以被施用到动脉和/或静脉。

本发明的所述药物组合物(B)或者药物混合物可以被施用到心脏组织。在优选的实施方案中，所述施用可以是冠状动脉内(对于所述药物组合物(B))和静脉内(所述组合物(A)的初步施用)。

如本文使用的TGFβ是指TGFβ-1、TGFβ-2或者TGFβ-3，也可以是任何具有TGFβ活性的多肽，例如人类TGFβ。例如，TGFβ可以是重组TGFβ。在一个实施方案中，TGFβ可以是TGFβ-1。可以使用任何合适浓度的TGFβ。例如，可以使用每ml中0.1和100ng之间的TGF-β的浓度(例如，每ml约33ng的TGFβ1)。

BMP可以使任何具有BMP活性的多肽，例如人类BMP。例如，BMP可以是重组BMP。在一个实施方案中，BMP可以是BMP4。可以使用任意浓度的BMP。例如，每ml中0.1和200ng之间的BMP(例如，可以使用每ml约65ng的BMP4)。

FGF-2可以是任何具有活性的多肽，例如人类FGF-2。例如，FGF-2可以是重组FGF-2。可以使用任意浓度的FGF-2。例如，每ml中0.1和200ng之间的FGF-2(例如，可以使用每ml约65ng的FGF-2)。

IGF-1可以是任何具有IGF-1活性的多肽，例如人类IGF-1。例如，IGF-1可以是重组IGF-1。可以使用任意浓度的IGF-1。例如，可以使用每ml中1和1000ng之间的IGF-1(例如，每ml中约650ng的IGF-1)的浓度。

活化素A可以是任何具有活化素A活性的多肽，例如人类活化素A。例如，活化素A可以是重组活化素A。任意浓度的活化素A可以使用.例如，可以使用每ml中0.1和500ng的活化素A(例如，每ml中约130ng的活化素A)。

α-凝血酶可以是任何具有α-凝血酶活性的多肽，例如人类α-凝血酶。例如，α-凝血酶可以是重组α-凝血酶或合成的α-凝血酶。可以使用任意浓度的α-凝血酶。例如，可以使用每ml中0.05和100单位之间的α-凝血酶。

心肌营养蛋白可以是任何具有心肌营养蛋白活性的多肽，例如人类心肌营养蛋白-1。例如，心肌营养蛋白可以是重组心肌营养蛋白。可以使用任意浓度的心肌营养蛋白。例如，可以使用每ml中0.05和100ng之间的心肌营养蛋白(例如，每ml中约13ng的心肌营养蛋白-1)。

IL-6可以是任何具有IL-6活性的多肽，例如人类IL-6。例如，IL-6可以是重组IL-6。可以使用任意浓度的IL-6。例如，可以使用每ml中10和400ng之间的IL-6。

任意浓度的Cardiogenol C或者其药学上可接受的盐(例如Cardiogenol C盐酸盐)可以使用。例如，可以使用每ml中1和1000ng之间的Cardiogenol C(例如每ml中约350ng的Cardiogenol C)。

维生素A酸可以是具有维生素A酸活性的任何分子，例如合成的维生素A酸、天然的维生素A酸、维生素A代谢物、天然的维生素A的衍生物或者合成的维生素A衍生物。可以使用任意浓度的维生素A酸。例如，可以使用1×10^-7和4×10^-6μM之间的维生素A酸。

在某些情况下，可以使用补充了TGFβ-1(例如2.5ng/ml)、BMP4(例如5ng/ml)、FGF-2(例如5ng/ml)、IGF-1(例如50ng/ml)、活化素A(例如10ng/ml)、心肌营养蛋白(例如1ng/ml)、α-凝血酶(例如1Unit/ml)和Cardiogenol C(例如100nM)的含血清培养基或者无血清培养基。在某些情况下，所述培养基(例如含血清或无血清培养基)可以含有血小板裂解液(例如人类血小板裂解液)。

在某些情况下，用于刺激CSCs的组合物可以含有任选添加的因子，例如TNF-α、LIF和VEGF-A。

TNF-α可以是具有TNF-α活性的任何多肽，例如人类TNF-α.例如，TNF-α可以是重组TNF-α。可以使用任意浓度的TNF-α。例如，可以使用每ml中0.5和100ng之间的TNF-α。

LIF可以是具有LIF活性的任何多肽，例如人类LIF。例如LIF可以是重组LIF。可以使用任意浓度的LIF。例如，可以使用每ml中0.25和200ng之间的LIF。

VEGF-A可以是具有VEGF-A活性的任何多肽，例如人类VEGF-A。例如，VEGF-A可以是重组VEGF-A。可以使用任意浓度的VEGF-A。例如，可以使用每ml中0.5和400ng之间的VEGF-A。

本文提供的组合物可以使用任何合适的方法制备。例如，本文提供的组合物可以使用商业方法获得的刺激剂制备。在某些情况下，本文提供的组合物可以制备成含有细胞裂解液的(例如血小板裂解液)或者来自细胞的条件培养基(例如心肌细胞或者TNF-α-刺激的内胚层细胞)。例如，本文提供的组合物可以使用补充了商业方法可以获得的因子的血小板裂解液制备得到。在某些情况下，本文提供的组合物的制备可以使用从条件培养基分离得到的因子。在某些情况下，所述因子可以溶解在培养基中，例如含有或者不含有血清的培养基。

实施例

测试在急性梗死的猪中进行。建立了下述的试验方案。所述梗死在T0时间进行(通过使冠状动脉左前降支(LAD)闭塞90分钟)，然后再灌注30分钟。在再灌注结束的时候(T1)，初级组合物非肠胃地施用到动物闭塞部位的远端，通过冠状动脉给药。负载BrdU的渗透泵也在T1时间皮下植入。14天后(T2)，第二级组合物非肠胃地施用到动物。所述施用的两种组合物可以通过不同的方法实现，例如静脉内的注射，肌肉内注射或者冠状动脉内注射。最终，在42天(T3)，对所述猪执行安乐死。

成分的浓度在括号中提及。两种组合物，单独或者联合地，都进行测试：

-组合物A：含有IGF-1(8g，在15ml的磷酸缓冲液(PBS)中)和HGF(2g，在15ml的PBS)；以及

-组合物B：含有TGFβ-1(0.5pg，在15ml的PBS中)、BMP4(1g，在15ml的PBS中)、FGF-2(1pg，在15ml的PBS中)、IGF-1(10pg，在15ml的PBS中)、活化素A(2g，在15ml的PBS中)、心肌营养蛋白1(0.2g，在15ml的PBS中)和Cardiogenol C(5.2g，在15ml的PBS中)。

两种组合物都在药学上可接受的赋形剂中。所述药学上可接受的赋形剂可以是磷酸缓冲液(PBS)、哈特曼氏液(Hartmann′s solution)、乳酸林格氏液(Ringer′s lactate)、生理NaCI(0.9％NaCI)(补充或者不补充白蛋白或任何合适的蛋白稳定剂组合物)。

5只动物的5个治疗组的每个都被评估。

-治疗组1是对照组，并且在T1和T2时只接受盐溶液。

-治疗组2在T1接受含有组合物A的溶液，在T2时接受盐溶液标注为混合A.。

-治疗组3在T1接受含有组合物A的溶液，在T2时接受含有组合物B的溶液，标注为混合A+B。

-治疗组4在T1和T2时接受含有组合物B的溶液，标注为混合B+B。

-治疗组5在T1接受含有组合物B的溶液，在T2时接受盐溶液标注为混合B.

试验方案在表1中概述。

表1

	治疗组1	治疗组2	治疗组3	治疗组4	治疗组5
						T0：梗死
T1：30分钟	盐	A	A	B	B
						T2：2周	盐	盐	B	B	盐
T3：6周	安乐死	安乐死	安乐死	安乐死	安乐死

在不同的时间间隔进行血液分析。从每个治疗组的2只猪中，通过颈内经脉的冠状窦中和通过耳静脉的静脉血中采集血液样品。在所述初步施用之后，样品采集时间点在T1+5min；T1+1h和T1+6h。在所述第二次施用之后，样品采集时间在T2+5min；T2+1h，T2+6h和T2+24h。样品进行ELISA免疫分析，以定量IGF-1和心肌营养蛋白1浓度。

磁共振成像(MRI)对所有动物进行，在T1+3天、T2和T3，以研究所述瘢痕区域、左心室整体功能、区域功能(室壁运动和增厚)和心室的区域灌注。MRI允许测定和确定新的血管、组织或者细胞的存在，以改善心室功能。

也进行组织病理试验，以测定所述瘢痕区域，识别和定量c-kit阳性心脏干细胞。组织病理试验也提供了关于新血管和心肌细胞的分布、大小和密度的数据。组织病理试验允许记载在组织和细胞水平的修复过程。

在心脏修复中也考虑了重要的变数：(1)再生组织的量或者心肌质量和冠状动脉脉管系统；(2)修复的肌肉细胞和血管的数量和大小；(3)新形成的肌肉细胞和血管，伴随周边心肌的整合；和/或(4)再生心肌结构的起源。

梗死结果

MRI成像的图片用来评估梗死面积，梗死区重量和梗死区域。结果列在下文的表2中。

表2

	梗死区域(％)	梗死区重量(g)	梗死区体积(cm3)
				组别1(对照)	19.8	15.6	22.0
组别2(混合A)	18.7	15.8	20.7
				组别5(混合B)	13.7	13.2	15.6
组别4(混合B+B)	18.8	22.2	25.2
				组别3混合(A+B)	9.6	10.3	10.3

试验记录了，所述梗死区域：对照组约19.8％；分别使用混合A和混合B+B的所述组别2和4为约19％。出乎意料的，使用本发明的所述组合物(B)，所述梗死区域限制到13.7％，为组别5(混合B)。因此，相对于其它组合物，根据本发明的所述组合物(B)对治疗梗死是非常有效的，例如心肌梗死。

另外，令人奇怪地观察到：当注射混合B后接着进行混合A的初步注射，所述梗死区域进一步被限制到约9.6％的数值。根据其它组别的观察结果，这个结果是没有被预料到的。的确，组别2的混合A单独上基本上是无效的。使用根据本发明的药物混合物可以观察到协同效果。该结果通过组织病理学和免疫组织化学分析方法测试确认。

组织病理学

将梗死的边缘区和中心区域中分别采集的结果汇编。所有组别的结果列在下文的表3中。表3中的数据意味着来自心脏切片，以分析每个组别的动物。

表3

所述梗死和瘢痕区域大小的比例代表了梗死大小，而透壁性是确立所述梗死是否强烈定位在所述心肌外表面还是其贯穿所述心肌内表面延伸。所述透壁性的数值越高，所述梗死范围越大。

关于所述梗死的边缘区域，表3显示：混合A，混合B+B或者对照混合对梗死大小几乎没有影响。在这些情况下，所述梗死和瘢痕大小的比例范围从31.4％至36.0％。与之相反的是，当使用根据本发明的所述组合物(即混合B)，所述梗死和瘢痕大小的比例出乎意料地减少到26％。当使用根据本发明的所述药物混合物(如混合A+B)，这个数值可以进一步的减少到20％。这个实验证明了：目前的药物组合物和药物混合物对治疗心脏疾病是有效的。当在梗死区域进行的实验时，也确定了这结果。

进一步的，它出乎意料地证明了：单独混合B或者单独混合A+B的透壁性减少。这也意味着本发明的所述组合物(B)单独或者与组合物(A)联合，允许限制所述心肌外表面的梗死扩散。这也是另一个证据，表明本发明所述药物组合物和所述药物混合物是治疗心脏疾病或问题的有效组合物。

因此，从上文描述的实验中看出很明显：根据本发明的所述药物组合物和药物混合物是适合治疗心肌缺氧，局部缺血或者心肌梗死继发的心力衰竭。

免疫组织化学

在梗死部分范围内进行测试以评估，所述微血管密度(vWF-阳性微血管/mm²)、BrdU阳性细胞和c-kit阳性细胞。使用von Willebrand因子(vWF)的定量微血管密度允许测定在所述梗死区建立的新血管的量。BrdU阳性细胞测试表征细胞的增值，包括心脏细胞。C-kit阳性细胞测试表明在所选定的梗死部分的CSCs的量。结果列在表4中。这些测试只在组别1(对照组别)、组别3(混合A+B)和组别5(混合B)中进行。

表4

结果显示：当根据本发明的组合物(A)和(B)联合或者单独的组合物(B)，被注射在心脏中后，它们对心脏干细胞刺激或者心脏细胞增殖产生巨大影响。事实上，经过本发明组合物或本发明混合物刺激，微血管密度增加，新的血管生成。获得的组别3或者5的结果分别达到34.2和34.3，相对于对照组的27.9。这在BrdU阳性细胞测试中得到确证，其表明使用本发明组合物细胞增殖增强，并观察到强烈的细胞活性。当注射混合B，观察到36.0％的BrdU阳性细胞，相对于对照组的只有22.1％。这明显地强调了根据本发明的所述药物组合物促进细胞增殖，并因此形成新的肌肉细胞和血管、以及周边的心肌。这可以进一步增强，当使用根据本发明的所述药物混合物。使用这种混合物可以达到52.7％的值。因此，根据本发明的药物组合物和药物混合物是适合改善心脏组织再生的。

所述药物混合物有道和促进所述CSCs的活化和增殖的能力在c-kit阳性细胞测试中得到确证。C-kit阳性细胞测试允许表明：原位CSCs被消耗，因为相对于对照组，当使用混合A+B它们的量显著减少。因此，所述再生的心肌结构起源于原位心脏干细胞。本发明组合物和/或混合物对或体内原位心脏干细胞的刺激有效。

本文使用的所述术语和描述仅仅以通过解释性的方式提出，而不是作为限制的意思。本领域技术人员将认识到：在本发明权利要求书中解释的精神和范围内的许多变体，和它们的等同变换；其中除非另有指明，所有术语应该以其宽广的定义来理解。因此，其他人在阅读和理解了本发明先前的描述后将作出的所有修饰和变化。特别地，上文描述的尺寸、材料和其他参数，可以根据实施应用的需要作出改变。

Claims (32)

1.刺激干细胞的人用或兽用药物组合物(B)，包含至少两种干细胞刺激剂和至少一种药学上可接受的赋形剂。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述至少两种干细胞刺激剂选自：TGFβ-1、BMP-4、FGF-2、IGF-1、活化素A、心肌营养蛋白1、Cardiogenol C及其混合物。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述干细胞刺激剂是TGFβ-1、BMP-4、FGF-2、IGF-1、活化素A、心肌营养蛋白1和CardiogenolC。

4.根据任意一项前述的权利要求所述的药物组合物，其中所述组合物进一步包含凝血酶抑制体，其选自：水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、阿加曲班、美拉加群、希美加群、达比加群和肝素。

5.根据任意一项前述的权利要求所述的药物组合物，其进一步包含至少一种物质选自：生长因子、细胞因子、激素及其组合。

6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述至少一种物质选自：

-骨形成蛋白(BMP)，例如BMP-1、BMP-2、BMP-5、BMP-6；

-表皮生长因子(EGF)；

-促红细胞生成素(EPO)；

-成纤维细胞生长因子(FGF)，例如FGF-1、FGF-4、FGF-5、FGF-12、FGF-13、FGF-15、FGF-20；

-粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；

-粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；

-生长分化因子-9(GDF-9)；

-肝细胞生长因子(HGF)；

-胰岛素样生长因子(IGF)，例如IGF-2；

-肌肉生长抑制素(GDF-8)；

-神经营养蛋白，例如NT-3、NT-4、NT-1和神经生长因子(NGF)；

-血小板衍生生长因子(PDGF)，例如PDGF-β、PDGF-AA、PDGF-BB；

-促血小板生成素(TPO)；

-TGF-(转化生长因子α)

-转化生长因子β(TGF-β)，例如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3；

-VEGF(血管内皮生长因子)，例如VEGF-A、VEGF-C；

-TNF-α、白血病抑制因子(LIF)、白细胞介素6(IL-6)、维生素A酸、C SDF-1(基质细胞衍生因子-1)、BDNF(脑衍生神经营养因子)、骨母细胞特异性因子-2、血管紧张素II、Flt3配体、胶质细胞衍生的神经营养因子、胰岛素样生长因子结合蛋白-3、胰岛素样生长因子结合蛋白-5、白细胞介素-3、白细胞介素-8、中期因子、黄体酮、腐胺、干细胞因子、TGF-α、Wntl、Wnt3a、Wnt5a、胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶-4、趋化因子配体1、趋化因子配体2、趋化因子配体5、趋化因子配体7、趋化因子配体11、趋化因子配体20、结合珠蛋白、植物凝血素、胆固醇25-羟化酶、突触融合蛋白-8、突触融合蛋白-11、血浆铜蓝蛋白、补体成分1、补体成分3、整联蛋白α6、溶酶体酸脂酶1、θ-2微球蛋白、泛素、巨噬细胞移动抑制因子、丝切蛋白、亲环素A、FKBP12、NDPK、肌动蛋白抑制蛋白1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、钙周边蛋白、斯钙素-1、PGE-2、mpCCL2、IDO、iNOS、HLA-G5、M-CSF、血管生成素、PIGF、MCP-1、细胞外基质分子、CCL2(MCP-1)、CCL3(MIP-1α)、CCL4(MIP-1β)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL20(MIP-3α)、CCL26(嗜酸细胞活化趋化因子-3)、CX3CL1(不规则趋化因子)、CXCL5(ENA-78)、CXCL11(i-TAC)、CXCL1(GROα)、CXCL2(GROβ)、CXCL8(IL-8)、CCL10(IP-10)及其组合。

7.根据任意一项前述的权利要求所述的药物组合物，其中被刺激的干细胞是原位心脏干细胞或循环干细胞、或注射干细胞。

8.根据任意一项前述的权利要求所述的药物组合物，其包含一级粒子。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其中所述一级粒子选自：藻酸盐、壳聚糖、葡萄聚糖、纤维素、脂质体、以及聚酯的微球体或纳米微球，所述聚酯的微球体或纳米微球例如PLGA、聚已酸内酯或者共聚多酯。

10.根据权利要求8或9所述的药物组合物，其中所述一级粒子囊封所述药物组合物的所述干细胞刺激剂。

11.药物混合物，其特征在于，其包含根据任意一项前述的权利要求所述的药物组合物(B)、以及含有至少一种药学活性物质的组合物(A)。

12.根据权利要求11所述的药物混合物，其特征在于，所述至少一种药学活性物质选自：胰岛素样生长因子1(IGF-1)、肝细胞生长因子(HGF)和/或其变体；所述其变体例如NK1、1K1、1K2、HP11、或者HP21、及其组合。

13.根据权利要求11或12所述的药物混合物，其特征在于，所述至少一种药学活性物质进一步包含SCF-1。

14.根据前述的权利要求11至13任意一项所述的药物混合物，其特征在于，所述组合物(A)进一步包含二级粒子，其选自：藻酸盐、壳聚糖、葡萄聚糖、纤维素、脂质体、或者聚酯的微球体或纳米微球，所述聚酯的微球体或纳米微球例如PLGA、聚已酸内酯或者共聚多酯。

15.根据权利要求14所述的药物混合物，其中所述二级粒子囊封所述至少一种药学活性物质。

16.根据权利要求14或15所述的药物混合物，其中所述二级粒子配置使在其中囊封的基材的递送在所述一级粒子中囊封的基材的递送之前。

17.根据权利要求1至10任意一项所述的药物组合物或者根据权利要求11至16任意一项所述的药物混合物作为药物使用的用途。

18.根据权利要求1至10任意一项所述的药物组合物或者根据权利要求11至16任意一项所述的药物混合物在心脏组织再生中的用途。

19.根据权利要求1至10任意一项所述的药物组合物或者根据权利要求11至16任意一项所述的药物混合物在心脏组织恶化治疗中的用途。

20.根据权利要求1至10任意一项所述的药物组合物或者根据权利要求11至16任意一项所述的药物混合物在心脏疾病治疗中的用途，所述心脏疾病包括心力衰竭、心脏缺血或者心肌梗死。

21.对活体内或离体的人类或动物心脏干细胞起作用的方法，其中根据权利要求1至10所述的药物组合物(B)被施用于人类或动物。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述组合物(B)的施用在所述组合物(A)的初步施用之后，所述组合物(A)包含至少一种药学活性物质。

23.根据权利要求21或者22所述的方法，其中所述施用通过注射完成。

24.根据前述的权利要求21至23任意一项所述的方法，其中所述施用是顺序注射。

25.根据前述的权利要求21至24任意一项所述的方法，其中根据权利要求1至10任意一项所述的所述药物组合物(B)的两次连续施用之间的持续时间为从1小时至180天。

26.根据权利要求21至25任意一项所述的方法，其中每次施用被重复。

27.根据权利要求21至26任意一项所述的方法，其中所述组合物(A)或者(B)是肠胃外施用的。

28.根据权利要求21至27任意一项所述的方法，其中所述组合物(A)或者(B)是施用到人类或者动物的循环系统。

29.根据权利要求21至28任意一项所述的方法，其中所述组合物(A)或者(B)是施用到静脉和/或动脉。

30.根据权利要求21至29任意一项所述的方法，其中所述组合物(A)或者(B)是施用到心脏组织。

31.根据权利要求21至30任意一项所述的方法，其中所述施用对所述药物组合物(B)是冠状动脉内，对所述组合物(A)的初步施用是静脉内。

32.根据权利要求21至26任意一项所述的方法，其中所述组合物(A)的每次施用是任选的。